Молекулярная биология Скоблов Михаил Юрьевич Лекция 10
advertisement
Молекулярная биология Лекция 10. Эпигенетика. Скоблов Михаил Юрьевич Эпигенетика - область генетики, изучающая механизмы наследственности и изменчивости, в основе которых НЕ лежит изменение первичной последовательности ДНК и РНК. (С.Г. Инге-Вечтомов 2004 г.) Эпигенетическая регуляция – процесс, приводящий к изменению активности гена без изменений в его кодирующей последовательности, которое стабильно наследуется после исчезновения фактора, вызвавшего это изменение. Уровни эпигенетической регуляции 1. ДНК (геном) метилирование, повторяющиеся последовательности, мутации отдаленных регуляторных элементов, транспозиции генетического материала 2. РНК (транскриптом) регуляторные мотивы пре-мРНК, антисмысловые РНК, нетранслирующиеся РНК, микро РНК, двухцепочечные РНК 3. Белки (протеом) метилирование/деметилирование лизина 4 и 9 гистона Н3, ацетилирование/деацетилирование гистонов ? Изменения Генетические • Как правило необратимые (мутации) • Изменения первичной структуры ДНК • Стабильно наследуемые Эпигенетические • Как правило обратимые • Не затрагивают изменений первичной структуры ДНК • Бывают долговременные и кратковременные • Множество взаимосвязанных механизмов Эпигенетические модификации Модификации гистонов Модификации ДНК Модификации негистоновых белков хроматина Изменение статуса транскрипции Часть 1. Метелирование ДНК Метилирование ДНК – основной способ передачи эпигенетической информации у растений и млекопитающих • Не нарушает способность комплементарному взаимодействию , но стабилизирует двойную спираль ДНК и распознается многочисленными белками Метилирование цитозина и аденина • Цитозин метилируется значительно чаще, чем аденин • Может происходить ферментов • Наиболее эффективно цитозин в мотиве CpG “спонтанно” “спонтанно” без участия метилируется Схема метилирования и деметилирования цитозина 5-метилцитозин ДНК метилтрансфераза Гидролитическое дезаминирование Деметилаза цитозин Дезаминирование Репарация с помощью ДНК урацилгликозилазы тимидин Репликация ДНК урацил Распространенность метелирования у разных организмов Объект М. musculus H. sapiens Растения Насекомые (D. melanogaster) С. elegans S. cerevisiae N. crassa Наличие метилирования есть есть незначительно роль неизвестна незначительно роль неизвестна нет есть Относительная распространенность CpG у разных организмов Дезаминирование метилированого цитозина • В результате “спонтанного” дезаминирования метилированного цитозина возникает тимин, что приводит к мутации, закрепляемой при репликации ДНК • То же самое происходит в геномах in vivo, , результат – элиминация мотивов CpG (у растений – CpNpG) CpG островки Определения CpG островка: Frommer (1987) Any stretch of DNA greater than 200bp with a GC content of greater than 50% and an observed to expected CpG ratio of greater than 0.5 Takai (2002) Any stretch of DNA greater than 500bp with a GC content of greater than 55% and an observed to expected CpG ratio of greater than 0.6 • >200 пн, длина большинства -0.5-3 тпн. • Относительно высокий GC-состав (>50, обычно>60%), плотное расположение мотива CpG (один на 10 пн, в 10-20 раз выше, чем в среднем по геному) и его статистическая встречаемость • Как правило, содержат мотивы CCGCCC (сайты связывания транскрипционного фактора SP1) У человека - около 45000 островков. 60% генов имеют с своём локусе CpG как минимум один остров. Практически у всех генов “домашнего хозяйства”. Свойства CpG островков • CpG островки располагаются с основном в промоторах и 5’ районах генов • Также часто распространнены и внутригенные, не захватывающие старт транскрипции • Существую и межгенные CpG островки Свойства CpG островков • У позвоночных метилирование островков используется для закрепления паттерна экспрессии, который может быть “выбран” иными способами. • Установленный статус метилирования, как правило, стабилен и в дальнейшем поддерживается. • CpG-островки либо гиперметилированы, либо гипометилированы • CpG в промоторах обычно неметилированы, что необходимо для транскрипции соответствующего гена (метилирование, как правило, приводит к блоку транскрипции ) • Внутригенные CpG островки чаще гиперметилированы Механизмы репрессии транскрипции, обусловленной метилированием. Прямой механизм 1. Метильные группы нарушают ДНК-белковые взаимодействия, выступая в большую бороздку ДНК и препятствуя связыванию специфических транскрипционных факторов. 