ÝÍÄÎËÈÇÈÍ ÁÀÊÒÅÐÈÎÔÀÃÀ SPZ7: ÂËÈßÍÈÅ ÝÔÔÅÊÒÎÐΠÍÀ ÊÀÒÀËÈÒÈ×ÅÑÊÓÞ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÜ ÔÅÐÌÅÍÒÀ  ËÈÇÈÑÅ

222
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2010. Ò. 51. ¹ 3
ÓÄÊ 577.151.042
ÝÍÄÎËÈÇÈÍ ÁÀÊÒÅÐÈÎÔÀÃÀ SPZ7: ÂËÈßÍÈÅ ÝÔÔÅÊÒÎÐÎÂ
ÍÀ ÊÀÒÀËÈÒÈ×ÅÑÊÓÞ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÜ ÔÅÐÌÅÍÒÀ  ËÈÇÈÑÅ
ÃÐÀÌÎÒÐÈÖÀÒÅËÜÍÛÕ ÌÈÊÐÎÎÐÃÀÍÈÇÌÎÂ
1
1
1
2
1
Í.Ë. Êëÿ÷êî , Ñ.À. Ëåãîöêèé , Ï.À. Ëåâàøîâ , Â.Ì. Ïîïîâà , Í.Ã. Áåëîãóðîâà ,
À.Â. Òèìàøåâà1, È.À. Äÿòëîâ2, À.Â. Ëåâàøîâ1
(1êàôåäðà õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ;
å-mail: klyachko@enzyme.chem.msu.ru; 2 Ãîñóäàðñòâåííûé íàó÷íûé öåíòð ïðèêëàäíîé
ìèêðî-áèîëîãèè è áèîòåõíîëîãèè, Ìîñê. îáë., ïîñ. Îáîëåíñê, Ðîññèÿ)
Èçó÷åíû âîçìîæíîñòè ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7 â ëèçèñå ãðàìîòðèöàòåëüíûõ áàêòåðèé “ñíàðóæè”. Ïîêàçàíî ñóùåñòâåííîå ïîâûøåíèå (1,5–3 ðàçà) àêòèâíîñòè ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7 â ëèçèñå êëåòîê S. enteritidis N60 è E. coli TG1 â
ïðèñóòñòâèè âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûõ âåùåñòâ, ïëþðîíèêîâ ñ êðóïíûì ãèäðîôîáíûì áëîêîì, ëèçîöèìà êóðèíîãî ÿéöà, à òàêæå íèçêèõ êîíöåíòðàöèé ïåïòèäíîãî àíòèáèîòèêà êîëèñòèíà. Ðàçðàáîòàííûé ïîäõîä ìîæåò îêàçàòüñÿ ïåðñïåêòèâíûì â ïîâûøåíèè ýôôåêòèâíîñòè äåéñòâèÿ ëåêàðñòâåííûõ àíòèáàêòåðèàëüíûõ ïðåïàðàòîâ íà îñíîâå ôåðìåíòîâ áàêòåðèîôàãîâ â áîðüáå ñ ãðàìîòðèöàòåëüíûìè ìèêðîîðãàíèçìàìè.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: ýíäîëèçèí áàêòåðèîôàãà, àíòèáàêòåðèàëüíûå ñðåäñòâà, êàòàëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü, ãðàìîòðèöàòåëüíûå áàêòåðèè, ñàëüìîíåëëà, E. coli, ýôôåêòîðû.
