Механизмы биосинтеза антибиотиков и их действие на клетки

Р. А. ЖЕЛДАКОВА
Механизмы биосинтеза антибиотиков
и их действие на клетки микроорганизмов
Учебно-методический комплекс
Минск
2004
УДК 615.779.9:576.809.8(075.8)+574.6(075.8)
ББК 28.072р.я735+28.4р.я73+30.16р.я73
Ж50
Рекомендовано Ученым советом
биологического факультета
10 ноября 2003 г., протокол № 3
Р е ц е н з е н т ы:
кандидат биологических наук, доцент Н. М. Орел;
кандидат биологических наук, доцент М. А. Титок
Желдакова Р. А.
Ж50
Механизмы биосинтеза антибиотиков и их действие на клетки микроорганизмов: Учеб.-метод. комплекс для студентов специальности 1-31 01 01 «Биология» / Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ,
2004. – 111 с.
ISBN 985-485-099-4.
Рассмотрены основные принципы выделения продуцентов антибиотических веществ, условия их биосинтеза и действие, формирование у микроорганизмов механизмов резистентности к антибиотикам, а также факторы их
распространения.
В учебно-методический комплекс включены указания к лабораторным
работам, программа курса, тестовые задания.
Предназначено для студентов III и IV курсов дневного отделения,
V курса заочного отделения специальности 1-31 01 01 «Биология».
УДК 615.779.9:576.809.8(075.8)+574.6(075.8)
ББК 28.072р.я735+28.4р.я73+30.16р.я73
ISBN 985-485-099-4
© Желдакова Р. А., 2004
© БГУ, 2004
СОДЕРЖАНИЕ
I. Лекции по курсу «Механизмы биосинтеза антибиотиков
и их действие на клетки микроорганизмов» ............................................................. 3
1. История развития представлений об антимикробных средствах
и химиопрепаратах ................................................................................................. 3
2. Понятие «антибиотик». Качественные
и количественные аспекты действия антибиотиков на клетки патогенов......... 7
3. Классификация антибиотиков.............................................................................. 17
4. Образование антибиотиков в естественных условиях....................................... 20
5. Клеточная мембрана и вещества, нарушающие ее целостность ...................... 27
6. Антибиотики – ингибиторы функционирования клеточной мембраны .......... 31
7. Антибиотики, ингибирующие процессы образование клеточной стенки
бактерий.................................................................................................................. 36
8. Антибиотики, ингибирующие процессы биосинтеза белка.............................. 52
9. Антибиотики – ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК........... 70
10. Промышленное получение антибиотиков .......................................................... 82
11. Значение продукции антибиотиков для штаммов-продуцентов.
Дифференцировка микроорганизмов и синтез антибиотиков .......................... 87
12. Применение антибиотиков в сельском хозяйстве, пищевой
и консервной промышленности ........................................................................... 91
II. Программа курса ......................................................................................................... 94
III. Методические указания к лабораторным занятиям .......................................... 97
Занятие 1..................................................................................................................... 97
Занятие 2..................................................................................................................... 98
Занятие 3..................................................................................................................... 99
Занятие 4................................................................................................................... 100
Занятие 5................................................................................................................... 100
Занятие 6................................................................................................................... 101
IV. Тестовые задания ..................................................................................................... 105
Приложение ..................................................................................................................... 106
I. ЛЕКЦИИ ПО КУРСУ
«МЕХАНИЗМЫ БИОСИНТЕЗА АНТИБИОТИКОВ
И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТКИ
МИКРООРГАНИЗМОВ»
1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ
ОБ АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВАХ
И ХИМИОПРЕПАРАТАХ
Не многие события в истории медицины оказали такое влияние на
жизнь человека и общества, как открытие возможности контролировать
инфекции, вызываемые микроорганизмами. Однако следует указать, что
некоторые дезинфицирующие вещества применялись задолго до выявления механизмов их действия. Первым термином, характеризующим такие соединения, был, вероятно, «антисептик», введенный Дж. Принглем
в 1750 году для обозначения веществ, предотвращающих гниение. Однако широкое распространение антисептиков началось лишь в XIX веке
(водный раствор хлорида и гипохлорида натрия стал использоваться в
1825 году, а настойка иода – в 1839 году). Практическому внедрению антисептиков в значительной степени способствовала настойчивость английского хирурга Дж. Листера, который первым стал использовать 2,5 %
раствор фенола для обработки рук хирурга, а 5 % − для стерилизации хирургических инструментов и помещений. Однако даже в этом случае
можно говорить лишь об эмпирическом использовании антисептических
средств, без знания механизмов их действия, в силу чего этот период получил название эмпирической химиотерапии.
Работы Л. Пастера о микробной природе брожения, а также Р. Коха,
который усовершенствовал методы выделения чистых культур, выращивания бактерий на плотных средах и предложил способы проведения исследований в стерильных условиях, обеспечили возможность изучения действия на микроорганизмы антисептиков и дезинфицирующих веществ. Наиболее важный вывод из экспериментальных данных этого периода – необходимость создания условий, в которых будет невозможно заражение.
3
Основополагающими работами, которые использовали научный
подход к проблеме химиотерапии инфекционных заболеваний, стали исследования П. Эрлиха, опубликованные в 1897 году, а в период с 1902 по
1912 год им были сформулированы почти все концепции, которые легли
в основу последующего изучения антимикробных агентов. Его первые
идеи возникли при работе с прижизненными красителями, избирательно
поглощаемыми живыми клетками. Основываясь на работах Р. Коха о лечебном действии оксида мышьяка при терапии трипаносомоза, П. Эрлих
синтезировал другие родственные соединения и исследовал их активность. В 1910 году им был создан лекарственный препарат сальварсан,
получивший широкое применение в лечении сифилиса.
П. Эрлихом был предложен и сам термин «химиотерапия» для обозначения химических соединений, с помощью которых можно бороться с
инфекционными болезнями. Впоследствии были сформулированы основные принципы этого научного направления. Во-первых, было постулировано, что лекарственные препараты должны связываться с определенными рецепторами, имеющимися на поверхности клеток. Данное положение нашло свое отражение в современных представлениях о механизмах транспорта лекарств через клеточные мембраны. Во-вторых, было постулировано, что химиотерапевтическое соединение должно обладать двумя функциональными особенностями: иметь участок связывания, или «гаптофор», обеспечивающий взаимодействие с рецепторами
клеток; и «токсофор» − токсичную группировку, обусловливающую воздействие на клетку. В-третьих, П. Эрлих установил важность количественных измерений соотношения между дозой соединения, достаточной
для лечебного эффекта и оказывающей токсическое действие. Им были
введены такие понятия, как максимально переносимая доза (ДТ), минимальная лечебная доза (ДС), а их соотношение (ДТ/ДС) получило название химиотерапевтического индекса. Малотоксичные и нетоксичные
препараты имеют индекс больше 1; если эта величина равна или меньше
1, то препарат является токсичным или высокотоксичным.
П. Эрлих предложил и стратегию поиска новых лекарственных препаратов. Один из подходов – проведение испытания большого числа различных химических соединений в относительно простом биологическом
тесте для установления связи биологической активности с тем или иным
типом химической структуры. Второй метод, предложенный ученым, заключался в направленном синтезе химических соединений, обладающих
нужной антимикробной активностью. Любое улучшение антимикробных
свойств (расширение спектра действия, снижение токсичности и др.)
может быть использовано для получения наилучшей из возможных химических структур. П. Эрлих также считал, что соединения, действую4
щие на возбудителей инфекции, не обязательно должны вызывать гибель
последних. Вполне достаточным может быть предотвращение его размножения, а в дальнейшем природные защитные механизмы организмахозяина (клеточные и гуморальные факторы иммунитета) справятся с
чужеродными организмами.
П. Эрлих обратил внимание и на проблему устойчивости микроорганизмов к химиотерапевтическим соединениям. На основании различной чувствительности трипаносом к гистологическим красителям был
сделан вывод о наличии у клеток различных рецепторов для взаимодействия с ними. В случае устойчивости и меньшего накопления красителя
внутри клеток происходит снижение сродства между рецепторами и красителем. Важность научных выводов П. Эрлиха и сформулированных им
основных положений теории химиотерапии позволяет назвать данный
этап периодом научной химиотерапии.
В 1935 году появилось сообщение Г. Домагка об эффективности
пронтозила красного (красный стрептоцид) при терапии бактериальных
инфекций, вызванных грамположительными кокками. Оказалось, что в
организме данное соединение распадается с образованием сульфаниламида, который и является эффективным антибактериальным агентом. В
дальнейшем были синтезированы другие производные сульфаниламидов
(этазол, фталазол), которые успешно используются до настоящего времени. Однако и сейчас достигнуто относительно мало в создании и использовании синтетических препаратов для терапии инфекционных заболеваний: синтетическими, например, являются производные 8-оксихинолина, нитрофурановые соединения и некоторые другие. Этот период
развития иссследований, посвященный обнаружению синтетических антимикробных препаратов, получил название сульфаниламидотерапии и
продолжался примерно до 1940 года, когда был получен в кристаллическом виде первый антибиотик – пенициллин.
История открытия антибактериальных свойств пенициллина является увлекательной сама по себе и стала классическим примером для молодых исследователей. В 1929 году А. Флеминг обнаружил факт задержки
роста стафилококков в присутствии плесени Penicillium notatum, и вещество, которое вызывало такой эффект, было названо пенициллином. Однако только в 1939−1940 годах Г. Флори и Э. Чейну удалось получить
это вещество в неочищенном кристаллическом, но высокоактивном виде
и продемонстрировать его активность in vitro. Данные исследования следует рассматривать как величайшие в медицине и биологии. Именно они
послужили основой для возникновения такой отрасли знания, как учение
об антибиотиках, заложили основы создания медицинской промышленности и промышленного получения антибиотиков.
5
Многие исследователи занимались проблемой поиска новых антибиотических препаратов. Следует отметить работы С. Ваксмана, которые
привели к обнаружению и выделению стрептомицина. К 1940 году были
известны пять антибиотиков: микофеноловая кислота (1896 год, Б. Гозио), пиоционаза (1899 год, Р. Эммерих и О. Лоу), актиномицетин (1937
год, М. Вельш), мицетин (1939 год, А. Красильников) и тиротрицин
(1939 год, Р. Дюбо). Этот этап развития учения об антибиотиках получил
название периода антибиотикотерапии.
Трудно оценить количество известных в настоящее время веществ с
антимикробной активностью, отметим лишь, что ежегодно на цели их
изыскания выделяются огромные средства. Рассмотрим причины столь
пристального внимания к ним:
1. Многие антибиотические вещества или продукты их модификации – незаменимые лечебные препараты, широко применяемые при лечении инфекционных заболеваний, которые считались ранее либо неизлечимыми, либо характеризовались высокой летальностью.
2. В последние годы изменилась этиологическая структура ряда инфекций: число видов бактерий, вызывающих их, достигло 3000. Вместе с
тем грамотрицательные бактерии характеризуются более высокой степенью устойчивости к антибиотикам в этиологии инфекционных заболеваний, что предполагает поиск новых антибиотиков и увелечение их выпуска.
3. Антибиотики необходимы в сельском хозяйстве как лечебные
препараты, а также как стимуляторы роста животных. Кроме того, некоторые антибиотики применяются в пищевой промышленности в качестве
консервантов скоропортящейся продукции.
4. Проблема возникновения и широкого распространения резистентных к антибиотикам форм микроорганизмов ставит задачу замены
одних антибиотиков другими, более эффективными.
5. Антибиотики широко применяются в научных исследованиях,
при изучении отдельных сторон метаболизма организмов, расшифровке
тонких молекулярных механизмов биосинтеза белка, функционирования
клеточных структур и т. п.
6. Изучение химической структуры и путей образования антибиотиков представляет интерес для специалистов в области химии природных
соединений, способствует исследованию механизмов биосинтетической
деятельности штаммов-продуцентов, раскрытию основных этапов их физиологии и др.
Столь широкое использование множества химических соединений,
наделенных антибиотической активностью, позволяет назвать XXI век
6
периодом комбинированной химиотерапии. В клинике используется около 200 антибиотиков как индивидуальных средств и примерно в 10 раз
больше их лекарственных форм (в виде таблеток, мазей, суспензий, порошков и др.). Среди всех групп лекарственных веществ антибиотики
занимают первое место по жизненной необходимости.
В целом понятие «химиотерапевтические средства» (или вещества),
к числу которых относятся антибиотики, антисептики, дезинфектанты,
означает чужеродные для организма соединения, которые при введении в
организм оказывают губительное воздействие на возбудителя инфекции,
уничтожая его или резко снижая патогенное влияние. Если эти средства
применяются до начала развития инфекции, то говорят о химиопрофилактике, если при уже развившейся инфекции, то имеют в виду химиотерапию – теорию и практику использования химических средств специфического действия в комплексном лечении заболеваний, вызванных
соответствующим возбудителем.
Эффект комбинированного применения терапевтических средств
может проявляться в форме синергизма, антагонизма и индифферентности. Под синергизмом понимают возрастание противомикробного эффекта при комбинации двух препаратов как в отношении дозы, так и в отношении ожидаемого эффекта по сравнению с использованием каждого
из них по отдельности. Антагонизм – снижение антимикробной активности одного препарата при добавлении другого. Индифферентность – явление более частое, чем предыдущие два, и в этом случае комбинация
химиотерапевтических средств не превышает эффектов каждого из них
или же представляет собой их арифметическую сумму. Вещества, действующие на микроорганизмы, должны удовлетворять следующим требованиям клиники:
• активность в отношении одного или нескольких возбудителей;
• хорошее всасывание и распределение в организме;
• низкая токсичность или ее полное отсутствие.
2. ПОНЯТИЕ «АНТИБИОТИК».
КАЧЕСТВЕННЫЕ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ АСПЕКТЫ
ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ НА КЛЕТКИ ПАТОГЕНОВ
Впервые термин «антибиотик» (буквальный перевод – «против жизни») ввел в употребление С. Ваксман в 1942 году. Однако до сих пор в
литературе встречаются как более широкие, так и более узкие определения этого понятия. Учитывая все биологические особенности и свойства
7
химической структуры этих соединений, можно остановиться на следующем определении. Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусам, бактериям, грибам, водорослям и простейшим) или
клеткам злокачественных опухолей, избирательно задерживающие рост
или полностью подавляющие их развитие.
Характеризуя антибиотики как химические соединения, следует отметить следующие их особенности:
• молекулярная масса антибиотиков составляет от 150 до 5000 Д;
• молекулы антибиотиков состоят из углерода и водорода, или же из
углерода, водорода, азота и кислорода, в некоторых случаях имеются
атомы серы, фосфора или галогенов;
• в молекуле антибиотиков представлены практически все известные в органической химии группировки: карбоксильные, карбонильные,
циклические, ароматические и др.;
• все антибиотики могут быть получены в кристаллическом виде.
Строго говоря, к антибиотикам следует отнести и полусинтетические производные, полученные либо путем химической модификации
природных антибиотиков или продуктов метаболизма организмов, либо
продукты, полученные в результате их микробиологической трансформации.
С биологической точки зрения антибиотики относятся к вторичным
метаболитам клетки. Это значит, что они синтезируются на определенной
стадии развития культуры-продуцента и их образование не является обязательным для клетки. Представления о двухфазности микробиологического синтеза вторичных метаболитов свидетельствуют, что в первую фазу (ростовую, или трофофазу) происходит накопление относительно окисленных соединений клетки, интенсивный синтез белков, нуклеиновых кислот, углеводов, ферментов, а во время второй (продуктивной, или идиофазы) имеет место синтез антибиотиков. Среди других биологических
особенностей образования антибиотиков можно отметить следующие:
1) большинство антибиотиков являются вторичными метаболитами
трех главных групп организмов: эубактерий, актиномицетов, грибов.
Немногие антибиотики образуются высшими грибами, водорослями и
растениями, причем обычно такие антибиотики характеризуются малой
специфичностью биологического действия;
2) наиболее разнообразные антибиотики образуются актиномицетами (не менее 50 % из всех известных), мицелиальными грибами (около
10 %), из эубактерий наиболее часто продуцентами являются представи8
тели родов Bacillus и Pseudomonas (около 400−600), причем большинство
антибиотиков бактериального происхождения – полипептиды;
3) очень часто определенный штамм образует семейство сходных
по структуре и одинаково синтезируемых антибиотиков, но возможно
образование одним продуцентом двух или более неродственных соединений;
4) образование антибиотиков не является видоспецифичным или родоспецифичным свойством продуцента: один и тот же антибиотик может
синтезироваться далеко отстоящими в систематическом отношении микроорганизмами. Однако связь между таксономическим положением и
синтезом определенных групп антибиотиков все же прослеживается
(терпеноидные структуры синтезируются только грибами, а стерины
входят в число компонентов их клеточных стенок).
Подавление антибиотиками роста других организмов включает два
понятия: бактериостатическое, при котором после удаления антибиотика из среды рост восстанавливается, и бактерицидное – необратимое
летальное действие антибиотика на клетку. В том случае, если гибель
микрооорганизма определяется лизисом клетки, говорят о бактериолитическом действии антибиотика. Соответствующие указанным выше
эффектам концентрации антибиотиков получили название бактерицидных и бактериостатических.
Основная характеристика активности антибиотика – минимальная
концентрация, подавляющая рост микроорганизмов, которая называется
минимальная подавляющая (или ингибирующая) концентрация (МПК,
МИК). На эту величину оказывают влияние ряд факторов: состав среды,
в которой проводится определение (рН, наличие сыворотки, определенных катионов); условия инкубирования (температура, время, аэрация);
величина и плотность инокулюма и т. п. Кроме того, характеризуя действие антибиотика, особенно необходимо учитывать вид микроорганизмов
и форму его нахождения in vivo − внутри- или внеклеточно.
Величина биологической активности антибиотиков обычно выражается в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора (ед/мл) или в
1 мг препарата (ед/мг). За единицу антибиотической активности принимается минимальное количество антибиотика, способное подавить
развитие или задержать рост определенного числа клеток стандартного
штамма тест-микроба в единице обьема питательной среды. Например,
за единицу активности пенициллина принято минимальное количество
препарата, задерживающее рост золотистого стафилококка в 50 мл бульона, а для стрептомицина – минимальное количество антибиотика, задерживающее рост кишечной палочки в 1 мл бульона. После выделения
9
антибиотиков в чистом виде появилась возможность выразить их биологическую активность в единицах массы. Для многих антибиотиков (эритромицин, нистатин, трихоцетин и др.) 1 ед. активности соответствует
1 мкг вещества. В других случаях это соотношение может отличаться:
1 мг чистого основания неомицина содержит 300 ед. активности. В табл. 1
приведены некоторые из этих величин.
Таблица 1
Соотношение единиц действия и единиц массы некоторых антибиотиков
Антибиотик-стандарт
Альбомицин
Эритромицин (основание)
Пенициллин (натриевая соль)
Ампициллин
Полимиксин В (сульфат)
Тетрациклин (тригидрат)
Стрептомицин
Новобиоцин
Ед/мг
700 000
1 000
1 667
1 000
7 200
890
800
1 000
Единица массы
Нет
1 мкг основания
0,587 мкг чистой калиевой соли
1 мкг ампициллина кислоты
0,1 мкг сульфата полимиксина
1 мкг чистой безводной соли
1 мкг чистого основания
1 мкг новобиоцина
Во взаимодействии микроб – антибиотик полное ингибирование
роста, которое характеризуется МИК, встречается не всегда, другие варианты возможны при субингибирующих концентрациях, т. е. находящихся в пределах от 0 до 1 МИК. При таких концентрациях антибиотика
характер роста микроорганизмов может в течение определенного времени замедляться с последующим восстановлением. Изучение кинетики
антимикробного действия такого типа послужило основанием для введения нового показателя – минимальной антибиотической концентрации
(МАК), за которую принимается концентрация антибиотика, вызывающая изменение структуры клеток бактерий или скорости их роста, или
того и другого одновременно. Выделяют МАК ультраструктуры, т. е.
морфологические изменения клеток, и МАК ингибирования, т. е. изменение плотности микробной популяции за время наблюдения на 1 lg.
К характеристикам антибиотической активности относится и такая,
как спектр антибиотической активности (действия) – группа организмов, рост которых подавляется данным соединением.
Различная активность антибиотиков в отношении микро-, а также
макроорганизмов может быть связана с разными факторами.
Во-первых, она зависит от различной проницаемости клеточных
оболочек для поступления антибиотиков. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий устроена более сложно, нежели грамположительных,
из-за наличия наружной мембраны. Вероятно, именно это привело к то10
му, что последние в норме более чувствительны к большинству антибиотиков. Если же у грамотрицательных бактерий удалить наружную мембрану, то чувствительность к антибиотикам изменится. Устойчивость
грамотрицательных бактерий за счет наличия наружной мембраны носит
название intrinsic, что значит «природная, естественно присущая».
Во-вторых, поступая в клетку, антибиотик должен проникнуть через липофильную наружную и внутреннюю мембраны, гидрофильный
пептидогликан и попасть в гидрофильную цитоплазму. В этом случае
говорят о том, что степень гидрофильности антибиотика должна быть
подходящей. В зависимости от этого свойства может быть задействовано несколько механизмов поступления антибиотиков, в том числе – активный и пассивный транспорт, использование транспортных систем
для других соединений.
Действие антибиотиков на бактериальные клетки определяется их
способностью проникать через наружную мембрану. Основные сведения
о структуре наружной мембраны были получены в 70–80-х годах
ХХ столетия и касались в основном представителей кишечной группы
бактерий и псевдомонад. Основными компонентами наружной мембраны
являются липополисахариды (ЛПС), фосфолипиды, липопротеины и
мембранные белки. Наружная и внутренняя поверхность мембраны
асимметричны: наружная часть представлена преимущественно ЛПС и
белками, внутренняя – фосфолипидами и белками. Каждое из этих соединений отдельно и все вместе могут либо способствовать (или обеспечивать), либо препятствовать поступлению антибиотиков.
ЛПС-компоненты наружной мембраны связаны между собой через
катионы Mg2+. Удаление этих катионов усиливает отталкивание между
соседними участками (молекулами) ЛПС и ЛПС и кислыми белками,
вследствие этого обнажаются участки поверхности, и их место могут занимать фосфолипиды из нижнего слоя и облегчать поступление гидрофобных (липофильных) веществ. Доказательством тому, что ЛПС и липиды могут быть связаны с поступлением антибиотиков в клетку (например, β-лактамных), является то, что чувствительность к ним возрастает после обработки ЭДТА. Кроме того, известны так называемые «шероховатые» (deep rough) мутанты, которые характеризуются изменением
ЛПС за счет укорочения полисахаридной части молекулы, что усиливает
поступление гидрофобных веществ. В качестве примера можно рассматривать и повышенную чувствительность N. gonorrhaeae к β-лактамам.
Показано, что отношение липидов к белкам в их мембране гораздо ниже
(примерно в 12 раз), чем у Salmonella spp. Также полагают, что у N. gonorrhaeae ослаблены связи между молекулами ЛПС.
11
Вторым путем поступления антибиотиков в клетку является система, обеспечиваемая белками. Основную роль в данном случае играют белки-порины. Помимо пориновых белков в клеточной стенке обнаруживаются липопротеид Брауна, состоящий из 58 аминокислотных
остатков и связанный с пептидогликаном, и белок ompA, или главный
белок наружной мембраны, поддерживающий ее стабильность, выполняющий функцию рецепторов для бактериофагов, бактериоцинов и
участвующий в конъюгации. Можно отметить также наличие ряда минорных белков и белков, обнаруживаемых при особых условиях культивирования.
Белки-порины образуют на наружной поверхности клетки три канала, которые в нижней части наружной мембраны сливаются в один. Каналы заполнены водой, и, следовательно, через них осуществляется
транспорт гидрофильных веществ. Количество пориновых каналов может достигать 105 на клетку, молекулярный вес соответствующих белков – 30–40 тыс. Д, у E. coli их три типа – ompС, ompF, phoE. Между отдельными бактериями существуют различия в типах пориновых каналов.
Например, у Salmonella имеется дополнительно ompD канал, у E.coli В –
нет канала ompF. Синтез omp-белков регулируется продуктами генов
ompR и envZ. Продукт гена envZ реагирует на изменение осмолярности
среды и может фосфорилировать белок ompR, который в свою очередь
изменяет транскрипцию генов всего оперона.
К специфическим особенностям и характеристикам пориновых
белков, влияющим на поступление антибиотиков, можно отнести следующие:
1) у различных бактерий может быть различное количество типов
пориновых белков и, соответсвенно, различное число каналов;
2) пориновые каналы имеют различный диаметр;
3) в зависимости от условий внешней среды (или условий культивирования) каналы определенных типов могут функционировать или нет.
Одной из существенных характеристик, влияющих на поступление
веществ по каналам, является их диаметр. Формально эта величина колеблется незначительно – от 1,08 до 1,16 Å, но для поступающих веществ это имеет большое значение. Кроме размеров поступающих молекул, диаметр определяет также и создание «гидрофильных» условий: чем
больше диаметр, тем дальше располагаются друг от друга выстилающие
канал молекулы воды и тем легче осуществляется транспорт гидрофильных веществ. Условия культивирования могут влиять на синтез белковпоринов. Например, при высоком осмотическом давлении и повышенной
12
температуре может подавляться синтез белка ompF и, соответственно,
образование наиболее широкого по диаметру канала. В средах с низким
содержанием питательных веществ и осмотическим давлением синтез
белка дерепрессируется.
В целом считается, что скорость диффузии через пориновые каналы
зависит от гидрофобности, конформации и заряда соединения. Катионные вещества характеризуются наиболее высокой скоростью поступления, промежуточное положение занимают молекулы, не несущие заряда,
медленнее всего проникают анионы. Пориновые каналы служат транспортными системами для поступления таких антибиотиков, как налидиксовая кислота, хлорамфеникол, аминогликозиды и др.
Роль различных поринов в характере поступления антибиотиков и
возникающей вследствие этого устойчивости бактерий была доказана с
использованием мутантных клеток. Основной вывод, который был сделан: при утрате одного или нескольких белков-поринов увеличивается
МИК антибиотика(-ов) по сравнению с таковой для бактерий дикого типа. Данный факт был подтвержден и клиническими исследованиями. После нескольких дней терапии антибиотиками группы цефалоспоринов в
клинических условиях был выделен мутант S. typhimurium, резистентный
к ним и отличавшийся тем самым от штамма, выделенного до начала
применения препарата. Оказалось, что такие мутантные клетки, в отличие от первоначально выделенного штамма, не имели одного из пориновых белков наружной мембраны.
Отмечают также и тот факт, что у некоторых микроорганизмов пориновые каналы могут находиться как в закрытом, так и в открытом состоянии. Например, для P. aeruginosa показано, что пориновые каналы
имеют достаточно широкий диаметр, но большую часть времени находятся в закрытом состоянии. Данные, полученные относительно функционирования пориновых каналов, следует учитывать при создании новых антибиотиков.
Помимо каналов omp, у бактерий выявлены и специфические, предназначенные для транспорта только определенных веществ, которые тем
не менее могут обеспечивать и транспорт определенных антибиотиков. К
их числу можно отнести канал phoE, а также системы для транспорта витамина В12 и нуклеозидов (Tsx), мальтозы (Lam) и системы для транспорта железа (Ton). Например, через канал Tsx поступают антибиотикинуклеозиды.
Общие сведения о значении клеточных структур для поступления
антибиотиков представлены в табл. 2.
