Гематология. Нов. справочник

Реклама
гематология
Под общей редакцией
доктора медицинских наук,
профессора К. М. Абдулкадырова
.Г о с у д а р с т в е н ны й
научная би^б^
C
Университет
http://www.bestmedbook.com/
•
Москва эксмо)
Санкт-Петербург «Сова»
2004
О
, V i
УДК 616
ББК 54.11
Г 33
Оформление художника Е. Брынчик
Г 33
Гематология: Новейший справочник / Под общ. ред.
К. М. Абдулкадырова. — М.: Иза-во Эксмо; СПб.: Изд-во
Сова, 2004. - 928 с, илл.
ISBN 5-699-05074-4
В справочнике изложены современные аспекты теоретической и
клинической гематологии, приведены самые последние данные о кроветворении, морфологии и функциях клеток крови и костного мозга,
гемопоэтического микроокружения, а также сведения о цитогенетике,
иммуногематологии, иммуногистохимии и системе гемостаза. Представлены современные методы диагностики и лечения заболеваний системы
крови, рассмотрены вопросы их этиопатогенеза.
Издание предназначено для врачей гематологов, терапевтов, онколо гов, лаборантов, а также студентов медицинских учебных заведений.
УДК 616
ББК 54.11
ISBN 5-699-05074-4
© К. М. Абдулкадыров, Т. А. Андреева,
B. А. Балашова, С. С. Бессмельцев,
Л. Н. Бубнова, Т. В. Глазанова,
C. В. Грицаев, Ю. Л. Кацадзе,
Ю. А. Криволапое, М. С. Мартынкевич,
С. И. Моисеев, Н. А. Романенко,
В. И. Ругаль, И. Г. Самускевич,
В. Ю. Удальева, Е. Р. Шилова,
А. В. Шмидт, 2004
© Оригинал-макет. ООО «Сова», 2004
© ООО «Издательство «Эксмо», 2004
http://www.bestmedbook.com/
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие
7
Часть 1
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 1. Кроветворение. Номенклатура клеток костного мозга и крови.
К. М. Абдулкадыров, В. А. Балашова
Глава 2. Пункция костного мозга. Методика его исследования.
Миелограмма. К. М. Абдулкадыров, В. А. Балашова
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови.
В. А. Балашова
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга. Стромальное микроокружение:
структурная организация и участие в гемопоэзе. К. М. Абдулкадыров,
В.И.Ругалъ
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга. В. А. Балашова
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии. В. А. Балашова
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах.
К. М. Абдулкадыров, И. С. Мартынкевич
Глава 8. Клиническая иммуногематология. Л. Н. Бубнова
Глава 9. Иммуногистохимия. Ю.А. Криволапое
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз). Т. В. Глаэанова
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза. Ю. Л. Кацадзе
9
34
39
62
75
100
122
145
164
221
231
Часть 2
КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 12. Анемии. К. М. Абдулкадыров, Е. Р. Шилова
250
Железодефицитная анемия
252
Анемия хронических заболеваний
270
Мегалобластные анемии
273
В ( -дефицитная анемия
273
Фолиеводефшцитная анемия
284
Мембранопатии
287
Наследственная сфероцитарпая анемия (наследственный сфероцитоз) 287
Наследственный эллиптоцитоз
293
6
Оглавление
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия
(болезнь Маркиафавы-Микели)
Ферментопатии
Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Дефицит пируваткиназы
Гемоглобинопатии (гемоглобинозы)
Серповидно-клеточная анемия
Талассемия
Иммунные гемолитические анемии
Аутоиммунная гемолитическая анемия
Апластическая анемия
Парциальная красноклеточная аплазия
Глава 13. Идиопатическаятромбоцитопеническаяпурпура. С. С. Бессмелъцев ..
Глава 14. Гемофилия. Т.А.Андреева
Глава 15. Болезнь Виллебранда. Т. А. Андреева
Глава 16. Острые лейкозы. С. И. Моисеев, К. М. Абдулкадыров
Глава 17. Миелодиспластические синдромы. К. М. Абдулкадыров,
С.В.Грицаев
Глава 18. Хронический миелолейкоз. К. М. Абдулкадыров, С. С. Бессмельцев...
Глава 19. Хронический идиопатический миелофиброз. С. С. Бессмельцев....
Глава 20. Истинная полицитемия. В. Ю. Удальева, К. М. Абдулкадыров
Глава 21. Эссенциальная тромбоцитемия. К. М. Абдулкадыров,
В. Ю. Удальева
Глава 22. Множественная миелома. С. С. Бессмелъцев, К. М. Абдулкадыров
Глава 23. Макроглобулинемия Вальденстрема. С. С. Бессмельцев
Глава 24. Болезни тяжелых цепей. С. С. Бессмельцев
Глава 25. Лимфомы. К. М. Абдулкадыров, И. Г. Самускевич
Неходжкинские лимфомы
Хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз
(лимфома из малых лимфоцитов)
Пролимфоцитарный лейкоз
Волосатоклеточный лейкоз
Другие формы В-клеточных неходжкинских лимфом
Т-клеточные неходжкинские лимфомы
Лимфогранулематоз (лимфома Ходжкина)
Глава 26. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток костного
мозга, периферической и пуповинной крови при заболеваниях
системы крови. С. И. Моисеев, К. М. Абдулкадыров
Глава 27. Гемокомпонентная терапия при заболеваниях системы крови.
К. М. Абдулкадыров, С. И. Моисеев
Глава 28. Терапия поддержки у больных гемобластозами.
К. М. Абдулкадыров, С. И. Моисеев
Глава 29. Центральные венозные катетеры в гематологии: приоритеты и
проблемы. К. М. Абдулкадыров, А. В. Шмидт
Глава 30. Заготовка, хранение и лабораторное тестирование пуповинной
крови. К. М. Абдулкадыров, Я. А. Романенко
Предметный указатель
294
299
300
306
307
308
314
320
321
327
337
349
373
390
402
468
496
556
572
583
593
666
687
696
698
705
723
724
726
741
755
770
813
830
851
890
902
Часть 1
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 1
КРОВЕТВОРЕНИЕ.
НОМЕНКЛАТУРА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И КРОВИ
Кроветворение, или гемопоэз — это сложный многоэтапный процесс образования в специализированных органах клеток крови.
Как образуются первые кроветворные клетки?
В результате дробления оплодотворенной яйцеклетки формируется бластоциста, затем бластула и гаструла. Внутренняя клеточная масса бластоцисты (ВКМ) содержит 30-150 эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Это поистине стволовые клетки,
клетки-прародительницы, обладающие тотипотентностью, т. е. способностью давать начало как собственно эмбриону, так и всем без
исключения клеткам и тканям организма. На стадии гаструлы в
результате сложных перемещений клеток образуется 3 зародышевых листка — экто-, мезо- и эндодерма. Мезодерма — средний
зародышевый листок — дает начало костному мозгу, крови, сердечно-сосудистой системе. Мезенхима, называемая иногда 4-м зародышевым листком, также является производной мезодермы и дает
начало костям, хрящам, мышцам, дерме и всей соединительной
ткани организма. Формирование органов из ЭСК, включая гемопоэтические — костный мозг, тимус, селезенку, лимфоузлы, Пейеровы бляшки, мукозоассоциированную лимфоидную ткань, — осуществляется благодаря транскрипции генов, реализующих генетическую программу в клетке. В частности, известна роль ядерных
10
Часть 1. Теоретическая гематология
белков GATA-2* в развитии ранних кроветворных предшественников (Martin D. I. К. ct al., 1990; Romeo P. H. el al., 1990).
Кроветворение у человека начинается на 3-4-й неделе гестации
одновременно в желточном мешке (внеэмбриональное кроветворение), а также в самом эмбрионе и хорионе (внутриэмбриональное кроветворение) в виде кровяных островков, окруженных клетками эндотелия, происходящего, по-видимому, из общих с гемопоэтическими стволовых клеток (Приндулл Г., 1998). К. Choi и
соавторы (1998) подтвердили идею существования бшготентных
гемангиобластов, прослеживая путь развития кроветворной клетки по схеме: мезодерма—эндотелий—кровь. Однако еще в 1932 г.
А. В. Румянцев отметил, что «как кровяные клетки, так и сосуды,
по которым движется кровь, — дериваты мезенхимы». М. Tavian и
соавторы (1996) показали, что в области парааорталыюй спланхоплевры эмбриона одновременно с желточным мешком возникают первые стволовые кроветворные клетки (СКК), которые мигрируют затем в фетальную печень, костный мозг и другие места
гемопоэза. Только эти клетки по праву могут называться стволовыми кроветворными, но в силу сложившейся традиции это название сохранилось и за некоторыми более поздними их потомками.
В период гаструляции ЭСК начинают формировать гемопоэтическую мезенхиму (Приндулл Г., 1998), а также синтезируется экстрацеллюлярный протеиновый матрикс, включающий фибронектин,
ламинин и коллаген; экспрессируются рецепторы молекул клеточной адгезии — интегрины; секретируются цитокины. Эндотелиальные клетки, сливаясь в капилляры, соединяют желточный мешок с эмбрионом. По этим капиллярам из желточного мешка на 45-й неделе гестации двигаются примитивные гемопоэтические
клетки и колонизируют образующуюся к тому времени печень.
На 8-10-й неделе происходит колонизация вилочковой железы.
Таким образом, закладка кроветворной системы осуществляется при координированном взаимодействии трех клеточных пулов — производных мезодермы — гемопоэтического, стромального
и сосудистого.
Первыми клетками, которые к концу 4-й недели образуются в
желточном мешке, являются примитивные эритробласты-мегало* GATA — семейство ядерных белков, которые наряду с другими факторами
транскрипции генов не только ответственны за пролиферацию и дифференцировку стволовых кроветворных клеток (GATA-2), но и участвуют в закладке эритропоэза и синтезе глобина, в развитии мегакариоцитопоэза (GATA-1,
GATA-5). базофилов и нейтрофилов (GATA-1) и Т-лимфоцитов (GATA-3).
Глава 1. Кроветворение
11
бласты, синтезирующие фетальный гемоглобин. На 4-5-й неделе
развития эмбриона в желточном мешке возникают различные генерации кроветворных клеток, в том числе полипотентные клетки-предшественники гранулоцито-эритро-моноцито-мегакариоцитопоэза, образующие в агаре смешанные колонии в составе этих
клеток — КОЕ-ГЭММ (колониеобразующие единицы гранулоэритро-моноцито-мсгакариоцитопоэза). Данные клетки экспрессируют рецепторы ранних миелоидных стволовых клеток CD34
(CD — кластер дифференцировки, т. е. группа дифференцировочных антигенов). Одновременно с ними в желточном мешке появляются биопотентные грануломоноцитарные клетки-предшественники, способные образовывать в условиях клеточных культур колонии из гранулоцитов и моноцитов, поэтому их называют
КОЕ-ГМ. В эти же сроки развития эмбриона в желточном мешке
также обнаружены эритроидные клетки-предшественники. По способности образовывать в культуре крупные эритроидные колонии
из нескольких агрегатов — бурсты или просто эритроидные колонии — их называют соответственно бурстобразующими единицами эритропоэза (БОЕ-Э) и колониеобразующими единицами эритропоэза (КОЕ-Э) (Migliaccio G., 1986; Приндулл Г., 1998). Активный гемопоэз в желточном мешке продолжается до 8-й недели и
полностью заканчивается к 16-й неделе (Чертков И. Л. и др., 2002).
Эмбриональная печень, закладка которой происходит на 4-й неделе развития, становится главным местом гемопоэза. Это второй,
печеночный, период кроветворения. Печеночная ткань представлена гепатоцитами — производными эндодермы и кроветворными
клетками — производными мезодермы. К 30-му дню в эмбриональной печени определяются первые гемопоэтические клетки, несущие маркер ранних кроветворных клеток-предшественников —
CD34. В эмбриональной печени гемопоэз в основном эритроидный, позже, в фетальной печени, усиливается миелоидный гемопоэз и количество гранулоцитов, макрофагов и мегакариоцитов
возрастает (Балашова В. А., Абдулкадыров К. М., 1984). К 9-й неделе в печени плода наблюдается В-лимфопоэз (Tavian M. et al,
1999 a, b).
Третий период кроветворения происходит в костном мозге, и
его начало относится к 11-12-й неделе развития плода. Хрящевой
скелет образуется уже у 6-8-недельного эмбриона. Костные рудименты окружаются сетью капилляров, клеток-предшественников
остеобластов и макрофагов. Макрофаги быстро переваривают хрящ,
оставляя небольшие островки хондроцитов, где при участии остеобластов начинается процесс костеобразования, и к 10-й неделе
12
Часть 1. Теоретическая гематология
между костными трабекулами образуются большие сосудистые синусы и костномозговые полости (Charbord P. et al, 1996). К 11-й неделе в костном мозге начинается активный гемопоэз и количество
эритроцитов и гранулоцитов быстро увеличивается. С этого времени костный мозг навсегда становится главным местом гемопоэза у человека.
Всю общность гемопоэтических клеток во взрослом организме
весьма условно подразделяют на 5-6 этапов дифференцировки,
границы которых размыты и которые содержат много переходных
промежуточных форм (Чертков И. П. и др., 2002). В процессе этих
дифференцировок происходит постепенное снижение пролиферативной активности клеток и их потентности, т. е. способности развиваться сначала во все кроветворные линии, а затем во все более
ограниченное количество линий. В схеме (рис. 1) приведены последовательные этапы развития кроветворных клеток, начиная от
тотипотентных стволовых клеток и заканчивая зрелыми элементами крови.
Пул поли- или мультипотентных СКК (II отдел) образуется из
тотипотентной ЭСК, стоящей на самом верху этой иерархической
лестницы (I отдел).
В эмбриональном периоде ЭСК экспрессируют гены, индуцирующие дифференцировку в направлении гемопоэза, что инициирует возникновение СКК и начало кроветворения. Количество СКК
невелико — около 0,01% (Шкловская Е. В. и др., 1998), а вместе с
потомками — клетками-предшественниками — около 0,05%
(Weissman I. L. et al., 1997). Их морфологические характеристики
не выяснены, однако предполагают, что они подобны лимфоцитам
малого и среднего диаметра. Методы их исследования не морфологические, а функциональные, и информация о них получена экспериментальным путем. В отличие от тотипотентной клетки СКК не
обладают неограниченным пролиферативным потенциалом и не
являются бессмертными. Возможно, что нелимитированное самовозобновление и бессмертность СКК явились бы условием, угрожающим их жизни, так как подобные клетки скорее подвержены
неоплазии (Ploemacher R. Е., 1999). В настоящее время доказана
полипотентность данных клеток, способность развиваться во все
8 линий гемопоэза, а также способность к Ограниченному самоподдерживанию ранних СКК (Воробьев А. И. и др., 1985, 2002). Их
саморепликация ограничена, как полагают, приблизительно 50 клеточными делениями (Vaziri H. et al., 1994), однако они поддерживают продукцию клеток крови в течение всей жизни индивидуума.
Большая часть СКК находится в состоянии покоя, в глубоком ре-
Глава 1. Кроветворение
13
зервс, обладая при этом огромным пролиферативным потенциалом (Чертков И. Л. и др., 2002; Ploemacher R. Е., 1999). Согласно
характеристикам и свойствам этих клеток, полученным экспериментальным путем, гетерогенный пул СКК II отдела подразделяют на клетки, способные: .
1) репопулировать кроветворение смертельно облученных мышей длительно (в течение всей жизни) — КРКМ-Д или кратковременно - КРКМ-К;
2) формировать колонии в селезенке смертельно облученных
мышей через 8 или 12 дней — колониеобразующие единицы селезенки - КОЕс-8 дн., КОЕс-12 дн.;
3) образовывать в длительной культуре через 5 недель на адгезивном слое так называемые области «булыжника» — очень
плотно прилегающие друг к другу клетки бластного типа —
КООБ-5 нед.
СКК, имплантированные в организм животных, демонстрируют клональный рост, т. е. формируют клоны-колонии, состоящие
из однотипных клеток различных клеточных линий, или смешанные, что является доказательством их полипотентности (способности развиваться во все клеточные линии). Полипотентность СКК
доказана также с помощью метода маркирования отдельных СКК
чужеродным геном (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 1996; Lemischka I. R. et al., 1986; Keller G. et al., 1990). Перенос гена производится
благодаря встраиванию в ДНК клетки специального ретровируса.
Имплантированные в организм облученной мыши «меченные» таким образом СКК способны полностью репопулировать кроветворение животного, а донорские клетки обнаруживаются в различных участках его кроветворной системы.
Ранние CD38 СКК экспрессируют антиген CD34, который является их маркером, и рецепторы к фактору стволовой клетки
(ФСК), фактору, подобному тирозинкиназе (ФЛТ 3-лиганд); рецептор к интерлейкину 6 (IL-6R); рецептор к CD45 (CD45R). Однако среди ранних СКК выделены клетки, не экспрессирующие
CD34 — CD34 CD38CKK. Возможно, они являются предшественниками CD34XKK (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2001).
По мере снижения пролиферативного потенциала СКК дифференцируются в полиолигопотентные коммитированные клеткипредшественники (III отдел). (Коммитирование — от англ. commit —
принятие на себя обязательств.) Клетки этого уровня имеют уже
ограниченную потентность, так как коммитированы к дифференцировке в направлении лишь 2-5 гемопоэтических клеточных линий. В этот отдел включены клетки, способные образовывать в
14
Часть 1. Теоретическая гематология
Отдел тотипотентных
клеток
ЭС
скк
Отдел стволовых
мультипотентных клеток
КРКМ-Д
КРКМ-К
КОЕс-12 дн, КООБ- 5 нед
КОЕс-8дн
Отдел полиолигопотентных
коммитированных
предшественников
КОЕ-Бл, КОЕ-ВПП
КОЕ-ГЭММ
2-5 потентные КОЕ (в любом наборе)
Отдел моноолигопотентных
коммитированных
предшественников
КОЕ-М
%т
Отдел морфологически
узнаваемых клеток
Т-лимфобласт
В-лимфобласт
Т-пролимфоцит
В-пролймфоцит
Т-лимфоцит
В-лимфоцит
Т-иммунобласт
В-иммунобласт
МоноВласт
Промочоцит
Проплаэмоцит
Дендритная
НК-клетка
клетка
{натуральный
•
•—
киллер)
Активный
Т-лимфоцит
'•
Плазмоц^т
;—
Тумкая
МОНОЦ!
МАКРОФАГИ
Ч
Гистиоииты
и купферовские клетки
Свободные и фиксированные
селезенки
костного мозга
лимфоузлов
W.4
Альвеолярный
Рис. 1. Схема кроветворения
(И. Л. Чертков, Н. И. Дризе, А. И. Воробьев, М. Д. Бриллиант;
схема из кн.: Руководство по гематологии / Пол ред. А. И. Воробьева.
М, 2002. Т. 1.)
ЭС — эмбриональная стволовая клетка; СКК -- стволовая кроветворная клетка;
КРКМ-Д — клетка, репопулирующая костный мозг длительно; КРКМ-К — клетка, репопулирующая костный мозг кратковременно; КОЕс-12 дн. (8"дн.) — колониеобразующая
единица селезенки, дающая колонии через 12 дней (8 дней): КООБ-э нед. — клетка, образующаяся в культуре области «булыжника» через 5 недель; КОЕ-Бл — колониеобразующая единица бластная; КОН-ВВП — колониеобразующая единица высокого пролиферативного потенциала; КОЕ-ГЭММ — колониеобразующая единица гранулоцитарная,-эритроцитарная, моноцитарная (макрофагальная), мегакариоцитарная; КОЕ-ГМ — коло-
Глава 1. Кроветворение
кбе-гм
15
БОЕ-Э
КОЕ-Г
=51
> I 1-Эоз
—
(ОЁ-БазКОЕ
КОЕ-Нейтр
КОЕ-Э
:зофильный Эоэинофилышй НейгрЦильный эрч^Зблзст
КОЕ-Мгкц
Мвга^ариобласт
Промегакариоцит
Базофильиый
нормоцит
-'-' Полихроматофильны!
ш
С е г м е и т о я д е р ч ы е
& •
щ
^•>
1*,
Ппевр зльиый Перито
льный Остеокласт
Оксиф ильный
нормоцит
Ретику'поцит
Эритроцит
Г
Клетки
микрсглии
. '"-.'Мегакариоциг
•/?,[*/.Тромбоциты
Ф
Дендритные
клетки
ниеобразующая единица гранулоцитарно-моноцитарная (макрофагальная); КОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитарная; КОЕ-М — колониеобразующая единица
моноцитарная (макрофагальная); КОЕ-Баз — колониеобразующая единица базофильная ц
тучноклеточная; КО К-Эоз — колониеобразующая единица эозинофильная; КОЕНейтр — колониеобразующая единица нейтрофильная; КОЕ-Э -- колониеобразующая
единица эритроцитарная; КОЕ-Мгкц — колониеобразующая единица мегакариоцитарная; БОЕ-Э — бурстообразующая единица эритроцитарная; пре-Т — клетка-предшественник Т-лимфоцитов; пре-В — клетка-предшественник В-лимфоцитов.
16
Часть 1. Теоретическая гематология
культуре бластные колонии (КОЕ-Бл), клетки, дающие в культуре
рост смешанных колоний, состоящих из гранулоцитов, эритроидных клеток, макрофагов, мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), и 25-потентные КОЕ (в любом составе). КОЕ-ГЭММ являются общим
предшественником миелопоэза. Они несут маркер CD34, а также
маркер, специфичный для клеток миелоидной линии, — CD33 и
детерминанты гистосовместимости — HLA-A, HLA-B, HLA-C и
HLA-DR. Ранние эритроидные предшественники экспрессируют
стволовоклеточный антиген CD34, ранний миелоидный CD33 и
антигены HLA-DR. Поздние эритроидные предшественники несут
на мембране рецепторы к эритропоэтину и трансферрину и специфический маркер гликофорин А. Их способность образовывать
колонии в полутвердых и вязких культуральных средах под влиянием колониестимулирующих факторов (КСФ) позволила доказать их существование и способность данных клеток к клональному росту.
Клетки IV отдела — коммитированные предшественники отдельных клеточных линий являются моноолигопотентными. Они
коммитированы в направлении 1-2-й клеточных линий. Среди них
находятся: КОЕ-Г — клетка-предшественник нейтрофилов, эозинофилов, базофилов; КОЕ-Мгкц — предшественники мегакариоцитов; БОЕ-Э и КОЕ-Э — предшественники эритроидных клеток;
КОЕ-Баз — предшественник базофилов; КОЕ-М —предшественник моноцитов и макрофагов; КОЕ-ГМ — общий предшественник
гранулоцитов и макрофагов; КОЕ-Эоз — предшественник эозинофилов; КОЕ-Нейтр — предшественник нейтрофилов; предшественники Т- и В-лимфоцитов — пре-Т и пре-В клетки. КОЕ-ГМ экспрессируют CD34, CD33, HLA-DR и антиген более зрелых миелоидных клеток — CD 13, по мере созревания которых на мембране
унипотентных моноцитарных и гранулоцитарных КОЕ появляются новые маркеры, но они утрачивают антиген CD34. Близость
путей дифференцировки эритроидных и мегакариоцитарных предшественников, существование бипотентных бурстобразугощих единиц эритро-мегакариоцитопоэза (БОЕ-ЭМгкц), выделенных из фракции CD34+CD38* клеток, доказаны цитогенетически (McLeod D. L.
et al., 1980) и методом клеточных культур, где общий предшественник этих двух линий требует для пролиферации комбинации фактора стволовой клетки (ФСК), интерлейкина-3 (ИЛ-3) и эритропоэтина (ЭРП) (Hunt P., 1995; Debili N. et. al., 1996).
V отдел морфологически узнаваемых клеток включает дифференцирующиеся, созревающие и зрелые клетки всех 8 клеточных
линий, начиная с бластов. Морфоцитохимическая характеристика
Глава 1. Кроветворение
17
в световом микроскопе позволяет идентифицировать большинство
бластных клеток этого уровня. Таким образом, собственно стволовыми кроветворными могут быть названы только клетки I отдела и
ограниченно — II отдела, длительно репопулирующие костный мозг,
или СКК, получаемые в длительных культурах на стромальной
подложке — LTCIC (Longterm Culture Initial Cells — клетки, инициирующие длительную культуру), обладающие, как известно, высокой способностью к самоподдержанию. Эти СКК не несут лииешгоспецифических маркеров и дают рост всем линиям гемопоэтических клеток (Weissman 1. L. et al., 1997). В норме они находятся
в состоянии глубокого покоя (Laitha L. G., 1963; Ladd А. С. et al.,
1997; Traycoff С. М. et al., 1998).
Известно, что отдел стволовых кроветворных клеток представляет из себя пул клеток с различной потентностью и пролиферативным потенциалом. Истинные стволовые кроветворные клетки,
единые для всех кроветворных линий, существование которых гениально предсказал Maximov А. А. (1909), располагаются, возможно, в отделе мезенхимальных клеток, или гемангиобластов (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2001).
Изучение СКК сопряжено с решением многих проблем, связанных с трудностью их выделения, расшифровки механизмов регуляции на клеточном и молекулярном уровне, направляющих клетку на путь самоподдержания или дифференцировки. Знание этих
механизмов имеет большое значение для понимания патогенеза
лейкозов.
В последние годы широко обсуждается вопрос о способности
СКК к дедифференцировке и трансдифференцировке, о так называемой пластичности СКК. Под пластичностью СКК понимают
способность развиваться в другие типы клеток, не свойственные
им в норме. Трансдифференцировка СКК предполагает перепрограммирование ее генома, что позволило бы ей проявить истинную
мультипотентность, если не тотипотентность.
Недавние исследования поколебали представление об СКК как
о клетках, потенциал которых ограничивается лишь дифференцировкой в клетки крови, т. е. гемопоэтической специализацией.
Пластичность СКК внутри гемопоэтической системы давно доказана. Однако множество работ сообщают о том, что любой тип
тканей взрослого организма имеет свои стволовые клетки, способные при трансплантации репопулировать гемопоэтическую систему. Появилось большое количество сообщений о способности СКК
при определенных условиях развиваться в клетки неродственных
тканей — кле ГК8ЁС.К
•О
научная би
Инв.№
18
Часть 1. Теоретическая гематология
клетки ЖКТ (Okada Т. S., 1991; Shi Q. et a]., 1998; Krause D. S. et al.,
2001; Kornblung M. et al., 2002). E. Lagasse и соавторы (2000) показали в экспериментах на мышах трансформацию СКК в гепатоциты. Т. R. Brazelton с соавторами (2000) и Е. Mezey с соавторами (2000) сообщили о трансформации СКК мышей в нейроны головного мозга и способности СКК преодолевать барьер между
кровью и головным мозгом. По данным К. A. Jackson и соавторов
(1999) и С. R. Bjornson и соавторов (1999), стволовые мышечные
или нейральные клетки способны мигрировать в костный мозг и
производить там клетки крови. Slack I. M. W., Tosh D. (2001), Tosh D.,
Slack I. M. W. (2002) в экспериментах на животных показали, что
взрослые стволовые клетки способны продуцировать дифференцированные клетки из неродственных тканей. По их мнению, подобная метаплазия показывает, что обязательства, взятые на себя
клеткой в период эмбриогенеза, могут быть полностью отменены.
В работах D. Orlik и соавторов (2001) и К. A.Jackson и соавторов
(2001) было показано, что клетки донорского костного мозга трансформировались в клетки миокарда и сосудов у мыши с экспериментальным инфарктом.
В то же время существует очень много критических замечаний
по поводу заявлений о возможности трансдифференцировки клеток взрослого организма (Дыбан А. П., Дыбан П. А., 2002; Morrison S. I., 2001; Abkowitz I. L, 2002; Orkin S. H., Zon L. I., 2002).
Учитывая, что гепатоциты, эпителий кишечника и клетки крови
происходят из разных зародышевых листков, выводы о возможности их трансдифференцировки в клетки других тканей вызывают
много вопросов. Действительно ли тогда специализированные ткани происходят из соответствующих специальных листков? Ведь
этот факт всегда был главным принципом, догмой эмбриологии.
Однако то, что негемопоэтические клетки могут быть получены из клеток костного мозга, еще не доказывает, что они происходят из СКК. Причиной может быть то, что обогащенная стволовыми кроветворными клетками клеточная взвесь, используемая
для трансплантации, может содержать как гемопоэтические предшественники, так и прекурсоры, коммитированные в направлении
других негемопоэтических линий. Доказано, что костный мозг содержит мезенхимальные, эндотелиальные клетки, способные развиваться в различные негемопоэтические ткани — остеокласты,
хондроциты, адипоциты, эндотелий (Сухих Г. Т. и др., 2002). Очевидно, что костный мозг может также содержать различные эндодермальные предшественники, способные развиваться в клеточные компоненты пищеварительной системы, а их физические и
Глава 1. Кроветворение
19
фенотипические свойства могут способствовать их попаданию в обогащенную популяцию СКК (Dorshkind К., 2002). Кроме того, полагают, что СКК могут находиться в покоящемся состоянии не только
в костном мозге, но и в других негемопоэтических тканях (Kawada H., Ogawa ML, 2001; Lewis R., 2002). Terada N. и соавторы (2002) и
Ying Q. L. с соавторами (2002) показали в эксперименте, что происходит не трансдифференцировка, а слияние клеток донора и реципиента, в результате чего клетки реципиента приобретают донорский фенотип. К тому же, существование во взрослом организме
тотипотентных эмбриональных клеток, а также плюрипотентных
мезенхимальных стволовых клеток многими исследователями уже
не подвергается сомнению (Weissinan I. L, 2000; Сухих Г. Т. и др.,
2002). Авторы полагают, что эти клетки способны, по-видимому,
покидать зоны своего распределения и мигрировать, циркулируя в
кровотоке. Источником ЭСК в экспериментальных условиях является внутренняя клеточная масса (ВКМ) in vitro фертилизированной человеческой бластоцисты (Schuldiner M. et al., 2000). ЭСК имеют также и гемопоэтический потенциал. Они персистируют в организме, очевидно, в очень небольших количествах и пребывают в
состоянии глубокого покоя. ЭСК взрослого организма могут быть
коммитированы к образованию эндо-, мезо- или эктодермы и могут
либо циркулировать в крови, либо оставаться в тканях, в том числе и
в костном мозге. Под влиянием сигналов микроокружения их потенциал может быть реализован (Gussoni E. et al., 1999; Lagasse E.
et al., 2000; Krause D. S. et al., 2001; Dorshkind K., 2002). Тотипотентность ЭСК, имеющих неограниченный потенциал, обеспечивается
выключением программы специализации клеточных линий. Если
тотипотентную клетку удастся выделить из тканей, то окажется, что
отвергать концепцию эмбриогенеза о зародышевых листках преждевременно (Dorshkind К., 2002). В настоящее время обсуждают роль
микроокружения тотипотентных клеток, способного сыграть решающую роль в их судьбе. С одной стороны, индуцирующие сигналы
могут вызвать экспрессию определенных генов и дифференцировку
ЭСК в направлении этой ткани. Так, в костном мозге эти клетки
могут быть стимулированы к развитию в СКК, чей потенциал ограничен клетками крови. С другой стороны, микроокружение может
ингибировать другие программы развития ЭСК, к которым она потенциально способна, и если эти негативные сигналы ослабеют, то в
ткани могут появиться клетки, не характерные для нее. Это скорее
объяснило бы метаплазию в тканях, чем возможность трансдифференцировки стволовых клеток. Решение этих вопросов нуждается
в дальнейших исследованиях.
20
Часть 1. Теоретическая гематология
Конечной целью процесса кроветворения является образование
зрелых, функционально полноценных клеток крови — лейкоцитов,
эритроцитов и тромбоцитов.
Гемопоэз — очень динамичная, четко сбалансированная и непрерывно обновляющаяся система. В постнатальном периоде он
происходит в плоских костях скелета, а также в позвонках, проксимальных отделах бедренных и плечевых костей, лимфоузлах, селезенке, тимусе. Ежесуточно в организме человека весом около 70 кг
вырабатывается более 300 миллиардов клеток: 20 х 10" — эритроцитов, 45 х 10" — нейтрофилов; 109 — моноцитов, 175 х 109 — тромбоцитов (DanceyJ. Т. et al, 1976; Erslev A. I., 1983; Огава М„ 1990).
В течение жизни у человека в среднем вырабатывается приблизительно 460 кг эритроцитов, 5400 кг гранулоцитов, 40 кг тромбоцитов, 275 кг лимфоцитов; всего — 5-6 т. Это обеспечивается за счет
пролиферации и дифференцировки СКК и их коммитированных
потомков. В крови взрослого человека в каждый данный момент
находится около 25 х 1012 эритроцитов, 15 х 10 й тромбоцитов и
3 х 109 лейкоцитов. Более 300 млн клеток производится в каждую
минуту жизни человека (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2002). Кроветворный красный костный мозг располагается среди элементов
кости и стромы, образующих его микроокружение. Кость, ее балки
и трабекулы образуют главную опорную структуру, ограничивающую зоны кроветворения. Клеточными элементами костной ткани
являются остеобласты, остеокласты и остеоциты. Строма, или подстилка из клеток, является производной мезенхимы и состоит из
большого количества высокоспециализированных клеток — адипоцитов, фибробластов, эпителиальных, адвентициальных, эндотелиальных, ретикулярных клеток. Строму также образуют кровеносные сосуды, нервные окончания и макрофаги. Производным
стромы является внеклеточный матрикс, включающий коллагеновые и ретикулиновые волокна и серию нерастворимых белков —
фибронектин, ламинин, тромбоспонин, тенасцин, гликозаминогликаны и др. Гемопоэтические клетки находятся в тесном контакте с клетками стромы. Адгезивное межмембранное взаимодействие
клеток стромы и гемопоэтических клеток обеспечивает передачу
регуляторных сигналов и необходимых клетке веществ. В этом
процессе большую роль играют молекулы клеточной адгезии, относящиеся к мембраносвязанному классу регуляторов гемоноэза
(Ploernacher R., 1999) и являющиеся производными клеток стромы. Главный маркер СКК — CD34 также является молекулой клеточной адгезии и поэтому участвует в адгезии СКК со стромальными клетками костного мозга. В костном мозге находятся СКК и
Глава 1. Кроветворение
21
все их потомство, в том числе ранние предшественники лимфопоэза. Окончательная дифференцировка В-лимфоцитов завершается
в лимфоузлах, селезенке и Пейеровых бляшках. Специализация и
дифференцировка Т'лимфоцитов осуществляется в вилочковой
железе.
Процесс кроветворения в костном мозге схематично можно представить следующим образом: костные трабекулы, клетки стремы и
прежде всего фибробласты, эндотелиальные и адвентициальные
клетки образуют в костях полости, ниши или синусоиды, в которых в виде гроздьев размещаются кроветворные клетки (Натан Д. Г.,
Зифф К. А., 1994; Spardling A. et al, 2001). Это отдельные клоны,
содержащие клетки различной степени зрелости. Полагают, что
СКК и их потомство находятся в кроветворных зонах преимущественного расположения миелоидных или эритроидных клеток
(Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А., 1980; Wolf N. S., 1978; Трентин Д. Д., 1982). Ниши не омываются кровью, и система полностью замкнута. Ниши являются смежными с венозными синусами, у них общие стенки, выстланные со стороны венозного синуса
эндотелием, а со стороны гемопоэтических ниш — адипоцитами,
клетками адвентиция, между которыми находится базальная мембрана. Созревшие клетки должны преодолеть этот барьер в виде
стенки, чтобы оказаться в венозном синусе, а затем в кровотоке.
Показано, что в определенных нишах находятся клетки различных
кроветворных ростков, а на границах ниш кроветворение смешанное. Способность гемопоэтических клеток распознавать соответствующие клетки стромы и размещаться в своих определенных
зонах называется хомингом.
Созревая, клетка продвигается ближе к стенке венозного синуса. Теперь она должна протиснуться между слоями клеток стенки.
Для этого в цитоплазме эндотелиальных клеток находятся отверстия в 1-2 мкм, через которые клетки могут проходить, если обладают достаточной эластичностью. Клетки с поврежденными или
потерявшими эластичность мембранами не могут пройти через отверстия и расщелины в стенке и гибнут. В прохождении нормобластов через стенку принимают участие макрофаги, освобождающие
нормоцит от ядра. Мегакариоциты плотно прижаты к промежуткам между клетками стенок, их цитоплазма в виде отростков выпячивается в эти трансмуральные отверстия и отделяет в просвет
венозного синуса тромбоциты (Натан Д. Г., Зифф К. А., 1994).
Иногда созревшие клетки могут проходить непосредственно через
мегакариоциты. Это явление, называемое эмпериополезисом, опосредовано способностью мегакариоцитов к эндоцитозу — захвату
22
Часть 1. Теоретическая гематология
других гемопоэтических клеток. В норме только зрелые, функционально полноценные клетки крови проходят через барьер и попадают в кровеносное русло. Способность зрелых клеток покидать
нишу и перемещаться в направлении стенки венозного синуса называется хемотаксисом. Этот процесс опосредован влиянием на
клетку специальных веществ — хемоаттрактантов, продуцируемых
пристеночными клетками.
Регуляция гемопоэза
Процессы регуляции кроветворения до сих пор изучены недостаточно. «...Мы по-прежнему не понимаем, как регулируется сложный процесс вступления стволовой клетки в цикл и выбор ею направления дифференцировки» (Чертков И. Л. и др., 2002). Необходимость непрерывно поддерживать гемопоэз, адекватно отвечать
на все запросы организма, удовлетворяя его потребности в различных специализированных клетках, обеспечивать постоянство и равновесие внутренней среды — гомеостазис — все это предполагает
существование сложных и тонких регуляторных механизмов, действующих по принципу обратной связи. В первую очередь таким
регулятором являются сами СКК и их коммитированные потомки,
обеспечивающие поликлональный гемопоэз, а также индуцирующее гемопоэз микроокружение (ИГМ). Микроокружение играет
огромную роль в регуляции гемопоэза. Клетки стромы, наряду с
гемопоэтическими и некоторыми соматическими клетками, а также молекулами экстрацеллюлярного матрикса продуцируют регулирующие гемопоэз факторы — цитокины. Особая роль принадлежит классу мембраносвязанных глюкозаминогликанов. Гемопоэз
инициируется этими факторами и непрерывно поддерживается
благодаря пулу СКК. Как уже упоминалось, пул СКК мал и, так
как он находится у истоков гемопоэза, бесценен для организма, и
поэтому должны быть механизмы, защищающие его от истощения.
СКК покоятся в специальных нишах и почти не отвечают на сигналы, запросы организма, на гуморальные факторы регуляции
(Laitha L. G., 1979). Полагают, что их количество регулируется
стохастически, т. е. случайно. Регуляция пула СКК осуществляется в соответствии с некой генетически обусловленной случайной
вероятностью пролиферации и дифференциации, как бы заданной периодичностью этих процессов (Чертков И. Л., Гуревич О. А.,
1984; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985; Гольдберг Е. Д. и др.,
2000; Laitha L. G., 1963; Nakahata et al, 1982; Mctcalf D., 1984; OraваМ., 1990).
Глава 1. Кроветворение
23
Стволовые кроветворные клетки стромозависимы и воспринимают короткодистантные регулятор.ные стимулы, получаемые ими
при тесном межклеточном контакте с клетками стромального
окружения. Однако существуют основания полагать, что регуляция
СКК не ограничена влиянием только корохкодистантных стимулов и что факторы ИГМ влияют на СКК, находящиеся в кроветворных зонах преимущественного расположения миелоидных и
эритроидных предшественников (Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А.,
1980; Wolf N. С, 1978; Трентин Д. Д., 1982). По мере дифференциации клетка начинает отвечать на дальнедействующие гуморальные стимулы. Эндогенная регуляция всех звеньев гемопоэза осуществляется цитокинами, которые инициируют клеточную пролиферацию, дифференциацию, воспаление, иммунный ответ, апоптоз.
Влияние цитокинов осуществляется через рецепторы на клеточной мембране, которые проводят сигнал в клеточное ядро, где происходит активация соответствующих генов. Цитокины включают
в себя интерлейкины, имеющие цифровые обозначения (ИЛ-1,
ИЛ-2 и т. д.), и ростовые факторы, включая колониестимулирующие факторы (КСФ) с буквенными обозначениями. Основными
продуцентами цнтокинов являются моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты и стромальные элементы — фибробласты, эндотелиальные
клетки и др. (Лурия Е. А., Фриденштейн М. Я., 1981; Теста Н., 1991).
Стволовые кроветворные клетки самообновляются медленно и
при готовности к дифференцировке (процесс коммитирования)
выходят из состояния покоя (С(1-фаза клеточного цикла) и становятся коммитированными. Это значит, что процесс стал необратимым и такие рестриктированные клетки, управляемые соответствующими цитокинами, пройдут все стадии развития вплоть до
конечных зрелых элементов крови, т. е. «погибнут через дифференцировку» (Till J. E., McCulloch Е. А., 1961). Стволовые кроветворные клетки способны дифференцироваться в одном из трех
главных направлений гемопоэза: миелоидном, В- и Т-лимфоцнтарном. Факторы регуляции гемопоэза подразделяют на близкодистантные (для СКК) и дальнедействующие гуморальные ростовые факторы для коммитированных предшественников и других
дифференцирующихся и созревающих клеток. В зависимости от
уровня развития клетки факторы регуляции делятся на 3 основных класса.
1. Факторы, влияющие на ранние СКК. К ним относятся: фактор стволовой клетки (ФСК, или фактор Стила), ФЛТ 3лиганд, колониестимулирующий фактор для гранулоцитопоэза — Г-КСФ, ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-12, а также ингибиторы,
24
Часть 1. Теоретическая гематология
которые тормозят выход СКК в клеточный цикл из состояния покоя, — воспалительный белок макрофагов (М1Р-1а,
ф ) , трансформирующий рост фактор (TGF-(3), фактор некроза опухоли (ФНО), кислые изоферритины и др. Фактор
стволовой клетки экспрессируется фибробластами и эндотелиальными клетками стромы. Он действует на СКК непосредственно, инициируя их вхождение в клеточный цикл,
или влияет на клетку как ко-стимулятор других цитокинов,
например ИЛ-3, являясь синергическим цитокином (Bernstein I. D. et al., 1991). Эта фаза регуляции СКК не зависит от
запросов организма.
2. Срсднедействующие линейно неспецифические факторы:
ИЛ-3, ИЛ-4, ГМ-КСФ (КСФ для грануломоноцитопоэза).
3. Позднедействующие линейно специфические факторы, которые поддерживают пролиферацию и созревание коммитированных предшественников и их потомков. Они включают:
для эритроидной серии клеток — гормон эритропоэтин
(ЭРП), для мегакариоцитов — гормон тромбопоэтин, а также
ИЛ-5, М-КСФ и Г-КСФ (Чертков И. Л. и др., 2002: Огава М.,
1990; Натан Н., Зифф К, 1994).
Эритроидные предшественники отличаются по чувствительности к ЭРП, которая возрастает по мере их созревания. Ранние эритроидные прекурсоры (БОЕ-Э) для своего развития нуждаются в
специфическом стимуляторе роста — бурстстимулирующей активности (БСА). Наибольшей чувствительностью к ЭРП обладают
КОЕ-Э. Присутствие этого гормона также требуется при развитии
эритробластов. иначе клетка погибнет.
Ингибиторы гемопоэза являются плеотропными факторами,
которые могут оказывать как стимуляторное, так и ингибиторное
влияние на различные клетки. Например, TGF-P, стимулирует
предшественников миелопоэза — поздние КОЕ-ГМ и в то же время
прямо ингибирует все виды ранних гемопоэтических предшественников (Axelrad А. А., 1990; Ploemacher R. E. et al., 1993). Для
взаимодействия клеток со стимуляторами и ингибиторами роста
необходима локальная презентация этих факторов. Вероятно, контакты клетка—клетка, клетка—экстрацеллюлярный матрикс опосредованы молекулами адгезии. Кроме этих факторов предположительно существуют и другие, более интимные уровни регуляции
СКК, включающие соединение внутриклеточных образований
смежных клеток через места соединения — лакуны, окна.
К регуляторам гемопоэза относятся также некоторые интерфероны и ядерные белки, например семейства GATA. Стимуляторы и
Глава 1. Кроветворение
25
ингибиторы действуют одновременно, одни и те же клетки вырабатывают как позитивные, так и негативные регуляторы, и этот синергизм определяет понятие «цитокинового каскада». Фаза регуляции гемотюэза средне- и позднедействующими цитокинами является чувствительной к запросам организма. Благодаря влиянию
этих факторов костный мозг способен быстро обеспечить потребности организма в специализированных клетках.
На смену представлению о бессмертии СКК и их неограниченном самоподдержании (способности к неограниченному количеству делений без снижения пролиферативного потенциала и воспроизведению абсолютно идентичных дочерних клеток) пришло
понятие клональной сукцессии, смене клонов СКК в течение жизни организма. В 1965 г. Н. Е. М. Кау и соавторы предложили гипотезу о поочередном участии клонов СКК в гемопоэзе. Клоновая (каскадная) теория получила экспериментальное подтверждение и сегодня имеет много последователей (Чертков И. Л., Дризе Н. И.,
1996; Огава М., 1990). Было доказано, что на протяжении жизни
индивидуума в организме существуют десятки одновременно функционирующих небольших короткоживущих клонов, состав которых меняется в течение 1-4 месяцев, а исчезнувшие клоны никогда больше не появляются. Авторы показали, что различные зоны и
органы кроветворной системы заселены разными локально расположенными клонами, где СКК и совершают свой жизненный цикл.
Существуют СКК как глубокого, так и быстромобилизуемого резерва. Клетки последнего могут возвращаться в состояние покоя
после 1-3 делений. Эти СКК, имеющие уже дифференцировочные
маркеры, способны быстро отвечать на запрос организма. Согласно И. Л. Черткову и Н. И. Дризе СКК закладываются только в эмбриогенезе и затем экономно расходуются в течение жизни, образуя короткоживущие, сменяющие друг друга клоны. Следовательно, система структурирована таким образом, что, несмотря на
отсутствие непрерывного самоподдержания индивидуальных СКК,
имеет место самоподдержание всей популяции стволовых клеток в
целом за счет непрерывно сменяющихся клонов.
Еще одним регулятором гемопоэза является апоптоз — запрограммированная клеточная смерть или генетически обусловленная программа самоубийства. Понятие «апоптоз» было введено
J. F. R. Кегг с соавторами в 1972 г. Учитывая, какое огромное количество клеток крови вырабатывается в организме взрослого человека (более 300 г в сутки и около 5-7 т в течение жизни), очевидно, что для поддержания гомеостаза и сохранения клеточного баланса должен существовать механизм удаления избыточных
26
Часть 1. Теоретическая гематология
клеток. Этим механизмом является апоптоз, и основной закон
клеточной кинетики состоит в том, что в единицу времени рождается и умирает одно и то же количество клеток (Владимирская Е. Б. и др., 1997). Апоптоз необходим для элиминации поврежденных, старых и избыточных или потенциально опасных
клеток. В организме происходит дифференцировка и активация
большого числа лимфоцитов, и только часть их в результате селекции отбирается для выживания. Лимфоциты, не получившие
сигналы выживания, погибают, при этом апоптозу подвергается
75% В-клеток-предшественников и 95% Т-клеток-предшественников (Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 2001). В норме апоптоз, в
отличие от некроза, не представляет собою патологическую форму смерти клеток, и удаление умирающих клеток происходит без
развития воспаления.
Апоптоз — это контролируемое самоперевариванис. в процессе которого клетка сморщивается, происходит конденсация и фрагментация ее ядра, разрушение цитоскелета. Фрагменты апоптической клетки поглощаются фагоцитами. Программа самоуничтожения клетки, для включения которой существуют внутренние и
внешние сигналы, уравновешивается программой ее блокирования. Рецептор, воспринимающий сигнал клеточной смерти, называется АРО-1, или FAS, или CD95 (Nagata S., 1998). Апоптоз
регулируется онкогеном р53 и семейством онкогенов BCL-2, причем ген р53 индуцирует апоптоз, a BCL-2 и BCL-X его блокируют.
Недавние работы показали, что митохондрии, семейство генов
BCL-2 и клеточные белки семейства ICE (IL-1-converting enzime)
взаимодействуют внутри клетки в регуляции апоптоза. Так, большая часть противоопухолевой терапии, такая как химиотерапия,
облучение, опосредуют клеточную смерть через активацию белков ICE (Debatin K.-M., 1999). Эти механизмы еще недостаточно
ясны, но нарушение взаимодействия апоптоз—ингибиция апоптоза может привести к развитию тяжелых заболеваний. В результате
мутации гена р53 клетка теряет способность к апоптозу и могут
возникнуть опухоль (рак, лейкоз) или аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка,-гломерулонефрит) (Thompson С. В., 1995). Повышенное саморазрушение клеток лежит в
основе патогенеза таких заболеваний, как апластическая анемия,
миелодиспластический синдром, СПИД, болезни Альцгеймера и
Паркинсона (Барышников А. Ю., 2001; Maciejewski J. P. et al,
1995; Gersuk G. M. et al., 1996). Причиной возникновения опухоли
может быть снижение противоопухолевого иммунного надзора
вследствие усиления апоптоза иммунокомпетентных клеток. В здо-
Глава 1. Кроветворение
27
ровом организме эти процессы уравновешены и апоптоз является
важным физиологическим регулятором гемопоэза.
Номенклатура клеток костного мозга и крови
Костный мозг включает кроветворную ткань (паренхима — красный костный мозг) и клетки стромального микроокружения. Клетки стромы костного мозга представлены большим количеством
высокоспециализированных элементов, принимающих прямое участие в регуляции гемопоэза. К ним относятся фибробласты, адипоциты (жировые клетки), эндотелиальные, эпителиальные, адвентициальные клетки. Среди клеток микроокружения кроветворной
ткани обычно рассматривают и такие, как остеокласты, мастоциты, макрофаги, хотя они являются дериватами кроветворных клеток. К клеткам микроокружения относятся остеобласты, участвующие в образовании кости. Жизненный цикл пролиферирующих.
дифференцирующихся и созревающих кроветворных клеток совершается в костном мозге, подчиняясь сложным законам регуляции, опосредованным множеством взаимодействующих факторов,
способных обеспечивать интерактивные связи клетки и ее микроокружения. К этим факторам относятся многочисленные цитокины, включающие ростовые стимулирующие факторы и ингибиторы роста, различные интерлейкины, а также интерфероны, ядерные белки, факторы внеклеточного матрикса, молекулы адгезии,
гормоны, белки, контролирующие апоптоз, и др. Данные факторы
действуют на кроветворные клетки, направляя их к пролиферации
или дифференцировке, и многие из них продолжают оказывать
свое влияние на клетки, циркулирующие и находящиеся в тканях.
Отдел морфологически узнаваемых клеток включает бластные
клетки-предшественники зрелых клеток всех клеточных линий,
которые, пройдя заключительные этапы дифференцировки, через
несколько промежуточных стадий развития превращаются в зрелые клетки, готовые выполнять свои функции.
Первой морфологически распознаваемой клеткой нейтрофильного ряда в костном мозге является миелобласт. Его пролиферация и дифференциация под влиянием позднедействующих регуляторных факторов приводит последовательно к образованию
нейтрофильного промиелоцита, миелоцита, метамиелоцита, палочкоядерного и сегментоядерного нейтрофилов.
Процесс дифференциации и созревания эозинофилов и базофилов происходит аналогично таковому у клеток нейтрофильного
28
Часть 1. Теоретическая гематология
ряда: эозинофильный и базофильный бласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты и, наконец, палочко- и сегментоядерные
эозинофилы и базофилы.
Монобласт является предшественником линии морфологически идентифицируемых моноцитарных клеток. Его дифференцировка и созревание приводят к образованию промоноцита, затем
моноцита. Моноциты после циркуляции в периферической крови
поступают в ткани, где превращаются в макрофаги.
В отделе морфологически распознаваемых клеточных элементов идентификация клеток эритроидной линии становится возможной начиная с эритробласта (проэритробласта). Последующая
эритроидная дифференцировка приводит к образованию базофильного нормобласта (нормоцита), затем, по мере гемоглобинизации
клетки, полихроматофильного и оксифильного нормобласта (нормоцита) — последней ядросодержащей клетки эритроидной линии. После энуклеации оксифильного нормобласта образуется ретикулоцит и наконец зрелый эритроцит.
Морфологическое распознавание клеток мегакариоцитарного
ряда в костном мозге начинается с мегакариобласта. В результате
эндомитоза и полиплоидизации мегакариобласт превращается в
промегакариоцит, базофильный, полихроматофильный и оксифильный мегакариоциты. Эффекторными клетками мегакариоцитарного ряда являются тромбоциты, главным продуцентом которых служит полихроматофильный мегакариоцит.
Лимфобласты — клетки-предшественники Т- и В-лимфоцитов
в составе V отдела кроветворных клеток — подразделяются на
Т-лимфобласты и В-лимфобласты, количество которых в костном
мозге слишком мало, а морфологические характеристики недостаточно убедительны для их распознавания.
Следующими за лимфобластами клетками этого ряда идут Т- и
В-пролимфоциты, которые созревают в зрелые Т- и В-лимфоциты.
Жизненный цикл этих клеток после костного мозга проходит в
основном в лимфоидных органах, куда они поступают после циркуляции в крови.
Продолжением В-лимфоцитарной серии клеток является линия плазматических клеток, которые берут свое начало от В-иммунобласта — активированного антигеном В-лимфоцита. В этом ряду
самой молодой клеткой является плазмобласт, который созревает
в проплазмоцит и плазмоцит — клетку иммунного ответа, продуцирующую антитела. Конечные стадии дифференциации и созревания клеток всех 8 клеточных линий преодолевают костномозговой барьер и поступают в кровеносное русло. Вместе с жидкой
Глава 1. Кроветворение
29
частью (плазмой) клетки, именуемые форменными элементами,
образуют периферическую кровь.
Огромный пул циркулирующих и функционирующих в тканях
кровяных клеток представляет собою чрезвычайно гетерогенный
состав. Это объясняется очень тонкой дальнейшей специализацией клеток и нахождением их в различных зонах распределения и
влияния.
Клетки так называемой белой крови — лейкоциты — включают
палочкоядерные и сстментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты и плазматические клетки. Клетки
красной крови представлены ретикулоцитами и эритроцитами. Еще
одна категория клеток — кровяные пластинки, или тромбоциты.
Непрерывное поступление этих клеток из костного мозга и естественная адекватная убыль обеспечивают постоянство и равновесие клеточного состава крови.
Литература
Афанасьев Б. В., Алмазов В. А. Родоначальные кроветворные клетки. Л.: Наука.
1985.204 с.
Балашова В. А., Абдулкадыров К. М. Клеточный состав гемопоэтической ткани
печени и селезенки у плодов человека // Арх. анат., гнет, и змбр. 1984. Т. 4.
С. 80-83.
Барышников А. Ю. Программированная клеточная смерть (Апоптоз)// Онкогематология / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 36-43.
Владимирская Е. В., Масчан А. А., Румянцева А. Г. Апоптоз и сю роль в развитии
опухолевого роста // Гематол. и трансфузиол. 1997. Т. 42. № 5. С. 4-9.
Воробьев А. И. Клетка // Руководство по гематологии / Под ред. А. II. Воробьева. М., 2002. Т. 1.С. 1-28. "
Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Шерстобоев Е. Ю. Механизмы локальной регуля-
ции кроветворения. Томск, 2002. С. 8-76.
Дыбан А. П., Дыбан П. А. Стволовые клетки в экспериментальной и клинической медицине // Мед. академ. журн. 2002. Т. 2, № 3. С. 3-24.
Лурия Е. А., Фриденштейн А. Я. О стромальной и Т-клеточной регуляции стволовых кроветворных клеток // Терапевт, архив. 1981. Т. 53, № 9. С. 116-120.
Натан Д. Г., Зифф К. А. Регуляция кроветворения // Гематол. и транефузиол.
1994. Т. 39, №2. С. 3-10.
Огава М. Стволовая кроветворная клетка: стохастическая дифференцировка и
гуморальный контроль пролиферации // Гематол. и трансфузиол. 1990. Т. 35,
№ 2. С. 24-32.
Приндулл Г. Гемопоэз в желточном мешке // Гематол. и трансфузиол. 1998.
Т. 43, №3. С. 14-15.
Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.: Медицина, 1985.
2 т.
Сухих Г. Т., Малайцев В. В., Богданова И. М. Мезенхимальная стволовая клетка // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2002. № 2. С. 124-131.
Глава 2
ПУНКЦИЯ КОСТНОГО МОЗГА.
МЕТОДИКА ЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ. МИЕЛОГРАММА
Пункция костного мозга производится главным образом при
заболеваниях системы крови для оценки клеточного состава костного мозга и его функционального состояния, установления диагноза и уточнения стадии заболевания (рецидив, ремиссия при лейкозах), оценки эффективности проводимой терапии, исключения
(или подтверждения) фазы лейкемпзации злокачественных лимфом, обнаружения метастазов рака.
