316 ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ ГИБРИДОВ

VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ ГИБРИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
Трояновская А.В., Солоденко А.Е.
65036, Украина, г. Одесса, Овидиопольская дорога, 3
Южный биотехнологический центр в растениеводстве НААН Украины
[email protected]
Для идентификации и паспортизации гибридов подсолнечника предложена технология, основанная на использовании ДНК-маркеров, в частности, микросателлитных последовательностей. Проанализирован полиморфизм 15 микросателлитных локусов у исследуемых генотипов. Составлены генетические формулы
(паспорта) для 28 гибридов подсолнечника мировой селекции.
Паспортизация и идентификация генотипов подсолнечника является актуальной задачей в селекционной работе. Основа классификации и идентификации наличие изменчивости, т.е. генетического полиморфизма. В большинстве случаев
идентификацию сортов, линий и гибридов подсолнечника проводят по морфологическим признакам. По таким признакам не всегда удается дифференцировать
близкие по происхождению образцы, выявить скрытую генетическую изменчивость
и осуществить контроль однородности исходного материала. Кроме того, число
морфологических признаков ограничено и они не всегда стабильны [1].
Наиболее информативными и стабильно воспроизводимыми являются
SSRP маркеры - (Simple Sequence Repeat Polymorphism), в состав которых входят
короткие тандемные повторы длиной 2-6 нуклеотидов, распространенные по всему геному. Важным преимуществом этих маркеров является их кодоминантный
тип наследования, полиаллельность и монолокусность [2].
Микросателлитные маркеры являются удобным инструментом для паспортизации, а также определения типичности линий, уровня гибридности гибридов
подсолнечника [3, 4].
Цель и задачи. Цель данной работы заключалась в паспортизации генотипов подсолнечника, зарегистрированных в Реестре сортов растений Украины
2006-2008 гг., а также создание базы данных аллельного состава проанализированных гибридов подсолнечника по протестированным локусам.
Материал и методы. Материалом исследования служили 28 гибридов подсолнечника, внесенных в Реестр сортов растений Украины 2006-2008 гг., созданные в селекционных центрах разных стран – Украины, России, Югославии, Франции, Австрии и Германии.
Праймеры для анализа микросателлитной ДНК подобраны согласно литературным данным, как обнаруживающие полиморфизм у элитных инбредных линий подсолнечника [5, 6].
ДНК выделяли из 4-5 – дневных этиолированных проростков цетавлоновым методом. Амплификацию проводили на приборе “Терцик” (ДНК-технология,
Россия). Состав реакционной смеси: 50 мМ KCI, 20 мМ трис-HCI (pH 8,4 при
25 ºС), 0,01 % Tween-20, 2 мМ MgCI2, 0,2 мкМ праймера, 200 мкМ каждого dNTP,
20-30 нг ДНК, 1ед. Taq – полимеразы. Условия амплификации: начальная денатурация – 94 ºС 2 мин, 30 циклов при следующих температурно – временных режимах – отжиг при 60 ºС 30 с, элонгация при 72 ºС 30 с, денатурация при 92 ºС
30 с, финальная элонгация 5 мин. Электрофорез продуктов амплификации проводили в денатурирующем полиакриламидном геле (10 % акриламид, 7М моче-
316
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИ МК, 2011 г.
вина, 1× трис – боратный буфер) при 500 В в течение 90 мин. Окрашивали азотнокислым серебром. Документировали полученные электрофореграммы видеосистемой VDS (Pharmacia Biotech, amersham США). Молекулярную массу фрагментов
ДНК определяли с помощью компьютерной программы “Image Master 1D Elite”
относительно маркера молекулярной массы – ДНК плазмиды pUC19, рестрицированной MspI.
Результаты и их обсуждение. Начальным этапом нашей работы было
определение генетической чистоты каждого исследованного гибрида подсолнечника по трем микросателлитным локусам - ORS 546, ORS 509 и ORS 599 .
