ОТЧЕТ Докторанта 1-го года Глотова Андрея Сергеевича

ОТЧЕТ
Докторанта 1-го года
Глотова Андрея Сергеевича
Специальность 03.00.15 - «генетика»
Тема диссертации: «Популяционный анализ спектра мажорных мутаций и
полиморфизма генов некоторых частых моногенных и мультифакторных
заболеваний с помощью технологии биочипов»
По теме диссертации в 2009 году проведены следующие работы.
Начато создание коллекций ДНК различных групп: создана коллекция образцов
ДНК беременных женщин с тяжелым гестозом (N=77), создана коллекция образцов ДНК
беременных женщин без акушерских патологий, тромбозов и хронических заболеваний в
анамнезе (N=100), создана коллекция образцов ДНК доноров (популяционная группа) без
кардиопаталогий (N=100), создана коллекция образцов ДНК детей (популяционная
группа) (N=100), создана коллекция образцов ДНК детей с повышенным уровнем
артериального давления (N=179). Во всех указанных группах сбор образцов ДНК
продолжается.
Разработаны принципы "конструирования" биочипов на примере анализа
генетического полиморфизма и мутаций в генах системы биотрансформации. Проведена
оценка эффективности применения биочипов на различных популяционных выборках и в
скрининговых исследованиях. Результаты тестирования контрольных образцов
(идентификация мутаций в них была подтверждена другими методами – ПДРФ,
секвенирование и другие) показали полное совпадение. Анализ клинических образцов
выявил 2 расхождения из 715 проанализированных мутаций. Таким образом, точность
метода составила 99,7%. Разработаны варианты биочипов для диагностики
наследственной предрасположенности к некоторым частым мультифакторным
заболеваниям (онкологическим, сердечно-сосудистым). Сконструированы праймеры,
зонды, а также отработаны условия мультиплексных ПЦР, необходимые для разработки
биочипа для диагностики 14 мажорных мутаций в гене муковисцидоза.
На примере «Кардио-биочипа» проведена апробация биочипов в сравнительных
скрининговых исследованиях образцов ДНК у больных и в соответствующих
контрольных группах. В частности проведен анализ генов REN (I9-83G>A), AGT (M235T),
AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A), BKR2 (-58T>C), MTHFR (677C>T), ADRB2 (48A>G
и 81C>G) у детей, больных артериальной гипертонией и в контроле. Получены
распределения частот аллелей и генотипов проанализированных генов. Выявлено, что
аллели генов BKR2 (С-аллель) и AGTR2 (А-аллель) ассоциированы с развитием
артериальной гипертензии у мальчиков. Показано, что наличие вариантов генов REN (Ааллель и А/А генотип), AGT (Т-аллель) и АСЕ (D-аллель) ассоциировано с формированием
стабильной формы артериальной гипертензии у детей. Обнаружено, что показатели
диастолического АД значимо выше у пациентов с генотипом T/T по гену AGT по
сравнению с генотипами M/M и/или M/T. Впервые применен метод комплексной оценки
полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, который
подтвердил роль данных каскадов в развитии артериальной гипертензии и формировании
стабильного артериального давления.
Разработаны универсальные олигонуклеотидные последовательности для ПЦР, а
также селективные праймеры с универсальным 5'-концом. На примере анализа мутаций в
генах MTHFR, F5, PAI1, FGB, GP3a, F2 показать эффективность использования данного
подхода для идентификации генетического полиморфизма с целью изучения
наследственных тромбофилий и тромбозов. Показана эффективность использования
универсальных праймеров как для моноплексной, так и для мультиплексной ПЦР.
Показано,
что
использование
для
универсальных
праймеров
выбранных
последовательностей Universal 1 и Universal 2 не менее эффективно, чем применение
описанных в литературе zip-code последовательностей.
Проведена апробация "Тромбо-биочипа" на образцах ДНК женщин с патологией
беременности (гестоз) и в контрольных группах. Выявлены частоты генотипов и аллелей
генов F5, FGB, F2, PAI, ITGB3 и MTHFR у беременных женщин с гестозом и у
беременных женщин без тромбозов и акушерских патологий для Северо-западного
региона России. При сравнительном анализе частот аллелей генов F5, F2, PAI, ITGB3 и
MTHFR у беременных женщин с гестозом и в контрольной группе не было показано
статистически значимых различий. При сравнительном анализе частот генотипов -675
5G/5G, -675 5G/4G,-675 4G/4G по гену PAI1 выявлены статистически значимые отличия
между изучаемыми группами (χ2=7.365, р=0,025). В группе беременных женщин с
гестозами наблюдали статистически значимое снижение частоты генотипа 5G/5G в 2.2
раза по сравнению с контролем (11.7% против 26.0% в контроле, OR = 0,376, 95% CI =
0.165-0.861, P=0.022). При сравнительном анализе частот генотипов 677C/C, 677C/T и
677Т/Т по гену MTHFR нами были обнаружены статистически значимые отличия между
изучаемыми группами (χ2=6.198, р=0,045). В группе беременных женщин с гестозами
одновременно наблюдали, как снижение частоты генотипа MTHFR 677C/C в 1.3 раз
(40.3% против 55.0% в контроле), так и частоты генотипа MTHFR 677Т/Т в 1.7 раз (5.2%
против 9.0% в контроле).