Наиболее простой и доступный способ получения костного мозга
из грудины, который применяется до настоящего времени, был
предложен в 1927 г. М. И. Аринкиным. Пункция костного мозга
производится специальными иглами (Кассирского, швейцарской
фирмы Unimed, разовыми иглами итальянской фирмы Bauer и
др.). Костный мозг получают посредством аспирационной биопсии
в области тела грудины на уровне третьего-четвертого межреберий или в области рукоятки грудины, а также гребня или бугристости подвздошной кости. Место прокола обрабатывают раствором
йода или другим антисептиком. Проводится местная анестезия 12% раствором новокаина послойно: кожа—подкожная клетчатканадкостница.
Пункция костного мозга производится врачом в процедурном
кабинете при соблюдении правил асептики. Пункционная игла и
шприц должны быть тщательно стерилизованы и обезвожены эфиром. Иглу вводят строго перпендикулярно поверхности грудины в
костномозговой канал; щиток иглы устанавливают на расстоянии
0,8-2 см от грудины, в зависимости от конституции пациента. После извлечения мандрена из иглы на нее насаживается 10-20-миллиметр. вый шприц и производится аспирация костного мозга, после чего иг.,у извлекают и обрабатывают место прокола антисепти-
Глава 2. Пункция костного мозга. Миелограмма
35
ком. Количество аспирированной взвеси клеток зависит от объема
и характера предполагаемых исследований. Для целей диагностики достаточно 0,1-0,2 мл во избежание примеси крови, однако для
проведения цитогенетических, культуральных, иммунологических,
цитохимических и других исследований требуется несколько миллилитров костного мозга. Костный мозг из шприца помещают на
парафинированное часовое или предметное стекло и часть материала немедленно вносят в пробирки для определения клеточности
костного мозга и количества мегакариоцитов. Сразу после этого на
предметных стеклах углом шлифованного стекла делают тонкие
мазки для оценки клеточного состава костного мозга. Во избежание свертывания костного мозга все перечисленные процедуры
делаются очень быстро.
Методика исследования
Подсчет миелокариоцитов производится в счетной камере Горяева под световым микроскопом. Пунктат разводят уксусной кислотой, для этой цели во время пункции в одну пробирку с 4 мл 35% уксусной кислоты вносят 0,02 мл клеточной взвеси (для подсчета миелокариоцитов), во вторую пробирку с 0,4 мл уксусной
кислоты помещают 0,02 мл клеточной взвеси (для подсчет;! мегакариоцитов). Содержимое пробирок тщательно перемешиьают п
заполняют счетные камеры. Через 2 минуты в камере Горяеь а под
микроскопом подсчитывают количество миелокариоцитов с пересчетом на 1 мкл. Подсчет ядросодержащих клеток костного мезга
производят в 100 больших квадратах и искомую цифру определяют по формуле
их 200x250
= п х500,
100
где х — количество миелокариоцитов в 1 мкл пунктата;
п — количество миелокариоцитов в 100 квадратах сетки счетной камеры;
200 — разведение пунктата;
250 — множитель для приведения к 1 мкл.
Число миелокариоцитов в 100 больших квадратах достаточно
просто умножить на 500. Нормальные показатели и количество
миелокариоцитов колеблется в довольно широких пределах — от
42 до 195 х 109/л (Соколов В. В., Грибова И. А., 1972). Клиническое
значение имеет как повышение, так и понижение клеточности костного мозга.
х=
36
Часть 1. Теоретическая гематология
Подсчет мегакариоцитов осуществляется в счетной камере Фукса -Розенталя. Разведенным пунктатом заполняют камеру и подсчитывают мегакариоциты на всей площади сетки камеры. При
расчете на 1 мкл костномозговой взвеси используют формулу
«х20
,
3,2
где х — количество мегакариоцитов в 1 мкл взвеси;
п — количество клеток в камере;
20 — степень разведения;
3,2 — объем камер Фукса-Розенталя в мкл.
У здоровых людей нормальные показатели мегакариоцитов колеблются от 50 до 150 в 1 мкл (0,050-0,150 х 109/л) (Соколов В. В.,
Грибова И. А., 1972; Лабораторные методы исследования в клинике, 1987; Грибова И. А., Воробьев А. И., 2002; Медицинские лабораторные технологии, 1998).
х=
Миелограмма
Состав костного мозга в норме подвержен значительным колебаниям и зависит от возраста обследуемого, функционального состояния костного мозга в момент пункции и качества произведенной пункции. Разбавленность пунктата периферической кровью и
фиброз костного мозга сильно влияют на клеточный состав миелограммы. В световом микроскопе анализируют мазки костного
мозга, окрашенные принятым в лаборатории методом (по Романовскому-Гимзе, Нохту, Крюкову-Паппенгейму и др.). Анализ
начинают с просмотра мазков под 100-кратным увеличением с
целью определения клеточности пунктата, ориентировочной оценки его состава, количества мегакариоцитов, наличия атипичных
клеток и их скоплений. Затем на окрашенный сухой мазок наносят
каплю иммерсионного масла и начинают подсчет всех попадающих в поле зрения окуляра ядросодержащих клеточных элементов
в количестве 500 или более клеток. Считают в различных участках
нескольких (2-3) препаратов, используя 1000-кратное увеличение, иммерсионный объектив и счетные клавишные машинки. После подсчета 500 клеточных элементов определяют содержание всех
клеток в составе их клеточных рядов (в %), располагая их в зависимости от стадии созревания. Распределенные таким образом клеточные элементы всех клеточных линий представляют собой миелограмму. В состав миелограммы входят все ядросодержащие клетки нейтрофильного ряда, начиная с миелобластов и заканчивая
сегментоядерными нейтрофилами (в среднем 60,8%), все эозино-
37
Глава 2. Пункция костного мозга. Миелограмма
филы и базофилы (-3,2% и 0,2% соответственно), клетки эритроидного ряда от эритробласта до оксифильного нормобласта
(-20,5%), моноциты (-1,9%), лимфоидные элементы (-9%), а также плазмоциты, мегакариоциты. Отмечают наличие тучных клеток, макрофагов, остеобластов, остеокластов и др. (см. табл. 1; по:
Грибовой И. А., Воробьеву А. И., 2002).
Таблица 1
Клеточный состав костного мозга в норме
Показатели
миелограммы
Ретикулярные клетки
Бласты
Миелобласты
Нейтрофильные клетки:
промиелоциты
миелоциты
метамиелоциты
палочкоядерные
cei ментоядерные
Все нейтрофильные элементы
Эозинофилы (всех генераций)
Базофилы
Эритробласты
Пронормоциты
Нормоциты
базофильные
полихроматофильные
оксифильные
Все эритроидные элементы
Лимфоциты
Моноциты
Плазматические клетки
Количество мегакариоцитов (клеток в 1 мкл)
Лейкоэритробластическое отношение
Индекс созревания нейтрофилов
Количество миелокариоцитов (тыс. в 1 мкл)
Среднее
Предел нормальных
значение, %
колебаний
0.9
0.6
1.0
0,1-1,6
0.1-1,1
0,2-1,7
2,5
1,0-4,1
7.0-12,2
8,0-15,0
12,8-23.7
13.1-24.1
52,7-68,9
0,5-5,8
0-0,5
0.2-1,1
0,1-1,2
9,6
11.5
18,2
18,6
60.8
3.2
0.2
0,6
0.6
3.0
12,9
3,2
20,5
9.0
1.9
0,9
3,3
0.7
118,4
1.4^,6
8.9-16,9
0,8-5,6
14,5-26.5
4,3-13,7
0,7-3,1
0,1-1,8
50-150
2,1-4,5
0,5-0,9
41,6-195,0
Определяют лейкоэритробластическое соотношение (отношение клеток белого ряда к клеткам красного ряда), которое в норме
равно 4 (3) : 1. При необходимости высчитывают индексы созревания нейтрофилов (0,6-0,8), эритрокариоцитов (0,8-0,9), парциальные эритрограммы и мегакариоцитограммы (Воробьев А. И.,
38
Часть 1. Теоретическая гематология
1985; Абрамов М. Г., Воробьев А. И., 2002). Миелограмму выписывают на специальном бланке, где кроме количественного анализа
клеточного состава пунктата (содержание клеток в %) производят
качественный анализ — морфологическое описание клеточных элементов в составе их клеточных рядов. Прежде всего дают оценку
клеточностн пунктата, например: пунктат костного мозга клеточный, гиперклеточный, скудный или клеточность пунктата нормальная, умеренная, пониженная, повышенная. Затем дается описание
каждого клеточного ряда, начиная с количества клеток и их соотношения внутри него. Употребляют выражения: росток сохранен,
в пределах нормальных колебаний, на нижней границе нормы; или
сужен, редуцирован, угнетен; или, напротив, усилен, раздражен,
гиперплазирован. Отмечают увеличение или уменьшение содержания клеток какой-либо стадии созревания (например: содержание миелобластов увеличено до 15%), подчеркивают особенности
морфологии клеток, их созревания, признаки дисплазии, наличие
патологических включений в цитоплазме (палочки Ауэра в лейкозных миелобластах и др.) (Коленкин С. М., Михеева А. И., 1999).
Таким образом, после тщательного просмотра мазков, подсчета
миелограммы и последующего анализа всех клеточных линий результат аналитического исследования мазков костного мозга выписывается на бланке с цифровой и описательной характеристиками пунктата, заключением по каждому клеточному ряду и предполагаемым диагнозом, основанным на данных лабораторных
исследований.
Литература
Абрамов М. Г., Воробьев А. И. Костный мозг, клеточный состав. Пункционная
диагностика //' Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.,
2002. Т. 1.С. 47-53.
Грибова И. А., Воробьев А. И. Гематологическая норма // Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М„ 2002. Т. 1. С. 61-63.
Коленкин С. М., Михеева А. И. Основные правила исследования пунктата костного мозга // Клинич. лаб. диагностика. 1999. № 2. С. 41-43.
Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /11од ред. В. В. Меньшикова. М„ 1987. С. 140-145.
Медицинские лабораторные технологии: Справочник / Под ред. А. II. Карпищенко. СПб.: Интермедицина, 1998. 406 с.
Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.: Медицина, 1985.
Т. 2. 448 с.
Соколов В. В., Грибова И. А. Гематологические показатели здорового человека.
М„ 1972.
Глава 3
МОРФОЛОГИЯ И ФУНКЦИИ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
И КРОВИ
Морфологическое распознавание клеток костного мозга становится возможным, начиная с бластных клеток V отдела костномозгового кроветворного пула (Чертков И. Л. и др., 2002). Властные
клетки предшествуют созревающим и зрелым клеткам костного
мозга и подразделяются на бласты миелоидной и лимфоидной линий. Миелопдные бластные клетки включают миелобласты, монобласты, эритробласты и мегакариобласты. Миелобласты подразделяются в свою очередь на 3 гранулоцитарных типа: бласты нейтрофильные, базофильные и эозинофильные. Лимфоидные клетки
также имеют бласты, предшествующие В- и Т-лимфоцитам, а именно Т-лимфобласты и В-лимфобласты.
Нейтрофильные гранулоциты
Нейтрофильный миелобласт созревает из унипотентной клетки-предшественника гранулоцитопоэза и затем — нейтрофилопоэза (в агаровой культуре из колониеобразующей единицы гранулоцитопоэза — КОЕ-Г и колониеобразующей единицы нейтрофилопоэза — КОЕ-Нейтр). Его диаметр — 15-20 мкм, ядро круглое, с
нежнозернистой структурой ядерного хроматина, 2-4 нуклеолами. Цитоплазма умеренная, голубого или синего цвета. Редкие миелобласты содержат в цитоплазме единичные азурофильные гранулы. Количество миелобластов в норме составляет в среднем 1%
миелокариоцитов. Пролиферация и созревание миелобластов под
влиянием специфических цитокинов приводит к образованию более зрелых клеток — промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов.
40
Часть 1. Теоретическая гематология
Нейтрофильный промиелоцит — самая крупная клетка этого
ряда, ее диаметр может достигать 25 мкм. Округлое ядро, расположенное несколько эксцентрично, имеет нежнозернистую структуру хроматина, четко прослеживаются 1-3 ядрышка. Цитоплазма
более широкая, чем у миелобласта, голубая или базофильная и
содержит яркую азурофильную (окрашивающуюся азуром) зернистость, которая представляет собою первичные лизосомальные
гранулы. Гранулы содержат миелопероксидазу, кислую фосфатазу,
(3-глюкуронидазу, арилсульфатазу, лизоцим, сульфатированные
мукополисахариды, основные белки и др. На стадии промиелоцита начинают формироваться вторичные гранулы. В миелограмме
определяется 1-4% промиелоцитов.
Миелоцит — более зрелая клетка, ее размер меньше, чем размер
промиелоцита (12-15 мкм). Это последняя клетка данного ряда,
способная к делению. Эксцентрично расположенное овальное или
бобовидное ядро отличается более грубой структурой хроматина.
В «молодых» миелоцитах можно видеть отчетливые нуклеолы, в
более зрелых миелоцитах ядрышки не видны. Цитоплазма клетки
уже не базофильная, а полихроматофильная, розоватая или сероголубоватая. Кроме первичных она содержит вторичные гранулы,
более мелкие, розовато-коричневые, а позднее в ней появляются
еще более мелкие — третичные гранулы. Маркером вторичных гранул является щелочная фосфатаза. Содержание миелоцитов в костном мозге колеблется от 7 до 12%.
Нейтрофильный метамиелоцит и все последующие стадии созревания клеток этой серии уже не способны к делению (Fibbe W. Е.,
Ploemacher R. Е., 1999). Диаметрметамиелоцита — 12-14мкм,ядро
бобовидное, грубое, ядрышки не видны. Ядерно-цитоплазматическое соотношение низкое, цитоплазма светлая, розоватая и содержит мелкую специфическую зернистость. Содержание метамиелоцитов в костном мозге — 8-15%.
Небольшая часть палочкоядерных нейтрофилов и сегментоядерные нейтрофилы, представляющие из себя зрелые, функционально полноценные клетки, способны преодолевать костномозговой барьер и выходить в кровеносное русло. Ядро палочкоядерного нейтрофила лентовидной формы и может быть изогнуто в виде
подковы, закручено и т. д. Ядро сегментоядерного нейтрофила имеет
2-4 фрагмента, соединенных мостиками из ядерной мембраны и
тонких нитей хроматина. Структура хроматина грубая, цитоплазма розоватого цвета и содержит мелкую специфическую коричневатую зернистость и небольшое количество первичных азурофильных гранул. Содержание палочко- и сегментоядерных нейтрофи-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
41
лов в костном мозге колеблется от 25 до 47%. Увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов в периферической крови (в норме 2-3,5%) является чаще всего следствием воспаления, бактериальной инфекции. Сегментоядерные нейтрофилы созревают в
костном мозге за 1-2 дня, после чего поступают в периферическую
кровь, образуя 2 пула — циркулирующий и пристеночный, в соотношении 1 :3 (Френкель М. А., 2001). В крови нейтрофилы
остаются 6-8 часов перед тем как проникнуть в ткани, где они
выполняют свои основные функции фагоцитов (Тотолян А. А.,
Фрейндлин И. С, 1999). Среднее содержание клеток нейтрофильного ряда в костном мозге составляет около 60% миелокариоцитов.
Функции нейтрофилов
Нейтрофилы, называемые также микрофагами, являются главными эффекторными клетками при остром воспалении, первой
линией защиты, и их основные функции заключаются в фагоцитозе — захвате и переваривании чужеродного материала (микробных
агентов, грибов и других частиц) и секреции цитокинов. Работы
И. И. Мечникова (1898) явились пионерскими в открытии явления фагоцитоза, а П. Эрлих (1900) обосновал секреторную способность нейтрофилов. Учитывая относительно ограниченную длительность их жизни, понятно, что большие количества нейтрофилов должны ежедневно восполняться, особенно при возникновении
инфекции, когда их количество увеличивается в 10-30 раз. Во
взрослом организме в 1 минуту продуцируется до 120 млн нейтрофилов (Dexter Т. М., 1984). Быстрая трансмиграция нейтрофилов через
клетки эндотелия опосредована действием многих цитокинов,
в том числе хемокинов, которые являются медиаторами воспаления, активируя нейтрофилы. Они продуцируются многими
клетками крови и тканей, и прежде всего моноцитами, макрофагами, Т-лимфоцитами, нейтрофилами, фибробластами и эндотелием
сосудов, на поверхности которых происходит маргинация нейтрофилов. К хемокинам для нейтрофилов относятся ИЛ-1, ИЛ-8,
ФНО (фактор некроза опухоли) и др. Хемоаттрактантной активностью — способностью обеспечить направленное движение фагоцита к очагу воспаления — обладают также некоторые компоненты системы комплемента; пептиды, секретируемые тучными клетками; гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
(Г-КСФ); эндотоксины бактерий; N-формил-олиго-пептиды
(FMLP), выделяемые из бактерий; содержимое лизосом разруша-
42
Часть 1. Теоретическая гематология
ющихся нейтрофилов; вазоактивные амины (серотонин, гистамин)
и многие другие факторы. Прикреплению нейтрофилов к эндотелию сосудов способствуют молекулы адгезии — интегрины, к которым нейтрофилы экспрессируют рецепторы. После трансмиграции пейтрофилов в ткань и их встречи с антигеном начинается
сложный процесс фагоцитоза — захвата чужеродного объекта нейтрофилом. Нейтрофил может захватывать только опсонизированные частицы. Опсонизация осуществляется специфическими сывороточными факторами, опсонинами, которые обволакивают бактерии или другие антигены, готовя их к фагоцитозу. К опсонинам
относятся некоторые компоненты системы комплемента, иммуноглобулины, фибронектин, липополисахарид-связывающий белок
(LBP) и другие факторы, которые соединяются со специфическими антигенами бактерий и обеспечивают их адсорбцию к нейтрофилу. Далее нейтрофил путем инвагинации мембраны формирует
фагосому, окружающую объект фагоцитоза, и замыкает его в полости фагосомы. Гранулы нейтрофила перемещаются к фагосоме и
проникают в нее. Происходит внутриклеточная дегрануляция.
Внутри образованной фаголизосомы происходит киллинг микроорганизмов протеолитическими ферментами, содержащимися в
гранулах, а также за счет образующихся в результате «респираторного взрыва» перекиси водорода и гидроксильных радикалов при
кислородзависимом механизме киллинга. Последняя стадия фагоцитоза — переваривание. В результате эффективного фагоцитоза
нейтрофил погибает. Секреторная функция нейтрофилов опосредована наличием в их гранулах многих секреторных продуктов,
взаимодействующих как с микроорганизмами, так и с окружающими тканями. Нейтрофилы высвобождают активные вещества путем внутриклеточной (при фагоцитозе) и внеклеточной дегрануляции. При внеклеточной дегрануляции, когда объект слишком
велик и не может быть включен в фагосому, происходит экзоцитоз — выброс содержимого гранул в межклеточное пространство.
Нейтрофил взаимодействует с инфицированной клеткой также
через межклеточные контакты. В месте контакта образуются трансмембранные каналы, через которые проходит секреторное содержимое гранул нейтрофила, и это может привести к дегенерации
клеточных органелл и ядра зараженной клики и ее деструкции.
Факторами лнзосомальных гранул являются протеазы, фосфолипазы, гликозидазы. лизоцим, другие белки и пептиды, лактоферрин и эластаза (Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1983; Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 1999). Первичные и вторичные гранулы нейтрофилов содержат более 20 протеолитических ферментов.
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
43
Эозинофильные гранулоциты
Эозинофильный миелобласт происходит из монопотентной
эозпнофилыюй клетки-предшественника. Существуют доказательства, что эозинофилы имеют также общую с базофилами бипотентную клетку-предшественника (Тотолян А. А., Фрейндлин И. С,
2001). Эозинофильный миелобласт редко встречается в костном
мозге, и распознавание клеток этой линии начинается с зозинофильного промиелоцита. Это крупная клетка с округлым тонкодисперсным ядром и 2-3 нуклеолами. Цвет цитоплазмы плохо различим из-за обилия зернистости. На стадии промиелоцита наблюдаются 2 вида гранул: преобладающие первичные крупные почти
базофильные гранулы и специфические вторичные эозинофильные (окрашиваются кислым эозином). Вторичные гранулы активно формируются в основном на стадии миелоцита. Миелоцит имеет меньший диаметр, более грубое округлое ядро, плохо контурируемые ядрышки. Цитоплазма заполнена обильной специфической
эозшюфи.тьной зернистостью ярко-оранжевого цвета и содержит
очень мелкие третичные гранулы, содержащие кислую фосфатазу
и арилсульфатазу. Входящая в состав вторичных гранул эозинофильная пероксидаза вместе с перекисями и галлоидами обеспечивает киллерный, противопаразитарный эффект эозинофилов.
Миелоцит созревает в метамиелоцит, затем в палочко- и сегментоядерный эозинофил. Диаметр последнего 12-15 мкм. Ядро менее
фрагментировано, чем у зрелого нейтрофила, и обычно состоит
из двух долей. В костном мозге эозинофилы остаются в течение 25 дней, а в кровеносном русле — 6-12 часов, затем мигрируют в
ткани. Тканевые эозинофилы расположены в слизистых тканях
дыхательного, пищеварительного и мочеполового трактов, ближе
к поверхности. Эозинофилы составляют 0,4-5% (в среднем 2,5%)
миелокариоцитов костного мозга.
Функции эозинофилов
Главные функции эозинофилов — клеток иммунной системы —
заключаются в участии в механизмах защиты при гельминтозах,
паразитозах и в. реакциях гиперчувствительности немедленного
типа, связанных с острой аллергией. Эозинофилы предупреждают
генерализацию иммунного ответа. В уничтожении антигенов (паразитов, аллергенов) участвуют различные факторы, включая гистамин базофилов и тучных клеток (Струков А. И., Кауфман О. Я..
1989). Эозинофилы контролируют избыточное выделение гистамина и нейтрализуют его. Они способны ограничить очаг пораже-
44
Часть 1. Теоретическая гематология
ния с помощью местного некроза и фиброзирования вокруг этого
участка (Виноградова Ю. Э., 2002). Эозинофилы способны быстро проникать из сосудистого русла в ткани и концентрироваться
там в больших количествах в очаге поражения. Это приводит сначала к эозинофилопении, так как эозинофилы не формируют пристеночный пул, но ответное усиление продукции эозинофилов в
костном мозге сопровождается нормализацией их уровня в периферической крови и затем эозинофилией (Тотолян А. А., ФрейндлинИ. С, 2001).
Факторами активации эозинофилов служат липиды (лейкотриены), пептиды, белки (иммуноглобулины, в частности IgG),
компоненты комплемента (СЗа, С5а), некоторые цитокины (ИЛ-3,
ИЛ-5-и ГМ-КСФ — колониестимулирующий фактор для грануломоноцитопоэза). Хемотаксическими факторами для эозинофилов,
опосредующими их движение к месту поражения в тканях, являются гистамин, иммунные комплексы, ИЛ-8, воспалительный белок макрофагов (М1Р-1а) и фактор RANTES (регулятор активации, экспрессируемый и секретируемый Т-лимфоцитами) — один
из основных хемоаттрактантов для эозинофилов. RANTES способен быстро и в больших количествах рекрутировать эозинофилы в
очаг поражения.
Эозинофилы обладают цитотоксичностью по отношению к гельминтам. Они способны соединяться с паразитами и вводить содержимое своих гранул в их цитоплазму. Специфические белки цитоплазмы эозинофилов повреждают личинки паразитов. При реализации «респираторного взрыва» эозинофилы образуют активные
метаболиты кислорода — токсичные кислые радикалы. Эозинофилы обладают способностью к фагоцитозу и киллингу чужеродных
клеток. Они способны к фагоцитозу бактерий, грибов и других
частиц, осуществляя сходный с нейтрофилами метаболизм и механизм дегрануляции, но не столь эффективный (Козинец Г. И., Макаров В. А., 1997). Эозинофильные катионные белки принимают
участие в реакциях воспаления и механизме свертывания крови,
повреждая эндотелий сосудов и эндокард при длительных гиперэозинофилиях.
Секреторная функция эозинофилов состоит, в продукции и секреции ИЛ-2, ИЛ-3, ФИО, ИЛ-4, ИЛ-5, ИНФ-у (гамма-интерферон). Цитоплазматические гранулы эозинофилов секретируют
большое количество катионных белков, ферментов, в том числе
эозинофильную миелопероксидазу, арилсульфатазу В, гистаминазу и фосфолипазу D, но не содержат, в отличие от нейтрофилов и
моноцитов, лизоцим.
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
45
Базофильные гранулоциты
Базофилы имеют монопотентную клетку-предшественника базофилов (в культуре клеток — КОЕ-Баз — колониеобразующая
единица базофилов). Есть доказательства того, что базофилы имеют общую с эозинофилами бипотентную клетку-предшественника, дифференцирующуюся из общей гранулоцитарной клетки-предшественника (Тотолян А. А., Фрейдлин И. С, 2001). Базофильный
бласт — очень редкая клетка, которую обычно не удается увидеть в
костном мозге здорового человека. Базофильный промиелоцит и
миелоцит также очень редкие клетки. Миелограмма содержит всего 0,1-0,5% этих клеток. Базофильный промиелоцит и миелоцит
имеют ядра округлой или овальной формы с трудноразличимой
структурой ядерного хроматина, особенно когда гранулы покрывают ядро клетки. Зрелые базофилы в диаметре составляют 810 мкм, их ядра отличаются неопределенной формой, иногда билобулярной, лопастной и окрашены в фиолетово-розовый цвет.
В клетках этой линии определяется специфическая крупная метахроматическая (отличная от цвета красителя) темно-фиолетовая,
не обильная зернистость. По причине ее водорастворимости она
частично теряется при окраске, и на месте гранул остаются пустоты, вакуоли. Базофилы, как и тканевые тучные клетки (мастоциты), являются гистаминсодержащими клетками (Valent P. et al.,1990).
В процессе созревания базофилов и тучных клеток в зоне их пластинчатого комплекса происходит синтез гепарина и содержимое
гранул формируется путем образования комплекса белок-гистамин-гепарин. Базофилы находятся в крови в течение 6 часов, после чего поступают в ткани, где по истечении 1-2 суток, после дегрануляции, выброса гистамина и других веществ погибают (Проценко В. А. и др., 1987).
В росте и созревании базофилов принимают участие ИЛ-3,
ГМ-КСФ, ИЛ-5. В регуляции базофилов особая роль отводится
ИЛ-4, для которого на его клеточной мембране имеется много рецепторов. ИЛ-4 — мультипотентный лимфокин, он играет важную
роль в регуляции иммунного ответа и во взаимодействии различных гемопоэтических клеток. Существуют доказательства, что
ИЛ-4 является важным медиатором роста и активации базофилов
и тучных клеток, регулируя продукцию IgE и В-клеток (Valent P.
et al., 1990).
Количество базофилов возрастает при миелопролиферативных
заболеваниях (хроническом миелолейкозе, истинной полицитемии,
базофильных лейкозах) и уменьшается в начале воспалительного
Часть 1. Теоретическая гематология
процесса и особенно аллергических реакций типа крапивницы,
бронхиальной астмы, характеризующихся гиперчувствительностью немедленного типа, за счет быстрого перехода базофилов в
ткани. Тканевые тучные клетки очень варьируют в размерах (от 5
до 30 мкм). Они имеют неопределенное, скорее округлое ядро и
большое количество довольно крупных красно-фиолетовых гранул. В них выявляют полисахариды, амины, металлы, ферменты,
белки, ферменты триптазу и химазу. Триптаза снижает свертываемость крови и является маркером анафилактической реакции. Мастоциты содержат много органелл — рибосомы, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Рецептор к IgE
является главным рецептором на поверхности тучных клеток, которые, как и базофилы, отвечают секрецией гистамина на опосредованную IgE активацию. Кроме того, они экспрессируют рецепторы к IgG, CD28 и молекулам адгезии. Тучные клетки наряду с
базофилами ведут свое начало от общей клетки-предшественника
гранулоцитопоэза (Чертков И. Л. и соавт., 2002). Доказательства
того, что базофилы и тучные клетки принадлежат к одной и той
же популяции клеток, приводят Т. Nakahata и соавторы (1982).
Клетка-предшественник тканевых базофилов зкспрессирует антиген CD34, маркер ранних миелоидных предшественников (Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 2001). Специфическим маркером мастоцитов является CD 123. В развитии тучных клеток принимают
участие ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИНФ-у (гамма1
интерферон), TGF-p (трансформирующий рост фактор), ГМ-КСФ,
IgE. В слизистых тканях описаны слизистые (атипичные) тучные
клетки, которые называют глобулярными лейкоцитами. Тучная
клетка представлена в тканях ЖКТ, легких, урогенитальном тракте, в соединительных тканях вблизи сосудов, в коже, дыхательных путях.
Функции базофилов и тучных клеток
Базофилы и тканевые мастоциты способны к фагоцитозу, но их
главная функция связана с высоким содержанием в их гранулах
гистамина — главного медиатора реакции, гиперчувствительности
немедленного типа (Струков А. И., Кауфман О. Я., 1989). Гистамин — двуосновной вазоактивный амин, вызывающий сокращение
гладких мышц бронхов, трахеи, кишечника. Он повышает проницаемость СОСУДОВ крови и принимает участие в возникновении кожной
гиперемии, аллергического ринита, астмы, оказывает хемотаксическое действие на нейтрофилы и эозинофилы. Гепарин, продуцируемый тучными клетками и базофилами, является антикоа-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
47
гулянтом. Среди многих его функций нужно отметить участие в
регуляции клеточной пролиферации, подавление действия комплемента, стимуляцию фагоцитоза и пиноцитоза и др. Базофилы и
тучные клетки могут быть источником образования и секреции
ряда хемокинов и цитокинов, включая ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6,
ИЛ-13, ГМ-КСФ, ФНО (тучные клетки), макрофагальный воспалительный протеин — MIP-loc (базофилы), фактор стволовой клетки (ФСК) и др. Секреции мастоцитами ИЛ-4 придают особое значение, так как он является одним из важных регуляторов В-лимфоцитов, базофилов, моноцитов, дендритных клеток и участвует в
аллергических, противоопухолевых и противовоспалительных процессах (Виноградова Ю. Э., 2002). Базофилы секретируют также
простагландины, тромбоксаны, лейкотриены, фактор хемотаксиса
эозинофилов и нейтрофилов серотонин, протеазы, фактор активации тромбоцитов. Доказана способность тканевых базофилов к
фагоцитозу—эндоцитозу.
Моноциты и макрофаги
Моноциты имеют общую с гранулоцитами клетку-предшественника и затем унипотентного предшественника моноцитарной линии (КОЕ-М - в культуре). Все клетки этой линии, особенно зрелые моноциты и макрофаги, относятся к системе мононуклеарных
фагоцитов (СМФ) и занимают особое место в гемоиоэзе. R. Van
Furth и соавторы обосновали выделение моноцитов и тканевых
макрофагов, ранее объединяемых в ретикуло-эндотелиальную систему, в систему мононуклеарных фагоцитов — клеток с особыми
функциями, что было официально утверждено в бюллетене ВОЗ в
1972 г. (Van Furth R. et al, 1968, 1972, 1979). Первой распознаваемой клеткой этого ряда является монобласт. Морфологически его
трудно отличить от миелобласта. Это клетка диаметром 15-20 мкм,
имеет овальное или круглое ядро с пежносетчатой структурой, 24 нуклеолы, более широкую, чем у миелобласта, цитоплазму светло-серого или светло-голубого цвета без зернистости или со скудной пылевидной зернистостью. Следующая клетка — промоноцит,
диаметром 11-15 мкм, характеризуется более грубым волокнистым хроматином ядра, имеющего овальную или бобовидную форму и слабоконтурируемые ядрышки. Цитоплазма промоноцита
серо-голубая, довольно широкая и часто содержит нежную пылевидную азурофильную зернистость. Моноцит — зрелая клетка
данной клеточной линии, диаметром 12-20 мкм, имеет ядро часто неправильной формы (бобовидное, рассеченное, лопастное),
Часть 1. Теоретическая гематология
светлую серо-голубую цитоплазму с пылевидной зернистостью.
В периферической крови моноциты образуют циркулирующий и
пристеночный пулы. В тканях они создают субпопуляции дифференцированных органо- и тканеспецифических макрофагов. Моноциты циркулируют в крови от 12 до 48 часов перед тем, как мигрировать в ткани, где они превращаются в макрофаги (Яворковский Л. И., 1987: Fibbe М. Е., Ploemacher R. Е„ 1999). В крови моноциты составляют 1-5% лейкоцитов, в костном мозге 1-3% миелокариоцитов.
Регуляция роста и дифференцировки моноцитов и макрофагов осуществляется группой ростовых факторов — стимуляторов
(ИЛ-3, ГМ-КСФ, М-КСФ) и ингибиторов (интерферон-а и -р,
простагландин, ИЛ-10). Часть моноцитов остается в костном мозге, где превращается в резидентные или оседлые макрофаги (Van
Furth R. et al., 1979).
Функции моноцитов и макрофагов
Одной из основных функций мононуклеарных фагоцитов является неспецифическая антибактериальная защита организма, которая обеспечивается способностью к фагоцитозу и секрецией цитокинов про- и противовоспалительного действия. Эти цитокины
активируют и мобилизуют как моноциты и макрофаги, так и другие
клетки иммунной системы — лимфоциты, NK-клетки, гранулоциты.
Миграция моноцитов в ткани опосредована действием молекул
адгезии — интегринов — и активаторов моноцитов (хемоаттрактантов) — ИЛ-8, компонента комплемента С5а, тромбоцитактивирующего фактора (PAF), воспалительного макрофагального
протеина (М1Р-1(3), макрофагального хемоаттрактантного протеина (МСР-1), фактора, ингибирующего миграцию (MIF) и др.
(Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 1999). Следующей после адгезии
фазой является трансмиграция моноцита через эндотелий сосуда и
движение к очагу воспаления под влиянием хемотаксических факторов, которыми могут быть эндотоксины бактерий, продукты деструкции ткани и др. Киллинг и переваривание микроорганизмов
происходит при участии протеолитических ферментов, включая
лизоцим и другие факторы. Характерным для моноцитарных макрофагов является метаболический, или респираторный, «взрыв» в
процессе фагоцитоза, который проявляется повышенным потреблением кислорода и продукцией микробицидных кислородных
радикалов, перекиси водорода и супероксиданиона, обладающих
мощными цитотоксическими и бактерицидными свойствами (Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1983). В тканях, где моноциты/макро-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
49
фаги выполняют свои функции, они специализируются в иммунокомпетентные клетки 2 классов:
1-й — антигенперерабатывающие макрофаги;
2-й — антигенпредставляющие макрофаги.
Относящиеся к первому классу антигенперерабатывающие, или
резидентные макрофаги называют также профессиональными фагоцитами. И. И. Мечников, открывший явление фагоцитоза как
защитной функции организма против микробов, называл их «клетками-мусорщиками». Открытие И. И. Мечниковым фагоцитоза и
его работы по иммунитету были удостоены Нобелевской премии.
Резидентные макрофаги — это большое сообщество клеток, которое включает фиксированные макрофаги печени, плевральные и
перитонеальные макрофаги, альвеолярные макрофаги легких, макрофаги соединительной ткани, клетки микроглин, астроциты, макрофаги селезеночных синусов, костномозговые макрофаги, макрофаги лимфоузлов; в почках — интрагломерулярные и мезангиальные макрофаги, гигантские клетки очагов воспаления и другие.
Эти клетки имеют различные морфологические характеристики и
функциональные особенности, но их принадлежность к единой
клеточной линии, моноцитарное происхождение подтверждается
наличием ряда общих свойств — они содержат большое количество фермента лизоцима (мурамидазы), неспецифическую моноцитарную эстеразу, кислую фосфатазу и сходный иммунофенотип,
в частности они экспрессируют моноцитарный антиген CD 14. Данные клетки характеризуются также очень развитым лизосомальным аппаратом (Лукина Е. А., 2002). Это оседлые макрофаги, не
способные к рециркуляции. Продолжительность их жизни исчисляется месяцами и годами. Диаметр тканевых макрофагов колеблется от 18 до 80 мкм (Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Они
имеют рыхлое, относительно небольшое ядро без четких ядрышек,
широкую, слабо очерченную голубую или светло-серую цитоплазму, содержащую гранулы и вакуоли. В световом микроскопе можно видеть клетки с пенистой цитоплазмой, фагировавшие липиды, — липофаги или пигментофаги, фагировавшие гемоглобин. При
некоторых заболеваниях (гистиоцитозах, лейкозах) можно видеть
макрофаги, фагировавшие другие клетки, например эритрофаги.
Пул макрофагов пополняется за счет моноцитов периферической
крови, так как их способность к делению очень ограничена. Их
основной функцией является фагоцитоз микроорганизмов, фрагментов клеток, циркулирующих иммунных комплексов и других
частиц. Они осуществляют также пиноцитоз — поглощение растворимого антигена. В процессе фагоцитоза макрофаги включают
50
Часть 1. Теоретическая гематология
в свою цитоплазму объект фагоцитоза и формируют фагосому, в
которой под влиянием лизоцима и других ферментов происходит
киллинг и переваривание фагоцитированного материала.
Второй класс — антигенпредставляющие (антигенпрезентируюгдие) макрофаги (Van Furth R. et al, 1979; Knight S., Stagg A.,
1993). К ним в настоящее время относят в основном дендритные
клетки (ДК). Морфология большинства дендритных клеток имеет
звездчатую форму со множеством тонких отростков — дендритов.
Эта форма и их подвижность позволяют Д К задерживать антигены
и фиксировать их, а также взаимодействовать с Т-лимфоцитами.
В тканях они часто находятся в незрелом состоянии. Активацию
ДК инициирует встреча с антигеном — микробами или продуктами воспаления. Активаторами ДК являются ИЛ-1, ГМ-КСФ,
ФНОос, бактерии, липополисахариды микробов. ИЛ-10 блокирует
процесс активации ДК. В процессе созревания ДК их способность
активировать лимфоциты увеличивается (Птушкин В. В., 2001).
Дендритные клетки продуцируют ИЛ-8, ИЛ-12, MIP-а и р\ Этапы
презентации антигена включают захват антигена и его ферментативную обработку, транспортировку пептидных фрагментов антигена — эпитопов — в соединении с главным комплексом гистосовместимости I и II на поверхность дендритной клетки для презентации и распознавания Т-лимфоцитами. Активированные дендритными клетками Т-лимфоциты осуществляют запуск иммунных
реакций, стимулируя В-лимфоциты к продукции антител. Таким
образом, клетки СМФ обеспечивают специфический иммунный
ответ организма.
Антигенпредставляющие ДК — иммунные акцессоры, включают
клетки Лангерганса (эпидермоциты), интердигитачьные Д К и дендритные ретикулярные ДК (интерстициальные ДК) (Птушкин В. В.,
2001). Клетки Лангерганса (КЛ) расположены в эпидермисе, их диаметр 14-20 мкм, они имеют широкую светлую цитоплазму, бобовидное или округлое ядро. В КЛ ультраструктурным методом выявляют гранулы Бирбека (их маркеры). Эти клетки экспрессируют
антиген С D 1а и S-100 протеин и содержат аденозинтрифосфатазу
(Chu Т., Jaffe R., 1994). После связывания антигена КЛ поступают
в региональные лимфоузлы, где дифференцируются в интердигитальные ДК, способные представлять антиген Т-лимфоцитам
(Strunk D. et al.. 1997). Клетки Лангерганса не экспрессируют моноцитарный антиген CD 14, обладают слабой фагоцитарной активностью, не содержат лизоцим и не могут превращаться в макрофаги.
В настоящее время предполагают 3 пути развития ДК: из моноцитов крови, лимфоцитов и клеток-предшественников гемопоэза.
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
51
Интерстициальные ДК, как считают, имеют миелоидное (моноцитарное) происхождение и, в отличие от КЛ, стимулируют В-лимфоциты к продукции антител (Птушкин В. В., 2001; Peters J. Н.
et al., 1991). Они могут превращаться в макрофаги под влиянием
М-КСФ или ГМ-КСФ и экспрессируют CD14. В то же время установлен другой путь развития ДК — из лимфоцитов. Дендритные
клетки могут принимать участие в индукции иммунной толерантности. Они способны подавлять незрелые Т-лимфоциты тимуса
или зрелые Т-лимфоциты лимфоузлов, направленные против собственных антигенов. Установлено, что ДК толерантности происходят из общего с Т-лимфоцитами предшественника. Аргументы в
пользу лимфоидного происхождения некоторых ДК у человека
привели V. Soumelis с соавторами (1997), показавшие противоположный эффект ИЛ-4 на ДК миелоидного и лимфопдного происхождения. По их данным, лимфоидные ДК имеют морфологию
плазматических клеток, низкую экспрессию миелондных маркеров CD13 и CD33, позитивный эффект на их клеточный рост от
ИЛ-3 и отсутствие эффекта от миелоидного ГМ-КСФ.
ДК используют в терапии злокачественных заболеваний в качестве фактора, стимулирующего противоопухолевый иммунитет и
инициирующего иммунный ответ на антиген.
Таким образом, клетки СМФ обеспечивают специфический
иммунный ответ, а также участвуют в процессах репарации и заживления ран и очистке кровяного русла в основном за счет макрофагов печени и селезенки (Маянский Д. Н., 1981). Они участвуют в обмене железа, углеводов и липидов, регуляции гемостаза
и гемопоэза, продуцируя как стимуляторы гемопоэза (М-КСФ,
ГМ-КСФ, ИЛ-1), так и ингибиторы (TNF-a, TGF-a). Как секреторные клетки они продуцируют медиаторы воспаления, протеазы, интерлейкины, факторы роста, адгезивные молекулы (Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Клетки макрофагалыгой системы
обладают цитотоксической активностью против опухолевых, инфицированных и других измененных клеток.
Эритроидные клетки
Первой морфологически распознаваемой клеткой эритроидного
ряда является эритробласт, который происходит из унипотентной
эритроидиой клетки-предшественника. Последняя проходит несколько этапов дифференциации, постепенно ограничивающих ее
пролиферативный потенциал. Это происходит в результате осуществления эритроидной программы генной экспрессии (Romeo P.-H.,
52
Часть 1: Теоретическая гематология
1999). Большую роль в регуляции экспрессии эритроидно-специфических генов, таких как гены глобина, порфобилиногена, гликофорина А и В, гена эритропоэтина играют ядерные белки семейства GATA. Поздние этапы эритропоэза полностью зависят от
присутствия эритропоэтина (ЭРП), для которого эритроидные
клетки-предшественники экспрессируют рецептор (ЭРГТ-R). Эритропоэтин необходим для эритроидной дифференцировки вплоть
до позднего базофильного (раннего полихроматофильного) нормоцита, после чего эритроидная клетка больше не нуждается в
ЭРП для своего созревания (Долгов В. В. и др., 2001; Romeo P.-H.,
1999).
Эритробласт — крупная клетка диаметром 15-25 мкм. Круглое
ядро с мелкозернистой структурой ядерного хроматина содержит
2-3 крупные нуклеолы. Умеренная цитоплазма резко базофильна,
часто содержит 1-2 выступа в виде «ушек». Вокруг ядра находится
перинуклеарная зона просветления. Синтез гемоглобина (Hb)
начинается на стадии эритробласта. После митоза количество гемоглобина сокращается наполовину и в течение интерфазы полностью восстанавливается. Клетка совершает от 3 до 7 делений, и один
эритробласт продуцирует в среднем 32 эритроцита. Эритробласты
составляют 0,2—1,0% миелокариоцитов. По мере созревания эритробласт превращается в пронормоцит и затем в нормоцит, который
в процессе развития уменьшается в размере, ядерный хроматин
становится все более грубым, приобретая колесовидную структуру. Количество гемоглобина в нормоцитах прогрессивно нарастает,
в результате чего цитоплазма утрачивает базофилию, и в зависимости от ее гемоглобинизации различают 3 вида нормоцитов —
базофильные, полихроматофильные и оксифильные. Последней
клеткой, способной к пролиферации, является полихроматофильный нормоцит. После деления раннего полихроматофильного нормоцита концентрация гемоглобина в дочерних клетках достигает
критической величины — 13,5 пг (пикограммов), синтез ДНК в
ней прекращается и она выводится из митотического цикла. Оксифильный нормоцит — клетка, которая не делится и не синтезирует
НЬ. Часть эритрокариоцитов уже на стадии базофильного нормоцита достигает критической массы НЬ и выключается из митотического цикла. Эти незрелые клетки гибнут в костном мозге, подчиняясь законам апоптоза и демонстрируя таким образом неэффективный эритропоэз. Последний является одним из факторов
регуляции эритрона, поддержания необходимого уровня эритроцитов в крови. Ядро оксифильного нормоцита конденсировано,
пикнотично («вишневая косточка»). Клетка лишается его в период
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
53
нахождения в костном мозге. Цитоплазма оксифильного нормоцита розовая, насыщенная гемоглобином. Стадия созревания после
энуклеации оксифильного нормоцита перед зрелым, полностью
гемоглобинизированным эритроцитом называется ретикулоцитом.
Ретикулоцит характеризуется активным метаболизмом. Время его
пребывания в костном мозге 1-2 дня, после чего он покидает его и
еще от 1 до 3 дней дозревает в периферической крови, лишаясь
остатков сетчатой ретикулофиламентозной субстанции, представляющей собою фрагменты рибосом, митохондрий и других органелл. Зрелый эритроцит (клетка, основным содержимым которой
является гемоглобин) — это двояковогнутый диск диаметром 7,5—
8 мкм. Его эластичность и деформируемость при сохранении структуры клетки обусловлены особенностями цитоскелета и позволяют ему проходить даже через стенки синусов селезенки. В костном
мозге содержание клеток эритроидного ряда колеблется от 14 до
26%, в среднем около 20%. Длительность жизни эритроцита — 100—
120 дней.
Функции эритроцитов
Основная функция эритроцитов заключается в снабжении тканей кислородом и транспорте углекислоты. Она осуществляется за
счет присутствия в клетке гемоглобина. Гемоглобин — дыхательный пигмент, хромопротеид. У взрослого человека гемоглобин представлен двумя типами: НЬА — взрослым гемоглобином (98%) и
HbF — фетальным гемоглобином (2%). Его небелковая часть, включающая железо, называется гемом, белковый компонент — глобином. Гемоглобин переносит кислород от легочных альвеол к тканям, транспортирует углекислый газ от тканей к легким и участвует в поддержании буферного кислотно-основного равновесия крови.
В самих эритроцитах совершается много ферментативных реакций. Они участвуют в иммунных процессах, взаимодействуя с циркулирующими иммунными комплексами, так как на мембране эритроцитов имеется Fc-рецептор к иммуноглобулинам. На своей мембране они адсорбируют аминокислоты, липиды, токсины. Среди
них выделяют эритроциты-супрессоры, участвующие в подавлении иммунного ответа (Козинец Г. И., Макаров В. А., 1997).
Мегакариоциты. Тромбоциты
Мегакариобласт является первой морфологически распознаваемой клеткой этого ряда в костном мозге. Предшественником мегакариобласта является унипотентная клетка-предшественник
54
Часть 1. Теоретическая гематология
мегакариоцитов. Тромбоциты, или кровяные пластинки, самые маленькие клетки крови, происходят из мегакариоцитов — самых
крупных, гигантских клеток костного мозга. Мегакариобласт, по
данным ряда авторов (Paulus J.-H., Aster R. H., 1983) и нашим
наблюдениям, — крупная клетка, имеющая большое округлое или
складчатое ядро и слабо различимые нуклеолы. Структура хроматина сетчатая, узкая базофильная цитоплазма иногда имеет выросты. В результате процессов эндомитоза (многократного удвоения
числа хромосом без разрушения ядерной оболочки и без деления
клетки) и по.пшлоидизации (возникновения более чем диплоидного набора ДНК) ядро мегакариобласта увеличивается, оставаясь
в пределах той же цитоплазмы, и возникает мегакариоцит. Большой размер этих клеток обусловлен очень высоким содержанием
в них ДНК. Среди мегакариоцитов различают более молодые 6азофильные и более зрелые гранулярные формы. Среди гранулярных выделяют полихроматофильные и оксифильные мегакариоциты. Мегакариоциты достигают в диаметре 120 мкм и более
(в среднем — 40-50 мкм). Ядро базофильного мегакариоцита нелобулярное, ядрышки плохо различимы. Неширокая темно-голубая или базофильная цитоплазма не содержит зернистости и в
норме не отделяет пластинки.
Диаметр полихроматофильного мегакариоцита (клетка окрашивается основными и кислыми красителями) колеблется от 40 до
120 мкм. Ядро грубое, без нуклеол, форма ядра вариабельная, причудливая, может быть сегментированной; в цитоплазме содержится азурофильная зернистость. Клетка является главным продуцентом пластинок, в ее цитоплазме видны тромбоциты и можно
наблюдать процесс их отделения. В процессе эндомитоза клетка
становится полиплоидной (4N, 8N, 16N, 32N, 64N).
Оксифильный мегакариоцит характеризуется очень слабой функциональной активностью и, как правило, не отделяет пластинки.
Это крупная клетка с грубым полиморфным ядром, широкой розовой цитоплазмой с остатками скудной зернистости. Различают также инволютивные формы — старые, разрушающиеся клетки и свободные ядра мегакариоцитов. Жизненный цикл мегакариоцита —
10 суток. Стимулятором его роста и дифференцировки является
тромбопоэтин (ТП). В развитии и дифференцировке мегакариоцитов принимают участие многие другие факторы, среди которых:
ИЛ-1, ИЛ-3. ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, НЛ-11, ЭРП, лейкозингибирующий фактор (ЛИФ), колониестимулирующие факторы ГМ-КСФ,
М-КСФ и многие другие (Chatelain С, 1999). Регулятором мегакариопоэза является также количество тромбоцитов, избыток кото-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
55
рых тормозит тромбоцитопоэз, и наоборот. В цитоплазме зрелых
мегакариоцитов находятся гранулы, содержащие большое количество белков, среди которых фактор Виллебранда, тромбоспондин,
тромбоцитарный фактор 4, фибронектин, фибриноген, тромбоцитарный ростовой фактор, IV7 и V факторы свертывания крови и др.
Ультраструктурным маркером мегакариоцитов является выявляемая при электронной микроскопии тромбоцитарная пероксидаза.
Мегакариоциты составляют 0,2-0,6% миелокариоцитов.
Функции тромбоцитов
Эффекторными клетками мегакариоцитоноэза, участвующими
в процессах свертывания крови, являются тромбоциты — производные мегакариоцитов. Это сферические образования диаметром
1-4 мкм, их количество составляет в среднем 250 тыс. в 1 мкл.
В кровяном русле тромбоциты находятся в активированном (40%)
и неактивированном состоянии. Они имеют периферическую зону,
условно называемую цитоплазмой, или гиаломером, и зону-гель, а
также мембраны и органеллы (Иванов Е. П., 1991). Зона-гель содержит гранулы, включающие множество факторов, обеспечивающих функции тромбоцитов. Главные функции тромбоцитов — ангиотрофическая и адгезивно-агрегационная. Известно 11 пластинчатых факторов свертывания, которые содержатся в тромбоцитах.
Среди них тромбоцитарный тромбопластин, акцелератор тромбина, активатор фибринолиза, фибринстабилизирующий фактор, ссротонин, антигепаригговый фактор, фибриноген тромбоцитов и др.
(Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Тромбоциты обеспечивают
тромбоцитарное звено гемостаза. Повреждение сосуда немедленно
влечет за собою его спазм и прилипание (адгезию) тромбоцитов к
коллагеновым волокнам и другим адгезивным белкам субэндотелия. Пластинки агрегируют в месте повреждения под влиянием
многих факторов, в частности тромбина, и в результате фазы обратимой или первичной агрегации образуется тромбоцптарная пробка. Дальнейшая агрегация и уплотнение пробки обеспечивают необратимую, вторичную агрегацию — первичный гемостаз (Петрищев Н. Н., Папаяп Л. П., 1999). На основе первичного тромба
образуется фибриновый сгусток и формируется тромбоцитарнофибриновая пробка, обеспечивающая окончательный, или вторичный гемостаз. Плазменно-коагуляционный механизм гемостаза также происходит при непосредственном участии тромбоцитов, которые секретируют многие факторы, активирующие плазменный
гемостаз.
56
Часть 1. Теоретическая гематология
Лимфоциты
Лимфопиты имеют общую с миелоидными элементами клеткупредшественника на уровне СКК, но затем они приобретают независимую линию дифференцировки (Morrison S.J.etal., 1997). Лимфоциты представлены в основном тремя клеточными линиями —
В-, Т- и NK-клетками, — и имеют общую для них клетку-предшественника, коммитированную в направлении лимфопоэза. В костном мозге В- и Т-лимфобласты присутствуют в очень небольшом
количестве (-0,5%). Лимфобласт характеризуется более мелкими
размерами, чем миелобласт, круглым ядром с 1-2 нуклеолами и
нежнозернистой структурой хроматина. Его неширокая голубая
цитоплазма в норме лишена зернистости.
Следующие клетки — пролимфоцит и лимфоцит. Пролимфоцит характеризуется более грубым ядерным хроматином и реже
выявляемыми нуклеолами. Лимфоциты даже морфологически
очень гетерогенная группа, которая объединяет многие типы этих
иммунокомпетентных клеток. Давая морфологическую характеристику лимфоцитам, учитывают их форму и размеры, структуру
хроматина, особенности цитоплазмы, наличие или отсутствие в
ней включений и другие признаки. Обычный лимфоцит крови имеет размер 7-12 мкм. Он имеет овальное или круглое ядро, глыбчатую структуру ядерного хроматина, отличается отсутствием нуклеол. Клетка чаще не содержит зернистости, но есть категории
гранулированных лимфоцитов, например большие гранулированные лимфоциты размером 9-15 мкм. По ширине цитоплазмы их
делят на узко-, средне- и широкоцитоплазменные. Первые из них —
это малые лимфоциты диаметром 6-7 мкм с плотным ядром. Деление лимфоцитов на В- и Т-типы обусловлено их специализацией
и функциями. В костном мозге В-лимфоциты при участии цито*
кинов проходят антигеннезависимую стадию созревания и дифференцировку от про-В-типа, через пре-пре-В-тип, пре-В тип до
В-типа — зрелого лимфоцита. В костном мозге формируется антигенраспознающий иммуноглобулиновый рецептор В-лимфоцитов — BCR. Из костного мозга В-лимфоциты, зкепрессирующие
IgM и IgD, поступают в периферическую кровь и заселяют В-зависимые зоны лимфоидных органов — фолликулы, в зародышевых
центрах которых они проходят антигензависимую пролиферацию
и дифференцировку в плазматические клетки, продуценты антител, или В-клетки памяти (Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 2001;
Тупицын Н. Н., 2002). Активированный антигеном В-лимфоцит
превращается в В-иммунобласт, затем плазмобласт. Это крупная
клетка диаметром 15-22 мкм. Она имеет округлое ядро, располо-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
57
женное эксцентрично, 2-4 нуклеолы, резкобазофильную ••цитоплазму без включений. Иногда наблюдается зона просветления вокруг ядра. Проплазмоцит характеризуется эксцентрично расположенным ядром, боле плотной структурой ядерного хроматина,
менее отчетливыми нуклеолами и базофильной цитоплазмой.
Плазмоциты очень различаются по размеру. Они имеют округлое,
эксцентрически расположенное ядро с грубым хроматином. Ядрышки отсутствуют; цитоплазма базофильна, часто вакуолизирована.
Плазматические клетки продуцируют антитела, одной специфичности и одного класса иммуноглобулинов. Предшественники Т-лимфоцитов — протимоциты — из костного мозга мигрируют в корковый слой тимуса — центральный орган Т-лимфопоэза. Здесь они
подвергаются антигеннезависимой дифференцировке и проходят
стадии про-Т-клетки, пре-Т-клетки и Т-клетки. На стадии про-Тлимфоцита начинает формироваться антигенраспознающий Т-клеточный рецептор — TCR. При переходе из коркового слоя в мозговой Т-лимфоциты превращаются в СО4+Т-хелперы (Th) и C D 8 предшественники цитотоксических лимфоцитов (киллеров).
«Наивные» СО4*Т-лимфоциты после встречи с антигеном и активации представляют собою ThO, секретирующие ИЛ-2, ИЛ-4,
ИНФ-у, и могут дифференцироваться в ТЫ и Th2. Thl способны
активировать макрофаги, участвовать в клеточном иммунном ответе. Th2 активируют В-лимфоциты к продукции антител, т. е.
участвуют в гуморальном ответе. Эти две популяции продуцируют цитокины, которые способны противодействовать дифференцировке и активации противоположной субпопуляции (Фрейндлин И. С, 2000). Морфологически различить Т- и В-лимфоциты
практически невозможно. Единственно надежным способом их
идентификации является иммунофенотипирование с использованием моноклональных антител.
Классические NK-клетки (natural killer — естественные киллеры) — 3-я очень небольшая популяция лимфоцитов — не несет на
своей поверхности маркеров В- или Т-клеток. Они составляют около 5% от числа лимфоцитов периферической крови. Морфологически это большие гранулированные лимфоциты, способные непосредственно, без помощи антител убивать клетки-мишени — опухолевые или инфицированные вирусом — или микроорганизмы,
т. е. они обладают клеточной цитотоксичностью. Специфический
белок NK-клетоК — перфорин способен разрушать мембрану клетки-мишени. Полагают, что NK-клетки, возможно, включают в себя
+
супрессорные цитотоксические СО38 Т-клетки. Вся популяция
лимфоцитов в костном мозге составляет 8-9% миелокариоцитов.