По результатам анализа 50 индивидуальных образцов каждого гибрида
установлено, что все исследуемые генотипы подсолнечника генетически однородны, то есть полученные электрофоретические спектры продуктов амплификации
ДНК идентичны для всех образцов в пределах каждого генотипа.
Использование 12 пар SSR-праймеров позволило выявить на данной выборке гибридов от 2 до 8 аллелей в локусе. По локусам ORS 1036, На 1608, ORS
533, было выявлено два аллельных варианта, для локусов ORS 409, ORS 4 – три
аллеля, для локусов На 1796, ORS 546 и ORS 509 – четыри, для локусов ORS 599,
ORS 815 – пять. Наиболее полиморфными локусами, выявляющими 7 и 8 аллелей
оказались ORS 78 и ORS 1024 (табл.1).
Локусы ORS 595, ORS 3 и ORS 307 - неполиморфные на данной выборке
генотипов, что оказалось неожиданностью, учитывая результаты предыдущих
исследований [7, 8], в которых показано наличие семи, пяти и трех аллельных
вариантов.
Таблица 1 – Характеристика микросателлитных локусов, использованных
для исследования гибридов
№
Праймер
Повтор
Код
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
ORS 78
ORS 509
ORS 595
ORS 815
ORS 3
ORS 4
Ha 1796
Ha 1608
ORS 1036
ORS 307
ORS 533
ORS 409
ORS 546
ORS 599
ORS 1024
(AGG)
(AT)(GT)
(AG)
(CTT)
(AGT)
(AGG)
(ATT)
(ATT)
(CТ)
(AT)(GT)
(CT)
(AC)
(CT)
(AG)
(AG)
А
B
C
D
Е
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
Количество
аллелей
7
4
1
5
1
3
4
2
2
1
2
3
4
5
8
РІС
0,76
0,41
--0,78
--0,1
0,37
0,5
0,5
--0,5
0,27
0,69
0,77
0,83
По некоторым локусам были выявлены уникальные аллели так, например,
по локусу ORS 1024 (у гибридов Час – 249 п.н., Сержан – 229 п.н., и Мастер –
242 п.н.); по локусу На 1796 (у гибридов Час- 188 п.н., Латино – 256,262 п.н.); по
локусу ORS 409 (у гибрида КВС Гелия – 131 п.н.); по локусу ORS 4 (у гибрида
317
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
Одор 157, 169 п.н). По локусам ORS 595, ORS 3, ORS 307 и На 1608 все исследованные генотипы имели одинаковый аллельный состав.
Проведенная работа позволила сформировать базу данных ДНКтипирования по микросателлитным локусам подсолнечника. В таблице 2 приведены молекулярно-генетические паспорта исследованных гибридов (в нижнем
индексе возле кода локуса указаны размеры аллелей в п.н.)