Ââåäåíèå
Ýíäîëèçèíû (ëèçèíû èëè ëèçîöèìû) áàêòåðèîôàãîâ,
ÿâëÿþùèõñÿ âèðóñàìè áàêòåðèé, ñïîñîáíû îñóùåñòâëÿòü ðàçðûâ ñâÿçåé â ïåïòèäîãëèêàíîâîì ñëîå êëåòî÷íîé ñòåíêè ìèêðîîðãàíèçìîâ, ïðèâîäÿ ê ëèçèñó (äåãðàäàöèè) ïîñëåäíèõ [1–2].  íàñòîÿùåå âðåìÿ, â ñâÿçè ñ ïîÿâëåíèåì âñå áîëüøåãî ÷èñëà ðåçèñòåíòíûõ ê
àíòèáèîòèêàì áàêòåðèé, ôåðìåíòû áàêòåðèîôàãîâ
ðàññìàòðèâàþòñÿ â êà÷åñòâå àëüòåðíàòèâû àíòèáèîòèêàì â ïðîôèëàêòèêå è ëå÷åíèè ðàçëè÷íûõ áàêòåðèàëüíûõ èíôåêöèé [1–8]. Íåñìîòðÿ íà òî ÷òî ýíäîëèçèíû ïðèñïîñîáëåíû ïðèðîäîé äëÿ ëèçèñà êëåòêè “èçíóòðè”, â ëèòåðàòóðå ñóùåñòâóåò ìíîãî ïðèìåðîâ ýôôåêòèâíîé ðàáîòû òàêèõ ôåðìåíòîâ “ñíàðóæè” â ñëó÷àå ãðàìïîëîæèòåëüíûõ áàêòåðèé (cì., íàïðèìåð, [2,
9–12]).  ñëó÷àå ãðàìîòðèöàòåëüíûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ ñëîæíîå ñòðîåíèå êëåòî÷íîé ñòåíêè áàêòåðèé,
íàëè÷èå âíåøíåé ìåìáðàíû, âîçìîæíî, ïðåïÿòñòâóåò
äîñòóïó ýíäîëèçèíîâ “ñíàðóæè” ê ðàçðûâàåìûì ñâÿçÿì, ïîýòîìó ïðàêòè÷åñêè íåò ïðèìåðîâ ýôôåêòèâíîãî ëèçèñà êëåòîê “èçâíå”. Äëÿ ìíîãèõ ôåðìåíòîâ òàêèõ ôàãîâ âàæíûì êîìïîíåíòîì äëÿ ýôôåêòèâíîãî
ëèçèñà ÿâëÿþòñÿ áåëêè-õîëèíû [13]. Ïðè èññëåäîâàíèè ñâîéñòâ ôåðìåíòîâ áàêòåðèîôàãîâ, ñïåöèôè÷íûõ
ê ãðàìîòðèöàòåëüíûì áàêòåðèÿì, in vitro èñïîëüçóþòñÿ, êàê ïðàâèëî, êëåòêè, îáðàáîòàííûå õëîðîôîðìîì,
ñïîñîáñòâóþùèì îáðàçîâàíèþ ïîð (“äûðîê”) â êëå-
òî÷íûõ ìåìáðàíàõ (ñì., íàïðèìåð, [14]). Îäíàêî ïðè
ðàçðàáîòêå ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì ôåðìåíòîâ áàêòåðèîôàãîâ âàæíûì ïðåäñòàâëÿåòñÿ èçó÷åíèå ýôôåêòèâíîñòè ôåðìåíòîâ â îòíîøåíèè íåîáðàáîòàííûõ õëîðîôîðìîì êëåòîê ïàòîãåíîâ.  ëèòåðàòóðå îïèñàíû ðàçëè÷íûå àíòèìèêðîáíûå àãåíòû, îáëàäàþùèå ñâîéñòâîì èçìåíåíèÿ ïðîíèöàåìîñòè êëåòî÷íîé ñòåíêè áàêòåðèé, ñðåäè êîòîðûõ ñëåäóåò îòìåòèòü õåëàòèðóþùèå àãåíòû [15–16],
ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûå âåùåñòâà [17–19], ïåïòèäû è
ïåïòèäíûå àíòèáèîòèêè [20–22] è ò.ä. Îäíàêî èìååòñÿ ëèøü íåñêîëüêî ðàáîò, ïîêàçûâàþùèõ ñèíåðãèçì
äåéñòâèÿ íà êëåòêè, íàïðèìåð, äâóõ ôåðìåíòîâ ðàçëè÷íîé ñïåöèôè÷íîñòè èëè ôåðìåíòà è àíòèáèîòèêà
[1–2].  íàñòîÿùåé ðàáîòå ìû èçó÷àëè äåéñòâèå ýíäîëèçèíà ôàãà SPZ7, ñïåöèôè÷íîãî ê Salmonella
enteritidis, íà íåîáðàáîòàííûå õëîðîôîðìîì êëåòêè.
Îñíîâíàÿ öåëü äàííîãî èññëåäîâàíèÿ ñîñòîÿëà â èçó÷åíèè âëèÿíèÿ ýôôåêòîðîâ ðàçíîé ïðèðîäû íà êàòàëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7.
Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü
Ìàòåðèàëû
 ðàáîòå èñïîëüçîâàí ýíäîëèçèí áàêòåðèîôàãà
SPZ7, ïîëó÷åííûé ïîñëå èíôèöèðîâàíèÿ áàêòåðèîôàãîì êëåòîê Salmonella enteritidis øòàìì 60. Ôåðìåíò
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2010. Ò. 51. ¹ 3
ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 19 êÄà áûë âûäåëåí è î÷èùåí ìåòîäàìè æèäêîñòíîé õðîìàòîãðàôèè íèçêîãî
äàâëåíèÿ (êîíöåíòðàöèÿ ôåðìåíòà 0,2–0,5 ìã/ìë) [23–
24]; ðÍ-îïòèìóì àêòèâíîñòè ôåðìåíòà ñîñòàâëÿë 8,5
[24].  êà÷åñòâå ñóáñòðàòîâ äëÿ òåñòèðîâàíèÿ êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ýíäîëèçèíà ôàãà SPZ7 ìû èñïîëüçîâàëè êëåòêè S. enteritidis øòàìì 60 è E. coli
øòàìì TG1. Â ðàáîòå òàêæå èñïîëüçîâàíû òðèñ-HCl
(“ICN Biomedicals”, ÑØÀ), êîëèñòèí (“Sigma
Aldrich”, ÑØÀ), áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí, êóðèíûé ÿè÷íûé ëèçîöèì, ïëþðîíèêè F127, P85, L101
(“Serva”, Ãåðìàíèÿ).
Ìåòîäû
Èçìåðåíèå àêòèâíîñòè ôåðìåíòà
 ðóòèííûõ ýêñïåðèìåíòàõ àêòèâíîñòü ôåðìåíòà
îïðåäåëÿëè ìåòîäîì òóðáèäèìåòðèè ïî èçìåíåíèþ
ìóòíîñòè ñóñïåíçèé êëåòîê S. enteritidis øòàìì 60 è
E. coli øòàìì TG1 âî âðåìåíè. Èçìåðåíèå èçìåíåíèÿ îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè âî âðåìåíè â íåïðåðûâíîì
ðåæèìå ïðîâîäèëè íà ñïåêòðîôîòîìåòðå “Shimadzu
UV-1601PC” ñ òåðìîñòàòèðóåìûì êþâåòíûì îòäåëåíèåì ïðè òåìïåðàòóðå 37°Ñ è äëèíå âîëíû 650 íì.
 òèïè÷íîì ýêñïåðèìåíòå â êþâåòó îáúåìîì 0,5 ìë
âíîñèëè 480 ìêë áóôåðà äëÿ èçìåðåíèÿ àêòèâíîñòè
(20 ìÌ òðèñ-ÍÑl, ðÍ 8,5), 7 ìêë ñóñïåíçèè êëåòîê S.
enteritidis èëè E. coli (â òàêîì êîëè÷åñòâå, ÷òîáû
îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü ïðè 650 íì ñîñòàâëÿëà 0,65),
ïîìåùàëè â òåðìîñòàòèðóåìîå êþâåòíîå îòäåëåíèå
ñïåêòðîôîòîìåòðà (37°Ñ), âûæèäàëè íåñêîëüêî ìèíóò,
÷òîáû ñîäåðæèìîå êþâåòû ïðîãðåëîñü, è ðåãèñòðèðîâàëè ôîíîâîå çíà÷åíèå ëèçèñà êëåòîê. Çàòåì â êþâåòó âíîñèëè 3–5 ìêë 0,2–0,5 ìã/ìë ðàñòâîðà ôåðìåíòà
(êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ ýíäîëèçèíà ñîñòàâëÿëà 1,2–
5,0 ìêã/ìë) è ðåãèñòðèðîâàëè ôåðìåíòàòèâíóþ àêòèâíîñòü. Çà àêòèâíîñòü ôåðìåíòà ïðèíèìàëñÿ òàíãåíñ
óãëà íàêëîíà íà÷àëüíîãî ó÷àñòêà êðèâîé, îòðàæàþùåé
çàâèñèìîñòü îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè îò âðåìåíè.
Àêòèâíîñòü ôåðìåíòîâ â ëèçèñå êëåòîê
S. enteritidis ïîêàçûâàëè òàêæå ìèêðîáèîëîãè÷åñêèå òåñòû.
1. Ïîÿâëåíèå çîíû ëèçèñà (çîíà ïðîñâåòëåíèÿ) â
ìåñòå êîíòàêòà ýíäîëèçèíà SPZ7 ñ ãàçîíîì êóëüòóðû
êëåòîê.  òèïè÷íîì ýêñïåðèìåíòå íà ÷àøêó Ïåòðè ñ
ãàçîíîì íî÷íîé êóëüòóðû S. enteritidis (109 ÊÎÅ/ìë)
íàíîñèëè 20 ìêë ðàñòâîðà ýíäîëèçèíà, îñòàâëÿëè èíêóáèðîâàòüñÿ â òå÷åíèå 6 ÷ ïðè 37°Ñ, íàáëþäàëè ïîÿâëåíèå çîíû ïðîñâåòëåíèÿ â ìåñòå êîíòàêòà ôåðìåíòà ñ ãàçîíîì êëåòîê.  êîíòðîëüíîì ýêñïåðèìåíòå äîáàâëÿëè 20 ìêë áóôåðíîãî ðàñòâîðà, îñòàâëÿëè
223
èíêóáèðîâàòüñÿ â òå÷åíèå 6 ÷ ïðè 37°Ñ, íàáëþäàëè
îòñóòñòâèå çîíû ïðîñâåòëåíèÿ.