58
Часть 1. Теоретическая гематология
Функции лимфоцитов
Основной функцией лимфоцитов является распознавание собственных и чужеродных антигенов и обеспечение гуморального и
клеточного иммунитета. В-лимфоциты получили свое название от
слова «bursa» — сумка, так как впервые были обнаружены у птиц в
органе, называемом «бурса Фабрициуса». Они ответственны за
гуморальный иммунитет и способны распознавать антигены с помощью экспрессируемых ими на мембране специфических рецепторов. В-лимфоциты способны самостоятельно распознавать антигены и отвечать продукцией соответствующих антител, но в основном для реализации иммунного ответа они нуждаются в
кооперации с Т-лимфоцитами, которые представляют им антиген
и стимулируют к дифференцировке в плазматические клетки и
выработке антител. Т-лнмфоциты обеспечивают клеточный иммунитет и распознают антигены с помощью антигенпрезентирующих
клеток, к которым относятся макрофаги и главным образом дендритные клетки. В результате этих контактов происходит активация Т-лимфоцитов хелперов и секреция ими цитокинов, стимулирующих к пролиферации и дифференциации макрофаги, В-лимфоциты и сами Т-клетки.
Цитокины, секретируемые Т-лимфоцитами, инициируют выход нейтрофилов из крови в ткани к очагам воспаления, и сами
активированные Т-лимфоциты — Т-цитотоксические лимфоциты — способны лизировать клетки, несущие чужеродные антигены
и внутриклеточные паразиты: грибы, микобактерии туберкулеза,
вирусы и простейшие. Цитотоксические Т-лимфоциты принимают прямое участие в реакции отторжения трансплантата.
Лимфоциты находятся в состоянии постоянной циркуляции
между кровью, лимфой и лимфоидными органами, и это делает
возможной встречу каждого антигена с соответствующей очень
немногочисленной популяцией лимфоцитов, несущих специфические маркеры для распознавания именно данного антигена. Одной
из форм иммунного ответа является иммунологическая память,
которая формируется при контакте лимфоцита с чужеродным антигеном и способствует быстрой выработке соответствующих антител при повторном контакте с тем же антигеном. Это вторичный
иммунный ответ, который обеспечивается клоном долгожнвущих
клеток памяти - соответствующих Т- и В-лимфоцитов.
Т-лимфоциты являются секреторными клетками, и их цитокины играют большую роль в регуляции гемопоэза. иммунного ответа, процессов воспаления и др. Они секретируют:
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
59
1) гемопоэтины ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10,
ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17,ТМ-КСФ;
2) интерфероны, в том числе ИНФ-у;
3) факторы некроза опухоли — ФНОа, ФНОр и др.;
4) хемокины — цитокины, обладающие активностью хемоаттрактантов, в частности М1Р-1а и -1(3 и RANTES — хемоаттрактант для эозинофилов и базофилов, принимающий участие в аллергических реакциях;
5) TGF-J3 н фактор, ингибирующий миграцию, — MIF и др.
Синтез и секреция иммуноглобулинов В-лимфоцитами - завершающая стадия специфического гуморального иммунного ответа.
Продукты иммунного ответа — иммуноглобулины — относятся к
фракции гамма-глобулинов. Активированные В-лимфоциты также
способны секретировать некоторые цнтокины, например ИНФ-а,
IUI-12,TGF-p.
Таким образом, координированное взаимодействие клеток крови, опосредованное влиянием регуляторов пролиферации и дифференциации — цитокинов, обеспечивает постоянство клеточного
состава крови и равновесие внутренней среды организма.
Литература
ВиноградоваJO. Э. Строение и функции лейкоцитов. Гранулоциты // Руководство по гематологии / Под рел. А. И. Воробьева. М., 2002. С. 88-106.
Воробьев А. И. Клетка// Руководство по гематологии / Пол ред. А. И. Воробьева. М., 2002. Т. 1.С. 13-28."
Долгов В. В., Луговская С. А., Морозова В. Т. и др. Лабораторная диагностика
анемий: Пособие для врачей. Тверь, 2001. 88 с.
Иванов Е. П. Руководство по гемостазиологии. Минск, 1991.
Козинец Г. И., Макаров В. А. Исследование системы крови в клинической практике. М., 1997. 480 с.
Лукина Е. А. Моноциты и макрофаги // Руководство по гематологии / Под ред.
А. И. Воробьева. М„ 2002. Т. 1. С. 100 - 106.
Маянскип Д. Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. Новосибирск: Наука, 1981. 168 с.
Мая некий А. Н., Маянскип Д. II. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1983. 256 с.
Петрищев А. Л., Напаян Л. П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. СПб., 1999.
117с.
Проценко В. А., Шпак С. И., Доценко С. М. Тканевые базофилы и базофильные
гранулоциты крови. М., 1987. 128 с.
Птушкин В. В. Дендритические клетки и роль цитокинов is их дифференцировке и функционировании /'/' Клиническая онкогематология / Под ред. М. А. Волковой. М.: Медицина, 2001. С. 72-76.
Глава 4
ТРЕПАНОБИОПСИЯ КОСТНОГО МОЗГА.
СТРОМАЛЬНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ:
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И УЧАСТИЕ В ГЕМОПОЭЗЕ
Главным кроветворным органом человека является деятельный
костный мозг губчатого вещества костной ткани. Являясь сложнорегулируемой иерархической системой, гемопоэз возможен только
при обязательном условии взаимодействия со стромой костного
мозга. Как известно, в основе интенсивного обновления различных клеточных форм гемолимфопоэза .[ежит единая клеточная
линия. Мультипотентная стволовая кроветворная клетка является
общим предшественником всех известных линий гемопоэтическоп
дифференцировки и всей мозаики лимфоидных элементов. Процессы, лежащие в основе самоподдержания, коммитирования, пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, определяются
регуляторными механизмами на уровне генома и эпигеномными
факторами.
Ведущими среди эпигеномных факторов, играющих ключевую
роль в жизнедеятельности стволовых клеток, являются межклеточные взаимодействия гемопоэтических предшественников с элементами стромального микроокруженйя, которые представлены в
костном мозге синусоидальными сосудами, ретикулярными,
жировыми и эндостальными клетками (Ругаль В. И. и др., 1991;
Mayany H. et al., 1992; Van Damme A. et al, 2002). Регуляторный
потенциал указанных элементов реализуется путем их непосредственных контактов с кроветворными предшественниками, а также благодаря широкому спектру стимуляторов и ингибиторов гемолимфопоэза, продуцируемых стромой костного мозга — цитокинов, рестриктинов, циклинов, адгезшюв и других, локальный
эффект которых обеспечивается как их продукцией in situ, так и
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
63
иммобилизацией на компонентах внеклеточного матрикса. Строма костного мозга является источником сигналов, которые воспринимаются рецепторами плазматических мембран гемопоэтических клеток, преобразуются при участии сложных взаимодействий клеточных органоидов и поступают в ядро, где происходит
запуск экспрессии генов, необходимых для клеточной пролиферации и дифференцировки. В результате этого начинают реализовываться генетические программы, ответственные за формирование
тканеспецифических и стадиеспецифических клеточных фенотипов с соответствующими морфофункциональными особенностями клеток гемолимфопоэза.
Одним из доступных и информативных методов изучения костного мозга в целом и стромы костного мозга в частности является
трепанобиопсия (Теодорович В. П., Абдулкадыров К. М., 1977).
Признавая неоценимое диагностическое значение при заболеваниях системы крови стернальной пункции, необходимо подчеркнуть,
что метод трепанобиопсии костного мозга позволяет получить более полную информацию о состоянии костномозгового кроветворения. Так, с помощью трепанобиопсии возможно изучить истинное соотношение кроветворной ткани и жировой субстанции. При
трепанобиопсии также легко выявляются и изменения со стороны
костной ткани, стромы костного мозга и гемопоэтического микроокружения. Однако данный метод не может заменить, тем более
вытеснить стернальную пункцию. Он является весьма информативным, объективным и обязательным при диагностике заболеваний системы крови.
Методика исследования
При трепанобиопсии забор губчатого вещества костной ткани
осуществляют иглой Jamshidi или Islam из задней ости подвздошной кости. Для исследования необходим столбик костной ткани не
менее 2 см длиной, поскольку субкортикальные лакуны не отражают состояние кроветворения. Материал фиксируется в 10% водном растворе формальдегида или жидкости Карнуа. Объем фиксирующих сред должен превышать объем трепаната не менее чем в
10 раз. Кусочек ткани после фиксации декальцинируется и проводится через ряд спиртов восходящей концентрации, хлороформ и
жидкий парафин. Обезвоженный материал, пропитанный парафином, погружают в специальные кассеты с жидким парафином. Полученные после охлаждения блоки закрепляют в микротоме и приготовляют гистологические препараты толщиной около 5 мкм. Срезы прикрепляют к предметным стеклам, депарафинируют и
64
Часть 1. Теоретическая гематология
окрашивают Азур-2-эозином или гематоксилин-эозином, заключают в оптически прозрачную среду и покрывают покровным стеклом. При необходимости производится окраска азотнокислым серебром по Гомори или пикрофуксином по Ван-Гизону.
При ря/[е патологических состояний бывает трудно, даже невозможно с помощью указанных методов окраски определить тип
клеток и их происхождение (гистогенез). В связи с этим, наряду с
гистологическим методом, используют дополнительно иммуногистохимические исследования трепанобиопсий подвздошной кости. При использовании этого метода на гистологические препараты наносят раствор с антителами к определенным антигенам. Антитела иснользуемых сывороток имеют на себе метку флюорохром
либо красящий фермент. Более распространен иммунопероксидазный метод, при котором антитела красящей сыворотки несут фермент — пероксидазу хрена. Для иммуногистологических реакций
используют два типа антител: поли- и моноклональные. Имеется
большое количество коммерческих наборов (kits) сывороток к различным антигенам. Использование маркеров позволяет дагь иммунофенотипическую характеристику кроветворных и лимфоидных клеток костного мозга для диагностики заболеваний, назначения и оценки лечения. Ниже представлены результаты исследований структурной организации стромы костного мозга на основании
изучения трепанобиоптатов подвздошной кости здоровых лиц с
использованием стандартных методов гистологических, морфометрических и ультрамикроскопических исследований.
Стромалыюе микроокружение:
структурная организация и участие в гемопоэзе
Синусоидальные сосуды
Клетки крови человека формируются в экстравазальных секторах костного мозга и в сосудистое русло проникают через васкулярную стенку. Ежесуточно у взрослого человека образуется около
1/3 триллиона клеток. Их миграция в кровоток обеспечивается
особенной структурной организацией сосудистого русла костного
мозга. Как известно, активный гемопоэз происходит в тех участках
костной ткани, которая имеет губчатую структуру и, в отличие от
компактной, не обладает системой гаверсовых каналов, обеспечивающих кровоток. В губчатой кости снабжение кровью костных
балок и интрамедуллярной кроветворной паренхимы осуществляется за счет периостальных артерий, которые в виде a. perforans
входят внутрь костного мозга через плотную кортикальную плас-
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
65
тинку. Указанные сосуды в лакунах губчатого вещества разделяются на костномозговые артерии, переходящие в артериальные капилляры. Последние, расширяясь в виде воронки, образуют синусоиды костного мозга. Венозный отток осуществляется посредством балочковых синусов, которые проходят через компактный
слой губчатой кости, вливаясь в периостальные вены. Таким образом, синусы костного мозга — это «чудесная сеть» внутри венозного русла. Именно в этих участках в условиях нормального кроветворения происходит миграция клеток крови в сосудистое русло. .
В гистологических препаратах подвздошной кости здоровых
людей синусы представлены тонкостенными сосудами, которые на
разрезе имеют вытянутую, овальную или округлую форму. Их вид
зачастую зависит от размеров. Мелкие и средние синусоиды имеют преимущественно удлиненную и вытянутую форму. Для более
редко встречающихся крупных синусоидальных сосудов характерны овальные или округлые очертания. В интрамедуллярных пространствах костного мозга иногда выявляются синусоиды неправильной формы вследствие неравномерного расширения просвета
(грушеобразные, колбовидные и др.).
Представляя собой начальное звено венозного русла, синусоидальные сосуды образуются в результате слияния узких капилляров или ветвления артериол. Венозные сосуды, следующие за
синусами, имеют значительно меньший диаметр. Однако в гистологических препаратах синусоидальные сосуды не всегда представлены с их приносящими и выносящими ветвями. В большинстве
наблюдений морфологический рисунок синусоидального русла
представлен преимущественно только синусоидами. Стенка синусоида состоит из одного слоя эндотелиоцитов, цитоплазма которых имеет вид истонченного тяжа, ограничивающего просвет.
Встречаются клетки как с увеличенными просветленными, так и
пикнотическими ядрами. В просветах сосудов находились эритроциты, небольшое количество гранулоцитов, а в некоторых — незрелые элементы эритроидного ряда. Фагоцитоз эндотелиальным клеткам не свойственен. При морфометрическом исследовании площадь, занимаемая в гистологических препаратах синусоидальными
сосудами, составляет около 5%.
При обзорном просмотре электронно-микроскопических срезов
обнаруживаются синусоиды двух видов. В одних эндотелиоциты
имеют уплощенную форму с длинными, резко истонченными цитоплазматическими отростками. Ядра в этих клетках плоские, с
грубым, конденсированным по всему сечению хроматином. Ядрышки не выявляются. Как в перикарионе, так и в маргинальных
3 Гематология. Нов. справочник
66
Часть 1. Теоретическая гематология
участках цитоплазмы обнаруживается небольшое количество органоидов: единичные митохондрии с небольшим числом крист и
матриксом умеренной плотности, незначительное количество nvзырьков, гетерогенные по размеру электронноплотные гранулы,
тельца Вейбеля-Палладе. В просвете синусоидов выявляются только зрелые клетки гранулоцитарного ряда, эритроциты и тромбоциты. В состав стенки таких синусов входит тонкая базальная мембрана.
В синусоидах другого типа эндотелиоциты отличаются от описанных выше структурой ядра и содержанием органелл в цитоплазме. Как правило, эти клетки выбухают в просвет синусов и имеют
крупные ядра с у меренной конденсацией хроматина по периферии и
четким преобладанием эурохроматина. Цитоплазма богата органоидами и имеет хорошо выраженные признаки пино- и экзоцитоза.
Базальная мембрана имеет прерывистую структуру. В синусах такого тина наблюдается трансмуральный проход зрелых клеток, а в их
просветах наря!су со зрелыми элементами гемопоэза обнаруживаются эритроидные клетки на стадии эритробластов.
Полученные ультрамикроскопические данные подтверждают
существование в костном мозге человека замкнутой системы кровообращения. Вместе с этим наблюдается отчетливая функциональная мозаичность эндотелия. Трансцеллюлярная миграция клеток крови происходит в местах наличия прерывистой базальной
мембраны и расположения функционально активных, богатых органеллами эндотелиоцитов с признаками пино- и экзоцитоза. Вполне вероятно, что миграция стволовых гемопоэтических клеток также осуществляется в этих зонах.
Учитывая сведения о непосредственном влиянии эндотелиальных клеток на кроветворение, можно предполагать, что богатые
органоидами эндотелиоциты способны не только передавать, но и
секретировать функционально активные вещества, регулирующие
процессы дифференцировки и созревания гемопоэтических предшественников. Резкое увеличение диаметра просвета синусоидальных сосудов приводит к значительному снижению в них скорости
кровотока, поэтому синусы могут выполнять роль своеобразного
отстойника, создавая условия для созревания ядросодержащих гемопоэтических клеток. Это предположение подтверждается обнаружением эритробластов в просветах синусов.
Несомненно, что синусоиды, обеспечивая упорядоченное поступление в кровоток физиологически важных веществ и клеток
крови, создают благоприятные условия для деятельности костного
мозга как кроветворного органа. Их значение не ограничивается
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
67 •
функцией гистогематического барьера. Входящие в их состав эндотелиальные клетки могут играть инструктивную роль в гемопоэзе, а регуляторный эффект может осуществляться посредством секреции ростовых факторов либо путем межклеточных контактов
эндотелиоцитов с гемопоэтическими предшественниками.
Интрамедуллярные ретикулярные клетки
Ретикулярные клетки костного мозга являются одним из основных клеточных компонентов кроветворного микроокружения.
В интрамедуллярных пространствах трубчатой кости цитоплазматические отростки ретикулярных клеток контактируют с отростками соседних клеток, а также с периваскулярными адвентициальными и покрывающими поверхность костных балок клетками, формируют цитоплазматическую сеть — ретикулум, в ячейках которого
располагаются гемопоэтические клетки. В костномозговых пространствах подвздошной кости человека в одном поле зрения иммерсионного увеличения микроскопа заметны около трех ретикулярных клеток. Размеры и форма ретикулярных клеток весьма
изменчивы. Чаще обнаруживаются крупные клеточные элементы
с деформациями и длинными цитоплазматическими выростами.
Как правило, цитоплазма интрамедуллярных стромальных клеток
слабо базофильна, мелкоячеистого строения. Ядра неправильной
формы с мелкодисперсной структурой хроматина. Также встречаются малоотростчатые клетки с овальными светлыми ядрами.
В центральных отделах лакун, вокруг них в виде островков располагаются эритроидные клетки. Когда ретикулярные клетки выявляются вблизи поверхности костных трабекул, их цитоплазма находится в тесном контакте с властными элементами гранулоцитарного ростка. Наряду с цитоплазматическими отростками ретикулярные клетки костного мозга способны образовывать тонкие
волокна, которые могут располагаться свободно либо связываться
с цитоплазматическими отростками.
В гемопоэтической ткани в зависимости от локализации можно
выделить два основных типа ретикулярных клеток, отл ичающихся
по ультраструктуре. Клетки первого типа с очень длинными цитоплазматическими отростками располагаются диффузно и формируют сеть, в ячейках которой располагаются кроветворные элементы. Ядра с мелкодисперсным хроматином иногда содержат ядрышки. Цитоплазма содержит большое количество рибосом,
хорошо развитую сеть канальцев эндоплазматического ретикулума и пучки микрофнламентов.
68
Часть 1. Теоретическая гематология
В эндостальных и периваскулярных зонах среди кроветворных
элементов гранулоцитарного ряда выявляются ретикулярные клетки другого типа — малоотростчатой формы со светлым ядром и
наличием ядрышек. Они имеют тесный контакт с гемопоэтическими бластными элементами. Довольно часто в местах контактов
таких клеток их плазмолеммы как самостоятельные структуры не
определяются. Отмечается их способность к фагоцитозу.
Как разновидность ретикулярных клеток рассматриваются адвентициальные клетки, тесно прилегающие к стенкам капилляров
и синусов. Большинство периваскулярных клеток имеют темное
ядро и умеренных размеров цитоплазму. В части клеток обнаруживаются крупные жировые капли, окруженные богатым органеллами ободком цитоплазмы. Наличие переходных форм между указанными клетками и адипоцитами указывает на возможности развития жировой ткани костного мозга человека из адвентициальных
ретикулярных клеток.
Полученные в ходе исследований ретикулярной стромы результаты прежде всего свидетельствуют о функциональной мозаичное ти клеток стромального ретикулума. Кроме того, они указывают на
существование функциональных взаимосвязей стромальной и кроветворной ткани.
Отростчатые ретикулярные клетки первого типа своими длин-'
ными цитоплазматическими ответвлениями пронизывают интрамедуллярные пространства, формируют механический каркас, на
котором располагаются гемопоэтические клетки. Они, вероятно,
выполняют роль своеобразного якоря, который задерживает клетки крови и участвует в их движении в циркуляцию. Контактируя
между собой, а также с костью и сосудами, они создают прочную
основу для синусов, не позволяя спадаться их стенкам, состоящим
из единственного слоя эндотелия.
Кроме того, в их цитоплазме обнаружены микрофиламенты.
Известно, что ретикулярные клетки лимфатических узлов способствуют транспортировке лимфоцитов в межуточной ткани и далее
в лимфатические сосуды. По всей вероятности, в костном мозге
ретикулярные клетки первого типа вместе с опорной функцией
способствуют, по аналогии с лимфатическими узлами, миграции
клеток крови в интрамедуллярных пространствах костномозговых
лакун.
Нельзя исключить, что ретикулярные клетки первого типа наряду с отмеченными свойствами выполняют и более специфические функции. Имея в цитоплазме хорошо развитый белоксинтезирующий аппарат, дендритические клетки ретикулума являются
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
69
основным источником образования экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микросреду интрамедуллярных пространств
костного мозга. Синтезируя коллаген, гликозаминогликаны и другие физиологически активные субстанции, ретикулярные клетки
способны непосредственно влиять на процессы пролиферации и
дифференцировки кроветворных предшественников. Особенно
следует отметить роль коллагена. Как известно, экстрацеллюлярный коллагеновый матрикс интрамедуллярных пространств костного мозга представлен коллагеном первого и третьего типов. Химическая структура коллагена и его биологические функции хорошо изучены. Роль этого белка не ограничивается только опорной
функцией. Он необходим в процессах эмбрио- и морфогенеза, оказывает влияние на рост и дифференцировку клеток различных
органов и систем организма.
В гемопоэтических очагах, преимущественно гранулоцитарных
и в меньшей мере эритроидных, выявляются ретикулярные клетки
второго типа. Они характеризуются отсутствием цитоплазматических отростков, наличием молодого ядра, содержащего ядрышки. Их отличительной особенностью является тесный контакт с
молодыми гемопоэтическими элементами. В местах контактов наблюдаются структурные перестройки мембран. На наличие функциональных взаимоотношений указывают отмеченные анатомические характеристики, а также перемещение гемопоэтических
клеток, по мере созревания, от центра кроветворного очага с расположенными в нем стромальными клетками к периферии фокусов
гемопоэза. Эритрокариоциты чаще ассоциированы с макрофагами. Однако, учитывая возможность трансформации ретикулярных
клеток в элементы, обладающие фагоцитарной способностью, можно предположить, что среди макрофагальных элементов эритроцидных островков имеются ретикулярные клетки, способные к
фагоцитозу.
Тесная гистотопографическая взаимосвязь ретикулярных и гемопоэтических клеток подтверждает положение о функциональных взаимоотношениях между ними. Таким образом, совершенно
очевидно, что гетерогенность популяции ретикулярных клеток может быть проявлением их функциональных различий и отражением специфической роли в формировании кроветворного микроокружения.
Адипоциты
. В условиях нормального кроветворения жировые клетки заполняют у взрослых все пространство костномозговой полости, не
70
Часть 1. Теоретическая гематология
занятое миелоидной тканью. Как правило, форма адипоцитов шаровидная или слегка овальная. Обычно клетка содержит единственную крупную жировую вакуоль, занимающую практически всю
цитоплазму. Последняя видна в виде небольших участков по краям
ядер. В зрелых адипоцитах ядра всегда расположены эксцентрично, имеют ровные контуры, вытянутую форму, мелкозернистую
структуру хроматина с конденсацией по периферии. В промежутках между жировыми клетками диффузно расположены гранулоциты. Иногда адипоциты тесно прилежат к поверхности костных
балок. В таких участках молодые гемопоэтические клетки не выявляются. В интрамедуллярных пространствах подвздошной кости
взрослых объем жировой ткани составляет около 30% площади
гистологического препарата.
При ультраструктурном исследовании органеллы обнаруживаются в перинуклеарной зоне. Выявляются в небольшом количестве канальцы незернистой эндоплазматической сети, свободные
рибосомы, крупные митохондрии с элетроннопрозрачным матриксом и короткими кристами. Наряду с такими зрелыми адипоцитами встречаются молодые формы, имеющие широкую цитоплазму с
большим количеством органелл и пусками микрофиламентов, проходящих в различных направлениях.
Каких-либо ультраструктурных особенностей в местах межклеточных контактов зрелых адипоцитов с гемопоэтическими предшественниками, которые позволили бы предположить наличие
функциональной связи, не выявлено. В то же время при электронно-микроскопическом исследовании можно отметить тесные взаимоотношения незрелых жировых клеток (преадипоцитов) с молодыми гранулоцитарными элементами. У незрелых адипоцитов
отмечена высокая функциональная активность, а в местах межклеточных контактов с кроветворными предшественниками обнаружены перестройки плазмолемм преадипоцитов, подобные тем, которые наблюдали в межклеточных контактах ретикулярных и кроветворных клеток. По всей видимости, незрелые жировые клетки
оказывают влияние на гранулоцитопоэз. Как известно, in vitro показана способность молодых жировых клеток влиять на пролиферацию и дифференцировку гранулоцитарных предшественников с
помощью гуморальных факторов и межклеточных контактов. Что
касается зрелых жировых клеток, то они являются энергетическими депо костного мозга и лабильным матриксом, легко теряющим
липиды для обеспечения плацдарма развития гемопоэтических
клеток в условиях повышенного запроса при различных экстремальных ситуациях. Способность адипоцитов адсорбировать на
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
71
своей поверхности широкий спектр физиологически активных субстанций позволяет жировым клеткам непосредственно участвовать в гуморальной регуляции процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических предшественников.
Эндостальные клетки
При морфометрическом исследовании площадь трабекул губчатого вещества подвздошной кости в норме составляет 20,0 ± 4%.
Костные балки правильной формы, имеют гладкие ровные края.
Их эндостальная поверхность выстлана сплошным слоем клеток,
среди которых выявляются клетки двух основных типов. Первые
характеризуются резко уплощенной вытянутой формой, небольшим объемом цитоплазмы, темными узкими ядрами. Вторые отличаются полигональными очертаниями, более обильной цитоплазмой, округлыми, содержащими ядрышки ядрами. В некоторых
участках отчетливо прослеживается двуслойное расположение эндостальных клеток. Число клеток первого и второго типов в единице площади эндостальной поверхности составляет соответственно
1,17 ±0,26 и 0,09 ±0,02.
Молодые кроветворные клетки (миелобласты, промиелоциты)
и мононуклеары типа лимфоцитов зачастую определяются вблизи
трабекулярной поверхности в местах расположения эндостальных
клеток с просветленными ядрами. В таких очагах количество стромальных клеток увеличено. Часть из них находится в тесном контакте с кроветворными клетками. По мере созревания гранулоциты смещаются в центральные отделы лакун.
Электронно-микроскопический анализ эндостальной и субэндостальной зон подвздошной кости показывает присутствие в них
довольно гетерогенной группы стромальных клеток, отличающихся ультраструктурной организацией. Непосредственно на поверхности кости наиболее часто выявляются резко уплощенные вытянутые клетки с небольшим количеством органоидов и электронноплотной цитоплазмой, распространявшей остростки в костное
вещество. Реже встречаются крупные клетки со сравнительно гладкими контурами. Их цитоплазма характеризуется большим количеством внутриклеточных органелл. Округлые ядра всегда имеют
электронноплотные ядрышки. Оба типа клеток располагаются на
матриксе, который состоит из большого количества примерно одинаковой толщины коллагеновых фибрилл с отчетливой поперечной исчерченностью.
Кроме описанных двух видов зндостальных элементов на костных балках обнаруживаются стромальные клетки третьего типа.
.72
Часть 1. Теоретическая гематология
Вне зон активного гемопоэза, когда к кости прилежит жировая ткань
или зрелые гемопоэтические элементы, кроветворная паренхима
отделяется от эндоста истонченным клеточным пластом, элементы
которого обозначаются как клетки «костномозгового мешка».
Толщина слоя эндостальных клеток в различных участках трабекулярной кости варьирует. Прежде всего клеточность эндоста и
его структура находится в зависимости от присутствия в эндостальной зоне молодых гемопоэтических клеток гранулоцитарного
ряда. В тех местах, где определяются признаки повышенной пролиферативной активности гемопоэтической ткани, эндостальная
зона отличается увеличенным количеством стромальных клеток в
состоянии повышенной функциональной активности, которые тесно прилежат к молодым кроветворным элементам. Характер межклеточных контактов указывает на существование функциональных взаимосвязей между стромальными элементами эндоста и гемопоэтическими предшественниками. Кроме этого, эндостальные
клетки играют роль сеплективно проницаемой мембраны, регулирующей ионный обмен между костным матриксом и интрамедуллярной средой костного мозга. При этом особо важное значение
имеет обмен кальция, который, как известно, играет значительную
роль в развитии гемопоэтических клеток. Этому способствует присутствие в популяции эндостальных клеток — остеобластов, объем
которых достигает 10%. Также хорошо известно, что в костном
мозге наибольшая концентрация стволовых кроветворных клеток
обнаруживается эндостально, а пролиферативная активность эндостальных зон значительно выше таковой на расстоянии от эндоста. С одной стороны, это связано с оптимальной концентрацией
ионов кальция, с другой, — со способностью стромальных клеток
создавать соответствующее микроокружение для стволовых клеток и влиять на развитие гемопоэтических предшественников посредством межклеточных контактов и широкого спектра гуморальных факторов.
Следует отметить, что кроме охарактеризованных выше клеточных элементов в состав стромы костного мозга входят также
миоциты сосудов, фибробласты и фиброциты, располагающиеся
по ходу части сосудов, нервные клетки. Естественно, они принимают участие в поддержании функции костного мозга как кроветворного органа. При этом их влияние сводится к обеспечению
кровотока. Инструктивная, регуляторная роль процессов самоподдержания, пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников осуществляется эндотелием синусоидальных сосудов, жировыми, ретикулярными и эндостальными клетками.
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
73
Совершенно очевидно, что функциональные и структурные изменения элементов микроокружения могут быть причиной нарушений кроветворной функции костного мозга. В связи с этим ключевым является вопрос об участии стромы костного мозга в развитии патологических состояний гемопоэза. В настоящее время твердо
установлено значение дефектов стромы костного мозга в развитии
апластической анемии, миелодисплазий, острых и хронических
форм лейкозов, иммунодефицитных состояний (Duhrsen U.,
Hossfeld D., 1996; Tauros S. et al., 2002). В связи с этим учет изменений стромального микроокружения необходим как для определения оптимального лечения, так и для целей прогнозирования заболеваний.
Как известно, клетки стромы костного мозга, так же как и все
клеточные линии гемолимфопоэза, имеют мезенхимальное происхождение. Также установлено присутствие мезенхимальных стволовых клеток, подобных эмбриональным, в костном мозге взрослых. Указанные клетки являются источником развития стромы
костного мозга в течение жизни человека и, по мнению некоторых
исследователей, они обладают способностью развиваться в кроветворные предшественники. Интерес к стволовым клеткам вообще
и стволовым клеткам костного мозга в частности повысился в связи с обнаруженным свойством пластичности стволовых клеток,
т. е. способности стволовых клеток одной линии развиваться в другие клеточные линии (Yannaki Е., 2001; Krause D., 2001; La Russa V.
et al., 2002). Так, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга взрослого человека могут дифференцироваться в кардиомиоциты, гепатоциты, нервные клетки и др. В связи с этим использование стволовых клеток костного мозга взрослых не ограничивается
их применением только в лечении гематологических заболеваний.
В настоящее время стволовые клетки костного мозга, периферической и пуповиннои крови начинают использовать в лечении ряда
соматических заболеваний.
Литература
Ругань В. И., Блинова Т. С, Пономаренко В. М., Абдулкадыров К. М. Ультраструктурная организация кроветворного микроокружения костного мозга человека //' Гематология и трансфузиология. 1991. № 3. С. 11-14.
Теодорович В. П., Абдулкадыров К. М. Трепанобиопсия костного мозга при некоторых гематологических заболеваниях. Л.: Медицина, 1977. 95 с.
Duhrsen i'., Hossfeld D. Stromal abnormalities in neoplastic bone marrow diseases //
Ann. Hematol. 1996. V 73. P. 53-70.
Krause D. Plasticity of marrow-derived stem cells // Gene Ther. 2001. V. 9, N 11.
P. 754-758.
Глава 5
ЦИТОХИМИЯ КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА
Среди многих современных и высокоинформативных методов
диагностики лейкозов морфоцитохимия прочно сохраняет свое
место, и необходимость применения морфоцитохимических методов диагностики лейкозов не вызывает сомнений.
Цитохимия основывается на использовании цветных химических реакций для определения химической природы клеток и выявления в них метаболически активных энзимов и веществ. Химический состав нормальных клеток крови и костного мозга изучен
достаточно хорошо. Диагностическая цитохимия лейкозов базируется на том, что лейкозные клетки, особенно до начала химиотерапии, сохраняют особенности метаболизма и многие из основных
свойств, присущих их нормальным аналогам. Поэтому идентификация лейкозных бластов, а значит, и установление варианта лейкоза в немалой степени основываются на выявлении этих свойств.
Одним из способов идентификации клеток и определения их принадлежности к соответствующей клеточной линии является определение с помощью цитохимических реакций характеризующих
их субстанций и энзимов. Среди них наибольшее диагностическое
значение имеют ферменты — миелопероксидаза, кислая и щелочная фосфатазы, неспецифические эстеразы (а-нафтилацетат-эстераза, кислая неспецифическая эстераза, сх-нафтилбутират-эстераза и хлорацетат-эстераза), а также такие субстанции, как липиды и
углеводы.
Цитохимическая характеристика клеток крови
Углеводы играют важную роль в клеточном метаболизме. Их
расщепление сопровождается выделением большого количества
энергии, обеспечивая таким образом энергетические потребности
76
Часть 1. Теоретическая гематология
клетки. Разнообразные соединения углеводов включают моно- и
полисахариды, в том числе гликоген, кислые мукополисахариды, а
также гликопротеиды, гликолипиды и др. Для выявления углеводов применяют реакцию с использованием реактива Шифф и йодной кислоты — ШИК-реакция, она же PAS-реакция (Periodic Acid
Schiff). Реакция выявляет в клетках не только гликоген, но и некоторые другие углеводы, однако гликоген — самый распространенный и основной полисахарид.
В миелобластах полисахариды могут отсутствовать или может
наблюдаться слабая диффузная или мелкогранулярная реакция.
По мере созревания клеток нейтрофильного ряда их количество
возрастает. Наибольшее количество полисахаридов содержится в
зрелых нейтрофилах, где они выявляются в виде ярко-малиновых
гранул или интенсивной диффузной окраски цитоплазмы. Целесообразно использование контрольной реакции с амилазой, которая устраняет розовое окрашивание цитоплазмы в случае гликогеновой природы углевода. В эозинофилах полисахариды диффузно
окрашивают цитоплазму и не содержатся в гранулах. По данным
Д. Ф. Глузмана (1978), Ф. Г. Дж. Хейхо и Д. К. Кваглино (1983), в
базофилах они не определяются, в то же время S. J. Galli и соавторы
(1983) выявили PAS-положительное вещество в этих клетках. Лимфоциты содержат умеренное количество полисахаридов в виде мелких немногочисленных гранул, иногда в виде венчика вокруг ядра,
на фоне неокрашенной цитоплазмы. Согласно Ф. Г. Дж. Хейхо,
Д. К. Кваглино, в норме 10-40% лимфоцитов содержат PAS-положительное вещество. В моноцитах оно распределяется в виде мелких пылевидных гранул на фоне бледно-розовой цитоплазмы. Реакция тромбоцитов на полисахариды высокоположительна. Мегакариоциты содержат их в виде рассеянных гранул на диффузном
фоне. Контрольный тест с амилазой подтверждает гликогеновую
природу полисахарида в этих клетках.
Кислые сульфатированные мукополисахариды включают хондроитин-4-сульфат и выявляются цитохимически, главным образом в незрелых миелоидных клетках (Морозова В. Т., 1977; Харченко М. Ф. и др., 1986; Kolset S. О., Gallagher J. Т., 1990).
Оксидазы — ферменты, катализирующие окислительные процессы молекулярным кислородом. Среди них особое значение имеет
миелопероксидаза (МП). Энзим миелопероксидаза является очень
важным компонентом клеток, особенно нейтрофилов. Она служит
маркером клеток нейтрофильного ряда и располагается в основном в первичных лизосомальных гранулах (Бронштейн М. И.,
Френкель М. А., 2002). Этот фермент катализирует окисление раз-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
77
личных субстратов, например фенолов и некоторых аминокислот
в присутствии перекиси водорода, которую он расщепляет. Активность МП обнаруживается уже на стадии миелобласта и возрастает в процессе созревания клетки, однако наибольшую активность
фермента демонстрируют промиелоциты. Слабое окрашивание
цитоплазмы эритроцитов и нормобластов выявляет псевдопероксидазу — продукт реакции с гемоглобином (Koike T. et al., 1986).
В эозинофилах выявляется специфическая эозинофильная пероксидаза. По данным одних авторов, МП никогда не выявляется в
базофилах (Глузман Д. Ф. и др., 2000), в то время как другие находят, что она содержится в базофильных про- и миелоцитах и почти
отсутствует в зрелых базофилах (Parwaresch M. R., 1976). Мы же не
наблюдали активность МП в зрелых базофилах. В мегакариоцитах
и тромбоцитах присутствует специфическая тромбоцитарная МП,
которая определяется с помощью электронной микроскопии. Часть
моноцитов дает реакцию на пероксидазу от умеренной до слабой.
Липиды — важная составная часть лейкоцитов — представляют
собой разнообразные соединения, включающие простые липиды:
эфиры жирных кислот, в том числе нейтральные жиры, и сложные
липиды в составе фосфолипидов, гликолипидов (цереброзидов),
аминолипидов, сульфолипидов и др. Они содержатся во многих
клетках крови, за исключением лимфоцитов и эритроидных клеток. Для выявления липидов существует несколько методов, но
чаще применяют метод Sheehan и Storey (1947) и Ackerman (1952)
с Суданом черным Б, который окрашивает фосфолипиды в черный
цвет. Наибольшее их количество содержится в клетках нейтрофильного ряда, начиная с миелобласта, и реакция усиливается с
увеличением зрелости клетки. Половина нейтрофилов содержит
фосфолипиды в составе специфической зернистости. Эозинофилы демонстрируют'сильно положительную реакцию на липиды,
которые содержатся в их гранулах. Реакция на липиды в базофилах, особенно незрелых, положительна, хотя и очень вариабельна
(Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Моноциты могут давать
отрицательную реакцию на липиды, но чаще в них выявляется
вариабельное количество мелких гранул, иногда в виде пылевидной зернистости.
Фосфатазы входят в состав гидролаз. Эти ферменты широко
распространены в клетках человека и животных. Они участвуют в
обменных процессах с жирами, полисахаридами и нуклеопротеидами.
Кислые фосфатазы (КФ) включают изоферменты, катализирующие освобождение фосфата из спиртовых или фенольных
78
Часть 1. Теоретическая гематология
моноэфиров при кислой рН среды. Кислые фосфатазы локализованы в лизосомах и цитохимически выявляются благодаря образованию окрашенных участков красного цвета в местах гидролиза
субстрата. В качестве субстрата могут быть использованы нафтолAS-фосфат, а-нафтилфосфат натрия, нафтол-А8-О-фосфат и др.
Кислая фосфатаза присутствует в большинстве клеток крови и
костного мозга. В гранулоцитах, моноцитах, эозинофилах и базофилах она выявляется, начиная с незрелых клеток этих рядов, где
ее активность наиболее высокая. Во многих клетках, в том числе в
моноцитах, она ингибируется ионами тартрата (Глузман Д. Ф. и
др., 2000). Активность фермента определяется в лимфобластах и
лимфоцитах, где она очень вариабельна. Наибольшая активность
среди клеток этой серии наблюдается в Т-лимфоцитах. Реакция
положительна в плазматических клетках, мегакариоцитах, тромбоцитах и эритробластах. Высокую активность КФ демонстрируют макрофаги. Активность фермента снижена в лимфоцитах при
хроническом миелолейкозе (ХМЛ). В нейтрофилах повышение ее
активности наблюдается при ХМЛ, истинной полицитемии и миелофиброзе.
Щелочные фосфатазы (ЩФ) также относятся к группе гидролитических ферментов. Они способны освобождать фосфат, катализируя отщепление фосфатных групп из фосфомоноэфиров в
щелочной среде. ЩФ принимают участие в обмене липидов и нуклеиновых кислот (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Активность ЩФ присуща только зрелым гранулоцитам. Иногда она
может выявляться в метамиелоцитах (Бронштейн М. И., Френкель М. А., 2002). Фермент локализуется во вторичных гранулах и
пластинчатом комплексе. В эритроцитах, тромбоцитах, моноцитах
ЩФ не выявляется. Небольшая ее активность наблюдается в единичных лимфоцитах. Базофилы реагируют отрицательно, а эозинофилы могут демонстрировать слабую фоновую окраску (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Содержание ЩФ повышается
при воспалительных состояниях, бактериальных инфекциях, лёйкемоидных реакциях, миелофиброзе, полицитемии и снижается
при хроническом миелолейкозе, некоторых миелодиспластических синдромах и пароксизмалыюй ночной гемоглобинурии. Фермент выявляется в виде желто-коричневых гранул в цитоплазме.
Изофермент N-щелочная фосфатаза определяется иногда в лимфоидных клетках у больных хроническим лимфолейкозом, при
лимфомах мантийной зоны (Nanba К. et.al., 1975).
Неспецифические эстеразы (НЭ) также относятся к гидролазам. Эти ферменты способны гидролизовать простые эфиры N-CBO-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
79
бодных спиртов жирных кислот. Это весьма неоднородная группа
энзимов, названия которых обусловлены субстратом, который они
гидролизу ют. Получено более 9 шоферментов НЭ. Фракции 1, 2,
7, 8, 9 выявляются при использовании нафтол-АБ-О-хлорацетата
и представляют активность хлорацетат-эстеразы (ХАЭ), которая
присутствует в гранулоцитах. Фракции 3, 4, 5, 6 взаимодействуют
с эфирами а-нафтилацетата или ос-нафтилбутирата и представляют собою НЭ, выявляемые в моноцитах, плазматических клетках и
тромбоцитах (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Наибольший
интерес для гематологов представляют хлорацетат-эстераза, ос-нафтилацетат-эстераза (аНАЭ), а-нафтилбутират-эстераза (осНБЭ).
Неспецифические эстеразы являются лизосомальными ферментами. Существует мнение, что эстеразы участвуют в киллерной функции Т-лимфоцитов (Fcrluga I. J. et al., 1972). а-Нафтилацетатэстераза обнаруживается во всех миелоидных клетках (Wachstein M., Wolf G., 1958), но наибольшая ее активность определяется
в моноцитах, в которых присутствует изоформа аНАЭ, подавляемая фторидом натрия и свойственная только клеткам моноцитарной линии (Дульцина С. М. и др., 1986; Fischer R., Schmalze F.,
1964). Реакция на осНАЭ может быть положительной в нейтрофилах, эозинофилах, лимфоцитах, но в них она не подавляется фторидом натрия. В лимфоцитах, преимущественно Т-клетках, фермент располагается локально, фокусно или в виде 1-2 гранул в
цитоплазме. Фермент выявляется в мегакариоцитах и тромбоцитах. Высокая, нечувствительная к ингибитору активность аНАЭ
наблюдается в макрофагах. В клетках эритроидного ряда в норме
она не определяется.
Кислая НЭ — это фермент, локализующийся в лизосомальных
гранулах. Его активность выявляется в реакции с а-нафтилацетатом в кислой среде при рН 5,8. Она характерна для Т-хелперов и,
по мнению J. Kullenkampf и соавторов (1977), может служить маркером Т-лимфоцитов. Кроме того, она выявляется в клетках моноцитарного ряда.
Хлорацетат-эстеразу (ХАЭ) называют гранулоцитарной, в
отличие от моноцитарных аНАЭ и аНБЭ. Как и миелопероксидаза, она является маркером нейтрофилов. Хлорацетат-эстераза выявляется чаще всего, начиная с промиелоцита, редко миелобласта,
и ее активность постепенно снижается по мере созревания клетки
(Глузман Д. Ф., 1978). Активность фермента выявляется в виде
гранул синего цвета. Часть эозинофилов и моноцитов может демонстрировать слабую активность ХАЭ. Эритроидные клетки отрицательно реагируют в реакции на ХАЭ. Возможно, хлорацетат-
80
Часть 1. Теоретическая гематология
эстераза принимает участие в иротеолитической и переваривающей функции нейтрофилов (Ferluga J. et al, 1972).
Сдвоенную реакцию на ХАЭ и аНАЭ проводят последовательно на одном мазке. Это позволяет разделить клетки гранулоцитарной и моноцитарной линий, что имеет значение при диагностике
миеломоноцитарного лейкоза. При выявлении клеток, демонстрирующих одновременно активность двух ферментов, есть основание диагностировать бифенотипичный вариант этого лейкоза.
Цитохимическая диагностика лейкозов
Франко-американо-британская классификация миелоидных и
лимфоидных опухолей (ФАБ-классификация) (Bennet J. M. et al.,
1976, 1985) основана на морфоцитохимических особенностях незрелых лейкозных клеток. Одновременно с появлением ФАБ-классификации и на смену подобным ей пришли классификации морфоиммуноцитогенетические (MlС-working classification, 1986,
1988), иммунологические — EGIL (Бене М. К. и др., 1996) и др.
В последнее время появились классификации миелоидных и лимфоидных опухолей, которые дополнили существовавшие прежде и
кроме морфоиммуноцитогенетических свойств клеток учитывают
их молекулярно-генетические характеристики (Воробьев А. И. и
др., 2002;"Классификация ВОЗ /Хэррис Н. Л. и др., 2000/; Wardiman J. W. и др., 2002). Кроме острых лейкозов, представленных в
ФАБ-классификации, они включают ряд новых наименований, в
частности вторичные миел областные лейкозы, связанные с проводимым лечением алкилирующими препаратами и радиационным
облучением, ряд лейкозов со специфическими цитогенетическими
и молекулярно-генетическими нарушениями, миел областный лейкоз с мультилинейной дисплазией и др. Согласно рекомендациям
создателей классификации ВОЗ, диагноз острого лейкоза может
быть установлен при достижении 20%-ного уровня бластных клеток в костном мозге (30%-ного — по ФАБ-классификации).
С развитием техники получения моноклональных антител
(МКА) появилась возможность изучения иммунологических маркеров клеток различных клеточных линий (линейные маркеры)
и маркеров различных уровней дифференцировки клеток. Методы проточной цитометрии, иммуноцитохимические, метод непрямой иммунофлюоресценции и другие позволяют выявить экспрессию поверхностных клеточных иммунных маркеров, объединяемых в группы дифференцировочных антигенов — кластеров дифференцировки (CD), — определить принадлежность клеток к
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
81
миелоидной или лимфоидной клеточным линиям и стадию созревания клетки на пути ее дифференцировки. Благодаря иммунофенотипированию клеток среди Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) были выделены в зависимости от стадии
дифференцировки про-Т-тип, пре-Т-тип, кортикальный Т-тип, зрелый Т-тип. Среди В-клеточных ОЛЛ выделены про-В-тип, тип
Common, пре-В-тип, зрелый В-тип ОЛЛ. Кроме этого, выделены
иммунологические варианты так называемых стволовоклеточных
лейкозов.
Значительная часть острых миелобластных лейкозов диагностируется морфоцитохимически. Определение иммунофенотипа
миелобластов необходимо при отсутствии в лейкозных клетках
основных цитохимических маркеров — миелопероксидазы, хлорацетат-эстеразы, липидов или их слишком слабой активности.
Поэтому определение антигенного профиля субстратных клеток
лейкозной популяции необходимо при острых миелобластных лейкозах с минимальной дифференцировкой, монобластных, мегакариобластных лейкозах, эритромиелозе и эритробластном лейкозе.
Диагностике некоторых типов миелобластных лейкозов, вошедших в новейшие классификации, помогают выявленные корреляции между цитогенетическими аномалиями в лейкозных клетках и
их иммунологическими детерминантами. Трудно ассоциировать
иммунофенотип и цитогенетические особенности клеток с их морфоцитохимическими характеристиками и проводить корреляции
между ними. Однако названия лейкозов базируются по-прежнему
на морфологических особегпгостях клеток, а в основе новейших
классификаций лежат морфоцитохимические характеристики, и
диагностическая работа во многих лабораториях начинается с морфоцитохимического анализа клеточного субстрата. Тем не менее
необходимо еще раз подчеркнуть, что только комплексное использование всех современных методов может сделать диагностику лейкоза успешной.
Цитохимическая окраска клеток позволяет разделить острые
лейкозы на 2 основные группы — острые лимфобластные лейкозы
(ОЛЛ) и острые нелимфобластные лейкозы (ОНЛЛ), а также,
основываясь на морфоцитохимических характеристиках клеток,
выделить среди ОНЛЛ несколько основных вариантов. Классификация ОЛЛ в настоящее время полностью основана на иммунофенотипировании и цитогенетике, и тем не менее в ряде случаев морфоцитохимия может иметь некоторое вспомогательное значение в
предварительной дифференциальной диагностике Т- и В-клеточных форм ОЛЛ.
82
Часть 1. Теоретическая гематология
Цитохимические реакции проводятся на мазках крови, лейкоконцентратов, костного мозга, на отпечатках и срезах биопсийного
материала из лимфоузлов, селезенки, кости и других органов и
тканей.
Проведение цитохимических реакций требует строгого соблюдения многих правил, связанных с приготовлением препаратов и
рабочих растворов из реактивов, фиксацией мазков, условиями их
инкубации в процессе реакции и дальнейшей окраской.
Цитохимические реакции следует проводить до начала терапии
лейкоза. Результаты исследований, которые проводятся в процессе лечения, в период рецидивов заболевания, сильно зависят от
химиотерапии, в результате которой может не только измениться
характер и интенсивность цитохимических реакций, но также может быть полностью редуцирована активность некоторых ферментов.
Очевидно, что просто морфологическая диагностика вариантов
острого лейкоза без цитохимических исследований чаще всего невозможна, и в то же время любое цитохимическое исследование
начинается с анализа морфологических особенностей исследуемых клеток, с обычной паноптической окраски. Поэтому правильно говорить о морфоцитохимических исследованиях клеток.
Цитохимические методы иссчедования лейкозов
Перед началом цитохимических исследований производится
морфологический анализ окрашенных по Романовскому- Гимзе или
Май-Грюнвальду мазков костного мозга и/или периферической
крови. Для осуществления цитохимической диагностики лейкозов
широко используются следующие цитохимические реакции:
1. Определение содержания полисахаридов в PAS-реакции по
методам McManus (1946), R. D. Hotchkiss (1948) (Лецкий В. Б.,
1973; Глузман Д. Ф. и др., 2000 ).
2. Определение содержания фосфолипидов в реакции с Суданом черным Б, по методам Shneehan и Storey (1947); Ackerman
(1952).
3. Определение активности миелопероксидазы по методу Sato
(1928) и Quaglino (1958), W. Loele (1936) (Глузман Д. Ф. и др.,
2000; Лецкий В. Б., 1973 ).
4. Определение активности хлорацетат-эстеразы по методу
Moloney с соавт. (1960).
5. Определение активности кислой фосфатазы по методам
Р. П. Нарциссова (1968); Гольдберга и Барка (1962); Берстона
(1958).
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
83
6. Определение активности а-нафтилацетат-эстеразы по методам Хейхо с соавт. (1964); Э. Пирса (1960) в модификации Леффлера(1961).
7. Определение активности щелочной фосфатазы по методам
Kaplow (1955); Ф. Г. Дж. Хейхо. Д. К. Кваглино (1958); М. Г. Шубич (1967) (ЛецкийВ. Б., 1973; Глузман Д. Ф. и др., 2000; Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983).
Общепринятый способ оценки реакции в световом микроскопе
был предложен Kaplow в 1955 г. и в 1957 г. модифицирован Астальди и Верга. Он основан на оценке интенсивности реакции. Прежде
всего в окрашенном препарате подсчитывают не менее 100 исследуемых клеток. При острых лейкозах оценку реакции проводят в
бластных элементах; определяют процент положительно реагирующих клеток (ППК), а также средний цитохимический коэффициент окраски (СЦК).
Реакция считается положительной при наличии 3 и более процентов клеток, в которых выявлена положительная реакция, при
этом количество клеток с положительной окраской может колебаться от 3 до 100%.
Вторым показателем реакции является интенсивность окраски,
которая отражает активность фермента или количество исследуемого вещества в клетке. Она выражается средним цитохимическим коэффициентом — СЦК. Для его вычисления учитывают
различную степень интенсивности окраски клеток. При подсчете
100 клеточных элементов любого типа различают 4 степени реакции: 0 (нулевая) — с отрицательной реакцией; I — со слабоположительной реакцией; II — с положительной реакцией; III — с выраженной реакцией.
Цитохимический коэффициент (СЦК) вычисляют по формуле:
100
где
цифры означают степень интенсивности окраски, а буквы количество клеток (в %), соответствующее указанным в формуле
степеням окраски. Максимальный СЦК равен 3,0.
При 0 (нулевой) степени интенсивности окраски окрашивание
клеток отсутствует.
При I степени интенсивности окраски имеют место единичные
окрашенные гранулы в цитоплазме, либо слабое диффузное окрашивание всей цитоплазмы, либо наличие небольшого окрашенного участка — фокусное или локальное окрашивание.
Часть 1. Теоретическая гематология
84
При II степени интенсивности окраски наблюдается заполнение окрашенными зернами или диффузно почти всей цитоплазмы,
но неокрашенные ее участки имеются.
При III степени окраски интенсивно окрашенные гранулы заполняют всю цитоплазму, иногда частично покрывая ядро. При
диффузном характере реакции наблюдается очень яркая интенсивная реакция во всей цитоплазме. Таким образом, СЦК свидетельствует, как уже было сказано, о содержании вещества или о его
активности в клетке.
Пример: из 100 подсчитанных клеток одного типа (бластных
клеток при остром лейкозе) 50 клеток реагировали отрицательно и
50 клеток — положительно. При этом окрашенные клетки распределились по степени интенсивности окраски следующим образом: I степень — 30 клеток; II степень — 18 клеток; III степень —
2 клетки.
Согласно формуле:
„тт„
v, LLrv =
0x50 + 1x30+2x18 + 3x2
—
U,
/
z,
100
СЦК =0,72; ППК=50%.
При оценке реакции, особенно при отсутствии окрашивания
клеток, необходимо быть уверенным, что нулевая степень интенсивности окраски не зависит от качества реакции. Поэтому надо
обязательно найти в. мазке положительно реагирующие клетки
любого типа. В противном случае реакцию нужно повторять.
Для оценки реакции ориентируются на нормальные цитохимические показатели клеток здоровых людей (Лецкий В. Б., 1973).
Острые миелоидныё лейкозы (ОМЛ)*
Авторы ФАБ-классификации острых миелобластных лейкозов
выделяют 3 типа миелобластов при ОМЛ: I— клетки с узкой голубой или базофильной, не содержащей азурофильных гранул, цитоплазмой, ядром с нежнозернистой структурой хроматина и одной крупной нуклеолой; II — клетки с 2-4 мелкими нуклеолами,
отличаются более широкой цитоплазмой, содержащей от нескольких до 20 азурофильных гранул; III —в периферической крови и
костном мозге больных ОМЛ иногда выявляют бласты с много* Придерживаясь новейшей классификации лейкозов ВОЗ, мы все же сохраняем в тексте нумерацию острых миелоидных лейкозов, рекомендованную
авторами ФАБ-классификации.
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
85
численными азурофильными гранулами; наличие таких бластов в
некоторых случаях ОМЛ с созреванием (М2) коррелирует с транслокацией t(8;21) (Bennet J. M. et al., 1985).
Острый миелобластный лейкоз с минимальной дифференцировкой (ОМЛ МО), или острый недифференцируемый лейкоз
характеризуется отрицательными реакциями на МП, липиды, ХАЭ
и КФ. Может наблюдаться слабоположительная PAS-реакция типичного для ОМЛ диффузного или мелкогранулярного характера.
Очень редко в небольшом количестве бластов выявляется слабая,
не подавляемая фторидом натрия реакция на осНАЭ (Cuneo A.
et al., 1995). Морфологические особенности бластных клеток при
МО преимущественно I типа неоднородны, но преобладают клетки среднего диаметра. Их содержание может достигать 95%. Характерные только для этой формы лейкоза хромосомные аберрации не выявлены (Воробьев А. И. и др., 2002). МО диагностируется по результатам иммунофенотипирования — наличия маркеров
CD13, CD33, CD34, CD117 (Bene M. С. et al., 1998). Дифференциальная диагностика проводится с ОМЛ М7 и ОЛЛ.
Острый миелобластный лейкоз без созревания (ОМЛ М1)
характеризуется наличием в пунктате костного мозга более 90%
бластных клеток. Наблюдаются преимущественно бласты I типа,
без зернистости. Азурофильная зернистость определяется менее
чем в 10% бластов. Согласно Д. Ф. Глузман и соавторам (2000),
палочки Ауэра обнаруживаются приблизительно у 50% больных
ОМЛ Ml. По нашим наблюдениям, палочки Ауэра при этом варианте лейкоза отсутствуют. Властные клетки характеризуются средними и крупными размерами, округлыми, иногда неправильной
формы ядрами с 1-4 нуклеолами и нежнозернистой структурой
ядерного хроматина. Иммунофенотип бластов включает CD33,
CD13, CD117, CD14, CD64, CD15, HLA-DR и МПО, реже CD34,
CD117 (Bene M. С. et al., 1998). Дифференциальный диагноз проводится с ОМЛ М2, ОМЛ М5, ОМЛ М7 и ОЛЛ.