13
Таблица 2
Влияние компонентов клеточных стенок бактерий
на поступление антибактериальных агентов
Структура
Эффект
Полисахариды внешней мембраны
грамотрицательных бактерий
Замедляют или предотвращают поступление высокомолекулярных антибиотиков
Определяют скорость поступления липофильных веществ
Определяют скорость поступления водорастворимых веществ с м.м. 600–
700 Д
Проникновение высокомолекулярных
веществ, родственных питательным
соединениям
Влияют на скорость поступления ионизированных молекул
Поступление липофильных веществ
Липидный бислой внешней мембраны
грамотрицательных бактерий
Пориновые каналы внешней мембраны
грамотрицательных бактерий
Рецепторы питательных веществ во
внешней мембране
Тейхоевые и тейхуроновые кислоты
грамположительных бактерий
Липидный бислой цитоплазматической
мембраны
Транспортные белки для питательных
веществ цитоплазматической мембраны
Проникновение веществ, родственных
питательным соединениям
В-третьих, при оценке спектра действия того или иного антибиотика
следует учитывать наличие или отсутствие защитных механизмов в
клетках микроорганизмов. В настоящее время к основным защитным
механизмам относят: 1) модификацию молекул-мишеней действия антибиотика; 2) продукцию ферментов, инактивирующих антибиотик; 3) наличие систем активного выброса антибиотика из клетки.
Различают природную и приобретенную устойчивость к антибиотикам. При природной устойчивости у микроорганизмов отсутствует мишень для действия препарата. Например, микоплазмы, не имеющие клеточной стенки, устойчивы к действию β-лактамных антибиотиков. Под
приобретенной устойчивостью понимают возникновение в пределах
штамма клеток микроорганизмов с существенно более высокими значениями МИК антибиотика для них, чем для популяции в целом.
Клиническая устойчивость штаммов заключается в неэффективности
и невозможности лечения инфекционного заболевания данным антибиотиком, хотя микроорганизм-возбудитель и обладает мишенями для его
действия. В этом случае в организме не может быть достигнута такая концентрация препарата, при которой происходит подавление роста микробных клеток. Например, для некоторых энтерококков МИК цефалоспоринов, необходимая для подавления их роста за счет связывания с ПСБ, со14
ставляет 200 мкг/мл, однако в тканевых жидкостях организма она достигнута быть не может. С точки зрения клинической медицины к штаммам
микроорганизмов, чувствительным к данному антибиотику, относят те,
рост которых подавляется при терапевтической концентрации препарата в
крови. Умеренно чувствительными считаются штаммы, для подавления
роста которых требуются максимально переносимые концентрации препаратов. К устойчивым относят те бактерии, для которых бактериостатический эффект может быть достигнут только in vitro при высоких концентрациях препарата, являющихся токсичными для человека.
Проблема возникновения и распространения устойчивых к антибиотикам форм бактерий является фактором, ограничивающим использование ряда антибиотиков, и может быть выделена в самостоятельный раздел учения об антибиотиках. В настоящее время распространение устойчивых форм связывают со следующими факторами:
• использованием ряда антимикробных препаратов для эмпирической терапии;
• профилактическим применением антибиотиков при вирусных инфекциях;
• использованием новейших препаратов широкого спектра действия
по сомнительным показаниям;
• неадекватными дозировками препаратов;
• недостаточно длительным лечением, самолечением;
• применением антибиотиков в сельском хозяйстве, особенно в качестве кормовых добавок;
• широким распространением системы «быстрого питания»;
• уменьшением грудного вскармливания.
Все перечисленные моменты необходимо учитывать при проведении рациональной химиотерапии, общий принцип которой заключается в
следующем: при введении антимикробного препарата в организм в крови
должна создаваться такая его концентрация, которая превосходит МИК
для возбудителя заболевания, но в то же время не вызывает выраженного
токсического эффекта. Исходя из этого выделяют три основных параметра антибиотикотерапии: разовая вводимая доза препарата; временной интервал между введением препарата; общая продолжительность
курса, которая зависит от нозологической формы, тяжести течения заболевания и состояния больного.
Наконец, нельзя не указать на взаимодействие в инфекционном
процессе между макроорганизмом и микроорганизмом. В общем виде
данный процесс представлен на рис. 1.
15
Инактивация
Микроб – возбудитель
заболевания
Антибиотик
Подавление
Токсичность
Иммунитет
Выведение,
инактивация
Факторы патогенности
Макроорганизм
Рис. 1. Взаимоотношения в системе
микроорганизм – антибиотик – макроорганизм
Таблица 3
Побочные реакции при терапии антибиотиками
Реакции и механизм
их возникновения
Аллергические реакции:
Развиваются как осложнение
на аллерген (антибиотик); возникновение не зависит от дозы,
сенсибилизация нарастает при
повторных курсах лечения
Токсические реакции:
Возникновение связано с органотропным фармако-динамическим действием антибиотиков; степень выраженности
зависит от сроков лечения и
дозы препарата
Дисбактериозы и другие явления, связанные с химиотерапевтическим действием антибиотиков
Реакции
опасные для жизни
не опасные для жизни
Анафилактический
шок, ангионевротический отек гортани
Кожный зуд, крапивница, сыпь, астматические приступы, ринит,
конъюнктивит, эозинофилия
Токсическое действие
на кровь, агранулоцитоз, аппластическая
анемия
Поражение VIII пары черепно-мозговых нервов,
периферических нервов,
нефротоксическое действие: тошнота, рвота,
понос
Генерализованный
кандидосепсис, стафилококковые энтероколиты, вторичные
пневмонии грамотрицательной этиологии
Местные кандидозы
16
Таблица 4
Токсическое действие некоторых антибиотиков
Токсическая реакция
Антибиотики
Ототоксичность
Аминогликозиды, полимиксин В, хлорамфеникол, эритромицин, тетрациклины
Аминогликозиды, полимиксины, тетрациклины, линкамицин, клиндамицин
Циклосерин, хлорамфеникол, пенициллины
Пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, тетрациклины
Хлорамфеникол, пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, тетрациклины, рифамицины
Эритромицин, рифампин
Неомицин, клиндамицин, линкомицин, тетрациклины, хлорамфеникол
Тетрациклины, полимиксины, ампициллин
Нервно-мышечная блокада
Неврологическая токсичность
Нефротоксичность
Токсичность для крови
Токсичность для печени
Желудочно-кишечная токсичность
Токсичность для кожи
Избирательность действия антибиотиков на макроорганизм следует
понимать с учетом того, что про- и эукариотические клетки являются
различными по строению, и это приводит к различиям в способности антибиотиков проникать в них; их действие специфично; сродство антибиотиков к структурам и веществам, имеющимся в клетках и играющим
там одну и ту же роль или выполняющим сходные функции, но не идентичным, различно.
Широкое использование антибиотиков в повседневной жизни предполагает, что при их назначении следует добиваться максимального терапевтического эффекта при минимальном риске побочного действия
(табл. 3). Кроме того, в современных схемах антибиотикотерапии учитываются и некоторые возможные токсические эффекты антибиотиков
(табл. 4).
3. КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИБИОТИКОВ
Классификации антибиотиков различаются в зависимости от того,
какие цели преследуют при этом исследователи различных профилей.
Так, например, для биолога интерес представляет классификация по
штаммам-продуцентам, для врача – по спектру действия на различных
возбудителей и т. д.
В зависимости от продуцирующих организмов антибиотики могут быть разделены на следующие группы:
17
1. Образуемые эубактериями:
• бактериями рода Bacillus: грамицидины, полимиксины и др.;
• бактериями рода Pseudomonas: мупироцин, пиоцианин, антифунгин и др.;
• бактериями других родов (Micrococcus, Streptococcus, Escherichia,
Proteus): низин, колиформин и др.
2. Образуемые бактериями рода Streptomyces: стрептомицин, тетрациклин, новобиоцин и др.
3. Образуемые несовершенными грибами: пенициллин, гризеофульвин и др.
4. Образуемые грибами классов базидио- и аскомицетов: термофиллин, лензитин, хетомин и др.
5. Образуемые лишайниками, водорослями, низшими растениями:
усниновая кислота и др.
6. Образуемые высшими растениями: аллицин, рафанин и др.
7. Образующиеся в организмах животных: лизоцим, интерферон,
круцин и др.
По механизму биологического действия антибиотики могут быть
классифицированы следующим образом:
1. Нарушающие синтез клеточной стенки бактерий: бацитрацин,
фосфомицин, циклосерин и др.;
2. Нарушающие функции мембран: альбомицин, грамицидин и др.;
3. Подавляющие синтез нуклеиновых кислот:
• ингибиторы синтеза пуринов и пиримидинов;
• синтеза ДНК;
• синтеза РНК.
4. Подавляющие синтез белков: хлорамфеникол, аминогликозиды,
тетрациклины;
5. Ингибирующие процессы клеточного дыхания: пиоцианин, усниновая кислота, антимицины.
6. Антиметаболического действия: боррелидин, пуромицин;
7. С иммунокорректирующей активностью: циклоспорин.
По спектру действия антибиотики делятся на такие группы:
1. Противобактериальные узкого спектра действия, активные в отношении грамположительных бактерий: природные пенициллины, некоторые макролидные антибиотики.
2. Противобактериальные широкого спектра действия: тетрациклины, хлорамфеникол, аминогликозиды.
3. Противотуберкулезные: рифампицин.
4. Противогрибковые: нистатин, леворин.
18
5. Противоопухолевые: актиномицины, блеомицины.
6. Антипротозойные: фумагиллин.
При классификации антибиотиков по химической структуре учитывают, что природные и полусинтетические соединения, имеющие общую структуру, составляют один класс, название которого присваивается
по первому выделенному представителю или по названию антибиотика,
имеющего наиболее характерные свойства и структуру. При наименовании антибиотиков используются и другие подходы. Если структура вещества неизвестна, то название следует давать по наименованию рода или
порядка, к которому относится продуцент, при этом суффикс «-мицин»
присваивается только антибиотикам, продуцируемым актиномицетам. Если название было использовано ранее, то допускается применение эпитета
к видовому названию продуцента. В названии антибиотика можно использовать спектр или способ его антимикробного действия. Необходимо
также, чтобы название антибиотика было благозвучным.
Выделяют следующие химические группы соединений (см. приложение):
1. β-лактамные антибиотики, имеющие в структуре четырехчленное
лактамное кольцо и подразделяющиеся на пенициллины и цефалоспорины.
2. Аминогликозидные антибиотики (стрептомицин, канамицин, гентамицин и др.), имеющие в структуре циклический аминоспирт, к которым через гликозидные связи присоединяются один или несколько сахаров или аминосахаров.
3. Тетрациклины, имеющие четыре конденсированных кольца.
4. Макролидные антибиотики, имеющие макроциклическое лактонное кольцо, с которым соединяются несколько аминосахаров или сахаров
(эритромицин, олеандомицин). В этот класс входят также и полиеновые
антибиотики (амфотерицин В, нистатин), имеющие в лактонном кольце
несколько сопряженных двойных связей и разделяющиеся на диены,
триены, тетраены, пентаены, гексаены и гептаены.
5. Анзамицины (рифамициновый комплекс), имеющие бициклическую структуру с длинным алифатическим мостиком и нитрифицированной боковой цепью.
6. Полипептидные антибиотики (полимиксины, низины, бацитрацины) и депсипептидные (валиномицин, энниатин В), представляющие собой циклические или линейные полипептидные цепи.
7. Антибиотики-антрациклины (дауномицин, рубомицин, карминомицин, целикамицины) – гликозиды, хромофорная группа которых представлена красноокрашенными антрациклинонами или синими пигментами актиномицетов, нерастворимыми в воде и соединенными с аминоили дезоксисахарами, иногда с аминокислотами.
19
8. Антибиотики-гликопептиды (ванкомицин, ристомицин), имеющие
несколько остатков углеводов, соединенных с циклопептидным агликоном.
9. Металлосодержащие антибиотики, среди которых имеются железо- (сидеромицины, альбомицин, гризеин) и медьсодержащие (флеомицин) соединения.
10. Соединения с другой структурой, среди которых можно выделить ароматические соединения (хлорамфеникол); антибиотики, сходные
с нуклеозидами (линкомицин), и др.
4. ОБРАЗОВАНИЕ АНТИБИОТИКОВ
В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
Считается, что лучшими продуцентами антибиотиков являются почвенные организмы, причем около 3000 всех известных соединений с антибиотической активностью образуют представители актиномицетов. На
проявление способности продуцировать антибиотики оказывает воздействие весь сложный комплекс условий культивирования или существования продуцента.
В лабораторных условиях биосинтез многих антибиотиков (как и
других вторичных метаболитов) происходит во время определенной стадии роста культуры. С этой точки зрения, по предложению Б. Локка,
рост популяции продуцентов можно разделить на две стадии: трофофазу
(или фазу сбалансированного роста) и идиофазу (или фазу несбалансированного роста). В первой происходит интенсивный синтез таких соединений, как белки, нуклеиновые кислоты, ферменты, некоторые органические кислоты; во второй – относительно окисленные продукты синтеза первой фазы потребляются, и происходит образование большинства
вторичных метаболитов (антибиотиков, пигментов и др.), т. е. относительно восстановленных соединений.
В зависимости от участвующих в процессе биосинтеза веществ антибиотики могут быть образованы следующим образом:
1) из единственного предшественника – первичного метаболита. Их
синтез – цепь реакций, модифицирующих исходный продукт таким же
образом, как при синтезе аминокислот или нуклеотидов. Примером такого рода синтеза является образование хлорамфеникола через типичный
для ароматических соединений путь шикимовой кислоты;
2) из двух-трех различных предшественников, которые модифицируются и конденсируются с образованием сложных молекул. За счет конденсации двух аминокислот происходит биосинтез линкомицина. Антибиотик новобиоцин образуется из замещенной бензойной кислоты, аминогидрооксикумарина (оба – производные тирозина) и сахара новиозы;
20
3) путем олигомеризации или полимеризации близких по структуре
мономеров через образование основной структуры, которая впоследствии может модифицироваться. По такому механизму происходит биосинтез четырех основных групп антибиотиков:
а) из аминокислот образуются полипептидные и депсипептидные;
б) из ацетат-пропионатных единиц (по типу синтеза жирных кислот) – тетрациклины, рифамицины, макролиды;
в) из ацетатных единиц при конденсации до изопреновых структур –
фузидиевая кислота;
г) из сахаров (по типу синтеза полисахаридов) – аминогликозиды.
Известно не менее 300 соединений, которые относятся к антибиотикам с полипептидной структурой и образование которых можно рассматривать как результат конденсации аминокислот с образованием пептидных связей. Они отличаются от обычных белков тем, что их молекулярная
масса не превышает 3000, а в их составе обнаруживаются необычные
аминокислоты, например в D-форме, метилированные или оксиаминокислоты. Такие структуры склонны к циклизации или гиперциклизации.
Считается, что в биосинтезе полипептидных антибиотиков не участвует рибосомная система, и, соответственно, процесс носит название нерибосомного синтеза. В подтверждение рассматриваются факты, свидетельствующие о том, что процесс не чувствителен к ингибиторам биосинтеза белка и что в составе пептидных антибиотиков обнаруживаются
необычные аминокислоты.
В качестве примера синтеза полипептидных антибиотиков можно
рассмотреть биосинтез грамицидина С – декапептидного циклического
соединения, состоящего из двух идентичных пентапептидных цепей.
Биосинтез катализируется двумя растворимыми ферментными белками –
Н (280 тыс.) и L (100 тыс.). В присутствии этих ферментов экстракты
клеток B. brevis при наличии АТФ, катионов Mg2+, соответствующих
аминокислот могут синтезировать антибиотик. Фермент с большей молекулярной массой связывает четыре молекулы АТФ и четыре аминокислоты, в результате этого образуются тиоэфиры активированных аминокислот. Далее остатки аминокислот, активированные за счет АТФ,
связываются с –SH группами этого фермента, возможно, через остатки
цистеина. На молекуле фермента имеется четыре независимых сайта связывания для каждой аминокислоты.
Для инициации синтеза полипептида необходимо также и участие
L-фермента. Его роль сводится к связыванию и активации с участием
АТФ молекулы L-фенилаланина, в результате такого взаимодействия
происходит рацемизация, и в молекулу антибиотика аминокислота
включается в D-форме.
21
Собственно образование пептидных связей начинается с переноса
активированного D-фенилаланина, связанного с L-ферментом, на фермент Н и связывания этой аминокислоты с молекулой L-пролина. В
дальнейшем происходит образование связи между аминогруппой очередной аминокислоты и карбоксильной группой строящегося пептида, и
в реакции участвует только фермент H. Полимеризация двух активированных пентапептидов осуществляется в случае, если два ферментных
комплекса, несущих активированные аминокислоты, соединенные пептидными связями, объединяются (рис. 2).
Пептидные антибиотики не содержат более 15–20 аминокислот,
так как маловероятно, что ферментный комплекс удерживал бы большее
их количество. Синтез полипептидных антибиотиков осуществляется
семействами, отдельные представители которых различаются заменой
одной или нескольких аминокислот. Это, возможно, объясняется тем, что
происходит ошибочное связывание аминокислот с ферментными комплексами либо аминокислоты конкурируют друг с другом за возможность включения в молекулу антибиотика.
По такому же механизму происходит и образование таких широко
известных антибиотиков, как пенициллины и цефалоспорины. Основу молекулы составляют L-цистеин, D-валин и L-α-аминоадипиновая кислота.
Фермент L
S
Phe
+
Фермент Н
S
Pro
S
Val
S
Orn
S
Leu
Phe
Phe
Pro
S
Pro
S
Val
S
Val
S
Orn
S
Orn
S
Leu
S
Leu
S
Фермент Н
Рис. 2. Синтез полипептидных антибиотиков
22
Фермент Н
Первым этапом биосинтеза считается образование трипептида, который последовательно превращается в моноциклический β-лактам, затем в изопенициллин N и 6-аминипенициллановую кислоту (6-АПК).
Последняя является исходной при получении полусинтетических пенициллинов. При биосинтезе цефалоспоринов процесс происходит сходным образом до образования изопенициллина N, после появления этого
соединения пути биосинтеза молекул расходятся. Дополнительными этапами являются гидроксилирование и ацетилирование молекул.
В группе антибиотиков, образующихся путем конденсации ацетатных и пропионатных единиц, обнаруживаются разные по структуре молекулы: изолированные или конденсированные ароматические, хиноны,
макролиды, анзамицины. Реакции их образования близки к реакциям
биосинтеза жирных кислот. Такие антибиотики образуются микроорганизмами под действием мультиферментного комплекса с участием молекулы-затравки, которая связывается с ним.
Принципиальные отличия синтеза жирных кислот от синтеза вторичных метаболитов-антибиотиков заключаются в следующем:
1) восстановление карбонильных групп может не происходить, и
образуются ароматические структуры; если оно все же осуществляется
частично до стадии гидроксильной группы или двойной связи, то образуется макротетралид;
2) при синтезе антибиотиков может использоваться метилмалонат и
образуются метилированные цепи;
3) активатором – инициатором процесса может быть не только уксусная кислота, но и пропионат, изовалериановая кислота, малониламид
и другие соединения.
Структура антибиотика определяется главным образом длиной цепи
и степенью ее восстановленности. Если цепь образована исключительно
из ацетатных единиц и группы С=О не восстановлены, образуются поликетидные структуры. Согласно стерическим представлениям образуются
шестичленные кольца ароматической природы. Если карбонильная группа восстанавливается частично и циклизация затруднена, то получаются
линейные структуры или макроциклы.
Один из примеров – образование тетрациклинов. Исходными структурными единицами являются восемь молекул малонил-КоА и одна молекула малониламин-КоА. Первым общим предшественником для всех
тетрациклинов является метилпрететрамид, для его образования используется примерно 50 ферментных систем, а последующие 11 реакций приводят к образованию молекулы антибиотика. Исключительно важное
значение имеет наличие НАДФН+, необходимыми являются три молеку23
лы – продукт пентозофосфатного пути утилизации глюкозы. Следовательно, они образуются раньше, чем используются для биосинтеза антибиотика. Был постулирован тот факт, что чем ниже уровень реакций в
ЦТК, тем более высоким является выход тетрациклина. Считают, что
продуктивный штамм имеет дефект в энергетическом обмене, в результате чего усиливается утилизация уксусной кислоты для синтеза тетрациклина.
Биосинтез эритромицина является еще более сложным, так как в
структуру молекулы входят макроцикл, сахара и необходима конденсация этих соединений. Структурной основой является одна молекула пропионил-КоА и шесть молекул метилмалонил-КоА. Первоначально синтезируется эритронолид В, который далее циклизуется и превращается в
различные формы эритромицина (А, В и С) после присоединения сахаров – производных глюкозы. Все реакции происходят в мультиферментном комплексе, от которого молекулы отщепляются после полного синтеза. Способность производных пропионовой кислоты и пропилового
спирта участвовать в биосинтезе в качестве предшественника молекулы
используется на практике: при ферментации их вводят в ферментационную среду, что значительно повышает выход антибиотика.
Молекула стрептомицина представлена двумя функциональными
частями: стрептидином, не обладающим антибиотической активностью,
и стрептобиозамином – дисахаридом, в составе которого имеется метилированный глюкозамин и не содержащая азота стрептоза. Обобщая
данные по биосинтезу стрептомицина культурой S. griseus, можно предложить следующую схему:
S. griseus
Глюкоза – 3 молекулы
Метионин – 1 молекула
Аргинин – 2 молекулы
стрептомицин
Витамин В12
Вопрос о регуляции синтеза того или иного продукта сводится практически к вопросу о регуляции синтеза или изменению активности ферментов, участвующих в процессе. Ферменты, участвующие в синтезе
вторичных метаболитов, обладают меньшей субстратной специфичностью, чем ферменты первичного метаболизма. Это связано с тем, что
ошибки в специфичности работы последних скорее всего летальны для
клетки, в то время как при биосинтезе вторичных метаболитов они могут
быть даже полезны, если синтезируемое с их помощью соединение сохраняет биологическую активность.
24
Ферменты, участвующие в биосинтезе антибиотиков, могут быть
разделены на три группы:
1) образующие и модифицирующие промежуточные продукты метаболизма, которые являются исходными для синтеза данного антибиотика. Такие продукты образуются путем конденсации первичных предшественников, например АсКоА, который может быть превращен в мевалоновую кислоту, поликетидные структуры;
2) катализирующие образование первичных предшественников, например малоната, метилмалоната, их ацилированных производных;
3) образующие первичные метаболиты, которые затем включаются в
синтез вторичных, например ферменты биосинтеза валина и цистеина,
аминокислот, составляющих молекулу антибиотика.
Относительно механизма, который обусловливает образование антибиотика именно в идиофазе, можно сказать, что синтез ферментов, ответственных за это в период трофофазы, подавлен, после ее окончания
должна наступить дерепрессия их синтеза. Возможны несколько механизмов обеспечения данного процесса.
1. Индуктор, дерепрессирующий гены биосинтеза, должен накапливаться после окончания роста культуры или добавляться извне. В настоящее время описаны несколько химических веществ, которые рассматриваются как регуляторы внутриклеточных процессов, в том числе и
антибиотикообразования. Они способны действовать одновременно на
несколько процессов. Например, косинтетический фактор I (Streptomyces
aureofaciens) способен индуцировать образование хлортетрациклина у
малоактивного штамма, 1 мкг его индуцирует образование 50 000 мкг/мл
антибиотика. Фактор IM (Streptomyces virginiae) индуцирует образование
стафиломицина.
Наиболее хорошо изученным является фактор А и его продукция и
участие в процессах биосинтеза стрептомицина. Продукция данного вещества была обнаружена А. Хохловым в 1970-х годах. Изучение различных по активности мутантов показало, что при совместном выращивании
ряда из них можно получить такой же выход антибиотика, как и при выращивании высокоактивного продуцента. В дальнейшем было обнаружено, что один из неактивных в отношении синтеза антибиотика мутантов
нуждается в крайне небольшом количестве вещества, которое образуется
малоактивным штаммом, причем это количество настолько мало, что оно
не может рассматриваться как продукт промежуточного метаболизма:
0,001 мкг вещества А, прибавленного к нулевому мутанту, вызывает образование 1000 мкг стрептомицина, т. е. коэффициент индукции равен 106.
Впоследствии было показано, что фактор А относится к неспецифическим регуляторам биосинтеза антибиотиков и других процессов. Моле25
кулярная масса А-фактора – 342, представляет он собой 2S-изокапроноил3S-оксиметил-γ-бутирлактон. Для фактора А в клетках существует специфический рецепторный белок, обозначенный как Arp A, который действует как репрессор во время ранних стадий роста. После внутриклеточного
накопления фактора А и связывания его с Arp A белком последний высвобождается от ДНК, где он связан с гипотетическим геном Х, который регулирует экспрессию так называемых генов adp (А-фактор зависимые
белки). Морфологические особенности определяет аdp В ген, в то время
как другие гипотетически влияют на синтез стрептомицина.
Размер белка Arp A – 24–29 кДа, также как и других белков такого
типа (Bar A и IM-2; гены barA и farA). Данные белки имеют примерно
на 40 % сходный состав. На N-концевом участке имеется последовательность спираль – клубок – спираль, которая связывается с ДНК; на
С-концевом участке – фрагмент с высокой специфичностью связывания
с бутиролактонами. Arp A, Bar A и IM-2 являются транскрипционными
регуляторами, которые предотвращают экспрессию определенных генов. После достижения (по мере роста культуры) критических концентраций факторов-лактонов они связываются с белками. Как неспецифический регулятор, фактор А принимает участие в образовании мицелия
у Streptomyces griseus.
Помимо неспецифических, известны и специфические регуляторы
процесса образования антибиотиков. Это гены – регуляторы соответствующих оперонов, например биосинтеза стрептомицина (strR) и спектиномицина (srmR). Их белковые продукты связываются с ДНК в области
промоторов и активируют структурные гены.
2. В трофофазе конечный продукт первичного метаболизма по типу
обратной связи вызывает подавление одной или нескольких реакций на
пути синтеза антибиотика. Истощение этого продукта приводит к дерепрессии генов, ответственных за синтез антибиотиков – продуктов
идиофазы. Репрессия синтеза антибиотика конечным продуктом возможна в двух вариантах: сам антибиотик является тем метаболитом, который угнетает активность определенного фермента. Например, при
биосинтезе хлорамфеникола, на этапе присоединения азотсодержащего
радикала, образующийся продукт может подавлять активность ферментов начальных этапов.
Иная ситуация наблюдается при биосинтезе пенициллина. В этом
случае ингибитором является лизин, т. е. один из продуктов первичного
метаболизма, который ингибирует активность гомоцитратсинтазы – первого фермента, который участвует в образовании аминоадипиновой кислоты, включающейся в молекулу антибиотика.
26
3. Рост на легкоутилизируемом источнике углерода ведет к подавлению активности генов в идиофазе вследствие катаболитной репрессии.
Истощение источника углерода приводит к дерепресии генов. Было отмечено влияние явления катаболитной репрессии на биосинтез пенициллина: добавление глюкозы к культуре Penicillum в высоких концентрациях приводит к снижению уровня синтеза антибиотика. На практике для
устранения подобного явления глюкозу вводят в среду дробно. Катаболитной репрессии подвержен и синтез многих пептидных антибиотиков.
4. Синтез вторичных метаболитов (антибиотиков) подавляется высоким энергетическим зарядом в клетке. Истощение АТФ приводит к дерепрессии генов их биосинтеза.
5. РНК-пролимераза во время трофофазы может осуществлять
транскрипцию только генов, ответственных за синтез продуктов трофофазы, и не может присоединяться к промоторам генов, активных во время идиофазы. После завершения трофофазы происходят конформационные изменения РНК-полимеразы, и она способна присоединяться к промоторным участкам соответствующих генов и инициировать синтез ферментов биосинтеза вторичных метаболитов.
5. КЛЕТОЧНАЯ МЕМБРАНА И ВЕЩЕСТВА,
НАРУШАЮЩИЕ ЕЕ ЦЕЛОСТНОСТЬ
Помимо антибиотиков, которые используются при приеме внутрь,
всасывании и циркулировании в крови, часто возникает необходимость в
использовании веществ, угнетающих рост микроорганимзов в целом, на
поверхности тела или каких-либо объектов. Для обозначения таких веществ используют несколько названий: стерилизующие, дезинфицирующие, антисептические, биоцидные. Их использование входит в состав противомикробных мероприятий, под которыми понимают совокупность способов и методов уничтожения, подавления численности популяции и ограничения распространения потенциально патогенных для
человека микроорганизмов.
