Молекулярная биология Скоблов Михаил Юрьевич Лекция 3 кислот. Часть 1.
advertisement
Молекулярная биология Лекция 3. Функции нуклеиновых кислот. Часть 1. Скоблов Михаил Юрьевич Часть 1. История исследования функции ДНК Происхождение ДНК Земное! Внеземное? Эксперимент Миллера — Юри Теория химической эволюции Ученые из NASA проанализировали состав 12 богатых углеродом метеоритов, 9 из которых найдены в Антарктике. В них были обнаружены компоненты ДНК такие как аденин, гуанин, а также и другие клеточные компоненты - гипоксантин и ксантин. История изучения ДНК • В 1869 году Фридрих Мишер обнаружил неизвестное соединение, содержащееся в ядрах клеток, и назвал его нуклеином, от латинского nucleus — ядро. Эксперимент Эвери, Маклеода и Маккарти по трансформации бактерий. 1944 г. История изучения ДНК Эксперимент Эвери, Маклеода и Маккарти по трансформации бактерий. 1944 г. Вторая серия….. Вывод: Только ДНК определяет наследственные свойства организма. Реализация ДНК как генетического материала У каждого живого организма есть наследственный материал Реализация ДНК как генетического материала Размер генома человека 3,2x109 нуклеотидных пар, из него около 1.5% генома кодирует белки А остальное? “junk DNA”? Реализация ДНК как генетического материала Плотность генов,ген/тыс.нукл. Прокариоты и вирусы Эукариоты Размер генома, тыс. нукл. Реализация ДНК как генетического материала Гены организованы по разному: Ген А Размер генома человека 3,2x109 нуклеотидных пар, из него около 30% генома кодирует гены кодирующие белки мРНК гена А А остальное? У прокариот: “junk DNA”? У эукариот: Ген А мРНК гена А Реализация ДНК как генетического материала Парадокс: С эволюционной сложностью организма растёт и доля ДНК не кодирующей белки… Реализация ДНК как генетического материала Структура генома человека Информационная емкость ДНК Демонстрация записи текста целой книги Чёрча в 1 пикограмм молекул. Авторы кодировали не текст ASCII, а бинарный код —книгу Чёрча, с сохранением форматирования HTML и иллюстраций JPEG. Перед записью код разбили на 96-битные блоки. Общий объём записанной информации составил 54898 таких блоков, то есть примерно 643 килобайта, включая служебную информацию — 19-битный уникальный адрес каждого блока (на диаграмме внизу он изображён красным цветом). В данном эксперименте достигнута информационная плотность записи 5,5 петабит на кубический миллиметр. Информационная емкость ДНК Исследователи из Европейского института биоинформатики опубликовали работу с описанием способа, как можно существенно повысить информативность ДНК, предложив отказаться от четверичной системы (Base-4) в пользу троичной (Base-3), а четвёртый нуклеотид использовать в служебных целях для разбиения длинных цепочек Информационная плотность записи 2,2 петабайта на 1 грамм биологического материала. На сегодняшний день стоимость кодирования информации в ДНК оценивается примерно в $12400 за мегабайт, стоимость считывания — $220 за 1 МБ. Часть 2. Функции ДНК Анализ первичной структуры ДНК и её функции Что? Где? Когда? Проект ENCODE Полученные данные позволяют провести фактически полноценный анализ по исследованию регуляции изучаемого локуса. Гены Найти ген – значит картировать РНК на ДНК, проаннотировать эту последовательность. «Ген – это совокупность геномных последовательностей, кодирующих сцепленный набор потенциально перекрывающихся функциональных продуктов». Гены Псевдогены. Классификация. (процессированый) (единичный) (дуплицированный) Процессированные псевдогены Виды Количество генов Количество процессированных псевдогенов Arabidopsis 33583 4260 Caenorhabditis elegans 21187 2445 Drosophila melanogaster 22372 2208 Danio rerio 34291 16357 Gallus gallus 22720 5539 Canis lupus familiaris 24953 12852 Rattus norvegicus 42743 13962 Mus musculus 58433 19119 Pan troglodytes 32989 16785 13 12 10 48 24 52 33 33 51 Homo sapiens 42000 17609 42 % ? функциональность • Образованы 10% кодирующих генов • Около 80% примато-специфичные • Значительная фракция псевдогенов (до 20%) транскрипционно активна… Механизмы действия процессированных псевдогенов Псевдогены и miRNA “PTEN is a functionally haploinsufficient tumour suppressor gene”. • В нормальных образцах и рака простаты найдена прямая корреляция экспрессии между PTEN и PTENP1 • Локус PTENP1 селективно теряется при раке •3’ UTR PTENP1 проявляет активность опухолевого супрессора miR-17 miR-21 miR-214 miR-19 miR-26 Регуляторные участки в геноме Промотор — последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНКполимеразой для осуществления транскрипции. мРНК гена А ТАТА-бокс - консервативная, богатая аденином и тимином последовательность ДНК, выявленная примерно у четверти генов человека на расстоянии 25-30 п. о. слева («вверх по течению») от точки инициации транскрипции. ТАТА-бокс обеспечивает ориентацию РНК-полимеразы относительно промотора, участвует в инициации транскрипции генов. Регуляторные участки в геноме Энхансер (enhancer) — последовательность ДНК, способный связываться с факторами транскрипции, при этом увеличивая уровень транскрипции гена или группы генов. Сайленсер (silencer) — последовательность ДНК, с которой связываются факторы транскрипции (белки-репрессоры), что приводит к понижению или к полному подавлению транскрипции гена. Инсулятор (insulator) — последовательность ДНК, способная блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними. Регуляторные участки в геноме Уровень экспрессии гена является результирующей всех взаимодействий. Регуляторные участки в геноме •Проанализировано 19 тканей и типов клеток мыши •Найдено около 300 000 цис-регуляторных элементов •Они составляют до 11% генома мыши •И включают в себя более 70% консервативных не-кодирующих последовательностей Регуляторные участки в геноме Было идентифицировано 295,676 цисрегуляторных последовательностей, включающих в себя: • 53,834 возможных промоторов • 234,764 потенциальных энхансеров • 111,062 инсуляторов Анализ консервативности регуляторных элементов Сами последовательности высоко консервативны Однако сравнение их активного состояния в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека показало, что только 25% процентов активных энхансеров и инсуляторов консервативны. Повторяющиеся последовательности в ДНК Простые повторы Организм Тандемные повторы Диспергированные повторы Всего повторов в Сателлиты и геноме простые повторы Мобильные элементы Кукуруза 70% 10% 60% Рис 35% 9% 26% Рожь 87% 15% 72% Нематода 16% 7% 9% 8% 6% 2% Дрозофила 16% 6% 10% Москит 95% 11% 84% Курица 16% 7% 9% Мышь 62% 15% 47% Человек 64% 17% 46% Медовая пчела Повторяющиеся последовательности в ДНК Общее число 5 млн, 50% генома Диспергированные повторы Тандемные повторы Сателлиты Минисателлиты Микросателлиты > 100 нуклеотидов от 7 до 100 нукл. от 1 до 6 нуклеотидов ATGCGTAGCTAGCAGTAG CTGACGTACATGCTAACA TGCTAACATGCTAACATG CTAACATGCTAACATGCT AACATGCTAACATGCTAA CATGCTAACATGCTAACA TGCTACTAGCAGTAGCTG ACGTAGACTAGGCTAGC ATGCGTAGCTAGCAGTAGC TGACGTACAACAACAACAA CAACAACAACAACAAATGC GTAGCTAGCAGTAGCTGAC GTATAGGCTAGCATGCAGTC TAGCTAATGCGATCGCATCG Повторяющиеся последовательности в ДНК Диспергированные повторы Транспозоны мобильные элементы, репликация которых включает перемещение своей ДНК последовательности на новое место в геноме • 2-3% генома человека • Примеры: MER1, MER2 Ретротранспозоны мобильные элементы, которые могут самовоспроизводиться в геноме, осуществляя реакцию обратной транскрипции. • 42% генома человека • Примеры: Alu, MIR, LINE1, LINE2….. Открытие мобильных элементов Нобелевская премия по физиологии и медицине: «За открытие мобильных генетических элементов» Исследование южноамериканских видов кукурузы Барбара Мак-Клинток, 1944-1951 гг. лаборатория Колд-Спринг Харбор Эффект транспозиции мобильных элементов выражался в изменении окраски зёрен кукурузы относительно образцов из поколений от контрольного скрещивания. Полиморфизм ДНК Сравнение результатов секвенирования индивидуальных геномов человека Gonzaga-Jauregui C, Lupski JR, Gibbs RA. Human genome sequencing in health and disease. Annu Rev Med. 2012;63:35-61. Функционирование вторичной структуры ДНК Квадруплексы - последовательности нуклеиновых кислот, обогащенные гуанином и способные образовывать структуры из двух, трёх или четырех цепей. В геноме человека насчитывается около 300 тысяч квадруплексов. ДНКазимы • Впервые дезоксирибозимы были экспериментально продемонстрированы в 1994 Брикеро и Джойсом • Они использовали селекцию in vitro для поиска специфичных ДНК последовательностей способных катализировать Pb2+-зависимое расщепление фосфодиэфирной связи в РНК • Сегодня в литературе описано большое количество различных каталитических молекул ДНК способных расщеплять, лигировать, фосфорилировать деапуринизировать молекулы ДНК, метилировать порфирины, расщеплять и лигировать молекулы РНК. • Также в литературе описано несколько десятков случаев использования in vivo РНКрасщепляющих дезоксирибозимов для подавления экспрессии генов с ориентированием на будущий прикладной потенциал.