Острый миелобластный лейкоз с созреванием (ОМЛ М2)
отличается от ОМЛ Ml меньшим содержанием бластных клеток в
пунктате костного мозга (менее 89% бластов). Властные клетки I и,
главным образом, II типов характеризуются средними и крупными
размерами и заметным полиморфизмом. Их ядра могут быть
округлыми или неправильной формы. Структура ядерного хроматина тонкодисперсная. Значительная часть бластов содержит азурофильную зернистость (бласты II типа), встречаются палочки Ауэра,
которые могут обнаруживаться в более зрелых гранулоцитах. Созревающие гранулоциты составляют более 10% клеток (Bennet J. M.
86
Часть 1. Теоретическая гематология
et al., 1985). Иммунофенотипические маркеры при ОМЛ М2 —
CD13, CD15, CD33, CD64, МПО, HLA-DR. Небольшое количество бластов экспрессирует CD34 и CD117 (Воробьев А. И. и др.,
2002; Бене М. К. и др., 1996).
Для этих двух вариантов ОМЛ характерна положительная реакция бластов на миелопероксидазу липиды и ХАЭ, которые являются маркерными для миелобластов. Выраженность реакции в бластах на МП вариабельна, по нашим наблюдениям, она колеблется
от 7 до 100% МП позитивных клеток. При ОМЛ М2 процент клеток, положительно реагирующих в реакции на МП, липиды и ХАЭ,
значительно выше, чем при ОМЛ без созревания — Ml. Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме в виде гранул золотисто-желтого цвета при использовании в реакции ортотолидина или в виде
гранул темно-синего цвета при использовании бензидина. Количество гранул различно от случая к случаю — от небольшого их числа
в одном участке цитоплазмы до полного ее заполнения. Реакция на
МП, как и реакция на липиды, часто лучше выявляет палочки
Ауэра, чем обычная паноптическая окраска. Согласно нашим наблюдениям и сообщениям других авторов (Френкель М. А., 1999),
у части больных ОНЛЛ (Ml, M2) могут выявляться только один
или два цитохимических маркера. В ряде случаев при отсутствии в
бластах МП большая часть зрелых нейтрофилов может быть также
пероксидазоотрицательна. В процессе лечения клетки иногда утрачивают фермент.
Вторая маркерная реакция для ОМЛ с созреванием и без созревания — реакция на липиды с Суданом черным Б. По мнению некоторых исследователей и согласно нашим наблюдениям, она даже
более надежна, чем миелопероксидаза (Ковалева Л. Г., 1990). Фосфолипиды выявляются в 14-100% бластов в виде черных гранул,
которые часто заполняют всю цитоплазму клетки. Интенсивность
реакции различна.
Реакция на гранулоцитарную эстеразу — ХАЭ — также является маркерной для нейтрофилов, но имеет меньшее значение в диагностике, особенно для ОМЛ Ml, так как фермент начинает выявляться в основном со стадии промиелоцита. По мере созревания
клеток активность фермента снижается. Реакция на полисахариды не имеет особого диагностического значения. В миелобластах
PAS-положительное вещество может отсутствовать или иметь диффузный или диффузномелкогранулярный характер распределения.
Мелкие, реже средние гранулы темно-малинового цвета беспорядочно располагаются на фоне диффузно окрашенной бледно-розовой цитоплазмы.
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
87
Реакция на а-нафтилацетат-эстеразу способствует дифференциальной диагностике ОМЛ Ml и ОМЛ М2 с острыми моноцитарными лейкозами. Она может быть отрицательной в миелобластах,
однако в случае положительной реакции диагностическое значение имеет отсутствие ингибиции реакции в миелобластах фторидом натрия в отличие от монобластов, в которых она подавляется
ингибитором.
Фермент выявляется в виде буровато-коричневых гранул (при
использовании в реакции синего прочного В или ВВ) на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.
Кислая фосфатаза не имеет диагностического значения для этих
двух вариантов ОМЛ. При наличии положительной реакции необходимо обратить внимание на взаимодействие фермента с ингибитором — ионами тартрата. В отличие от моноцитарных клеток реакция в бластных клетках при мнелобластных лейкозах не подавляется тартратом натрия.
Очень редкий вариант ОМЛ М2 — острый базофильный лейкоз
(классификация ВОЗ, 2000,2002) — характеризуется содержанием
более 5% базофилов от неэритроидной популяции костного мозга. При этом типе ОМЛ выявляется транслокация t(6;9)(p23;q34) и
делеция или транслокация короткого плеча хромосомы 12. Выделяют редкий вариант этого лейкоза, содержащий вариабельное,
иногда значительное, количество базофильных клеток различной
степени зрелости. Клетки характеризуются средним диаметром и
неширокой голубой цитоплазмой. Ядра могут иметь неправильную форму; ядрышки, как это свойственно базофилам, почти не
видны. В бластах выявляется крупная базофильная зернистость.
Реакция на МП, липиды и гранулоцитарную эстеразу отрицательная, но положительная с альциановым синим (Френкель М. А.,
1999). PAS-реакция в виде крупных гранул и блоков. Пунктат костного мозга малоклеточный, кроме базофильных бластов в нем обнаруживают более зрелые клетки этого ряда.
Острый промиелоцитарный лейкоз (ОМЛ МЗ). Особый тип
бластнвгх клеток наблюдается при остром промиелоцитарном лейкозе (ОПЛ, или ОМЛ МЗ). Это название было дано из-за наличия
в лейкемических клетках обильной зернистости. Властные клетки,
или атипичные промиелоциты при ОПЛ характеризуются выраженным полиморфизмом и анаплазией. Их ядра имеют неправильную форму, часто лопастную, двудольчатую, складчатую и могут
располагаться эксцентрично. Цитоплазма — от голубого до базофильного цвета, иногда имеет выросты. В ней выявляется обильная зернистость 2 типов: грубые крупные темно-фиолетовые гра-
Часть 1. Теоретическая гематология
пулы IT более мелкие пурпурного цвета. Гранулы заполяют цитоплазму и иногда покрывают ядро клетки. Как правило, бласты
содержат палочки Ауэра, иногда в виде пучков. Кроме этих бластов
наблюдаются клетки с мелкой зернистостью и не более 8—10%
обычных миелобластов. Это типичный макрогранулярный вариант ОПЛ.
Нетипичный, редкий микрогранулярный вариант этого лейкоза — О МЛ M3v — характеризуется бластами с очень скудной, мелкой, иногда пылевидной зернистостью. Палочки Ауэра немногочисленны. При этом варианте ОПЛ бласты отличаются уродливостью ядер (бобовидные, двудольчатые, лопастные, рассеченные, с
глубокими выемками) и могут напоминать бласты при остром монобластном лейкозе с созреванием (ОМЛ М5в). Из-за этого сходства необходимо проводить дифференциальную диагностику между этими двумя типами лейкоза, тем более что своевременная диагностика ОПЛ важна в связи с возможностью достижения полной
ремиссии под воздействием дериватов ретиноевой кислоты (Савченко В. Г. и др., 2001, а, о; Huang M.-E., 1988). Клетки при ОМЛ
МЗ содержат главные маркеры миелоидных клеток — МП, липиды, ХАЭ в максимальных количествах. Даже реакции на а-нафтилацетат-эстеразу, не подавляемую фторидом натрия, и полисахариды значительно более выражены, чем в бластных клетках при
Ml и М2 вариантах ОМЛ. Основываясь на нашем опыте, следует
отметить, что интенсивность реакций на МП, ХАЭ и осНАЭ хотя и
достаточно высокая, тем не менее в некоторых случаях M3v ниже,
чем при макрогранулярном ОПЛ. При дифференциальной диагностике с монобластным лейкозом с созреванием помогает отсутствие миелоидных цитохимических маркеров или их слабая выраженность и яркая реакция на аНАЭ, подавляемую фторидом натрия в монобластах в отличие от бластов при ОПЛ (Bennet J. М.
et al, 1976). Гранулы лейкозных клеток при ОПЛ содержат кислые
сульфатированные мукополисахариды (Абду'лкадыров К. М. и др.,
1978). С помощью цитогенетических исследований при ОПЛ обнаруживается транслокация t(15;17)(q22;ql2-21) и ряд других аберраций. Иммунофенотипически клетки ОПЛ характеризуются экспрессией антигенов CD13, CD33, МПО, CD64 и CD15. Клетки
не несут антигены CD34, HLA-DR (Савченко В. Г. и др., 2001, а;
Paietta E. et al., 1994).
Острый миеломонобластный лейкоз (ОММЛ, или М4) — билинейный лейкоз, и его клеточный субстрат представлен клетками
нейтрофилыгого и моноцитарного рядов, которые эксирессируют
антигены обеих линий - CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD64,
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
CDllc, CD117, CD4 и HLA-DR. Наиболее частые цитогенетические аберрации — t(9;ll), трисомия 4, t(l;7), t(8;21), связанные с
Hq23. При этом варианте лейкоза обе клеточные линии характеризуются заметной дифференцировкой до зрелых форм. Сумма
миелобластов I и II типов и монобластов в костном мозге обычно
не превышает 60%, а на долю созревающих и зрелых гранулоцитов
и моноцитов приходится в общей сложности от 20 до 40% клеток.
Моноциты периферической крови составляют не менее 5 х 109/л.
Цитохимически выявляются миелобласты, дающие положительную реакцию на МП, липиды, ХАЭ и монобласты, характеризующиеся присутствием в них моноцитарной а-нафтилацетат-эстеразы, подавляемой фторидом натрия (Fischer R., Schmalze E, 1964) и
КНЭ. Дифференциальный диагноз проводится с ОМ Л М2 и ОМ Л
М5в.
Подвариантом билинейного типа ОММЛ является миеломоноцитарный лейкоз с эозинофилией (М4эоз). Количество эоэинофилов в костном мозге составляет более 6%. Имеют место и характерные цитогенетические аберрации, в частности инверсия хромосомы 16 (pl3;q22) и t(16;16)(pl3;q22). Атипичные эозинофилы содержат крупные незрелые пурпурно-фиолетовые гранулы. Имеет
место ядерная гиперсегментация. Эозинофилы дают положительную реакцию на полисахариды и ХАЭ. Властные клетки и даже
зрелые нейтрофилы могут содержать палочки Ауэра.
Бифенотипичный вариант ОММЛ составляет около 1% случаев ОНЛЛ. При этом варианте лейкоза бласты содержат одновременно МП, липиды, ХАЭ и аНАЭ, подавляемую фторидом натрия. В таких случаях при диагностике проводят реакцию на двойную эстеразу — ХАЭ и аНАЭ. Здесь можно увидеть, что одни и те
же клетки содержат цитохимические маркеры как неитрофильнои,
так и моноцитарной линий.
Острый монобластный лейкоз (ОМоЛ, или М5) подразделяется на монобластный лейкоз без созревания (М5а) и с созреванием
(М5в). При М5а-варианте более 80% клеток — монобласты. Это
клетки большого диаметра с округлыми или овальными ядрами,
1-2 нуклеолами, с нежносетчатой структурой ядерного хроматина
и достаточно широкой голубой или базофильной цитоплазмой.
В части клеток наблюдается скудная пылевидная зернистость.
В редких случаях можно видеть очень нежные, едва заметные палочки Ауэра. В бластах "содержится большое количество неспецифической эстеразы (аНАЭ и аНБЭ), подавляемой фторидом натрия и КНЭ. Неспецифическая эстераза, чувствительная к ингибитору, служит маркером моноцитов и монобластов и имеет
90
Часть 1. Теоретическая гематология
большое значение для диагностики острых монобластных лейкозов, будучи высокоспецифичной для этих клеток. Положительная
реакция выявляется в виде красновато- или буровато-коричневых
обильных мелких гранул, заполняющих цитоплазму, поэтому иногда реакция кажется диффузной. Ингибиция реакции вариабельна — от частичной до тотальной. В отдельных монобластах выявляется слабая реакция на миелопероксидазу и липиды в виде редких рассеянных гранул. R. МсКеппа и соавторы (1975) описали
несколько случаев монобластного лейкоза с высокой активностью
аНАЭ, подавляемой фторидом натрия, и слабой активностью ХАЭ
в большинстве клеток. Авторы считают, что в этих случаях бластные клетки обладают свойствами моноцитарных и гранулоцитарных клеток. В литературе приводятся примеры аНАЭ негативных
случаев ОМоЛ (Scott С. S. et al., 1993). Наблюдается умеренная
активность КФ, подавляемая ионами тартрата. Дифференциальный диагноз М5а нужно проводить с ОМЛ МО, ОМЛ Ml.
При ОМоЛ с созреванием (М5в) содержание бластных клеток
колеблется от 20 до 80%, остальные клетки представлены промоноцитами, моноцитами и гранулоцитами. Моноцитарные клетки
при ОМоЛ с созреванием отличаются полиморфизмом. Властные
клетки — крупного размера, с бобовидными, иногда расщепленными, лопастными, вдавленными ядрами, содержащими несколько
нуклеол. Структура ядерного хроматина нежносетчатая; цитоплазма умеренная, со скудной пылевидной азурофильной зернистостью. Как и при ОМоЛ без созревания, при этом варианте лейкоза монобласты содержат большое количество подавляемой фторидом натрия неспецифической эстеразы (Яворковский Л. И., 1987)
и КНЭ. Липиды и пероксидаза содержатся в части бластов в небольших количествах. В сыворотке и моче, как и при ОМоЛ без
созревания, определяется большое количество фермента лизоцима. Бласты при ОМоЛ экспрессируют CD13, CD15, CD33, CD11,
CD4, CD7 и моноцитарные CD 14. При М5а может выявляться
CD34 — антиген ранних клеток-предшественников. Установлены
цитогенетические аберрации — транслокации t(9;ll); t(10;ll);
t(ll;17), связанные с Ilq23.
Нужно еще раз отметить, что в отличие от монобластных лейкозов при Ml, М2, МЗ и М7 вариантах ОМЛ, с которыми нужно
проводить дифференциальный диагноз, позитивная реакция на
аН АЭ обусловлена экспрессией общих или немоноцитарных эстераз (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д., 1983). Реакция в этих случаях
резистентна к ингибиции, но эта резистентность тоже может быть
очень вариабельной. Диагностическое значение имеет высокая
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
91
активность кислой фосфатазы в монобластах при ОМоЛ, которая
ингибируется ионами татрата в отличие от других, не моноцитарных клеток (Яворковский Л. И., 1987; Глузман Д. Ф. и др., 2000).
Гранулоцитарная эстераза (ХАЭ) не свойственна моноцитарным клеткам. Гликоген выявляется в части бластов в виде бледнорозового диффузного или мелкогранулярного окрашивания. ОМЛ
М5в необходимо дифференцировать с ОМЛ M3v и ОМЛ М4.
Острый эритромиелоз (Мб). При остром эритромиелозе число
лейкемических эритрокариоцитов в костном мозге достигает 50%
и более, а содержание бластных клеток составляет более 20% от
числа неэритроидных клеток (классификация ВОЗ, 2000, 2002).
При подсчете бластов эритробласты не учитываются (Wardiman J. W. et al., 2002). Содержание бластов имеет решающее значение при дифференциальной диагностике с В,,-дефицитной и некоторыми другими гемолитическими анемиями, рефрактерной анемией с увеличением бластов, при которых содержание бластных
клеток менее 20%. Властные клетки представлены эритробластами, миелобластами, недифференцированными бластами. Эритроидные клетки имеют признаки выраженной дисплазии, наблюдаются мегалобласты, макроциты, многоядерные эритрокариоциты,
асинхронность в созревании ядра и цитоплазмы, дольчатость ядер.
Могут наблюдаться явления эритрофагоцитоза лейкозными эритробластами. В миелобластах могут обнаруживаться палочки Ауэра.
Признаки дисплазии отмечены в мегакариоцитах и нейтрофилах
(гигантские уродливые ядра метамиелоцитов и палочко- и сегментоядерных нейтрофилов). Наблюдается созревание эритрокариоцитов, и в пунктате можно видеть все стадии эритроидных клеток.
Вообще картина костного мозга при этом варианте лейкоза очень
вариабельна. Миелобласты I и II типов демонстрируют положительные реакции на МП, липиды, ХАЭ. Дополнительное диагностическое значение имеет позитивная PAS-реакция в эритрокариоцитах. PAS-положительное вещество располагается в цитоплазме
незрелых красных клеток в гранулярной форме, а в более зрелых
„аритрокариоцитах — в диффузной форме. Реакция вариабельна и
непостоянна. Это не абсолютно специфичный признак, так как
известны случаи эритромиелоза, когда эритрокариоциты PAS-негативны. Нужно также учитывать, что PAS-позитивная реакция в
ядросодержащих эритроидных клетках встречается при некоторых гемолитических анемиях. В эритрокариоцитах при остром эритромиелозе может быть обнаружена слабоположительная реакция
на ссНАЭ, резистентная к ингибитору, КНЭ и КФ (Глузман Д. Ф. и
др., 2000). Иммунологическими маркерами этого лейкоза являются
92
Часть 1. Теоретическая гематология
CD 13, CD33, CD41, CD71 и гликофорин А. Имеют место хромосомные аберрации, относящиеся к 5 и 7 хромосомам (Воробьев А. И. и др., 2002; Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., 2001, б;
Савченко В. Г. и др., 2001, а).
Вариантом острого эритромиелоза является острый эритролейкоз (Мбв), при котором в костном мозге преобладают эритробласты без признаков созревания (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Френкель М. А., 2001). Лейкемические эритробласты содержат полисахариды в гранулярной форме и в виде блоков. Установить диагноз
острого эритролейкоза помогает иммунофенотипирование, в результате которого выявляется экспрессия эритробластами специфического для них маркера — гликофорина А и В, а также CD36,
CD71, CD33, CD117 (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Френкель М. А.,
2001). Дифференциальный диагноз проводится с О МЛ МО, М7
(мегакариоцитарный лейкоз).
Острый мегакариоцитарный лейкоз (М7) — редкая форма острого лейкоза, которая характеризуется очень полиморфной картиной костного мозга. Морфоцитохимическая диагностика этого лейкоза затруднена. Властные клетки в количестве не менее 20% представлены недифференцированными бластами, миелобластами и
микрогенерациями мегакариобластов. Последние почти таких же
размеров, как лимфобласты или миелобласты. Ядра мегакариобластов характеризуются плотной структурой ядерного хроматина,
неотчетливыми нуклеолами, узкой отростчатой базофильной цитоплазмой. Аспират из кости, как правило, беден вследствие миелофиброза и потому часто малоинформативен. В пунктате встречаются микрогенерации мегакариоцитов, свободные ядра мегакариоцитов и их обломки. Иногда можно видеть мегакариоциты,
отделяющие пластинки. Мегакариобласты не содержат липидов,
МПО и ХАЭ. При электронной микроскопии в них выявляется
тромбоцитарная нероксидаза. Они демонстрируют довольно высокую активность осНАЭ, КНЭ и умеренную активность аНБЭ, несколько чувствительных к ингибитору — фториду натрия (Луговская С. А. и др., 1999). Полисахариды располагаются в них в виде
скоплений у края мембраны на фоне диффузно окрашенной в розовый цвет цитоплазмы. Важно исследование периферической крови, где выявляются фрагменты мегакариоцитов и иногда наблюдается гипертромбоцитоз. Нужно проводить дифференциальную диагностику с МО, Ml, M5a и острым лимфобластным лейкозом,
которая возможна только по результатам иммунофенотипирования, выявляющего характерные для М7 маркеры: CD41, CD42 и/
или CD61, CD36. Не менее 50% клеток должны иметь иммунофе-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
93
нотип мегакариоцитов (Логинский В. Е. и др., 1996; Глузман Д. Ф.
и др., 2000). В 5% случаев находят цитогенетические нарушения,
наиболее частыми из которых являются моносомия 7 или трисомия 8, 10 и 21. Таким образом, из острых миелобластных лейкозов
острый недифференцируемый лейкоз, эритролейкоз и острый мегакариоцитарный лейкоз прежде всего нуждаются в обязательном
иммунофенотипировании для установления антигенного профиля
их бластных клеток.
Острый плазмобластный лейкоз — очень редкая форма острого
лейкоза. Одни авторы считают, что он является лейкозом de novo,
следствием пролиферации и экстрамедуллярного распространения незрелых плазматических клеток (Воробьев А. И. и др., 2002;
Mufti G. J. et al.,1996). По мнению других авторов, это может быть
проявлением множественной миеломы, ее бластной трансформацией (Dimopoulos M. A., Palumbo A.,1994). Плазмобластный лейкоз характеризуется анемией и нейтропенией. Костный мозг инфильтрирован плазмобластами и более зрелыми клетками этого
ряда. Маленькие плазматические клетки могут циркулировать в
крови в большом количестве, в отличие от множественной миеломы. Плазмоциты имеют выраженную базофилию цитоплазмы, сгущающуюся к краю мембраны, и перинуклеарную зону. В цитоплазме могут встречаться азурофильные включения, подобные тельцам Ауэра. В некоторых случаях плазмобласты могут достигать
больших размеров и напоминать бластные клетки при некоторых
миелобластных лейкозах или крупные бласты злокачественной
лимфомы (Mufti G. J. et al, 1996). Цитохимически в плазмобластах выявляется высокая активность кислой фосфатазы и р-глюкуронидазы в виде гранул (Глузман Д. Ф., 1978; Хейхо Ф. Г. Дж.,
Кваглино Д. К, 1983). Плазмобласты продуцируют патологические иммуноглобулины. Рекомендовано обязательное иммунофенотипирование для выявления обычных антигенов В-клеточной
лимфоидной дифференцировки и поздних В-клеточных антигенов, например CD38 (Mufti G. J.,1996).
Под нашим наблюдением находилось двое больных с плазмобластным лейкозом. В обоих случаях имело место тотальное замещение костного мозга плазмоцитами различной степени зрелости — от плазмобластов до зрелых плазматических клеток. Плазматические клетки циркулировали в периферической крови, наблюдалась спленомегалия. При проведении цитохимических реакций
у обоих больных в большинстве клеток определялась высокая активность кислой фосфатазы. В части клеток была выявлена аНАЭ
и слабая диффузная реакция на полисахариды.
94
Часть 1. Теоретическая гематология
Острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ). Внедрение метода
иммунофенотипирования позволило разделить ОЛЛ на Т- и IBклеточные типы, включающие иодварианты, соответствующие различным уровням дифференцировки лимфоидных клеток. Возрастные, клинические, прогностические особенности ОЛЛ также показали, что лимфобластные лейкозы представляют собою весьма
гетерогенную группу заболеваний. Авторы последних классификаций лейкозов (классификация ВОЗ, 2000, 2002) сочли нецелесообразным сохранение терминологии ФАБ-классификации для
ОЛЛ (LI, L2, L3) в связи с тем, что диагностические и прогностические критерии морфологических вариантов L1 и L2 недостаточны, их корреляции с иммунофенотипом и генетическими маркерами чаще всего не наблюдается, а форма L3 ОЛЛ является эквивалентом лимфомы Беркитта в фазе лейкемизации. Классификация
ВОЗ включает вместо лимфобластного лейкоза В-лимфобластный
лейкоз/лимфому и Т-лимфобластный лейкоз/лимфому. В то же
время А. И. Воробьев с соавторами (2002) сочли необходимым выделять ранее описанные основные формы В- и Т-лимфобластных
острых лейкозов у детей и взрослых.
Морфологические особенности лейкозных лимфобластов
варьируют в широких пределах. Микрогенерации лимфобластов
(7-10 мкм) характеризуются очень узкой цитоплазмой, плотным
ядерным хроматином, слаборазличимыми единичными нуклеолами. Существуют варианты ОЛЛ, отличающиеся более гетерогенным составом бластной популяции, включающей как мелкие,
так и средние и крупные бластные клетки с ядрами различных
очертаний, более тонкой структурой ядерного хроматина и четкими одним-двумя ядрышками. Их цитоплазма достаточно выражена, и в таких случаях необходима дифференциальная диагностика с ОМЛ — Ml, МО, Мбв. М7. Бластные клетки при беркиттоподобном ОЛЛ/лимфоме Беркитта характеризуются средними и
большими размерами, резко базофильной вакуолизированной цитоплазмой. В настоящее время главным критерием в классификации ОЛЛ являются не морфоцитохимические характеристики
бластов, а их иммунофенотипическая характеристика и выявление линейных (Т- или В-клетки) или стадиеснецифических маркеров. Кроме того, для диагностики имеет значение выявле?ше
различных патогенетических аномалий в лимфобластах. В то же
время в ряде случаев морфоцитохимические особенности лимфобластов могут быть дополнительным критерием в дифференциальной диагностике как между Т- или В-клеточными вариантами ОЛЛ, так и между ОЛЛ и некоторыми формами нелимфо-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
95
бластных лейкозов. Литературные данные (Глузман Д. Ф. и др.,
1975: Глузман Д. Ф. и др., 1987; Глузман Д. Ф. и др., 2000) и наш
опыт показали, что Т- и В-лимфобласты имеют морфоцитохимическпе особенности. В-лимфобласты отличаются большим полиморфизмом, в то время как Т-лимфобласты — небольшие клетки
с высоким ядерноцитоплазматическим соотношением. Признаком В-лимфобластов является наличие в них, в большинстве случаев, полисахаридов. В миело- и монобластах реакция имеет слабый диффузный или мелкогранулярный характер, причем гранулы располагаются беспорядочно на фоне диффузно окрашенной
цитоплазмы. В В-лимфобластах средние и крупные темно-малиновые гранулы гликогена располагаются в виде венчика на фоне
неокрашенной цитоплазмы, иногда сливаясь в блоки. Могут выявляться лишь 1-2 крупные гранулы в небольшом количестве
клеток, иногда располагаясь над ядром клетки. В Т-лимфобластах полисахариды чаще всего не выявляются или имеют характер
скудной мелкой зернистости в части клеток. В то же время в Т-лимфобластах обнаруживается высокая активность кислой фосфатазы, ос-нафтилацетат-эстеразы и КНЭ. Кислая фосфатаза может
располагаться в цитоплазме этих клеток в виде крупных гранул
или фокусно — в виде пятна. Такой характер распределения фермента, а также отсутствие или слабая реакция на полисахариды
типичны для Т-клеточного ОЛЛ, хотя нужно учитывать, что подобный характер реакции наблюдается иногда в эритро-, моно- и
мегакариобластах. осНАЭ располагается в Т-лимфобластах локально, в виде 1-2 небольших, интенсивно окрашенных пятнышек. Реакция не чувствительна к фториду натрия. Активность
КФ, аНАЭ и КНЭ в В-лимфобластах чаще всего не определяется
или слабо выражена.
Для подтверждения диагноза ОЛЛ имеет значение не только
выявление полисахаридов или кислой фосфатазы, но и отрицательные реакции на маркерные для миелоидных клеток миелопероксидазу, липиды и хлорацетат-эстеразу.
Диагностика редких вариантов бифенотипичных, гибридных
(бласты несут одновременно антигены двух различных клеточных
линий) или стволовоклеточных лейкозов (клетки экспрессируют в
основном антигены ранних предшественников гемопоэза) целиком основана на иммунофенотипировании.
Хронический миелолейкоз (ХМЛ). Роль цитохимических исследований при хронических лейкозах не столь велика, как при
ОНЛЛ, однако нужно отметить важность реакции на щелочную
фосфатазу (ЩФ) в зрелых нейтрофилах при ХМЛ. Щелочная фос-
96
Часть 1. Теоретическая гематология
фатаза является маркером этой формы лейкоза. При ХМЛ в развернутой фазе заболевания активность ЩФ в нейтрофилах резко
снижена или может вообще отсутствовать. Дефицит ЩФ в нейтрофилах ассоциирован с хромосомными нарушениями при ХМЛ и
является скорее всего результатом транслокации t(9;22) и существования химерного гена BCR-ABL.
Властный криз ХМЛ характеризуется повышением активности
ЩФ и иногда ее полной нормализацией. Определение активности
ЩФ имеет значение при дифференциальной диагностике ХМЛ с
миелофиброзом, полицитемией и лейкемоидными реакциями, при
которых активность ЩФ нормальна или даже повышена. Использование цитохимических реакций на МП, фосфолипиды и полисахариды способствует идентификации БК ХМЛ миелоидного или
лимфоидного типа.
Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ). При ВКЛ более чем в
90% случаев клетки имеют иммунофенотип зрелых В-лимфоцитов. Они экспрессируют пан-В-клеточные антигены CD19, CD20,
CD22. Кроме обычного варианта ВКЛ описывают лейкемический
тип этого заболевания, при котором, как считают, лейкемические
клетки менее зрелые. Особенностью ВКЛ является присутствие в
костном мозге и периферической крови специфических лейкемических клеток, морфология которых послужила основанием для
появления названия этого лейкоза. Это мононуклеары, цитоплазма которых имеет отростчатые, ворсинчатые очертания. Ядра клеток круглые, овальные, лопастные, имеют нежносетчатую структуру хроматина и слабо контурируемые 1-2 нуклеолы. Цитоплазма
голубого или серо-голубого цвета. Для диагностики ВКЛ имеет
значение выявление активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы, которая обнаруживается у 95% больных (Луговская С. А.
и др., 1999), и НЭ. Одно-, двух- или трехростковая цитопения,
нейтропения и моноцитопения, а также спленомегалия очень характерны для ВКЛ (Волкова М. А., 2001).
Таким образом, вопреки мнению некоторых авторов, предлагающих отказаться от морфоцитохимического анализа клеток при
диагностике лейкозов (Бене М. К. и др., 1996), в настоящее время'
общепризнано, что первоначальная диагностика большинства
ОНЛЛ основана на результатах морфоцитохимических исследований, которые являются в этих случаях достаточно информативными и доступными методами. В то же время для диагностики
таких вариантов штелобластных лейкозов, как ОМЛ Ml, ОМЛ
МО, ОМЛ Мбв, ОМЛ М7, для дифференциальной диагностики
между М2 и M3v, М5в и M3v вариантами ОМЛ, а также для всех
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
97
лимфобластных лейкозов необходимо проводить иммунофенотипирование и цитогенетические исследования.
Литература
Абдулкадыров К. М., Харченко М. Ф., Шляпочникова Г. П. и др. Цитоморфологические и некоторые биохимические особенности бластных клеток при остром
промиелоцитарном лейкозе // Пробл. гематол. 1978. № 23(9). С. 18-20.
Бене М. К., Кастольди Г., Harm В. и др. Предложения для иммунологической
классификации острых лейкозов (Европейская группа по иммунологической
классификации лейкозов) // Гематол. и трансфузиол. 1996. № 6. С. 43-45.
Бронштейн М. И., Френкель М. А. Гистохимические особенности лейкоцитов
крови и костного мозга в норме /'/ Руководство по гематологии / Под ред.
А. И. Воробьева. М, 2002.Т. 1. С. 137-145.
Волкова М. А. Волосато-клеточный лейкоз // Клиническая онкогематология:
Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 396-410.
Воробьев А. И., Бриллиант М. Д., Савченко В. Г. Гемобластозы // Руководство по
гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М., 2002. Т. 1. С. 147-236.
Глузман Д. Ф., Юдин В. М., Сидоренко С. П. и др. Морфологические критерии
распознавания Т- и В-лимфоцитов и их возможное применение при изучении
неопластических процессов // Иммунология опухолей. Киев, 1975. С. 57-59.
ГлузманД. Ф. Диагностическая цитохимия гемобластозов. Киев, 1978. 215 с.
Глузман Д. Ф., Скляренко Л. М., Надгорная В. А. и др. Рецепторы поверхностных
мембран, дифференцировочные антигены и цитохимические признаки клеток
крови при остром лимфобластном лейкозе у детей // Эксп. онкол. 1987. № 3.
С. 36-39.
Глузман Д. Ф., Абраменко И. В., Скляренко Л. М. и др. Диагностика лейкозов:
Атлас и практическое руководство / Под ред. Д. Ф. Глузмана. Киев, 2000.
Дульцина С. М., Дягилева О. А., Кореневская М. К. и др. Исследование активности ос-нафтилбутират-эстеразы в клетках периферической крови здоровых людей // Лаборат. дело. 1986. № 10. С. 590-594.
Ковалева Л. Г. Острые лейкозы. М„ 1990. 272 с.
Лецкип В. Б. Цитохимические исследования лейкоцитов. Л., 1973. 36 с.
Логинский В. Е., Выговская Я. И., Масляк 3. В. и др. Значение иммунологического фенотипирования бластных клеток в диагностике острой миелоидной лейкемии у взрослых // Эксп. онкол. 1996. № 18. С. 146-149.
Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е. Лабораторная диагностика лейкозов: Учебное пособие. Тверь, 1999. 78 с.
Морозова В. Т. Лабораторная диагностика лейкозов. Л., 1977.152 с.
Пирс Э. Гистохимия. М., 1962. 944 с.
Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., Исаев В. Г. и др. Острые промиелоцитарные
лейкозы: Эпоха новых знаний и достижений // Гематол. и трансфузиол. 2001.
№ 46 (3). С. 26-34 (а).
Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н. Острые лейкозы // Клиническая онкогематология. Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 156-207 (б).
Френкель М. А. Современная диагностика острых лейкозов // Заочная академия последипломного образования. М., 1999. С. 25-33.
Френкель М. А. Лабораторная диагностика острых лейкозов // Клиническая
онкогематология: Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М., 2001.
С. 146 151
4 Гематология. Нов. справочник
Глава 6
КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ В ГЕМАТОЛОГИИ
Кроветворные клетки животных и человека начали культивировать в конце XIX—начале XX в. (Скворцов И. П., 1885; Arnold,
1887; Maximov A. A., 1927).
Под культурой клеток понимают совокупность жизнеспособных клеточных элементов, полученных в результате их выращивания и сохранения при определенных условиях вне организма хозяина. Для культивирования клеток и тканей, а также поддержания
их жизнедеятельности применяют различные культуральные системы. Культуральные системы с использованием сред на гелевой
основе (агар, метилцеллюлоза, коллаген), в отличие от жидких
культур, ограничивают способность имплантированных в среду
клеток к движению, фиксируют их в одном месте, не позволяя
«расползаться» в процессе деления материнской клетки. Таким
образом, клетки, способные пролиферировать, образуют в полутвердых и вязких средах дискретные колонии — клеточные агрегаты, представляющие из себя клон, т. е. потомство одной делящейся
клетки, состоящее из однотипных клеточных элементов, которые
можно анализировать. Поэтому методы культивирования клеток в
полутвердых и вязких средах, а также колониеобразование в условиях in vivo, называют методами клонирования.
Изучение кроветворных клеток и клеток стромы костного мозга
с использованием методов клонирования относится к 70-м годам
прошлого столетия. С этого времени, благодаря работам J. E. Till,
Е. A. McCulloch (1961), а также исследованиям A. J. Friedenstein и
соавторов (1968), Т. R. Bradley, D. Metcalf( 1966) и других исследователей, методы клонирования кроветворных и стромальных клеток заняли прочное место среди других функциональных методов
изучения системы крови. Клонирование кроветворных клеток открыло новые огромные возможности для понимания процессов
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
101
кроветворения. Благодаря этому удалось доказать клоногенный
характер стволовых кроветворных клеток (СКК), т. е. происхождение клона однотипных клеток из одной исходной клетки.
Выявление клонов, содержащих клетки двух и более клеточных
типов (смешанные колонии), доказало полипотентность СКК, то
есть способность их к развитию в направлении всех кроветворных
ростков. Разработка воспроизводимых методов клеточных культур для различных типов гемопоэтических клеток-предшественников послужила мощным импульсом для изучения нормального
и патологического кроветворения. Культуральные методы, позволившие изучать гемоноэз ex vivo, оказались очень полезными для
исследования СКК, коммитированных (направленных к дифференцировке) клеток-предшественников (ККП) и их потомства, а
также для различных манипуляций с гемопоэтическими клетками
в культуре, изучения экспрессируемых ими медиаторов кроветворения — цитокинов, влияния на эти клетки различных экзо- и
эндогенных факторов, таких как радиация, медикаментозные средства и различные гуморальные и физические факторы.
Методы клонирования клеток позволили оценить величину пула
СКК в костном мозге, охарактеризовать потомство этих клеток,
объединенных в клоны, выявить промежуточные этапы их дифференцировки от мультипотентной СКК через стадии коммитированных поли- и моноолигоиотентных клеток-предшественников
различных клеточных линий до уровня морфологически распознаваемых в световом микроскопе бластных клеток костного мозга, а также доказать клоногенные свойства стволовых клеток и
клеток-предшественников стромы костного мозга. Поли- и моноолигопотентные клетки-предшественники способны дифференцироваться в направлении 2-5 кроветворных линий. Клетки, дающие
рост колоний в условиях вне организма, называют колониеобразующими единицами (КОЕ). Например КОЕ, образующие в агаре,
метилцеллюлозе или селезенке облученного животного смешанные колонии из гранулоцитов, эритрокариоцитов, макрофагов и
мегакариоцитов, называют КОЕ-ГЭММ и т. д.
Результаты этих исследований, ставшие возможными благодаря внедрению методов клонирования, изучение кинетики гемопоэтических клеток, открытие явления апоптоза — запрограммированной клеточной смерти — оказались чрезвычайно важными для
понимания механизма гомеостаза — равновесия внутренней среды
организма и сбалансированности всего процесса кроветворения.
Сегодня значение культуральных исследований гемопоэтических
клеток для науки и практической медицины трудно переоценить.
102
Часть 1. Теоретическая гематология
В то же время необходимо решать многие проблемы, связанные с
особенностями культуральных методик, в частности, с вариабельностью роста и качеством колоний в зависимости от типа культуральной системы, количества и концентрации различных компонентов культуральных сред, применяемых в различных лабораториях.
Стандартизация и оптимизация культуральных сред и условий
культивирования призваны уменьшить возможные ошибки и повысить адекватность и информативность этих методов. Среди необходимых условий культивирования нужно отметить прежде всего использование качественных культуральных сред, содержащих
необходимые колониестимулирующие факторы (КСФ), а также
температурные условия, влажность, газовую среду и т. д. Нарушение условий культивирования приводит к снижению эффективности клонирования и изменению качества и морфологического состава клеточных агрегатов в культуре.
Методы культивирования клеток
По способу культивирования клеток различают культуры ех
vivo — вне организма и in vivo — в организме. Для выращивания
клеток ex vivo применяют различные культуральные системы и
среды. Культуралыгая среда призвана обеспечить оптимальный режим жизнедеятельности клеток и тканей. Среды для культивирования делят на естестественные (сыворотка, плазменный сгусток и
др.) и синтетические (среды Игла, МакКоя, Пскова и их модификации — D-MEM, IMDM, RPMI и многие другие). Хорошо зарекомендовали себя среды IMDM (среда Дульбекко, модифицированная Исковым), среды с метилцеллюлозой (Methylcellulose Culture
Medium), «полные» среды с эмбриональной телячьей сывороткой
(ЭТС), эритропоэтином (ЭРП) и всеми необходимыми для роста
СКК и коммитированных клеток-предшественников ростовыми
факторами, а также «неполные» — без ЭРП, или ЭТС, или какихлибо цитокинов. Культуральные среды предназначаются для поддержания жизнедеятельности непролиферирующих соматических
клеток (поддерживающие среды) или для обеспечения процессов
пролиферации и дифференциации клеток (ростовые среды с ростовыми факторами).
Культуральные среды могут быть жидкими, вязкими, полутвердыми и твердыми. Синтетические среды состоят из воды, солевых
растворов, буферных систем, витаминов, аминокислот, ростовых
факторов и т. д. Составной частью многих сред являются сыворотки: крови человека, эмбриональная телячья, бычья, лошадиная,
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
103
свиная, новорожденных телят и ягнят, сыворотка плаценты здоровых рожениц (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985; Гольдберг Е. Д.
и др., 1992). Культуры могут быть краткосрочными (4-24 часа). 814-дневными и длительными (5-8 недель и более), в зависимости
от поставленных задач.
По характеру базового субстрата культуральные системы делятся на: 1) суспензионные, где клетки находятся в жидкой питательной среде в разобщенном состоянии; 2) на основе плазменного
сгустка; 3) на основе полутвердых агаровых или коллагеновых сред;
4) на основе вязких сред — метилцеллюлозы. Кроме того, клональный рост стволовых кроветворных клеток и коммитированных клеток-предшественников изучают in vivo, например, в селезенке смертельно облученных мышей или в диффузионных камерах с агаром
или плазменным сгустком, имплантированные облученным животным интраперитонеально или под капсулу почки, а также в
длительных культурах на стромальной подложке. Основным условием для получения колоний, образованных различными гемопоэтическими предшественниками, является присутствие в культуре
необходимых колониестимулирующих факторов (факторов роста
клеток).
Метод селезеночных колоний (Till J. E., McCulloch E. A., 19G1)
заключается в том, что внутривенно вводят костномозговую клеточную взвесь смертельно облученной мыши, собственный гемопозз которой тотально подавлен, после чего в ее селезенке образуются макроскопически видимые скопления кроветворных клеток,
каждое из которых является клоном, т. е. представляет собою потомство одной клетки — колониеобразующей единицы селезенки
(КОЕс). Среди них наблюдаются колонии, состоящие из однотипных клеток (гранулоцитов, макрофагов, эозинофил'ов, эритроидных
клеток и др.), и смешанные колонии, включающие представителей
двух и более клеточных линий. Так был доказан клоногенный
характер КОЕс и их полипотентность — способность развиваться в
направлении нескольких клеточных линий. При переносе отдельных клеток из этих колоний в новую культуральную систему снова получали дискретные колонии из однотипных клеток или смешанные колонии, что говорит о способности этих клеток к самоподдержанию. Полагают, что в селезенке облученных животных
клональные свойства проявляют СКК с ограниченной способностью к самоподдержанию, а также их потомки — коммитированные клетки-предшественники клеточных линий (коммитирование — необратимая направленность стволовой клетки к дифференцировке).
104
Часть 1. Теоретическая гематология
Различные культурадьные системы обладают различной «разрешающей» способностью для клонирования клеток. Простые агаровые системы, в которых источником КСФ для клоногенных клеток служат лейкоциты донорской крови, обеспечивают клональный рост только моно- и бнпотентных КОЕ, или КОЕк — колониеобразующих единиц в культуре, где они формируют локализованные клеточные агрегаты — колонии, которые могут быть идентифицированы и анализированы под обычным световым микроскопом. Среди них различают КОЕ-Г (гранулоцитарные), КОЕ-М
(моноцитарно-макрофагальные), КОЕ-Эоз (эозинофильные),
КОЕ-ГМ (гранулоцито-макрофагальные) и др. Более сложные
культуральные системы, оптимизированные кондиционированными средами (КС) или различными КСФ, обеспечивают клональный рост не только уни- и бипотентных клеток-предшественников, но и КОЕ-ГЭММ.
Для культивирования клеток используют стерильные пластиковые или стеклянные чашки Петри, флаконы Карреля, Эрла и др.
Культивирование производят либо в инкубационных камерах
при +37 °С, с постоянной газовой атмосферой (кислорода — 5%,
углекислого газа — 10% и азота — 85%) и 100% влажностью, либо в
термостате при +37 °С, в герметически закрытых стеклянных эксикаторах или пластиковых контейнерах, где также поддерживается необходимая влажность и газовая атмосфера.
Для достижения эффекта клонирования в культуральную среду
должны быть внесены стимуляторы роста клеток (специфические
ростовые факторы). Характер и количество ростовых факторов
зависят от типа культуралыгой системы и поставленных задач.
Культивирование клеток в агаре
Клетки-предшественники грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ).
Полутвердые агаровые среды используют в одно- и двухслойных
агаровых культурах для выращивания и поддержания жизнедеятельности моноцитарно-макрофагальных, гранулоцитарных, гранулоцито-макрофагальных и других миелоидных клеток-предшественников. Агар, получаемый из морских водорослей, образует
гелевый субстрат, позволяющий клонировать клетки. Используют
такие образцы агара, как бактоагар Difco (США), агар-агар, бактоагар Serva (Германия) и др.
В 1966 г. Т. R. Bradley и D. Metcalf в двуслойной агаровой системе культивировали костный мозг мыши и получили рост гранулоцито-макрофагальных колоний. В 1970 г. В. L. Pike и W. A. Robinson
использовали двуслойную агаровую среду для культивирования
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
105
человеческих кроветворных клеток. При данном методе в чашку
Петри помещают 0,5%-ный расплавленный агар с донорскими лейкоцитами (источник КСФ) и после застывания на него наслаивают верхний слой 0,3%-ного агара с тестируемыми клетками в количестве 1,0-1,5 х 10'миелокариоцитов. Таким образом, нижний слой
служит питательной средой для клеток верхнего слоя.
Колониестимулирующим фактором для гранулоцитов и макрофагов в этой системе является КСФ, продуцируемый моноцитами
и макрофагами донорской крови. Чашки Петри помещают в термостат при описанных выше условиях на 7-8 дней. По истечении
этого срока оценивают количество выросших клеточных агрегатов-колоний и кластеров в световом микроскопе. За кластер принимают клеточные агрегаты, содержащие от 3 до 40-50 клеток.
Агрегаты в составе 40-50 и более клеток оцениваются как колонии. Количество гранулоцитарных, моноцитарно-макрофагальных
и гранулоцито-моноцитарных колоний в норме колеблется от 8 до
150 на 1 х 105 миелокариоцитов — в среднем около 30, количество
кластеров — от 10 до 340 на 1 х 105 миелокариоцитов — в среднем
около 70 (Афанасьев Б. В. и др., 1980; Балашова В. А., 1985; Entriiiger M. A. et al., 1977). Соотношение кластер/колония в норме колеблется в среднем от 2 до 5 и не превышает 12 (Metcalf D. et al.,
1979). Эта культуральная система пригодна для клонирования
КОЕ-Г, КОЕ-М и КОЕ-ГМ. В культуре доказана их высокая чувствительность к радиации, воздействию химиопрепаратов и таких
физических факторов, как излучение лазера, УФО, магнитные излучения, соединения перфторуглеродов и т. д. (Балашова В. А. и
др., 1988; Абдулкадыров К. М. и др., 1992, 1995).
Культивирование гемопоэтических клеток в системе
«агаровая капля—жидкая среда»
Эта система предложена Б. В. Афанасьевым в 1983 г. и предназначена главным образом для клонирования КОЕ-Г, КОЕ-М и
КОЕ-ГМ. В отличие от системы Пайка и Робинсона она не содержит нижнего агарового слоя. Вместо верхнего слоя агара используется агаровая капля — гель. Тестируемые клетки имплантируют в
0,3%-ный агар (Difco, США) в количестве 1,0-1,5 х 105 миелокариоцитов на 0,5 мл агаровой среды, включающей также ЭТС и
питательную среду типа D-MEM, IMDM и др. С помощью шприца
и тупоконечной иглы жидкий агар с клетками размещается на дне
чашки Петри, где и застывает в форме капли-геля. После застывания капли в чашку наливают 2,5 мл питательной среды с донорски6
ми лейкоцитами в концентрации 1 х 10 клеток на 1 мл жидкой
IOG
Часть 1. Т е о р е т и ч е с к а я г е м а т о л о г и я
среды (фидер). В состав среды входят также ЭТС и антибиотики.
Фидер служит источником гранулоцитарно-моноцитарного КСФ,
основным продуцентом которого являются моноциты донорской
крови. Эффективность клонирования возрастает при внесении в
жидкую фазу системы специальной среды, кондиционированной
стимулированными ФГА (фитогемагглютинин) монойуклеарными лейкоцитами периферической крови, или добавлении коктейля
из рекомбинантных цитокинов (McNiece I. К. et al., 1991; Bernstein I. D. et al., 1991; Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995).
В таких системах растут не только КОЕ-ГМ, но и КОЕ-ГЭММ, и
КОЕ-Бл (бластные колонии). Преимуществом системы «агаровая
капля—жидкая среда» является способность поддерживать клональную пролиферацию не только нормальных, но и лейкозных
клеток (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). Система также более оптимальна для межклеточных взаимодействий тестируемых
клеток с клетками фидера (лейкоцитами донора) и позволяет изучать влияние на КОЕ-ГМ различных веществ, препаратов и физических факторов.
Клонирование клеток-предшественников эритропоэза
и мегакариоцитопоэза (БОЕЭ, КОЕЭ, БОЕ- Мгщ КОЕ Мгкц)
Для клонирования клеток-предшественников эритропоэза
(КПЭр) используют различные культуральные системы, но главным образом системы с применением плазменного сгустка, агара
или метилцеллюлозы. Получение максимально обогащенной клетками-предшественниками эритропоэза клеточной взвеси достаточно трудоемко и состоит из нескольких этапов, одним из которых
является осаждение клеток в градиентах плотности (Stephenson I. R.
et al., 1971; Tepperman A. D. et al., 1974). Культивирование КПЭр в
агаровых культурах практически не отличается от культивирования КОЕ-ГМ, однако при клонировании эритроидных предшественников необходимо внесение в культуру главного регулятора
эритропоэза — эритропоэтина (ЭРП) и некоторых кондиционных
сред (бурстстимулирующей активности — БСА), полученных в
результате стимулирования ФГА клеток селезенки или лейкоцитов (ФГА-ЛКС). Более ранние примитивные предшественники
эритропоэза называют бурстобразующие («бурст» — взрыв) единицы эритропоэза (БОЕ-Э). Они формируют в метилцеллюлозе,
оптимизированной кондиционированными средами и/или ростовыми факторами, большие агрегаты из 16 и более кластеров и содержат до 104 клеток. Более зрелые БОЕ-Э образуют малые бурсты из 3-8 кластеров и могут содержать 200-500 гемоглобинизи-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
107
рованных эритроидных клеток. КОЕ-Э (колониеобразующие единицы эритропоэза) образую! агрегаты, содержащие 100-200 эритрокариоцитов (Eaves С. I., Eaves А. С, 1978; McNiece et al, 1991).
Для идентификации клеток в эритроидных колониях и бурстах
используют также пероксидазную окраску с бензидином (Гольдберг Е. Д. и др., 1992), производят оценку колоний по способности
клеток утилизировать железо (59Fe) или проводят иммунофенотипирование для выявления маркера эритроидных клеток — гликофорнна А.
Для клонирования клеток-предшественников мегакариоцитопоэза (БОЕ-Мгкц и КОЕ-Мгкц) используют различные культуральные системы: культивирование в агаре, плазменном сгустке,
на коллагене и агарозе. Разработана система с использованием свободной от ЭТС среды, так как ЭТС, содержащая TGF-p и обычно
используемая в системах для клонирования эритроидных и гранулоцитарно-моноцитарных клеток-предшественников, ингибирует
рост мегакариоцитов (Kaushansky К.,1995; Bertolini F. et al., 1997).
Рекомбинантные цитокины, особенно тромбопоэтин, а также IL3 и
IL6, позволяют оптимизировать условия для пролиферации и дифференциации КОЕ-Мгкц. Кроме того, использование гелевых полутвердых сред па коллагене (среда Mega-Cult) позволяет клональному потомству одной клетки оставаться вместе для образования колоний. Коллаген, как считают, удобен и предпочтителен
для формирования стабильного гелевого матрикса, который поддерживает рост и развитие КОЕ-Мгкц и позволяет in situ производить иммуногистохимическую окраску колоний с использованием
антител против CD41 (маркера мегакариоцитов) после дегидратации геля. При окраске на кислую фосфатазу мегакариоциты окрашиваются в розовый цвет, а их ядра — в голубой.
Мегакариоцитарные колонии должны содержать от 4 до 50 клеток. Выделяют три типа колоний: I — колонии из 4-30 зрелых
мегакариоцитов; II — колонии из более чем 30 клеток мегакариоцитарного ростка; III — колонии из мононуклеаров, экспрессирующих маркеры мегакариоцитов и дифференцирующиеся позже в
мегакариоциты (Гольдберг Е. Д. и др., 1992).
Клонирование полипотентных коммитированных
предшественников в агаре и метилцеллюлозе
В полутвердой агаровой и вязкой метилцеллюлозной средах в
присутствии кондиционированных сред (КС) и ЭРП происходит
рост смешанных колоний - КОЕ-ГЭММ, КОЕ-ГЭМ, КОЕ-ГММ,
КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭ, КОЕ-ЭМ (Колесникова А. И., Смирнов А. Н.,
108
Часть 1. Теоретическая гематология
2002; Johnson G. R., Metcalf D., 1977; Fauser A. A., Messner H. A.,
1979). Разработаны высокоэффективные «полные» среды IMDM
на метилцеллюлозе с коктейлем из рекомбинантных цитокинов.
Компоненты этих сред поддерживают рост в культуре СКК и обеспечивают рост мультилинейных колоний (КОЕ-ГЭММ), эритроидных колоний (БОЕ-Э, КОЕ-Э), грануломоноцитарных (КОЕТМ)
и др. (Bernstein I. D. et al, 1991). «Полная» среда может включать
кроме метилцеллюлозы с IMDM эмбриональную телячью сыворотку, бычий сывороточный альбумин, 2-меркаптоэтанол, L-глютамин, ростовый фактор стволовых клеток (ФСК), ГМ-КСФ, ИЛ-3,
ИЛ-6, Г-КСФ и ЭРП. В таких системах СКК способны в течение
2-3 недель образовывать очень большие (>10 3 клеток) колонии,
состоящие только из бластов. Перенесенные в свежую среду бласты генерируют дочерние бластные колонии, демонстрируя способность к самоподдержанию. Оптимизировать рост бластных колоний, в состав которых входят СКК, можно, используя взвесь костномозговых клеток, обогащенных субпопуляциями СВ34*-клеток,
являющихся ранними предшественниками гемопоэтических клеток.
Длительные клеточные культуры
Эти культуры растут на подложке — выращенном слое стромальных клеток — фибробластов, адипоцитов, макрофагов, эндотелиальных клеток (Чертков И. Л., Гуревич О. А., 1984; Dexter Т. М.
et al., 1977). Клетки в этих культурах можно многократно пересевать, они выдерживают несколько пассажей и не теряют полипотентности (Moore M. A. S. etal, 1978; Petzer A. L. etal., 1996). Это
происходит благодаря контакту кроветворных тестируемых клеток со стромальными клетками подложки, питающими их. В длительных культурах кроме уни- и бипотентных КОЕ достигается
рост ранних гранулоцитарных, эритроидных и мегакариоцитарных
клеток-предшественников уровня КОЕ-ГЭММ, КОЕс, КОЕ-Бл,
КООБ, а также Т-лимфоцитов (Дерюгина Е. И. и др., 1990;
Fanning S. F. et al., 1993). КООБ — клетки, образующие области
«булыжника», были названы так потому, что клеточные элементы
в них тесно прилегают друг к другу. Каждая КООБ является клоном, состоящим из бластов, среди которых находятся и СКК. Кроме того, в длительных культурах на стромальной подложке выявлено большое количество мезенхимальных полипотентных клеток, которые, как известно, являются предшественниками не только
клеток стромы, но и при определенных условиях могут трансформироваться в гемопоэтические клетки (Friedenstein A. J. et al.,1968;
Репин В. С, 2001; Сухих Г. Т. и др., 2002; Seshi В. et al.. 2000).
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
109
Длительные клеточные культуры, оптимизированные жидкой
средой типа MyeloCult (Myeloid Long-term Culture Medium) (Канада), в присутствии рекомбинантных цитокинов позволяют:
1) создать слой стромальных клеток для поддержания примитивных гемопоэтических клеток; 2) охарактеризовать ростовые факторы, ингибиторы и молекулы адгезии, продуцируемые стромальными клетками; 3) проанализировать факторы, влияющие на нормальные и лейкемические клетки на модели костномозгового
микроокружения ex vivo; 4) исследовать клетки, индуцирующие
длительную культуру; 5) нарастить популяцию гемопоэтических
клеток.
При исходной плотности костномозговых клеток более 10ь на
1 мл в длительной культуре сначала образуется «прилипающий»
слой мезенхимальных стромальных клеток. Примитивные гемопоэтические клетки при наличии соответствующей среды и добавок,
условий инкубирования и графика питания, в течение многих недель взаимодействуя со стромальной подложкой, образуют миелоидные клоногенные предшественники и зрелые гранулоциты. Жидкую среду MyeloCult при добавлении кондиционированных сред
или рекомбинированных цитокинов также можно использовать
для наращивания массы гемопоэтических предшественников в свободной от стромы суспензионной культуре.
Методы клонирования гемопоэтических клеток
при гематологических заболеваниях
Разработка и внедрение методов клонирования кроветворных
клеток открыли новые возможности для понимания природы
лейкозной стволовой клетки, уровня ее поражения лейкозогенными факторами, патогенеза лейкозов (Чертков И. Л., Фриденштейн А. Я., 1966; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). Культуральные системы обеспечивают клональный рост костномозговых
клеток и делают возможным изучение процессов пролиферации и
этапов дифференцировки клеток-предшественников и их потомков в условиях ex vivo. При культивировании клеток крови и костного мозга клоногенные свойства могут проявлять как лейкозные,
так и нормальные клетки. D. Metcalf (1984) справедливо отметил,
что говорить с уверенностью о принадлежности колониеобразующих клеток в культуре к лейкозному клону можно только при
проведении кариологических, иммунофенотипических и других исследований клеток каждой отдельной колонии. Сегодня такой анализ стал возможным.