Косвенные противомикробные мероприятия – снижение распространения микроорганизмов, их численности, создание неблагоприятных
условий для размножения. Прямые противомикробные мероприятия –
полное или селективное освобождение от микробов объектов внешней
среды или живых организмов.
В зависимости от области применения выделяют следующие мероприятия:
1) стерилизация – совокупность физических и химических способов
полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и по27
коящихся форм микроорганизмов. Стерилизующими агентами являются
горячий насыщенный пар под давлением, сухой жар, кипячение и прокаливание, холодная стерилизация (окись этилена, пары формалина и др.);
2) дезинфекция – совокупность способов полного, частичного или
селективного удаления (уничтожения) потенциально патогенных для человека микроорганизмов на объектах внешней среды с целью разрыва
путей передачи возбудителей. Дезинфицирующий эффект может быть
достигнут путем сжигания материала или объекта, обработки УФ светом,
ультразвуком. Чаще используют дезинфектанты (хлорамин, фенол, крезол, четвертичные соединения аммония), вещества, к которым предъявляют особые требования:
• широкий спектр действия;
• наличие бактерицидных свойств;
• хорошая растворимость в воде или образование стойких суспензий, аэрозолей в воздухе;
• низкая токсичность и аллергенность.
Специфика некоторых противомикробных мероприятий показана в
табл. 5.
Таблица 5
Сравнительная характеристика некоторых противомикробных мероприятий
Признак
Цель
мероприятия
Область
использования
Средства
воздействия
Объекты
воздействия
Эффект
воздействия
Деконтаминация
Направленность
Стерилизация
Дезинфекция
Разрыв путей передачи
инфекции
Антисептика
Химиотерапия
Резкое снижение Полное освочисленности
бождение от
микроорганизмов возбудителей
Объекты внешней среды
Кожа, слизистые
Внутренняя
оболочки
среда
организма
Физические, химические,
Физические, хиХимические
механические
мические, механические, биологические
Все виды и Патогенные и
Патогенные,
Патогенные и
формы микроусловноусловно-патоген- условно-патоорганизмов
патогенные
ные и непатогенгенные микмикроорганизные микрооргароорганизмы
мы
низмы
Бактерицидный
Бактерицидный,
бактериостатический
Полная
Селективная
Полная
(для патогенов)
Профилактическая
ПрофилактичеХимиотераская, терапевтипия, химиоческая
профилактика
28
Антисептики – химические соединения, которые обладают противомикробным действием и используются для нанесения на кожу, слизистые оболочки, полости и раны в целях лечения и предупреждения развития местных инфекционных поражений и сепсиса. Разделить антисептики можно на три группы:
1) неорганической природы (галогены и их производные, перекись
водорода, марганцевокислый калий, борная кислота и др.);
2) биоорганической природы (антибиотики – полимиксины и грамицидины, экстракты календулы, чеснока, эвкалипта, лизоцим);
3) органические антисептики абиогенного происхождения (органические производные хлора, иода, брома, молочная, салициловая кислота
и др.).
Рассмотрим механизмы противомикробного действия антисептиков.
1. Деструктивный механизм подразумевает разрушение структур и
макромолекул клетки в присутствии антибиотика, что не позволяет им
выполнять свои функции.
Деструкцию могут вызывать химические вещества, температура,
ультразвук, соли тяжелых металлов, поверхностно-активные вещества.
Молекулы, которые имеют в своем составе гидроксильные или карбонильные группы, двойные связи, разрушаются в основном за счет окисления. Биополимеры типа белков, полиэфиров – под действием окислителей, детергентов. Наиболее подвержена деструкции мембрана, у которой изменяется целостность, – таким образом наступает гибель клетки.
Применение антисептиков этой группы может иметь отрицательные последствия для макроорганизма (оказывают раздражающее действие, вызывают повреждение кожи, слизистых оболочек и т. д.).
2. В соответствии с окислительным механизмом активности антисептиков (перекись водорода, иод, марганцевокислый калий) на первом
этапе взаимодействия с химическими веществами клетки происходит отсоединение от антисептика кислорода, его активация и образование промежуточных перекисных продуктов – гидроксил-иона и др. На втором
этапе активированный кислород и промежуточные продукты взаимодействуют с реакционноспособными группами соединений микробной клетки, в результате чего происходит полная деструкция молекул или возникают солеобразующие или несолеобразующие комплексы с молекуламимишенями. Изменения носят необратимый характер, и, следовательно,
окислители имеют бактерицидный эффект. Например, в растворе марганцевокислого калия марганец в кислой среде переходит в четырехвалентное, а в щелочной – в двухвалентное состояние с выделением атомарного кислорода, который окисляет соединения, входящие в состав
поверхностных структур бактериальной клетки.
29
3. Антисептики, действующие по мембранатакующему механизму,
могут вызывать разрушение входящих в состав мембраны полимеров,
что приводит к лизису микробных клеток, или нарушает функции мембран (осмотическую проницаемость, перенос ионов через мембраны).
Основная масса соединений такого рода – поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые могут быть разделены на три группы: катионные
(четвертичные соединения аммония), анионные (щелочные мыла, желчные кислоты) и нейтральные.
Антимикробное действие ПАВ зависит от типа соединения. Наибольшим бактерицидным эффектом обладают катионные ПАВ, промежуточным – анионные, слабым – нейтральные. Катионные ПАВ – уникальный класс дезинфицирующих веществ, в силу того что растворимы в
воде, не имеют запаха, активны в высоком разбавлении в отношении
грамположительных и грамотрицательных бактерий, спор, нитчатых водорослей и других объектов.
Амфифильная природа ПАВ позволяет им гидрофильной частью
молекулы взаимодействовать с белками, нарушая их конформацию, а
липофильной – с липидами. Разрушение бактериальных клеток под
влиянием ПАВ происходит после адсорбции и проникновения их в клеточную мембрану, где они изменяют ее молекулярную организацию. Это
сопровождается изменением проницаемости и осмотического равновесия, после чего наблюдается выход в среду внутриклеточного содержимого: катионов К+, аминокислот, веществ с максимумом поглощения в
области 260 нм.
Механизм устойчивости к ПАВ можно рассматривать с точки зрения
химической организации клеточных мембран микроорганизмов. Известно,
что чем больше липидов содержится в клеточной стенке, тем выше их устойчивость к ПАВ. Для проявления устойчивости имеет значение, кроме
общего количества липидов, их состав и расположение в мембране. Повышенную устойчивость к ПАВ туберкулезных бактерий связывают с наличием в составе их липидов особого гликолипида – корд-фактора.
Одним из лучших катионных антисептиков является хлоргексидин.
Это вещество активно в отношении широкого круга микроорганизмов в
относительно низких концентрациях (10–50 мкг/мл), имеет низкую токсичность и проявляет слабое раздражающее действие на слизистую оболочку полости рта. При использовании в качестве полоскания действует
на Streptococcus mutans, снижая вероятность кариеса; обладает способностью накапливаться в тканях, что говорит о пролонгированном действии.
Может влиять как на цитоплазматическую, так и наружную мембрану
бактерий.
30
6. АНТИБИОТИКИ – ИНГИБИТОРЫ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЫ
Соединения, относящиеся к этой группе, являются практически антисептическими веществами. Среди них обнаружены те, которые могут
действовать на клетки бактерий и высших организмов. Это обусловлено
различиями в мембранах – присутствием различных стеринов: зимостеринов и эргостеринов у растений и грибов, холестерина у животных.
Все антибиотики, действующие на клеточную мембрану, могут вызывать нарушение осмотических свойств клетки, не являясь при этом
высокоспецифичными. Зачастую они относятся к токсичным соединениям и в силу этого применяются местно. Антибиотики этой группы могут
быть классифицированы следующим образом:
1) вещества, нарушающие надмолекулярную структуру и организацию клеточной мембраны, что приводит к высвобождению клеточных
веществ;
2) вещества-ионофоры, участвующие в транспорте катионов и ионов. Они могут быть подразделены:
а) на каналообразователи (образуют в мембране канал для определенных веществ);
б) подвижные переносчики, проходящие с ионом через мембрану,
или подвижные ионофоры.
К веществам первой группы, нарушающим структуру мембраны,
относят соединения двух типов в химическом отношении. Это антибиотики, которые имеют пептидное кольцо, состоящее менее чем из 10 аминокислот, но к этому кольцу присоединяется пептидная цепь, а к ней –
разветвленная жирная кислота (8–9 атомов углерода). Их примером являются полимиксины. Активны данные соединения в отношении грамотрицательных бактерий. Вещества второй группы (грамицидин С и тироцидины) являются циклическими полипептидами, состоящими из 10
аминокислот и имеющими свободные аминогруппы, активны в отношении грамположительных бактерий.
Полимиксин В – бактерицидный антибиотик, продуцируемый бактериями Bacillus polymixa. Положительно заряженный полипептид электростатически связывается с анионными фосфатными группировками
мембранных фосфолипидов, вытесняя при этом катионы Mg2+, обеспечивающие стабильность мембраны. Одновременно во внутренние гидрофобные участки мембраны встраивается боковая цепь жирной кислоты.
Структура мембраны изменяется, и нарушаются параметры ее прони31
цаемости (происходит потеря ионов К+). Нарушения структуры наружной мембраны при электронно-микроскопическом анализе выглядят как
выпячивания (в виде пузырей) из-за увеличения площади ее поверхности. Существует несколько аналогий между действием полимиксинов и
таких антисептиков, как хлоргексидин. Одна из них заключается в том,
что токсический эффект может быть снижен при повышении концентрации двухвалентных катионов.
Полимиксины избирательно действуют на грамотрицательные бактерии и очень слабо на грамположительные. К ограничениям при использовании полимиксинов следует отнести возможный нефротоксический эффект.
Группу ионофорных антибиотиков составляют несколько различных в химическом отношении соединений, общим для них является то,
что они способны облегчать перенос через мембраны различных неорганических катионов. Эти соединения не нашли широкого применения в
лечебной практике в силу неспецифического действия и токсичности,
однако они используются в научных исследованиях как инструмент для
определения функций мембран.
Типичный представитель таких антибиотиков – валиномицин. Это
депсипептидное циклическое соединение. Из 12 компонентов кольца
аминокислоты располагаются таким образом, что попарно чередуются Dи L-формы, а также амино- и оксикислоты. Если аминокислот шесть (энниатин), то каждый компонент кольца имеет другую конфигурацию. С
катионами калия, для которых валиномицин является высокоспецифическим переносчиком, образуется комплекс, в котором (как показал рентгеноструктурный анализ), калий соединяется с внутренней частью молекулы шестью кислородными связями. Кольцо имеет такие размеры, которые позволяют идеально разместиться в нем только ионам калия, причем без гидратной оболочки. Общий заряд всего комплекса положительный. Валиномицин способен образовывать комплексы и с катионами натрия, но их размеры меньше, и константа сродства примерно в тысячу
раз ниже.
Действие валиномицина на мембрану обусловлено высокой специфичностью комплекса и его гидрофобностью снаружи. Липофильная молекула калий – валиномицин с общим положительным зарядом перемещается через мембрану путем простой диффузии, удаляя катионы калия
из клетки. Процесс очень эффективен: одна молекула может переносить
до 104 ионов в минуту. Выкачивание катионов калия в конечном итоге
приводит к ингибированию процессов биосинтеза белка.
32
По сходному механизму работает и антибиотик нонактин, относящийся к группе макротетралидов. За счет наличия циклической структуры он также позволяет заключить катион калия (или другие однозарядные катионы – NH4, Na+) в оболочку из восьми атомов кислорода. Наружная поверхность является липофильной.
Антибиотикам с линейной структурой – монензину и нигерицину –
также присуща способность транспортировать катионы калия и натрия соответственно. В данном случае конформация линейной молекулы изменяется таким образом, что она как бы складывается, и карбоксильная группа
на одном конце способна образовывать связь с гидроксильной группой на
другом. Внутри такой структуры находятся катионы за счет формирования
связей с кислородом. Монензин имеет важное практическое значение, так
как является средством, предотвращающим развитие кокцидиоза у кур.
При этом использование его не ограничивается – устойчивые формы появляются относительно редко, а пищеварение улучшается.
К антибиотикам-ионофорам, образующим в мембране поры, относится грамицидин А. Это линейная молекула, в которой наблюдается чередование D- и L-форм аминокислот. С одним концом полипептида связан этаноламин, с другим – формильная группа. По характеру переносимого иона это родственное валиномицину соединение, однако механизм
процесса совершенно иной. При выяснении его действия учитывали тот
факт, что в системе in vitro липидная мембрана, разделяющая растворы с
различной концентрацией калия, при определенной температуре переходит в твердое состояние. В таких условиях перенос катионов калия с
участием валиномицина (также специфического переносчика для них)
резко снижается или не наблюдается вообще.
В случае же использования грамицидина А проведение калия происходит, скорее всего, за счет образования пор. Спиральная структура молекулы изменяется таким образом, что внутренняя поверхность становится
гидрофильной, а наружная – липофильной. Одна молекула антибиотика
не имеет достаточной длины, чтобы образовывать пору через весь липидный слой, и считают, что две молекулы соединяются «голова к голове».
Размеры канала таковы, что по нему могут перемещаться небольшие одновалентные катионы. При этом участок канала, где в данный момент находится ион, становится шире и короче. Время жизни такой поры мало
(около одной секунды), однако она весьма активна в отношении транспорта: через отверстие может переноситься до 107 катионов калия.
Антибиотики-полиены относятся к группе макролидных и имеют
большое лактонное кольцо. Гидрофобная часть молекулы содержит систему сопряженных двойных связей (4–7). Противоположный участок является гидрофильным за счет наличия ОН-группировок. В медицине ис33
пользуются нистатин, амфотерицин В, относящиеся к противогрибковым
препаратам. Особенностью полиеновых антибиотиков является то, что
они действуют только на мембраны со стеролами. Однако в некоторых
случаях они могут взаимодействовать и с холестерином, вызывая побочное действие на макроорганизм (гемолиз, нефрит).
Обобщенная модель образования поры (для амфотерицина В) в
мембране и нарушение функций последней выглядит следующим образом. Молекула антибиотика своим полярным концом, представленным
аминосахаром и карбоксильной группой, заякоривается на поверхности
мембраны. Участок молекулы с ОН-группами взаимодействует с таким
же участком другой молекулы, а липофильный участок с двойными связями реагирует с углеводородной частью мембранных липидов. Десять
молекул амфотерицина образуют замкнутый канал со скрытыми полигидроксильными группами и с выступающими липофильными. Между
двумя молекулами антибиотика располагается молекула стерола. Из этого следует объяснение повышенной чувствительности мембран, содержащих стеролы, к полиенам: наблюдается повышенная ригидность углеводородных цепей фосфолипидов в мембране, что усиливает взаимодействие между антибиотиками и стеролами. Как уже отмечалось, заякоренная часть молекулы остается на поверхности мембрана – водная среда.
Липофильный остов молекулы располагается вдоль цепей жирных кислот. В одном липидном слое образуется полупора, в двойном бислое –
полная. Две полупоры образуют полную за счет водородных связей.
Диаметр образованной поры соответствует по размерам молекулам
глюкозы, следовательно, через нее могут удаляться вещества и меньшего
размера: ионы калия, аммония, нуклеозиды, некоторые аминокислоты.
Потеря жизнеспособности происходит не только за счет потери тех или
иных компонентов цитоплазмы, но и за счет снижения рН и коагуляции
белков при поступлении водородных ионов. Известно, что пора может
находиться в трех состояниях: открытом, т. е. проводящем, короткоживущем закрытом и непроводящем (неактивном). В активном проводящем
состоянии каналы могут находиться 220–260 с, а за 1 с переносить
2,5–10 · 106 ионов.
Антибиотик филипин, молекула которого не имеет полярной части,
взаимодействует с мембранами за счет образования стопок, представленных параллельными рядами молекул. В конечном итоге образуется
крупный агрегат диаметром 150–200 Å, расположенный внутри мембраны. Два таких агрегата образуют сверхагрегат, в котором гидрофильные
стороны повернуты друг к другу. Образование таких крупных включений в мембране ведет к ее разрушению.
34
К числу антибиотиков, нарушающих поступление катионов в клетку, относят и сидеромицины, механизм действия которых связан с особенностями поступления железа в клетки бактерий. Рассматривая действие антибиотика, следует учесть, что поступление железа в клетки при
его дефиците в окружающей среде связано с несколькими стадиями:
• клетка синтезирует кофактор (сидерофор) транспорта железа;
• кофактор освобождается из клетки во внеклеточную среду организма-хозяина;
• часть железа связывается с сидерофором, экстрагируя его из тканевых жидкостей;
• комплекс поступает в клетку микроорганизмов с помощью специфических переносчиков, локализованных в их мембране;
• по мере необходимости железо высвобождается из хелатного комплекса либо за счет восстановления, либо за счет ферментативного гидролиза лиганда.
Считают, что сидеромицины конкурируют с сидерофорами и, следовательно, подавляют поступление железа в клетку. Примером сидеромициновых антибиотиков является альбомицин. У E. coli белки
(феррихромы), которые участвуют в накоплении железа, структурно
сходны с альбомицином и транспортируются в комплексе с железом
через наружную мембрану с участием как минимум двух белков – TonA
и TonB. В присутствии альбомицина нарушается взаимодействие белка
TonA и феррихрома (рис. 3), вследствие чего прекращается транспорт
железа в клетку и нарушается ее рост.
Fe3+ –
феррихром
Fe3+ –
энтерохилин
Альбомицин
Fe3+ – цитрат
Ton
A
Feu
Наружная
мембрана
Ton
B
Рис. 3. Транспорт железа в бактериальные клетки
и нарушение этого процесса сидеромицинами
35
7. АНТИБИОТИКИ, ИНГИБИРУЮЩИЕ ПРОЦЕССЫ
ОБРАЗОВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ БАКТЕРИЙ
В данную группу могут быть объединены соединения, препятствующие биосинтезу клеточной стенки на различных этапах. В общем виде можно выделить три группы таких соединений:
1) ингибиторы образования компонентов, из которых строится клеточная стенка;
2) ингибиторы реакций переноса структурных блоков клеточной
стенки из цитоплазмы наружу;
3) ингибиторы образования связей (сшивок) между элементами пептидогликана.
Общими свойствами антибиотиков, относящихся к данным группам,
можно считать бактерицидный эффект при их действии; эффективное
воздействие только на делящиеся клетки, а также устойчивость к ним
бактерий без клеточной стенки (табл. 6).
Прежде чем рассматривать механизм их действия, следует остановиться на некоторых особенностях структуры и биосинтеза пептидогликана. Пептидогликан имеется в клеточных стенках грамположительных
(20–30 слоев), грамотрицательных (2–4 слоя) бактерий, архебактерий
(псевдомуреин) и отсутствует у микоплазм. Полисахаридная часть пептидогликана представлена N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой
(N-ацетилглюкозамин после присоединения молочной кислоты) кислотой. Исходным веществом для синтеза обоих является глюкоза. К карбоксильной группе мурамовой кислоты присоединяются пептидные
фрагменты, представленные как D-, так и L-формами аминокислот, в которых также имеются диаминокислоты. Синтез пептидогликана делят на
три этапа:
1) сборка и синтез структурных единиц (N-ацетилглюкозамина и
N-ацетилмурамовой кислоты, соединенной с пентапептидом) в цитоплазме;
2) перенос их с помощью специфического переносчика (бактопренол, или ундекапренилпирофосфат, фосфорилированный С55 спирт), локализованного в мембране, на ее наружную поверхность;
3) образование связей (гликозидных и пептидных) на наружной
стороне мембраны. В процессе участвуют трансгликозидазы, транспептидазы и карбоксипептидазы. Между четвертым остатком D-аланина в одной пентапептидной цепочке и одной из диаминокислот в соседней образуется пептидная связь, после чего удаляется пятый остаток D-аланина.
36
Таблица 6
Влияние некоторых антибиотиков на отдельные этапы
биосинтеза клеточной стенки
Антибиотик
Активность в отношении
клеток бактерий
грамотриграмположицательных
тельных
Клеток
эукариот
Действуют на стадии
Дефосфорилирование С55-изопренилпирофосфата
Образование комплекса из
УДФ-мурамилпентапептида и
С55-изопренилпирофосфата
Образование липидного предшественника тейхоевой кислоты
Синтез хитина
Образование N-ацетилмурамовой кислоты
Подавляет активность D-alaрацемазы и D-ala-синтетазы
Препятствует удалению концевого D-ala
Бацитрацин
+/–
+
–
Амфомицин
–
+
–
Туникамицин
–
+
+
Полиоксины
Фосфомицин
–
+
–
+
грибов
–
Циклосерин
–
+
–
Ванкомицин,
ристоцетин
–
+
–
К антибиотикам, ингибирующим образование предшественников,
относят фосфомицин и D-циклосерин. Первое соединение было обнаружено в начале 1970-х годов, продуцентом его являются стрептомицеты
(Streptomyces fradiae, Streptomyces viridochromogenes). Антибиотик взаимодействует с ферментом, участвующим в образовании N-ацетилмурамовой кислоты, связанной с уридиндифосфатом, действуя как аналог
ФЕП (фосфоенолпирувата) и связывается с цистеином в активном центре
трансферазы. Мишень для действия антибиотика находится в цитоплазме, и реакция является весьма специфичной: на другие ферменты и реакции с участием ФЕП антибиотик не действует.
Поступление антибиотика происходит за счет двух транспортных
систем – для гексозофосфатов и для глицерофосфата. За счет увеличения
поступления в присутствии этих соединений активность антибиотика
возрастает. В настоящее время обнаружены несколько механизмов резистентности к фосфомицину: изменение систем транспорта или ослабление сродства между ферментом-мишенью и антибиотиком за счет хромосомальных мутаций. При устойчивости, детерминируемой плазмидными генами и обнаруженной у кишечных бактерий Serratia marcescens,
37
выявлен транспозон Tn2921, кодирующий синтез локализованного в цитоплазме белка Fos (16 Кд). С антибиотиком связывается глутатион (два
глутамата, соединенных через цистеин), а глутатионтрансфераза катализирует раскрытие цикла молекулы. Наконец, возможна одновременная
устойчивость, определяемая как плазмидными, так и хромосомальными
генами и имеющая различные механизмы.
Действие фосфомицина с другими антибиотиками может быть как
синергидным, так и антагонистическим. Возможно, что в его присутствии уменьшается или увеличивается количество пенициллинсвязывающих белков в клеточной стенке или же продукты повреждения пептидогликана включаются как эффекторы в систему регуляции синтеза β-лактамаз. Антибиотик является бактерицидным, его использование в клинике ограничено.
D-циклосерин (Streptomyces lavendulae) следует рассматривать как
антагониста D-аланина, что обусловлено их структурным сходством.
При действии антибиотика в цитоплазме клеток накапливается трипептидное производное N-ацетилмурамовой кислоты, лишенное двух
концевых D-аланиновых остатков. Мишенью для действия фермента
являются рацемаза L-аланина и синтетаза D-аланина. Было продемонстрировано, что циклосерин структурно сходен с одной из возможных
конформаций D-аланина, а его сродство к синтетазе намного больше,
чем для природного субстрата. Устойчивость к антибиотику может
быть связана с повышением уровня синтеза ферментов, взаимодействующих с антибиотиком, либо с утратой способности к его транспорту
в клетку (через систему аланина).
Бацитрацин А относится к антибиотикам, связывающимся с молекулами-переносчиками. Этот пептидный антибиотик, продуцируемый
Bacillus lichiniformis, выделенный в 1945 году, обладает повышенной
токсичностью для организма за счет возможного связывания со стеролами мембран и используется местно для подавления грамположительной
микрофлоры.
Антибиотик подавляет перенос через мембрану мурамилпентапептида
к растущей цепи пептидогликана. В процессе переноса происходит фосфорилирование-дефосфорилирование бактопренола, который только в дефосфорилированной форме способен связывать и при последующем фосфорилировании транспортировать предшественника. Антибиотик не является
высокоспецифическим и может подавлять некоторые другие реакции с
участием бактопренола (например, синтез О-антигена липополисахарида).
К антибиотикам третьей группы (препятствующим образованию
сшивок на поверхности мембраны) относят соединения двух больших
38
групп – гликопептидные и β-лактамные. Гликопептидные антибиотики
синтезируются представителями различных редких родов актиномицетов: Amycolatopsis orientalis (ванкомицин), Actinoplanes teicomyceticus
(тейкопланин), Proactinomyces. Используются антибиотики для лечения
тяжелых кокковых инфекций, являются бактерицидными.
Особенности структуры и механизма действия данных антибиотиков следующие:
• молекулы антибиотиков крупные (1500–2000 Д), в них имеется
значительное число ароматических фенольных колец (у ванкомицина –
5, у других – 7), имеется гептапептидный хвост, необычные сахара (ванкозамин, ристозамин);
• действуют только на грамположительные бактерии, так как из-за
больших размеров не способны проникать через наружную мембрану в
клетки грамотрицательных бактерий;
• механизм действия связан непосредственно с взаимодействием с
N-ацетилмурамилпентапептидом. В данном случае принципиально
важно наличие двух концевых остатков D-аланина. Если хотя бы один
из них замещен на L-форму, связывания не происходит. Три другие
аминокислоты в пентапептиде не влияют на взаимодействие с
антибиотиком. Из-за больших размеров молекулы антибиотика
считают, что концевые остатки D-аланина как бы «проваливаются» в
молекулу антибиотика. Следует отметить, что молекула антибиотика
экранирует субстрат (D-аланин-D-аланин) от ферментов – транспептидаз и карбоксипептидаз.
В настоящее время описаны несколько механизмов резистентности
к гликопептидным антибиотикам, касающихся в основном ванкомицина.
Во-первых, это резистентность, обнаруженная у Enterococcus и связанная
с наличием ряда белков. Синтез этих белков кодирует плазмида pIP 816,
имеющая размеры 34 т.п.о. Важно, что детерминанты резистентности организованы в транспозон 1546, ограниченный инвертированными повторами, и, следовательно, способны передаваться между различными репликонами. В составе Tn 1546 обнаружены гены:
• van A, 1029 п.о., продуктом которого является специфическая D-аланин-D-аланин лигаза. Она характеризуется низкой специфичностью по
сравнению с хромосомным геном, отвечающим за включение в
пентапептид D-аланина, и может включать, наряду с аланином, D-лактат. В
результате этого образуются концевые фрагменты со структурой D-аланинD-лактат, которые не связываются с ванкомицином;
• van H, кодирующий специфическую дегидрогеназу для образования D-лактата, т. е. субстрата для ранее описанной реакции;
39
• van Х, кодирующий специфическую гидролазу, гидролизующую
димеры D-аланина, но не димеры D-аланина-D-лактата.
Благодаря работе этих генов резко сокращается содержание группировок D-аланин-D-аланин по сравнению с D-аланин-D-лактат (1: 49).
В составе плазмиды имеются и регуляторные гены van S и van R. Белок
Van S располагается в мембране, а его внутренний участок способен
фосфорилироваться в цитоплазме при участии АТФ в результате воздействия на наружную часть внешнего сигнала. Подобный процесс приводит к передаче сигнала на белок Van R, который связывается с промоторным участком ДНК перед геном van H, и запускает транскрипцию
всех остальных. В качестве внешнего стимула выступает не сам антибиотик, а процесс подавления реакций трансгликозилирования и транспептидации.
Во-вторых, резистентность, связанная с доступностью мишени, обнаружена у Staphylococcus. Клетки с таким типом резистентности характеризуются более толстыми стенками, имеющими иррегулярную структуру, на них хуже адсорбируются некоторые бактериофаги, они более
устойчивы к лизоциму. Анализ белков клеточной стенки показал, что
содержание одного из пенициллинсвязывающих (РВР-2) белков сильно
повышено и обнаружены два новых белка – 35 и 39 Кд, с которыми и
связывают устойчивость.