2. Èçó÷åíèå äèíàìèêè ëèçèñà êëåòîê ïîä äåéñòâèåì ýíäîëèçèíà SPZ7 ïóòåì ïîäñ÷åòà êîëè÷åñòâà âûðîñøèõ êîëîíèé.  òèïè÷íîì ýêñïåðèìåíòå èç ñóñïåíçèè êëåòîê S. enteritidis (109 ÊÎÅ/ìë) â ïðèñóòñòâèè è â îòñóòñòâèå ôåðìåíòà ÷åðåç îïðåäåëåííûå
ïðîìåæóòêè âðåìåíè îòáèðàëè ïðîáû (ïî 0,1 ìë), ïåðåíîñèëè íà ÷àøêó Ïåòðè ñ ïèòàòåëüíîé ñðåäîé;
÷àøêè èíêóáèðîâàëè ïðè 37°Ñ, êîëè÷åñòâî âûðîñøèõ
êîëîíèé ïîäñ÷èòûâàëè ÷åðåç 24 ÷.
Èçó÷åíèå âëèÿíèÿ ýôôåêòîðîâ íà àêòèâíîñòü
ýíäîëèçèíà SPZ7
Èñõîäíûå ðàñòâîðû ýôôåêòîðîâ (1–5% ïî ìàññå)
ãîòîâèëè â 1 ìë áóôåðà äëÿ èçìåðåíèÿ àêòèâíîñòè
ýíäîëèçèíà ìåòîäîì ïîñëåäîâàòåëüíîãî ðàçâåäåíèÿ
äî ðàçíûõ êîíöåíòðàöèé îò 0,1 äî 10–4 %.  òèïè÷íîì ýêñïåðèìåíòå â êþâåòó îáúåìîì 0,5 ìë äîáàâëÿëè 430 ìêë áóôåðà äëÿ èçìåðåíèÿ àêòèâíîñòè, 7 ìêë
ñóñïåíçèè êëåòîê E. coli, 50 ìêë ðàñòâîðà ýôôåêòîðà.
Êþâåòó ïîìåùàëè â òåðìîñòàòèðóìîå êþâåòíîå îòäåëåíèå ñïåêòðîôîòîìåòðà (37°Ñ) è âûæèäàëè íåñêîëüêî ìèíóò äëÿ òîãî, ÷òîáû ñîäåðæèìîå êþâåòû
ïðîãðåëîñü, çàòåì ðåãèñòðèðîâàëè ôîíîâîå çíà÷åíèå
ëèçèñà. Ïîñëå ýòîãî â êþâåòó äîáàâëÿëè 3 ìêë ðàñòâîðà áàêòåðèîëèòè÷åñêîãî ôåðìåíòà è ðåãèñòðèðîâàëè ôåðìåíòàòèâíóþ àêòèâíîñòü ïî èçìåíåíèþ ïîãëîùåíèÿ ïðè äëèíå âîëíû 650 íì.
Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå
Îòìåòèì, ÷òî áàêòåðèîôàã SPZ7 è ýíäîëèçèí ôàãà
ïðîÿâëÿþò âûñîêóþ ëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü â îòíîøåíèè êàê S. enteritidis N60 (êëåòêà-“õîçÿèí”), òàê è ðåçèñòåíòíûõ ê ðèôàìïèöèíó êëåòîê S. enteritidis Rif
N92, íåêîòîðûõ øòàììîâ S. typhimurium (N204, N423/
80 è äð.), S. choleraesuis sp. è ò.ä. Êàê âèäíî èç
ðèñ. 1, íà ãàçîíå ñ êóëüòóðîé S. enteritidis N60 â ïðèñóòñòâèè ôåðìåíòà ïîÿâëÿåòñÿ çîíà ïðîñâåòëåíèÿ (ëèçèñà) (ðèñ. 1, à), åå îòñóòñòâèå çàôèêñèðîâàíî ïðè äîáàâëåíèè áóôåðíîãî ðàñòâîðà â îòñóòñòâèå ôåðìåíòà
(ðèñ. 1, á). Èçó÷åíèå äèíàìèêè ëèçèñà êëåòîê â ïðèñóòñòâèè ýíäîëèçèíà (ðèñ. 1, â) âî âðåìåíè ïîêàçàëî
ñóùåñòâåííîå óìåíüøåíèå êîíöåíòðàöèè êëåòîê â ñóñïåíçèè S. enteritidis N60 (êðèâàÿ 1) ïî ñðàâíåíèþ ñ
êîíòðîëåì â îòñóòñòâèå ôåðìåíòà (êðèâàÿ 2). Îäíàêî,
êàê âèäíî, ïðîöåññ äîâîëüíî äëèòåëåí âî âðåìåíè è íå
ïðèâîäèò ê ïîëíîìó ëèçèñó êëåòîê ïàòîãåíà.