Работы проводятся в рамках научных грантов:
1.
Государственный контракт Федерального агентства по науке и инновациям № 02.512.11.2275:
«Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научнотехнического задела в области живых систем с участием научных организаций Украины» (шифр заявки
«2009-02-1.2-00-01-002»), 2009-2010. «Совместное исследование по разработке новых методов диагностики
и профилактики акушерских осложнений у беременных женщин России и Украины с генетически
обусловленными формами тромбофилии».
2.
Грант РФФИ, 09-04-13849-офи_ц «Разработка новых методических и методологических подходов к
анализу генов системы свертывания крови и фибринолиза - важных патогенетических факторов риска
детского и материнского здоровья».
3.
Государственный контракт Федерального агентства по образованию (на стадии подписания).
Конкурс
№
НК-421П
«Проведение
поисковых
научно-исследовательских
работ
по направлениям: «Физика конденсированных сред. Физическое материаловедение», «Коллоидная химия и
поверхностные явления», «Информатика», «Общая биология и генетика» в рамках мероприятия 1.2.2
Программы», выполняемому в рамках мероприятия 1.2.2 «Проведение научных исследований научными
группами под руководством кандидатов наук» по теме: «Исследование полиморфизма генов, регулирующих
предрасположенность к повышенному артериальному давлению, как важных патогенетических факторов
риска детского и материнского здоровья».
В 2009г. подготовлены следующие публикации (в том числе по теме диссертации*):
1.
*Глотов А.С., Вашукова Е.С., Полушкина Л.Б., Потулова С.В., Глотов О.С., Иващенко Т.Э., Гра
О.А., Наседкина Т.В., Аверьянова Н.С., Березнева Н.А., Пинелис В.Г., Баранов В.С. Диагностика
наследственно обусловленных заболеваний у детей с помощью ДНК-микрочиповой технологии // Вопросы
диагностики в педиатрии. 2009. Т. 1. №. 1. С. 14-17.
2.
Samochatova E.V., Chupova N.V., Rudneva A., Makarova O., Nasedkina T.V., Fedorova O.E., Glotov
A.S., Kozhekbaeva Zh., Maiorova O.A., Roumyantsev A.G., Krynetski E.Y., Krynetskaia N.F., Evans W.E., Ribeiro
R.C. TPMT genetic variations in populations of the Russian Federation // Pediatr. Blood Cancer. 2009. V. 52(2). P.
203-208.
3.
Глотов О.С., Глотов А.С., Баранов В.С. Состояние и перспективы генетического тестирования в
спорте. Генетический паспорт спортсмена становится реальным // «Молекулярно-биологические технологии
в медицинской практике”. Сб. статей. Новосибирск. Альта Виста. 2009. В. 13. Стр. 17-35.
4.
*Глотов А.С., Вашукова Е.С., Полушкина Л.Б. Биочипы в диагностике наследственных болезней и
заболеваний с генетической предрасположенностью // “Современные технологии профилактики
наследственных болезней и детской инвалидности” к 40-летию Медико-генетического центра. СанктПетербург. 2009. С. 52-57.
5.
*Баранов В.С., Иващенко Т.Э., Глотов А.С., Глотов О.С., Швед Н.Ю., Асеев М.В., Кречмар М.В.,
Потин В.В., Зайнулина М.С., Беспалова О.Н., Мозговая Е.В., Ермолинская М.И., Оржанова О.Н., Тарасова
М.А., Лаврова О.С. Определение наследственной предрасположенности к некоторым частым заболеваниям
при беременности. Генетическая карта репродуктивного здоровья: методические рекомендации. Под ред. В.
С. Баранова и Э. К. Айламазяна. — СПб.: «Изд-во Н-Л», ООО, 2009. — 66 с.
6.
*Баранов В.С., Иващенко Т.Э., Глотов А.С., Баранова Е.В., Асеев М.В., Глотов О.С., Беспалова
О.Н., Демин Г.С., Москаленко М.В., Швед Н.Ю. Генетический паспорт - основа индивидуальной и
предиктивной медицины. Под ред. В. С. Баранова — СПб.: «Изд-во Н-Л», ООО, 2009. — 452 с.
7.
*Глотов А.С., Полушкина Л.Б., Вашукова Е.С., Митяева О.Н., Наседкина Т.В., Гра О.А.,
Голденкова-Павлова И.В., Баранов В.С. ПЦР-амплификация с использованием универсальных праймеров:
разработка, усовершенствование и опыт использования в клинической практике // Съезд генетиков и
селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. V съезд ВОГиС. 21-28 июня
2009 г. Москва. Часть I. Стр. 403.