Антибиотики β-лактамные являются, пожалуй, самыми широко
распространенными в лечебной практике. Они используются для лечения ряда заболеваний и активны в отношении многих возбудителей,
так как обладают широким спектром антимикробного действия, высокой
активностью, стабильностью и эффективностью. Продуцентами β-лактамных антибиотиков являются грибы Penicillium chrysogenum (пенициллины) и Cephalosporium acremоnium (цефалоспорины). Общим свойством антибиотиков данной группы является наличие в молекуле β-лактамного кольца, а в биологическом смысле – механизм антимикробного
действия. В лечебной практике используется около 50 различных препаратов группы пенициллинов. Современная их классификация является
комплексной, учитывает как химические особенности, так и спектр действия и выглядит следующим образом:
1. Природные пенициллины (бензилпенициллин, бициллин и др.).
2. Полусинтетические пенициллины:
а) активные в отношении преимущественно грамположительных
бактерий, устойчивые к пенициллиназе (оксациллин);
б) широкого спектра действия (ампициллин, карбенициллин и их
производные);
40
в) антипсевдомонадные (азлоциллин, мезлоциллин);
г) активные в отношении преимущественно грамотрицательных
бактерий.
3. Структурно близкие к пенициллинам соединения:
а) ингибиторы β-лактамаз;
б) карбапенемы (имипенем, тиенам);
в) монобактамы (азтреонам).
Препараты группы цефалоспоринов, обнаруженные в 1945 году
(в настоящее время используется в клинике около 30), классифицируются с учетом последовательности их внедрения в практику, спектра действия и делятся на поколения:
I – антибиотики с антистафилококковой, антистрептококковой и антигонококковой активностью (цефалоридин, кефзол, цефалексин);
II – обладающие дополнительной активностью в отношении эшерихий, клебсиелл, протеев (клафоран);
III – проявляющие активность в отношении большого числа грамотрицательных бактерий, в том числе и P. aeruginosa (цефокситин,
цефобид);
IV – проявляющие активность в отношении грамположительных кокков, а также многих штаммов кишечных бактерий и псевдомонад (цефпиром, цефипим).
Все β-лактамные антибиотики являются бактерицидными. Между
собой они различаются по способности всасываться, используемым дозам, фармакокинетическим показателям, способам применения и т. д.
Еще в 1960-х годах (на модельной системе Staphylococcus aureus) было показано, что мишенью действия пенициллина являются ферменты,
обеспечивающие образование клеточной стенки бактерий. Единственной
приемлемой стала гипотеза о сходстве между молекулой фермента транспептидазы и молекулой пенициллина. Вероятно, пенициллин связывается
с активным центром фермента транспептидазы, ацилирует его и блокирует доступ для субстрата. Высвобождение молекулы пенициллина из комплекса происходит крайне медленно, в то время как природный субстрат
(пентапептид) высвобождается быстро. Установлено сходство между пространственной ориентацией атомов и полярных групп пенициллинового
ядра и одной из конформаций остатков D-аланина-D-аланина, причем такое сходство устанавливается при взаимодействии с ферментом. β-Лактамные антибиотики действуют и на карбоксипептидазы, удаляющие свободные остатки D-аланина, однако такое действие не является для клетки
летальным.
41
Рассматривая действие β-лактамных антибиотиков на клеточную
стенку, а также анализируя возможные механизмы устойчивости к ним,
следует отметить и роль так называемых пенициллинсвязывающих белков
(ПСБ, PBP”s). Открыты эти белки были собственно по способности связываться с меченым пенициллином, а также конъюгатами пенициллина и
сывороточных белков.
ПСБ локализованы в цитоплазматической мембране, по своей активности относятся к ферментам классов транспептидаз и D-аланинкарбоксипептидаз. Основная их роль – участие в процессах синтеза клеточной стенки, формообразовательных процессах в клетке и ее физиологическом цикле. Разные типы ферментов включены в увеличение длины,
приобретение формы, образование перегородки клетки. Считается, что
типов ПСБ меньше у кокков, нежели у палочек: у E. coli – 9, S. aureus –
2–4, B. subtilis – 7–8. Количество молекул на клетку составляет у E. coli –
2000–3000 или примерно 1 % от всех мембранных белков.
ПСБ доступны для антибиотика, так как они располагаются частично в мембране, частично – в периплазме грамотрицательных бактерий
или на границе мембрана – среда. Сигнальной частью пептид заякорен в
мембране (у ПСБ-1 E. coli – это остатки с 64 по 87), с 88 по 844 находятся в периплазме. Такое расположение связывают с тем, что активный
центр транспептидаз захватывает структурные единицы пептидогликана
и включает их в полимер. Степень необходимости тех или иных ПСБ для
клеток различается, что означает наличие существенных и менее существенных. Например, у S. aureus из четырех ПСБ существенными являются
только второй и третий, дефекты в белках 1 и 4 не являются летальными
для клетки. У S. faecalis – шесть ПСБ, однако существенными являются
только три из них. Важно отметить, что при действии пенициллинов и
разрушении существенных белков несущественные могут выполнять
функции последних.
Наиболее полно изученными являются ПСБ у E. coli. В табл. 7 представлены свойства некоторых из них.
Белки ПСБ 1А и ПСБ 1В рассматривались ранее как один белок,
однако в последние годы показано, что они кодируются отдельными генами, локализованными на 3-й и 73-й минутах карты. Неодинаковы и
условия их функционирования: потребность в катионах (Mg2+), сродство к отдельным лактамным антибиотикам. Их основная роль – элонгация пептидогликана, и обладают они бифункциональной активностью
(наращивание полисахаридной цепи и замыкание мостиков пептидов),
хотя трансгликозидазная функция и не чувствительна к действию пенициллинов.
42
Таблица 7
Содержание в клеточной стенке, %
1А
90
6
1В
(αβγ)
87
2
2
66
1
3
60
2
4
49
4
5
6
42
40
65
20
Морфологический
эффект
Тип
белка
Молекулярная
масса × 103 Д
Свойства некоторых пенициллинсвязывающих белков Escherichia coli
Активность
Основные функции
Образование гиперсвязанного пептидогликана
Быстрый
Главная транспептидаза
лизис
элонгации пептидогликана
Овоидная
Придание клетке ее
–«–
форма клеток
формы
Образование
Формирование
клеточ–«–
филаментов
ной перегородки
КарбоксипептиВторичная траспептида–
даза, транспепти- ция, увеличение числа
даза, эндопепти- поперечных сшивок
даза
Не ясна
–
–«–
Не ясна
–
–«–
–
Транспептидаза,
трансгликозидаза
–«–
ПСБ 2 также бифункционален, за счет его активности клетка приобретает очертания, формируются ее полюса. Инактивация белка приводит
к образованию сферических, но осмотически стабильных и маложизнеспособных клеток. При изменении белка ПСБ 3 образуются филаменты,
или нитевидные клетки, следовательно, он участвует в образовании клеточной перегородки и клеточном делении.
Проявление резистентности к β-лактамным антибиотикам на уровне
ПСБ – многоступенчатый процесс. При этом происходит поочередное
изменение чувствительности белков к антибиотикам: вначале легко насыщается (связывается) наиболее чувствительный белок, при устойчивости клеток он становится мутантным, затем – второй по чувствительности и т. д. При таком механизме резистентность не может быть достигнута за счет одной мутации.
Действие β-лактамных антибиотиков на клетку может привести к
литической и нелитической гибели. Кроме того, было отмечено такое
свойство, как толерантность клеток. Ранее считалось, что пенициллины и
цефалоспорины могут вызывать только лизис, однако в настоящее время
43
обнаружено множество видов, штаммов, мутантов бактерий, чей рост
ингибируется β-лактамными антибиотиками, но микроорганизмы в течение длительного времени не лизируются. Нелитическая гибель – свойство некоторых микроорганизмов терять жизнеспособность, но не лизироваться быстро при контакте с антибиотиком. Под толерантностью (бактериостазом) понимают специфическое свойство микробной клетки к сохранению жизнеспособности в течение длительного контакта с антибиотиком за счет существенных дефектов метаболизма, которые играют, однако, в его присутствии положительную роль.
Реализация того или иного последствия ингибирования синтеза пептидогликана под действием антибиотика зависит от нескольких факторов
в процессе клеточного цикла. В зависимости от стадии роста клетки различается активность ферментов синтеза клеточной стенки, например
пептидогликангидролазы (с эндопептидазной и гликозидазной активностью), участвующей в разрушении клеточной стенки при росте за счет
освобождения мест для «застройки» и включения новых единиц пептидогликана. У S. aureus и E. coli аутолитическая активность ферментов
сильно возрастала через 20 мин после начала репликации ДНК и снижалась через 30 мин. Первое время соответствует периоду образования клеточной перегородки и клеточному делению.
Характерным на разных стадиях клеточного цикла является и содержание различных типов ПСБ. Для E. coli при переходе в стационарную стадию роста уменьшалось связывание меченого ампициллина с
ПСБ 1, 2, и 3, а связывание с ПСБ 4 и 5 увеличивалось в 4–10 раз. При
разбавлении такой культуры процесс происходил в обратном направлении. Считается, что, если антибиотик ингибирует клеточное деление на
стадии, когда аутолитическая активность высока, происходит лизис
клетки; если такая активность подавлена или отсутствует – нелитическая
гибель или бактериостаз. При этом в последнем случае антибиотик должен действовать таким путем или в такое время клеточного цикла, когда
он приводит к несбалансированному росту и неспособности клеток делиться.
Толерантные формы, например, дефектны по синтезу гидролазы
пептидогликана: в этом случае и мутантные формы, и бактерии дикого
типа обладали одинаковой МИК, но в первом случае лизиса не наблюдалось. Кроме этого, толерантность может быть обусловлена:
1) пониженным содержанием аутолизинов;
2) более высокой способностью к синтезу ингибиторов аутолизинов
и др. Например, у Streptococcus pneumoniae описан так называемый
«форссмановский антиген», липидтейхоевая кислота, расположенная в
44
цитоплазматической мембране и клеточной стенке. Под действием пенициллина он может высвобождаться и ингибировать активность одного из
основных аутолитических ферментов – амидазы. Многие хронические
заболевания обусловлены наличием толерантных форм, например эндокардиты.
ПСБ играют определенную роль в случае спорогенеза, обеспечивая
переход от палочковидной клетки к сферической споре. При этом могут
образовываться новые ПСБ или наблюдаться протеолитическая модификация уже имеющихся. Последние выводы показаны для бацилл, у которых аспорогенные мутанты содержали примерно вдвое меньше ПСБ, а в
мембранах предспоры обнаруживались новые ПСБ.
Роль ПСБ в развитии устойчивости к пенициллинам и цефалоспоринам, можно сказать, весьма незначительна, что связано с необходимостью множества мутаций для перевода всех ПСБ в сосотояние пониженной аффинности к антибиотикам. Однако существуют некоторые исключения, которые оказываются весьма важными для химиотерапии и клиники. Речь идет о MRSA (метициллинрезистентность различных видов
стафилококков). В этом случае в мембране устойчивых клеток появляется новый белок – ПСБ2а, который перекрывает функции всех остальных
инактивируемых метициллином белков. Отмечается, что детерминируют
метициллинрезистеность гены mec, которые имеют размер 37 кб. Помимо структурного гена во фрагменте содержится информация о регуляции
экспрессии гена, ген транспозазы, гены устойчивости к другим антибиотикам и ионам тяжелых металлов. Транспозон обозначен Tn 4291.
В качестве основного механизма резистентности к β-лактамным антибиотикам рассматривают продукцию ими β-лактамаз – ферментов,
гидролизующих амидную связь в молекулах пенициллинов, цефалоспоринов, пенемов и монобактамов. Обнаружены эти ферменты были
Ф. Абрахамом и А. Чейном практически сразу после внедрения в клиническую практику пенициллина в 1940 году. С тех пор интерес к ним чрезвычайно возрос, поскольку в 1948 году были устойчивы к β-лактамам менее 50 % выделенных штаммов, а в середине 1950-х годов – уже 80 %.
Данные о распространении различных типов резистентности к β-лактамным антибиотикам у различных групп организмов представлены в табл. 8.
В общем виде в зависимости от субстратного профиля все β-лактамазы делят на три группы: пенициллиназы (активные преимущественно
в отношении пенциллинов); цефалоспориназы (активные в отношении
преимущественно цефалоспоринов) и β-лактамазы широкого спектра действия, обладающие примерно равной активностью в отношении обеих
групп антибиотиков (активности не отличаются более чем на 30 %).
45
Таблица 8
Механизмы резистентности к
β-лактамным антибиотикам у бактерий
Группа бактерий
Staphylococcus
Enterobacteriaceae
Pseudomonadaceae
Bacteroides
Суммарно
Нарушение
поступления
Продукция β-лактамаз
плазмидных хромосмальных
–
+
++
+++
12 %
+++
+++
+/–
+
–
–
+/–
+
80 %
Изменение
мишени
+++
–
–
–
8%
Обнаруживаются β-лактамазы в цитоплазматической мембране как
грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. У первых они
выделяются дополнительно в окружающую среду, у вторых – в периплазматическое пространство. Более высокая каталитическая активность
β-лактамаз грамположительных бактерий объясняется строением клеточной стенки: пептидогликан непосредственно соприкасается с окружающей средой, и молекулы антибиотика могут быть инактивированы
только β-лактамазами с высокой удельной активностью, работающими в
большом объеме среды. У грамположительных бактерий хорошо изучены данные ферменты у стафилококков и бацилл. После индукции синтеза количество фермента может достигать 0,1 % от всего белка.
У грамотрицательных бактерий β-лактамазы обнаруживаются, за
небольшим исключением, в периплазматическом пространтстве. Известны лишь несколько случаев обнаружения внеклеточных β-лактамаз, например у нейссерий. Считается, что в периплазме β-лактамазы располагаются упорядоченно вокруг пориновых каналов, что усиливает эффективность их действия. Количество β-лактамаз у грамотрицательных бактерий – около тысячных долей процента.
Характеризуя β-лактамазы с физико-химической точки зрения, сразу
же отмечают их субстратный профиль: наиболее легко гидролизуемым
субстратом является для них бензилпенициллин, и в большинстве случаев активность β-лактамаз по отношению к другим антибиотикам выражают в процентах от их активности к бензилпенициллину. Субстратный
профиль определяют двумя способами – спектрофотометрически и иодометрически. В первом случае судят об уменьшении содержания антибиотика в реакционной смеси по скорости его гидролиза; во втором –
выявляют продукты гидролиза, пенициллоиновые и цефалоспороиновые
кислоты (по образованию окрашенных продуктов с иодом). Практически
все β-лактамазы не имеют четвертичной структуры, т. е. состоят из од46
ной полипептидной цепи, имеют молекулярную массу от 20 до 40 Кда,
изоэлектическую точку – от 5 до 9.
β-Лактамазы могут быть как металлозависимыми, так и сериновыми
протеазами. В зависимости от этого они представлены четырьмя классами. Ферменты класса А имеют в активном центре ключевой остаток серина в 70-м положении и не менее четырех высококонсервативных аминокислотных последовательностей. По субстратному профилю это пенициллиназы или ферменты, обладающие широким спектром действия.
Ферменты класса С характеризуются иной последовательностью аминокислот в активном центре и относятся к цефалоспориназам. К классу Д
относят ферменты, обладающие активностью в отношении оксациллина
и клоксациллина. Наконец, металлозависимые ферменты класса В сильно отличаются как друг от друга, так и от сериновых протеаз. Их активность зависит от наличия двухвалентных катионов, обычно Zn2+. Также
они характеризуются исключительно высокой активностью в отношении
ряда новых антибиотиков. В целом при создании системы классификации β-лактамаз учитывают:
• их субстратную специфичность;
• чувствительность к ингибиторам β-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам);
• локализацию генов синтеза (плазмидная или хромосомальная);
• изоэлектрическую точку;
• чувствительность к ЭДТА.
Рассматривая механизм действия β-лактамаз, считают, что при связывании с субстратом-антибиотиком конформация фермента меняется на
более компактную. В результате взаимодействия гидроксильной группы
сериновых протеаз с карбонильной группой β-лактамного кольца происходит его разрыв и образование ацил-ферментного комплекса. Далее он
гидролизуется, и продукт расщепления антибиотика высвобождается из
комплекса. В течение 1 с одна молекула фермента способна разрушить
до 1000 молекул антибиотика.
Синтез β-лактамаз может детерминироваться генами, локализованными как в составе хромосомы, так и плазмиды. Причем одновременно в
клетке могут присутствовать детерминанты обоих типов. Если учесть,
что кодируемые ими ферменты существенно различаются по субстратному профилю и другим свойствам, то нетрудно объяснить одновременную устойчивость клеток к широкому кругу β-лактамных антибиотиков.
Сравнивая активность β-лактамаз, детерминируемых плазмидными и
хромосомальными генами, отмечают, что в случае детерминант, локали47
зованных на плазмидах, кодируемые ими ферменты активны в отношении более широкого круга соединений, вырабатываются в высоких концентрациях и являются общими для различных видов. Ферменты же, детерминируемые хромосомальными генами, гидролизуют либо пенициллины, либо цефалоспорины, вырабатываются в невысоких концентрациях, но индуцибельны, имеют тенденцию к видоспецифичности.
Хромосомально локализованные гены синтеза β-лактамаз обнаружены практически у всех патогенных бактерий. β-Лактамазы могут продуцироваться как конститутивно (E. coli, Proteus, Shigella), так и индуцибельно (Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Pseudomonas). Индукторами
синтеза служат β-лактамные антибиотики в субингибирующих концентрациях (4–40 мкг/л), причем продукция β-лактамаз может увеличиваться в сотни и тысячи раз. В настоящее время рассматривают два возможных механизма индукции синтеза β-лактамаз антибиотиками:
1) первый заключается в том, что антибиотик взаимодействует с
трансмембранным белком, С-концевой участок которого расположен на
наружной стороне мембраны, имеет аминокислотные последовательности, сходные с β-лактамазой и ПСБ. Взаимодействие такого белка с антибиотиками и служит сигналом к синтезу β-лактамаз. Белок такого типа, кодируемый геном blaR1, обнаружен у B. lichiniformes. Белок 53 Кда
(ген ampG) Citrobacter freundii выполняет ту же функцию. Если клонировать структурный ген β-лактамазы ampC без гена ampG в E. coli, индукции синтеза β-лактамазы не наблюдается;
2) другим сигналом может быть накопление клеткой избытка предшественников клеточной стенки, которые образуются при действии β-лактамных антибиотиков. Это подтверждается тем, что при клонировании β-лактамазных генов их индукция наблюдалась только в нормальных клетках, а
не в L-формах.
Индуцибельные опероны расположены в клетках некоторых энтеробактерий и псевдомонад рядом с геном фумаратредуктазы. Между генами frd и ampC располагается регуляторный ген ampR. Эти гены транскрибируются в противоположных направлениях с перекрывающихся
промоторов. В регуляции синтеза β-лактамаз принимает участие и ген
ampD, продуктом которого является белок 25 кДа, репрессирующий синтез β-лактамаз. Продукт гена ampR связывается с промотором, прилегающим к гену ampC, и способствует его транскрипции. Продукт гена
ampD либо разрушает индуктор, который после связывания с белком
ampR связывается с ДНК, либо ampD белок образует комплекс с ДНК,
который разрушается после действия индуктора.
48
Классической, кодируемой плазмидными генами в составе Tn1 (А)
является β-лактамаза, которая обнаруживается у плазмид не менее восьми различных групп несовместимости. Наиболее распространенными являются также ферменты типа ТЕМ (80 % плазмидных β-лактамаз, 21
тип), SHV (5 % плазмидных β-лактамаз, 5 типов). Относятся они к классу
А и являются ферментами широкого спектра действия. Между собой
различные типы ферментов различаются незначительным числом (1–4)
аминокислотных замен.
Начиная с 1975 года описано не менее 7–8 различных классификаций
β-лактамаз. В табл. 9 представлена современная классификация β-лактамаз с учетом последних данных.
Поскольку устойчивость бактерий к β-лактамным антибиотикам практически полностью обеспечивается продукцией β-лактамаз, то одной из задач и одним из направлений поиска новых препаратов явилось исследование ингибиторов β-лактамаз. Такие соединения были обнаружены в 1960-х
годах, и исследования показали, что они могут быть как синтетическими,
так и природными соединениями. Эффект проявления ими активности как
собственно β-лактамных антибиотиков наступает при очень высоких концентрациях, которые не могут иметь терапевтического значения. Из культуральной жидкости после выращивания бактерий Streptomyces olivaceus и
Streptomyces clavuligerus были выделены оливановая и клавулановая кислоты, которые обладали способностью инактивировать β-лактамазы на фоне
низкой антибиотической активности. Например, клавулановая кислота отличается от бензилпенициллина замещениями по двум положениям, а оливановая имеет замену атома серы на углерод.
Взаимодействуя с ферментом, на начальной стадии ингибитор распознается им как субстрат (антибиотик) и связывается с активным центром β-лактамаз. Затем происходит гидролиз ингибитора по β-лактамной
связи. Специфическая активность ингибитора определяется длительностью существования ацил-ферментных промежуточных соединений. Образование комплекса фермент – ингибитор часто имеет необратимый характер, и активность фермента не восстанавливается. В таком случае ингибиторы носят название «прогрессивных» (клавулановая кислота). В
клинике предложено использовать ее в комбинации с амоксициллином
1: 2 (препарат аугментин). Синтетическое соединение сульбактам в комплексе с ампициллином было названо уназин. Препараты, в которых содержатся одновременно β-лактамный антибиотик и ингибитор β-лактамаз, получили название «потенцированных».
49
С
A
A
A
A
A
D
A
A
B
D
1
2a
2b
2bc
2br
2c
2d
2e
2f
3
4
нет
нет
нет
широкого
спектра
расширенного
спектра (БЛРС)
–«–
–«–
–«–
–«–
–«–
нет
Общепринятое
название
β-лактамаз
Pen, Cph I–
IV
Pen
Pen, Kb
Pen, Clx
Chp
Pen, Chp,
карбапенемы
большинство
β-лактамаз
Pen
Pen
Pen, Cph I
Cph I–III
Преимущественный
субстрат
–
–
+/–
+
+/–
+
+
+
+
+
–
Чувствительность к
ингибиторам
L-1 (Xanthomonas campestris)
Ccr (Bacteroides)
Burkholderia cepacia
TEM-30 – TEM-36, плазмидный
PSE1, PSE 3,4, плазмидный
OXA 1 – OXA 11, плазмидный
индуцибельный, из Proteus vulgaris
NMC-A, Sme-1
TEM-3, TEM-26, SHV 2-6, плазмидный
AmpC – фермент грамотрицательных бактерий, плазмидный, хромосомальный, конститутивный и индуцибельный
грамположительные бактерии
TEM-1, TEM-2, SHV-1, плазмидный
Типичные
представители
50
П р и м е ч а н и е: Pen – пенициллины, Cph I–IV – цефалоспорины I–IV поколений; Clx – клоксациллин, Kb – карбенициллин; БЛРС – β-лактамазы расширенного спектра действия
.
Класс
Группа
Современная классификация β-лактамаз
Таблица 9
Ингибиторы β-лактамаз делят на две группы: обратимые ингибиторы и необратимые инактиваторы. В основе механизма действия обратимых ингибиторов лежит конкурентное ингибирование. В этом случае
изменяется лишь сродство фермента к субстрату-антибиотику: происходит преимущественное связывание с ингибитором, что препятствует связыванию с субстратом. По такому механизму действуют антибиотики,
которые с очень малой скоростью гидролизуются соответствующей
β-лактамазой. Например, для цефалоспрориназ класса С – это клоксациллин, широкого спектра действия – азтреонам.
В отношении некоторых β-лактамаз имеет место неконкурентное
ингибирование. В этом случае ингибитор связывается с ферментом не в
активном центре, а в другом участке. Такое ингибирование встречается
относительно редко: например, ЭДТА, связывающая двухвалентные катионы, является неконкурентным ингибитором β-лактамаз класса В.
Необратимые инактиваторы вызывают потерю активности фермента, которая не восстанавливается после удаления избытка ингибитора. К ним относятся: модификаторы аминокислот, вещества, ингибирующие активный центр фермента, суицидные ингибиторы.
Модификаторы аминокислот – пара-хлор-ртуть бензоат (п-ХМБ) –
ингибируют те β-лактамазы, у которых в активном центре важную роль
играют остатки цистеина. Ингибиторами активного центра являются и
вещества, сходные с субстратом, но имеющие высокоактивные группы.
Они способны связываться с более чем одной аминокислотой в активном
центре фермента и образовывать долгоживущие комплексы. Суицидные
ингибиторы расщепляются при взаимодействии с ферментом за счет наличия высокоактивных групп, образуются ковалентные связи, и происходит инактивация фермента. К таким инактиваторам относятся клавулановая и оливановая кислота, сульбактам и др.
В качестве общих свойств ингибиторов β-лактамаз можно также
рассматривать и следующее:
1) ингибитором может быть то соединение, чья фармакокинетика
сходна с фармакокинетикой антибиотика, с которым она находится в
комбинации;
2) не может быть создано ингибитора вообще, т. е. конкретное вещество действует на более или менее широкий круг лактамаз.
Создание комплексных препаратов, содержащих ингибитор β-лактамаз, является одним из перспективных направлений при оценке качества и расширения спектра новых β-лактамных антибиотиков. Среди
других задач подобного рода особенно важна разработка препаратов с
51
расширенным спектром действия. Возникла данная проблема из-за возрастания в течение последних лет роли грамотрицательных бактерий в
этиологии госпитальных инфекций, в появлении множественно резистентных штаммов и др. Этот процесс обусловлен совокупным действием ряда факторов: изменением нормальной микрофлоры человека под
воздействием антибиотикотерапии вообще; применением лучевой терапии, цитостатиков, стероидных гормонов и других средств, снижающих
реактивность больного организма.
Такими препаратами стали полусинтетические пенициллины и цефалоспорины. Предпосылки для их получения были созданы в 1959 году, когда Г. Бичем и К. Батчелор выделили ядро молекулы пенициллина – 6-аминопенициллановую кислоту (или Pen G), которая и послужила основой для
синтеза препаратов с улучшенными свойствами.
Одно из требований, которое предъявляется к таким препаратам, –
улучшенная проницаемость через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. К немаловажным свойствам можно отнести и повышение
связывания с ПСБ. Наконец, некоторые фармакокинетические показатели: незначительное связывание с белками сыворотки крови, меньшая аллергенность, стабильность в кислой среде желудка, всасываемость при
приеме внутрь – относятся также к существенным при оценке качества
вновь созданных препаратов.
8. АНТИБИОТИКИ, ИНГИБИРУЮЩИЕ
ПРОЦЕССЫ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА
Антибиотики, относящиеся к данной группе, весьма многочисленны
и подавляют синтез белка за счет различных механизмов и на различных
уровнях.
Условно их можно разделить на четыре группы:
1. Ингибиторы активации аминокислот и реакций переноса.
2. Ингибиторы функций малых субъединиц (30S) рибосомы.
3. Ингибиторы функций больших субъединиц (50S) рибосомы.
4. Ингибиторы внерибосомных функций.
Особенностями действия антибиотиков данной группы являются
следующие:
1) временная остановка биосинтеза белка сама по себе не является
летальной для клетки, поэтому антибиотики – ингибиторы биосинтеза
белка обладают бактериостатическим действием, если только не связываются необратимо с какими-либо компонентами системы синтеза;
52
2) остановка биосинтеза белка имеет различные последствия для
клеточного цикла: уже начавшийся цикл репликации ДНК продолжается,
но новых циклов не инициируется, синтез РНК также продолжается в течение короткого промежутка времени, скорость синтеза клеточной стенки снижается и в конце концов прекращается;
3) биосинтез белка у про- и эукариот различается, поэтому может
подавляться разными антибиотиками.