2. Некоторые ТФ наоборот имеют повышенное сродство к метилированным сайтам. •Чувствительные к метилированию •AP-2, E2F, NFkB, CREB, Myc/Myn •Нечувствительные к метилированию •SP-1, CTF Опосредованный механизм 3. Метилированные районы ДНК связывают MBD (methyl binding domain) – содержащие белки, привлекающие транскрипционные репрессоры или белки, модифицирующие гистоны. – Большинство MBD содержащих белков – репрессоры или корепрессоры транскрипции. – У Arabidopsis сущ. 12 MBD – содержащих белков. – МBD – содержащие белки могут формировать комплексы с деацетилазами гистонов (репрессорами). В клетках млекопитающих действуют по крайней мере две системы метилирования, за которые отвечают разные метилазы Метилирование de novo вносит элементы изменчивости в профиль метилирования Поддерживающее метилирование обеспечивает поддержание уже сформированного профиля Поддерживающее метилирование активируется при каждом клеточном делении Механизм наследования паттерна метилирования Метилирование ДНК : основные функции • Поддержание структуры хроматина и стабильности хромосом • Сайленсинг повторенных и интегрированных чужеродных последовательностей • Механизм защиты против эффектов встраивания чужеродной ДНК высоко метилированы: • Сателлиты и другие повторяющиеся последовательности • Транспозоны, провирусные копии • Последовательности, характерные для гетерохроматина • Тканеспецифичное ненаследуемое долговременное подавление экспрессии генов на уровне транскрипции • Формирование профиля экспрессии, характерного для данного типа клеток высоко метилированы: • Транскрипционно неактивные гены (в гаметах – все, кроме • экспрессируемых гаметоспецифично) • Гены “опухолевой инвазии” и другие онкогены • Импринтированные гены гипометилированы: • транскрипционно активные гены непосредственное влияние метилирования на уровень экспрессии гена далеко не всегда понятно Установление геномного метелирования • • • • Большая часть (почти все) метилирования “стирается” в раннем эмбриогенезе за счет деметилирования и/или гидроксилирования метильных групп Паттерн метилирования генома (распределение метилированных оснований) устанавливается заново в каждом поколении, в основном не наследуется, но есть и исключения После установления специфические паттерны метилирования поддерживаются в поколениях клеток, обеспечивая специфичность экспрессии генов Таким образом, при смене поколений происходит последовательное цикличное метилирование/деметилирование по множеству позиций в геноме Волны деметилирования в раннем эмбриогенезе • • • • Во время эмбрионального развития, в первичных половых клетках проходит полногеномное деметилирование, которое стирает предыдущие родительские отметки метилирования. После оплодотворения отцовский геном активно деметилируется, в то время как материнский геном пассивно деметилируется. Затем по всему геному происходит заново метилирование на обоих родительских геномов до имплантации. Тем не менее, импринтированные гены сохраняют своё метилирование проходя через это репрограммирование, что позволяет наследовать специфичную для родителей моноаллельную экспрессию генов в соматических тканях в течение взрослой жизни. Деметилирование ДНК глобальный характер cпецифический млекопитающие – ранние этапы развития зародыша, старение геномный импринтинг ДНК-деметилаза до сих пор не выявлена БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ МЕТИЛИРОВАННОЙ ДНК • геномный импринтинг • инактивация Х-хромосомы • регуляция структуры хроматина • регуляция генной экспрессии • репликация ДНК • канцерогенез • клеточная дифференцировка • выключение трансгенов ( “silencing”) Метилирование при раке Опухолевые процессы гиперметилирования характеризуются ключевых инактивацией генов-супрессоров и посредством посредством гипометилирования активацией целого ряда онкогенов (raf, c-fos, c-myc, c-Haras, c-K-ras), факторов роста (IGF2, TGF) и мобильных повторяющихся элементов, расположенных в районах гетерохроматина. Часть 2. Ремоделинг хроматина Эволюция нуклеосом Структура коровых гистонов Между ДНК и гистонами 14 различных взаимодействий В геноме присутствуют Участки, свободные от нуклеосом Активные для транскрипции, сайты связывания транскрипционных факторов, регуляторных белков Участки, где положение нуклеосомы строго фиксировано +1 нуклеосома в генах (дрожжи – от +1 нуклеотида, позвоночные – от +60) Участки, в которых нуклеосомная укладка подвержена регуляции белками АТФ-зависимого ремоделинга хроматина Пост-трансляционные модификации гистонов регуляторных N-концов Пост-трансляционные модификации гистонов регуляторных N-концов • Ацетилирование лизин (K) • Метилирование лизин (K) аргинин(R) • Фосфорилирование серин(S) треонин(T) • Убиквитинилирование лизин (К) • ADP-рибозилирование • Сумоилирование Роль пост-трансляционных модификаций гистонов Изменение электростатического взаимодействия между гистонами и ДНК: • ПолиАДФрибозилирование приводит к тому, что гистоны или негистоновые белки приобретают большой отрицательный заряд и отваливаются от ДНК • Ацетилирование гистонов также вносит отрицательный заряд, ослабляя взаимодействие ДНК-нуклеосома Принцип работы “гистонового кода” • Аминокислотный остаток в гистоне • Модифицирующий фермент • Белок, который “воспринимает” модификацию Наследование гистонового кода • Во время репликации нуклеосомы разбираются на димеры и удаляются с ДНК, а затем собираются на ДНК вновь. • Для двух дочерних цепей требуется в два раза больше нуклеосом. • Часть нуклеосомы во время репликации собирается по полуконсервативному принципу (например, если один димер H3H4 «старый», то второй – вновь синтезированный). • Вновь синтезированные гистоны будут модифицироваться по образцу «старых». Часть 3. Эпигенетика Изменения Генетические • Как правило необратимые (мутации) • Изменения первичной структуры ДНК • Стабильно наследуемые Эпигенетические • Как правило обратимые • Не затрагивают изменений первичной структуры ДНК • Бывают долговременные и кратковременные • Множество взаимосвязанных механизмов Первое «полногеномное» исследование эпигенома человеческих клеток Расшифрован эпигеном эмбриональных стволовых клеток человека и клеток соединительной ткани легких (фибробластов). Эпигеном – совокупность состояний метилирования генома и модификаций гистонов Взгляд на эпигеном • Исследование 80 пар однояйцевых близнецов в возрасте 3-74 года • Чем старше исследуемая пара, тем больше разница в их профилях метилирования и ацетилирования гистонов, что приводило в существенной разнице в паттерне экспрессии генов При клонировании трехцветной кошки никогда не получится кошка идентичного окраса, так как рисунок определяется случайной пятнистостью и случайной инактивацией одного из аллелей гена, определяющего окраску (черный/коричневый), в Х-хромосоме Имя кошки Сиси (“cc”) от слова “copycat”… В опухолевых клетках паттерн эпигенетических модификаций значительно отличен от такового в нормальных клетках Изменения метилирования ДНК при старении • Чем длиннее характерная продолжительность жизни у вида животного, тем медленнее снижается у этого вида уровень метилирования с возрастом • Формирование аберрантных паттернов метилирования: гипометилирование в стареющих клетках и тканях (в целом) но: гиперметилирование CpG-островков в стареющих клетках и тканях • Такие же разнонаправленные изменения метилирования характерны для раковых клеток 88 сайтов около 80 генов 80 для которых степень метилирования высоко коррелировала с возрастом