110
Часть 1. Теоретическая гематология
Колониеобразующая способность (КОС)
клеток-предшественников гранулоионоцитопоэза
при острых лейкозах
Результаты многочисленных исследований лейкозных клеток в
культуре свидетельствуют о том, что при острых нелимфобластных лейкозах (ОНЛЛ) в острой фазе заболевания клоногенные
свойства нормальных КОЕк чаще всего угнетены и имеет место
патологическое колониеобразование лейкозными клетками-предшественниками (Афанасьев Б. В., Алмазов В.. А., 1985; Bull I. M.
et al., 1973; Moore M. A. S. et al, 1974). При острых лейкозах наблюдается угнетение нормального гемопоэза и замещение нормальной
гемопоэтической ткани лейкозными клетками. В то же время при
клонировании клеток костного мозга больных малопроцентным
лейкозом было показано, что развитие панцитопении у них связано не только с вытеснением нормальных клеток, по и с высвобождением из лейкозных клеток кислых изоферритинов, ингибирующих рост нормальных гемопоэтических клеток. Экспериментально было доказано, что рекомбинантный изоферритин ингибирует
рост в культуре СКК и ККП (Cassileth P. А. 1984; Broxmeyer H. Е.
et al., 1981, 1982), а развитие колоний из нормальных КОЕк подавляется при добавлении в культуральную среду лейкозных клеток
(Spitzer G. et al., 1978; Broxmeyer H. E. et al., 1987; Olofsson Т.,
Olsson I., 1980). Кроме того, известно, что лейкозные клетки при
ОНЛЛ более чувствительны к низким дозам колониестимулирующего фактора (КСФ), чем нормальные. Возможно, это является
одной из причин преимущественного роста лейкозных клеток in
situ по сравнению с нормальными клетками, учитывая, что при
острых лейкозах, по данным некоторых авторов, клетки крови не
вырабатывают достаточного количества КСФ (Takaku E, 1982;
Metcalf D., 1984) и при снижениии уровня КСФ может возникать
«старение» нормальных клоногенных клеток (Senn I. S. et al., 1974).
Пролиферативное преимущество лейкозных клеток подтверждается высоким уровнем «тимидинового самоубийства» клеток при
ОЛ, в отличие от нормальных клеток.
При ОНЛЛ в большинстве случаев КОС и КЛОС (кластерообразующая способность) клоногенных миелоидных предшественников в агаровых культурах отсутствует или при резком снижении
КОС наблюдается повышенное кластерообразование (лейкемический тип роста) (Афанасьев Б.В., 1980; Мур М. А. С, Меткалф Д.,
1973). Колонии и кластеры могут состоять из незрелых миелоидных клеток — про- и миелоцитов или из одних миелобластов (Spitzer G. et al., 1978).
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
111
G. Spitzer с соавторами (1978) выделили три типа колониеобразования при острых лейкозах:
1. Отсутствие роста колоний и кластеров либо наличие отдельных колоний с нормальной морфологией клеток.
2. Множество мелких кластеров (до 20 клеток).
3. Агрегаты лейкозного типа с числом клеток более 20. У больных 3-й группы реже достигалась ремиссия, которая была менее
продолжительной, чаще развивалась резидуальная болезнь. Авторы сделали вывод, что характер колониеобразования может служить прогностическим признаком при лейкозе.
Б. В. Афанасьев (1980) предложил следующие типы роста КОЕк
в агаровой культуре.
1. Нормальный тип роста — КОС от 8 до 67 колоний на 1 х 101
ядросодержащих клеток. Соотношение кластер: колония менее 12.
2. Гипопластический тип роста — КОС менее нижней границы
нормы (от 0 до 7), а КлОС — менее 84.
3. Гиперпластический рост — КОС более верхней границы нормы (>67), соотношение кластер : колония не превышает 12.
4. Лейкемический рост — КОС от 0 до 7, КлОС превышает 84,
соотношение кластер : колония более 12.
Главным критерием для установления лейкемического типа роста является резкое увеличение соотношения кластер/колония.
М. A. S. Moore и соавторы (1974) отмечали наиболее высокую способность к образованию кластеров при остром промиелоцитарном
лейкозе. Это подтверждают данные М. А. Френкель и соавторов
(1994) и наши наблюдения.
Плохим прогностическим признаком считается отсутствие роста клеток в культуре или повышенное образование крупных кластеров (Moore M. A. S. et al, 1976), хотя есть и прямо противоположные сообщения.
Отмечены высокая частота ремиссий у больных с нормальным
типом роста в культуре (Moore M. A. S. et al., 1974) и плохой прогноз у больных с лейкемическим типом роста в сочетании с высокой клонирующей эффективностью (Алмазов В. А. и др. 1981; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). После проведения химиотерапии рост колоний и кластеров, как правило, отсутствует.
В период ремиссии часто происходит восстановление нормального типа колонне- и кластерообразования (Bodey L. P., Rodriguez V., 1978), а цитогенетические исследования подтверждают происхождение клеток из нормальных предшественников. Показатели КОС являются ранним прогностическим признаком реакции на
химиотерапию, гак как часто ее восстановление происходит рань-
112
Часть 1. Теоретическая гематология
ше, чем восстанавливается нормальная морфологическая картина
костного мозга (Moore М. А. S., 1976; Spitzer G. et al, 1977). Нормализация КОС и КлОС — достоверный признак, указывающий на
близкую ремиссию.
В то же время С. В. Miller и В. A. Zehnbaucer (1991) выявили у
части больных ОМЛ, обследованных ими в период полной ремиссии, характерный лейкемический рост КОЕ-ГМ. Мы ни разу не
отмечали этого, но, по нашим наблюдениям, отсутствие какого бы
то ни было роста в культуре в период ремиссии не редкость.
Острый лимфобластный лейкоз чаще всего характеризуется отсутствием роста в агаровых системах, приспособленных для КОЕГМ, или наличием небольшого числа мелких кластеров и колоний
в костном мозге и повышенным колонне- и кластерообразованием
в крови.
При использовании культуральных систем с метилцеллюлозой,
средой IMDM и рекомбинантными цитокинами при остром лейкозе наблюдается отсутствие роста нормальных КОЕ-Э, БОЕ-Э,
КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ. В то же время, как и в агаровых культурах, нередко присутствие большого количества мелких кластеров
из бластных клеток. При наступлении ремиссии происходит снижение (до исчезновения) числа бластных кластеров и появляются
нормальные эритроидные и миелоидные колонии (Atlas of Human
Hematopoietic Colonies, 1995). Рецидив ОНЛЛ часто характеризуется появлением большого количества мелких кластеров. Происходит возвращение к колониеобразованию лейкозного типа, но в
этот период наблюдается очень пестрая картина, так как в костном
мозге одновременно персистирует колониеобразование за счет нормальных КОЕк (Spitzer G. et al., 1976). Резкое снижение КОС
костного мозга обнаруживают уже за 2-8 недель до развертывания
рецидива (Greenberg P. L. et al., 1971).
С. В. Miller и В. A. Zehnbaucer (1991) на примере больных ОНЛЛ,
у которых была выполнена аутологичная ТКМ, показали, что вероятность развития рецидива острого лейкоза существенно выше
у тех из них, у кого был выявлен лейкемический тип роста колоний
в культуре.
Колониеобразующая способность КОЕ-ГМ
при хронических миелопролиферативных заболеваниях
При хроническом миелолейкозе (ХМЛ) поражение происходит
на уровне полипотентной стволовой клетки, что, в частности,
подтверждается фактом нахождения Ph'-хромосомы во всех мие-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
113
лоидных клетках и в некоторых популяциях В-лимфоцитов
(Bernheim A., Berger R., 1981). Хронический миелолейкоз до развития бластного криза (БК) характеризуется гиперпластическим типом роста в агаре КОЕк, костного мозга и особенно крови (Забелина Т. С. и др., 1980; Френкель М. А. и др., 1982).
Гиперплазия пула КОЕк и КЛОЕк у больных ХМЛ может быть
объяснена либо увеличением способности лейкемичсских клетокпредшественников к самоподдержанию, либо увеличением притока КОЕк из пула полипотентных СКК, тем более что пролиферация лейкозных клеток не увеличена и процент «тимидинового самоубийства» снижен (Забелина Т. С. и др., 1980). Все клетки в
колониях и кластерах содержат Ph'-хромосому. Морфология клеток и соотношение кластер/колония нормальное, хотя число агрегатов может быть в 500 раз больше, чем в норме. При ХМЛ наблюдается повышение уровня КСФ в сыворотке. Прогрессировать
заболевания ведет к еще большему росту КОС и КлОС, иногда с
преобладанием эозинофилытых агрегатов.
При успешном лечении количество КОЕк уменьшается одновременно со снижением числа гранулоцитов. В период ремиссии
КОС костного мозга нормализуется. В стадии БК ХМЛ количество КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ в культуре резко снижается, наблюдается лейкемический или гипопластический тип роста КОЕк, как
при ОЛ (Афанасьев Б. В. и др., 1980). Появление лейкемического
типа роста на ранних этапах, за несколько недель до начала терминальной фазы, позволяет заподозрить развитие БК ХМЛ (Афанасьев Б. В. и др., 1980; Афанасьев Б. В., 1980). В период ремиссии
БК показатели КОС и КлОС близки к таковым в хронической
стадии болезни. Типичным для ХМЛ является наличие бластных
колоний и значительное увеличение числа макрофагов.
При клонировании клеток больных ХМЛ в среде IMDM с метилцеллюлозой, оптимизированной КС или рекомбинантными
цитокинами, также наблюдается резкое увеличение всех типов миелоидных колоний, в том числе КОЕ-Э и БОЕ-Э (Atlas of Human
Hematopoietic Colonies, 1995). Для хронического миеломоноцитарного лейкоза наиболее характерен гиперпластический тип роста КОЕк, а для хронического эритромиелоза — лейкемический тип
роста в культуре.
У больных миелофиброзом найдено увеличение КОЕ-ГМ в периферической крови и у части больных — в костном мозге.
Истинная полицитемия (ИП). Это миелопролиферативное заболевание, которое характеризуется повышенной репродуктивной
способностью общей для миелопоэза клетки-предшественника.
http://www.bestmedbook.com/
114
Часть 1. Теоретическая гематология
Уровень циркулирующего КСФ при ИП повышен (Spitzer G. et al.,
1978; Eaves С. I., Eaves A. C, 1978).
По данным Л. В. Филева и соавторов (1982), в агаровой культуре клеток костного мозга больных ИП число КОЕ-ГМ и
КЛОЕ-ГМ на 1 х 10' клеток соответственно в 3-7 раз превышало
нормальные показатели. В период ремиссии данные показатели
снижались, хотя оставались высокими. Эта особенность ИП помогает в дифференциальной диагностике с симптоматическими эритроцитозами (СЭ), при которых КОС клоногенных миелоидных
клеток ниже, чем в норме, так как СЭ характеризуется угнетением
функциональной активности КОЕ-ГМ.
В метилцеллюлозе со средой IMDM, оптимизированной КС
или коктейлем рекомбинантных цитокинов, колон иеобразующая
способность БОЕ-Э и КОЕ-Э при ИП резко увеличена. Образуются колонии из созревающих эритробластов, причем более чем 10%
КОЕ-Э и БОЕ-Э продуцируют гемоглобинизированные колонии в
отсутствие ЭРП, хотя их размер, степень созревания и гемоглобинизация ниже, чем в культурах с ЭРП. Эта ненормальная эритропоэтин-незавнеимость неопластических эритроидных предшественников сохраняется даже после многих лет лечения больного, что
используют для диагностики ИП. Не так постоянно, но такие ЭРПнезависимые колонии могут развиваться и при ХМЛ и эссенциальной тромбоцитемии.
Миелодиспластический синдром (МДС)
При МДС, учитывая выраженную гетерогенность этой группы
заболеваний, наблюдается различная КОС костного мозга. G. Spitzer с соавторами (1978), L. P. Bodey, V. Rodriguez (1978) показали
3 типа роста КОЕк в агаре при МДС:
1-й — формирование нормальных колоний и кластеров с их
нормальным соотношением;
2-й — развитие колоний и кластеров как нормального, так и
лейкозного типа;
3-й — формирование клеточных агрегатов только лейкозного
типа (маленькие кластеры, состоящие из бластов, при отсутствии
колоний. Их число может быть очень большим).
У больных со 2-м и 3-м типом роста клеток в культуре острый
лейкоз развивался за 0,5-3 месяца. У остальных наблюдался постепенный переход от 1-го к 3-му типу. Число КОЕк обычно снижено, и степень снижения коррелирует с вероятностью развития
лейкоза. По мере прогрессировав ия заболевания наблюдается сме-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
115
на типа роста: нормальный —> лейкемический; гипопластический
—» лейкемический —> более лейкемический. Происходит увеличение клонирующей эффективности лейкозных бластов и нарушение созревания клеток (Афанасьев Б. В. и др., 1982). Анализ зависимости между течением МДС и характером колониеобразования
показал, что при наличии лейкемического типа роста в агаре резко
возрастает риск возникновения лейкоза (Tennant G. В. et al., 1991).
Гипопластический тип роста при МДС также является неблагоприятным, и выживаемость больных с нормальным и гиперпластическим ростом в агаре больше. При ранних вариантах МДС (РА
и РАКС) наблюдается чаще всего нормальный характер роста (Ruutu Т. et al, 1984). При клонировании клеток костного мозга больных МДС в максимально обогащенных ростовыми факторами и
интерлейкинами средах с метилцеллюлозой и средой IMDM
наблюдается резкое снижение или отсутствие КОЕ-Э, БОЕ-Э,
КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ. В некоторых случаях нормальные гранулоцитарные или эритроидные колонии соседствуют с маленькими
бластными колониями.
Апластическая анемия (АА)
Заболевание характеризуется гипопластическим типом роста
КОЕк у подавляющего большинства больных в период развернутой картины заболевания, и лишь у части больных величина КОС
близка к нижней границе нормы (Балашова В. А. и др., 1994; Абдулкадыров К. М. и др., 1995). В период ремиссии КОС костного
мозга увеличивается и может нормализоваться.
При нейтропениях различного генеза может иметь место как
нормальное, так и пониженное и повышенное колониеобразование в агаре (Афанасьев Б. В., 1980). По-видимому, происходит
нарушение гуморальной регуляции, так как в присутствии КСФ
гранулоцитарные предшественники костного мозга больных некоторыми нейтропениями начинают нормально дифференцироваться и формируют нормальное количество колоний (Barack Y.
et al., 1971). S. Nakino с соавторами (1997) показали, что
СВ34+кроветворные клетки, которые культивировали в количе6
стве 5 х 10 в течение 14 дней в метилцеллюлозе со средой IMDM
в присутствии ИЛ-3, ИЛ-6, Г-КСФ и фактора стволовой клетки,
генерировали 2 х 109 миелоидных клеток и 5 х 10' КОЕ-ГМ. Предпринимаются попытки лечения нейтропений после высокодозной химиотерапии инфузией таких клеточных популяций (Williams S. F. et al., 1996).
116
Часть 1. Теоретическая гематология
Хронический лимфолейкоз и другие лимфопролиферативные
заболевания характеризуются гипопластическим типом роста или
его отсутствием в рассмотренных выше культуральных системах,
приспособленных для миелоидной серии клеток.
Таким образом, культивирование гемопоэтических клеток позволяет:
1) производить количественную и качественную оценку пула
СКК и ККП костного мозга, периферической и пуповинной
крови;
2) изучать процессы пролиферации и дифференциации СКК и
ККП;
3) изучать процессы пролиферации и дифференциации стволовых клеток стромы костного мозга и их потомков;
4) производить дифференциальную диагностику и прогнозирование гематологических заболеваний;
5) осуществлять контроль за эффективностью и адекватностью
проводимой терапии;
6) выявлять и оценивать ростовые факторы и другие регуляторы гемопоэза, экспрессируемые кроветворными клетками в
культуре;
7) оценивать влияние на СКК и ККП различных регуляторов
кроветворения и других гуморальных и физических факторов;
8) оценить качество и жизнеспособность трансплантата при аллогенной и аутологичной трансплантации костного мозга;
9) наращивать массу СКК и ККП для различных исследований
как источника клеток для трансплантации;
10) контролировать поступление в периферическую кровь из
костного мозга миелоидных клоногенных клеток, используемых затем для пересадки.
Стимуляция костного мозга для выхода в кровяное русло стволовых и коммитированных клеток-предшественников осуществляется с помощью рекомбинантных цитокинов — нейпогена, граноцита и других миелоидных КСФ.
Культуральные исследования с целью определения количества
КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ являются одними из самых информативных
методов оценки качества трансплантата при пересадке костного
мозга, а также определения жизнеспособности криоконсервированного костного мозга и крови, предназначенных для трансплантации. Культуры клеток используют при изучении гемопоэтического потенциала пуповинной крови. Клонирование клеток пуповинной крови показало, что она является альтернативным источ-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
117
ником СКК и ККП для целей трансплантации (Абдулкадыров К. М.
и др., 2003; Нао О. L. et al, 1995; Hunt С. J. et al, 2003).
Достижения последних лет, связанные с клонированием эмбриональных стволовых клеткок (ЭСК), совершили настоящую революцию в биологии и медицине (Thomson J. A. et al., 1998). Появилась возможность крупномасштабного выращивания специализированных клеток человека, в том числе и гемопоэтических (Репин В. С, 2001; Сухих Г. Т. и др., 2002). Сегодня перспективы ЭСК
в медицине очень велики. Возможности тотипотентных ЭСК уже
используют в медицине для заместительных клеточных трансплантаций. Большое внимание привлекают сегодня исследования, связанные с мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), которые отличаются низкой антигенной активностью и наличием иммуносупрессорных белков. Поэтому применение МСК как биосырья для тканевой регенерации имеет большие перспективы в
медицине. Уже сегодня аллогенные и аутологичные пересадки МСК
используют для лечения множественной миеломы, апластической
анемии и цитопений — заболеваний, связанных с дефектами стромы (Репин В. С, 2001). Результаты культивирования эмбриональных, мезенхимальных и дефинитивных стволовых клеток в средах
с ростовыми факторами показали возможность репрограммирования стволовых клеток и направленного изменения их свойств (Дыбан А. П., Дыбан П. А., 2002).
Литература
Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, Балашова В. А. и др. Использование
лазерного и СВЧ-излучения при лечении больных злокачественными заболеваниями системы кроветворения // Эксп. онкол. 1992. Т. 14. С. 67-70.
Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, Балашова В. А. и др. Колониеобразующая
способность клеток-предшественников грануломоноцитопоэза у больных
апластической анемией на фоне различных методов лечения // Архив анат.,
гистол., эмбриол. 1995. № 3. С. 58-62.
Абдулкадыров К. М., Романенко Н. А. Организационные проблемы создания
банка пуповинной крови // Гематол. и трансфузиол. 2003. Т. 3. № 2. С. 49-53.
Алмазов В. А., Афанасьев Б. В., Кулибаба Т. Г. и др. Клонирование кроветворных
клеток при различных формах острого лейкоза в двуслойной агаровой системе //
Тер. архив. 1981. Т. 53. № 9. С, 110-115.
Афанасьев Б. В. Использование результатов клонирования клеток крови и костного мозга в двуслойной агаровой системе для дифференциального диагноза
различных заболеваний системы крови // Тер. архив. 1980. Т. 52. № 9. С. 71-76.
Афанасьев Б. В., Сайдали М. А., Зарицкий А. Ю. и др. Пролиферация и созревание гемопоэтических клеток больных хроническим миелолейкозом в стадии
бластного криза // Проблемы гематол. и перелив, крови. 1980. № 4. С. 15-21.
Афанасьев Б. В., Кулибаба Т. Г., Забелина Т. Н. и др. Клонирование кроветворных клеток больных с различными формами гемопоэтических дисплазнй в
Глава 7
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АНОМАЛИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ
Немецкие ученые Arnold (1879) и von Hansemann (1891) еще в
конце XIX в. первыми начали анализировать хромосомы. В начале
XX в. исследователи попытались не только определить число и
форму хромосом, но и установить их роль в неопластических процессах. Первый труд, обобщающий работы в этой области, был
опубликован Boveri в 1914 г. Согласно его представлениям злокачественно перерожденные клетки характеризуются аномалиями в
структуре хроматина. Современная же цитогенетика берет свое
начало с 1956 г., когда Tjio и Levan установили истинное диплоидное число хромосом — 46 и описали основные морфологические
характеристики хромосом. В 60-е гг. было проведено множество
исследований, посвященных изменениям хромосом опухолевых
клеток.
Американские ученые P. S. Nowell и D. A. Hungerford в 1960 г.
описали первый генетический маркер опухоли — делению примерно половины длинного плеча одной из хромосом G группы в клетках крови больных хроническим миелолейкозом. Измененную хромосому назвали филадельфийской (Ph'), по названию города, где
ее обнаружили. Rubkin и соавторы в 1964 г. с помощью цитоспектрофотометрического метода измерения количества ДНК установили, что в Ph'-xpoMoco.vie отсутствует около 40% генетического
материала.
Огромные возможности для идентификации как нормальных,
так и измененных хромосом человека появились после того, как
были внедрены в практику новые методы дифференциального
окрашивания хромосом. Сначала был предложен метод флюоресцентной окраски с помощью кинакрина — Q-окраски, затем — R-, С-,
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах 123
G-окрасок препаратов хромосом, в результате которых каждая хромосома приобретает специфическую исчерченность, позволяющую
ее идентифицировать.
В 1971 г. на Парижской конференции была предложена Международная классификация хромосом человека и их исчерченности
(ISCN, 1971). В 1981 г. опубликована используемая до сих пор
стандартная номенклатура нормальных хромосом человека (ISCN,
1981).
Если первоначально цитогенетические исследования проводили преимущественно в случаях гематологических неоплазий, то в
последнее время, благодаря развитию методов интерфазной цитогенетики, возросла интенсивность исследований солидных опухолей. Одновременно с накоплением данных цитогенетических исследований в 80-е гг. получены результаты молекулярно-биологпческих исследований, которые значительно расширили наши
представления о механизмах неопластических процессов.
Основные термины
Кариотипом называют совокупность определенного вида и числа митотических хромосом данного индивидуума. В норме соматические клетки человека содержат диплоидный (2и = 46), а половые
клетки — гаплоидный (п = 23) наборы хромосом. У мужчин и женщин одинаковый набор (22 пары) аутосомных хромосом, 23-я пара — половые хромосомы: у женщин — XX, у мужчин — ХУ.
Хромосома разделена центромерой на два плеча: длинное — q и
короткое — р. По положению центромеры хромосомы делятся на
метацентрическис, субметацентрические и акроцентрические. В метацентрических хромосомах центромера располагается приблизительно посередине р- и q-плечи приблизительно одинаковой длины. В субметацентрических хромосомах центромера занимает промежуточное положение и р-плечо по длине гораздо короче q-плеча.
В акроцентрических хромосомах центромера находится в верхнем
конце q-плеча. На концевых участках хромосомы располагаются
теломеры. С их помощью хромосомы сохраняют свою морфологию и не соединяются друг с другом.
Парижская номенклатура предназначена для описания по единой форме линейной структуры каждой хромосомы. Ее обозначение строится на следующих принципах. Каждая хромосома рассматривается как непрерывная совокупность сегментов, независимо от их окраски. Хромосомные плечи (р и q) подразделяются па
районы (regions), а районы, в свою очередь, на сегменты (bands) —
участки хромосом, четко отличающиеся от соседних по интенсив-
124
Часть 1. Теоретическая гематология
ности окраски. Районы и сегменты нумеруются арабскими цифрами — от центромеры к теломере, отдельно для каждого плеча. По
этой системе обозначение индивидуального сегмента включает
информацию о хромосоме, плече и районе, в котором он находится.
Так, символ 1р22 означает второй сегмент в районе 2 короткого
плеча хромосомы 1. Если возникает вопрос о выделении субсегментов того или иного сегмента, для их обозначения вводят следующий ряд цифр, принцип нумерации остается прежним.
Известны следующие структурные изменения кариотипа:
1) транслокация (t) — обмен участками между хромосомами (чаще
двумя); 2) делеция (del) — утрата хромосомой части своего материала; 3) инверсия (inv) — поворот района в пределах одной хромосомы на 180°; 4) инсерция (ins) — включение в хромосому нового материала; 5) изохромосома (i) — хромосома, состоящая из двух
одинаковых плеч; 6) дериват (der) — измененная хромосома.
Численные изменения кариотипа — это наличие дополнительных или потеря целых хромосом, что обозначается соответственно
знаком «+» или «-». Клетки с числом хромосом более 46 называют
гипердиплоидными, а менее 46 — гиподиплоидными. Выявление
структурной аномалии в двух и более клетках свидетельствует о
наличии клонального нарушения. Обнаружение дополнительных
хромосом в двух и более клетках, а потеря — в трех и более говорит
о численном нарушении кариотипа.
Стандартное цитогенетическое исследование позволяет анализировать весь хромосомный набор клетки целиком. При этом стоит помнить, что даже при максимальном разрешении этот метод
способен выявить только сравнительно крупные аномалии хромосом (размером > 10 6 -10' пар оснований ДНК) и что анализируются
только клетки в митозе. В ряде случаев эти ограничения удается
преодолеть с помощью молекулярно-генетических методов.
Наиболее широкое применение для молекулярной диагностики
гемобластозов получили методы FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) и ПЦР (полимеразная цепная реакция).
FISH основан на способности хромосомной ДНК-мишени связываться с отрезками ДНК-зонда, содержащими комплементарные ДНК-мишени последовательности. ДНК-мишенью при FISH
является ядерная ДНК интерфазных клеток или ДНК метафазных
хромосом, нанесенных на стекло. Визуализация гибридизовавшихся зондов проводится при помощи флуоресцентной микроскопии.
С помощью FISH возможно определение нормальной или аномальной локализации гена, числа его копий и наличия хромосомных перестроек. Следует заметить, что при помощи FISH-метода
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
125
возможен анализ только тех участков хромосом, молекулярные
зонды которых используются, а не всего хромосомного набора, как
при цитогенетическом исследовании. Недавно разработано многоцветное спектральное кариотипирование (multicolor spectral
karyotyping - SKY), основой которого является метод FISH.
ПЦР — метод амплификации (многократного копирования)
специфических последовательностей ДНК с помощью специфического фермента — термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-noлимераза). ПЦР представляет собой циклический процесс, включающий фазы денатурации ДНК, отжига (присоединение праймеров) и синтеза заданных участков ДНК. В каждом цикле ДНК
происходит удвоение числа копий исследуемого участка, что позволяет по истечении 25-30 циклов накопить в реакционной смеси от 10''до 109 молекул ДНК заданной длины (обычно 150-900 оснований) и известной нуклеотидной последовательности. Чувствительность ПЦР метода высока: он позволяет обнаружить одну
опухолевую клетку со специфической ДНК- или РНК-последовательностью среди 10'-10" нормальных клеток. ПЦР является чрезвычайно быстрым, дешевым и чувствительным методом обнаружения минимальной резидуальной болезни.
Клиническое и биологическое значение
хромосомных аберраций при гемобластозах
К настоящему времени накоплена обширная информация по
хромосомным аномалиям. Общее число случаев новообразований
с описанными хромосомными нарушениями составляет более
26 тыс., причем 73% из них относятся к лейкозам и другим гематологическим заболеваниям.
Анализ хромосом при этих состояниях вошел в перечень обязательных исследований как на этапе диагностики, так и в динамике
заболевания. Некоторые геномные нарушения строго ассоциируются с характерной клинической и иммунологической картинами,
посредством чего обеспечивают основу для определения подтипа
заболевания. Во время диагностики кариотип является также важным прогностическим фактором. Современные терапевтические
схемы оказывают огромное влияние на прогноз при острых лейкозах (ОЛ), где 2/3 детских и 1/4 взрослых пациентов имеют длительную безрецидивную выживаемость. Цитогенетические исследования повышают количество надежных прогностических факторов, способствующих подбору адекватной терапии этим пациентам
по распространенным схемам. Корреляцию между кариотипом,
126
Часть 1. Теоретическая гематология
прогнозом и диагнозом при ОЛ впервые продемонстрировали
L. Seeker-Walker и соавторы в 1978 г. и подтвердили многие исследователи. Отмечалось, что цитогенетическая картина всегда информативнее других показателей относительно прогноза заболевания. Особенно значимы обнаружения специфических хромосомных нарушений, изменений модального числа хромосом и, наконец,
присутствие или отсутствие клональных аномалий.
В настоящее время разрабатывается генетическая классификация лейкозов, которая объединяет и дополняет предшествующие,
основанные только на фенотипических особенностях опухолевых
клеток. Генетическая классификация выделяет группы гемобластозов, имеющих одинаковые генетические аномалии, сходство морфологии, иммунофенотипа и биологических свойств опухолевых
клеток. Основой генетической классификации является комплекс
цитогенетических и молекулярно-генетических методов исследований. Это позволяет более точно определить степень злокачественности опухоли и прогноз заболевания.
Хромосомные нарушения при остром лимфобластном
лейкозе
Изучение хромосомных аномалий при остром лпмфобластном
лейкозе (ОЛЛ) представляется крайне важной задачей. Цитогенетический анализ случаев ОЛЛ долгое время был связан со значительными методическими трудностями из-за плохой морфологии
метафазных хромосом, патогномичной для лимфобластных клопов. Усовершенствование методик позволило установить изменения кариотипа примерно у 70% (55-90%) больных, причем, в отличие от других форм лейкозов, модальное число хромосом при
ОЛЛ — самостоятельный прогностический признак.
У 25-30% пациентов клоны клеток содержат более 50 хромосом. Этот кариотип ассоциирован с pre-B/common иммунофенотипом.
Гипердиплоидия (и > 50 хромосом), как правило, ассоциируется с наибольшей продолжительностью первой ремиссии и высокой безрецндивной выживаемостью (медиана составляет 50 месяцев). Предполагается, что гипердиплоидные клетки высокочувствительны к терапии фазовоспецифичными противоопухолевыми
препаратами вследствие большой продолжительности S-фазы. Почти в половине случаев гипердиплоидии п > 50 обнаруживаются
дополнительные структурные хромосомные аберрации. Чаще других встречаются: t(9;22), t(4;ll) и iso(17q). Наличие в кариотипе
опухолевых клеток перечисленных неслучайных структурных ано-
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемоблаетозах
127
малий обусловливает у таких пациентов возникновение ранних
рецидивов или плохой ответ на терапию.
Промежуточный прогноз заболевания характерен для группы
больных с модальным числом хромосом в лейкозных клетках — от
47 до 50 (гипердиплоидия п = 47-50). Довольно сложно оценить
прогноз у пациентов с околотриплоидным набором хромосом из-за
недостаточного числа подобных наблюдений. По некоторым данным, случаи с околотетраплоидным набором хромосом часто ассоциируются с Т-клеточным фенотипом ОЛЛ и могут иметь неблагоприятный прогноз. Наиболее часто в трисомии вовлекаются следующие хромосомы: 4, 6, 10, 14, 17, 18, 21 и X. Дополнительные
структурные аномалии, как правило, являются типичными для
ОЛЛ.
Частота встречаемости гиподиплоидии (и < 46) при ОЛЛ составляет 7-8%. Как правило, такие клоны характеризуются высокой злокачественностью и резистентностью к химиотерапии.
Основной интерес относительно патогенетической роли хромосомных нарушений при ОЛЛ все же сконцентрирован вокруг структурных аберраций. В настоящее время при ОЛЛ описано около
40 типичных хромосомных нарушений. Некоторые из них, наиболее характерные, приведены в табл. 2 с указанием иммунофенотипа лейкозных клеток и генов, вовлекающихся в аберрации.
Среди выявляемых маркеров важное диагностическое и прогностическое значение имеет филадельфийская (Ph') хромосома
(рис. 2).
rrtt
19
20
Рис. 2. Кариограмма пациентки М. Ы. Ю.: 46, XX, t(9;22)(q34;qll)
128
Часть 1. Теоретическая гематология
Таблица 2
Первичные хромосомные аберрации при ОЛЛ
Нарушение
Вовлекаемые гены
Типичный иммунофенотип
t(l;ll)(p32;q23)
AF1P;MLL
Mixed lineage
t(l;19)(q23;pl3)
РВХ!;Е2А
Mixed lineage
Dup(l)(ql2-21q31-32)
Не определены
Prc-B, B-cell
t(2;8)(pl2;q24)
IGK;MYC
t(4;ll)(q21;q23)
AF4:MLL .
B-cell
Early B-precursor,
Biphenotypic
del(6q)
MYB
B- or T-lineage
+8
Не определены
B- or T-lineage
t(8;14)(q24;qll)
MYCTCRA/
TCRD
T-lineage
t(8;14)(q24;q32)
MYC;IGH
B-cell
t(8;22)(q24;qll)
MYCIGL
B-cell
del(9p)
Не определены
B- or T-lineage
T/dic(9;12)(pll-13)
Не определены
Pre-B
i(9q)
Не определены
Pre-B
t(9;22)(q34;qll)
ABL;BCR
B-lineage.
t(10;14)(q24;qll)
HOXlhTCRD
T-lineage
t(ll;14)(pl5;qll)
RBTN1:TCRD
T-lineage
t(ll;14)(pl3;qll)
RBTN2;TCRD
T-lineage
T/dcl(12p)
He определены
B- or T-lineage
t(14;18)(q32;q21)
TGH;BCL2
B-lineage
i(17q)
He определены
Mixed lineage
-20
He определены
B-lineage
+21
He определены
B-lineage
Выявляется она в три раза чаще .у взрослых больных, чем при
детских ОЛЛ. Встречаемость Ph'-маркера у взрослых пациентов с
ОЛЛ составляет 15-20%, а у детей — 5%. Характерны высокий
лейкоцитоз с большим количеством бластных клеток и поражение
центральной нервной системы (ЦНС). Ph'-хромосома при ОЛЛ,
как и при хроническом миелолейкозе (ХМЛ), образована вследствие реципрокной транслокации между дистальными частями
длинных плеч хромосом 9-й и 22-й пар: t(9;22)(q34;ql 1). На хромосоме 9 в области поломки находится с-abl онкоген, который вследствие транслокации переносится на 22-ю хромосому и соединяется с находящимся там bcr-геном. В итоге на хромосоме 22 образуется новый химерный ген bcr-abl, белковый продукт которого
обладает повышенной тирозинкиназной активностью.
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
129
Цитогенетически Ph'-хромосома у больных ОЛЛ и ХМЛ не
отличается. Однако молекулярно-генетические исследования показывают, что уровень поломки bcr-гена может быть различным.
Обнаружены два основных типа перестройки данного гена при
ОЛ. Один из них точно такой же, как и при ХМЛ, когда образуется
белок р 210-bcr-abl, кодируемый мРНК длиной 8,5 kb, Ь2-а2. Другой вариант поломки — внутри первого нитрона bcr-гена. При этом
образуется белок р 190-bcr-abl, кодируемый мРНК длиной 7,5 kb,
el-a2.
Наличие клонов с t(9;22) определяет крайне неблагоприятный
прогноз заболевания. Полную ремиссию удается получить примерно у 60% пациентов, медиана ремиссии составляет 5-10 мес, а
3-летняя выживаемость — всего 13%. У некоторых больных Ph'-хромосома отсутствует при цитогенетическом исследовании, тогда как
на молекулярном уровне обнаруживается типичная t(9;22). Следовательно, для молекулярио-генетической диагностики и мониторинга Ph'-позитивного ОЛЛ целесообразно использовать кроме
цитогенетического анализа молекулярные методы: ГЩР или FISH.
Иммунологически больные с Ph'-позитивными ОЛЛ чаще имеют
смешанную лимфоидную и миелоидную картину, чем пациенты с
другими хромосомными нарушениями (исключая ОЛЛ с 1 Iq23
поломкой).
Аберрации, затрагивающие ii(q23), встречаются при различных формах острых лейкозов. Обусловлено это тем, что данные
аномалии происходят в полипотентной стволовой кроветворной
клетке, которая способна дифференцироваться как в миелоидную,
так и в лимфоидную линию. При ОЛЛ перестройки, вовлекающие'
11(q23), в число которых входят r(4; 11 )(q21;q23), t( 1; 11 )(p32;q23),
t(6;l I)(q21;q23),t(ll;19)(q23:pl3) и del(llq23), встречаются в 1015% случаев и ассоциированы с pre-pre-В-иммунофенотипом бластов и плохим прогнозом.
Наиболее важная цитогенетическая патология, которая встречается у 5% взрослых больных ОЛЛ, — транслокация t(4;il)
(q21;q23) (рис.3).
Пациенты характеризуются очень высоким лейкоцитозом с
большим числом бластов и выраженной опухолевой инфильтрацией органов. Это нарушение впервые обнаружено Oshimura с соавторами в 1977 г. и впоследствии описано как типичное для ОЛЛ
Van Den Berghe с соавторами в 1979 г. На Ilq23 картирован ген
MLL, на 4q21 — ген AF4. Вследствие транслокации на der(ll)
образуется химерный ген AF4/MLL. Данная аномалия кариотипа
выявляется чаще у молодых пациентов с недифференцированным
5 Гематология. Нов. справочник
130
Часть 1. Теоретическая гематология
'
4
5
Ц II
п\
13
**»
19
14
15
14
20
16
*•
21
12
17
18
§*
|а
22
ху
Рис 3. Кариограмма пациента Р. А. А.: 46. XY. t(4;ll)(q21;q23)
иммунологически фенотипом лейкоза. Lampert с соавторами обнаружили у больных с t(4;l 1) перестройку генов тяжелых цепей иммуноглобулинов, что позволяет говорить о В-клеточной природе
заболевания. Описаны также врожденные ОЛЛ с t(4;ll). При наличии у пациентов этой аберрации прогноз заболевания крайне
тяжелый. Ремиссии удается достичь примерно у 50-60% больных,
а ее продолжительность составляет всего 3 месяца. Для мониторинга минимальной резидуальной болезни можно использовать
методы ПЦР и FISH.
Для больных ОЛЛ характерны нарушения кариотипа, затрагивающие хромосому 8-й пары, где расположен с-тус онкоген, и
области локализации генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов - 2р12,14q32 и 22qll. Образуется t(2;8)(pl2;q24) и ее варианты: t(8;14)(q24;q32), t(8;22)(q24;qll), которые приводят к активации онкогена с-тус, увеличивающейся его транскрипции и, в
конечном счете, к неопластической трансформации. Иммунологически характерен В-клеточный вариант. Для пациентов с описанными выше аберрациями типичны поражение ЦНС, гепатоспленомегалия, лимфаденопатия, резко повышенные уровни мочевой
кислоты и лактатдегидрогеназы в крови. Ранее такие нарушения
кариотипа относили к прогностически неблагоприятным хромосомным аномалиям. Используя современные протоколы терапии,
полную ремиссию удается достичь у 86% взрослых больных, а
3-летняя выживаемость у них составляет 74%.
Для больных с Т-клеточным вариантом ОЛЛ типичными являются изменения кариотипа, затрагивающие точки локализации ге-
http://www.bestmedbook.com/
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
19
131
20
Рис. 4. Кариограмма пациента С. Ю. В.: 46, XY. del8(q24)
нов Т-клеточных рецепторов. Примером может служить t(8;14)
(q24;qll), при которой с-тус онкоген патологически экспрессирован. В результате слияния генов MYC, картированного на 8(j24, и
TCRD, локализованного на 14q, образуется химерный ген, кодирующий протеин с новыми свойствами. Эта транслокация обусловливает крайне тяжелый прогноз заболевания (медиана выживаемости составляет 5 месяцев).
Приблизительно у 5% больных ОЛЛ встречается изолированная делеция del8(q24), которая также ассоциируется с крайне неблагоприятным прогнозом заболевания (рис. 4).
Делеция длинного плеча 6 хромосомы (del 6(q21)) (рис. 5) является характерным нарушением для ОЛЛ и встречается у 5-10%
пациентов. На уровне 6q21-24 располагается онкоген c-myb, гиперэкспрессия которого обнаруживается во всех случаях заболеваний
с del6(q21). Большей частью аномалия встречается при common
ОЛЛ. Прогноз заболевания при данном нарушении кариотипа относительно благоприятный, медиана выживаемости составляет
около 38 месяцев.
Однако описываются случаи обнаружения del6(q) и при ОНЛЛ
и ХМЛ. В этих случаях пациенты часто имеют дополнительные
хромосомные нарушения.
Данная аномалия обнаруживается при всех вариантах ОНЛЛ,
но чаще наблюдается при ОНЛЛ Мб (26% всех eq-ОНЛЛ случаев). Как правило, уровни поломок находятся на ql2 27. причем в
80% наблюдений вовлекается 6q21—23 район. Экспрессия c-myb
обнаруживается во всех случаях.
132
Часть 1. Теоретическая гематология
Н h
,#
10
13
14
»
i
11
12
17
15
18
22
Рис. 5. Кариограмма пациентки К. А. С: 46, XX, del 6(q21)
?! U tl
1
2
ti it м
6
7
8
" M «I
13
J
19
14
II 4
3
15
4
it I* >f
10
*i
16
••
*
20
21
11
41
17
12
|>;
18
**1 1
22
x
Рис. 6. Кариограмма пациентки Я.Р. А.: 46, XX, t(l;19)(q23;pl3)
Транслокация t(l;19)(q23;pl3) (рис. 6) встречается в 3% всех
случаев ОЛЛ с кариологическими нарушениями.
Это нарушение ассоциируется с pre-B-ОЛЛ фенотипом. Молекулярные особенности t(i;19) в настоящее время до конца не изучены. Однако известно, что аберрация приводит к слиянию Е2А
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
133
гена, картированного на 19р13, с РВХ1 геном, расположенным на
Iq23. Dedera и соавторы обнаружили в экспериментах на животных, что данный химерный ген индуцирует не только пролиферацию и апоптоз, но и злокачественные лимфомы у животных.
Прогностические особенности t(l;19) не совсем ясны, однако
большинство исследователей показывают, что данная аберрация
обусловливает неблагоприятный исход заболевания. У большинства больных рецидив наступает в течение года после достижения
ремиссии.
Транслокация t(12;21)(pl3;q22) — наиболее часто встречающаяся при В-клеточном ОЛЛ аномалия кариотипа у детей. Она
является криптической (скрытой), не выявляющейся при стандартном цитогенетическом исследовании. Данная аберрация выявляется при помощи молекулярно-генетических методов исследования в 19-27% детских ОЛЛ. У взрослых описаны лишь единичные
случаи. На молекулярном уровне вследствие транслокации образуется химерный ген из генов TEL (12р13) и AML1 (21q22). Клинически данная транслокация ассоциируется с возрастом больных от
1 до 10 лет, относительно невысоким лейкоцитозом (<50 000/мкл),
хорошим ответом на терапию и практически 100% безрецидивной
выживаемостью пациентов.
Нарушения кариотипа больных острым нелимфобластным
лейкозом
В настоящее время клональные аномалии хромосом обнаруживаются у 70-80% нелеченных больных с ОНЛЛ. Встречающиеся
хромосомные нарушения носят неслучайный характер — наблюдается определенное соответствие между типом цитогенетической
аберрации и типом лейкоза по FAB-классификации. Установлено
два основных типа нарушений: сбалансированные аберрации —
реципрокные транслокации и инверсии, а также несбалансированные — потеря целой хромосомы и/или ее части. Наиболее часто
встречающиеся нарушения кариотипа при ОНЛЛ представлены в
табл. 3.
Важное клиническое значение имеет реципрокная аберрация
t(8;21)(q22;q22) (рис. 7), обнаруживающаяся у 7-8% всех наблюдаемых пациентов с ОНЛЛ и у 46% с М2 вариантом ОНЛЛ. Данная аберрация редко наблюдается при Ml, М4 и М5 ОНЛЛ.
В транслокацию вовлекаются гены AML1, расположенный на 21-й хромосоме, и ЕТО (eight twenty one), картированный на 8-й хромосоме. Так образуется слитый химерный ген AML1/ETO. и молекулярно-генетические исследования показывают, что располагается
Часть 1. Теоретическая гематология
134
Таблица 3
Первичные хромосомные аберрации при ОНЛЛ
Вариант заболевания*
Типичные хромосомные нарушения
Ml
del или t с 3q26 и 1р36, 2р13-22, 5q31-35
М2
t(8;21)(q22;q22)
t(6;9)(p23;q34) (с базофилией)
del(2)(p23)Hdel(2)(p21)
МЗ
t(15;17)(q22;q21)
М4
inv(16)(pl3q22) (с эозинофилией)
t(16;16)(pl3;q22) (с эозинофилией)
del(16)(q22)
del или t e l l q23
М5
del или t 1 Iq23 (напр. t(6;ll)(q27;q23),
t(9;ll)(p21;q23),
t(10;ll)(pl5;q23)
t(3;3)(q21;q26) (с нарушениями тромбоцитов
и мегакариоцитов)
Мб
inv(3)(q21;q26)
del(2O)(qll)
dup( 1 q)
* При всех вариантах заболевания встречаются следующие аберрации:
del(5q); -7 или del(7q): +8
If И Ji
IS M
3
it* it H
и
8
If
4b
И U
10
11
»l
13
17
I ft
Я Я
19
20
22
Si
Рис. 7. Кариограмма пациентки Ж. О. С: 46, XX. t(8;21)(q22; q 22)
-5 или
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
135
он всегда на der(8) хромосомы. Локализация точек разрывов в
обоих генах у различных больных примерно одинаковая, что
приводит к формированию только одного типа РНК-транскриптов.
Транслокация t(8;21) чаще обнаруживается у молодых больных. Примерно у 70% больных мужчин с t(8;21) в кариотипе обнаруживается дополнительная потеря Y-хромосомы, а у 25% женщин — Х-хромосомы.
У 90% пациентов с данной аберрацией удается получить полные ремиссии, а около 60% больных живут 5 лет и более, что указывает на благоприятное прогностическое значение данной аномалии.
Реципрокная t(15;17)(q22;q21) является высокоспецифическим маркером МЗ варианта ОНЛЛ (рис. 8). Эта хромосомная аберрация встречается почти в 100% всех наблюдаемых ОПЛ (острых
промиелоцитарных лейкозов).
Впервые она описана в 1975 г. в лаборатории Rowley. В 1987 г.
ген, кодирующий рецептор ретиноевой кислоты (RARa), был картирован на участке 17 q21 хромосомы. На хромосоме 15, в локусе
15q22, — идентифицирован ген PML. Вследствие t( 15; 17) они объединяются в химерный ген PML/RARa. Хотя разрывы гена RARa
на 17-й хромосоме всегда происходят в интроне 2, точки разрыва
!
1
2
* *
II
1 у
*•
f f
6
К
13
7 «
7
а
*
li
4
* ; /
10
14
11
*
1*
.•V
16
••».
н
с;
12
••* « г
*ч
\
17
•*
18
• .
19
20
21
22
X
Рис. 8. Кариограмма пациентки М. Е. Л.: 46, XY, t(15;17)(q22;qll)
Часть 1. Теоретическая гематология
136
на 15-й хромосоме группируются в двух разных интронах и одном
экзоне гена PML. Это приводит к появлению различных слитых
белков, для которых еще не придумано общепринятых названий.
Корреляции между локализацией точек разрыва в гене PML и клиническими характеристиками, такими как морфология, ответ на
проводимую терапию и выживание, пока не обнаружено.
Последние данные показывают, что ген PML/RARa может доминантно делокализовать PML-ген из его нормального ядерного
положения, и этот процесс устраняется действием трансретиноевой кислоты. Научные открытия в области онкологии редко бывают настолько исключительными, что немедленно меняют лечебную тактику н существенно улучшают понимание механизмов
заболевания. Однако открытие специфической молекулярно-генетической аномалии рецепторов к ретиноидам и универсальная эффективность трансретиноевой кислоты при лечении больных ОПЛ
существенно углубили научное понимание патогенеза лейкоза и
радикально изменили подходы к терапии этого заболевания.
r
Нарушения 16-й пары хромосом — (in\ (16)(pl3;q22),
t(16;16)((pl3;q22), del(16)(q22) (рис. 9)) являются характерными
аберрациями для пациентов с ОНЛЛ М4Е и М4 вариантами. На
молекулярном уровне и при inv(16), и при t( 16; 16) происходит
слияние фрагментов гена CBFb, локализованного в районе 16q22,
и гена MYH11, картированного на 16р13. Продукт химерного гена
CBFb/MYHl 1 является фактором транскрипции.
Обнаружение перечисленных аномалий ассоциируется с хорошим прогнозом заболевания и длительной безрецидивной выживаемостью. Полные ремиссии удается получить у 90% пациентов с
19
20
21
22
x
Рис. 9. Кариограмма пациента Д. А. М.: 46, XY, del(16)(q22)
у
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
137
данными аберрациями, а медиана выживаемости составляет 80 месяцев.
При стандартном цитогенетическом исследовании обнаружение inv( 16) и t( 16; 16) часто затруднено. Надежно диагностировать
перечисленные аномалии позволяют молекулярно-генетические
методы исследования ПЦР и FISH.
У больных М5 вариантом ОНЛЛ изменения кариотипа прежде
всего касаются длинного плеча хромосомы 11 (в локусе q23-24).
Впервые эта связь была установлена Berger и соавторами в 1982 г.
Кроме изолированной делении del H(q23) (рис. 10) обнаружено,
что с хромосомой 11 -й пары могут вступать в реципрокные обмены
различные хромосомы — 1, 2, 6, 10, 17, 19 и др.
Наиболее известная перестройка, в которую вовлекается 1 Iq23, —
это t(9;ll)(p22;q23). Впервые она была описана Rowley и соавторами в 1975 г. Kabwinski и соавторы провели сравнительный анализ заболевания у больных ОНЛЛ с патологией длинного плеча
11 -й хромосомы и с другими изменениями кариотипа. Было отмечено, что t(9;ll) обнаруживается только у больных ОНЛЛ М5
вариантом.
Больные с повреждениями 11-й хромосомы отличаются более
молодым возрастом, высоким уровнем лейкоцитов в периферической крови, более частой встречаемостью геморрагических осложнений и нейролейкемией. Больные нуждаются в более интенсивной терапии.
Ряд изменений хромосом, такие как потеря из кариотипа целой
или части хромосомы 5-й пары и/или 7-й пары, встречается как у
< 1
ii
Рис. 10. Кариограмма пациентки С. А. Б.: 46, XX, dell I(q23)
Часть 1. Теоретическая гематология
138
i *
1
•+
1
i
•
i
2
7
-rf
8
9
14
15
1
21
*
22
12
и
<1-2
17
16
"It "«I
20
i !« It
w
I g ft I h
19
10
"ITS
13
%
4
3
•
6
Ш
*-«;
1 4
(—-
18
^ j
X
L
1
у
Рис. 11. Кариограмма г [ациентки М. Н . A.: 46. XX, de!5(q31)
больных ОНЛЛ, так и у пациентов с ОЛЛ. Примером таких нарушений может служить кариограмма больной ОНЛЛ с del5(q31)
(рис. 11).
Характерной особенностью данных цитогенетических патологий является то, что они выявлены у пациентов с вторичными
острыми лейкозами, индуцированными воздействиями ионизирующей радиации, алкилирующих агентов и других мутагенов.
Однако эти нарушения описаны и при de novo острых лейкозах.
У пациентов с потерей из кариотипа части или целой хромосомы
5-й и/или 7-й пар отмечены общие клинические особенности.
А именно — резистентность или непродолжительный ответ на проводимую терапию и плохой прогноз. Смерть больных наступает,
как правило, на ранних стадиях заболевания вследствие тяжелых
инфекционных или геморрагических осложнений.
Изменения кариотипа при хроническом миелолейкозе
Приблизительно у 95% больных с клинико-морфологическими
признаками хронического миелолейкоза (ХМЛ) выявляется специфический маркер — филадельфийская (Ph') хромосома, образующаяся в результате реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql 1).
Примерно в 5% случаев Ph'-хромосома является результатом сложных или простых вариантных (атипичных) транслокаций t(9;22).
При сложных транслокациях в перестройках участвуют три и более хромосом, причем две из них — 9-я и 22-я — постоянно.
В большинстве случаев диагноз ХМЛ можно поставить и без
цитогенетического исследования, на основании клинико-гематологнческих данных. Однако нередко необходимо дифференциро-
Глава /. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
139
вать ХМЛ с другими гематологическими заболеваниями (например, «ювенильный» ХМЛ, хронический миеломоноцитарный лейкоз), и обнаружение Ph'-хромосомы или химерного гена BCR/ABL
помогает подтвердить диагноз.
Огромное значение имеет цитогенетическое исследование и при
мониторинге эффективности терапии больных ХМЛ препаратами
интерферона. Для ХМЛ характерна связь между эволюцией кариотипа и прогрессированием заболевания. Так, у большинства больных (70%) за 3-6 месяцев до развития властного криза появляются дополнительные к Ph'-хромосоме структурные и/или численные хромосомные аберрации: +8, +19, +17, дополнительная Ph'хромосома, iso(17q), t(3;21) и другие. На рис. 12 представлена
кариограмма больного ХМЛ (бластный криз) с Ph'-хромосомой и
рядом дополнительных нарушений.
ТТ
4
Ч1
I i
IT
5
i I"H"it
Рис. 12. Кариограмма пациента 3. А. Я.: 46, XY. -7, t(9;22)(q34;qll),
dei(der9)(p21),+mar
Для оценки минимальной остаточной болезни при ХМЛ можно
использовать молекулярно-генетические методы ПЦР и FISH.
Хромосомные аномалии,
выявляемые при миелодиспластическом синдроме
При миелодиспластическом синдроме (МДС), как и при лейкозах, клоновый характер кроветворения подтверждается вместе с
другими характеристиками и цитогенетическими исследованиями, при помощи которых у пациентов обнаруживаются те или иные
хромосомные аберрации. Нарушения кариотипа выявляются приблизительно у 60% больных с МДС. Среди аномалий преобладают
Часть 1. Теоретическая гематология
140
ftt)
ft 'He
13
14
19
20
15
16
21
17
18
x
y
22
Рис. 13. Кариограмма пациентки М. Е. А.: 46, XX, del 7(q31)
**DC(2;21)
1
6
2
3
d e i ; 6 q i
7 tJel<7q)
13
ШИК
}
14
*-1
19
м, м2 м3
\
2 0 -20
g
и
9
*9
15
10
11
16
н*—тИ w» * •
21
\
-21
22
12
17
'!•
™
18
г<
х
Л
*
(
"-1
у
Часе
Рис. 14. Кариограмма пациентки Д. 3. Я.: 46, ХО, -4.+9.-13.+14-17,-20,-21,-Х,
DC(2 ; 21),add5(q36),del6(q21),del7(q31), +М1.+ М2, +МЗ, асе
потери целой или части хромосом и трисомии. Реже наблюдаются
транслокации (кроме случаев вторичных МДС).
Наиболее частыми изменениями кариотипа при первичном МДС
являются потеря хромосом 5-й и 7-й пар, дополнительная 8-я хромосома и делеции длинного (q) плеча хромосом 5-й. 7-й и 20-й пар
(около 30% всех исследованных пациентов). Кариограммы некоторых из них представлены ниже.
Для вторичного МДС характерны потеря целой и/или части
7-й и/или 5-й хромосом (рис. 13). Кроме этого, приблизительно у
50% больных встречаются комплексные нарушения кариотипа.
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
141
h г - » Ь*~гн I]
ИМИ H - * i •-Ж-т-HI-*--** И
if
-8
8
-:Д
13
^-10
10
9
11
-15
14
15
16
17
18
<§>., (
19
20
-°
21
22
1
-22
~-DC(8;10)(q24:p15)
Рис. 15. Кариограмма пациентки С. А. А.: 46, XX, -2,add4(pl6), -8,+ 10,+ 12,
-14,-15,-20,-22,DC(8;10)(q24;pl5),+Ml.+M2.+M3,+M4
1
2
aer(2j
3
'—*—I
9
13
19
14
20
15
21
22
10
11
12
16
17
18
x
у
Рис. 16. Кариограмма пациента Ю. В. Ц.: 45, XY, -12,t(2;5)(p24;ql4),del8(pl2)
Примерами таких изменений могут служить кариограммы двух
пациентов (рис. 14, 15). Делеция 5q при вторичном МДС редко
обнаруживается как изолированное нарушение (рис. 16). Значительно чаще, чем при первичном МДС, встречаются изменения
12р, 3 q n l l q .
Имеются данные, что у больных с МДС и нормальным кариотипом риск трансформации в ОЛ меньше и сроки выживаемости
142
Часть 1. Теоретическая гематология
больше, чем у больных аномалиями хромосомы 7-й, 8-й и 11-й.
Относительно благоприятным считается прогноз заболевания в
тех случаях, когда выявлены клоны клеток с единственной перестройкой: 5q- или 20q-. Обнаружение клона с комплексными нарушениями кариотипа является крайне неблагоприятным прогностическим признаком.
Нарушения кариотипа при множественной миеломе
У больных множественной миеломой аномалии кариотипа обнаруживаются, по различным сообщениям, в 20-60% исследованных случаев. Из них у 30% пациентов обнаруживается гиподиплоидия, у 30% — псевдодиплоидия и у 30/о — гипердиплоидия. Типичными для данного варианта заболевания являются: моносомия 13, трисомии 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19.
Среди структурных нарушений чаще других выявляется 14q+ маркер, присутствующий у 30% пациентов с цитогенетическими аномалиями. В перестройки вовлекается локус 14q32, аберрации которого при молекулярно-гснетическом исследовании FISH обнаруживаются у 75% больных с аномальным кариотипом в два раза
чаще, чем при цитогенетическом. Как правило, локус
14q32 вовлекается в транслокацию t( I I;14)(ql3;q32).