В качестве представителей антибиотиков первой группы можно рассматривать природные и синтетические аналоги аминокислот, подавляющие образование комплексов «ацилированная аминокислота –
тРНК». Связываясь с тРНК, они могут включаться в полипептид, что
приводит к образованию аномальных белков. К числу аналогов аминокислот можно отнести этионин, норлейцин, этилглицин, дигидропролин.
Природными соединениями являются боррелидин и индолмицин, которые конкурентно подавляют связывание с аминоацил-тРНК треонина и
триптофана соответственно. За исключением индолмицина, который является специфическим ингибитором прокариотической тРНК-синтетазы
триптофана, остальные соединения действуют неспецифически и поэтому не нашли использования в клинике.
На стадии взаимодействия с пептидил-тРНК действует пуромицин.
Это уникальный ингибитор белкового синтеза, так как он вступает в реакцию образования пептидной связи с С-концевым аминокислотным остатком растущей полипептидной цепи на рибосоме, что приводит к
преждевременной терминации образования полипептида. Отмечено
структурное сходство пуромицина и концевого аминоациладенозина в
тРНК. Аминоациладенозин является концевым участком в тРНК как
про-, так и эукариотических клеток, и действие пуромицина распространяется на клетки этих типов. Структурное сходство пуромицина и аминоациладенозина приводит к тому, что аминогруппа антибиотика образует пептидную связь с ацильной группой концевого аминоациладенозина пептидил-тРНК, связанной с рибосомой. Образование стабильного
комплекса приводит к завершению образования пептидных связей и высвобождению пептидилпуромицина из рибосомы.
Аминогликозидные антибиотики, которых в настоящее время насчитывается около сотни, по своей значимости занимают второе после
β-лактамных место. Относясь к антибиотикам с широким спектром действия, аминогликозиды используются для лечения таких инфекционных
заболеваний, как туляремия, чума, коклюш, туберкулез. Стрептомицин
может быть использован в сельском хозяйстве для борьбы с заболеваниями растений: бактериальным увяданием фасоли, ожогом косточковых. Антибиотики являются бактерицидными.
53
Первым обнаруженным представителем антибиотиков данной группы явился стрептомицин. Он был открыт в 1944 году С. Ваксманом, за
что впоследствии (в 1952 году) ему была присуждена Нобелевская премия. С точки зрения химической структуры все соединения данной группы могут быть разделены:
1) на стрептомицины, имеющие в качестве агликонового фрагмента
стрептидин, не содержащий NH2-группу, которая замещена на гуанидиновую, и имеющие пентозы с разветвленной цепью;
2) 2-ДОС (дезоксистрептамины) – в качестве агликонового фрагмента присутствует дезоксистрептамин, к которому гликозидной связью
могут быть присоединены два сахара (пентозы и гексозы) по разным положениям;
3) фортамины, содержащие неизвестный ранее агликон, названный
фортамином, и углеводный фрагмент;
4) сорбистины, содержащие нециклический агликон сорбитол и
один углеводный фрагмент.
Таким образом, аминогликозиды – это соединения, содержащие
аминосахара и сахара, соединенные гликозидной связью с агликоновым
фрагментом. С другой стороны, в зависимости от устойчивости к действию инактивирующих ферментов, можно выделить аминогликозиды
первого (стрептомицин, канамицин, неомицин, мономицин) и второго
(гентамицин) поколений.
Для биолога исследование аминогликозидов может быть интересно
со следующих позиций:
1) продукция данных антибиотиков наблюдается у представителей
не менее шести различных родов бактерий, в частности у Pseudomonas,
Bacillus, Streptomyces, Micromonospora или других редких родов актиномицетов, что позволяет рассмотреть вопрос о локализации генов биосинтеза и биогенезе молекулы антибиотика;
2) структура молекулы предполагает широкие возможности для ее
модификации, что используется в создании новых препаратов путем мутасинтеза;
3) именно для продуцентов стрептомицина обнаружен фактор А и
установлена его регулирующая роль в процессах биосинтеза;
4) изучение функционирования рибосом и регуляция биосинтеза
белка;
5) изучение общих механизмов устойчивости, особенно за счет продукции инактивирующих ферментов, и создание антибиотиков, у которых экранированы подверженные их действию активные группы.
54
Поступление в клетку аминогликозидов осуществляется с использованием пориновых каналов наружной мембраны грамотрицательных
бактерий. Это согласуется с тем, что аминогликозиды являются гидрофильными поликатионными соединениями, что облегчает их транспорт
через заполненные водой каналы. Общим положительным зарядом молекулы объясняется также и способность некоторых аминогликозидов вытеснять из наружной мембраны катионы Mg2+, связывающие молекулы
липополисахаридов. В результате этого частично дезорганизуется мембрана, что приводит к усилению поступления аминогликозидов через наружную мембрану. Такое явление получило название «самопромотирования», и в зависимости от роли, которую играют катионы Mg2+ в поддержании целостности наружной мембраны, для различных бактерий
оно выражено в разной степени. Можно отметить, что высокие концентрации Mg2+ отрицательно сказываются на антимикробном действии
аминогликозидов.
Поступление аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану является сложным, многоступенчатым процессом, идущим с затратами энергии. Его можно разделить на три фазы:
I – фаза связывания антибиотика с наружной поверхностью цитоплазматической мембраны (ионное связывание). Никакие механизмы резистентности клеток не влияют на ее осуществление;
II – фаза медленного поглощения, в результате которого через цитоплазматическую мембрану в клетку проникает незначительное количество антибиотика, не вызывающее летального исхода, но индуцирующее
наступление фазы III;
III – индукция массивного поглощения антибиотика. Именно на
этой стадии наступает летальный эффект для чувствительных клеток
(рис. 4).
Потребность в энергии на двух последних стадиях требует транспорта электронов по дыхательной цепи. Относительно веществ – переносчиков аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану в настоящее время сложилось устойчивое мнение, что это хиноны либо какие-то связанные с ними вещества. По крайней мере для E. coli показано, что аминогликозиды в субингибирующих концентрациях блокируют функционирование цикла трикарбоновых кислот. Исходя из этого факта и объясняют отмеченное еще С. Ваксманом в 1950-х годах
явление, которое заключается в том, что в аэробных и анаэробных условиях наблюдаются резкие различия в активности аминогликозидов
по отношению к клеткам микроорганизмов. Клиницистам известна ре55
зистентность анаэробов (Clostridium, Bacteroides) и в некоторых условиях – факультативных анаэробов (Escherichia, Staphylococcus) к аминогликозидам. В среднем для лечения инфекций, развивающихся в
анаэробных условиях, требуются примерно в десять раз большие концентрации антибиотиков. Причем такая резистентность не связана ни с
изменением рибосом, ни с наличием инактивирующих ферментов.
Считают, что в таких условиях не функционирует цикл трикарбоновых
кислот, нет активных переносчиков аминогликозидов в клетку, а следовательно, и антибиотик в клетки не поступает. Такая ситуация, т. е.
недостаток кислорода, наблюдается при развитии таких инфекций, как
абсцессы и остеомиелиты.
Sm
Связывание с
поверхностью
ЦПМ
Sm
R
ЦПМ
Накопление
в клетке
Sm
ЦПМ
Связывание
с полисомой
R
R
полисома
Рис. 4. Поступление стрептомицина в клетки бактерий
56
С учетом механизма поступления аминогликозидов и того, что они
действуют на процессы биосинтеза белка, создана единая концепция о
действии аминогликозидов на бактериальную клетку. В основе такой концепции лежат исследования модельной системы «стрептомицин – E. coli».
Во время первой энергозависимой фазы незначительное количество
стрептомицина проникает в клетку и взаимодействует с рибосомами на
стадии элонгации белковой цепи. В результате ошибок считывания генетического кода образуются аномальные (или неправильные) клеточные
белки с нарушенной последовательностью аминокислот, которые входят
и в состав цитоплазматической мембраны. С их участием в мембране
формируются неспецифические туннели, и в клетку поступают новые
порции антибиотика, увеличивается количество ошибок считывания, повышается проницаемость мембраны, и количество поступающего антибиотика достигает той концентрации, когда белковый синтез блокируется уже на стадии инициации.
Высвобождение из клетки через образующиеся туннели низкомолекулярных метаболитов и неорганических ионов можно рассматривать
как фактор, дополняющий летальное действие аминогликозидов. Также к
летальному эффекту приводит и нарушение формирования точки начала
репликации ДНК за счет образования аномальных белков на нижней поверхности цитоплазматической мембраны.
На молекулярном уровне действие аминогликозидов происходит
следующим образом. Уже достаточно давно установлено, что мишенью
их действия является процесс биосинтеза белка, а из клеточных структур – рибосомы. Здесь следует отметить, что стрептомицин действует на
30S субъединицу, другие аминогликозиды связываются с обеими субъединицами, в их присутствии образуется нестабильный 70S инициаторный комплекс и обрывается биосинтез белка.
В 1961 году было высказано предположение о влиянии стрептомицина на процессы биосинтеза белка. К тому времени была разработана
бесклеточная система синтеза белка и уточнение сайта действия антибиотика проводили in vitro. В бесклеточную систему вводили стрептомицин и четыре возможных комбинации 30S и 50S субъединиц из рибосом чувствительных и устойчивых клеток, необходимые для осуществления биосинтеза белка составляющие. В результате было установлено,
что ключевую роль в устойчивости играет 30S субъединица: если данная
субъединица получена из резистентных клеток, то процесс биосинтеза
белка происходит в присутствии антибиотика.
Дальнейшая диссоциация 30S субъединицы на 16S-рРНК и 21 белок
определила, что ключевую роль играет одна из белковых молекул. Сравнение белковых профилей из устойчивых и чувствительных клеток позволило М. Номура в 1968 году выявить разницу в одном белке – Р10
57
(S12). Именно его структура определяет устойчивость к антибиотику.
Различия между белком в чувствительных и устойчивых клетках сводятся к очень небольшому числу замен аминокислот: лизин в 42 положении
может быть заменен на аспарагин, треонин или аргинин, а лизин в 87 положении – на аргинин.
Оказалось, что белок S12 в изолированном виде стрептомицин не
связывает, а, по всей вероятности, контролирует такое связывание на рибосоме. Объяснили это следующим образом:
1) S12 при выделении изменяет конформацию;
2) S12 экранирует места связывания стрептомицина на рибосоме в
устойчивых клетках;
3) S12 влияет на конформацию тех белков, которые реагируют со
стрептомицином.
Ни одно из этих предположений не опровергнуто, и в настоящее время считают, что со стрептомицином связываются по крайней мере пять
белков (S3, S5, S9, S12, S14) и 16S-рРНК. Каждая 30S субъединица рибосом связывает по одной молекуле антибиотика, образуя так называемое
место «сильного» связывания. Кроме этого, отмечают, что в разных функциональных состояниях, в зависимости от температуры, концентрации катионов, рибосома может по-разному связывать антибиотик.
При связывании с рибосомой одно из следствий действия стрептомицина – возникновение ошибок считывания. Этот факт зарегистрирован и в системе in vivo, и в системе in vitro. В частности, в системе биосинтеза белка с поли-U как матрицей и в присутствии таких аминокислот, как фенилаланин, лейцин, серин, тирозин, при наличии стрептомицина наблюдается ошибочное включение лейцина вместо фенилаланина.
Было установлено, что такое ошибочное считывание подчиняется нескольким закономерностям:
1) происходит при высокой концентрации магния и зависит от концентрации тРНК;
2) в любом кодоне мРНК ошибочно считывается одно основание,
обычно пиримидин, расположенный на 5′-конце или в среднем положении;
3) 3′-основание считывается верно;
4) ошибки считывания пуринов происходят редко, и при их наличии
в кодоне вероятность ошибочного считывания резко снижается.
Ошибочное считывание лежит в основе явления фенотипической
супрессии или подавления последствий мутации на уровне фенотипа.
Мутанты такого типа названы «стрептомицинзависимые» или Smd.
Стрептомицин подавляет биосинтез белка монофазным путем: при
увеличении концентрации синтез снижается практически до полной остановки. Относительно действия других аминогликозидов на клетки
можно отметить, что мишень действия та же, однако связываться анти58
биотики могут с обеими субъединицами; одна субъединица может связать более одной молекулы антибиотика.
Следовательно, аминогликозидные антибиотики подавляют синтез
белка трехфазным путем:
1) при низких концентрациях (порядка 2 мкг/мл) наблюдается общее
подавление синтеза;
2) при более высоких (порядка 50 мкг/мл) синтез белка даже стимулируется;
3) при еще больших концентрациях процесс вновь подавляется.
В первом случае считают, что ошибки считывания незначительны;
во втором – ошибки считывания существенны, особенно для терминирующих кодонов, что приводит к синтезу аномально длинных белковых
цепей, и это фиксируется как увеличение синтеза белка. Наконец, в
третьем – молекулы антибиотика способны связываться и занимать новые места на рибосоме.
Таким образом, можно сказать, что летальное действие аминогликозидов обусловлено подавлением диссоциации свободных рибосом; снижением точности трансляции; подавлением транслокации рибосом; подавлением терминации полипептидной цепи.
Устойчивость к аминогликозидам может быть обусловлена как мутациями, затрагивающими хромосомальные гены, так и наличием в клетке плазмид, и проявляется на нескольких уровнях:
• модификации рибосом, которая выражается в изменении или отсутствии белков для связывания антибиотиков – rpsL-мутация (S12) и
rrs-мутация (16S-рРНК);
• снижение транспорта антибиотика в клетку, например, у анаэробных бактерий. В этом случае наблюдается одновременная устойчивость
практически ко всем аминогликозидам;
• синтез ферментов, инактивирующих антибиотики, как правило,
детерминируемый плазмидными генами. Такие ферменты не выделяются
в среду и локализованы на наружной поверхности цитоплазматической
мембраны или в периплазме грамотрицательных бактерий, они требуют
наличия кофакторов и нестабильны при выделении. Известны три типа
таких ферментов: N-ацетилтрансферазы, О-фосфотрансферазы и О-аденилилтрансферазы. В каждом случае происходит взаимодействие фермента с конкретной группой в молекуле антибиотика: NH2-группа может
быть замещена на ацетильный остаток (кофактор АсКоА); ОН-группа –
на остаток фосфорной или адениловой кислот (кофактор АТФ). В молекуле аминогликозидов три функциональные группы подвергаются ацетилированию, шесть – фосфо- или аденилированию.
Фосфотрансферазы (АРН) в зависимости от положения атакуемой
группы делятся на пять подгрупп, обозначаемых А, B, C, D, E. Среди
59
ферментов этих групп описаны несколько, обладающих бифункциональной активностью – фосфо- и ацетилтрансферазной. У исследованных
штаммов стрептококков и стафилококков соотвествующий ген мог быть
локализован как на конъюгативной, так и неконъюгативной плазмидах, а
также хромосомально. Синтез ферментов такого рода обусловливают гены устойчивости в составе транспозонов Tn5, Тn1699, Tn 903 и др.
Аденилилтрансферазы (ААВ или ANT) разделены на пять
различных типов. Ацетилтрансфераз (ААС) известно четыре типа, они
обнаруживаются только у грамотрицательных бактерий, гены имеют
плазмидную или хромосомальную локализацию. Ацетилированию могут
подвергаться только дезоксистрептаминовые антибиотики.
Аминогликозиды относятся к препаратам с низким терапевтическим
индексом, т. е. малым разрывом между терапевтической и токсической
дозой или концентрацией. Такой эффект наиболее часто объясняют тем,
что антибиотики являются поликатионами, а большинство биополимеров
клетки – полианионы. In vitro показано взаимодействие аминогликозидов
с фосфолипидами, липопротеинами, нуклеиновыми кислотами.
Существует модель, согласно которой в нервной ткани аминогликозиды взаимодействуют с полифосфоинозитидами – компонентами мембран. Это приводит к изменению проницаемости для различных катионов. Ототоксический эффект аминогликозидов (влияние на восьмую пару черепно-мозговых нервов и сопутствующая глухота при длительном
применении) связывают с конкуренцией между аминогликозидами и катионами кальция за отрицательно заряженные фосфорные остатки. В некоторых случаях частота ототоксичности наблюдается в пределах
2–25 %. Ототоксический эффект не снимается при прекращении приема
антибиотика, а его наличие зависит от индивидуальных особенностей и
срока приема антибиотика.
Нефротоксический эффект и нейромышечная блокада (курареподобное действие) обусловлены взаимодействием аминогликозидов с
клетками почечных канальцев и с актином. Нефротоксический эффект
может сниматься при прекращении приема антибиотиков. Наиболее
нефротоксичным является гентамицин. Указанные факты, а также развитие аллергических реакций и высокая частота возникновения резистентных форм, ограничивают использование аминогликозидов в клинике.
Тетрациклины – относительно небольшая группа химически весьма сходных соединений, состоящих из четырех конденсированных ароматических колец. Основная масса природных соединений этого класса
обнаружена в 1948–1952 годах. Первым был выделен хлортетрациклин
(S. aureofaciens), существует и другое его название – аурантин (ауреомицин), что свидетельствует об одном из его свойств – наличии золотистой
окраски. Данный антибиотик под названием биовит используется в сель60
ском хозяйстве как добавка в корм животных, что ускоряет рост, повышает привесы, снижает риск развития некоторых заболеваний. В
1952 году при культивировании S. rimosus был выделен тетрациклин, хотя в настоящее время антибиотик получают, выращивая продуцент хлортетрациклина в условиях, когда к образующемуся антибиотику не присоединяется атом хлора (при добавлении барбитала). Тетрациклины являются антибиотиками широкого спектра действия, бактериостатическими в лечебной дозе. Всего описано 35 соединений данной группы, в
клинике для лечения пневмоний, скарлатины, кишечных инфекций, бруцеллеза используются 3–5. Существуют как природные, так и полусинтетические (доксициклин, метациклин) соединения.
Поскольку мишень для действия антибиотиков находится внутри
клеток, встает вопрос о поступлении антибиотика в клетку. Первым
барьером на этом пути является мембрана грамотрицательных бактерий.
Тетрациклины – соединения в разной степени гидрофильные, поэтому
принято считать, что канал OmpF у E. coli или аналогичные каналы у
других бактерий – основной путь их поступления. Связывание с поверхностью микробной клетки, поступление через пориновые каналы и клеточную стенку не требует затрат энергии.
Гораздо более спорным и менее изученным остается вопрос о поступлении антибиотика через цитоплазматическую мембрану. Вывод о том,
что поступление через мембрану является активным, энергозависимым
процессом и осуществляется против градиента концентраций, основан,
прежде всего, на том, что внутриклеточная концентрация антибиотика
может в 10–100 раз превышать внеклеточную. Транспорт тетрациклина
может быть связан с функционированием двух систем: протондвижущей и
связанной с гидролизом фосфатной связи. Для некоторых бактерий
(Staphylococcus, Streptococcus) показано, что компоненты системы транспорта являются термочувствительными и не функционируют при температуре 50–60 ºС, что указывает на возможную белковую природу переносчика. В отдельных случаях, учитывая сходство с оксалоацетатом и
другими дикарбоновыми кислотами, рассматривают возможность поступления тетрациклина через систему транспорта С4 – дикарбоновых кислот.
Рассматривая механизм действия тетрациклина, следует сразу же
указать на тот факт, что антибиотик может связываться и с 80S рибосомами, однако в клетках макроорганизма антибиотик не накапливается, и
не создается такая его концентрация, которая была бы достаточной для
ингибирования биосинтеза белка. Сходный эффект описан также и для
фузидиевой кислоты. В бактериальных же клетках считается установленным фактом (расшифровка механизма началась с середины 1950-х
годов), что тетрациклин является ингибитором элонгации белковой цепи
и препятствует связыванию очередной аа-тРНК.
61
Предполагается, что фиксированная 30S субъединицей рибосомы
молекула тетрациклина, возможно с участием катионов магния, находится в А-сайте и нарушает взаимодействие кодон – антикодон. Тетрациклин удерживается в связанном с рРНК состоянии за счет шести водородных, одной ионной связи, а также различных липофильных и слабых
взаимодействий. Наиболее вероятно, что взаимодействие происходит в
последовательности ГУ:ГЦ или ГЦ:АУ. Тетрациклин занимает участок,
реагирующий с аминоацил-тРНК, фактором элонгации Tu и GTF. Связывание тетрациклина с рибосомой происходит в любом соотношении. На
30S субъединице обнаружено одно место специфического или сильного
связывания, в результате которого блокируется биосинтез белка, и около
500 мест неспецифического связывания. В образовании места связывания антибиотика и рибосомы принимают участие минимум три белка
(S7, S14, S19) и примерно 450 оснований 16S-рРНК. На 50S субъединице
мест связывания тетрациклина не обнаружено.
Устойчивость к тетрациклину может являться следствием различных механизмов, а гены резистентности могут быть локализованы как в
составе плазмид, так и хромосомально, могут организовываться в транспозоны. На рис. 5 представлены возможные последствия взаимодействия
с тетрациклином клеток, различных по чувствительности.
В чувствительные клетки тетрациклин проникает с участием активных переносчиков, и его концентрация в клетке становится выше, чем в
среде, а молекула антибиотика воздействует на А-сайт 30S-субъединицы
(рис. 5, а). При устойчивости, связанной с наличием системы выведения
(efflux) антибиотика из клетки, существует белок цитоплазматической
мембраны, который с затратами энергии удаляет антибиотик, и его концентрация становится ниже внеклеточной и недостаточной для связывания с рибосомами (рис. 5, б). Устойчивость на рибосомном уровне связана с модификацией рибосом, в силу чего антибиотик не может быть долгое время связан с ними (рис. 5, в). Наконец, устойчивость вследствие
внутриклеточной модификации антибиотика связана с его переходом в
неактивную форму (рис. 5, г). Измененный тетрациклин затем диффундирует из клетки. Существует также устойчивость, связанная с потерей
пориновых каналов и отсутствием транспорта антибиотика в клетки грамотрицательных бактерий.
Устойчивость к тетрациклину у бактерий – довольно распространенное явление, поэтому его использование в клинике ограничено. В некоторых случаях клинические изоляты бактерий на 70–90 % являются
устойчивыми к тетрациклину.
Для клиники принципиальное значение имеет устойчивость, связанная с системой активного выведения антибиотика из клетки, а по локализации соответствующих генов – связанная с плазмидами. Плазмиды с ге62
нами резистентности к тетрациклину обнаружены в настоящее время более чем у 25 различных видов грамположительных и грамотрицательных
бактерий. В табл. 10 представлены сведения о распространенности детерминант, обусловливающих различные типы резистентности у бактерий. По своим особенностям – гомологии ДНК, сходству аминокислотных последовательностей белков, связанных с устойчивостью, в зависимости от механизма действия, – все детерминанты делятся на 14 классов.
Tc
Тс
а
Tc
Тс
Тс
Тс
б
Тс
Тс
Тс
в
Тс
Тс
Тс
Тс
О2
t
t
t
г
Рис. 5. Возможные механизмы устойчивости клеток к тетрациклину
Таблица 10
63
Распространенность различных механизмов
резистентности к тетрациклину у бактерий
Классы детерминант
Микроорганизмы
Механизм
А–Е
Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Haemophilus
K–L
Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Bacillus
M, O, S, Q, T, Enterococcus, Clostridium,
P, U, OtrA
Mycoplasma, Listeria, Camphylobacter, Neisseria
F, X
Bacteroides (Tn 4400,
Tn 4351)
Выведение антибиотика из клетки за
счет мембранных белков
Выведение антибиотика из клетки за
счет мембранных белков
Защита рибосом, белок 72 Кд
Модификация тетрациклина, цитоплазматический белок 44 Кд
Два семейства генов (классы A – E, K – L) определяют функционирование в резистентных клетках механизма активного выведения антибиотика.
У грамотрицательных бактерий это классы детерминант А – Е. Резистентность клеток за счет активного выведения антибиотика – основной механизм устойчивости, распространенный среди клинических изолятов многих видов бактерий. Так, к классу А относят детерминанты резистентности, обнаруженные в составе плазмиды RP4 и транспозона
Tn1721; в классе В наиболее изученным является Tn10; в классе С – детерминанты из плазмиды pBR322. У бактерий Pseudomonas наиболее
часто встречаются детерминанты класса А, у Aeromonas – класса Е, у
кишечных бактерий, кроме E. coli, – класса D. Одной из особенностей
таких детерминант тетрациклинрезистентности является их индукция
при наличии молекулы тетрациклина, которая взаимодействует прямо с
димерной формой белка-репрессора. В последние годы дополнительно
идентифицированы детерминанты классов tetG (Vibrio), tetH (Pasteuriella), tetI (E. coli, P. aeruginosa).
Общая схема организации детерминант такого типа следующая:
имеется ген-репрессор и структурные гены. В частности, для наиболее
изученного транспозона Tn10 соответствующие гены обозначены tetR,
tetA, tetB. При отсутствии тетрациклина (или других родственных соединений-индукторов) в клетке обнаруживается низкий уровень белкарепрессора. Этот белок осуществляет негативную регуляцию синтеза
продуктов как структурных, так и собственного гена. В присутствии те64
трациклина репрессор отделяется от ДНК, и обеспечивается транскрипция в разных направлениях соответствующих генов. Белок, кодируемый
структурными генами, состоит из двух полипептидных цепей и локализован в мембране, его сверхпродукция приводит к неограниченной
транслокации протонов через мембрану и, в конечном итоге, к гибели
клеток.
Между генами, относящимися к различным классам (А – Е), существует определенная гомология (от 45 до 80 %). Следует отметить, что
«гибридные» белки, содержащие С- или N-участки от белков различных
классов (например, А/Е или С/В), проявляют в клетке защитный эффект
в различной степени (от максимальной устойчивости до полного ее отсутствия).
У грамположительных бактерий аналогичный механизм резистентности обеспечивают детерминанты классов K и L, белковые продукты
которых гомологичны примерно на 70 %.
Принципиально другой механизм резистентности обеспечивают детерминанты классов K – L, определяющие наличие белка, модифицирующего и защищающего рибосомы. Такие белки, обозначенные RP (ribosome protection), обнаружены у грамотрицательных, грамположительных и анаэробных бактерий. Сходство между белками незначительно. Белки, являющиеся продуктами этих генов, имеют молекулярную массу 68–70 Кд. Недавно пришли к заключению, что существует
восемь классов таких белков, в состав этих классов входит также семейство белков otrA, найденных у штамма-продуцента антибиотика. На основании сходства аминокислотных последовательностей белки делят на
четыре группы. Все белки имеют G-домен на N-концевом участке молекулы, который гомологичен таковому фактора EF-G и EF-Tu. Связываясь
с рибосомами, белок препятствует связыванию с ними тетрациклина, но
не аминоацил-тРНК. Экспрессия некоторых белков RP регулируется на
уровне транскрипции.
Долгое время открытым оставался вопрос о наличии детерминант,
связанных с образованием ферментов, инактивирующих тетрациклин.
Следует отметить, что молекула тетрациклина является крупной, с двойными связями, и существует множество возможностей для ее окисления,
восстановления и, следовательно, инактивации. Относительно недавно
были обнаружены детерминанты, обеспечивающие функционирование
механизма такого типа. Было показано, что при выращивании бактерий
E. coli, в клетках которых резистентность обусловлена либо системой активного выведения антибиотика, либо ранее неизвестными причинами
(детерминанты классов С и Х), в культуральной жидкости впоследствии
65
обнаруживаются соединения со спектрами поглощения, характерными
для тетрациклина (364 нм) либо с измененными (258 нм). Выделенный в
последнем случае белок ТЕТ Х имеет молекулярную массу 44 Кд, богат
метионином. Он относится к типу НАДФ-оксидоредуктаз и неспецифически может окислять тетрациклин, также как и другие соединения с фенольной структурой, например лигнин.
Следует указать, что широкое распространение получило присутствие в одном и том же штамме детерминант нескольких различных типов.
Это относится к представителям родов Enterococcus, Streptococcus.
Тетрациклин, и особенно его полусинтетическое производное доксициклин, широко используется в клинике. К его отрицательному действию можно отнести фототоксический эффект; способность связывать катионы кальция и тем самым нарушать формирование зубов и костей.