 ñâÿçè ñ âûøåñêàçàííûì ìû ïðîâåëè èññëåäîâàíèå äåéñòâèÿ ýôôåêòîðîâ ðàçíîé ïðèðîäû íà êà-
224
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2010. Ò. 51. ¹ 3
Ðèñ. 1. Ìèêðîáèîëîãè÷åñêèå òåñòû ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7:
â – äèíàìèêà ëèçèñà êëåòîê S. enteritidis N60 âî âðåìåíè, âûðàæåííàÿ êàê ÷èñëî êîëîíèé (log
ÊÎÅ/ìë) â ïðîáàõ, îòîáðàííûõ èç ñóñïåíçèè êëåòîê â ïðèñóòñòâèè (1) è â îòñóòñòâèå (2)
ôåðìåíòà; à è á – ãàçîí êëåòîê S. enteritidis N60 ïîñëå äîáàâëåíèÿ 20 ìêë áóôåðíîãî ðàñòâîðà â ïðèñóòñòâèè (à) è â îòñóòñòâèå (á) ôåðìåíòà è èíêóáèðîâàíèÿ â òå÷åíèå 6 ÷ ïðè 37°Ñ
òàëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà ôàãà SPZ7.
Êàê îòìå÷àëîñü âûøå, ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûå âåùåñòâà (ÏÀÂ) ìîãóò âëèÿòü íà ïðîíèöàåìîñòü áèîëîãè÷åñêèõ ìåìáðàí. Ñïîñîáíîñòü âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ ÏÀÂ, ïëþðîíèêîâ ñ áîëüøèì ãèäðîôîáíûì áëîêîì, ê ðàçóïîðÿäî÷èâàíèþ áèñëîéíûõ ìåìáðàí îòìå÷àëàñü â ðàáîòàõ [18–19]. Äëÿ èçó÷åíèÿ âëèÿíèÿ
íà àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà ìû èñïîëüçîâàëè êàê ãèäðîôèëüíûå (F127, F108), òàê è ãèäðîôîáíûå (L61,
P85, L101) ñîåäèíåíèÿ. Äëÿ âñåõ èñïîëüçîâàííûõ
ñîåäèíåíèé íàáëþäàëèñü ÿâíî âûðàæåííûå çàâèñèìîñòè àêòèâíîñòè ôåðìåíòà îò êîíöåíòðàöèè ýôôåêòîðà, áîëüøèé ýôôåêò â îïòèìóìå ïðîÿâëÿëñÿ â ïðèñóòñòâèè áîëåå ãèäðîôîáíûõ ìîëåêóë.  êà÷åñòâå
ïðèìåðà íà ðèñ. 2 ïðåäñòàâëåíû äàííûå äëÿ L101
(ðèñ. 2, à) è P85 (ðèñ. 2, á). Êàê âèäíî, ïðè óâåëè÷åíèè êîíöåíòðàöèè ïëþðîíèêà L101 íàáëþäàåòñÿ
ñóùåñòâåííîå ïîâûøåíèå àêòèâíîñòè ôåðìåíòà
(ïðåäåëüíàÿ âåëè÷èíà îïðåäåëÿåòñÿ îãðàíè÷åííîé
ðàñòâîðèìîñòüþ äàííîãî ñîåäèíåíèÿ â âîäíîì áóôåðíîì ðàñòâîðå); çàâèñèìîñòü àêòèâíîñòè ýíäîëèçèíà îò êîíöåíòðàöèè P85 èìååò âèä êðèâîé ñ îïòèìóìîì. Àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà â áóôåðíîì ðàñòâîðå â îòñóòñòâèå äîïîëíèòåëüíûõ ñîåäèíåíèé, ïðèíÿòàÿ çà 100%, îáîçíà÷åíà íà ðèñ. 2 áåëûì ñòîëáèêîì. Àíàëîãè÷íûå çàâèñèìîñòè áûëè ïîëó÷åíû äëÿ
ýôôåêòîðîâ äðóãèõ êëàññîâ: êîëèñòèíà (ñìåñü öèêëè÷åñêèõ ïîëèïåïòèäîâ), ëèçîöèìà (ôåðìåíò – ìóðî-
ìèäàçà) è äð. Ëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà
áûëà ïðîâåðåíà êàê íà êëåòêàõ S. enteritidis N60,
òàê è E. coli TG1. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî èñïîëüçóåìûé â ðàáîòå êîëèñòèí îòíîñèòñÿ ê ïåïòèäíûì àíòèáèîòèêàì, îáëàäàþùèì áàêòåðèöèäíûì äåéñòâèåì, íî â äàííîé ðàáîòå áûëè âçÿòû âåñüìà íèçêèå