Приблизительно у 30% пациентов с аберрациями выявляются
аномалии 1р11-22. С вовлечением данного локуса описаны транслокации, делеции — терминальная и интерстициальная, а также
частичная дупликация.
Наилучший прогноз заболевания у больных с нормальным кариотипом. Огромное прогностическое значение имеют некоторые
структурные нарушения. Так, резистентны к терапии пациенты с
t(l I;14)(ql3;q32), частичной или полной потерей 13-й хромосомы,
делецией длинного плеча 11-й хромосомы. Крайне неблагоприятным прогностическим признаком являются множественные нарушения кариотипа.
Заключение
Необходимо подчеркнуть, что в настоящее время прослеживается четкая тенденция к активному расширению исследований по
изучению хромосомных аномалий при гемобластозах. Это связано
с тем, что большинство сообщений, позволивших установить прогностическое значение различных аберраций, относится к 90-м годам XX в. Изменения в терапевтических режимах, очевидно, потребуют внесения корректив в прогностические оценки значимое-
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
143
ти цитогенетических исследований. Кроме того, далеко не все часто встречающиеся хромосомные аномалии описаны в достаточной
степени. Для некоторых из них отсутствуют данные о прогностической ценности и диагностическом значении. Важной задачей
представляется также определение редких вариантов хромосомных нарушений и генов и/или онкогенов, расположенных вблизи
точек разрывов.
Так как события, происходящие на генетическом уровне, лежат
в основе любой лейкозной трансформации и опухолевой прогрессии, определение кариотипа больных гемобластозами как важного
прогностического фактора является патогенетически обоснованным. Интенсификация лечения сопряжена с целым рядом осложнений, следовательно, определение прогностических групп риска,
в том числе и цитогенетических, становится все более важным.
Накопление сведений о прогностической роли генетических аберраций при гемобластозах в условиях использования интенсивных
программ лечения позволит применять данные цитогенетического
исследования для адекватного выбора современных методов лечения.
Известно, что препараты метафазных пластин, полученные из
опухолевых клеток, отличаются плохим качеством хромосом. В настоящее время в лабораторной практике исследователи используют компьютерные анализаторы изображений, что позволяет значительно упростить и ускорить цитогенетическое исследование.
Такая система анализа изображений, которая в течение последних
нескольких лет используется нами, помогает не только улучшить
качество исходного изображения, но и выводить результаты исследования на. печать, создавать базу изображений и результатов
анализа.
Литература
Генкин А. А. Новая информационная технология анализа медицинских данных.
СПб.. 1999. С. 24-32.
Кобзев Ю. Н., Домрачева Е. В. Молекулярная цитогенетика в диагностике острых лейкозов и миелодиспластических синдромов. 1996. Т. 4. С. 32-38.
Кобзев Ю. Н., Флейшман Е. В. Хромосомные изменения при гемобластозах:
Руководство для врачей. 2001. С. 92-114.
Сергеев А. Г., Иванов Р. А. Генодиагностика лейкозов: Пособие для врачей. 1998.
An Atlas of Malignant Haematology. 1997. P. 5-25.
Appelbaum F. et al. The biology and treatment ol acute myeloid leukemia //
Haematology. Education Program Book. 1998. P. 15-43.
BergerR., Bemheim A., DanielM.-T. Karyotypes and cell phenotypes in acute leukemia
following other diseases // Blood Cells. 1993. V. 7. P. 93-299.'
Глава 8
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ
Ни один раздел современной науки не обходится без иммунологических исследований. В гематологии эти исследования ведутся по следующим основным направлениям: исследование особенностей иммунного статуса больных, где используются общеиммунологические методы; иммунофенотипирование лейкозной клетки,
позволяющее уточнить диагноз; иммуногематологические исследования, изучающие антигены и антитела составных частей крови.
Некоторые аспекты клинической иммунологии
Как известно, главной функцией иммунной системы является
иммунологический надзор за постоянством внутренней среды организма и элиминация чужеродных агентов как экзогенной, так и
эндогенной природы. В выполнении этой задачи участвуют гуморальный и клеточный иммунитет, системы фагоцитов, комплемента и др. Все эти компоненты выполняют свои функции в тесном
взаимодействии друг с другом.
Нарушения иммунитета прежде всего проявляются в развитии
иммунодефицитных состояний, которые бывают первичными (генетически детерминированными) и приобретенными, или вторичными (например, СПИД). Проявлением нарушений в иммунной
системе являются также различные аутоиммунные заболевания,
связанные с отменой толерантности и нарушением распознавания
«своего» и «чужого». Под вторичными иммунодефицитами подразумевают такие нарушения иммунной системы, которые возникают через какой-то определенный промежуток времени после рождения, и их развитие связано с воздействием на организм какоголибо повреждающего фактора (например, лучевая, цитостатическая
терапия).
146
Часть 1. Теоретическая гематология
В основе изучения клеточного иммунитета лежит количественное определение Т-лимфоцитов и их субпопуляций, идентификация продуцируемых ими цитокинов и выявление способности осуществлять эффекторные функции. К тестам гуморального иммунитета относят определение уровня сывороточных и секреторных
иммуноглобулинов. Выделяют также факторы неспецифического
иммунитета, к которым относят фагоцитоз, системы комплемента
и естественных клеток-киллеров (ЕК).
Развитие современной техники оценки различных клеточных
субпопуляций связано с двумя крупными научно-техническими
достижениями: созданием панели моноклональных антител (МАТ)
к различным поверхностным антигенам клеток и разработкой нового типа проточных цитофлуориметров. В настоящее время с помощью МАТ идентифицировано множество поверхностных антигенов лимфоцитов. В большинстве случаев определены их молекулярная масса, химическая структура и функция. Лейкоцитарные
антигены называют кластерами дифференцировки и обозначают
буквами CD и соответствующим номером. На 7-м Международном рабочем совещании (2000 г.) обозначено уже около 200 кластеров дифференцировки лейкоцитов, включая антигены лимфоцитов, моноцитов/макрофагов, миелоидных клеток, ЕК-клеток, рецепторы к цитокинам и колониестимулирующим факторам.
Наиболее значимыми поверхностными маркерами для определения Т-лимфоцитов являются CD3 и CD7, для Т-хелперов и
Т-цитотоксических/супрессорных клеток — CD4 и CD8 соответственно. Для характеристики В-лимфоцитов используют маркеры CD19,
CD20, CD21, CD22, CD24 и CD72, а также определяют экспрессию поверхностных иммуноглобулинов (slg). Для ЕК-клеток применяют маркеры CD 16, CD56 и CD57. Однако следует помнить,
что CD16 — низкоаффинный Fc-рецептор — присутствует практически на всех гранулоцитах и на некоторых моноцитах. Маркерами миелоидных клеток являются CD13, CD 14 (экспрессируется
на моноцитах), CD15 и CD33. На мегакариоцитах и тромбоцитах
экспрессированы молекулы CD41 и CD42, которые играют существенную роль в адгезии тромбоцитов в месте повреждения сосудов. Наиболее важными маркерами гемопоэтических стволовых
клеток являются CD34 и CD117. Кроме того, на всех кроветворных клетках выявляются молекулы CD45. Для большинства цитокинов в настоящее время также установлены рецепторы в соответствии с кластерами дифференцировки (Фрейдлин И. С, Тотолян А. А., 2001).
Наилучшим методом выявления поверхностных маркеров является проточная цитофлуориметрия. Она позволяет дифферен-
Глава 8. Иммуногематология
147
пировать большое число субпопуляций лимфоцитов в очень короткие сроки. Определение осуществляется по двум параметрам:
интенсивности свечения лимфоцитов, окрашенных МАТ. конъюгированными с флуоресцентными красителями, и размерам и зернистости, позволяющим дифференцировать лимфоциты от нейтрофилов и моноцитов. С помощью проточной цитометрип осуществляют идентификацию клеток, определяют частоту их встречаемости и количественные характеристики. При использовании
двухцветной цитофлуориметрии имеется возможность получить
информацию о двух и более антигенах на одной и той же клетке.
Например, при сепарации гемопоэтической стволовой клетки можно установить уровень ее дифференцировки: CD34 CD33 или
CD34 CD33+.
Определение уровня иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM, IgD и
IgE) является очень важным при диагностике и клиническом мониторинге иммунодефицитов, моноклональных гаммапатий, аутоиммунных заболеваний и других патологических состояний. Так, IgG
является особенно активным против грамотрицательных бактерий,
токсинов и вирусов. С помощью IgG-антител микробы и чужеродные клетки агглютинируются и лизируются. Комплемент взаимодействует с СН1- и СН2-доменами IgG. С помощью СН2- и
СНЗ-доменов IgG взаимодействует с Fc-рецептором макрофагов,
моноцитов, нейтрофилов, киллеров и клеток плаценты. IgG состоит
из 4 подклассов, которые отличаются количественно. Наибольшим
по количеству является IgG 1, наименьшим — IgG4. IgA нейтрализует вирусы и бактериальные токсины, может активировать систему
комплемента. В секретах слизистых оболочек IgA находится в димерной форме. Секреторный IgA имеет два вида Н-цепи: od и а2. Он
выявляется в слюне, молозиве и грудном молоке. Концентрация IgA
у детей первых лет жизни очень низка и только к 10-14 годам приближается к уровню взрослых. IgM с эволюционной точки зрения
является старейшим. Он образуется на ранних этапах иммунного
ответа и совместно с комплементом лизирует бактерии и другие
чужеродные клетки. При первичном контакте с антигеном синтезируются сначала IgM-, а затем IgG-антитела. При повторном введении того же антигена IgG-аптитела синтезируются быстрее и в большем количестве, чем IgM, который в сыворотке находится в виде
пентамера и имеет наибольший молекулярный вес.
Иммуноглобулин Е относится к минорным компонентам сывороточных Ig. После секреции В-клетками IgE присоединяется к тучным клеткам и базофилам с помощью Fc-фрагмента. При взаимодействии IgE с антигеном происходит освобождение вазоактивных
148
Часть 1. Теоретическая гематология
аминов из этих клеток, т. е. он является главным иммуноглобулином, участвующим в аллергических реакциях. Полагают, что
IgE-антитела участвуют в борьбе против паразитарных инфекций.
Иммуноглобулин D является рецепторным иммуноглобулином
только В-лимфодитов, и наличие сывороточного IgD рассматривается как результат сбрасывания рецепторного IgD с В-клеток
при их активации. В настоящее время накапливаются данные, что
IgD может местно синтезироваться в подслизистых оболочках
слюнной железы. Иными словами, так же, как секреторный IgA,
этот класс иммуноглобулинов выполняет определенную роль при
защите слизистых оболочек от инфекционных агентов.
Экзо- или эндогенные антигены могут образовывать в организме иммунные комплекы с соответствующими антителами. Этот
процесс может стать причиной системной или органной патологии. Судьба циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) зависит от их величины и индивидуальной активности фагоцитирующей системы. Антитела в составе иммунных комплексов могут включать каскад активации комплемента. Кроме того, IgG- и IgM-антитела
могут оказывать влияние на функции клеток, связываясь с их
Fc-рецепторами. Концентрация ЦИК, как правило, повышена при
системных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях (лепра,
шистозоматоз), а также при злокачественных новообразованиях.
Величина и состав их зависят как от свойств антигена, так и от свойств
антител, и в то же время от их абсолютной и относительной концентрации. Соотношение антиген : антитело в составе ЦИК зависит от
относительных концентраций обоих компонентов. Принято считать,
что ЦИК, возникающие в условиях небольшого избытка антигена,
представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплементактивирующей способности.
Цитокины — это множество факторов полипептидной природы,
синтезируемых стромальными (фибробласты, эндотелий), дендритными, эпителиальными, нейроэндокринными и другими видами
клеток. Однако основными продуцентами цитокинов являются активированные клетки иммунной системы. Цитокины осуществляют регуляцию всего многообразия межклеточных взаимодействий
при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении и межсистемных взаимодействиях. В основе механизма их действия лежит свойство вызывать дифференцировку, пролиферацию и программируемую гибель клеток — апоптоз.
Наиболее важные характеристики цитокинов:
1. Индуцибельность - генетически детерминированная зависимость выработки цитокинов от стимулирующих воздействий.
Глава 8. Иммуногематология
149
Индукция экспрессии генов цитокинов или усиление их активности, приводящее к усиленному синтезу цитокинов, происходит под
влиянием внешних факторов (микроорганизмов, их продуктов, конкретных антигенов, других цитокинов).
2. Локальность функционирования - действие цитокинов происходит в определенном микрообъеме (местно), куда проникает
инфекционный агент (носитель антигена) и где активируются клетки-продуценты цитокинов и клетки-мишени. В норме цитокины,
образуемые при первичном иммунном ответе, практически не поступают в кровоток, и только при патологии их содержание в сыворотке крови повышается.
3. Избыточность - каждый тип клеток способен продуцировать
несколько цитокинов и каждая разновидность цитокинов может
секретироваться разными клетками. Цитокины избыточны в биологических свойствах, для них характерна полифункциональность
с сильным перекрыванием эффектов.
4. Взаимосвязанность и взаимодействие компонентов. Цитокины оказывают сильное влияние на выработку друг друга, они могут как усиливать продукцию цитокинов, вызванную другими агентами, так и ингибировать ее, проявляя плейотропность.
В соответствии с особенностями структуры цитокинов и цитокиновых рецепторов их разделяют на несколько основных семейств:
гемопоэтины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических
предшественников; интерфероны (ИНФ), осуществляющие естественную защиту организма от вирусов; факторы некроза опухоли
(ФИО), обладающие провоспалительными, иммуностимулирующими и многими другими свойствами; хемокины, привлекающие в
очаг воспаления лимфоциты и лейкоциты из циркулирующей крови; «бессемейственные» цитокины, не отнесенные пока к какомулибо семейству (Ярилин А. А., 1997).
Исходя из общих закономерностей функционирования системы цитокинов, представители разных семейств могут оказывать
однотипные воздействия на клетки и представители одного семейства — вызывать разные эффекты. Так, в регуляции гемопоэза участвуют не только гемопоэтины, но и ФНО и ИНФ. А в реакции
воспаления провоспалительные свойства проявляют не только
ФНО и ИНФ, но и целый ряд интерлейкинов (ИЛ), относящихся
к другим семействам.
В группу провоспалительных цитокинов включают ИЛ-1, ИЛ-6,
ИЛ-8, ИЛ-12, ФНОа, ИНФ и др. Они действуют на HMMVHOKOMпетентные клетки на ранней стадии воспалительного ответа, участвуют в запуске специфического иммунного ответа и в его эффекторной
150
Часть t. Теоретическая гематология
фазе. Альтернативную группу представляют противовоспалительные
цитокины: ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, тканевой фактор роста (ТФР) и др.
Цитокины оказывают существенное влияние на гемопоэз, регулируя процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза
клеток. В зависимости от характера этого влияния их условно разделяют на позитивные и негативные регуляторы гемопоэза. К позитивным относятся те факторы, которые поддерживают пролиферацию полипотентных стволовых клеток, эритроидных, миелоидных и лимфоидных предшественников, стимулируя соответствующие ростки кроветворения. Это, прежде всего, фактор стволовой клетки, различные колониестимулирующие факторы, зритропоэтин и целый ряд интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4,
ИЛ-6, ИЛ-11 и др.). Другие цитокины (ФИО, ИНФ, ТФР), напротив, могут снижать клоногенность всех типов предшественников
гемопоэтических клеток, в силу чего их относят к негативным регуляторам гемопоэза. Цитокины являются наиболее многочисленной группой биологически активных веществ, влияние которых на
процесс апоптоза считается доказанным. Так, выявлена большая
группа цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-3, ИЛ-10, факторы роста),
при действии которых на клетку запускается эндогенная программа защиты клеток от апоптоза, опосредованная через белки Вс1-2,
Bcl-х и др. Тем не менее ряд цитокинов обладает способностью
индуцировать апоптоз (ФНОа, ИНФ-у, ИЛ-1 и др.); при этом
наиболее апоптогенным цитокином считается ФНОа.
Таким образом, цитокины характеризуются полифункциональностью, плейтропностью, действуют в синергизме друг с другом
или являются антагонистами и в зависимости от условий могут
оказывать как ингибирующее, так и стимулирующее действие на
клетки. Регуляторные эффекты цитокиновой сети построены на
равновесии оппозитных пулов молекул, нарушение которого, по
всей видимости, ведет к патологии.
Иммуногематология — раздел иммунологии и гематологии, изучающий антигены и антитела составных частей крови, их роль в
организме, а также патологические состояния, связанные с иммунологическими реакциями. Иммуногематология как наука появилась в 1900 г., когда проведенные 32-летним венским ученым
К. Ландштейнером исследования по изучению антител эритроцитов человека привели к открытию групповых, а затем и резусантигенов и впервые позволили эффективно и безопасно осуществлять переливание крови.
Этот успех, пожалуй, оставался единственным достижением
иммуногематологии в течение полувека, пока в середине 50-х го-
Глава 8. Иммуногематология
151
дов, продолжая идеи К. Ландштейнера, J. Dosset, R. Payne и
J. van Rood, не начали изучать антитела к ядерным клеткам крови — лейкоцитам, что привело к открытию главного комплекса
гистосовместимости и стало огромным вкладом в успешное развитие трансплантации органов и тканей в качестве лечебного метода.
Главный комплекс гистосовместимости, или major histocompatibility complex (MHC) — генетическая система, ответственная за развитие специфического иммунного ответа. У человека эта
система получила название HLA — human leukocyte antigens "человеческие лейкоцитарные антигены, поскольку впервые они
были обнаружены на белых клетках крови.
Первый антиген системы HLA — MAC — открыл в 1958 г. J. Dosset, который в 1980 г. был удостоен Нобелевской премии (Доссе Ж., 1959). Кроме него наибольший вклад в развитие учения об
этой системе внесли R. Cepellini, впервые предложивший на основании семейного анализа концепцию о существовании единой
генетической системы; J. van Rood, впервые показавший многоаллельность системы и предложивший компьютерную обработку
результатов серологических реакций, и P. Terasaki, разработавший микролимфоцитотоксический тест, который до настоящего
времени является основным методом серологического исследования.
Вторая Нобелевская премия за изучение системы HLA была
присуждена в 1996 г. Zinkernagel и Doherty за установление роли
молекул главного комплекса гистосовместимости в иммунном ответе — так называемую теорию «двойного распознавания» — своего и чужого для организма. Присуждение за столь короткий период двух наиболее престижных наград мирового научного сообщества свидетельствует как о чрезвычайно быстром прогрессе в
изучении этого раздела медицинской науки, так и об огромной
важности этих открытий.
Генетическая структура системы HLA
Гены, кодирующие молекулы HLA, локализуются на коротком плече 6-й хромосомы, занимая участок, вмещающий более
4000 пар нуклеотидов, и состоят из трех групп генов — I, II и III
класса. К I классу относятся гены локусов А, В, С («классические»,
открытые первыми), а также Е, F, G, Н. Во II класс входят гены
локусов DR, DQ, DP, а также DO, DM, TAP, MICA. И к III классу
относятся гены, собственно генами комплекса гистосовместимо-
Часть 1. Теоретическая гематология
152
сти не являющиеся (но расположенные на 6-й хромосоме между
классами I и II): это гены компонентов комплемента С2 и С4, белков теплового шока HSP70, факторы некроза опухоли и некоторые
другие (Histocompatibility testing, 1993).
Наследование генов HLA происходит по ко-доминантному типу — ребенок наследует половину признаков от отца и половину —
от матери. Это позволяет использовать HLA-фенотип в качестве
маркера при установлении спорного отцовства в судебной медицине.
Продукты HLA-генов — мембранные гликонротеины. Здесь молекула I класса состоит из а-цепи и Р-2 микроглобулина, а молекула II класса состоит из а- и (З-цепей. Молекулы как I, так и II
классов являются трансмембранными гетеродимерами, имеющими внутриклеточную и внеклеточную части. Большинство вариабельных аминокислотных остатков сосредоточены в верхней части молекулы, где она образует глубокую полость, или бороздку для
связывания чужеродного пептида. Продукты различных HLA-генов отличаются друг от друга по аминокислотным последовательностям и, следовательно, по конфигурации антигенсвязывающей
бороздки.
Экснрессированы молекулы HLA I класса практически на всех
ядросодержащих клетках организма. Наибольшее количество этих
молекул представлено на лимфоцитах. Молекулы HLA II класса
экспрессированы на так называемых профессиональных антигенпредставляющих клетках — это дендритные клетки,-В-лимфоциты
и макрофаги.
Функции продуктов ШЛгенов
Первичная роль адаптивной иммунной системы заключается в
распознавании и элиминации различных агентов, которые могут
причинить вред организму. Важной особенностью этой функции
является то, что иммунная система должна правильно выявить
различия между собственными (безвредными) и чужими (потенциально вредными) антигенами. Молекулы МНС играют ключевую роль в том процессе, посредством которого организм проводит
разделение на молекулярном, клеточном, а возможно, и организменном уровне между собственными и чужими элементами.
Эта роль определяется основными биологическими функциями
продуктов HLA-гснов, к которым в настоящее время относят: определение молекулярного репертуара Т-клеточных антигенных рецепторов; презентацию пептидов Т-клеткам; регуляцию цитотоксической активности ЕК-клеток; защиту вынашиваемого плода.
Глава 8. Иммуногематология
.
153
МНС и селекция репертуара Т-клеточного рецептора. Распознавание Т-клетками антигенов, несущих генетически чужеродную
информацию, осуществляется антигенными рецепторами Т-клеток. Для развития адекватного иммунного ответа Т-клеточный рецептор должен четко отличать «свое» от «чужою», и при непосредственном участии МНС-молекул в тимусе происходит «позитивная» и «негативная» селекция репертуара Т-клеточного рецептора,
в результате которой Т-клстки, обладающие повышенной аутореактивностью или, наоборот, не распознающие собственные антигены, подвергаются апоптозу. В результате окончательный репертуар слабоаутореактивных Т-клеток содержит рецепторы, которые
распознают изменение собственных МНС, вызванных воздействием «чужих» пептидов, в нем отсутствуют рецепторы, которые распознают немодифицированные собственные МНС-молекулы или
аутологичные пептиды, связанные с собственными МНС-молекулами.
Презентация антигенов Т-клеткам является второй важной
функцией МНС-молекул. Т-клеточные рецепторы распознают комплекс, который состоит из пептида, связанного внутри бороздки
МНС-молекулы. Конфигурация этой комбинации определяет аффинитет данного комплекса для набора Т-клеточных рецепторов и
последующей активации Т-клеток. Большинство чужеродных пептидов, представляемых Т-клеточным рецепторам МНС-молекулами, образуются из более крупных белковых цепей путем частичного переваривания в специализированных цитоплазматических образованиях — эндосомах внутри клеток. Две молекулы Т-клеточной
дифференцировки — CD8 и CD4 — прямо взаимодействуют с молекулами МНС I и II классов соответственно и участвуют в Т-клеточной активации и иммунной функции клетки-эффектора.
Комплекс молекулы HLA I класса — пептид взаимодействует с
CD8'Т-клетками. Пептиды, презентируемые молекулами I класса,
происходят преимущественно из протеинов, которые продуцируются самими клетками. Этот путь назывется эндогенным путем
презентации антигена. CD8 T цитотоксические Т-лимфоциты первично распознают и убивают аутологичные клетки, которые экспрессируют чужеродные вирусные или другие антигены. При аллогенной трансплантации цитотоксические Т-лимфоциты также убивают ал.тогенные клетки-мишени, экспрессирующие как чужие
молекулы HLA I класса, так и чужие пептиды.
Основной функцией HLA II класса является презентация CD4*
клеткам пептидов, которые происходят из экзогенных источников. Данная популяция Т-клеток включает клетки, которые могут
154
Часть 1. Теоретическая гематология
функционировать или как Т-хелперы при продукции антител В-клетками, или как регуляторные клетки, регулирующие продукцию
цитокинов, в зависимости от типа сигналов, которые Т-клетки
получают во время их активации. В этом случае чужеродные белки, микроорганизмы и другие антигены захватываются антигенпрезентирующими клетками и перерабатываются в пептиды внутри цитоплазматических эндосом. CD4" клетки необходимы для
начального распознавания экзогенных пептидов таким образом,
чтобы клеточные и гуморальные ответы были направлены на элиминацию внедрившегося агента (Ройт А. и др..'2000).
Регуляция активности естественных клеток-киллеров. Естественные киллеры — ЕК-клетки — весьма разнообразная и широкая популяция лимфоцитов, которая осуществляет прямую цнтотоксичпость, антнтелозависимую клеточную цитотоксичность. а
также вырабатывает провоспалительные цитокины — такие как
ИНФ, ФНО и колониестимулирующие факторы. ЕК-клетки, которые являются фактором врожденного иммунитета, в эволюционном отношении являются «двоюродными братьями» Т-клеток.
Функция ЕК-клеток как цитотоксических клеток заключается в
особом свойстве убивать некоторые типы опухолевых клеток-мишеней in vitro, но точный механизм распознавания был неизвестен в течение многих лет. В настоящее время установлено, что
ЕК-клеточная активация угнетается присутствием молекул МНС.
Каждая ЕК-клетка имеет множественные рецепторы распознавания, которые активируют или ингибируют эффекторную функцию. Рецепторы активации распознают широко распространенные
структуры клеточной поверхности, такие как некоторые Fc-рецепторы. Рецепторы ингибиции распознают общие («публичные») эпитопы HLA-молекул, включая Bw4 эпитоп, некоторые продукты
генов локуса HLA-C и неклассические HLA-молекулы — HLA-E и
HLA-G.
Защита вынашиваемого плода. Во время внутриутробного развития плод, являющийся своего рода аллотрансплантатом, защищен от иммунной агрессии со стороны иммунной системы матери
благодаря наличию разнообразных механизмов. Местно вырабатываемые гормоны плаценты — стероиды и гонадотропные гормоны хориона — обладают иммуносупрессивным действием. В дополнение классические продукты генов I класса — HLA А, В и С —
не экспрессированы на клетках трофобласта плаценты, в интерфейсе соприкосновения плода и матери.
Следовательно, Т-клетки должны быть индифферентны в отношении трофобласта и плода. Однако ЕК-клетки в большом коли-
Глава 8. Иммуногематология
155
чес i ве находятся в плаценте и по всем правилам должны бы были
атаковать HLA-негативные клетки трофобласта. Причиной, почему они не распознают эти клетки, по-видимому, является наличие
двух специализированных молекул I класса - HLA-G и -Е, которые в значительном количестве экспрессированы в тканях трофобласта. Преимущественным сайтом для распознавания одного из глав-,
ных ингибиторных рецепторов ЕК-клеток являются HLA-E-MOлекулы. Таким образом, неклассические HLA-молекулы - HLA-E
и -G - играют специальную биологическую роль - предохраняют
развивающийся плод от атак как Т-клсток, так и ЕК-клеток (Abbas A. et al., 1991).
Популяционная иммуногенетика
HLA-система невероятно разнообразна, у человека насчитывается более тысячи аллельных специфичностей. У индивидуума
может быть до 22 различных классических продуктов HLA-генов,
функционирующих как лиганды Т-клеточного рецептора.
Яркие примеры необходимости функционального разнообразия продуктов HLA-генов представляют исследования генетически замкнутых популяций индейцев Центральной и Южной Америки. Народы Северной Азии, которые заселили Северную и Южную Америку примерно 30 тыс. лет назад, разделились на отдельные
племена, поселившиеся в различных географических и экологических зонах. Изучение HLA в этих изолятах в 1970-е годы показало наличие очень ограниченного числа продуктов HLA-генов
I класса на основании серологического типироваиня. Это ограничение заставляет предположить, что популяции имели либо очень
высокий уровень смертности до или после заселения, либо крайне
ограниченное число родоначальных особей (эффект основателя).
Примечательно, что последующее изучение HLA-генов у изолированных туземных американских популяций с использованием метода секвенирования показало, что внутри ранее наблюдавшихся ограниченных специфичностей имеется большее количество аллельных вариантов. Основным механизмом создания
разнообразия в течение относительно короткого периода (столетий) является конверсия генов, при которой небольшие участки
нуклеотидов других HLA-аллелей внутри HLA-комнлекса замещают существующую последовательность в гене. Этот процесс воссоздает репертуар продуктов HLA-генов для эффективной защиты
от патогенов, которые существуют в новой окружающей среде (Коненков В. И., 1999).
156
Часть 1. Теоретическая гематология
Таким образом, теоретически набор продуктов HLA-генов, обнаруженных у большинства нелинейных индивидуумов, имеет достаточное разнообразие для того, чтобы дать возможность Т-клеткам распознавать пептиды любого патогена. Избыточность функции — отличительный признак иммунной системы, позволяющий
снизить опасность того, что новые микробные мутации смогут победить хозяина.
HIA и болезни
Поскольку характер иммунного ответа во многом определяется
индивидуальным HLA-генотипом, естественно предположить, что
это может оказывать существенное влияние на течение различных
заболеваний. В 1973 г. появилось сообщение о поразительной по
силе ассоциации между HLA-B27 и анкилозирующим спондилитом: оказалось, что более 80% больных имеют эту специфичность.
В последующем были изучены сотни заболеваний на предмет связи с HLA и обнаружены статистически значимые ассоциации более чем для 50 из них (Rodey G., 2000).
За некоторыми исключениями, HLA-ассоциированные заболевания у людей — это незлокачественные хронические заболевания.
Важной характеристикой многих из них являются аутоиммунные
проявления. Большинство болезней имеет мультифакторную этиологию, вовлекая несколько генов и один или более факторов внешней среды. Многие из этих заболеваний, по-видимому, инициируются микроорганизмами.
Клиническая значимость HLA-ассоциаций - это возможность
диагностировать или предсказать вероятность развития заболевания у индивидуума на основании типирования. Оценка силы ассоциаций между HLA-фактором и заболеванием определяется путем
расчета относительного риска развития заболевания. При этом важно, чтобы и больные, и группа сравнения принадлежали к одной и
той же расовой и этнической группе, так как частота HLA-антигенов в различных популяциях варьирует.
В 1980-е гг. картирование комплекса HLA было неполным, поэтому полагали, что комплекс содержит кроме собственно HLA-генов гены иммунного ответа, которые определяют восприимчивость
к заболеванию. В настоящее время известно, что большинство феноменов, приписываемых ранее генам иммунного ответа, по-видимому, являются функциональными характеристиками известных
генов I и II классов.
Поскольку главные функции HLA-молекул включают презентацию антигенов Т-клеткам и селекцию репертуара Т-клеточного
Глава 8. Иммуногематология
157
рецептора, логично предположить, что восприимчивость к некоторым заболеваниям отражает нарушение этих процессов. Определенные унаследованные HLA-молекулы могут, в частности, эффективно презентировать аутологичные пептиды (или микробные
пептиды, которые имеют сходство с аутологичными), что приводит к развитию аутоиммунного заболевания (HLA in health and
disease, 2000).
С другой стороны, финальный репертуар Т-клеток, отобранный
набором HLA-молекул данного индивидуума, может не включать
рецепторы, распознающие те или иные вирусные пептиды, что является необходимым для распознавания и удаления вируса. Нарушение может привести к хронической вирусной инфекции.
Заболевания, при которых HLA-молекулы напрямую влияют
на их развитие либо из-за нарушения связывания определенных
пептидов, либо из-за избыточного связывания, — это анкилозирующий спондилит и сахарный диабет 1 типа. Анкилозирующий спондилит ассоциирован с HLA-B27 во всех изученных популяциях.
Аллели восприимчивости характеризуются специфическим «карманом» в пептид-связывающей бороздке, который аккомодирован
к восприятию боковой цепи аргинина. Другие заболевания, ассоциированные с В27, включают болезнь Рейтера, передний увеит,
некоторые формы постинфекционных артритов, связанные с грамотрицательными организмами (Salmonella, Yersinia, Shigella,
Neisserid).
Ревматоидный артрит ассоциирован с очень специфическими
HLA-аллелями: DRBl*0401, *0402, *0404, *0408, и, менее часто, с
DRBl*0101 (кавказоиды), *0405 (японцы) и *1402 (американские
индейцы).
Аллель HLA-DRB1*O3 является маркером генетической предрасположенности ко многим аутоиммунным заболеваниям (сахарный диабет 1 типа, системная красная волчанка, диффузный токсический зоб, аутоиммунный тиреоидит). Объяснение этого факта, по-видимому, заключается в особенностях биохимической
структуры рецепторов, кодируемых данным аллелем: связывающий участок является высокоаффинным, но низкоспецифичным
по отношению к антигенам. Так, более 90% больных сахарным диабетом 1 типа (жители Санкт-Петербурга) имеют в своем генотипе
аллели-провокаторы DRB1*O3 и DRB1*O4, при этом те больные, у
которых встречаются оба этих аллеля, значительно чаще заболевают в более раннем возрасте — до 15 лет. У больных диффузным
токсическим зобом при наличии в генотипе сочетания DRB1*O3 и
DQAl*0501 риск развития эндокринной офтальмопатии увеличн-
158
Часть 1. Теоретическая гематология
вается в 10 раз (Глазанова Т. В. и др., 2002). Механизм HLA-accoциированности аутоиммунных заболеваний рассматривается как
предпочтительное связывание аутоантигенных пептидов и представление их потенциально аутореактивным клеткам.
Значение иммуногематологии
для трансплантации органов и тканей
Одно из важных достижений иммуногематологии XX в. — это
открытие в начале века групп крови, которое позволило успешно
осуществлять переливания крови, а открытие в середине XX столетия антигенов гистосовместимости сделато реальным преодоление иммунологического барьера при трансплантации других органов и тканей.
Открытие новых HLA-специфичностей главного комплекса гистосовместимости шло одновременно с изучением их влияния на
результаты пересадки органов и тканей. Было однозначно показано, что совпадение пар донор—реципиент по антигенам HLA значительно повышает выживаемость аллогенных органов. Хотя созданные в последние годы эффективные методы иммуносупрессии
позволяют функционировать в течение длительного времени не
полностью совпадающим трансплантатам, однако влияние степени иммунологического подбора по-прежнему остается значительным.
В результате коллективного исследования Collaborative
Transplant Study (CTS), в котором принимати участие более 300 лабораторий Европы и Америки, включая Санкт-Петербургский
центр трансплантации почки, была показана прямо пропорциональная зависимость выживаемости почечного трансплантата от
числа совпадений, в особенности по антигенам II класса: так, пятилетняя выживаемость при отсутствии несовпадений возрастает
на 20%. Поэтому в трансплантационных центрах как Европы, так и
Америки аллогенные трансплантаты почек распределяются в соответствии со степенью HLA-совместимости.
В Санкт-Петербурге круглосуточную службу типирования и
подбора пар донор—реципиент осуществляет Республиканский
центр иммунологического типирования тканей на базе Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.
Трансплантация костного мозга
Трансплантация костного мозга в настоящее время является
методом лечения многих гематологических заболеваний. При этом
Глава 8. Иммуногематология
159
установлено, что успешное приживление и функционирование аллогенных гемопоэтических стволовых клеток возможно только при
высокой степени точности подбора пар донор—реципиент. Так, например, при полном совпадении больных хроническим миелолейкозом и доноров костного мозга по А-, В-, С-, DRB1- и DQ-специфичностям пятилетняя выживаемость после трансплантации составила 61%, тогда как при расхождении по антигенам/генам двух
локусов — всего 33%.
Особенностью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток по сравнению с трансплантацией других органов и тканей является то, что пересаживается иммунологически активный материал. В связи с этим возникает риск развития реакции «трансплантат против хозяина», отсутствующий, например, при пересадке
почки. В связи с этим требования к подбору пар донор- реципиент
гораздо более высокие, требуется практически полное совпадение
по всем основным локусам (А, В, DR, DQ).
Регистры потенциальных доноров костного мозга. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток имеет то преимущество
перед трансплантацией сердца, печени и даже почки, что материал
для трансплантации может быть взят у донора в достаточном количестве практически без ущерба для его здоровья. Это позволяет
располагать теоретически неограниченным пулом доноров и проводить подбор с высокой степенью точности. Однако для того чтобы значительному числу больных и в достаточно короткие сроки
был подобран HLA-совместимый донор, необходимо иметь большое количество доноров, типированных по HLA-A, -В и -DR локусам. Поэтому успех аллогенной трансплантации костного мозга в
значительной-степени зав.исит от величины донорского регистра,
которым располагает лечебное учреждение.
Стимулом для создания донорских регистров послужил быстрый рост числа аллогенных трансплантаций в разных странах. Так,
в США с 1986 по 1996 гг. количество ежегодно проводимых аллогенных трансплантаций возросло в 5 раз. Первые донорские регистры в Европе были созданы в Англии, Голландии, Италии в середине 80-х гг. В США этот раздел медицинской помощи был признан
государственно важным, и в 1991 г. Конгресс США принял закон
«Об улучшении трансплантации» с разделом «О национальном
регистре доноров костного мозга».
Национальные регистры достаточно быстро пришли к пониманию необходимости объединения для повышения эффективности
подбора доноров, и в настоящее время они объединены в организацию «Всемирный регистр доноров костного мозга».
160
Часть 1. Теоретическая гематология
На Международной конференции по донорским регистрам в
Германии в 2001 г., в которой участвовали представители России,
было указано, что очередная ядерная авария, произошедшая в Японии, — казалось бы, в благополучной и технически развитой стране — показывает, что техногенные катастрофы возможны в любом
месте земного шара, и всем участникам было настоятельно указано
на необходимость расширения собственных регистров, поскольку
поиск донора значительно более эффективен в пределах собственной популяции.
В России же до настоящего времени не существует ни законодательной базы, ни целевого финансирования, а имеющиеся малочисленные регистры поддерживаются исключительно за счет внутренних резервов учреждений, в которых они находятся.
Регистр доноров костного мозга Российского НИИ гематологии и трансфузиологии насчитывает около 4000 человек, что, безусловно, крайне мало. Однако имеются особенности распределения генетических характеристик, связанных с национальной и расовой принадлежностью, и поэтому для больного из России
с гораздо большей вероятностью подходящий донор может быть
найден именно в Российском регистре (Бубнова Л. Н., 2000).
Благодаря этому обстоятельству, в апреле 2002 г. в отделении
трансплантации костного мозга Российского НИИ гематологии
и трансфузиологии (руководитель — з. д. н. РФ д. м. н. проф.
К. М. Абдулкадыров) проведена первая в России аллогенная неродственная трансплантация стволовых периферических клеток
от донора, подобранного в собственном регистре.
Значение антигенов гистосовместимости
для трансфузиологии
Известно, что природных антител против антигенов HLA не
существует — они возникают в результате сенсибилизации во время переливания крови или у женщин, иммунизированных антигенами плода во время беременности. В последнем случае частоста
их появления увеличивается с числом беременностей. При этом
хотя несовместимость матери и плода по системе AB0 и резусфактору не оказывает значительного влияния на синтез антител к
антигенам HLA, однако они чаще встречаются в сыворотках, содержащих антитела против эритроцитарных антигенов. Антитела
появляются на разных сроках беременности, и время, в течение
которого они персистируют в сыворотке матери, очень сильно
варьирует — от нескольких месяцев до нескольких лет.
Глава 8. Иммуногематология
161
Появление антилейкоцитарных антител после переливания крови отмечается достаточно часто — от 20 до 50%, и вероятность их
выработки возрастает с числом перенесенных переливаний. Однако приблизительно у половины пациентов антитела не обнаруживаются, хотя им многократно переливают компоненты крови. Такая кажущаяся резнстентность к иммунизации может быть вызвана разными причинами, например перекрестными реакциями
между епсцпфпчностямп одного локуса пли блокирующими антителами, а также типом иммунного ответа реципиента.
Клиническое значение ант игенов главного комплекса гистосовместимости для трансфузиологии состоит в том, что они представлены на ядерных клетках крови и тромбоцитах и являются главной причиной аллоиммунизации к ним. Повторные трансфузии от
разных доноров приводят к появлению антител к HLA-антигенам.
Клинически такая аллонммунизация проявляется развитием негемолитических реакций, к которым относятся лихорадка (80%) и
крапивница (20%). Фебрпльные реакции, по данным некоторых
авторов, могут возникать у 1 3% больных, которым выполняются
повторные гемотраисфузии. Иногда тяжелые формы трансфузионных реакций, вызываемых антилейкоцитарными антителами,
сопровождаются развитием острой легочной патологии и обычно
проявляются как некардиогенный острый отек легких. Среди методов предотвращения или снижения нежелательных эффектов,
связанных с лейкоцитами, присутствующими в компонентах крови, используют удаление лейкоцитов из переливаемой эритроцитной массы с помощью фильтрации. Максимальное количество
лейкоцитов, еще не вызывающее развитие иоеттрансфузпонной фебрнльной реакции у аллопммунпзированных больных, — до 0,5 х 10я
клеток на трансфузию.
Трансфузии донорских тромбоцитов представляют мощное
средство современной терапии больных с повышенной кровоточивостью, обусловленной эндогенной депрессией кроветворения или
воздействием экзогенных факторов (лучевая, цитостатпческая терапия). Успешное проведение лечения аллогенными тромбоцитами в значительной степени связано с сохранением их высокой функциональной активности. Однако второе нежелательное последствие аллоиммунизации против HLA-антигенов состоит в том, что
даже при отсутствии негемолитических реакций" срок выживания
тромбоци- ток сокращается. Поскольку на поверхности тромбоцитов хорошо выражены HLA-антигены I класса, то продолжительность жизни тромбоцитов напрямую зависит от степени совместимости донора п реципиента по антигенам гистосовместимости.
6 Гематология. Нов. справочник
162
Часть 1. Теоретическая гематология
Тромбоциты, взятые у сиблинга, идентичного по HLA с реципиентом, имеют нормальную продолжительность жизни даже у тех больных, которые не переносят переливания тромбоцитарной массы от
неродственных доноров. Тромбоциты, введенные от HLA идентичного неродственного донора, имеют почти нормальный срок выживания.
Трансфузии тромбоцитов пациентам, которые иммунизированы к HLA-антигенам, не только могут сопровождаться негемолитическими реакциями, но и не приводят к увеличению числа тромбоцитов. Это происходит из-за быстрого удаления и деструкции
покрытых антителами тромбоцитов макрофагами в ретикулоэндотелиальных органах. Поэтому трансфузии тромбоцитов у аллоиммунизированных пациентов обречены на неудачу и не могут облегчить или предотвратить тромбоцитопенические осложнения. Рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов является одним из
главных препятствий в трансфузионном обеспечении пациентов,
получающих химиотерапию.
В настоящее время при трансфузиях тромбоконцентрата, способных вызвать образование у реципиентов HLA-антител и связанную с ними рефрактерность к тромбоцитотерапии, считается
необходимым производить типирование доноров тромбоцитов и
переливать HLA-совместимый концентрат. Это достигается или за
счет использования родственных доноров, или за счет регистров
типированных неродственных доноров. Использование генетически идентичных больному доноров, а также разработка упрощенных иммунологических методов скрининга совместимых доноров
тромбоцитов позволит повысить эффективность и снизить расходы на проведение весьма дорогостоящей тромбоцитотерапии.
Таким образом, иммунологические и иммуногенетические исследования являются неотъемлемой частью современной гематологии.
Литература
Бубнова Л. Н. Создание регистра доноров костного мозга и значение селекции
по HLA-специфичностям // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2000.
№ 1.С. 21-22.
Глазанова Т. В., Бубнова Л. П., Кузмичев А. С. и соавт. Фенотипические и функциональные особенности лимфоцитов периферической крови и иммуногенетическая характеристика больных с диффузным токсическим зобом и узловым
эутиреоидным зобом // Медицинская иммунология. 2000. Т. 2, № 4. С. 385393.
ДоссеЖ. Иммуногематология. М.: Мир, 1959.637 с.
Глава 9
ИММУНОГИСТОХИМИЯ
Иммуногистохимия — метод морфологической диагностики, в
основе которого лежит визуализация и оценка с помощью микроскопа результатов реакции антиген-антитело в срезах биопсированной ткани. В качестве антигена выступают компоненты клеточных структур или межклеточного вещества ткани. Антитела
получают из сыворотки крови животных, иммунизированных интересующим антигеном, или от культуры ткани гибридомы, которую создают слиянием «бессмертных» клеток плазмоцитарной
опухоли (миеломы) и активированных интересующим антигеном
В-лимфоцитов. Уникальность последнего метода состоит в том,
что все клетки гибридомы являются потомками одной-единственной клетки и поэтому синтезируют абсолютно идентичные молекулы антител. Такие антитела называют моноклональными, в отличие от поликлональных, получаемых иммунизацией животных.
Способ окрашивания клеточных и тканевых компонентов с помощью специфических антител для микроскопического исследования был предложен A. Coons с соавторами в 1941 г. Антитела
метили флюоресцирующей краской, что позволило обнаружить
комплекс тканевого антигена и диагностического антитела в гистологических срезах с помощью люминесцентного микроскопа.
Следующий шаг в развитии иммуногистохпмии связан с разработкой антител, меченных не флюорохромами, а ферментами. Для
обнаружения места связывания меченных ферментом антител применяют субстрат, в котором под воздействием ферментных меток
образуются окрашенные продукты. Ферментные метки позволяют
получить постоянные гистологические препараты, которые могут
длительно храниться, а результаты иммуногистохимической реакции точнее привязаны к структуре тканей.
Глава 9. Иммуногистохимия
165
Принципиальным отличием иммуногистохимии от других методов иммунологической диагностики, использующих реакцию
антиген-антитело, является структурная специфичность исследования. Это означает, что в реакции оценивается не только наличие
сигнала (есть окрашивание или нет) и его сила (интенсивность
окрашивания), но и пространственное распределение в гистологическом препарате (окрашивание мембран клеток, цитоплазмы, ядра
и других структурных элементов).
В морфологической (биопсийной) диагностике иммуногистохимические методы позволяют решать следующие главные задачи.
1. Уточнение гистогенеза опухолей.
2. Определение характера патологического процесса в плохо
сохранившихся биоптатах или биоптатах с недостаточным
объемом материала.
3. Уточнение вероятного источника метастазирования.
4. Оценка функционального состояния клеток опухоли.
5. Иммунофенотипирование опухолей кроветворной и лимфоидной тканей.
6. Диагностика иммунокомплексных и аутоиммунных заболеваний (гломерулопатии, буллезные дерматозы, синдром Гудпасчера и др.).
7. Поиск инфекционных агентов (токсоплазма, микобактерии,
хламидии, вирусы и др.).
Иммунологические маркеры,
используемые в гистологической диагностике лимфом*
Лимфомы представляют собой гетерогенную группу опухолей,
различающихся по клиническому течению, морфологическим, иммунологическим и генетическим признакам. За последние годы
достигнуты значительные успехи в понимании биологических основ этой гетерогенности. Развитие гибридомной технологии привело к созданию огромного числа моноклональных антител (мкАТ)
к широкому спектру линейных, дифференцировочных и субпопуляционных антигенов кроветворных и лимфоидных клеток, которые успешно используют в качестве иммунофенотипических маркеров для диагностики и классификации лейкозов и лимфом. Тысячи мкАТ были охарактеризованы на шести Рабочих совещаниях
(Париж, 1982; Бостон, 1984; Оксфорд, 1986; Вена, 1989; Бостон,
1993; Кобэ, 1996), результатами которых было принятие стандарт* Раздел подготовлен при участии Л. Ь. Салтыковой.
166
Часть 1 Теоретическая гематология
ной номенклатуры. Для лейкоцитарных антигенов, выявляемых
различными антителами, была разработана CD-классификация
(CD-cluster of differentiation — кластер дифференцировки). Кластер дифферснцировки включает группу антител, реагирующих с
одним или разными эпигонами определенного антигена. К настоящему времени получены данные по 247 кластерам.
Ниже приведены лейкоцитарные антигены согласно их принадлежности к тому или иному кластеру дифференцировки (в соответствии с материалами VI Рабочего совещания по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека, проведенного в 1996 г.
в г. Кобэ, Япония). В скобках указаны клоны соответствующих
антител, пригодных для применения на парафиновых срезах.
CDla (010, МТВ1, JPM30, ICA04). Антиген незрелых Т-клеток. Диагностическое значение для тканей, фиксированных в формалине, имеет детекция CDla. Молекулы CDla в норме обнаруживаются на кортикальных и, в меньшей степени, медуллярных
тимоцитах, клетках Лангерганса и других дендритных клетках и
не экспрессируются зрелыми Т-клетками в состоянии покоя. Экспрессия CDla отмечена в цитоплазме активированных Т-клеток и
на активированных моноцитах.
Антитела к CDla используют для дифференциальной диагностики Т-лимфобластной лимфомы/лейкоза от периферических
Т-клеточных лимфом. При лимфомах из зрелых Т- клеток экспрессия CDla, как правило, отсутствует.
CD2 (АВ75). Пан-Т-клеточный антиген (LFA-2). CD2 экспрессируется всеми тимоцитами. Т-лимфоцитами, субпоиуляцией
естественных киллеров (NK-клеток), незрелыми клетками миелоидного ряда, гистиоцитами. Выявляется при Т-лимфобластной
лимфоме/лейкозе, большинстве периферических Т-клеточных лимфом, ангиоцентрической лимфоме, Т-клеточной лимфоме/лейкозе взрослых, Т-клеточпом хроническом лимфолейкозе, Т-клеточном лейкозе из крупногранулярных лимфоцитов, грибовидном
микозе/синдроме Сезари. Может экспрессироваться бластными
клетками при остром миелоидном лейкозе. Окрашивание мембранное.
CD3 (CD3poly, PS1, РСЗ/188А, CD3-12). Пан-Т-клеточный антиген. СОЗ-антигенный комплекс состоит из 5 полипептидных цепей (гамма-, дельта-, эпсилон-, зета- и эта-), ковалентно связанных
с Т-клеточным рецептором (TCR). Поликлональные и большинство моноклональных антител к CD3 реагируют с цитоплазматпческим доменом эпсилон цепи CD3/TCR-aHTnreHHoro комплекса,
экспрессируемого Т-клетками. CD3- антиген появляется на более
Глава 9. Иммуногистохимия
167
ранней стадии Т-клеточной дифференцировки, чем CD2, и у кортикальных тимоцптов преимущественно обнаруживается в цитоплазме. Цитоплазматическая экспрессия CD3 характерна для
Т-лимфобластной лимфомы/лейкоза, а также фетальных, зрелых активированных и нсоиластических NK-клеток. Поверхностная
экспрессия CD3 антигена возникает на стадии медуллярных тимоцитов и сохраняется у зрелых Т-клеток. СОЗ-антиген является
высокоспецифичным маркером Т-лимфоцитов: на других клетках
он не обнаружен, за исключением, возможно, клеток Пуркинье в
мозжечке. Практически все Т-клеточные лимфомы экспрессируют
CD3. кроме редко встречающихся опухолей, при которых данный
антиген утрачивается в процессе малигнизации. Это явление наиболее характерно для анапластических крупноклеточных лимфом.
Экспрессия антигена CD3 выявляется в отдельных случаях злокачественного гистиоцитоза и лимфогранулематоза.
CD4 (1F6, 4В12). Антиген Т-лимфоцитов-хелперов и индукторов. Экспрессируется большинством Т-клеток периферической
крови и 80-90% кортикальных тимоцитов. Слабая экспрессия
обнаружена на моноцитах и гистиоцитах. СО4-антиген ассоциирован с комплексом CD3/TCR, является рецептором молекул
HLA II класса и ВИЧ; участвует в Т-В-клеточной адгезии, дифференцировке тимоцитов. МкАТ 1F6 и 4В12, которые реагируют
с CD4 в парафиновых срезах, являются необходимым компонентом диагностической панели Т-клеточных опухолей, так как экспрессия антигена CD4 характерна для неопластических клеток
большинства периферических Т-клеточных лимфом. CD4 выявляется также при Т-лимфобластной лимфоме/лейкозе, Т-клеточном лейкозе/лимфоме взрослых, большинстве случаев грибовидного микоза/синдрома Сезари, Т-клеточном пролимфоцитарном
лейкозе, при ангиоиммунобластной лимфоме. Окрашивание —
мембранное.
CD5 (4С7, CD5/54/F6, CD/54/B4). Пан-Т-клеточный антиген. CD5-aHTiiren присутствует в норме на клеточной поверхности
большинства Т-лимфоцитов, начиная с кортикальных тимоцитов,
и В1а — субпопуляции В-клеток. Диагностическое значение антитела к CD5 имеют при В-клеточных опухолях: В-клеточном хроническом лимфолейкозе/лимфоцитарной лимфоме, лимфоме из клеток зоны мантии, некоторых диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфомах. Для детекции CD5 в парафиновых срезах на
опухолевых клетках (не реактивных) чувствительность методов
визуализации может оказаться недостаточной. Выявляется на клетках рака вилочковой железы. Окрашивание мембранное.
168
Часть 1. Теоретическая гематология
CD7 (CD7-272). Пан-Т-клеточный антиген. Экспрессия CD7
на предшественниках Т-клеток возникает в эмбриональной печени, во время реарранжнровки гена дельта-цепи TCR. Кроме клеток
Т-ряда экспрессируется на костномозговых полипотентных CD34T
клетках-предшественниках, NK-клетках и моноцитах. Участвует в
активации Т-клеток. Антитела к CD7 используются для характеристики Т-клеточпых лимфом/лейкозов.
CD8 (С8/144В, 4В11, 1А5). Антиген супрессорных/цитотоксических Т-клеток, нормальных и опухолевых. Антитела реагируют с цитоплазматическим доменом а цепи молекулы CD8.
СО8-аптиген экспрессирует примерно 30% периферических мононуклеарных клеток и 60-85% кортикальных тимоцитов. В норме
антитела к CD8 могут окрашивать NK-клетки, а также клетки
эндотелия, клетки, выстилающие тяжи Бильрота в селезенке.
Окрашивание опухолевых клеток антителами к CD8 наблюдается
обычно при Т-клеточном хроническом лимфолейкозе, некоторых
Т-лимфобластных лимфомах/лейкозах, Т-клеточном лейкозе из
крупногранулярных лимфоцитов и кишечных Т-клеточных лимфомах с проявлениями энтеропатии. Экспрессия CD8 отсутствует
при грибовидном микозе/синдроме Сезари. Окрашивание мембранное.
CD10 (56С6). В-клеточный антиген (CALLA, common lymphoblastic leukaemia antigen). Эксирессируется различными типами
нормальных и опухолевых клеток, включая гемоноэтнческие (клетки зародышевого центра, плазматические клетки, зрелые гранулоциты, субпопуляция тимоцитов), эпителиальные (проксимальные
почечные канальцы, желчные канальцы) и стромальные клетки
(фибробласты), и не является исключительным маркером В-лимфобластов при ОЛЛ «общего типа». Экспрессия CD10 наблюдается не только при В-лимфобластной лнмфоме/лейкозе, но также и
при фолликулярной лимфоме (окрашивание от слабого до среднего), в большинстве случаев лимфомы Беркитта и в 30% случаев
диффузной крупноклеточной В-клеточнойлимфомы. CD 10 не экспрессируется при В-клеточном хроническом лимфолейкозе, лимфоплазмоцитарной лимфоме и, за редким исключением, лимфоме
из клеток зоны мантии (в том числе при бластоидном варианте).
Слабая экспрессия CDIO отмечается в ряде случаев множественной мпеломы. За исключением Т-лимфобластной лимфомы/лейкоза, CD 10 редко экспрессируется при других Т-клеточных опухолях. При всех подтипах острого миелоидного лейкоза и лимфоидном варианте бластного криза хронического миелолейкоза отмечена
экспрессия CDlO-антигена. Окрашивание — мембранное.
Глава 9. Иммуногистохимия
169
CD15 (C3D-1, LeuMl, MMA, TU9, BY87). Антиген гранулоцитов, активированных лейкоцитов, эпителиальных клеток. Более
95% гранулоцитов периферической крови и 80% циркулирующих
.моноцитов, а также дендритические ретикулярные клетки экспрессируютСО15-антиген. Экспрессия CD 15 не выявлена на лимфоцитах и тромбоцитах. В диагностике антитела к CD15 используют при иммунофенотипировании лимфогранулематоза и исследовании лейкозов миелоидного происхождения. Реакция с антителами проявляется в сильном окрашивании клеток БерезовскогоШтернберга-Рид и клеток Ходжкина в области клеточной мембраны, цитоплазмы или комплекса Гольджи (околоядерная область).
Экспрессия CD15 при лимфомах не ограничивется лимфогранулематозом: данный антиген выявляется на опухолевых клетках ряда
Т- и В-клеточных неходжкннекпх лимфом.
CD16a (2H7). Антиген NK-клеток и клеток миеломоноцитарного происхождения. Экспрессируется всеми покоящимися естественными киллерами, нейтрофилами, макрофагами, а также небольшой субпопуляцией Т-клеток. CD16a также является рецептором при антитело-зависимой клеточной цитотоксичности.
Диагностическое значение антитела к CD 16а имеют при лимфомах/лейкозах из NK-клеток и некоторых лимфобластных лимфомах из предшественников Т-клеток. Окрашивание — мембранное.
CD20 (L26, 7D1, MJ1, CD20poly). Пан-В-клеточный антиген.