Особенно вредно его использовать беременным женщинам и детям до 7–
8 лет.
Макролидные антибиотики относятся к соединениям, блокирующим процессы биосинтеза белка в области 50S субъединицы рибосом.
Структура антибиотиков достаточно сложна, так как они содержат макроциклы из 14 (эритромицин, кларитромицин, олеандомицин); 15 (азалиды, сумамед, азитромицин) и 16 (спирамицин, джозамицин, тилозин)
атомов углерода, к которым присоединяются нейтральные или аминосахара. Всего обнаруживается в составе различных антибиотиков пять различных амино- и 11 нейтральных сахаров. Известно около 100 природных и полусинтетических производных, которые обладают бактериостатическим действием, в основном против грамположительных кокков,
редко – в отношении грамотрицательных бактерий. С клинической точки
зрения данные антибиотики могут быть разделены на противобактериальные и противогрибковые (полиены). Первым обнаруженным в 1952
году соединением этой группы был эритромицин (S. erythreus = Saccharopolyspora erythraea). Следует отметить, что в последние годы были
обнаружены и 12-членные макролиды, образуемые Penicillium и получившие название патулолиды, а также получены производные макролидов – кетолиды с весьма интересными для клиники свойствами.
Макролиды – крупные гидрофобные структуры, поэтому их поступление в клетки грамотрицательных бактерий ограничено, но если процесс происходит, то считают, что он обеспечивается наличием пориновых каналов. Через цитоплазматическую мембрану поступление антибиотиков происходит, вероятно, путем пассивной диффузии.
Проникая в клетку, антибиотик связывается с 50S субъединицей рибосомы, причем такое связывание обратимо и происходит за счет водо66
родных связей. Для связывания антибиотика обязательно наличие интактного лактонного кольца и хотя бы одного сахара. Макролид более активен
обычно, если таким остатком сахара в молекуле является аминосахар. При
взаимодействии эритромицина с 50S субъединицей в образовании места
связывания участвуют и 30S субъединица, и 23S-рРНК. При определении
места связывания за основу было взято определенное сходство участка
(сахар + часть лактонного кольца) с участком пептидил-тРНК.
Современная концепция действия эритромицина на белковый синтез рассматривает антибиотик как аллостерический эффектор пептидилтрансферазы. Эффектор означает, что эритромицин может как подавлять,
так и стимулировать образование пептидной связи. Основополагающим
явился тот факт, что эритромицин не подавляет образование первой пептидной связи. Однако, если имеется хотя бы дипептид, наблюдается подавление данной реакции, т. е. Р-сайт должен быть занят пептидил-тРНК
с определенной минимальной последовательностью аминокислот.
Эритромицин рассматривают и в связи с изучением транслокации
пептидной цепи (т. е. при перемещении пептидил-тРНК из А- в Р-сайт;
вытеснение из Р-сайта тРНК; перемещение мРНК). В системе in vitro
(рибосомы E. coli, присутствие других ингибиторов белкового синтеза,
тРНК с различными по длине пептидами) исследовалось влияние на белковый синтез эритромицина. Оказалось, что связывание эритромицина с
рибосомой приводит к нарушению расположения в Р-сайте возвращающейся из А-сайта пептидил-тРНК. Возможно, что она располагается при
этом даже не в Р-сайте, а рядом с ним. В результате этого не вытесняется
в окружающую среду уже деацитилированая тРНК, а неправильное расположение пептидил-тРНК по отношению к Р-сайту обрывает функционирование системы. А-место на рибосоме не изменяется в присутствии
эритромицина и может принимать тРНК.
Рибосомы эукариотических клеток макролиды не связывают, а митохондриальные рибосомы защищены мембраной, через которую они не
проникают.
В настоящее время описано несколько механизмов резистентности
к макролидам. Следует учитывать природную резистентность у грамотрицательных бактерий за счет отсутствия поступления через наружную мембрану. Для E. coli описаны мутанты с повышенной резистентностью к эритромицину и другим макролидам за счет изменения некоторых
белков 50S субъединицы. Это приводит к ослаблению способности рибосом связывать эритромицин. Считают, что как минимум шесть или семь
белков участвуют в таком связывании.
Значительно больший интерес представляет MLS-резистентность
(макролиды, линкозамины, стрептограмин), описанная для Staphylococ67
cus и Streptococcus. Гены, отвечающие за такой тип резистентности (ermгены), могут быть локализованы как на хромосоме, так и в плазмидах. Их
насчитывается семь классов. Продуктом данных генов является специфическая метилаза, катализирующая метилирование определенных остатков аденина в 23S-рРНК. Например, у E. coli происходит диметилирование остатка А-2058 в петле V, включенного в перенос пептидильного
фрагмента. Возможна также замена аденина в этом (или сходных положениях у других организмов) на другой нуклеотид. Количество метилированных остатков – 2–3 на молекулу. Индукция синтеза метилазы происходит обычным путем: антибиотик воздействует на регуляторный белок на уровне транскрипции. Индуцирующими могут быть бактериостатические концентрации любого из антибиотиков. Такой тип резистентности носит название диссоциирующей. Удаление индуктора приводит к
потере MLS-резистентности. Проблема достаточно актуальна, так как в
животноводстве часто используется тилозин, и в этих случаях наблюдалось повышенная частота выделения грамположительных бактерий с таким типом устойчивости.
Все большее распространение получает механизм резистентности за
счет образования клетками инактивирующих макролиды ферментов, которые могут быть трех типов: фосфорилирующие или гликозилирующие
молекулу и эстеразы, расщепляющие лактонное кольцо. Фосфорилирующие ферменты инактивируют лактонное кольцо в присутствии АТФ
и магния; гликозилирующие нуждаются в УДФ-глюкозе как кофакторе.
Особое внимание в последнее время уделяется эстеразам, которые впервые были обнаружены у Pseudomonas, E. coli. Считают, что проблема их
распространения как факторов резистентности приобретает для клиники
такое же значение, как и продукция лактамаз и аминогликозидинактивирующих ферментов. В настоящее время описаны два типа изоферментов – эстеразы I и II. Наконец, в последние годы у Staphylococcus обнаружен механизм, обусловливающий резистентность за счет энергозависимого выброса антибиотика из клетки, что сопровождается наличием в
клетке плазмиды определенного типа.
Применение макролидов в клинике ограничено по двум причинам:
они являются нейтральными или основными соединениями, поэтому наблюдается плохое всасывание в организме; вторая причина – широкое
распространение устойчивых штаммов.
Бактериостатическое действие хлорамфеникола, выделенного в
1947 году и образуемого S. venezuellаe, основывается на ингибировании
синтеза белка на 70S рибосомах. Показано, что антибиотик связывается с
одним белком малой субъединицы и семью белками большой субъединицы. Хлорамфеникол ингибирует активность пептидилтрансферазы.
68
Это антибиотик широкого спектра действия, хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта. Используется для лечения инфекций, вызываемых кокками, лихорадки Скалистых гор, сыпного тифа. Основное побочное действие – поражение костного мозга, анемия, лейкопения.
Устойчивость к хлорамфениколу определяется наличием фермента
хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ). Этот фермент участвует в
ацетилировании с помощью АсКоА гидроксильной группы антибиотика.
САТ – тетрамер, состоящий из идентичных полипептидных цепей, каждая из которых участвует в образовании активного центра. У энтеробактерий обнаружены четыре типа САТ, которые различаются по электрофоретической подвижности, чувствительности к ингибиторам, серологическим свойствам. Например, штаммы энтеробактерий, устойчивые к
хлорамфениколу и фузидиевой кислоте, содержат САТ I типа, и показано, что устойчивость к обоим антибиотикам кодируется одним и тем же
геном. Это объясняют тем, что фермент имеет домен, который легко связывается с ароматическими соединениями, структурно не сходными с
хлорамфениколом.
Надо отметить, что активные центры ферментов САТ всех четырех
типов имеют сходные последовательности. Все ферменты энтеробактерий являются конститутивными, и синтез их детерминируется плазмидными генами.
Фузидиевая кислота, относящаяся к группе стероидных соединений, была выделена в 1960 году из культуральной жидкости гриба Fusarium coccidium. В первых исследованиях было показано, что антибиотик
активен в отношении широкого круга грамположительных бактерий,
особенно стафилококков, обладает низкой токсичностью.
Фузидиевая кислота in vivo и in vitro ингибирует синтез белка в прои эукариотических клетках на том этапе, когда происходит транслокация, в результате чего рибосома передвигается относительно мРНК на
один кодон (рис. 6). Рибосома содержит пептидил-тРНК в сайте А, деацетилированная тРНК находится в сайте Р и в процессе транслокации
удаляется. Пептидил-тРНК передвигается из А- в Р-сайт, а рибосома, соответсвенно, на один кодон. Транслокация нуждается в факторе элонгации (транслоказе), который катализирует гидролиз ГТФ. Для этого образуется комплекс с ГТФ, который гидролизуется на рибосоме с высвобождением ГДФ, рибосомы и фактора G. Фузидиевая кислота стабилизирует этот комплекс и препятствует вследствие этого повторному использованию фактора элонгации G и ГДФ. На 80S рибосомах мишенью для
действия является фактор элонгации 2, однако вследствие малой внутриклеточной концентрации антибиотика его токсическое действие не проявляется.
69
пептид
пептид
тРНК
тРНК
аа-тРНК
транслокация
EF-G, GTF
Рибосома + EF-G + GTF
Рибосома: EF-G::GTF
(комплекс 1)
Фузидиевая кислота
Рибосома + EF-G + GTF
Рибосома : EF-G::GDF + Pi
(комплекс 2)
Рис. 6. Ингибирующее действие фузидиевой кислоты на процесс
биосинтеза белка
Устойчивость к фузидиевой кислоте обусловлена изменением фактора элонгации за счет хромосомальных мутаций, что приводит к изменению белоксинтезирующей системы. Такие мутанты характеризуются
низкими скоростями роста. Другой механизм опосредован наличием
плазмидных генов и связан с удалением антибиотика из клетки. Наконец,
существует механизм устойчивости за счет хлорамфениколацетилтрансферазы I типа энтеробактерий, которая связывает молекулу антибиотика
и препятствует связыванию с фактором G.
9. АНТИБИОТИКИ — ИНГИБИТОРЫ РЕПЛИКАЦИИ
И ТРАНСКРИПЦИИ ДНК И РНК
Антибиотики, относящиеся к данной группе, могут быть разделены
следующим образом:
1) ингибиторы синтеза предшественников нуклеиновых кислот;
2) ингибиторы реакций полимеризации, среди которых:
• ингибиторы матричных функций ДНК;
• ингибиторы ферментов (ДНК-полимераз, РНК-полимераз и др.).
70
Антибиотики, относящиеся к первой группе, как правило, рассматриваются как потенциальные соединения при терапии опухолей и вирусных инфекций. Однако их не следует считать соединениями с избирательным действием, так как нуклеотиды участвуют во множестве клеточных процессов и их эффект достигается за счет совокупного действия
на клетку.
Для большинства антибиотиков данной группы механизм действия
заключается в ингибировании ферментов на отдельных этапах пути синтеза нуклеотидов. Так, например, азасерин имеет большое сходство с
глутамином, и при образовании связи с одним из ферментов пути биосинтеза пуринов ковалентная связь между SH-группой цистеина в молекуле фермента и азасерином более прочна, чем между глутамином и
ферментом. По такому же механизму действует и диазооксонорлейцин.
Ингибиторы конкретных реакций не имеют высокой специфичности и по
этой причине ингибируют ряд реакций, в которых принимает участие
глутамин. Аналогом аспарагиновой кислоты является хадацидин (Penicillium), который действует на стадии амидирования УМФ, причем его участие в реакции является достаточно специфичным.
К веществам – ингибиторам синтеза пуринов относятся синтетические соединения из группы сульфаниламидов, триметоприм, метотрексат. Их действие основано на подавлении синтеза фолиевой кислоты на
разных стадиях. Мишенью для действия сульфаниламидов является
фермент дигидроптероатсинтаза (ДГПС); для триметоприма – дигидрофолатредуктаза (ДГФР), которая восстанавливает фолиевую кислоту в
ди- и тетрагидрофолиевую. Последняя является донором одноуглеродных единиц на стадии синтеза пуринов и пиримидинов. Сульфаниламиды по структуре близки к парааминобензойной кислоте, и возможный
механизм их действия заключается в подавлении включения ПАБК в
фолиевую кислоту либо включение вместо ПАБК. Добавление фолиевой кислоты экзогенно не снижает ингибирующий эффект, поскольку
она не в состоянии проникать в клетки бактерий. На клетки животных
сульфаниламиды не действуют, так как они не синтезируют фолиевую
кислоту (рис. 7).
Резистентность определяется наличием ДГПС, устойчивых к
сульфаниламидам. Кроме хромосомально локализованных генов их синтеза, имеются также и гены, локализованные на плазмидах и детерминирующие ДГПС I и ДГПС II. Ферменты характеризуются различной стабильностью при разных температурах, молекулярной массе и обладают
71
при этом слабым сродством к сульфаниламидам, но не к ПАБК. Показано, что ферменты I типа обнаруживаются чаще всего у плазмидсодержащих штаммов энтеробактерий с множественной лекарственной резистентностью. Такие плазмиды являются конъюгативными. Ферменты II
типа cинтезируются клетками с неконъюгативными плазмидами IncQ
групп несовместимости, имеющими дополнительно устойчивость к
стрептомицину, обусловленную наличием фосфоаденилилтрансфераз.
Считают, что оба типа ферментов синтезируются конститутивно, хотя их
синтез и находится под контролем разных промоторов. Менее распространенной является устойчивость, связанная со снижением поступления
антибиотика в клетку.
птеридин +
парааминобензойная кислота
дигидроптероатсинтаза
сульфаниламид
дигидроптероевая кислота +
глутаминовая кислота
дигидрофолат
дигидрофолатредуктаза
триметоприм
тетрагидрофолат
пурины
тимидилат
метионин
Рис. 7. Мишени для действия сульфаниламидных
препаратов в клетке
72
Устойчивость к триметоприму, детерминируемая плазмидными генами, связана с образованием четырех типов ДГФР. Ферменты I и II типа
определяют высокий уровень резистентности (200–1000 мкг/мл), а их
синтез детерминируют гены, находящиеся в составе Tn7 и Tn702. Ферменты III и IV типа определяют средний (100 мкг/мл) и низкий
(8 мкг/мл) уровень резистентности соответственно. Ферменты отличаются друг от друга и от хромосомально локализованных генов по молекулярной массе, оптимуму рН, стабильности, чувствительности к ингибиторам и т. д. Устойчивость, определяемая хромосомальными генами,
связана с повышенной продукцией фермента (в 80–100 раз).
Обычно в клинике оба препарата используются в комплексе (бисептол, сульфатон) для лечения урогенитальных инфекций и инфекций пищеварительного тракта (этазол, фталазол). Следует отметить, что используемые по отдельности препараты обладают бактериостатическим, а
совместно – бактерицидным действием. Возможным побочным действием является кристаллурия: образование в печени нерастворимого ацетата
сульфаниламида; изменение формулы крови, повышенная чувствительность к препаратам.
К числу ингибиторов матричных функций ДНК относятся соединения, которые могут препятствовать за счет встраивания в нее процессу
транскрипции или же способны вызывать изменения структуры за счет
разрывов, модификации или выщепления цепей ДНК.
Модификацию цепей за счет встраивания осуществляют некоторые
интеркалирующие соединения, гистологические красители (акридины,
бромистый этидий). Красители легко связываются с ДНК in vitro, вызывая при этом изменение флуоресценции. Существуют данные, которые
позволяют утверждать, что профлавин может связываться с ДНК сильно
(первичное связывание) или более слабо (вторичное). Специфичности
связывания красителей с определенными парами оснований не обнаружено. Показано, что плоская ароматическая молекула профлавина интеркалирует между парами оснований. Пары оснований при этом остаются
перпендикулярными оси спирали, но раздвигаются на 3,4 Å (толщина
профлавина). Известно также, что одно связывание приходится на 2–2,5
пары оснований. На первой стадии происходит быстрое, зависящее от
концентрации связывание с ДНК за счет электростатических сил. В результате следующих стадий наблюдается интеркаляция, вероятно, за счет
изгибания молекулы ДНК.
Связывание с ДНК придает молекуле некоторые измененные свойства: увеличивается вязкость растворов ДНК, снижается коэффициент
седиментации, а термостабильность молекулы повышается. Степень из73
менений пропорциональна количеству вещества. ДНК с интеркалированными красителями имеет более жесткую структуру, следовательно,
увеличивается вязкость растворов. Снижение седиментации и плавучей
плотности связано с уменьшением массы на единицу длины, так как интеркалирующий агент имеет те же размеры, что и нуклеотид, но в два
раза меньшую массу. Более высокая термостабильность объясняется тем,
что для удаления агента из спирали требуются дополнительные затраты
энергии. При взаимодействии с ДНК интеркалирующие соединения
предпочитают суперскрученную структуру.
По механизму интеркалирующего взаимодейсвтия с ДНК работают
и многие противоопухолевые антибиотики. Такие антибиотики получили
название межкаланты. Следует отметить, что чрезвычайно сложно в
данном случае выделить только одно воздействие противоопухолевых
антибиотиков: как правило, эффект бывает многофункциональным, затрагивающим различные уровни метаболизма клетки. В различных странах к применению разрешены блеомицин, рубомицин (дауномицин), митомицин С, актиномицин D (дактиномицин).
Наличие противоопухолевой активности у актиномицинов, выделенных в 1940 году, было продемонстрировано только в 1952 году. Антибиотики продуцируются Streptomyces antibioticus семействами. В настоящее время выделено около 100 различных актиномицинов, продуцируемых примерно 50 видами актиномицетов. В лечебной практике используются два препарата с очень высокой токсичностью – актиномицин
Д и С. Молекула антибиотика состоит из хромофорной части (актиноцина) и чаще всего депсипептидной части, представленной двумя лактонными пентапептидами. В образовании лактонной части участвует треонин, а ее разрыв принципиален для активности антибиотика. Синтез антибиотика происходит в два этапа: синтез хромофорной части и синтез
нерибосомным путем пептидного фрагмента.
Особенностью биологического действия актиномицина Д является
то, что он действует на микробные клетки, ингибирует рост нормальных
и малигнизированных клеток животных, подавляет рост опухолей. Однако в качестве антибактериального препарата не используется, так как обладает малой токсичностью, а в клетки грамотрицательных бактерий
проникает плохо.
Установлено, что антибиотик ингибирует ДНК-зависимый биосинтез РНК за счет образования комплекса с ДНК-матрицей без взаимодействия с РНК-полимеразой. Актиномицин ингибирует стадию элонгации
цепи РНК, его функция состоит в том, что он препятствует продвижению
РНК-полимеразы вдоль ДНК. Для выполнения данной функции необхо74
димо образование прочного, медленно диссоциирующего комплекса. Для
этого ДНК должна находиться в двуспиральном состоянии в β-конфигурации, в ее составе должны быть остатки гуанина с NH2-группами,
расположенными в малой бороздке. При различном содержании ГЦ-пар
число мест связывания актиномицина Д составляет 5–6 на 100 п.о. ГЦ,
т. е. не все остатки гуанина участвуют в реакции.
В различное время появилось несколько моделей для объяснения
связывания актиномицина Д с ДНК, и их разделили на два типа: модели
поверхностного связывания и интеркаляционные. Предполагается, что
молекула актиномицина Д частично погружается в малую бороздку
двойной спирали и удерживается там за счет водородных связей между
функциональными группами антибиотика и ДНК. Вторая модель предполагает, что актиномицин Д внедряется между парой ГЦ и соседней за
счет хромофорной части молекулы.
Эксперименты на клетках животных показали, что актиномицин Д
способен превращаться ферментами микросомальной фракции печени в
свободный радикал. Такой радикал является фармакологически активным, и существуют два пути его действия на клетку: конформационные
изменения гидрофобной области мембран, что нарушает их транспортную функцию и вызывает гибель клетки, и образование активных форм
кислорода, что вызывает перикисное окисление липидов, повреждения и
разрыв ДНК.
Группа антрациклиновых антибиотиков содержит в своей структуре антратетрациклиновый хромофор, связанный с одним или несколькими остатками сахаров. Антибиотик рубомицин (S. rubomycini) выделен в
1971 году, в качестве сахарного остатка содержит необычный сахар даунозамин. Антибиотик активен в отношении грамположительных бактерий, грибов, простейших, обладает сильно выраженной антимитотической активностью, вызывает хромосомные аберрации и разрывы в ДНК.
Активность данных антибиотиков, вероятно, связана с нарушением
матричной активности ДНК в процессе репликации или транскрипции в
результате образования стабильных комплексов антибиотика с ДНК.
Считают, что в основе действия на ДНК лежит образование интеркаляционных комплексов. Молекула антибиотика встраивается в цепь ДНК
без выраженной специфичности, хромофор интеркалирует между парами
основаниий, а сахар располагается в малой бороздке. Вклад в противоопухолевую активность вносит и образование одно- и двухнитевых разрывов, возможной причиной чего является образование свободных радикалов при активации антибиотика микросомальной фракцией.
75
Блеомицины (S. verticillus) выделены в 1966 году и синтезируются в
виде комплексов, состоящих из 2–5 различных молекул. Антибиотик
очень активен в отношении грамположительных и грамотрицательных
бактерий, способен вызывать образование нитевидных форм, индуцировать синтез колицинов и исключение профага, обладает противоопухолевой активностью. Считают, что в образовании комплексов с ДНК важную роль играет процесс интеркаляции. Действительно, обнаружено раскручивание витков спирали на 3,1 А при связывании с молекулой антибиотика, интеркаляция и фрагментация ДНК происходят чаще в последовательности ГЦ или ГТ. Косвенным доказательством интеркаляции
является образование мутаций со сдвигом рамки.
Блеомицин связывается с ДНК за счет механизмов, не требующих
наличия ионов металлов. Однако для фрагментации ДНК определенные
ионы металлов, например железа, все же необходимы. Деградацию определяет тройной комплекс: блеомицин – ДНК – железо (II). Окисление
этого комплекса приводит к генерированию гидроксильных радикалов в
непосредственной близости к ДНК, что и определяет процесс. Особое
значение имеет наличие кислорода. Эксперименты показали, что разрыв
связи происходит между С3 м С4 атомами углерода в дезоксирибозе.
Митомицин С относится к группе хиноксалиновых антибиотиков.
Выделен в 1956–1958 годах из культуральной жидкости S. caespitosus. Антибиотик проявляет активность в отношении бактерий, простейших, водорослей, опухолевых клеток. Как в бактериальных клетках, так и в клетках животных антибиотик избирательно подавляет синтез ДНК.
В. Шибальски показал, что митомицин С вызывает образование поперечных сшивок в ДНК после внутриклеточной активации антибиотика. Считают, что в клетке происходит восстановление митомицина до гидрохинонов, а образующееся реакционноспособное соединение по двум центрам может атаковать гуанин, после чего и образуются сшивки. Причем
они являются высокостабильными, т. е. антибиотик – бифункциональный
алкилирующий агент. Образование сшивок приводит к нарушению разделения нитей ДНК при репликации. Частота образования сшивок возрастает с увеличением содержания ГЦ-пар. В синтетических нуклеотидах алкилирование гуанина происходит в четыре раза чаще, чем других нуклеотидов. Алкилированная митомицином С ДНК обладает пониженной матричной активностью в РНК- или ДНК-полимеразных реакциях, значительно медленнее расщепляется различными экзонуклеазами.
К соединениям – ингибиторам активности ферментов, участвующим в репликации и транскрипции ДНК, относятся высокоактивные бактерицидные синтетические химиотерапевтические средства широкого
76
спектра действия, получившие название хинолонов и фторхинолонов.
Препараты группы хинолонов (налидиксовая кислота) предложены к использованию в 1962 году, фторхинолоны – в 1978–1980 годах. В соответствии с активностью среди препаратов данной группы нефторированные
соединения относят к I и II поколениям, фторированные производные
делят на препараты III и IV поколений.
Сравнивая общую структуру хинолонов и фторхинолонов, можно
отметить, что принципиальными изменениями, влияющими на антибактериальную активность, являются наличие атома фтора в положении 6 (в
цикле В) и наличие в цикле А шестичленного цикла с кето- и карбоксильной группой по отношению к азоту. Далее принципиальным является также наличие в цикле В заместителей по 7 положению (пиперазиновый цикл). В настоящее время получены ди- и трифторированные хинолоны, однако улучшение их свойств требует и специфических заместителей по другим положениям. На данный момент в практике используется 15 препаратов. Их особенности представлены в табл. 11.
Поступление в клетку препаратов группы хинолонов определяется
их гидрофобностью, а также способностью взаимодействовать с катионами наружной мембраны. Считается, что нефторированные соединения,
которые являются гидрофобными, поступают непосредственно через
слой фосфолипидов и липополисахаридов, а фторированные – через пориновые каналы, например ompF. Взаимодействие с катионами магния
нарушает целостность мембраны, и, следовательно, используется механизм «самопромотирования». Через цитоплазматическую мембрану антибиотик поступает путем диффузии через фосфолипидные слои, создается градиент концентрации между ее наружной и внутренней поверхностью. Поступление антибиотиков не требует затрат энергии.
Механизм действия антибиотиков был расшифрован в середине
1970-х годов, и долгое время считалось, что основной мишенью является
ДНК-топоизомераза II, которая присутствует и у про- (ДНК-гираза II), и
у эукариот, но имеет различную структуру. Фермент является тетрамерным белком и состоит из двух субъединиц А и В, которые катализируют
строго определенные этапы в процессе формирования необходимой укладки ДНК в хромосоме:
1) разрыв спирали ДНК и образование комплекса ДНК + субъединица А;
2) отрицательная спирализация, энергозависимый процесс, гидролиз
АТФ в присутствии Mg2+ – субъединица В;
3) восстановление двойной спирали, формирование окончательной
укладки ДНК – субъединица А.
77
Таблица 11
Некоторые особенности клинического использования
соединений группы хинолонов и фторхинолонов
Фторхинолоны
Нефторированные соединения
Широкий спектр действия: грамположительные и грамотрицательные
бактерии, аэробы и анаэробы, микобактерии, микоплазмы, хламидии,
риккетсии, боррелии
Высокая степень биодоступности
Оптимальные фармакокинетические
свойства; хорошее проникновение в
органы и ткани, биологические жидкости
Широкие показания к применению
Спектр действия ограниченный, активность в отношении Enterobacteriaceae
Биодоступность невысокая
Плохое проникновение, высокая концентрация в моче
Ограниченные показания к применению:
инфекции мочевыводящих путей, кишечные инфекции
Применение внутрь и парентерально, Применение внутрь и парентерально, хохорошая переносимость
рошая переносимость
Применение у взрослых
Применение у взрослых и в педиатрии
Считают, что в субъединице А имеются различные функциональные
домены. В N-участке остаток tyr122 способен за счет гидроксильной
группы взаимодействовать с одним 5′-фосфатом углеводно-фосфатного
остова ДНК, именно это и обеспечивает разрыв-воссоединение молекулы
ДНК. На каталитическую функцию тирозина влияют и прилегающие остатки аминокислот от 67 до 106, особенно серин в 83 и аспарагин – в 87
положениях. Данные аминокислоты образуют так называемый «хинолоновый карман».
Существует несколько моделей молекулярных механизмов действия
антибиотиков, принципиально не отличающихся между собой. Прежде
всего, отмечают, что сходства между ДНК, АТФ и фторхинолонами не
существует, следовательно, не может быть конкурентного ингибирования.