Таблица 2 – Молекулярно-генетические паспорта гибридов подсолнечника
по данным анализа микросателлитных локусов
Гибриды
Час
A174B192C134D178E226F172G188H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N199,203O249
Славутич
A171,174B172,192C134D172E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N199,203 O244
Карат
A171,174B179,198C134D172E226F172G256H157,160I242,252J118K156,160L127M169,166N199,210 O240,244
Латино
A165,171B192C134D175,183E226F172G256,262H157,160I242J118K156,160L127M166,169N199,210 O244
Оникс
A165,174B192C134D172,175E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N199,203 O244
Иберика
A165B192C134D175,183E226F172G175H157,160I242,252J118K156L127M166N203,210O236
Оберег
A165,178B192C134D175E226F172G175H157,160I242,252J118K156L127M166,169N199,203O232,236
Сапфир
A174B192C134D178,186E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N199,203O244
Ясон
A165,171B192C134D172,183E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N199,210 O236
Всесвит
A165,171B192C134D175E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N199,210 O236
Сержан
A159B179C134D172,183E226F172G256H157,160I242,252J118K156,160L125M166,169N199,203O229
Оскил
A159,171B192C134 D175,183E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N203,210 O232
Псьол
A167B192C134D172,175E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N199,203O232
Родник
A171B192C134D172,175E226F172G175H157,160I242,252J118K156L125M166,169N199,203O232
Оливер
A167B198C134D172,175E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N199,210O232
ПР 64Г
A174B192C134D175E226F172G256H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N199,210O238
Златибор
A171,174B192C134D178E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N199,203 O240
Тайфун
A171,178B172,179C134D172,175E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M169N203,210 O236
КВС Гелия A174B192,198C134D175,178E226F172G256H157,160I242,252J118K156,160L131M166,169N199,210 O244
Лакомка
A174B192C134D172,175E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,169N203,210 O238
Мастер
A174B192C134D172,178E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N199,203O242
Флагман
A174B198C134D178E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N199,210O238
Одор
A174B198C134D172,178E226F157,169G175H157,160I242,252J118K156,160L125M166N179O238
Дарий
A174B172,192C134D178E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M161,166N179,190 O240
Етюд
A169,178B192C134D175,186E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N179,190 O240,244
Сивер
A169,178B192C134D178,186E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N179,190 O240,244
Ковчег
A169,174B192C134D178,186E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N179,190 O240,244
Ной
A169,174B192C134D178,186E226F172G175H157,160I242,252J118K156,160L127M166,169N179,190 O240,244
318
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИ МК, 2011 г.
Заключение. Амплификация микросателлитных последовательностей ДНК
позволила выявить молекулярно-генетический полиморфизм 28 гибридов подсолнечника, внесенных в Реестр сортов растений Украины 2006-2008 гг. С помощью
анализа 15 SSR-локусов проанализированы все исследованные гибриды, а также
получены идентификационные ДНК-паспорта.
Работа проводилась под руководством Сиволапа Юрия Михайловича –
д-ра биол. наук, профессора, академика НААН Украины.
Литература
1.
Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений
по белкам семян / под ред. В.Г. Конарева. Санкт-Петербург: ВИР, 2000. – 186 с.
2.
Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно – генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. – 2002. –
Т 34. – № 4. – С. 279–296.
3.
Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная
биология. – Москва, 1991. – Т.25. – вып. 4. – С. 926–937.
4.
Ідентифікація і реєстрація генотипів м’якої пшениці (Triticum aestivum L.), ячменю (Hordeum vulgare L.), кукурудзи (Zea mays), соняшника (Helianthus annuus L.) за допомогою аналізу мікросателітних локусів // Методичні рекомендації. – Одеса, 2004. – С. 3–15.
5.
Tang S., Knapp S.J. Microsatellites uncover extraordinary diversity in native American land races and wild population of cultivated sunflower // Theor. Appl.
Genet. – URL: http:\\www.orst.edu (дата обращения: 2002).
6.
Tang S., Knapp S.J. Simple sequence repeat map of the sunflower genome. – URL: http:\\www.orst.edu.
7.
Солоденко А.Е., Саналатий А.В., Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов подсолнечника с помощью микросателлитных маркеров // Цитология и генетика. – 2004. – Т.38. – № 2. – С. 15–19.
8.
Саналатий А.В., Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов подсолнечника украинской селекции при помощи SSRP-анализа. // Цитология и генетика. – 2006. – Т.40. – № 4. – С. 31–37.
IDENTIFICATION AND CERTIFICATION OF SUNFLOWER OF HYBRIDS
Troyanovskaya A.V., Solodenko A.E.
The technology for identification and certification of hybrids is proposed. It is
based on the use of DNA markers, particularly microsatellite sequences. The pol ymorphism of 15 microsatellite loci of the studied sunflower genotypes was inv estigated. Genetic formulas (passports) for the 28 hybrids of the world development
have been made.
319