åãî êîíöåíòðàöèè (íåñêîëüêî ìêã/ìë), íå âûçûâàþùèå ñóùåñòâåííîãî óâåëè÷åíèÿ ôîíîâîãî ëèçèñà áàêòåðèàëüíûõ êëåòîê èëè ïîäàâëåíèÿ èõ ðîñòà. Àíàëîãè÷íî ëèçîöèì êóðèííîãî ÿéöà â îòñóòñòâèå ýíäîëèçèíà ôàãà SPZ7 è ñàì âûçûâàë óñèëåíèå ëèçèñà êëåòîê S. enteritidis N60 è E. coli TG1, îäíàêî âìåñòå
äâà ôåðìåíòà äåéñòâîâàëè ñóùåñòâåííî áîëåå ýôôåêòèâíî, ÷åì ïî îòäåëüíîñòè. Íà ðèñ. 3 ïðåäñòàâëåíû ñðàâíèòåëüíûå äàííûå ïî âëèÿíèþ îïòèìàëüíûõ
êîíöåíòðàöèé ðàçíûõ ýôôåêòîðîâ íà êàòàëèòè÷åñêóþ
àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà ôàãà SPZ7 â ëèçèñå êëåòîê E.
coli TG1 (àíàëîãè÷íûå äàííûå ïîëó÷åíû è äëÿ S.
enteritidis N60). Êàê âèäíî, àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà â
ïðèñóòñòâèè ýôôåêòîðîâ âîçðàñòàåò â 1,5–3 ðàçà.
Çàêëþ÷åíèå
Òàêèì îáðàçîì, â ðàáîòå èçó÷åíû âîçìîæíîñòè
ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7 â
ëèçèñå ãðàìîòðèöàòåëüíûõ áàêòåðèé “ñíàðóæè”. Âûÿâëåíî ñóùåñòâåííîå ïîâûøåíèå àêòèâíîñòè ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7 â ëèçèñå êëåòîê S.
enteritidis N60 è E. coli TG1 â ïðèñóòñòâèè âûñîêî-
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2010. Ò. 51. ¹ 3
225
Ðèñ. 2. Âëèÿíèå ïëþðîíèêîâ L101 (à) è P85 (á) íà êàòàëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7 â
ëèçèñå êëåòîê E. coli øòàìì TG1 ïðè ðàçíîé êîíöåíòðàöèè (%) ýôôåêòîðîâ: 2à – 10–3, 3à – 10–2, 4à – 10–1;
2á – 10–4, 3á – 10–3, 4á – 10–2, 5á – 10–1; 1à, 1á – êîíòðîëü, àêòèâíîñòü ôåðìåíòà â îòñóòñòâèå ýôôåêòîðîâ. Óñëîâèÿ
ýêñïåðèìåíòà: 20 ìÌ òðèñ-HCl áóôåð (ðÍ 8,5), 37°Ñ, èñõîäíàÿ êîíöåíòðàöèÿ êëåòîê ñîîòâåòñòâîâàëà 0,65 åäèíèö
ïîãëîùåíèÿ ïðè 650 íì, êîíöåíòðàöèÿ ôåðìåíòà â êþâåòå 1,2 ìêã/ìë
Ðèñ. 3. Âëèÿíèå ýôôåêòîðîâ íà êàòàëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü ýíäîëèçèíà áàêòåðèîôàãà SPZ7 â ëèçèñå êëåòîê E. coli øòàìì TG1. Ñëåâà íàïðàâî: 1 – êîíòðîëü, 2 – 0,01% P85, 3 – 120 íã/ìë ëèçîöèì, 4 – 0,1% L101, 5 – 0,01% F127, 6
– 25 ìêã/ìë êîëèñòèí. Àêòèâíîñòü ïðåäñòàâëåíà â % ïî îòíîøåíèþ ê êîíòðîëþ. Êîíòðîëü – àêòèâíîñòü ôåðìåíòà â áóôåðíîì ðàñòâîðå â îòñóòñòâèå ýôôåêòîðîâ. Óñëîâèÿ ýêñïåðèìåíòà: 20 ìÌ òðèñ-HCl áóôåð (ðÍ 8,5), 37°Ñ, èñõîäíàÿ
êîíöåíòðàöèÿ êëåòîê ñîîòâåòñòâîâàëà 0,65 åäèíèö ïîãëîùåíèÿ ïðè 650 íì,
êîíöåíòðàöèÿ ôåðìåíòà â êþâåòå 1,2 ìêã/ìë
ìîëåêóëÿðíûõ ÏÀÂ, ïëþðîíèêîâ ñ êðóïíûì ãèäðîôîáíûì áëîêîì, ëèçîöèìà êóðèíîãî ÿéöà, à òàêæå
íèçêèõ êîíöåíòðàöèé ïåïòèäíîãî àíòèáèîòèêà êîëèñòèíà. Ðàçðàáîòàííûé ïîäõîä ìîæåò ÿâëÿòüñÿ ïåðñïåê-