Скорее всего, молекулы хинолонов связываются непосредственно с однонитевой ДНК, образуемой гиразой, и реагируют с азотистыми основаниями за счет образования водородных связей своих 3-карбокси- и 4-оксогрупп. Возможно, что хинолоны стабилизируют связывание ДНК и гиразы, обусловливая конформационные изменения комплекса или препятствуя внутренней подвижности субъединиц гиразы. Это происходит перед
разрывом ДНК, в результате прекращается не только репликация, но и
транскрипция. В последнее время учитывают, что фторхинолоны могут
влиять и на ДНК-топоизомеразу IV, обеспечивающую расщепление цепей
78
после завершения репликации. ДНК-топоизомераза IV состоит из четырех
полипептидных цепей, обозначаемых С2F2. При этом у грамотрицательных бактерий более чувствительной является топоизомераза II, а у грамположительных – топоизомераза IV. Гены, кодирующие синтез топоизомераз, обозначаются Gyr A, Gyr B и Par A, Par B соответственно.
После поступления в клетку и взаимодействия с ДНК-гиразой происходит следующее:
• нарушение биосинтеза белка, индукция белков SOS-ответа (нарушение деления клеток, образование филаментов);
• при высоких концентрациях антибиотика наступает необратимое
нарушение деления, глубокие структурные изменения в ядре и цитоплазме клеток и их гибель.
Отмечая бактерицидный эффект действия, указывают, что хинолоны
и фторхинолоны в высоких концентрациях ингибируют биосинтез белка
и РНК. В качестве последствий действия антибиотиков всех типов отмечают механизм А in vitro (парадоксальный эффект): снижение бактерицидной активности, так как при таких концентрациях подавляется синтез
белка и РНК. Такой эффект может быть и при совместном действии с ингибиторами синтеза белка (тетрациклином, хлорамфениколом). Другой
механизм действия В – сохранение бактерицидной активности в условиях подавления синтеза белка и РНК. Он показан для некоторых препаратов и, наряду с механизмом А, проявляется или отсутствует в зависимости от вида или штамма бактерий. Наконец, некоторые препараты могут
проявлять свое действие в отношении неделящихся клеток, находящихся
в буфере (механизм С) (рис. 8).
В механизме действия следует учитывать и эффект на клетку суббактериостатических концентраций антибиотиков: снижаются адгезивные свойства бактерий, подавляется индукция экзо- и эндотоксинов и
ферментов, снижаются вирулентные свойства, повышается чувствительность клеток к фагоцитозу. Лечебные свойства фторхинолонов повышаются в присутствии аминогликозидных антибиотиков, что объясняется
общими путями поступления, нарушением ori репликации; антагонистическими являются препараты – ингибиторы биосинтеза белка и РНК; индифферентными – β-лактамные антибиотики.
В настоящее время описаны три механизма устойчивости к фторхинолонам, хотя и отмечают, что спонтанные мутации возникают с низкой
частотой – 10–9–10–11. Наиболее важным считают тип мутаций, приводящий к изменению ДНК-гиразы. Эти мутации являются хромосомальными и определяют устойчивость ко всем хинолонам и фторхинолонам.
Наиболее высокий уровень резистентности обеспечивается мутациями в
субъединице А, в этом случае фиксируют изменения в соответствующих
участках белка, так называемых «хинолоновых карманах».
79
Механизм А
Действие на клетки при синтезе белка и РНК
Парадоксальный эффект in vitro
БАКТЕРИЦИДНЫЙ ЭФФЕКТ
Ингибирование ДНК-гиразы и синтеза ДНК
Механизм В
Устойчивость к
процессу подавления синтеза белка:
ципрофлоксацин,
офлоксацин,
ломефлоксацин
Механизм С
Действие на покоящиеся клетки:
ципрофлокцин,
офлоксацин,
норфлоксацин
Рис. 8. Различные механизмы действия хинолонов
и фторхинолонов на клетки микроорганизмов
Причиной развития устойчивости может быть и снижение проницаемости наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Эти мутации затрагивают Omp-белки или липополисахариды. У белков изменяются некоторые свойства (молекулярная масса) либо некоторые типы отсутствуют вовсе. В липополисахаридах отмечают укорочение длинноцепочечного компонента – О-полисахарида. Третьей причиной возникновения резистентных форм следует считать активный выброс (efflux) антибиотика из клетки, обнаруженный у P. aeruginosa. Данный процесс
обеспечивается белками оперона mex – opr, что и приводит к резкому
снижению внутриклеточного содержания антибиотика.
Следует также отметить, что существуют ингибиторы функционирования и субъединицы В ДНК-гиразы. Это антибиотики новобиоцин
(S. niveus) и коумермицин (S. sphaeroides).
Среди положительных моментов использования данных синтетических препаратов отмечают низкую частоту формирования резистентных
форм; незначительные побочные реакции: препараты снимают в 2 %
случаев. Ограничено использование препарата в педиатрии, так как может нарушаться рост ювенильных хрящей и развитие скелета.
80
На базе фторхинолонов и цефалоспоринов создаются новые лекарственные формы – пролекарства (prodrugs). Между двумя молекулами
формируется ковалентная связь. Попадая в клетки совместно, каждый
компонент реагирует со своей мишенью. Накапливаются в клетке в
больших концентрациях, чем каждая составляющая по отдельности.
Антибиотики-анзамицины с химической точки зрения напоминают макролиды, однако образование цикла происходит через амидную
группу. Ароматическая часть молекулы представляет собой либо бензольное, либо нафталиновое ядро. В зависимости от того, какой связью
соединяются ароматическая и лактамная часть молекулы (через углерод
или кислород), выделяют стрептоварицины и рифамицины. Полусинтетические рифамицины получили название рифампицинов.
Рифампицин связывается с РНК-полимеразой в соотношении 1:1,
при этом значение имеет наличие макроциклического кольца. При известной структуре РНК-полимеразы (2α субъединицы, β, β' и σ-фактор)
участок связывания рифампицина находится у β-субъединицы. Существует несколько групп доказательств данного факта. Например, фермент,
выделенный из устойчивых клеток, не связывает антибиотик, что коррелирует с изменением β-субъединицы. Показано также, что поздняя РНКполимераза фага Т7, утратившая типичную структуру, нечувствительна к
рифампицину.
Рифампицин специфически подавляет инициацию синтеза РНК, вероятно, за счет инактивации РНК-полимеразы и индукции в ней конформационных изменений. На первой стадии взаимодействия происходит
быстрое связывание фермента и антибиотика, далее следует медленное
мономолекулярное изменение конформации фермента, приводящее к
проявлению ингибирующего действия антибиотика. Возможно взаимодействие между ароматическими кольцами в молекуле антибиотика и
ароматическими аминокислотами в активном центре фермента. Рифампицин мало влияет на образование первой фосфодиэфирной связи, но
практически полностью подавляет образование следующей. Однако если
образование второй и третьей связи все же произошло, то дальнейший
процесс к антибиотику не чувствителен. Устойчивость к рифампицину
может быть только хромосомальной и связана с изменением β-субъединицы РНК-полимеразы.
Рифамицины были открыты в 1958 году, продуцентом является Nocardia mediterranei. Антибиотик активен в отношении грамположительных бактерий и микобактерий, через наружную мембрану грамотрицательных проникает плохо.
Побочные эффекты от использования антибиотиков незначительны:
аллергия, окрашивание тканевых жидкостей в красный цвет, плохое всасывание через желудочно-кишечный тракт.
81
Несколько другим механизмом действия на РНК-полимеразу обладает стрептолидигин: антибиотик подавляет не только инициацию, но и
элонгацию синтеза цепи РНК. В присутствии стрептолидигина образуется стабильный комплекс ДНК – РНК-полимераза – антибиотик, что приводит к замедлению продвижения фермента вдоль матрицы.
10. ПРОМЫШЛЕННОЕ ПОЛУЧЕНИЕ
АНТИБИОТИКОВ
После установления лечебных свойств первого антибиотика – пенициллина – сразу же возникла задача организации его массового производства. В настоящее время можно говорить о том, что производство антибиотиков – хорошо развитая отрасль, которая занимает одно из центральных
мест в производстве лекарственных препаратов. Огромный спрос на антибиотические препараты со стороны медицины, сельского хозяйства, пищевой промышленности способствовал усиленному поиску новых антибиотиков и получению их в промышленных масштабах. Современное промышленное получение антибиотиков – это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий.
1. Стадия биосинтеза (образования) антибиотика, основной задачей которой является создание оптимальных условий для развития
продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика. Высокая результативность этой стадии зависит от уровня биосинтетической
активности продуцента, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма.
Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента используют комплекс мер, включающий подбор наиболее благоприятных для этих целей питательных сред и режимов культивирования организма. Все это входит в понятие управляемый синтез. На стадии
подготовки инокулята следует обратить внимание на состав среды, в которой выращивается организм, на возраст клеток или мицелия. На стадии
биосинтеза, кроме состава среды, большую роль играет скорость потребления тех или иных ее компонентов, регуляция процесса аэрации, поддержание соответствующих рН и температуры и других показателей
культивирования.
Для максимального снижения себестоимости препарата необходимо:
• внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов – продуцентов антибиотиков;
• создание и обеспечение самых благоприятных условий развития
продуцента антибиотика на относительно дешевых средах;
82
• широкое использование математических методов планирования
процесса развития организма и электронно-вычислительной техники с
целью оптимизации и моделирования условий его культивирования,
обеспечивающих максимальный выход антибиотика;
• применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с контролем основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика.
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов – продуцентов антибиотиков является метод
глубинного культивирования, суть которого заключается в том, что микроорганизмы развиваются в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается. Наибольшее распространение получила модификация глубинного
культивирования, названная непрерывным культивированием, при использовании которого возможно поддержание развития микроорганизмов на определенной стадии роста.
Для изучения условий образования антибиотиков и их производства
в промышленных условиях используются ферментеры, снабженные
приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры,
поддержания необходимой температуры и контрольно-измерительными
приборами. В зависимости от характера работ используют разные типы
ферментеров: лабораторные, полупромышленные, промышленные.
Для каждого продуцента разрабатывается оптимальная среда, которая должна соответствовать определенным требованиям:
а) обеспечивать максимальный выход антибиотика;
б) состоять из относительно дешевых компонентов;
в) иметь хорошую фильтрующую способность;
г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов для
выделения и очистки антибиотиков.
Стерилизация питательных сред в промышленных условиях достигается в результате:
• периодического метода для небольших объемов среды, при котором среда нагревается до 120–130 оС непосредственно в ферментере и
выдерживается в течение определенного времени;
• непрерывного метода для значительных объемов, при котором приготовленная среда подается в стерилизационную колонку, через которую
пропускают острый пар. Нагретая до необходимой температуры среда поступает в специальный аппарат, где выдерживается определенное время.
При подготовке посевного материала микроорганизмы предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирках, затем делают
высевы в колбы с жидкой питательной средой. На следующем этапе
83
делают высев в специальный инокулятор небольшого объема (10 л), из
которого хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный
(100–500 л) ферментер, откуда и делают высев в основной ферментер.
Для засева используется объемная доля инокулята 5–10 %.
2. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделения
культуральной жидкости от биомассы продуцента), эффективность
которой определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, накоплением антибиотика в культуральной жидкости или внеклеточно.
3. Стадия выделения и очистки антибиотика, особенностью которой является достигаемое увеличение концентрации антибиотика
(примерно от 1 до 20–30 %). В качестве основных методов используются
экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, выпаривание, сушка. Если антибиотик находится в культуральной жидкости, его
выделяют методами экстракции, используя для этого растворители, не
смешивающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, то вначале
его переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно изолировать.
Цель химической очистки – извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение от сопутствующих примесей.
4. Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка, основное требование к которой – высокое качество конечного продукта. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому. В первом случае ставится задача выяснения стерильности готового препарата, которая
обеспечивается соблюдением стерильных условий работы на всех стадиях процесса развития продуцента, выделения и очистки препарата. При
фармакологическом контроле предполагается исследование токсичности,
пирогенности, аллергенности и других свойств препарата, определенных
Государственной фармакопеей. Расфасованный и упакованный препарат
с указанием биологической активности, даты выпуска и срока годности
поступает в продажу.
Выход антибиотиков обычно составляет несколько десятков граммов на 1 л.
Можно отметить, что помимо прямой ферментации, которая описана выше, существует также способ получения полусинтетических производных антибиотиков. Такое производство было разработано с 1960 года, а первым полусинтетическим антибиотиком явился метициллин. Во84
обще говоря, на основе ферментативного гидролиза 6-аминопенициллановой (6-АПК) кислоты с помощью фермента пенициллинацилазы,
который образуется многими видами микроорганизмов, получено около
40 тыс. полусинтетических производных. 6-АПК оказалась исключительно удобным объектом для введения радикалов вместо атома водорода в аминной группе. В настоящее время в разных странах созданы биотехнологические производства с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы для выделения 6-АПК из бензилпенициллина.
Полученная 6-АПК затем используется для химического синтеза других пенициллинов. Например, при синтезе ампициллина гидролиз бензилпенициллина осуществляют при участии мутанта Kluivera citrophyla, после
чего вносят клетки Pseudomonas melanogenium и эфир D, L-фенилглицина,
условия процесса подобраны таким образом, что происходит образование
ампициллина (D-аминобензилпенициллин).
Некоторые примеры полусинтетических препаратов приведены в
табл. 12.
Таблица 12
Общее количество полусинтетических антибиотиков
Исходный антибиотик
Цефалоспорин
Тетрациклины
Аминогликозиды
Рифамицин
Макролиды
Блеомицин
Линкомицин
Коумермицин-новобиоцин
Полиеновые макролиды
Гризеофульвин
Число производных
Число применяемых
препаратов
25 000
Около 2 500
2 500–3 000
1 500–2 000
800–1000
200–400
500
200–300
200–300
100–200
25–30
5–6
4–5
3–4
2–3
1–2
1
–
1–2
–
В условиях мутасинтеза (рис. 9) сочетаются генетический и химический подход к образованию антибиотиков. В этом случае используются мутанты, у которых блокировано определенное звено в цепи реакций,
ведущих к синтезу антибиотика. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотика, последние переводят в аналоги самого антибиотика. Так, мутанты Nocardia mediterranei, у которых нарушена способность к ацилированию, образуют аналоги предшественника рифамицина – рифамицин SV, который служит исходным веществом для получения многих рифампицинов.
85
Для продуцентов аминогликозидных антибиотиков также имеются
убедительные примеры получения мутасинтетических антибиотиков.
Для представителей родов Streptomyces, Micromonospora, Bacillus получены мутанты, не образующие дезоксистрептамина, но способные включать его или его аналоги в молекулу антибиотиков. С использованием
серии полученных аналогов выделено более 10 производных неомицина,
гентамицина, бутирозина, а также 5-эписизомицин, который является
наиболее защищенным от действия инактивирующих ферментов.
Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны, однако в некоторых случаях пользуются и таким способом. Например, после установления структуры молекулы хлорамфеникола и выяснения, что она не является сложной, был осуществлен химический синтез, и сейчас антибиотик получают только таким путем. В настоящее время используется один из изомеров хлорамфеникола, который
получил название левомицетин.
ПРОДУЦЕНТ
АНТИБИОТИК
Мутаген
Мутантидиотроф
АНТИБИОТИК
ХХ
Аналоги
фрагментов
молекулы
антибиотиков
НОВЫЕ МУТАСИНТЕТИЧЕСКИЕ АНТИБИОТИКИ
Рис. 9. Создание мутасинтетических антибиотиков
86
11. ЗНАЧЕНИЕ ПРОДУКЦИИ АНТИБИОТИКОВ
ДЛЯ ШТАММОВ–ПРОДУЦЕНТОВ.
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА МИКРООРГАНИЗМОВ
И СИНТЕЗ АНТИБИОТИКОВ
Необходимость биосинтеза антибиотиков как продуктов вторичного
метаболизма для штаммов-продуцентов может быть объяснена исходя из
нескольких предположений:
1) антибиотики – остаточные токсичные продукты метаболизма, которые именно в таком виде должны быть удалены из клетки. Подобная
точка зрения вряд ли может быть справедливой по нескольким причинам: слишком многие вторичные метаболиты обладают биологической
активностью, а предшественниками их образования являются весьма
важные первичные метаболиты, на синтез которых затрачивается много
энергии и которые могли бы быть использованы клеткой;
2) несомненным является значение продукции антибиотиков как
фактора, способствующего выживанию продуцентов. Особенно справедливо это предположение для медленно растущих видов, например актиномицетов;
3) наиболее распространенной в настоящее время является точка
зрения, в соответствии с которой считается, что антибиотики синтезируются не только и не столько для конкуренции, а для изменения метаболизма собственного продуцента. Их образование в определенной стадии
роста может приводить к блокированию специфических функций обмена
и к индукции клеточной дифференцировки. Весьма подходящей кажется
такая гипотеза для антибиотиков с пептидной структурой или ионофорных антибиотиков.
Процесс дифференцировки клеток микроорганизмов затрагивает
разные уровни организации: клеточный и субклеточный, колониальный
и популяционный – и осуществляется во временном и пространственном
отношениях.
Изменения, происходящие при продукции антибиотиков на клеточном и субклеточном уровнях, лучше описаны и охарактеризованы для
грибов и актиномицетов.
Для штаммов Actinomyces spp. по мере перехода к образованию антибиотиков наблюдается утолщение клеточной стенки, в цитоплазме образуются полисомы, развиваются внутрицитоплазматические мембранные структуры. Такие мембранные структуры ограничивают продуцируемый антибиотик (тетрациклин) от внутриклеточного содержимого,
защищая тем самым клетки, и способствуют выделению антибиотика.
87
Изменения такого же рода наблюдаются и у продуцента хлорамфеникола: наличие электронно-прозрачных мембранных образований связывают
с выделением антибиотика в среду. Для продуцента линкомицина
(S. roseolus) в период наибольшей продуктивности мицелия характерно
утолщение клеточной стенки, образование молодых гиф внутри материнской.
Для B. polymyxa, образующего полимиксин В, показано, что в продуцирующих клетках изменяется структура клеточной стенки, усложняется мезосомальный аппарат. Начало процесса дифференцировки в эндоспоры коррелирует с высоким содержанием антибиотика.
На колониальном уровне зависимость между продукцией антибиотиков и дифференцировкой также более четко прослеживается для грибов и актиномицетов. Колонии продуцентов обычно более компактные,
складчатые, нередко имеют различия в окраске воздушного и субстратного мицелия, а также способности продуцировать растворимый пигмент. У большинства штаммов-продуцентов потеря способности образовывать воздушный мицелий соответствует потере способности продуцировать антибиотик. Варианты с нарушенной дифференциацией (олигоспоровые, аспорогенные) характеризуются пониженной антибиотической активностью или лишены ее. У ряда грибов суперпродуцентов отмечается снижение темпов роста колоний и споруляции.
Для мицелийобразующих продуцентов отмечают разный характер
роста мицелия в различных частях колонии. По профилю колонии отмечают изменение дегидрогеназной, фосфатазной активности, распределения белка и РНК. Для продуцентов, обладающих флуоресценцией, с помощью методов локализационно-топографической люминесценции выявлено, что основная масса антибиотика в колонии локализуется в субстратном мицелии (тетрациклин, D-актиномицин).
На популяционном уровне связь между дифференцировкой и образованием антибиотика заключается в том, что до начала образования антибиотика культура проходит ряд ростовых фаз, антибиотик синтезируется только после наступления соответствующей, когда завершается
синтез необходимых ферментов и предшественников. Как правило, образование антибиотиков происходит в условиях, не благоприятных для
роста продуцента. Следует учитывать, что образование антибиотика зависит и от условий культивирования, и от внешних факторов.
Для актиномицетов и грибов, продуцирующих антибиотики, характерна полицикличность развития, когда организм в процессе ферментации проходит 2–3 генерации с частичным автолизом мицелия в каждой
из них. У грибов это обусловлено образованием фрагментов гиф, кони88
дий, артроспор, гемм, способных к прорастанию и последующему развитию новых поколений глубинного мицелия, что коррелирует с наибольшей продуктивностью. Для продуцентов цефалоспорина показано, что
максимальная способность к синтезу антибиотиков наблюдается на стадии артроспор.
Несомненный практический интерес представляют вопросы изучения защитных механизмов продуцентов от образуемых антибиотиков.
Во-первых, гены резистентности продуцентов могут передаваться другим природным бактериям и в последующем распространяться среди
клинических изолятов. Во-вторых, наличие и изучение этого процесса у
продуцентов имеет практическое значение при создании штаммовсуперпродуцентов. В-третьих, интересным является исследование вопросов о возможности использования полученных сведений при отборе продуцентов. Тем не менее следует отметить, что существуют различия в
механизмах защиты у промышленных штаммов суперпродуцентов и их
природных аналогов.
По отношению к продуцирующему штамму с 1979 года все известные в настоящее время антибиотики принято делить на две группы:
1) ксенотоксические, или действующие только на метаболизм других штаммов и не имеющие мишени в клетках собственного продуцента;
2) аутотоксические, или имеющие мишени для действия в клетках
собственного продуцента и, следовательно, проявляющие определенные
защитные механизмы.
Очевидно, что такое деление является условным. Например, для
β-лактамных антибиотиков, продуцентами которых являются штаммы
Penicillum, образуемые антибиотики являются ксенотоксичными, но по
отношению к продуцентам-бактериям – аутотоксичными.
К чисто ксенотоксическим антибиотикам относятся антимицины –
ингибиторы функционирования дыхательной электронтранспортной цепи митохондрий за счет взаимодействия с убихинон-цитохромными
ферментами. Продуцентом данной группы антибиотиков являются бактерии S. antibioticus. Анизомицины – ингибиторы биосинтеза белка на
80S рибосомах, а продуцируются они S. griseolus и S. roseochromogenes.
Актиномицеты S. cacaoi продуцируют полиоксины – антибиотики, ингибирующие биосинтез клеточной стенки грибов. Такие антибиотики, как
бицикломицин и глобомицин, ингибируют функционирование наружной
мембраны грамотрицательных бактерий, однако продуцируются стрептомицетами, т. е. бактериями грамположительными.
Очевидно, что для аутотоксических антибиотиков должны существовать защитные механизмы. Это значит, что весь метаболизм продуцен89
та, и первичный, и вторичный, должен быть отделен и защищен от молекулы антибиотика. Чаще всего такие механизмы рассматривают на биохимическом уровне, а их классификация выглядит следующим образом:
1) изменение конформации мишени для действия антибиотика (например, участка рибосомы);
2) сверхпродукция молекул-мишеней (например, фермента);
3) наличие в клетке обходного пути метаболизма, который является
мишенью для действия антибиотика;
4) сверхпродукция метаболита антагониста (например, цистеина для
пенициллина, глиотоксина);
5) некоторые случаи толерантности к антибиотику (например, продукция β-лактамов и снижение продукции аутолитических ферментов);
6) избирательное снижение проницаемости мембраны по отношению к антибиотику;
7) внутриклеточная детоксификация антибиотика (например, фосфорилирование для неомицина).
Для продуцента эритромицина защита проявляется на двух уровнях.
На рибосомном, когда биосинтез белка на рибосомах продуцента подавляется значительно более высокими концентрациями антибиотика, нежели у непродуцирующих вариантов, что объясняют практически полным
отсутствием связывания его с рибосомами. На мембранном уровне отмечают избирательное поступление антибиотика в мицелий после его секреции, хотя для других антибиотиков избирательности поступления в
клетки продуцента не отмечается.
Снижение проницаемости мембраны свойственно и продуцентам
линкомицина, хлорамфеникола. Для последнего также существует защита на уровне продукции гидролаз, внеклеточно инактивирующих антибиотик.
Для продуцентов аминогликозидных антибиотиков характерно наличие механизма защиты на рибосомном уровне. Кроме того, для них
описаны системы защиты с участием фосфо- и ацетилирующих ферментов. Для антибиотиков – ингибиторов синтеза пептидогликана (β-лактамных) основной механизм защиты связан с изменением конформации
транспептидазы и набором и составом пенициллинсвязывающих белков.
У продуцентов тетрациклина белоксинтезирующая система оказалась в 20 раз более устойчивой к определенным концентрациям антибиотика (или к концентрациям в 20 раз более высоким). Отмечается также и
влияние физиологического состояния клеток на устойчивость. Так, молодые культуры в трофофазе, т. е. не продуцирующие антибиотик, ус90
тойчивы к 50 мкг/мл, в то время как на завершающих стадиях жизненного цикла – к 2000 мкг/мл. Кроме того, отмечают внутриклеточную компартментализацию, обеспечивающую отделение антибиотика от содержимого цитоплазмы.
Для актиномицина Д, ингибитора транскрипции, обнаружено три
механизма защиты:
1) на уровне мишени: как ДНК-, так и РНК-полимеры способны обходить прореагировавший с антибиотиком участок молекулы ДНК;
2) связывание в клетке актиномицина специфическими белками во
время идиофазы, что уменьшает количество антибиотика в свободной
активной форме;
3) снижение обратного поступления антибиотика в клетку на стадии
трофофазы, что, кроме того, снимает ингибирование его синтеза по типу
обратной связи.
12. ПРИМЕНЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ
В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ, ПИЩЕВОЙ
И КОНСЕРВНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
При выборе антибиотика для борьбы с возбудителями заболевания и
очагом его распространения, а также способа применения препарата основное внимание обращают не только на биологический эффект, но и на
экономический и экологический аспекты. Одно из существенных требований к антибиотикам для сельского хозяйства – они не должны использоваться в медицинской практике. Основные требования, предъявляемые
к антибиотикам, используемым в борьбе с фитопатогенными организмами, сводятся к следующему:
1) антибиотик должен быть активным в отношении возбудителя заболевания, т. е. обладать специфичностью биологического действия;
2) должны легко проникать в ткани растения;
3) лечебные дозы должны быть безвредны для растения;
4) антибиотик на поверхности и внутри растения не должен быстро
инактивироваться, но, попадая в почву, легко разлагаться там;
5) обладать биологическим действием внутри тканей растения;
6) не наносить ущерба окружающей среде.
Наиболее широко используемым методом является непосредственная обработка почвы, обрызгивание или опыление антибиотиками наземных частей растения, смачивание семян, корней или других органов и
91
т. п. Попав в ткани растения, антибиотики сохраняются там сравнительно долго – от 5 до 20 суток. Из большого числа антибиотиков, испытанных с целью применения для борьбы с различными заболеваниями растений, наибольший эффект наблюдается при использовании стрептомицина, гризеофульфина, циклогексамида и некоторых других.
Стрептомицин используется для борьбы с возбудителями, вызывающими бактериальное увядание фасоли и сои; болезнями косточковых
(в США); хлопка, риса (в Индии). В некоторых странах выпускают препараты стрептомицина с окситетрациклином, известные как «агримицин», «фитомицин», «фитостреп».
Биалофос – гербицид, полученный в начале 1980-х годов из культуры S. hydroscopicus. По своей структуре представляет трипептид, состоящий из двух остатков L-аланина и L-глутаминовой кислоты.
Антибиотики широко используются в животноводстве как лечебные
средства против заболеваний сельскохозяйственных животных, птиц и
пчел. С другой стороны, антибиотики применяются и как стимуляторы
роста ряда сельскохозяйственных животных и птиц. Даже их небольшие
количества вызывают значительное сокращение отхода молодняка, ускоряют рост и развитие животных и птиц, что в свою очередь связано с сокращением расхода кормов на 5–10 %.
Рассматривая действие антибиотиков на микрофлору кишечника,
отмечают следующее:
1) они способствуют увеличению количества микроорганизмов,
синтезирующих витамины и преобладающих над патогенной флорой;
уменьшают количество патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;
2) способствуют перемещению микроорганизмов в кишчнике животных;
3) снижают вероятность субклинических инфекций, повышают общий тонус защитных реакций организма;
4) снижают рН кишечного содержимого, уменьшают поверхностное
натяжение клеток организма и ускоряют их деление.
Действие антибиотиков на рост животных, прежде всего, связано с
изменением кишечной микрофлоры, хотя отмечают и непосредственное
влияние этих веществ на организм животного:
1) ткани увеличивают скорость абсорбции и потребление метаболитов, снижая расход кормов;
2) в организме отмечается синергизм гормонов, увеличивается количество ростовых гормонов; усиливается процесс потребления пищи,
возрастает приспособляемость организмов к неблагоприятным факторам;
92
3) снижается потребность животного в витаминах, увеличивается их
синтез, снижается образование метана, возрастает количество летучих
кислот, которые потребляются животными.