Экспрессия на В-клетках совпадает но времени с реарранжировкой генов легких цепей Ig. Это маркер нормальных и опухолевых
В-клеток, фолликулярных дендритических клеток. Экспрессируется в 50% случаев В-лимфобластных лимфом/лейкозов и в большинстве случаев зрелоклеточных лимфом/лейкозов В-клеточного
происхождения. В 40% случаев «классического» лимфогранулематоза некоторые клетки Березовского-Штернберга-Рид могут в различной степени интенсивности экспрессировать антиген CD20,
тогда как опухолевые (pop-corn, L&H) клетки при нодулярном
типе лимфоидного преобладания практически всегда имеют сильную экспрессию данного антигена. CD20 утрачивается плазматическими клетками, но экспрессируется в некоторых случаях при
плазмоцитоме/миеломе. Окрашивание — мембранное. Неспецифичным является окрашивание ядрышек в некоторых случаях применения высокочувствительных систем визуализации.
CD21 (1F8, BL13, 2G9). В-клеточный антиген. В лимфоидных
фолликулах экспрессируется зрелыми В-лимфоцитами (slg+) и
фолликулярными дендритическими клетками в норме и при различных типах В-клеточных лимфом/лейкозов; экспрессируется
170
Часть 1. Теоретическая гематология
субпопуляцией тимоцитов и некоторыми видами эпителия и не
экспрессируется циркулирующими лимфоцитами, Т-клетками,
гранулоцитами и моноцитами. Антитела к CD21 используются
для идентификации изменений сети фолликулярных дендритных клеток при В-клеточных лимфомах, ангиоиммуноблас т о й
лимфоме, ассоциированных с ВИЧ-инфекцией поражениях лимфоидной ткани, лимфогранулематозе. Характер окрашивания —
мембранный.
CD22 (FPC1). В-клеточный антиген. Экспрессия CD22 возникает в цитоплазме про- и ранних пре-В-клеток и на поверхности
зрелых В-лимфоцитов. Поверхностная экспрессия антигена CD22
вариабельна и может утрачиваться в процессе дифференцировки.
Антиген CD22 слабо экспрессирован при В-клеточных лимфомах/
лейкозах из клеток-предшественников; сильная экспрессия антигена CD22 наблюдается при волосатоклеточном лейкозе. Т-лимфоциты периферической крови и Т-клеточные лимфомы/лейкозы, а также гранулоциты и моноциты не экспрессируют антиген
CD22.
CD23 (МНМ6, BU38, 1В12). В-клеточный антиген. В слабой
степени CD23 экспрессирует большинство зрелых В-лимфоцитов.
Высокий уровень экспрессии характерен для фолликулярных дендритических клеток и особенно для трансформированных вирусом Epstein-Barr В-лимфобластов. CD23 экспрессируется также
на других клетках — моноцитах, зозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, Т-клетках, тромбоцитах, клетках Лангерганса и
субпопуляции эпителиальных клеток тимуса. Для В-клеток CD23
является маркером дифференцировки, который утрачивается Ig-секретирующими клетками. В лимфоидной ткани антитела к CD23
реагируют с субпопуляциями лимфоцитов зоны мантии и фолликулярных дендритических клеток, при этом реакции с лимфоцитами маргинальной зоны селезенки не обнаруживается. CD23 экспрессируется опухолевыми клетками при фолликулярных лимфомах, В-клеточных лимфоцитарных лимфомах/хронических лейкозах и не экспрессируются при других лимфомах, включая лимфому из клеток зоны мантии. Характер окрашивания - мембранный.
CD30 ( Ber-H2, 15B3, МР-1, 1G12 ). Активационный антиген
лимфоцитов и макрофагов, ранее известный как Ki-1-антиген.
Антиген CD30 экспрессируется активированными В-, Т-, NK-клетками, моноцитами, клетками Березовского- Штернберга- Рид и
Ходжкина при лимфогранулематозе, опухолевыми клетками анапластических крупноклеточных лимфом и при лимфоматоидном
Глава 9. Иммуногистохимия
171
папулезе. СОЗО-позитивными могут быть некоторые Т-клеточные
лимфомы с иммунофенотипом периферических лимфоцитов (в
частности, ангиоиммунобластные) и некоторые диффузные крупноклеточные В-клеточные лимфомы (иммунобластные). В нормальной лимфоидной ткани антитело Вег-Н2 реагирует с небольшой популяцией крупных клеток, располагающихся преимущественно вокруг В-клеточных фолликулов. Вне лимфоидной ткани
Вег-112 реагирует с клетками ацинуса поджелудочной железы и с
некоторыми карциномами, происходящими из этих клеток. Экспрессия CD30 характерна также для эмбрионального рака. Окрашивание — мембранное и в зоне комплекса Гольджи.
CD34 (QBendlO, MylO). Антиген гемопоэтических клетокпредшественников, в норме избирательно экспрессирующийся на
ранних гемопоэтических клетках-предшественниках и клетках эндотелия капилляров; нейронах, эмбриональных фибробластах. Участвует в межклеточной адгезии. Выявляется примерно в 33% случаев острых лейкозов миелоидиого происхождения, 50% В-лимфобластных лимфом/лейкозов и 5% Т-лимфобластных лимфом/
лейкозов из клеток-предшественников.
CD35 (Ber-MAC-DRC, To5, El I, RLB-25). Рецептор компонентов комплемента СЗЬ, СЗс! и других. Экспрессирован на эритроцитах, лейкоцитах, В-клетках, 10-15% Т-клеток, фолликулярных
дендритических клетках, астроцитах и подоцитах.
CD38 (SPC32, АТ13/5). Маркер плазматических клеток. Экспрессирован на тимоцитах, пре-В-клетках, активированных Т-клетках, моноцитах, NK-клетках; плазматических клетках, секретирующих иммуноглобулины; костномозговых клетках-предшественниках эритроидного и миелоидного ряда, клетках мозга. Антитела
к CD38 используются в диагностике плазмоклеточной миеломы,
дифференциальной диагностике лимфоплазмоцитарной лимфомы
и лимфоцитарной лимфомы/хронического лимфолейкоза. CD38
выявляется в части случаев хронического лимфолейкоза. Окрашивание — мембранное.
CD43 (МТ1, DF-T1, Leu22, L60, 84-ЗС1). Антиген, ассоциированный с Т-лимфоцитами, в парафиновых срезах сильно экспрессируется нормальными Т-лимфоцитами (в том числе 90% тимоцитов), NK-к.тетками, гранулоцитами, гистиоцитами, субпопуляцией плазматических клеток и не экспрессируется покоящимися В-лимфоцитами. Молекулы CD43 участвуют в процессе
активации Т-лимфоцитов. Антитела к CD43 реагируют с опухолевыми клетками Т-клеточных лимфом, по также и 20% лимфом и
лейкозов В-клеточного происхождения и гранулоцитарных сарком,
172
Часть 1. Теоретическая гематология
поэтому с диагностической целью должны использоваться совместно с другими Т- и В-клеточными маркерами. Характер окрашивания — мембранный.
CD45R0 (UCHL1, А6, OPD4). Ассоциированная с Т-лимфоцитами низкомолекулярная изоформа общелейкоцитарного антигена LCA/CD45. Сейчас известно 5 гликопротеинов, входящих
в состав LCA/CD45 и присутствующих на клеточной поверхности
большинства лейкоцитов. Гликопротеины кодируются одним геном CD45, и существующие три СО45-изоформы (RO, RA и RB)
являются продуктами альтернативного сплайсинга трех экзонов
(А, В и С) данного гена. CD45R0 выявляется на большинстве тимоцитов, зрелых активированных Т-клетках, субпопуляции покоящихся Т-лимфоцитов (как среди CD4% так и среди CD8 + ). Антитело UCHL1 реагирует с гранулоцитами и моноцитами, но не реагирует с NK-клетками и нормальными В-лимфоцитами. Экспрессия
CD45R0, характерная для Т-клеточных лимфом, может выявляться также в редких случаях диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом и в миеломонобластных инфильтратах. Окрашивание — мембранное.
CD45RB/LCA (LCA, 2B11, PD7/26, МЕМ55). Изоформа обгцелейкоцитарного антигена (Leukocyte Common Antigen), кодируемая экзоном В гена CD45 (см. выше). Антитела к CD45RB
имеют важное значение в дифференциальной диагностике злокачественных лимфом и низкодифференцированных опухолей другого гистогенеза. Мембранная позитивность, иногда выявляется
диффузное цитоплазматическое окрашивание и в участке комплекса Гольджи.
CD56 (1В6,123СЗ, 123C3D5). Маркер естественных киллеров
(NK-клеток). Экспрессируется всеми покоящимися и активированными NK-клетками и субпопуляцией NK-подобных цитотоксических у/5 Т-клеток, клетками нервной ткани. С помощью антител
к антигену CD56 были выделены новые категории T/NK-клеточных опухолей: NK/T-клеточные лимфомы типа лимфом верхних
дыхательных путей (ангиоцентрические), агрессивный NK-клеточный лейкоз, бластная NK-лимфома, а также NK-вариант Т-клеточного лейкоза из крупногранулярных лимфоцитов. CD56 экспрессируется при NK/T-клеточных лимфомах верхних дыхательных
путей и гепатолиенальной Т-клеточной лимфоме, редких случаях
кишечных Т-клеточных лимфом с проявлениями энтеропатии, а
также множественной миеломе, миелоидных лейкозах, нейробластоме* опухоли Юинга, мелкоклеточном раке легкого. Окрашивание — мембранное.
Глава 9. Иммуногистохимия
173
CD57 (Leu7, HNK-1, NCI, NK1). Антиген естественных киллеров. В лимфоидной ткани CD57 экспрессируется покоящимися
NK-клетками, субпопуляцией Т-клеток и некоторыми патологическими В-клетками. При активации NK-клетки перестают экспрессировать CD57, поэтому часто случаи NK-клеточных лимфом/
лейкозов являются СВ57-негативными. CD57 часто экспрессируется опухолевыми клетками при T/NK-клеточном лейкозе из
крупногранулярных лимфоцитов. CD57 экспрессируют реактивные Т-клетки, окружающие неопластические (L&H) клетки при
лимфогранулематозе с нодулярным типом лимфоидного преобладания, но не при классических типах лимфогранулематоза. Вне
лимфоидной ткани антитела к CD57 окрашивают нормальные и
опухолевые эктодермальные и нейроэктодермальные клетки. Окрашивание — мембранное.
CD68 (КР1, PG-M1, 514Н12). Маркер моноцитов и гистиоцитов. CD68 экспрессируется в цитоплазматических гранулах и, в
меньшей степени, на клеточных мембранах моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, базофилов и NK-клеток. Позитивными по CD68
могут быть также активированные Т-клетки, субпопуляция зрелых
В-клеток и эпителий (в цитоплазме). Характер окрашивания антителами гранулярный. Антитела к антигену CD68 обладают различной иммунореактивностью по отношению к одной и той же популяции клеток, так как выявляют разные эпитопы данного антигена.
Опухоли лимфоидного происхождения обычно негативны в отношении антител к CD68, за исключением'отдельных случаев волосатоклеточного лейкоза и В-клеточной лимфоцитарной лимфомы.
Антитела к CD68 используются для выявления реактивных макрофагов в тканевых срезах при иммунофенотипировании опухолей.
CD79oc (JCB117, 11ЕЗ, 11D10, НМ47/А9). Пан-В-клеточный
антиген. Экспрессия CD79a возникает на стадии предшественников В-лимфоцитов и сохраняется до стадии плазматических клеток, когда антиген локализуется внутри клетки. Антитела к CD79a
используются для идентификации всех опухолей В-клеточного
происхождения.
CD138 (5F7, МП5). Маркер плазматических клеток. Экспрессия CD138 специфична для плазматических клеток, содержащих
иммуноглобулины в цитоплазме. Антитела к CD 138 дают позитивную реакцию при плазмоклеточной миеломе, лимфоплазмоцитарной лимфоме, хроническом лимфолейкозе. Среди негемопоэтических тканей антиген CD138 в норме экспрессирован на фибробластах, клетках эпителия и эндотелиальных клетках; может
утрачиваться при малигнизации.
174
Часть 1. Теоретическая гематология
BCL-2 (124, BCL-2-100, 100/D5). Белок-супрессор апоптоза
(программируемой клеточной гибели). BCL-2 кодируется соответствующим геном, который вовлекается в хромосомную транслокацию t( 14; 18)(q32;q21), обнаруживаемую в подавляющем большинстве фолликулярных лимфом. Юкстапозиция гена bcl-2 к промотору гена тяжелых цепей lg приводит к аберрантной транскрипции
гена bcl-2 и избыточному синтезу его белкового продукта. Наличие
транслокации t(14;18) не является необходимым условием экспрессии белка BCL-2, так как в большинстве случаев BCL-2 синтезируется в отсутствие данной хромосомной перестройки. В нормальной лимфоидной ткани BCL-2 обнаруживается в малых лимфоцитах зоны мантии фолликулов, множестве Т-клеток в Т-зонах,
но лишь в единичных клетках зародышевых центров и отсутствует
в моноцитоидных В-клетках. В тимусе антителами к BCL-2 интенсивно окрашиваются клетки мозгового вещества, тогда как кортикальные тимоциты остаются BCL-2-негативными или слабопозитивными. Антитела к BCL-2-нротенну реагируют с опухолевыми
клетками большинства фолликулярных лимфом, что дает возможность отличать опухолевые фолликулы от зародышевых центров
при реактивных лимфопролиферативных процессах. Следует учитывать, что только 75% фолликулярных лимфом 3 степени (крупноклеточных) BCL-2-позитивны. Многие диффузные лимфоидные опухоли также экспрессируют протеин BCL-2: лимфобластные лимфомы, анапластические крупноклеточные лимфомы,
агрессивные Т- и В-клеточные лимфомы и волосатоклеточный лейкоз. Часто BCL-2 экспрессируется клетками Березовского-Штернберга-Рид при лимфогранулематозе.
Необходимо знать, что эпитоп протеина BCL-2 не всегда сохраняется в парафиновых срезах. Окрашивание — цитоплазматическое и мембранное.
BCL-6 (PG-B6p, P1F6). Репрессор транскрипции. В лимфоидной ткани антитела выявляют белок BCL-6, в основном в ядрах
центробластов и центроцитов зародышевых центров и в клетках
соответствующих лимфом. С антителом PG-Вбр реагируют 10%
Т-клеток зародышевых центров. Установлено, что при неходжкинских лимфомах ген BCL-6 вовлекается в хромосомные перестройки с участием 3q27. Реарранжировки гена BCL-6 выявлены примерно в 10% случаев фолликулярных лимфом и 30% диффузных
крупноклеточных В-клеточных лимфом. Продукт гена BCL-6 выявляется иммуногистохимически при фолликулярных лимфомах,
диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфомах, лимфоме
Беркитта, Т- и 0-клеточных анапластических крупноклеточных
Глава 9. Иммуногистохимия
175
лимфомах и лимфогранулематозе (тип лимфоидного преобладания). BCL-6 не экспрессируется при В-ХЛЛ, волосатоклеточном
лейкозе, лимфомах зоны мантии и маргинальной зоны. Окрашивание — ядерное.
BSAP (анти-BSAP). Фактор транскрипции. Белок BSAP (В-се11
specific activator protein), или фактор транскрипции, специфичный для В-клеток, кодируется геном РАХ5. Методами ИГХ BSAP
выявляется в клетках Березовского-Штернберга-Рид в 90% случаев классического лимфогранулематоза и отсутствует при анапластических крупноклеточных лимфомах.
Clusterin (7D1). Маркер CD30+ анапластической крупноклеточной лимфомы. Сверхэкспрессия кластерина обнаружена в опухолях различного генеза и при ряде других заболеваний. В реактивных лимфоидных тканях кластерии иммуногистохимически
выявляется только в фолликулярных дендритических и фибробластических ретикулярных клетках. Экспрессия кластерина, составляющая 100%, отличает анапластическую крупноклеточную
лимфому от других лимфоидных опухолей, в том числе от первичной анапластической крупноклеточной лимфомы кожи и лимфогранулематоза. Окрашивание преимущественно цитоплазматическое, но может наблюдаться также мембранное и внеклеточное.
CyclinDi(DCS-6,5D4,HD64,CyDlp,P2DllFll).Il,HioiHHDlпозитивный регулятор клеточного цикла. В норме в лимфоидной
ткани не экспрессируется. Избыточная продукция белка циклина
D1 в опухолевых клетках обнаружена иммуногистохимически в
60-100% случаев лимфомы из клеток зоны мантии и является
характерным диагностическим признаком данного заболевания,
хотя циклин D1 может выявляться и в редких случаях ХЛЛ (<2%),
лимфоплазмоцитарной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза и
плазмоклеточных опухолей. Антитела к циклину D1 дают ядерное
или ядерно-цитоплазматическое окрашивание: отсутствие ядерного окрашивания свидетельствует об отрицательном диагностическом результате ИГХ реакции.
DBA.44. Маркер волосатоклеточного лейкоза. Антиген еще
не охарактеризован. В срезах реактивных лимфоузлов и селезенки
антитело DBA.44 реагирует с мембранами клеток зоны мантии и
некоторых иммунобластов вне лимфоидных фолликулов; иногда
позитивную реакцию дают отдельные клетки зародышевых центров. DBA.44 реагирует с опухолевыми клетками при волосатоклеточном лейкозе в 97% случаев и примерно в 30% случаев В-клеточных лимфом высокой и низкой степени злокачественности. Тем не
менее антитело DBA.44 может использоваться для дифференци-
176
Часть 1. Теоретическая гематология
альной диагностики волосатою сточного лейкоза с другими В-клеточными неоплазиями, принимая во внимание морфологию позитивных клеток.
EMA (E29. МС5, GP1.4). Эпителиальный мембранный антиген
(epithelial membrane antigen). Белки EMA присутствуют в различных типах эпителия, как нормального, так и опухолевого. При лимфоидных опухолях экспрессия ЕМА часто обнаруживается в клетках анапластических крупноклеточных лимфом, что имеет важное
диагностическое значение. Примерно в 50% случаев лимфогранулематоза с иодулярным типом лнмфоидного преобладания, в отличие от классических типов, опухолевые (L&H) клетки реагируют с антителами к ЕМА. В тканевых срезах положительную реакцию с антителами к ЕМА могут давать нормальные и опухолевые
плазматические клетки. Мембранное и цитоплазматическое окрашивание, даваемое антителом Е29. часто ассоциировано с точечным (dot-like) окрашиванием зоны комплекса Гольджи. Антиген в
демаскировании не нуждается.
Granzyme В (GB9. 11F1). Гранзим В — маркер активированных цитотоксических клеток. Гранзим В, наряду с гранзимами А
п 3, является основным компонентом цитотоксических гранул
Т- и NK-клеток. Выявляется в опухолевых клетках при Т-клеточном лейкозе из крупногранулярных лимфоцитов, КК-/Т-клеточт
ных лимфомах верхних дыхательных путей и ]\ К-/Т-клеточных
лимфомах типа лимфом верхних дыхательных путей, кишечных
лимфомах с проявлениями энтеропатии, первично кожных CD30+
Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях, Т-клсточной панникулитоподобной лимфоме подкожной клетчатки, ряде
случаев Т-клеточной анапластической крупноклеточной лимфомы и классического лимфогранулематоза. Характер окрашивания — диффузно-гранулярный пли перинуклеарный точечный
(dot-like). Антиген в демаскировании не нуждается.
IgM (IgMpoly. HP6083). Иммуноглобулин М. Молекулы IgM
экспрессируются в цитоплазме пре-В-клеток и на клеточной поверхности зрелых В-лимфоцитов. Антитела к IgM реагируют с
тяжелыми (и) цепями поверхностных, цитоплазматических или
внеклеточных молекул IgM; совместно с другими антителами используются в дифференциальной диагностике В-клеточных лимфом из клеток с периферическим иммунофенотипом.
Ki-67 (Ki-67poly, Ki-67, MIB-1. Ki-S5, MM1, MB67). Маркер
пролиферативной активности. Антиген Ki-67 является ядерным
белком, не имеющим структурной гомологии ни с одной из других
известных полипептидных последовательностей. Антитела к анти-
Глава 9. Иммуногистохимия
177
гену Ki-67 реагируют с пролиферирующими (Gl, S. М и G2 стадии
клеточного цикла), но не с покоящимися клетками (стадия GO),
что находит применение для оценки фракции роста в опухолях.
Окрашивание — ядерное и ядрышковос.
NPM-ALK, р80 (ALK1, 5А4, ALK01). Маркер CD30+ анапластической крупноклеточной лимфомы. Белок NPM-ALK (Nucleophosmin-Anaplastic Lymphoma Kinase) (80 кД) является продуктом
химерного (гибридного) гена, возникающего в результате хромосомной транслокащш t(2;5)(p23;q35). Хромосомная транслокация
t (2:5) и соответствующая экспрессия химерного NPM/ALK протеина обнаруживается в 30-50% случаев CD30* анапластических
крупноклеточных лимфом и не встречается в нормальных лимфоцитах. Антитела к NPM/ALK протеину дают ядерное и ядерно-цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток анапластических крупноклеточных лимфом. В недавно выделенном редком
подтипе крупноклеточных В-клеточных лимфом, не несущих транслокации t(2;5), антитела ALK1 и 5А4 выявляют экспрессию ALK
протеина нормальной длины (200 кД) исключительно is цитоплазме.
Oct2 (Oct2p). Фактор транскрипции. Специфичен для В-лимфоцитов и нейронов. Индуцирует синтез иммуноглобулинов в
В-клетках путем активации промотора иммуноглобулиновых генов совместно с ко-активатором ВОВ.1. Экспрессирован в нормальных и неопластических зародышевых центрах. Сильная экспрессия Oct2 в L&H клетках отличает вариант лимфогранулематоза с нодулярным типом лимфоидного преобладания от вариантов классического лимфогранулематоза: клетки БерезовскогоШтернберга Рид в 75% случаев Oct2 не экспрессируют, а в 25% —
экспрессируют очень слабо. Окрашивание — ядерное.
TdT (Tdfp, 8-1E4. SEN28, NPT26, DT01). Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (terminal deoxyiiucleotidyl transferase),
классический маркер лимфоидных клеток-предшественников как
Т-, так и В-клеточного типа. В норме присутствует в ядрах Т-клеток тимуса и в небольшом количестве костномозговых лимфоцитов. TdT экспрессируется во всех случаях Т- и В-лимфобластных
лимфом/лейкозов из соответствующих клеток-предшественников,
в большинстве случаев бластного криза хронического миелолейкоза и 20% острых нелнмфобластных лейкозов. Определение TdT
используется для дифференциальной диагностики лпмфобластных лпмфом, бластоидного варианта лимфомы из клеток зоны мантии и лимфомы Беркитта. Антитела к TdT дают ядерное окрашивание.
178
Часть 1. Теоретическая гематология
TIA-1 (TIA-1, 2G9). Маркер цитотоксических лимфоцитов.
TIA-1 (T-Cell Intracellular Antigen-1) является эффекторным белком мембран цитоплазматических гранул покоящихся и активированных цитотоксических клеток. МкАТ TIA-1 реагирует с соответствующим антигеном как цитотоксических Т-лимфоцитов,
так и NK-клеток. Возможна перекрестная реакция с гранулоцитами, но гранулярный характер окрашивания при этом менее отчетлив, чем в цитотоксических лимфоцитах. Слабую диффузную
цитоплазматическую реакцию могут давать эпителиоидные гистиоциты. Антиген TIA-1 экспрессируется опухолевыми клетками
при МК-/Т-клеточных лимфомах верхних дыхательных путей и
КК-/Т-клеточных лимфомах типа лимфомы верхних дыхательных
путей, NK-клеточном лейкозе, гепатолиенальной Т-клеточной лимфоме, Т-клеточной панникулитоподобной лимфоме подкожной
клетчатки; часто выявляется при первично кожных CD301 лимфопролиферативных заболеваниях, Т-клеточных анапластических
крупноклеточных лимфомах, кишечной Т-клеточной лимфоме с
проявлениями энтеропатии, в ряде случаев классического лимфогранулематоза. Среди нелимфоидных опухолей фокально позитивную реакцию с TIA-1 могут давать клетки гранулоцитарной
саркомы.
VS38c. Маркер плазматических клеток. Антитело VS38c распознает внутриклеточный белок, ассоциированный с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Реакция с антителом VS38c
вызывает сильное окрашивание плазматических клеток, что используется в комплексе с другими антителами для диагностики
миеломы/плазмоцитомы и иммуноцитомы в тканевых срезах. Следует учитывать, что VS38c реагирует также с меланоцитами и целым рядом эпителиальных клеток.
Vimentin (V9, Vim3B4, 1905.5). Виментин - белок промежуточных филаментов. Антитела к виментину в норме реагируют с
клетками мезенхимального происхождения и не реагируют с гемопоэтическими клетками. Экспрессия виментина выявлена в клетках Березовского-Штернберга-Рид при классическом лимфогранулематозе, что помогает при дифференциальном диагнозе между
морфологически сходными случаями классического лимфогранулематоза (подтип «с большим количеством лимфоцитов») и
лимфогранулематоза с нодулярным типом лимфоидного преобладания, а также В-клеточной лимфомы с большим количеством
Т-клеток. Сохранность эпитопа виментина зависит от качества гистологической обработки материала. Окрашивание — цитоплазматическое.
Глава 9. Иммуногистохимия
179
Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика
неходжкинских лимфом
Классификация ВОЗ объединяет опухоли кроветворной и лимфоидной ткани. В раздел опухолей лимфоидной ткани включены
неходжкинские лимфомы и лимфогранулематоз. Классификация
неходжкинских лимфом — перечень клинико-морфологических
рубрик (форм), не имеющих иерархической соподчиненности. Рубрики (формы) описываются следующими классификационными
признаками (табл. 4.):
1) морфология (гистология и цитология);
2) иммунофенотип;
3) генетические признаки;
4) первичная локализация;
5) характер диссеминации;
6) другие клинические признаки.
Таблица 4
Перечень рубрик (форм) опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ (по кн.: Е. S. Jaffe, N. L. Ham's et al., 2001)
Формы опухолей лимфоидной i кани
в классификации ВОЗ
B-cell neoplasms (В-клеточные опухоли)
Precursor B-cell neoplasms
Опухоли из предшественников В-лимфоцитов
2
Precursor В lymphoblastic leukemia'/lymphoblastic lymphoma
(precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia)
В-лимфобластный лейкоз'/лимфома2 из предшественников
В-клеток (острый лимфобластный лейкоз из предшественников В-клеток)
Mature B-cell neoplasms
В-клеточные опухоли с фенотипом зрелых лимфоцитов
:
Chronic lymphocytic leukemia'/small lymphocytic lymphoma
Хронический лимфоцитарный лейкоз'/лимфоцитарная
лимфомаB-cell prolymphocytic leukemia
В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз
Lymphoplasmocytic lymphoma
Лимфоплазмоцитарная лимфома
Splenic marginal zone lymphoma
Селезеночная лимфома маргинальной зоны
Hairy cell lymphoma
Волосаюклеточный лейкоз
Колы
заболеваний
(ICD-O код)
9835/3'
9728/3"
9823/3'
9670/39833/3
9671/3
9689/3
9940/3
Часть 1. Теоретическая гематология
180
Продолжение таблицы 4
Формы опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ
Коды
заболеваний
(ICD-O код)
Plasma cell myeloma
Плазмоклеточная миелома
9732/3
Monoclonal gammapathy of undetermined significance
(MGUS)
Моноклональная гаммапатия неопределенного значения
9765/1
Solitary plasmacytoma
Солитарнаяплазмоцитома
9731/3
Extraosseous plasmacytoma
Внекостная плазмоцитома
9734/3
Primary amyloidosis
Первичный амилоидоз
Heavy chain diseases
Болезни тяжелых цепей
9769/1 с
9762/3
Extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosaassociated lymphoid tissue (MALT-lymphoma)
Экстранодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми
оболочками (MALT-лимфома)
Nodal marginal zone B-cell lymphoma
Нодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны
Follicular lymphoma
Фолликулярная лимфома
9699/3
9699/3
9690/3
Mantle cell lymphoma
Лимфома из клеток зоны мантии
9673/3
Diffuse large B-cell lymphoma
Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома
9680/3
Mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma
Медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома
9679/3
Intravascular large B-cell lymphoma
Внутрисосудистая крупноклеточная В-клеточная лимфома
9680/3
Primary effusion lymphoma
Первичная лимфома серозных полостей
9678/3
:
Burkitt lymphomaUeukemia
Лимфома Беркитта1/Лейкоз Беркитта 2
9687/3'
9826/32
B-cell proliferations of uncertain malignant potential
В-клеточные лимфопролиферативные процессы с неопределенным опухолевым потенциалом
Lymphomatoid granulomatosis
Лимфоматоидный гранулематоз
9766/1
Post-transplant lymphoproliferative disorder, polymorphic
Посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание, полиморфно-клеточное
9970/1
Глава 9. Иммуногистохимия
181
Продолжение таблицы 4
Формы опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ
Коды
заболеваний
(ICD-O код)
T-cell neoplasms (Т-клеточные опухоли)
Precursor T-cell neoplasms
Опухоли из предшественников Т-лимфоцитов
Precursor T-lymphoblastic leukemia'/lymphoblastic lymphoma 2 (precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia)
Т-лимфобластный лейкоз'/лимфома 2 из предшественников
Т-клеток (острый лимфобластный лейкоз из
предшественников Т-клеток)
9837/3'
9729/32
Mature T-cell and NK-cell neoplasms
T- и NK-клеточные опухоли с фенотипом зрелых лимфоцитов
Leukemic/disseminatcd
Лейкозы/первично диссеминировашые лимфомы
T-cell prolymphocytic leukemia
Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз
9834/3
T-cell large granular lymphocytic leukemia
Т-клеточный лейкоз из крупных гранулярных лимфоцитов
9831/3
Aggressive NK-cell leukemia
Агрессивный NK-кле точный лейкоз
9948/3
Adult T-cell leukemia/lymphoma
Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых
9827/3
Cutaneous
Кожные лимфомы
Mycosis fungoides
Грибовидный микоз
9700/3
Sezary syndrome
Синдром Сезари
9701/3
Primary cutaneous anaplastic large cell lymphoma
Первичная кожная крупноклеточная анапластическая
лимфома
9718/3
Lymphomatoid papulosis
Лимфоматоидный папулез
9718/1
Other extranodal
Другие экстранодальные лимфомы
Extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type
Экстранодальная NK/T-клеточная лимфома, назальный
тип
9719/3
Enteropathy-type T-cell lymphoma
Т-клеточная лимфома типа энтеропатии
9717/3
Hepatosplenic T-cell lymphoma
Гепатолиенальная Т-клеточная лимфома
9716/3
Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma
Подкожная панникулитоподобная Т-клеточная лимфома
9708/3
Часть 1. Теоретическая гематология
182
Окончание таблицы 4
Формы опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ
Коды
заболеваний
(ICD-Окод)
Nodal
Лимфомы лимфатических узлов
Angioimmunoblastic T-cell lymphoma
Ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома
9705/3
Peripheral T-cell lymphoma. unspecified
Лимфома in клеток с иммунофенотипом периферических
Т-лимфоцитов, неуточненная
9702/3
Anaplastic large cell lymphoma
Анапластическая крупноклеточная лимфома
9714/3
Xeoplasm of uncertain lineage and stage of differentiation
Опухоль неопределенной дифференцировки
Blastic NK-cell lymphoma
Властная NK-клеточная лимфома
9727/3
Hodgkin lymphoma (Лимфома Ходжкина)
Nodular lymphocyte predominant Hodgkin lymphoma
Лимфогранулематоз, нодулярный гип лимфоидного преобладания
9659/3
Nodular sclerosis classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. нодулярный склероз
9663/3
Mixed cellularity classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. смешанно-клеточный
вариант
9652/3
Lymphocyte-rich classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. с большим количеством лимфоцитов
9651/3
Lymphocyte-depleted classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. с истощением лимфоидной ткани
9653/3
Краткое описание клинико-морфологических рубрик (фЪрм)
неходжкинских лимфом включает морфологические и иммуногистохимические признаки этих опухолей.
Лимфобластные лимфомы/лейкозы из клеток
с иммунофенотипом В-клеток-предшественников
Лимфобластные лимфомы/лейкозы из предшественников
В-клеток характеризуются монотонной пролиферацией мелких
или среднего размера округлых клеток, которые в пораженных
лимфатических узлах замещают лимфоидную ткань. Довольно часто поражается средостение. Ядра бластов овальной, округлой пра-
Глава 9. Иммуногистохимия
183
внльной формы; встречаются варианты лимфобластных лимфом с
ядрами, имеющими «конволютную» форму. Более точно строение
ядер лимфобластных лимфом из клеток с «копволютными» ядрами описывают определения «извитой», <<с мозговидной извилистой поверхностью», «измятый», «зазубренный» и «изборожденный». Все это многообразие определений описывает особый характер строения ядерной мембраны и распределения гетерохроматина
в ядрах лимфобластов. Феномен легче наблюдать в заметно более
толстых, чем это требуется для диагностики, гистологических срезах. Поверхность ядра при небольших движениях микровинтом
микроскопа выглядит измятой, с вдавлениями и складками. Гетерохроматин пылевидный, однородный, равномерно распределен
по всем}' объему ядра. Ядра содержат 1-3 небольших ядрышка.
При окраске азур Н-эозином узкий ободок цитоплазмы окрашивается в бледно-голубой или серый цвет. Много фигур митозов. В некоторых случаях среди лимфобластов располагаются фагоцитирующие макрофаги («звездное небо»),
Иммунофенотип. В препаратах из ткани, фиксированной в формальдегиде, обезвоженной и залитой в парафин (далее — парафиновые срезы), В-клеточные лимфобластные лимфомы экспрессируют пан-В-клеточные антигены CD79a и в 50% случаев — CD20,
кроме этого, интенсивные положительные реакции дают антитела
к CD10, CD34 и TdT. Могут экспрессироваться гранулоцитарные
антигены CD13 и CD33, что не исключает диагноза опухоли из
предшественников В-клеток. Опухолевые клетки ранних стадий
дифференцировки (В-ОЛЛ из ранних предшественников) экспрессирует CD19, в цитоплазме — CD79a и CD22, а в ядре — TdT.
На промежуточной стадии дифференцировки (общий ОЛЛ —
CALLA) бласты экспрессируют CD10. Поздние стадии дифференцировки (пре-В-ОЛЛ) характеризуются появлением цитоплазматической экспрессии ц-цепей. Поверхностные иммуноглобулины,
как правило, не экспрессируются. CD5 и циклин D1 не экспрессируются (Borowitz M. J., Croker В. P. et aL 1983; Navid E, MosijczukA. D. era!.. 1999).'
Лимфомы из теток с штунофенотипом периферических
В-лимфоцитов
Лимфоцитарная лимфома/хронический лимфолейкоз. Основным компонентом лимфоцитарной лимфомы является опухолевый аналог лимфоцита. Эти клетки имеют округлое ядро, содержащее плотные глыбки гетерохроматина, которое окружено узким,
часто неразличимым ободком бледно окрашенной цитоплазмы.
184
Часть 1. Теоретическая гематология
Клетки большего размера, с более нежным хроматином в ядрах и
более широк: гм ободком цитоплазмы, которые цитологически можно определить как пролимфоциты, обнаруживаются в меньшем
количестве. Иногда опухолевые клетки могут дифференцироваться до стадии плазматических клеток, но это еще не является основанием для д] [агноза лимфоплазмоцитарной лимфомы. Всегда среди клеток лимфоцитарной лимфомы встречаются активированные лимфоидные клетки («бластные» формы). Это довольно
крупные клетки с округлым ядром и заметным ядрышком, лежащим в его центре. Гетерохроматина в ядре мало, он имеет нежное
строение, ядра клеток выглядят светлыми. При окраске срезов азур
П-эозином цитоплазма «бластов» не имеет выраженной базофилии, как у иммунобластов, описанные клетки получили название
«параиммунобластов» (Ben Ezra J., Burke J. S. et al., 1989).
От больного к больному и при выполнении нескольких биопсий у одного н того же больного соотношение количества малых
лимфоцитов, пролимфоцитов и параиммунобластов может отличаться. Про.'шмфоциты и параиммунобласты могут располагаться
достаточно компактно, и при исследовании препаратов при малом
увеличении эти нечетко очерченные скопления выглядят как более светлые пятна, создавая псевдофолликулярный тип строения
опухолевой ткани. Частота обнаружения маркеров пролиферативHoi'i активности (Ki-67) в клетках псевдофолликулов выше (центры пролиферации). Диффузный тин строения имеют лимфоцитарные лимфомы с примесью небольшого количества пролимфоцитов н параиммунобластов, которые не образуют заметных
скоплений. Обширные ноля пролимфоцитов и параиммунобластов при опухолевидном типе строения довольно четко отграничены от участков лимфоцитарной лимфомы, содержащих почти одни
малые лимфоциты (Bonato M., Pittaluga S. et al., 1998).
В клинической практике не следует пытаться разграничить лимфоцитарную лимфому и хронический лимфоцитарный лейкоз на
основании гистологического, иммуногистохимпческого и молекулярно-генетического анализа биопсированного лимфатического
узла, учитывая единую биологическую природу этого вида опухолей. Для диагноза лимфоцитарной лимфомы при клиническом обследовании должно быть доказано отсутствие поражения костного
мозга и периферической крови у пациента.
Иммунофенотип. Лимфоцитарные лимфомы (хронические лимфолейкозы) с В-клеточным иммунофенотипом слабо экспрессируют на опухолевых клетках поверхностные IgM или IgM и IgD,
сильно экспрессированы пан-В-клеточные антигены CD20 и
Глава 9. Иммуногистохимия
185
CD79a. В отличие от нормальных малых В-лимфоцитов обнаруживается экспрессия CD5 и CD43. Для получения результата с
CD5 в парафиновых срезах необходимо применение систем амплификации сигнала Экспрессия антигена CD23. характерная для
В-клеточных лимфоцитарных лимфом, может оказаться полезной
для дифференциальной диагностики этих опухолей и лимфом из
клеток зоны мантии, клетки которой не экспрессируют CD23. Примесь реактивных Т-клеток может быть весьма значительной, обычно больше их в центрах пролиферации. Интенсивность экспрессии
CD5 реактивными Т-клетками выше, чем опухолевыми В-лимфоцитами (Matutes E., Owusu-Ankomah К. et al, 1994).
В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз. Опухолевые клетки имеют средние размеры (вдвое больше лимфоцита), округлое
ядро п явно различимые ядрышки. Диагноз устанавливается, когда доля опухолевых пролимфоцитов в периферической крови превышает 55%. Случаи с меньшей долей пролимфоцитов относят к
хроническому лимфолейкозу с увеличенным количеством пролимфоцитов. Заболевание характеризуется выраженной спленомегалией без периферической лимфаденопатии и быстро растущим
лимфоцитозом, часто более 100 х 10 9 / л (Melo J. V., Catovsky D.,
GaltonD. A., 1986).
Опухолевые пролимфоциты имеют округлую форму ядра,
иногда встречаются формы с зазубренным ядром. Хроматин умеренно конденсирован, ядрышки отчетливо различимы и располагаются центрально. Неширокий ободок слабобазофильной цитоплазмы окружает ядро. Опухолевая ткань в лимфатических
узлах растет диффузно, не образуя псевдофолликулярного рисунка строения.
Иммунофеногпип. Выявляется сильная экспрессия поверхностных иммуноглобулинов М или М и D, В-клеточных антигенов
CD19, CD20, CD22, CD79cx. CD5 обнаруживается только в трети
случаев, CD23 обычно отсутствует. Поражение лимфатических узлов опухолью из пролимфоцитов, имеющих зазубренное ядро и
В-клеточный иммунофенотип с CD5"CD23 , может создать большие трудности в дифференциальной диагностике с лимфомой из
клеток зоны мантии. В таких случаях необходимо исследовать экспрессию циклина D1, который должен обнаруживаться в ядрах
большинства клеток лпмфомы из клеток зоны мантии (Matutes E.,
Owusu-Ankomah К. et al., 1994).
Лимфоплазмоцитарная лимфома. Опухолевые клетки в лимфоплазмоцитарной лимфоме — малые В-лимфоциты, плазмоцитоидные лимфоциты и плазматические клетки. Иммуноглобулины
186
Часть 1 Теоретическая гематология
(IgM) определяются в клетках с плазмоцитарной дифференцировкой в цитоплазме или в качестве внутриядерных включений —
телец Дютчера (Dutcher). Иммуноглобулины могут выявляться и
в сыворотке крови в качестве парапротеина, когда заболевание
клинически проявляется как макроглобулннемии Валденстрема.
В большинстве случаев моноклональная протеинемия обусловливает криоглобулинемию и вязкость крови (Dimopoulos M.,
Panayiotidis P. el al., 2000).
Опухоль в лимфатических узлах растет диффузно, без образования псевдофолликулярного рисунка строения. В составе опухолевого пролпферата в разнообразных долевых соотношениях обнаруживаются малые В-лимфоциты, плазмоцитоидные лимфоциты (клетки с ядром, характерным для лимфоцита, и широкой
базофильной цитоплазмой) и плазматические клетки. Нередко обнаруживаются внутриядерные ШИК-позитивные включения —
тельца Дютчера. Это не вакуоли, а глубокие инвагинации ядерной
мембраны, в бухтах которой оказывается цитоплазма.
Иммунофенотип. Большинство клеток позитивно реагируют с
антителами к CD79a, CD20, CD 19 и CD22 и не дают реакций на
CD5, CD 10 и CD23. Экспрессия CD43 вариабельна. В клетках
обнаруживаются поверхностные иммуноглобулины, в некоторых —
цитоплазматические. Обычно это иммуноглобулины класса М, реже
G или А. Характерно отсутствие экспресии IgD.
Другие лимфомы В-к.теточного происхождения (лимфоцитариая, маргинальной зоны и фолликулярная лимфомы) также могут
иметь плазмоцитарную дифференцировку. Поэтому диагноз лимфоплазмоцитарной лимфомы устанавливается методом исключения.
Волосатоклеточный лейкоз характеризуется наличием в мазках периферической крови и костного мозга клеток с ворсинчатой
поверхностью и бобовидным ядром. Поражение костного мозга и
селезенки приводит к нанцитопении и выраженной спленомегалии. Инфильтрация лимфатических узлов происходит редко
(Bouroncle В. Л., 1994).
Иммунофенотип. Клетки экспрессируют (в дополнение к типичным антигенам В-клеток) CD lie, рецептор интерлепкина-2
(CD25) и интегрин CD103 (молекулы клеточной адгезии). CD5,
CD10 и CD23 не экспрессированы (Frassoldati A., Lamparelli Т.
et al.. 1994).
Плазмоцитома/плазмоклеточнаямиелома. Плазматические
клетки характерны для миеломы, или плазмоцитомы. Термин плазмоклеточная миелома употребляется, когда опухоли находятся в
Глава 9. Иммуногистохимия
187
костном мозгу и вызывают разрушение скелета. Термин плазмоцитома относится к более редко встречающимся опухолям, которые
возникают экстрамедуллярно, или к солитарному поражению кости (Bartl R., Frisch В. et al, 1982).
Иммунофенотип. Поверхностные антигены В-клеток практически отсутствуют, так же как и у нормальных зрелых плазматических клеток, но обнаруживается цитоплазматический моноклональнын иммуноглобулин (или только легкие пени иммуноглобулинов). В большинстве случаев не экспреесированы общелейкоцитарный антиген, В-клеточныс антигены CD19 и CD20, а экспрессироваи CD79a (LingN. R., McLennan I. С, Mason D. Y, 1987).
Характерна экспрессия CD38, CD138, антигена эпителиальных
мембран. В некоторых случаях обнаруживается аномальная коэкспрессия миеломоноцитарных антигенов.
Лимфома из клеток зоны мантии — это современное определение лимфом, которые ранее назывались центроцитарными.
Опухолевые клетки обнаруживают многие характеристики лимфоцитов из зоны мантии. Обычно они бывают малого или среднего размера с неправильным или «расщепленным» ядром, иногда
могут иметь «бластный» вид. Опухолевых трансформированых
лимфоидных клеток (центробластов, иммунобластов и параиммунобластов) и псевдофолликулов (пролиферативных центров)
в опухоли нет. Характер роста нередко подулярный, возможен
диффузный и мантийный рост. Хроматин опухолевых клеток негрубо зернистый или мелкоглыбчатый, равномерно распределен
по объему ядра. Ядрышки неразличимы (Ott G., Kalla J. et al.,
1998).
Иммунофенотип. Выявляется умеренная экспрессия поверхностных иммуноглобулинов М или М и D, В-клеточных антигенов
CD19, CD20, CD22,'CD79oc. CD43 и CD5 обычно экспрессированы, но лимфома из клеток зоны мантии отличается от других
СВ5-иоложительных В-клеточных новообразований (лимфоцитарные лимфомы/лейкозы) отсутствием CD23 или только слабой
экспрессией в некоторых случаях. Не экспрессируется CD10 и
Bcl-6-протеин. Антитела к фолликулярным дендритическим клеткам (CD21, CD23 или CD35) дают возможность увидеть выраженную гиперплазию этих клеток в виде сети с тенденцией к образованию скоплений фолликулярных дендритических клеток в местах
нодулярного строения.
Часто встречающаяся транслокация между хромосомой 11 и
участком хромосомы 14, кодирующим тяжелые цепи иммуноглобулинов, ассоциирована с усиленной экспрессией гена, кодирующего
188
Часть 1. Теоретическая гематология
циклин D1. Антитела к циклину D1 выявляют ядерную экспрессию в большинстве случаев лимфом из клеток зоны мантии. Для
исследования необходима система усиления сигнала (с биотинилированным тирамидом или другие), при этом только сильная экспрессия в большинстве ядер должна иметь диагностическое значение. Цитоплазматическое окрашивание с антителами к циклину
D1 не имеет значения в диагностике лимфом из клеток зоны мантии (De Boer С. J., Schuuring E. et al.,1995).
Выделение бластоидного варианта лимфомы из клеток зоны
мантии имеет клиническое значение. Этот вариант опухоли характеризуется более крупным размером клеток, напоминающих лимфобласты с зазубренным ядром, мелкодисперсным хроматином в
нем и высокой митотической активностью. Опухолевые клетки в
бластоидном варианте лимфомы из клеток зоны мантии экспрессируют В-ассоциированные антигены CD20 и CD79a, а также CD43
и CD5. Ядерная экспрессия циклина D1 делает диагноз несомненным, но обнаруживается не во всех случаях. В отличие от лимфобластных лимфом не экспрессируются TdT, CD 10 и CD34.
Фолликулярные лимфомы представляют собой группу лимфоидных опухолей, происходящих из светлых центров размножения фолликулов и включающих все их элементы: центробласты,
центроциты, фолликулярные дендритические клетки и макрофаги. Опухоль обычно имеет фолликулярное или фолликулярное и
диффузное строение, реже — только диффузное. Между опухолевыми фолликулами встречаются зоны, состоящие из Т-лимфоцитов. Слои Т-клеток заметно менее массивны, чем при фолликулярной гиперплазии лимфатических узлов.
Гистологическое исследование выявляет практически полное
замещение лимфатического узла тканью опухоли, нередко простирающейся за пределы капсулы в перинодальную клетчатку. Синусы лимфатического узла в некоторых случаях сохраняются и даже
могут быть расширены. Учитывая характер роста фолликулярных
лимфом, выделяют опухоли с фолликулярным характером роста,
фолликулярным и диффузным и, наконец, диффузным.
Весьма полезен простой прием микроскопии, позволяющий
обнаружить фолликулярный тип роста лимфомы. Для этого необходимо исследовать препарат, окрашенный гематоксилин-эозином или азур П-эозином, с помощью объектива с 3,2-кратным
увеличением или меньшим при сильно ослабленном освещении.
Особенно удобен для этой цели осветитель с реостатом для изменения накала лампочки. Фолликулярный рисунок строения лимфомы, незаметный при ярком освещении с объективами с 8-
Глава 9. Иммуногистохимия
189
10-кратным увеличением, становится отчетливо различимым под
лупой в слабо освещенном препарате.
Клеточный состав опухолевых фолликулов определен происхождением фолликулярных лимфом. Большинство клеток составляют центроциты — клетки, в 1,5-2 раза превышающие по размерам малый лимфоцит, с неправильной формы угловатым ядром,
имеющим скорее многоугольную или клиновидную форму. Другое
свое название — пролимфоцит с расщепленным ядром — центроциты в гистологических срезах оправдывают не всегда. Расщелина, довольно отчетливая в цитологических препаратах, в срезах
только иногда видна как бороздка или черта на ядре. Ядро содержит грубо глыбчатый гетерохроматин и не всегда различимое ядрышко. Ободок цитоплазмы практически не виден. Центробласты
крупнее центроцитов, имеют округлую форму и отчетливый ободок базофилыгой цитоплазмы. Ядра содержат небольшое количество гетерохроматина в виде мелких зерен и глыбок, располагающихся преимущественно на периферии ядра, возле ядерной мембраны располагаются обычно 2-4 ядрышка. Атипия строения
опухолевых центробластов может проявляться в виде глубоких
вдавлений ядерной мембраны, иногда в двуядерности клетки или в
многодольчатом строении ядра.
Центроциты и центробласты образуют довольно однородную
смесь. Зоны с диффузным характером роста в фолликулярных
лимфомах также образованы однородной смесью центроцитов, центробластов и малых лимфоцитов. Поскольку признано, что фолликулярные лимфомы с фолликулярным и диффузным и только с
диффузным характером роста имеют худший прогноз, и в гистологическом заключении необходимо отражать обнаружение зон диффузного роста (Nathwani В. N., Metter G. E. et al., 1986).
Для уточнения прогноза имеет значение цитологический состав опухоли. В зависимости от доли центробластов выделяют типы
(степени) фолликулярных лимфом: 1) содержащие менее 50 центробластов на площади среза, равной 1,6 мм2 (10 полей зрения большого увеличения площадью 0,159 мм2); 2) содержащие 50-150 центроцитов на площади среза 1,6 мм-; 3) фолликулярные лимфомы с
2
более чем 150 центробластами на площади среза, равной 1,6 мм .
Необходимо провести подсчет в 10 полях зрения в различных случайно выбранных в срезе фолликулах. Если в фолликулярной лимфоме преимущественно 1-й или 2-й степени строения обнаруживают зону, имеющую 3-ю степень строения, то это обстоятельство
должно быть отражено в заключении с указанием примерного соотношения объемных долей отличающихся компонентов.
190
Часть 1. Теоретическая гематология
Третий тип фолликулярных лимфом подразделяется на опухоли За степени, в которых при наличии более 150 центробластов на
площади среза 1,6 мм2 центроциты все же присутствуют; и на опухоли ЗЪ степени, образованные солидными полями фолликулярного строения, состоящими только из центробластов.
При наличии зон диффузного строения в фолликулярной лимфоме обозначают тип роста: преимущественно фолликулярный,
если доля фолликулярного компонента превышает 75%, фолликулярный и диффузный, если фолликулярный компонент занимает
25-75% объема, и очагово-фолликулярный, если фолликулярный
компонент составляет менее 25% объема опухоли.
Для фолликулярных лимфом диффузного строения на площади среза 1,6 мм2 выделяют два типа (степени): 1-й —от 0 до 50 центробластов и 2-й — от 51 до 150.
Появление в ткани фолликулярной лимфомы участка, имеющего строение диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфомы, означает агрессивную трансформацию и должно быть отражено в заключении с указанием доли каждого компонента.
В участках с диффузным характером роста в фолликулярных
лимфомах чаще обнаруживаются поля склероза, в целом довольно
характерного для лимфом фолликулярного происхождения. Особенно часто склеротические изменения встречаются в висцеральных лимфатических узлах, пораженных фолликулярной лимфомой. Среди пеходжкинских злокачественных лимфом тотальный
некроз пораженных лимфатических узлов встречается практически только в фолликулярных лимфомах.
Иммунофенотип. Фолликулярные лимфомы являются опухолевым эквивалентом нормальных центров размножения. Если фолликулярный рисунок строения неходжкинской лимфомы очевиден, иммуногистохимическое исследование для определения В- или
Т-клеточной природы процесса особой диагностической ценности
не имеет. Клетки опухолевых фолликулов экспрессируют В-ассоциированные антигены CD 19, CD20, CD22 и CD79a. Фолликулярные дендритические клетки обнаруживаются с помощью CD21
или CD23. В отличие от лимфом из клеток зоны мантии фолликулярные лимфомы (в том числе и с диффузным характером роста)
CD 10 очень часто позитивны, CD5 и CD43 — негативны.
В большинстве случаев фолликулярных лимфом выявляется
транслокация между 14-й и 18-й хромосомами. Перемещение онкогена bcl-2 к гену, кодирующему тяжелую цепь Ig, сопровождается экспрессией протеина Вс1-2. В этом состоит отличие опухолевых клеток фолликулярных лимфом от нормальных В-лимфоци-
Глава 9. Иммуногистохимия
191
тов зародышевых центров, в которых отсутствует экспрессия протеина Вс1-2. Фолликулярные лимфомы, в которых транслокация
t(14;18) отсутствует, обычно также экспрессируют протеин Вс1-2.
Указанный факт позволяет использовать антитела к протеину Вс1-2
для дифференциальной диагностики фолликулярных лимфом и
фолликулярных реактивных гиперплазии лимфатических узлов.
Экспрессия опухолевыми клетками протеина Вс1-2 обнаруживается почти в 100% случаев фолликулярных лимфом 1-й степени, в
лимфомах 3-й степени частота экспрессии уменьшается до 75%
(Lai R., Arber D. A. et al.,1998).
При общепризнанной В-клеточной природе фолликулярных
лимфом применение с терапевтической целью антител к CD20
(ритуксимаб) у больного невозможно без положительного результата иммуногистохимического исследования, который доказывает
экспрессию CD20 клетками лимфомы у этого пациента.
В-клеточные лимфомы маргинальной зоны. Экстраиодальная, нодальная лимфомы маргинальной зоны MALT-типа и селезеночная лимфома маргинальной зоны имеют морфологически
сходный опухолевый субстрат - моноцитоидные В-клетки. Моноцитоидные В-лимфоциты характеризуются определенными цитологическими признаками. Они имеют овальное или бобовидное
ядро с небольшими зазубринами и широкий ободок оптически пустой цитоплазмы. Гетерохроматин ядра довольно гомогенный, ядрышки неотчетливы (Nathwani В. N., Anderson J. R. et al, 1999;
Isaacson P. G., Matures E. et al., 1994).
При поражении лимфатических узлов опухолевые аналоги моноцитоидных В-клеток могут располагаться вокруг лимфоидных
фолликулов, замещая мантийную зону, могут заполнять синусы
или распространяться диффузно. В некоторых случаях встречаются любые сочетания этих трех типов роста. Скопления моноцитоидных В-клеток имеют характерный вид из-за довольно широких
светлых промежутков, заполненных неокрашивающейся цитоплазмой, между ядрами бобовидной или неправильной формы. Часто
встречается другой тип моноцитоидной В-клеточной лимфомы из
клеток с округлыми ядрами. Ядра имеют правильную форму, но
неодинаковые размеры, и в одних случаях в опухоли преобладают
клетки с мелкими ядрами, в других — с более крупными. Довольно
много фигур митозов.
Поражение лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, сопровождается инфильтрацией эпителиальных
структур опухолевыми моноцитоидными В-клетками. Этот важный диагностический признак получил название лимфоэпители-
192
Часть 1 Теоретическая гематология
альных повреждений. Применение антител к цитокератинам контрастно выявляет эпителиальные структуры и упрощает обнаружен ие повреждений.
Резидуальная лимфоидная ткань представлена светлыми центрами размножения фолликулов, которые имеют обычный состав
из центроцитов, центробластов и макрофагов. В межфоллнкулярной ткани среди моноцитоидных В-к.теток часто обнаруживают
несколько более крупные лимфоциты и плазматические клетки.
Количество плазматических клеток мо'жет быть весьма значительным, и тогда возникают трудности в дифференциальной диагностике с лимфоплазмоцитарной лимфомой.
Иммунофенотип. Опухолевые моноцитеидные В-лимфоциты
экспрессируют В-ассоциированные антигены (CD20, CD79a) и
обычно не дают реакции с антителами к CD5, CD43 и CD23 (дифференциальная диагностика с лимфоцитарными лимфомами и
лимфомами из клеток зоны мантии), CD 10 (дифференциальный
диагноз с фолликулярными лимфомами) и циклином D1 (дифференциальный диагноз с лнмфомами из клеток зоны мантии) (Isaacson P. G., Norton A. J., 1994).
Диффузные крупноклеточные В-клеточные лимфомы. Морфологические проявления диффузных крупноклеточпых В-клеточных лимфом очень многообразны. Гистологическая картина
может сильно отличаться от случая к случаю, в пределах конгломерата пораженных лимфатических узлов у одного и того же пациента и далее в пределах одного лимфатического узла.
В опухолевой ткани могут преобладать центрооласты пли иммунобласты. Иногда ядра опухолевых клеток отличает многодольчатость или значительная атшшя строения, встречаются центроцитоидные центробласты.