òèâíûì â ïîâûøåíèè ýôôåêòèâíîñòè äåéñòâèÿ ëåêàðñòâåííûõ àíòèáàêòåðèàëüíûõ ïðåïàðàòîâ íà îñíîâå
ôåðìåíòîâ áàêòåðèîôàãîâ â áîðüáå ñ ãðàìîòðèöàòåëüíûìè ìèêðîîðãàíèçìàìè.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå ïðîãðàììû IPP (Project agreement 82032-AK2).
ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
1. Hermoso J.A., Garcia J.L., Garcia P. // Current Opinion in
Microbiol. 2007. 10. P. 461.
2. Fischetti V.A. // Current Opinion in Microbiol. 2008. 11. P. 393.
3. Coffey B., Mills S., Coffey A., McAuliffe O., Ross R.P. //Annu.
Rev. Food Sci. Technol. 2010. 1. P. 449.
4. Ìèðîøíèêîâ Ê.À., ×åðòêîâ Î.Â., Íàçàðîâ Ï.À., Ìåñÿíæèíîâ Â.Â. // Óñï. áèîë. õèì. 2006. 46. Ñ. 65.
226
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2010. Ò. 51. ¹ 3
5. Fischetti V.A. // Trends in Microbiol. 2005. 13. P. 491.
6. Loessner M.J. // Curr. Opin. Microbiol. 2005. 8. P. 480.
7. Lopez R., Garcia E., Garcia P. // Drug Discovery Today: Ther.
Strategies. 2004. 1. P. 469.
8. Borysowski J., Weber-Dabrowska B., Gorski A. // Exp. Biol.
and Med. 2006. 231. P. 366.
9. Nelson D., Loomis L., Fischetti V.A. // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2001. 98. P. 4107.
10. Becker S.C., Foster-Frey J., Stodola A.J., Anacker D.,
Donovan D.M. // Gene. 2009. 443. P. 32.
11. Êëÿ÷êî Í.Ë., Äìèòðèåâà Í.Ô., Åùèíà À.Ñ., Èãíàòåíêî
Î.Â., Ôèëàòîâà Ë.Þ., Ðàéíèíà Å.È., Êàçàðîâ À.Ê., Ëåâàøîâ À.Â. // Áèîîðã. õèìèÿ 2008. 34. Ñ. 416.
12. Ôèëàòîâà Ë.Þ., Áåêêåð Ñ.Ê., Äîíîâàí Ä.M., Ãëàäèëèí À.Ê., Êëÿ÷êî Í.Ë. //Âåñòí. Ìîñê. óí-òà. Ñåð. 2. Õèìèÿ.
2009. 50. C. 472.
13. Wang I.-N., Smith D.L., Young R. // Annu. Rev. Microbiol.
2000. 54. P. 799.
14. Rydman P.S., Bamford D.H. // J. Bacteriol. 2002. 184. P. 104.
15. Franklin T.J., Snow G.A. Biochemistry and molecular biology of
antimicrobial drug action. 5th edition. Kluwer, Dordrecht. 1998.
16. Unala R., Yousef A.E., Dunnec C.P. // Innovative Food
Science & Emerging Technologies. 2002. 3. P. 247.
17. Cornett J.B., Shockman G.D. // J. Bacteriology. 1978. 135.
P. 153.
18. Melik-Nubarov N., Krylova O. //Adv. Planar Lipid Bilayers &
Liposomes. 2005. 2. P. 5.
19. Erukova V.Yu., Krylova O.O., Antonenko Y.N., MelikNubarov N.S. // Biochim. Biophys. Acta – Biomembranes.
2000. 1468. P. 73.
20. Breukink E., Wiedemann I., van Kraaij C., Kuipers O.P.,
Sahl H.-G., de Kruijff B. // Science. 1999. 286. P. 2361.