Среди наиболее распространенных антибиотиков можно отметить
авермектины, используемые для подавления развития паразитов, в том
числе нематод; монензин для лечения кокцидоза домашней птицы;
линкомицин для лечения дизентерии; новобиоцин для лечения холеры
индеек.
Первые сведения об использовании антибиотиков в консервной промышленности относятся к 1943 году. К таким антибиотикам относятся
субтилин, низин и др.
Применение антибиотиков при консервировании позволяет значительно снизить время термической обработки того или иного продукта.
Так, для консервирования овощей предложено использовать субтилин,
под действием которого наблюдается гибель клостридиальных и термофильных бактерий.
Низин – антибиотик, образуемый молочнокислыми бактериями, используется при консервировании не только овощей (томаты, зеленый горошек, цветная капуста), но и рыбы, молока, сыров и др. Антибиотик подавляет развитие ряда термофильных спорообразующих бактерий, не
оказывая токсического действия на организм человека.
93
II. ПРОГРАММА КУРСА
История открытия антимикробных препаратов и антибиотиков. Развитие исследований по обнаружению антибиотиков, определению их действия и выделению
штаммов-продуцентов. Характеристика антибиотиков как вторичных метаболитов.
Продукция антибиотиков различными группами про- и эукариотических организмов.
Методические подходы к селекции штаммов-продуцентов антибиотиков: ступенчатый отбор на примере получения продуцента пенициллина; методы «метаболической
инженерии», генно-инженерные подходы, методы мутасинтеза.
Биохимические основы регуляции синтеза антибиотиков. Биосинтез антибиотиков из ацетатных единиц, синтез антибиотиков нерибосомным путем и т. д. Промышленное получение антибиотиков: зависимость процесса от условий внешней
среды и условий культивирования. Природные, синтетические и полусинтетические
антибиотики.
Роль антибиотикообразования в жизненном цикле штаммов-продуцентов, связь
с дифференцировкой клеток. Регуляторы синтеза антибиотиков, химическая природа
соединений и их классификация. Механизмы защиты штаммов-продуцентов от продуцируемых антибиотических веществ.
Принципы классификации антибиотиков: по механизму биологического действия, химической структуре, спектру действия. Бактерицидные и бактериостатические
антибиотики, количественные показатели, характеризующие их активность.
Основные требования к антимикробным веществам, применяемым в клинической практике. Химиотерапия и химиопрофилактика инфекционных заболеваний.
Антибиотики и бактериальная клетка. Механизмы поступления антибиотиков в
клетку: роль отдельных химических компонентов, специфические и неспецифические каналы поступления.
Антисептические, дезинфицирующие и другие противомикробные препараты.
Механизмы действия на микробные клетки (окислительный, деструктивный и т. д.).
Характеристика повреждающего действия антибиотиков на уровне цитоплазматической мембраны клеток. Каналообразующие антибиотики.
Биосинтез клеточной стенки и возможные мишени для действия антибиотиков.
Антибиотики, ингибирующие образование клеточной стенки на стадии синтеза
предшественников (фосфомицин, циклосерин) и включения их в полимер (гликопептидные и бацитрацин) и их характеристика. Механизмы устойчивости к данным препаратам.
Антибиотики β-лактамной природы, современная система их классификации.
Механизм и мишень действия данных антибиотиков в клетке. Происхождение и эволюция устойчивости, ее различные типы: на уровне пенициллинсвязывающих белков
94
и β-лактамаз. β-Лактамазы как ферменты, их особенности. Современные системы
классификации. Понятие об ингибиторах β-лактамаз. Роль плазмид и транспозонов в
распространении устойчивости к пенициллинам и цефалоспоринам. Поиск ингибиторов β-лактамаз как направление при создании препаратов новых поколений.
Характеристика антибиотиков – ингибиторов процесса биосинтеза белка.
Аминогликозидные антибиотики, их химическая структура и разнообразие. Поступление аминогликозидов в клетки бактерий, стадии процесса. Механизм биологического действия (на примере стрептомицина). Ферментативный механизм устойчивости и роль плазмид в распространении детерминант резистентности. Действие
аминогликозидных антибиотиков на макроорганизм: отрицательные эффекты.
Антибиотики группы тетрациклинов. Их открытие, химическая структура. Поступление тетрациклиновых антибиотиков в клетки микроорганизмов. Механизм антибактериального действия. Особенности развития устойчивости к данным препаратам. Классификация детерминант устойчивости. Использование антибиотиков тетрациклинового ряда в антибиотикотерапии.
Характеристика антибиотиков – ингибиторов функционирования больших
субъединиц рибосом. Группа макролидных антибиотиков, особенности их химического строения и действия на бактериальную клетку. Типы устойчивости к антибиотикам-макролидам. Использование макролидных антибиотиков в сельском хозяйстве.
Характеристика антибиотиков, взаимодействующих с ДНК. Противоопухолевые соединения и механизмы их действия. Влияние данных препаратов на макроорганизм.
Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, их общая характеристика. Рифампицин и ингибирование активности РНК-полимеразы.
Группа синтетических сульфаниламидов и фторхинолонов, ингибирование синтеза пуринов и репликации ДНК. Поступление фторхинолонов в клетку, особенности
действия на ДНК-гиразу. Современные представления о механизмах устойчивости к
фторхинолонам.
Использование антибиотиков в сельском хозяйстве, пищевой и консервной промышленности. Характеристика препаратов типа пробиотиков и эубиотиков.
ЛИТЕРАТУРА
Основная
1. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высш. шк., 1994.
2. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. М.: Мир, 1985.
3. Машковский М. Д. Лекарственные средства: В 2 т. Харьков: Торсинг, 1998.
4. Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К Поздеев. М.: Гэотар
Медицина, 1999.
5. Молекулярные основы действия антибиотиков / И. Гэйл, Э. Кандлифф, П. Рейнолдс и др. М.: Мир, 1975.
6. Сазыкин Ю. О., Навашин П. С. Антибиотики и оболочка бактериальной клетки //
Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. ВИНИТИ. 1991. Т. 31. С. 1–187.
7. Смирнов В В., Василевская А. И., Резник С. Р. Антибиотики. Киев: Вища школа,
1985.
Дополнительная
Научные обзоры в журналах «Биотехнология», «Биохимия», «Прикладная биохимия и микробиология» и «Антибиотики и химиотерапия» за 1995–2003 годы.
95
III. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ
ЗАНЯТИЕ 1
Определение продукции
антибактериальных веществ
методом «отсроченного» антагонизма
Техника. Метод «отсроченного» антагонизма был предложен в 1957
году П. Фредериком для определения продукции бактериоцинов. Суть
метода заключается в следующем. Исследуемые штаммы бактерий высевают пятнами (или «медальонами») диаметром 0,3–0,5 см по трафарету
на поверхность агаризованной глюкозо-солевой среды М9 в чашке Петри
в количестве 10–15. Макроколонии, сформирвавшиеся в результате
культивирования в течение 48 ч при оптимальной температуре, стерилизовали парами хлороформа (20 мин), для чего в крышку чашки Петри
помещали фильтровальную бумагу, пропитанную хлороформом. Чашки
проветривали 60 мин, проводя все манипуляции в вытяжном шкафу. Поверхность обработанных таким образом чашек Петри покрывали слоем
(4 мл) 0,7 % агаризованной среды М9, предварительно охлажденной до
48–50 ºС и содержащей 0,2 мл индикаторной культуры, находящейся в
логарифмической стадии роста. Учет результатов проводили через 24 ч
инкубирования при оптимальной для роста индикаторных культур температуре. Степень антибактериальной активности характеризовали размером зон задержки роста индикаторной культуры вокруг макроколоний
исследуемого бактериального штамма.
Цель работы. Используя штаммы бактерий Erwinia herbicola 195,
Erwinia herbicola 129, Bacillus subtilis 494, Bacillus subtilis 8-1 в качестве
продуцентов антибиотических веществ и набор штаммов бактерий Escherichia coli, Pseudomonas putida, Staphylococcus saprophyticus и др. как
индикаторные, исследовать продукцию и определить спектр действия
антибиотических веществ.
96
Состав и приготовление необходимых питательных сред. Солевой
концентрат М9 (г/л): Na2HPO4 – 60; KH2PO4 – 30; NaCl – 5; NH4Cl – 10;
рН – 7,2.
Для приготовления глюкозо-солевой среды в стерильный флакон
добавляли 30 мл солевого концентрата; 6 мл стерильного раствора 20 %
глюкозы; 3 мл 0,1 М раствора MgSO4; 3 мл 0,01 М раствора CaCl2.. Полученную смесь доводили до 300 мл 2 % агаром.
Для приготовления 0,7 % агаризованной глюкозо-солевой среды
полученную смесь доводили до 300 мл 2 % агаром и глюкозо-солевой
средой.
Для приготовления жидкой питательной среды полученную смесь
доводили до 300 мл стерильной дистиллированной водой.
Задание 1. Учесть результаты эксперимента по определению антагонистической активности и определить наиболее активные штаммыпродуценты.
Задание 2. Выбрать две индикаторные культуры, обладающие наибольшей и наименьшей чувствительностью к антибактериальному веществу, и использовать их для проведения дальнейших экспериментов.
ЗАНЯТИЕ 2
Изучение диализабельности
антибактериальных веществ через целлофан
и их чувствительности к ферментам
Техника. Половину стерильной чашки Петри с 1,5 % агаризованной
глюкозо-солевой средой М9, покрывают стерильным целлофаном. Исследуемые штаммы бактерий (см. занятие 1) засевают штрихом непосредственно на поверхность целлофана и на поверхность агаризованной
среды (контроль). Через 48 ч инкубирования при 28 ºС целлофан убирают, чашки обрабатывают парами хлороформа (30 мин), проветривают
(60 мин) и наслаивают 4 мл 0,7 % глюкозо-солевой среды, содержащей
0,2 мл индикаторной культуры. Если образуемое антибактериальное вещество способно к диффузии через целлофан, то в месте, соответствующем росту бактериальной культуры на поверхности целлофана, формируется зона задержки роста бактерий индикаторной культуры.
Техника. Для определения чувствительности антибактериальных
препаратов к действию ферментов используют засеянные медальонами
на поверхность агаризованной 1,5 % среды штаммы-продуценты. Сфор97
мировавшиеся макроколонии обрабатывают парами хлороформа и заливают двумя слоями 0,7 % агаризованной среды М9. Первый слой содержит фермент в заданной концентрации (5 мкг/мл); второй – индикаторную культуру. Действие ферментов на антибиотики учитывают через
24 ч по величине зон задержки роста индикаторной культуры.
Задание 1. Сделать вывод о диализабельности антибактериальных
веществ через целлофан.
Задание 2. Определить чувствительность антибактериальных веществ к гидролитическим ферментам.
ЗАНЯТИЕ 3
Изучение антагонистического
действия бактерий на фитопатогенные грибы
и определение их фитотоксической активности
Техника. Исследуемые бактерии засевают пятнами на поверхность
агаризованной среды М9 в чашках Петри и инкубируют в течение 24 ч
при оптимальной температуре. После этого на расстоянии 1,5 см от
сформировавшихся макроколоний методом укола в трех местах по окружности подсевают мицелий фитопатогенных грибов. В качестве контроля используют культуру бактерий E. coli. Засеянные чашки инкубируют при комнатной температуре в течение четырех суток. Антагонистическое действие учитывают по наличию зон задержки роста грибов.
Техника. Для изучения фитотоксической активности антибактериальных препаратов используется культура клеток зеленой водоросли
Chlorella vulgaris 157, предварительно выращенная на поверхности
скошенного агара среды М9; 2 мл такой взвеси вносят в 300 мл охлажденной до 46 ºС агаризованной среды М9 и разливают в чашки Петри.
Исследуемые бактериальные культуры засевают «медальонами» по
трафарету на поверхность среды. В качестве контроля используют
культуру бактерий E. coli. Чашки инкубируют 24 ч в термостате при
температуре, оптимальной для роста бактерий. После формирования
бактериальных колоний чашки переносят в светотеплицу и инкубируют еще 72 ч для развития хлореллы. Учет результатов проводят по наличию зон задержки роста клеток хлореллы вокруг макроколоний исследуемых бактерий, что свидетельствует о продукции бактериями
фитотоксических веществ.
98
Задание 1. Определить чувствительность к антибактериальным препаратам некоторых штаммов грибов.
Задание 2. Определить чувствительность Chlorella vulgaris 157 к исследуемым антибактериальным препаратам.
ЗАНЯТИЕ 4
Иодометрический метод определения
пенициллиназной активности микроорганизмов
Взаимодействие бактериальной пенициллиназы с пенициллином,
содержащимся в питательной среде (минимальной или полноценной),
сопровождается расщеплением антибиотика с образованием 6-аминопенициллановой кислоты, которая обеспечивает соединение крахмала с
иодом.
Техника. Исследуемые культуры засевают бляшками диаметром
0,5–0,7 см на сектора в чашке Петри. Чашки инкубируют при оптимальной температуре в течение 18 ч. После этого на поверхность среды наливают 10 мл минимального 1,5 % агара с 0,5 % растворимого крахмала и
пенициллином (5мг/мл) или любым другим антибиотиком, относящимся
к группе β-лактамных. Чашки помещают на 1 ч в термостат при 37 ºС,
после чего на поверхность среды наливают 5 мл раствора иода.
Учет результатов проводится через несколько минут после заливки
иодом, который, соединяясь с крахмалом, вызывает развитие синего окрашивания среды. Вокруг макроколоний, продуцирующих пенициллиназу, образуются бесцветные кольцевидные зоны на синем фоне (положительный результат). Отрицательный результат – сохранение общефоновой синей окраски.
Задание 1. Определить наличие пенициллиназы у бактерий, несущих различные R-плазмиды.
Задание 2. Определить спектр действия образующегося фермента по
отношению к различным β-лактамным антибиотикам.
ЗАНЯТИЕ 5
Получение препаратов антибиотиков
Техника. Ночную культуру исследуемых штаммов, выращенную в
жидкой питательной среде, разводят в 10 раз свежей средой и культивируют в течение 48 ч при 28 ºС с аэрацией, после чего центрифугируют
99
45 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают хлороформом (1 % по объему) и титруют методом критических разведений.
Для этого препарат антибиотика двукратно разводят физиологическим
раствором и по 0,2 мл смеси наносят в лунки на газон чувствительной
культуры. Чашки инкубируют в течение 24 ч при 28 ºС.
Учет результатов проводят по наличию зон задержки роста клеток
индикаторных бактерий, что свидетельствует о продукции бактериями
антибиотических веществ и выражают в условных единицах, соответствующих значениям последних разведений, обусловливающих формирование четких зон ингибирования роста индикаторной культуры.
Задание. Выявить штаммы бактерий, продуцирующие антибиотические вещества в культуральную жидкость, и выразить их антибактериальную активность в условных единицах.
ЗАНЯТИЕ 6
Определение принадлежности веществ
к соответствующим группам антибиотиков
Используя приведенные качественные реакции, определить принадлежность веществ к группам антибиотиков в зависимости от механизмов
действия, химической структуры и т. д. в соответствии с полученным вариантом задания.
• Эритромицин. К 0,1 г (или 0,1 мл раствора) прибавляют 0,5 мл
ацетона и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты. Появляется
оранжевое окрашивание, постепенно переходящее в темно-красное. Затем добавляют 1 мл хлороформа и взбалтывают. Хлороформный слой
окрашивается в фиолетовый цвет.
• Тетрациклин.
1) К пяти каплям раствора (0,5 %) добавляют одну каплю 5 % спиртового раствора хлорного железа. Появляется коричневая окраска.
2) К 5–10 мг порошка прибавляют 10 капель концентрированной
серной кислоты. Жидкость окрашивается в красный цвет.
• Пенициллин.
1) К 5–6 каплям водного раствора антибиотика (5–10 мкг/мл) прибавляют одну каплю реактива, состоящего из 1 мл 1 М раствора гидроксиламина солянокислого, и 0,3 мл 1 М раствора гидроксида натрия. Через 2–3 мин добавляют одну каплю 1 М раствора уксусной кислоты и после перемешивания одну каплю раствора нитрата меди (5 %). Через одну
минуту образуется зеленый осадок.
100
2) К пяти каплям антибиотика добавляют две капли 5 % раствора
гидроксиламина. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения прибавляют одну каплю 5 % раствора хлорного железа. Появляется розовое
или красное окрашивание.
3) К двум каплям раствора пенициллина добавляют две капли концентрированного раствора едкого натрия и кипятят 1–2 мин. После охлаждения добавляют по каплям 5 % раствор нитропруссида натрия. Наблюдают появление красного окрашивания, переходящего в оранжевое и
желтое.
• Ампициллин.
1) 0,02 г ампициллина растворяют в 2 мл воды, прибавляют 2 мл
свежеприготовленного 0,25 % нингидрина и кипятят 2–3 мин. Появляется вишневое окрашивание.
2). 0,01 г порошка растворяют в 1 мл воды и прибавляют 1 мл реактива Феленга, сразу же появляется фиолетовое окрашивание.
• Цефалоспорины.
1) К 20 мг вещества прибавляют несколько капель 80 % раствора
серной кислоты, содержащей 1 % азотной кислоты. Появляется желтое
окрашивание.
2) К 20 мг вещества прибавляют пять капель 1 % уксусной кислоты,
две капли 1 % раствора сульфата меди и одну каплю 2 н раствора едкого
натра. Образуется оливково-желтое окрашивание.
• Стрептомицин.
1) Реакция на гуанидиновую группировку. К трем каплям 1 % водного раствора стрептомицина добавляют три капли 10 % едкого натра,
три капли 0,1 % спиртового раствора α-нафтола и 3–9 капель 2 % свежеприготовленного раствора гипобромида натрия. Жидкость окрашивается
в красный или розовый цвет.
2) К 5–6 каплям исследуемого раствора (0,5 %, или 5–10 мкг/мл)
прибавляют 2–3 капли раствора 10 % раствора гидроксида натрия и нагревают на водяной бане 3 мин. После охлаждения добавляют 5–6 капель
разведенной (10 %) серной кислоты и 2–3 капли раствора хлорного железа (3 %). Появляется красно-фиолетовое окрашивание.
3) К 5-6 каплям раствора прибавляют 0,5 мл раствора хлорида бария
(5 %). Образуется белый осадок, не растворимый в разведенных минеральных кислотах.
• Сульфаниламиды.
1) К 0,05 г порошка прибавляют по 4–5 капель воды и разведенной
соляной кислоты, 5–6 капель 0,1 М раствора нитрита натрия и 4–6 капель
раствора аммиака. Появляется оранжево-красное окрашивание.
101
2) К 0,1 г порошка прибавляют 1 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия, взбалтывают 1 мин и фильтруют. К фильтрату добавляют 5–6 капель раствора сульфата меди. Образуется осадок различных цветов: у
норсульфазола – грязно-фиолетовый; у этазола – травянисто-зеленый; у
сульфадимезина – желтовато-зеленый.
• Стрептоцид. К 1 мл раствора прибавляют 5–6 капель разведенной
соляной кислоты, 2–3 капли 0,1 % нитрита натрия и к 0,1 мл полученной
смеси добавляют 1–2 мл щелочного раствора нафтола. Появляется вишнево-красное окрашивание.
• Левомицетин.
1) К 0,5 мл раствора (0,015 %) прибавляют 1–2 мл разведенной соляной кислоты, 0,1 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане 2–3 мин.
После охлаждения раствор фильтруют. К фильтрату добавляют 2–3 капли
0,1 М раствора нитрита натрия и 0,3–0,5 мл полученной смеси вливают в
1–2 мл раствора β-нафтола, приготовленного на 10 % растворе натрия
гидроксида. Появляется розовое окрашивание.
2) 10 мг левомицетина встряхивают с 1 мл 5 % раствора сульфата
меди (II), добавляют 1 мл раствора гидроксида натрия и встряхивают
1 мин. Появляется синий осадок.
• Салициловая кислота. К 4–5 каплям раствора прибавляют две
капли раствора (3 %) окисного железа хлорида. Появляется сине-фиолетовое окрашивание.
• Гентамицин. К 1 мл раствора антибиотика (5–10 мкг/мл) прибавляют 0,2 мл 0,2 М раствора гидроксида натрия, нагревают 10 мин
на водяной бане и охлаждают 3 мин под струей холодной воды. Затем
добавляют 0,8 мл 1 % раствора железоаммониевых квасцов в 0,275 М
растворе серной кислоты и перемешивают. Регистрируют изменение
окраски.
• Линкомицин. В пробирку с притертой пробкой отбирают 1,5 мл
исследуемого раствора антибиотика, добавляют 0,05 мл насыщенного
раствора углекислого натрия, 0,15 мл разведенного (1:1) реактива Фолина и нагревают на водяной бане в течение 15 мин. Раствор охлаждают и
хорошо перемешивают. О наличии антибиотика свидетельствует развитие синего окрашивания.
• Нистатин. К 0,05 г порошка прибавляют 1–2 мл ледяной уксусной
кислоты и 5–6 капель 0,1% раствора перманганата калия. Раствор быстро
обесцвечивается.
102
Результаты работы представляют в виде таблицы:
№ вещества
Результат качественной
реакции
Вывод
Механизм действия
данного соединения
1
2
3
Вариант 1
Определить каждый из β-лактамных антибиотиков.
Вариант 2
Определить каждый из антибиотиков – ингибиторов биосинтеза белка.
Вариант 3
Выявить противогрибковый антибиотик и антибиотики с антиметаболической активностью.
Вариант 4
Выявить: полусинтетический β-лактамный антибиотик; антибиотик из
группы дезоксистрептаминов; соединение с противовоспалительной активностью.
103
IV. ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
1. Что характерно для антисептических средств?
А. Универсальное противомикробное действие
Б. Избирательное противомикробное действие
В. Относительно высокая токсичность для человека
Г. Относительно низкая токсичность для человека
2. Что характерно для рифампицина?
А. Широкий спектр действия
Б. Активность в отношении грамотрицательных бактерий
В. Активность в отношении микобактерий туберкулеза
Г. Хорошее всасывание через желудочно-кишечный тракт
Д. Плохое всасывание через желудочно-кишечный тракт
Е. Токсическое действие на VIII пару черепно-мозговых нервов
Ж. Нарушение функций печени
3. Определить препарат.
Имеет широкий спектр противомикробного действия. Относится к производным 8-оксихинолина. Хорошо всасывается через желудочно-кишечный тракт. В значительных количествах выводится почками в неизменном виде. Применяется при
инфекциях мочевыводящих путей.
4. Укажите требования к химическим средствам,
используемым для дезинфекции.
А.
Б.
В.
Г.
Д.
Нетоксичность
Широкий спектр антимикробного действия
Хорошая растворимость в воде
Активность препарата при комнатной температуре
Достаточно бактериостатического действия дезинфектанта
5. Что опосредует резистентность микроорганизмов
к лекарственным препаратам?
А. Наличие плазмид лекарственной резистентности
Б. Уменьшение или отсутствие рецепторов для взаимодействия препарата с
микробной клеткой
В. Индуцированная применением антимикробных препаратов селекция устойчивых штаммов
Г. Спонтанные мутации генома бактерии и(или) хозяина
104
ПРИЛОЖЕНИЕ
Структурные формулы некоторых антибиотиков
Leu
DABA
D-Phe
DABA
DABA
Thr
DABA
DABA
C2H5
Thr
DABA
CO
(CH3)4CH
CH3
1. Структурная формула полимиксина В. DABA – 2,4-диаминомасляная кислота
D-val
D-Hiv
lac
val
val
lac
D-Hiv
D-val
D-val
D-Hiv
lac
val
2. Структурная формула валиномицина.
Lac – молочная кислота; Hiv – 2-гидрооксиизовалериановая кислота
H3C
O
HO
OH
HO
O
H
OH
H
OH
OH
OH
OH
O
COOH
CH3
H3C
OH
NH2
O
O
CH3
3. Структурная формула амфотерицина В
105
OH
O
R
C
S
NH
CH3
O
R1 C
S
NH
CH3
N
O
COOH
б
CH3
R2
S
C
R1
R3
R4
R2
N
O
CH2R2
COOH
а
HO
R1
N
O
COOR3
в
N
R5
O
г
4. Структурные формулы пенициллинов (а), цефалоспоринов (б), пенемов (в)
и монобактамов (г). Стрелками указаны места действия ацилаз и β-лактамаз
H
H
C
CH3
C
O
а
PO3H2
H
O
NH2
N
O
б
5. Структурная формула фосфомицина (а) и D-циклосерина (б)
106
pentose
OH
aminohexose
O
NH
O
C
NH
NH2
R
OH
а
a
m
i
n
o
h
e
R
x
o
s
e
NH2
O
p
e
n
t
o
s
e
NH3
O
OH
б
aminohexose
NH2
O
OH
OH
aminohexose
NH2
в
a
m
i
n
o
h
e
x
o
s
e
NH2
O
NH CHOCHOH
p
e
n
t
o
s
e
OH
CH2
O
CH2
г
107
NH2
a m in o h e x o s e
O
R2
OH
NH2
R1
OH
д
CH2NH2
C
H
aminohexose
OH
CH2
H2C
NH2
е
6. Строение природных аминогликозидных антибиотиков.
а – стрептомицин; б, в, г – группа дезоксистрептаминов (неомицины, канамицины,
бутирозин); д – фортамины; е – сорбистины
CH2NH2
HO
HO
O
NH2
O
HO
NH2
NH2
O
HO
CH2OH
O
NH2
OH
7. Канамицин как субстрат инактивирующих аминогликозиды ферментов.
Стрелками указаны функциональные группы, подвергающиеся ферментативной
инактивации
108
H3C
N(CH3)2
OH
OH
O
OH
CONH2
OH O
OH
8. Структурная формула тетрациклина
O
Cl2HC
C
CH2OH
HN
C
HC
H
OH
NH2
9. Структурная формула хлорамфеникола
Sar
L-Pro
Sar
L-MeVal
D-Val
L-MeVal
L-Pro
OH2
OH
D-Val
L-Thr
O
O C
L-Thr
C
N
NH2
O
O
CH3
CH3
10. Структурная формула актиномицина D
109
OH
O
CH3
OH
O
OH
O
CH3
CH3
OH
OH
CH3
O
CH3
O
OH CH
3
O
OH N(CH )
3 2
CH3
H3C
11. Структурная формула эритромицина С
H 2N
SO2NH2
12. Структурная формула сульфаниламида
R5
O
R6
R7
COOH
X
N
R8 R1
13. Структурная формула хинолонов и фторхинолонов.
R1 – -C2H5 , -C2H4F, R5 – -NH2, -CH3, -C2H5, R6 – F,
R7 – пиперазиновый цикл, R8 – F, Cl, X – C, N
110
Учебное издание
Желдакова Римма Анатольевна
МЕХАНИЗМЫ БИОСИНТЕЗА АНТИБИОТИКОВ
И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТКИ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Учебно-методический комплекс
для студентов специальности
1-31 01 01 «Биология»
Редактор У. Ю. Верина
Технический редактор Т. К. Раманович
Корректор М. А. Поддубская
Компьютерная верстка М. В. Устиновой
Подписано в печать 08.07.2004. Формат 60×84/16. Бумага офсетная.
Гарнитура Таймс. Печать офсетная. Усл. печ. л. 6,51. Уч.-изд. л. 7,41.
Тираж 100 экз. Зак.
Белорусский государственный университет.
Лицензия на осуществление издательской деятельности
№ 02330/0056804 от 02.03.2004.
220050, Минск, проспект Франциска Скорины, 4.
Отпечатано с оригинала-макета заказчика
в Республиканском унитарном предприятии
«Издательский центр Белорусского государственного университета».
Лицензия на осуществление полиграфической деятельности
№ 02330/0056850 от 30.04.2004.
220030, Минск, ул. Красноармейская, 6.
112