21. Hyde A.J., Parisot J., McNichol A., Bonev B.B. // PNAS. 2006.
103. P. 19896.
22. Ginsburg I. // Medical hypotheses. 2004. 62. P. 367.
23. Ïîïîâà Â.Ì., Êèñåëåâà Í.Â., Êëÿ÷êî Í.Ë., Æèëåíêîâ Å.Ë.,
Êîïûëîâ Ï.Õ., Äÿòëîâ È.À., Ëåâàøîâ Ï.À., Ëåâàøîâ À.Â. //
Ìàòåð. VII Ìåæãîñ. íàó÷íî-ïðàêò. êîíô. «×ðåçâû÷àéíûå
ñèòóàöèè ìåæäóíàðîäíîãî çíà÷åíèÿ â îáùåñòâåííîì
çäðàâîîõðàíåíèè â ðåøåíèÿõ Ñàíêò-Ïåòåðáóðãñêîãî ñàììèòà “Ãðóïïû Âîñüìè” è ñàíèòàðíàÿ îõðàíà òåððèòîðèé
ãîñóäàðñòâ ó÷àñòíèêîâ ÑÍû. Îáîëåíñê, 2006
24. Levashov P.A., Popova V.M., Popov D.V., Zhilenkov E.L.,
Dyatlov I.A., Klyachko N.L., Levashov A.V. // Proc. Int.
Conference Biocatalysis-2007. 2007. P. 111.
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 20.01.10
ENDOLYSIN OF BACTERIOPHAGE SPZ7: THE EFFECT OF “HELPERS”
ON THE ENZYME LYTIC ACTIVITY TOWARDS GRAM-NEGATIVE
MICROORGANISMS
N.L. Klyachko, S.A. Legotsky, P.A. Levashov, V.M. Popova, A. Timasheva,
N.G. Belogurova, I.A.Dyatlov, A.V. Levashov
(M.V. Lomonosov Moscow State University, Faculty of Chemistry, Department of Chemical
Enzymology, Moscow, Russia; State Research Center for Applied Microbiology and
Biotechnology, Moscow Region, Obolensk, Russia)
Bacteriophage SPZ7 endolysin functioning in the lysis of gram-negative bacteria from “outside”
was studied. Significant (1.5–3 times) increase of endolysin activity towards S. enteritidis N60
and E. coli TG1 was shown in the presence of high molecular surfactants, pluronics, with large
hydrophobic block; hen egg lysozyme, and peptide antibiotics, colistin in low concentrations. An
approach developed can be an important for increasing an efficiency of pharmaceutical
antibacterial preparations based on bacteriophage enzymes working against gram-negative
microorganisms.
Key words: bacteriophage endolysin, antibacterials, lytic activity, gram-negative
bacteria, Salmonella, E. coli, effectors, “helpers”.
Ñâåäåíèÿ îá àâòîðàõ: Êëÿ÷êî Íàòàëüÿ Ëüâîâíà – ïðîôåññîð êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ, äîêò. õèì. íàóê (klyachko@enzyme.chem.msu.ru); Ëåãîöêèé Ñåðãåé Àëåêñàíäðîâè÷ – àñïèðàíò êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ; Ëåâàøîâ Ïàâåë Àíäðååâè÷ – ñò. íàó÷.
ñîòð. êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ, êàíä. õèì. íàóê; Ïîïîâà Âàëåíòèíà
Ìèõàéëîâíà – ñò. íàó÷. ñîòð., ðóêîâîäèòåëü ãðóïïû áàêòåðèîôàãèè Ãîñóäàðñòâåííîãî íàó÷íîãî öåíòðà ïðèêëàäíîé ìèêðîáèîëîãèè è áèîòåõíîëîãèè, êàíä. ìåä. íàóê; Òèìàøåâà Àííà Âëàäèìèðîâíà – ìàãèñòðàíò
êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ; Áåëîãóðîâà Íàòàëüÿ Ãåîðãèåâíà – äîöåíò
êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ, êàíä. õèì. íàóê; Äÿòëîâ Èâàí Àëåêñååâè÷ –
äèðåêòîð Ãîñóäàðñòâåííîãî íàó÷íîãî öåíòðà ïðèêëàäíîé ìèêðîáèîëîãèè è áèîòåõíîëîãèè, ïðîôåññîð, äîêò.
ìåä. íàóê; Ëåâàøîâ Àíäðåé Âàäèìîâè÷ – ïðîôåññîð êàôåäðû õèìè÷åñêîé ýíçèìîëîãèè õèìè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ, äîêò. õèì. íàóê.