Центрооласты могут быть довольно крупными (в 2-3 раза больше малого лимфоцита) и имеют округлую форму. Заметный ободок цитоплазмы с выраженной базофилией окружает светлое «пузырьковидное» ядро. Ядра выглядят светлыми из-за малого количества мелкодисперсного гетерохроматина, большая часть которого
в клетках, при обработке биоптата фиксирующими жидкостями,
оказывается возле ядерной мембраны. Отчетливо различимы небольшие ядрышки, количество которых колеблется от 2 до 4, и
располагаются они также на периферии ядра. Среди центробластов встречаются в небольшом количестве центроциты, центроцитоидные центробласты, иммунобласты и макрофаги с фрагментами фагоцитированного ядерного вещества. Много фигур митозов,^
в том числе патологических.
Глава 9. Иммуногистохимия
193
Клетки с многодольчатыми ядрами обычно имеют несколько
меньшие размеры, чем иммунобласты, хотя могут быть очень крупными. Ядро в них разделено на 2-4 доли, гетерохроматин имеет
нежное строение, ядрышки трудноразличимы. Цитоплазма базофильная или светлая. Обнаружение в лимфоме многодольчатых
клеток является косвенным указанием на ее происхождение из
лимфоидных клеток светлых центров размножения и, следовательно, на В-клеточную природу опухоли.
Форма ядер центроцитоидных центробластов вытянутая, овальная, полигональная, как у центроцитов, но размеры заметно больше и гетерохроматин в ядрах имеет «бластный» вид. Строение
гетерохроматина в ядрах центроцитоидных центробластов может
отличаться от его нежно глыбчатого строения в типичных центробластах: тонкая гомогенная пылевидная структура гетерохроматина по всему ядру без конденсации возле ядерной мембраны
придает ядрам центроцитоидных центробластов довольно светлый
однородный вид. Встречаются центроцитоидные центробласты
с грубым глыбчатым хроматином, который делает их более похожими на центроциты. В ядрах разных клеток обнаруживается 25 мелких базофильных ядрышек.
Иммунобласты — клетки с большим светлым пузырьковидным
ядром, одним центрально расположенным большим базофильным
ядрышком и ободком базофильной цитоплазмы вокруг ядра. Выраженная базофилия цитоплазмы обусловлена хорошо развитым
шероховатым эндоплазматическим ретикулумом с большим количеством рибосомальной РНК в цитоплазме. Иногда цитоплазма
содержит ШИК-положительные включения моноклоналыгого иммуноглобулина.
Опухоль может выглядеть однообразной, состоящей из почти
одинаковых клеток, но может иметь очень полиморфное строение
из-за большой вариабельности размеров иммунобластов. Митотическая активность высокая, встречаются многочисленные фигуры
патологических митозов. Большой объем опухоли может спонтанно некротизироваться, но иногда встречаются многочисленные
фигуры индивидуальной клеточной гибели (апоптоз). В случаях с
апоптозом в ткани диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом обнаруживают макрофаги, которые активно фагоцитируют
фрагменты погибших клеток (Engelhard M., Brittinger G. et al,
1997).
Иммунофенотип. Несмотря на весьма разнообразные гистологические проявления диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом. все опухолевые клетки экспрессируют общелейкоцитарный
7 Гематология. Нов. справочник
194
Часть 1. Теоретическая гематология
антиген и В-клеточные антигены (CD20, CD79a и др.). В отдельных случаях удается обнаружить экспрессию CD5 (10%) и CD43,
чаще — CD 10 (25-50%). В тех случаях, когда клетки В-клеточной
лнмфомы экспрессируют CD30 и ЕМА, но антитела ALK1 не обнаруживают в клетках ALK-протеин, опухоль относят к диффузным
крупноклеточным В-клеточным лимфомам, а не к анапластическим крупноклеточным СВЗО^лимфомам (Delsol G., Lamant L. et
al., 1997). Пролиферативная активность (Ki67) высокая, иногда
более 90%, но 100% не достигает (Miller Т. P., Grogan Т. М. et al.,
1994).
Классификация ВОЗ выделяет некоторые подтипы диффузных
крушюклеточных В-клеточных лимфом.
Первичные крупноклеточные В-клеточные лимфомы средостения составляют около 0,9% всех неходжкинских лимфом, уступая по частоте поражения средостения лимфобластным лимфомам
и лимфогранулематозу. Чаще болеют молодые (25-35 лет) женщины (2,5 : 1). Течение заболевания сопровождается метастазированием в почки, надпочечники, головной мозг и другие внутренние органы. Поражение периферических лимфатических узлов и костного
мозга менее характерно. Прогноз несколько хуже, чем у других диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом. Гистологическое
строение опухоли в каждом случае довольно однородно, но у разных
больных размеры и вид клеток опухоли значительно отличаются.
Опухолевые клетки имеют характерную бледную цитоплазму и происходят, как считается, от внутритимических В-клеток (Perrone Т.,
Frizzera G., Rosai J., 1986; Kirn D., Mauch P. et al., 1993).
В-клеточная лимфома с большим количеством Т-клеток/гистиоцитов в прошлом диагностировалась как лимфогранулематоз,
малочисленные крупные клетки (центробласты, клетки с многодольчатыми ядрами, клетки типа Березовского-ШтернбергаРид) с В-клеточным моноклональным происхождением располагаются в плотном реактивном инфильтрате из мелких Т-клеток и
гистиоцитов (Ramsay A. D., Smith W. J., Isaacson P. G., 1988). Выделить опухоль в самостоятельную клинико-морфологическую
форму стало возможным с помощью иммунофенотипирования и,
главным образом, молекулярно-генетического анализа.
Внутрисосудистая лимфома (интраваскулярный лимфоматоз)
характеризуется полиорганной пролиферацией опухолевых клеток в просвете артерий, капилляров и мелких вен. Стенки сосудов
и прилежащие ткани оказываются не тронуты опухолевой инфильтрацией или она очень незначительна. Клетки опухоли внутри кровеносных сосудов имеют морфологию крупных активированных
http://www.bestmedbook.com/
Глава 9. Иммуногистохимия
195
лимфоидных клеток, что вместе с иммунофенотипом позволяет
отнести лимфому к диффузным крупноклеточным В-клеточным
(Di Giuseppe J. A., Nelson W. G. et al* 1994).
Первичная лимфома серозных полостей с выпотом встречается очень редко и почти всегда у пациентов со СПИДом. Лимфома
растет в серозных полостях в виде клеточной взвеси из опухолевых иммунобластов или анаплазированных клеток. Во всех немногочисленных описаниях опухоль была ассоциирована с вирусом герпеса человека 8-го типа (вирус герпеса саркомы Капоши)
(Nador R. G., Cesarman E. et al., 1996).
Лимфома/'лейкоз Беркитта впервые была описана у африканцев. Опухоль обычно состоит из В-клеток среднего размера с
большой фракцией пролиферирующих клеток. В большинстве эндемических африканских случаен в злокачественных клетках обнаруживается ДНК вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Описание гистологически и фенотипически идентичных заболеваний встречается иногда и на Западе. Эти новообразования могут возникать у
пациентов с иммунодефицитом, и в таких случаях часто выявляется
присутствие вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Однако «спорадические» неафриканские лимфомы возникают и при отсутствии ослабления иммунной системы, и тогда данный вирус обнаруживается
редко. Практически все случаи, независимо от места проживания
больного, характеризуются хромосомными транслокациями, захватывающими ген туе на 8-й хромосоме и ген тяжелой цепи иммуноглобулина или, более редко, один из двух генов легких цепей.
Лимфатический узел полностью замещен монотонным диффузным опухолевым пролифератом, состоящим из тесно расположенных лимфобластов небольшого размера. Клетки расположены настолько плотно, что сдавливают друг друга и в срезах имеют не
округлую, а многоугольную форму. Ядра клеток содержат довольно много нежнозернистого гетерохроматина и поэтому выглядят
темными. В ядрах располагаются 2-3 базофильных ядрышка. В них
отчетливо различим узкий ободок базофилыгой цитоплазмы. В цитологических препаратах в цитоплазме клеток обнаруживаются
мелкие округлые вакуоли. В тонких гистологических препаратах
из хорошо фиксированного материала с помощью большого увеличения удается увидеть, что ядра лнмфобластов имеют неправильные очертания и окружены едва различимой узкой зоной просветления цитоплазмы. Эта зона просветления в базофильной цитоплазме имеет четкообразное строение.
Митотическая активность обычно очень велика, встречается
много фигур апоптоза, что свидетельствует о коротком жизненном
196
Часть 1. Теоретическая гематология
цикле клеток и быстром росте опухоли. В ткани опухоли беспорядочно рассеяны крупные макрофаги с обильной светлой цитоплазмой, которая содержит фагоцитированные многочисленные обломки ядер распавшихся лимфобластов. Количество макрофагов может быть разным в разных случаях. Такое гистологическое строение
лимфомы традиционно обозначают как «звездное небо». Необходимо подчеркнуть, что феномен «звездного неба» не является патогномоничным признаком лимфомы Беркитта и встречается в
других лимфомах из бластных или активированных лимфоидных
клеток. Может оказаться непросто провести дифференциальную
диагностику лимфомы Беркитта и диффузной крупноклеточной
В-клеточной лимфомы.
Иммунофенотип. По иммунологическому фенотипу клетки относятся к периферическим В-клеткам, CD10 также часто экспрессируется, это дает основание предполагать их происхождение от
клеток зародышевых центров лимфоидных фолликулов. Не обнаруживается реакция с антителами к CD43, TdT и Т-клеточным
антигенам. Диагностическое значение имеет выявление пролиферирующей фракции опухолевых клеток. Лимфома Беркитта характеризуется очень высокой пролиферативной активностью, и
практически 100% клеток метятся антителом Ki-67 (Spina D.,
Leoncini L. et al, 1997).
Лимфобмстные лимфамы/лейкозы из клеток
силтунофенотипач Т-клетокпредшественников
Морфология Т-лимфобластныхлимфом/лейкозов, образующихся из предшественников Т-клеток, обычно неотличима от морфологии лимфобластных В-клеточных лимфом. Они проявляются
как острые лейкозы, но иногда развиваются как опухоли в лимфатических узлах или тимусе. Пролиферат из опухолевых Т-лимфобластов чаще всего полностью вытесняет лимфоидную ткань
пораженного лимфатического узла и инфильтрирует капсулу. Могут встречаться участки с макрофагами, расположенными среди
лимфобластов поодиночке, — «звездное небо». Если лимфоидная
ткань замещена не полностью, опухолевые клетки чаще находятся
в паракортикальной зоне. В биоптатах из средостения нередко можно обнаружить своеобразное расположение опухолевых лимфобластов, которые выстраиваются в узкие линейные ряды или цепочки. В некоторых случаях ткань опухоли содержит эозинофильные гранулоциты.
Иммунофенотип. Т-клеточные лимфобластные лимфомы экспрессируют TdT и обнаруживают вариабельную экспрессию анти-
Глава 9. Иммуногистохимия
197
генов Т-клеток (CDla, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 и CD43).
В зависимости от степени дифференцировки опухолевых бластов
возможна экспрессия только некоторых Т-клеточных антигенов,
таких как CD7 или CD3 (обычно CD3 обнаруживается только в
цитоплазме), возможна коэкспрессия CD4 и CD8 (Czuczman M. S.,
Dodge R. К. et al., 1999). Встречаются случаи с экспрессией пан-Вклеточного антигена CD79a. Почти в 80% случаев обнаруживается экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45RB, в половине — CD45RO. Наличие гранулоцитарных антигенов CD 13 и CD33,
как и в В-клеточных лимфобластных лимфомах, диагноз Т-лимфобластной лимфомы не исключает. Экспрессия различных Т-клеточных антигенов может отражать степень дифференцировки опухоли. Незрелые опухоли экспрессируют цитоплазматический CD3,
а также CD2 и CD7. Следующие стадии дифференцировки связаны с экспрессией CD5 и CDla. Наиболее дифференцированные
Т-лимфобластные лимфомы экспрессируют CD3 на мембране опухолевых клеток.
Лимфомы из клеток с иммунофенотипом периферических
(посттимических) Т-лимфоцитов и естественных киллеров
Учитывая клинические особенности лимфом с иммунофенотипом периферических (посттимических) Т-лимфоцитов, их можно
разделить на первично лейкемические опухоли, первично нодальные и первично экстранодальные.
Первично лейкемические формы объединяют Т-пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз из крупногранулярных лимфоцитов, NK-клеточный лейкоз IT Т-клеточный лейкоз/лимфому
взрослых.
Т-клеточные пролимфоцитарные лейкозы напоминают лимфоцитарные лейкозы В-клеточного происхождения, так как часто
проявляются лейкемической картиной крови. Опухолевые клетки схожи, хотя у Т-клеток более явно выделяются ядрышки и обильнее цитоплазма, что более соответствует описанию пролимфоцита. В отличие от В-клеточных лимфоцитарных лимфом никогда не
обнаруживаются пролиферативные центры (псевдофолликулы).
В ткани опухоли при поражении лимфатического узла Т-клеточным пролимфоцитарным лейкозом могут обнаруживаться довольно многочисленные древовидно-ветвящиеся посткапиллярные венулы с набухшим эндотелием, а в некоторых участках в толще
стенки венул располагаются опухолевые лимфоидные клетки. В хорошо приготовленных тонких гистологических препаратах отчет-
198
Часть 1. Теоретическая гематология
ливо заметно неправильное строение ядер, отличающееся от округлых клеток В-.тимфоцитарных лимфом.
Иммунофенотип. Эти лимфомы экспрессируют Т-клеточные антигены, CD7 и обычно бывают СО4-позитивными (CD4+CD8~ —
60%, CD4XD8+ - 25%, CD4CD8 + - 15%). Не экспрессируются
TdT и CDla (Matutes E., Brito-Babapulle V. et al, 1991).
T-клеточный лейкоз из крупных гранулярных лимфоцитов диагностируют при обнаружении в периферической крови крупных
лимфоидных клеток (15- 18 мкм) с обильной цитоплазмой, содержащей азурофильные гранулы, и бобовидным ядром. В норме количество крупногранулярных лимфоцитов находится в пределах
2 -4 х 108/л. У больных количество превышает 2 х 109/л (медиана
8 х 109/л). При нормальном количестве лейкоцитов очень важно
тщательно исследовать мазки крови для поиска и подсчета крупногранулярных лимфоцитов. Для заболевания характерны анемия,
нейтропения, поражение костного мозга, спленомегалия, частые
бактериальные инфекции, ассоциация с ревматоидным артритом.
Иммунофенотип. Встречается несколько иммунофенотшшческих вариантов. Наиболее частый имеет профиль CD3 , CD4 ,
CD8^, TCRaP'; редкие варианты - CD3', CD4*. CD8 , TCRccP ;
CD3 , CD4+. CD8\ TCRaP"; CD3", TCRyS". CD4 и CDS экспрессируются неотчетливо. В каждом случае по-разному экспрессируются CD lib, CD56 и CD57. Обычно обнаруживается TIА-1 (Lamy Т.,
Loughran Т. Р., 1999).
Агрессивный NK-клеточный лейкоз — заболевание, встречающееся у лиц молодого возраста в странах Востока, характеризуется
спленомегалией, большим полиморфизмом и более бластным видом опухолевых лимфоидных клеток. В цитоплазме этих клеток
различимы нежные азурофильные гранулы.
Иммунофенотип. CD2\ sCD3 , CD3e+, CD4 , CD8 *, CD16*,
CD56*, TIA1\ CD57 обычно не экспрессирован (ChanJ. К., 1998).
Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых характеризуется
выраженной вариабельностью морфологических проявлений —
смесь мелких и крупных атипичных лимфоидных клеток с полиморфными ядрами — имеет в зависимости от преобладающего
компонента различный вид от случая к случаю. В периферической крови опухолевые клетки часто имеют характерные многодольчатые ядра. Заболевание встречается у взрослых, эндемично
для Японии, Бразилии и стран Карибского бассейна, ассоциировано с вирусом HTLV1. Протекает в тлеющей, хронической, острой (с гиперкальциемией) лейкемических формах и в виде лимфомы.
Глава 9. Иммуногистохимия
199
Иммунофенотип. Клетки экспрессируют CD2, CD3, CD4. CD5.
CD25, редко CD30, не экспрессируют CD7, CD8, TIA-1, granzyme
В, ALK (Shimoyama М„ 1991).
Раздел Т-к.теточных лимфом с первичной локализацией в лимфатических узлах появился в гистологических классификациях
после того, как иммунологические методы стали широко применяться в исследовании гистологических срезов. Сопоставление
иммунофенотипа Т-клеточных лимфом с их гистологическим строением и клиническими особенностями обнаружило, что существуют признаки, которые позволяют с большой вероятностью предположить диагноз Т-клеточной лимфомы с иммунофенотипом периферических (посттимических) лимфоцитов.
Вполне чувствительными и специфичными для предположительного гистологического диагноза следует считать следующие
морфологические признаки принадлежности неходжкинских лимфом к Т-клеточному типу: 1) диффузный характер роста лимфомы
с поражением в начальных стадиях развития опухоли паракортикальной зоны; 2) появление большого количества посткапиллярных венул с набухшим эндотелием; 3) гнездный вид расположения
(компартментализация) опухолевых клеток, разделенных тонкими пучками коллагеновых волокон; 4) широкие вариации размеров и формы ядер, отсутствие клеток с расщепленными ядрами;
5) клетки лимфомы имеют светлую цитоплазму с четкой мембраной, иногда образуя рисунок «булыжной мостовой»; 6) наличие
полиморфных клеток, в том числе подобных клеткам Березовского-Штернберга-Рид; 7) примесь гистиоцитов, эпителиоидных клеток, эозинофильных лейкоцитов и плазматических клеток.
Ангиоиммунобластнаялимфома. При ангиоиммунобластной
лимфоме нормальные анатомические структуры лимфатического
узла замещает богато васкуляризированный инфильтрат, который
может распространяться через капсулу в перинодальную жировую
ткань. Нередко удается увидеть остатки лимфоидных фолликулов
в виде неотчетливо очерченных скоплений малых лимфоцитов.
Характерные структуры из фолликулярных дендритических клеток в виде округлых образований с концентрическими рядами вытянутых (CD21 и CD35 позитивных) клеток встречаются за пределами остатков В-зоны лимфатического узла и не всегда имеют
отношение к предсуществовавшим «выгоревшим» лимфоидным
фолликулам.
Опухолевый инфильтрат не очень плотный, межклеточные пространства заполнены аморфным или нежнозернистым ШИК-положительным материалом. Многочисленные древовидно-ветвя-
200
Часть 1. Теоретическая гематология
щиеся посткапиллярные венулы с высоким набухшим эндотелием
имеют утолщенную стенку, содержащую ШИК-положительное гомогенное вещество базальной мембраны.
Цитологический состав опухолевого инфильтрата весьма разнообразен. Преобладают мелкие и среднего размера клетки с полиморфными ядрами, заметными ядрышками и бледной серой или
голубоватой цитоплазмой при окраске азур П-эозином. Характерны клетки с объемной, оптически пустой цитоплазмой («светлые»
клетки), их количество варьирует весьма значительно: от единичных, которые легко не заметить, до сплошных полей среди посткапиллярных венул. Содержимое цитоплазмы «светлых» клеток
ШИК-реакцию не дает (Jaffe E. S., 1995).
Иммунофенотип. Крупные клетки обычно экспрессируют CD3
и CD4. Малые лимфоциты в составе полиморфного инфильтрата
могут иметь фенотип CD8T. Всегда в небольшом количестве встречаются довольно крупные базофильные бласты с В-фенотипом и в
некоторых случаях — единичные многоядерные клетки, имеющие
сходство с клетками Березовского-Штернберга-Рид. С развитием процесса увеличивается количество иммунобластов и фигур
митозов. Крупные клетки (в большем или меньшем количестве)
экспрессируют CD30.
Обязательным компонентом сложной гистологической картины являются поликлональные плазматические клетки и плазмобласты, более или менее многочисленные эозинофильные гранулоциты, небольшие скопления эпителиоидных гистиоцитов
(Nakamura S., Suchi Т., 1991).
Первично нодальные Т-клеточные лимфомы с иммунофенотипом периферических лимфоцитов в Усовершенствованной Кильской классификации занимали несколько самостоятельных рубрик,
отличаясь размерами и морфологическими признаками опухолевых клеток, характером реактивного компонента. Довольно часто
было почти невозможным однозначно отнести лимфому из этого
круга к определенной категории Кильской классификации. Поэтому классификация ВОЗ объединяет лимфомы из этих рубрик в
единую категорию «лимфом из клеток с иммунофенотшюм периферических Т-лпмфоцитов», но добавляет определение «неуточненные», что указывает на наличие нескольких различных морфологических вариннтог, лимфом (Suchi Т., Lennert К. et al., 1987).
Лимфомы с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов', неуточиенные. Данные опухоли образованы смесью из
крупных и мелких клеток, часто с ядрами неправильной формы.
Глава 9. Иммуногистохимия
201
Возможна значительная примесь неопухолевых клеток, включающих макрофаги, эозинофильные гранулоциты и в некоторых случаях скопления эпителиоидных клеток. Набор экспрессированных
Т-клеточных антигенов варьирует: так, CD4 экспрессируется чаще,
чем CD8. Крупные скопления и целые поля эпителиоидных гистиоцитов — признак, который сразу бросается в глаза при гистологическом исследовании лимфатического узла с лимфоэпителиоидной лимфомой (лимфомой Леннерта). Гистиоциты имеют широкий ободок светлой цитоплазмы и овальное или бобовидное ядро
с отчетливо различимым ядрышком. В скоплениях иногда встречаются гигантские многоядерные клетки с ядрами такого же строения. Диффузно распределены немногочисленные плазматические
клетки и эозинофильные гранулоциты. Это придает опухоли внешнее сходство с лимфогранулематозом.
Собственно клетки опухоли располагаются между скоплениями эпителиоидных гистиоцитов. Главным критерием для гистологического диагноза лимфомы Леннерта являются цитологические
особенности опухолевого компонента. Атипичные лимфоидные
клетки несколько крупнее малого лимфоцита. Ядро клетки округлое, овальное или несколько вытянутое со «смятой» или «жатой»
поверхностью. Встречаются среднего размера иммунобласты и
крупные одноядерные и многоядерные опухолевые клетки с грубым хроматином в ядрах, мелкими базофильными ядрышками и
базофильной цитоплазмой, которые отличаются от клеток Ходжкина и Березовского-Штернберга-Рид.
Энителиоидные клетки могут муфтообразно окружать кровеносные сосуды лимфатического узла и распространяться за пределы капсулы. Посткапиллярные венулы лучше выявляются в препаратах, окрашенных ШИК-реактивом или импрегнированных солями серебра.
Характер роста и состав клеточного инфильтрата другого варианта лимфомы из клеток с иммунофенотипом периферических
Т-лимфоцитов позволили дать ей название лимфомы Т-зоны. При
исследовании под малым увеличением на стадиях, когаа лимфома
еще не захватила весь лимфатический узел, всегда удается увидеть
лимфоидные фолликулы, окруженные более светлой, довольно однородной межфолликулярной опухолевой тканью. В некоторых
случаях лимфоидные фолликулы имеют большой светлый центр
размножения, который окружен компактной зоной мантии, иногда
резидуальная В-клеточная зона состоит из фолликулов без активных центров размножения. Постепенно фолликулы начинают исчезать, пока полностью не будут вытеснены лимфомой.
202
Часть 1. Теоретическая гематология
В опухолевом инфильтрате преобладают мелкие лимфоидные
клетки с компактными, несколько полиморфными, иногда слегка
овальными или церебриформными ядрами. Клетки немного крупнее малых лимфоцитов, которые можно увидеть в составе резидуальных фолликулов. Доля иммунобластов и промежуточных форм
между ними и мелкими лимфоидными клетками может быть очень
разной. Иммунобласты имеют обычный вид с менее выраженной
базофилией цитоплазмы и ядрышка, чем у В-иммунобластов. Выделяются скопления и целые поля мелких лимфоидных клеток с
объемной, оптически пустой цитоплазмой — «светлые» клетки.
В отдельных случаях обнаруживаются одноядерные и многоядерные гигантские клетки, напоминающие клетки БерезовскогоШтернберга-Рид. Сходство с лимфогранулематозом усиливается
при обнаружении эозшюфильных гранулоиитов, плазматических
клеток и элителноидных гистиоцитов. Во всех случаях в состав
опухолевой ткани, занимает ли она паракортикальную зону или
заполнила уже весь лимфатический узел, вместе с реактивным компонентом входят многочисленные посткапиллярные венулы с высоким набухшим эндотелием.
Плеоморфноклеточные лимфомы из мелких клеток в классификации ВОЗ принадлежат к лимфомам из клеток с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов. Эти опухоли состоят из
довольно однообразного инфильтрата, в котором опухолевые клетки незначительно отличаются друг от друга но размеру. Полиморфизм проявляется в неправильной форме ядер, которые часто имеют зазубренную вогнутую поверхность с одной стороны и гладкую
с противоположной, выпуклой. Ободок цитоплазмы обычно узкий,
с серо-голубой окраской (азур И-эозин), иногда встречаются «светлые» клетки с широкой, оптически пустой цитоплазмой. Гетерохроматин ядер умеренно плотный, глыбчатый, ядрышки мелкие, одиночные. Среди мелких полиморфных клеток почти не встречаются
клетки других типов, исключая немногочисленные эозинофильные
гранулоциты. Гиперплазия посткапиллярных венул менее характерна для этого типа лимфом. Опухолевые клетки инфильтрируют стенки мелких и среднего диаметра кровеносных сосудов.
Плеоморфноклеточные лимфомы из средних и крупных клеток состоят из клеток в 1,5-2 и 2-3 раза больших ядра малого
лимфоцита, опухолевые клетки иногда образуют однородную смесь.
Ядра клеток отличаются выраженным разнообразием формы (плеоморфизм), часто имеют зазубренную с вдавлениями вогнутую
поверхность с одной стороны и более гладкую поверхность выпуклой стороны. У некоторых клеток ядра с церебриформной поверх-
Глава 9. Иммуногистохимия
203
ностью. Гетерохроматпн отличается более нежной структурой в ядрах крупных клеток и более грубой, глыбчатой в клетках среднего
размера. Ядрышек в ядрах может быть несколько, и они имеют
разнообразную форму и базофильную окраску. Цитоплазма клеток умеренно базофильная и окружает ядро в виде заметного
ободка.
Среди опухолевых клеток встречаются в большем или меньшем
количестве эозинофильиые гранулоциты, тканевые тучные клетки, интердигитирующие ретикулярные клетки. Картину выраженного полиморфизма в опухоли дополняют обнаруживаемые иногда гигантские опухолевые клетки.
Иммупофенотип. Большинство Т-клеточных лимфом может
быть диагностировано при иммуногистохимическом исследовании
парафиновых срезов материала, фиксированого в формалине. Используют антитела к CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45RO и
CD43. Весьма характерным является аберрантный иммунофенотип с утратой экспрессии каких-либо пан-Т-клеточных антигенов
или невозможной в норме коэкспрессией антигенов (Hastrup N.,
Ralfkiaer E., Pallcsen G., 1989; Pinkus G. S., O'Hara С J., Said J. W..
1990). Опухоли с крупноклеточным компонентом обнаруживают
от слабой до умеренной силы экспрессию CD30, характерную для
активированных лимфоидных клеток. Чаще CD30+ клетки располагаются периваскулярно. Эти случаи не следует относить к анапластическим крупноклеточным лимфомам.
Анапластические крупноклеточные лимфомы могут быть
разделены на первичные и вторичные (сочетанные и последовательные). Выделяют 3 гистологических варианта анапластических
крупноклеточных лимфом: обычный, мелкоклеточный и лимфогистиоцитарный. Опухоль может замещать ткань лимфатического
узла полностью или частично. Весьма характерным считается распространение опухоли в синусах лимфатического узла. Пласты
опухолевых клеток при частичном поражении лимфатического узла
чаще располагаются в паракортикальной зоне, перивазально или
окружают атрофичные фолликулы. Опухолевые клетки могут быть
очень немногочисленны и часто с трудом различимы, так как рассеяны среди клеток реактивного компонента. Реактивный инфильтрат содержит смесь из нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов, лимфоцитов, плазматических клеток, гистиоцитов. Количественное соотношение этих клеток неодинаково от случая к
случаю и меняется от места к месту в одном и том же биоптате.
Опухолевые клетки анапластической крупноклеточной лимфомы крупные и очень крупные, овальные, круглые, полигональные
204
Часть 1. Теоретическая гематология
с полиморфными атипичными ядрами. Для них характерна «эмбрионогюдобная» форма ядер, когда выпуклая поверхность ядра
имеет довольно правильное гладкое очертание, а вогнутая — глубокие погружные зазубрины. Детальное изучение морфологии ядер
с помощью большого увеличения микроскопа в ряде случаев дает
возможность увидеть в ядрах сквозное отверстие, являющееся инвагинацией ядерной мембраны, что придает ядрам вид кольца неправильной формы. Некоторые варианты опухоли характеризуются
появлением очень крупных клеток с многочисленными округлыми небольшим ядрами, которые располагаются по кругу на периферии клетки и, налегая друг на друга, формируют некое подобие
кольца с цитоплазмой в центре. Хроматин ядер собирается при
фиксации в глыбки, чередующиеся с участками нежносетчатой
структуры, ядрышки крупные, округлые или вытянутые, иногда —
уродливой формы. Некоторые клетки имеют двуядерное строение
и очень напоминают диагностические клетки Березовского- Штернберга-Рид. Их появление на фоне реактивного компонента, состоящего из плазматических клеток, гистиоцитов и эозинофильных
гранулоцитов, делает иногда невозможной дифференциальную
диагностику лимфогранулематоза и анапластической крупноклеточной лимфомы без применения иммуногистохимического исследования.
Тинкториальные свойства цитоплазмы опухолевых клеток очень
различаются от случая к случаю. Цитоплазма бывает интенсивно
базофильной, эозинофидьной, амфофильной, бледной или оптически пустой. Если цитоплазма базофильна, при хорошей окраске
препаратов почти всегда удается обнаружить участок перинуклеарного просветления с заметной эозинофилией, соответствующий
комплексу Гольджи.
В лимфатических узлах с анапластической крупноклеточной
лимфомой обнаруживается фиброз разной степени выраженности. Иногда это дуги фиброзной ткани, которые рассекают опухоль
на узлы, и картина при этом весьма напоминает нодулярный склероз при лимфогранулематозе. В других случаях это могут быть
довольно нежные пучки соединительной ткани, охватывающие
группы клеток или отдельные клетки (Benharroch D., MeguerianBedoyan Z. et al, 1998).
Иммунофенотип. Практически во всех случаях анапластической крупноклеточной лимфомы клетки экспрессируют CD30. Антитела к CD30 Ki-1 и Hefi-1 позволяют обнаружить экспрессию
только в нативной или замороженной ткани. Антитела Вег-Н2 распознают эпитоп CD30, резистентный к фиксации, обезвоживанию
Глава 9. Иммуногистохимия
205
и заливке ткани в парафин. Продукт иммуногистохимической реакции, свидетельствующий об экспрессии CD30, должен обнаруживаться на мембране клеток, в зоне комплекса Гольджи или одновременно на этих структурах.
••
Более чем в половине случаев анапластические крупноклеточные лимфомы экспрессируют антиген эпителиальных мембран
(ЕМА). Эта особенность данного вида лимфоидных опухолей вместе с довольно частым отсутствием экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45RB (до 40% случаев) может быть причиной
неверного диагноза эпителиальной опухоли, если панель применяемых антител недостаточна. Есть немногочисленные наблюдения
цитокератин-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом. Типична экспрессия активационных антигенов: рецептора
интерлейкина-2 (CD25), рецептора трансферрина (CD71), HLA-DR.
Экспрессия антигена CD15 встречается редко и только в небольшой доле опухолевых клеток. Ассоциированными с анапластическими крупноклеточными лимфомами считаются антигены, выявляемые антителами BNH9 и CBF78, экспрессия которых обнаруживается не всегда. Моноклональное антитело ALK-1 позволяет
выявить в парафиновых.срезах химерный белок NPM/ALK, возникающий в результате транслокацйи t(2;5). Анапластические
крупноклеточные лимфомы имеют Т-клеточный или 0-клеточный
иммунофенотип. Чем более широкая панель антител применяется
к Т-клеточным антигенам, тем реже встречается 0-клеточный фенотип. Экспрессия CD3 встречается только в 25% случаев, а антигены CD5, CD7 и CD8 часто отсутствуют. Более часто экспрессированы CD2 и CD4. Нередко выявляется цитотоксический фенотип (ТГА-1, granzyme В, perform) (Krenacs L, Wellmann A. et al,
1997). В отличие от лимфогранулематоза клетки анапластической
лимфомы экспрессируют кластерин.
CD30" крупноклеточные опухоли с В-клеточным иммунофенотипом относят к диффузным крупноклеточным В-клеточным лимфомам.
Грибовидный микоз — первичная Т-клеточная лимфома кожи
из мелких клеток с церебриформной поверхностью ядер. Эти клетки с глубокими инвагинациями ядерной поверхности получили
название клеток Лютцнера (Lutzner). Начальные проявления грибовидного микоза не сопровождаются поражением лимфатических узлов и костного мозга. Клинически выделяют три формы
грибовидного микоза и вариант с эритродермией, лимфаденопатией и лейкемической картиной крови, называемый синдромом Сезари (Sezary).
206
Часть 1. Теоретическая гематология
Морфогенез классической формы грибовидного микоза клинически и морфологически может быть разделен на три стадии: эритематозную, бляшечную и опухолевую. Деление в некоторой степени условное, поскольку у одного больного в различных участках
кожного покрова могут быть обнаружены проявления всех стадий
грибовидного микоза, а иногда развитие опухоли ограничивается
эритематозной стадией.
Ранние стадии поражения кожи характеризуются различной
плотности полосовидным инфильтратом в наружном слое дермы с
распространением на эпидермис (эпидермотропизм). Инфильтрат
образован мелкими клетками Лютцнера (с церебриформными ядрами), интердигитирующими и плазматическими клетками, а также клетками Лангерганса и эозинофильными гранулоцитами. С
развитием заболевания плотность опухолевых клеток в инфильтрате растет, и с появлением внутриэпидермальных полостей, заполненных клетками Лютцнера и интердигитирующими клетками
(микроабсцессы Потрие), более заметным становится поражение
эпидермиса.
Опухолевая стадия грибовидного микоза проявляется массивной инфильтрацией всех слоев кожи, а иногда и подкожной жировой клетчатки, полиморфной клеточной смесью, в которой обнаруживаются клетки Лютцнера. Встречаются заметно более крупные
полиморфные клетки с многодольчатыми ядрами и ободком базофильной цитоплазмы («микотические» клетки). Строение опухолевой ткани в этой стадии заболевания может быть сходным практически с любым вариантом Т-клеточной лимфомы высокой степени злокачественности.
Гистологическое исследование пораженной кожи при синдроме
Сезари обнаруживает изменения, сходные с грибовидным микозом. В периферической крови циркулируют клетки Лютцнера, хотя
поражение костного мозга нехарактерно вплоть до терминальной
стадии заболевания (Kim Y. H., Hoppe R. Т., 1999).
Начальные проявления грибовидного микоза (синдрома Сезари) сопровождаются дерматопатической лимфаденопатией. Паракортикальная зона лимфатических узлов расширена и заполнена большим количеством интердигитирующих ретикулярных клеток. Ядра этих клеток светлые, с четкой тонкой ядерной мембраной,
образующей углубления и складки на поверхности ядра. Форма
ядер весьма разнообразна, чаще вытянутая или изогнутая. Ядра
окружает широкая, оптически пустая цитоплазма. Среди интердигитирующих ретикулярных клеток, которые, возможно, происходят от клеток Лангерганса из эпидермиса, встречаются малочис-
Глава 9. Иммуногистохимия
207
ленные лимфоциты и гранулоциты. Лимфоидные фолликулы сохранены и могут быть оттеснены к капсуле лимфатического узла
(Scheffer E. M.. Meijer С. J., van Vloten W. A., 1980).
При поражении лимфатических узлов грибовидным микозом
среди интердигитирующих ретикулярных клеток удается обнаружить сначала немногочисленные атипичные лимфоциты с неребриформной поверхностью ядер и единичные микотические
клетки. С развитием опухолевого поражения лимфоидной ткани
клетки Лютцнера замещают все другие клеточные элементы в паракортикальной зоне, оставляя только единичные рассеянные интердигитирующие ретикулярные клетки. Все более очевидной становится атипия лимфоидного опухолевого инфильтрата, увеличивается количество митозов. Возрастает доля крупных ми котических
клеток. Появляются посткаииллярные венулы с набухшим эндотелием. Если лимфоидные фолликулы сохраняются, изменения
в лимфатическом узле могут напоминать лимфому Т-зоны. В дальнейшем лимфоидные фолликулы вытесняются опухолью и рисунок строения лимфатического узла становится полностью диффузным. Синдром Сезари с ранних стадий сопровождается инфильтрацией лимфатических узлов клетками Лютцнера, и встретить картину дерматопатической лимфаденопатии с небольшим
количеством опухолевых клеток практически не удается.
Иммунофенотип. Опухолевые клетки при грибовидном микозе
и синдроме Сезари имеют сходные иммунологические характеристики. Экспрессированы Т-клеточные антигены CD2, CD3, CD4,
+/
CD5 , не экспрессируются CD7, CD8, CD30, TIA-1. Клетки с
цитотипическими признаками бластов могут быть СОЗО-позитнвными.
Первично кожные CD30* Т-клеточные лимфопролиферативные заболевания объединяют первично кожную анапластическую
крупноклеточную лимфому и лимфоматоидный папулез. Заболевания, встречающиеся у взрослых, имеют вариабельную морфологию и при гистологическом исследовании весьма сходны. Анапластические крупноклеточные лимфомы кожи — солитарные опухоли; которые в некоторых случаях могут подвергатвея спонтанной
регрессии. Лимфоматоидный папулез проявляется множественными спонтанно разрешающимися папулами.
Иммунофенотип. Опухолевые клетки на клеточной мембране и
в зоне Гольджи экспрессируют CD30, часто экспрессированы антигены CD45RB. CD3, CD45RO, TIA-1, гранзим В, не реагируют с
антителами к ЕМА и ALK. Также не удается обнаружить транслокацию между 2 и 5 хромосомами (Willemze R., Kerl H. et al., 1997).
208
Часть 1. Теоретическая гематология
Т-клеточная панникулитоподобная лимфома подкожной
клетчатки проявляется подкожными узлами на туловище и конечностях с гиперемией кожи над ними. Характерны симптомы
интоксикации, панцитопения, гепатоспленомегалия, высокий уровень ферритина и проявления гемофагоцитоза в костном мозге и
селезенке. При гистологическом исследовании биоптата подкожной жировой ткани обнаруживают полиморфные лимфоидные
клетки средних размеров, окружающие в один ряд жировые клетки и образующие небольшие скопления в прослойках соединительной ткани между жировыми дольками. Клетки опухоли инфильтрируют стенки кровеносных сосудов. Все это становится причиной некрозов жировой ткани с омылением жиров и фагоцитозом
продуктов распада жира.
Иммунофенотип. При иммуногистохимическом исследовании
лимфоидных клеток инфильтрата выявляется экспрессия CD3 и
CD8, TIA1 и гранзима В, не выявляется CD4 (Kumar S., Krenacs L.
eta]., 1998).
Экстранодальные NK-/T-клеточные лимфомы верхних дыха тельных путей. Выраженную тенденцию к инфильтрации стенок
кровеносных сосудов с окклюзией их просвета опухолевыми клетками обнаруживают МК-/Т-кл сточные лимфомы верхних дыхательных путей. Массивные изъязвления слизистых оболочек верхних
дыхательных путей и некрозы тканей срединных структур лицевого
черепа с реактивным гранулематозным воспалительным компонентом при этом виде лимфомы, агрессивное течение обусловили название, под которым существовало заболевание, — летальная срединная гранулема и злокачественный срединный ретикулез. Местом первичной локализации кроме верхних дыхательных путей могут
быть кожа, мягкие ткани, желудочно-кишечный тракт и яички.
Опухолевые клетки имеют весьма разнообразную морфологию —
от атипичного малого лимфоцита до активированных лимфоидных
клеток. Всегда присутствует массивный реактивный компонент —
плазматические клетки, гистиоциты, эозинофильные гранулоциты.
Иммунофенотип. Для опухолевых клеток характерна экспрессия CD2, CD3e (в цитоплазме), CD56, TIA-1, гранзима В. Не экспрессируется CD3 на мембране клеток, CD4, CD5, CD8, CD16 и
CD57. В редких случаях экспрессированы CD7 и CD30. Диагноз
предполагает цитотоксический фенотип и ВЭБ*. При отсутствии
экспрессии цитотоксических молекул и ВЭБ лимфомы верхних
дыхательных путей с CD3e* относят к Т-клеточным лимфомам с
иммунофенотипом периферических лимфоцитов (Chan А. С,
HoJ. W. etal, 1999).
Глава 9. Иммуногистохимия
209
Кишечные Т-клеточные лимфомы с проявлениями энтеропатии. Изменения при кишечных Т-клеточных лимфомах с про
явлениями энтеропатии в течение долгого времени ОТНОСИЛИ К
осложнениям целиакии, а позднее — к опухолям гистноцнтарного
происхождения. В начале 1980 г. было доказано, что они являются
Т-клеточными лимфомами с весьма разнообразной морфологией.
Эта опухоль характеризуется мелкими изъязвлениями в кишечни-ке и типичными гистологическими проявлениями целиакии (виллезная атрофия), которые иногда могут отсутствовать. Некоторые
пациенты имеют документированный анамнез целиакии. но иногда лимфома проявляется de novo. Клинический прогноз плохой,
поскольку лимфома часто является многоочаговой.
Иммунофенотип. Опухолевые клетки экспрессируют пан-Т-клеточные маркеры и в большинстве случаев CD103 молекулу интегрина, обнаруживаемую в нормальных Т-лимфоцитах кишки
(Wright D. Н., 1997).
Гепатолиенальная Т-клеточная лимфома — заболевание мужчин молодого возраста, для которого основные проявления связаны с печенью и селезенкой, не характерны лимфаденопатия и лейкемическая картина крови. В синусах (синусоидах) печени, селезенки, костного мозга обнаруживаются малые лимфоциты с
невыраженными признаками атигши.
Иммунофенотип. Опухолевые лимфоциты имеют фенотип
CD2+, C D 3 \ CD4-, CD5 , CD8 , CD56 + , Т1А1+, гранзим В
(Cooke С. В., Krenas L. et al.. 1996).
Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика
лимфогранулематоза (лимфомы Ходжкина)
Лимфогранулематоз — злокачественная опухоль лимфоидной
ткани, в которой малочисленные опухолевые клетки характерного строения располагаются среди преобладающего реактивного
клеточного окружения. Выделяют две принципиально различные формы заболевания: лимфогранулематоз, нодулярный тип
лимфоидного преобладания и классический лимфогранулематоз.
Классический лимфогранулематоз представлен четырьмя гистологическими вариантами, среди них: с нодулярным склерозом, смешанно-клеточный, с истощением лимфоидной тканн и с большим
количеством лимфоцитов.
Гистологический диагноз лимфогранулематоза предполагает
идентификацию двух неотъемлемых составных частей патологического процесса: 1) опухолевых диагностических клеток Березов-
210
Часть 1. Теоретическая гематология
с кого- Штернберга- Рид и клеток Ходжкина; 2) окружающих неопухолевых клеток, формирующих один из типичных гистологических вариантов строения опухоли.
Клетки Березовского-Штернберга-Рид типичного строения —
крупные (20-30 мкм), с дву- или многодольчатым ядром или двуили многоядерного строения. Ядра округлые, с четкой ядерной
мембраной и небольшим количеством довольно гомогенного гетерохроматина. Ядра содержат, как правило, одно крупное (1/4 диаметра ядра) округлое гомогенное ядрышко, иногда оксифильное.
В диагностических клетках Березовского-Штернберга-Рид должно быть не менее двух ядрышек в двух долях ядра (по одному и
более в каждой доле). Вокруг ядрышка в ядре видна узкая зона
просветления. В клетках с двудольчатым ядром иногда заметна
центральная или зеркальная симметрия строения. Цитоплазма
широким ободком окружает ядро (ядра), амфофильна или слабо
базофильна, в препаратах, окрашенных азур П-эозином, часто
хорошо различима слабо эозинофильная зона перинуклеарного просветления (зона Гольджи). Одноядерные клетки сходного строения называют клетками Ходжкина. Встречаются опухолевые клетки с плотной компактной цитоплазмой и пикнотичным бесструктурным ядром — мумифицированные клетки. Еще один вариант
диагностических клеток — лакунарные — чаще всего обнаруживаются в ткани, фиксированной в формалине, в результате чего объемная цитоплазма клеток сморщивается и клетка остается в «лакуне», сформированной окружающими клетками.
Обнаружения клеток Березовского-Штернберга-Рид в гистологических препаратах для диагноза лимфогранулематоза недостаточно: морфологически сходные клетки могут встретиться при
неходжкинских лимфомах и некоторых реактивных- изменениях
лимфоидной ткани.
Особым вариантом клеток Березовского-Штернберга-Рид являются Ь&Н-клетки (лимфо-гистиоцитарный тип) или рор-согпклетки («воздушная кукуруза»). Они отличаются крупным складчатым, многодольчатым ядром с тонкой ядерной мембраной, однородным гетерохроматином и многочисленными базофильными
мелкими ядрышками. Цитоплазма необъемная, бледно окрашенная (Mauch P., ArmitageJ. О., Diehi V., 1999).
Лимфогранулематоз, нодулярный тип лимфоидного преобладания. Ткань лимфатического узла полностью или частично замещена довольно однообразным инфильтратом нодулярного строения. Могут быть различимы резидуальные фолликулы, оттесненные к капсуле узла. Часто обнаруживаются зоны диффузного рос-
Глава 9. Иммуногистохимия
211
та. Нодулярный тип роста бывает плохо различим, особенно при
исследовании тонких препаратов. В таких случаях полезной может быть импрегнация ретикулинового каркаса солями серебра.
Опухолевые клетки представлены L&H вариантом'клеток Березовского-Штернберга-Рид. L&H клетки чаще располагаются в центральной зоне нодулярных структур и не образуют явных скоплений. Среди клеток инфильтрата преобладают малые лимфоциты, в
меньшем количестве обнаруживаются гистиоциты, которые могут
образовывать небольшие скопления. На периферии нодулярных
образований иногда встречаются реактивные плазматические клетки. Эозинофильные и нейтрофильные лейкоциты почти всегда отсутствуют.
Иммунофенотип. Опухолевые L&H клетки экспрессируют В-линейные антигены CD20 и CD79a, общелейкоцитарный антиген
CD45RB и антиген эпителиальных мембран. В отличие от классических клеток Березовского-Штернберга-Рид не экспрессируют
CD 15 и CD30, в редких случаях обнаруживается слабая экспрессия CD30. L&H клетки окружены кольцом Т-клеток, которые часто экспрессируют CD57. Такие розетки CD57 позитивных лимфоцитов нехарактерны для классического лимфогранулематоза
и В-клеточной лимфомы с большим количеством Т-клеток. Выявление с помощью антител к CD21 или CD23 гиперплазированной
сети фолликулярных дендритических клеток, образующих шаровидные структуры, подчеркивает нодулярный рисунок строения
опухоли (Anagnostopoulos I., Hansmann M. L. et al., 2000).
Лимфогранулематоз, вариант с нодулярным склерозом. Изменения в лимфатическом узле могут захватывать весь объем или
обнаруживаться только в части узла. Обычно капсула лимфатического узла значительно утолщена, а в ткани узла обнаруживаются кольца и дуги васкуляризированной фиброзной ткани, которые
окружают округлые образования из опухолевой лимфоидной ткани. В некоторых случаях склероз развит слабо, тогда для выявления фиброзных дуг может оказаться полезной микроскопия в поляризованном свете — коллагеновые волокна выделяются из-за
двойного лучепреломления. Принято считать, что для того чтобы
отнести лимфогранулематоз к варианту с нодулярным склерозом,
достаточно обнаружить хотя бы одну дугу фиброзной ткани.
В нодулярных структурах опухолевая ткань состоит из клеток
Березовского-Штернберга-Рид, которые при этом гистологическом варианте лимфогранулематоза чаще всего имеют вид лакунарных клеток. Лакунарные клетки располагаются среди клеток реактивно-воспалительного компонента - малых лимфоцитов, плазма-
212
Часть 1. Теоретическая гематология
тических клеток, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов,
гистиоцитов и фибробластов. Количественные соотношения опухолевых и неопухолевых клеток меняются не Только от случая к
случаю, но и в пределах одного биоптата, так что клеточный состав
нодулярных образований может быть выраженно различаться.
Опухолевые лакунарные клетки могут располагаться поодиночке,
группами или крупными скоплениями. Обнаружение обширных
слоев и скоплений опухолевых клеток позволяет выделить синцитиальный вариант нодулярного склероза. Иногда опухолевые клетки довольно однообразны, а в некоторых случаях оказываются резко полиморфными. Клетки Березовского-Штернберга-Рид типичного строения встречаются редко.
Довольно часто в нодулярных образованиях обнаруживаются
очаги некрозов, в этих зонах возможна нейтрофильная реакция,
такая картина напоминает абсцедирование. Очаги некрозов могут
иметь ландкартообразныс очертания.
Разделение нодулярного склероза на две группы (градации, или
степени) основано на оценке клеточного состава нодулярных структур. Ко второй группе относят случаи, в которых: а) более 25%
нодулярных структур содержат многочисленные уродливые анаплазированные клетки Березовского-Штернберга-Рид на клеточном фоне без истощения лимфоидной ткани; б) более 25% нодулярных структур характеризуются истощением лимфоидной ткани, особенности строения клеток Березовского-Штернберга-Рид
во внимание не принимаются; в) более 80% нодулярных структур
обнаруживают фиброзно-гистиоцитарное содержимое с некоторым
количеством лакунарных клеток или типичных клеток Березовского-Штернберга-Рид. Синцитиальный вариант также относят
к группе 2.
Остальные случаи, сомнительные и пограничные относят к
1-й группе (McLennan К. A., Bennett M. H. et al, 1992). Данные о
прогностическом значении выделения этих групп лимфогранулематоза с модулярным склерозом противоречивы. Классификация
ВОЗ рекомендует в гистологическом диагнозе лимфогранулематоза с нодулярным склерозом указывать группу, к которой этот
случай относится, с целью накопления информации о прогностическом значении такого подразделения.
Лимфогранулематоз, смешанно-клеточный вариант. Лимфоидная ткань в лимфатическом узле частично или полностью замещена диффузной, довольно однородной смесью, в которой клетки Березовского-Штернберга-Рид располагаются среди малых
лимфоцитов, лимфоидных клеток среднего размера с угловатыми
Глава 9. Иммуногистохимия
213
ядрами, плазматических клеток, гистиоцитов, фибробластов, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов. Не все опухолевые
клетки имеют типичное строение, некоторые из них могут напоминать активированные крупные лимфоидные клетки или иммунобласты. В реактивно-воспалительном клеточном окружении количественный состав может сильно отличаться от случая к случаю.
Иногда эозинофильные гранулоциты очень редки и их нужно тщательно разыскивать, а иногда они так многочисленны, что формируют подобие «эозинофильных абсцессов». Некоторые случаи отличаются большим количеством эпителиоидных гистиоцитов, могут также обнаруживаться очаги некрозов и зоны фиброза.
Фиброзная ткань при смешанно-клеточном варианте лимфогранулематоза не образует слоев, полос или дуг и не обладает свойством
двойного лучепреломления в поляризованном свете.
Лимфогранулематоз, вариант с истощением лимфоидной
ткани. В биоптатс лимфатического узла изменения могут быть
двух типов. Истощение лимфоидной ткани по типу диффузного
фиброза характеризуется довольно однородным по плотности диффузным сетчатым недвулучепреломляющим фиброзом с аморфным
гомогенным эозинофильным бесклеточным веществом в петлях
коллагеновых волокон и очень большим количеством клеточных
элементов. Диагностические клетки Березовского- Штернберга Рид редки. Другой тип называется ретикулярным и отличается
большим количеством клеточных элементов, среди которых резко преобладают и типичные, и уродливые клетки БерезовскогоШтернберга-Рид. Клетки реактивно-воспалительного окружения
единичны. Опухолевая ткань при лимфогранулематозе с истощением лимфоидной ткани часто некротизируется (Neiman R. S., Rosen P. J., Lukes R.J., 1973).
Классический лимфогранулематоз с большим количеством
лимфоцитов. Клетки Ходжкина и Березовского-Штернберга-Рид
располагаются среди малых лимфоцитов. Диагностические клетки
Березовского-Штернберга-Рид встречаются редко, L&H клетки
не встречаются. Гранулоциты и гистиоциты очень редки или их
нет совсем. Малые лимфоциты располагаются диффузными полями или формируют фолликулярные структуры. Фолликулярные структуры имеют редуцированные центры размножения и широкую зону мантии, в которой располагаются опухолевые клетки
(Ashton-Key М„ Thorpe P. A. et al, 1995; Anagnostopoulos I., Hansmann M. L. et al., 2000).
Иммунофенотип. Все варианты клеток Березовского-Штернберга-Рид при классическом лимфогранулематозе имеют сходный
214
Часть 1. Теоретическая гематология
профиль экспрессии иммунологических маркеров. Эти клетки почти никогда не экспрессируют общелейкоцитарный антиген, почти во всех случаях экспрессируют CD30. Экспрессия обнаруживается на клеточной мембране и в перинуклеарной зоне цитоплазмы (зоне Гольджи). Антиген CD15 экспрессируется реже (75% случаев), в зоне Гольджи и на клеточной мембране, мембранное окрашивание может отсутствовать. Клетки Березовского-Штернберга-Рид экспрессируют виментин, фасцин и в ряде случаев CD20
на клеточной мембране (окрашивание ядрышек неспецифично).
Окрашивание с антителами к иммуноглобулинам, к- и Х-легким
цепям иммуноглобулинов связано с пассивной абсорбцией этих
белков из межклеточного пространства. Опухолевые клетки не экспрессируют антиген эпителиальных мембран, кластерин, очень редко обнаруживается экспрессия Т-линейных антигенов.
Лимфоидные клетки неопухолевого окружения — чаще CD4позитивные Т-клетки, CD8 T клеток немного. Т-клетки нередко обнаруживают экспрессию цитотоксических молекул. Не экспрессируют CD57.
Дифференциальная диагностика лимфом, характеризующихся
общими чертами гистологического строения
Гистологическая диагностика опухолей лимфоидной ткани —
раздел частной онкоморфологии, где в силу особенностей этой группы новообразований для установления диагноза необходимо изучение иммунофенотипа клеток опухоли.
Особенности опухолей лимфоидной ткани:
1. Многообразие морфологических вариантов.
2. Морфологическое сходство нормальных и опухолевых клеток.
3. Морфологическое сходство некоторых гистологических вариантов опухолей.
4. Морфологическое сходство некоторых реактивных процессов и опухолей.
В основе гистологического исследования биопсий лимфатических узлов, как и всех других органов и тканей, лежит детальное
исследование тканевой структуры (архитектоники) и клеточного
состава биоптата.
Изучение препаратов начинается с оценки пригодности срезов
для гистологического исследования и характеристики обнаруженных дефектов технологии приготовления препаратов.
Гистологическое исследование препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином или азур П-эозином, позволяет отнести иссле-
Глава 9. Иммуногистохимия
215
дуемую опухоль лимфоидной ткани к одной из групп лимфом,
объединенных выраженным морфологическим сходством.
Ниже перечислены гистологические признаки, объединяющие
лимфомы лимфатических узлов в группы.
1. Пролиферация бластных клеток.
2. Диффузная пролиферация мелких клеток.
3. Диффузная пролиферация крупных клеток.
4. Фолликулярный рост лимфоидной ткани.
5. Нодулярный характер роста опухолевой ткани.
6. Анапластическая морфология лимфоидных клеток.
7. Диффузная гюлиморфноклеточная димфоидная пролиферация опухоли.
8. Лимфогранулематозоподобное строение опухоли.
Специфичность рутинных гистологических методов для дифференциальной диагностики внутри группы в большинстве случаев недостаточна. Применение классификации ВОЗ опухолей лимфоидной ткани в практической работе обусловлено возможностью
использования иммуногистохимического метода.
С целью дифференциальной диагностики необходимо выбрать
рациональный состав панели иммунологических маркеров (антител), который позволяет различить гистологически сходные варианты лимфом между собой. С учетом высокой стоимости и трудоемкости нммуногистохимического исследования, набор антител
для каждой группы лимфом должен быть минимально достаточным (табл. 5).
Таблица 5
Состав панелей иммуногистохимических маркеров,
необходимых для дифференциальной диагностики
наиболее часто встречающихся лимфом
Признак
Пролиферация
лимфоидных
клеток с бластной морфологией
Диффузная
пролиферация
мелких лимфоидных клеток
Группа
Состав панели
TdT.
CD3po!v.
CD5.
CD79a,
CyDl
Лимфоцитарная лимфома
CD3poly.
Лимфоплазмоцитарная лимфома
CD5. CD 10.
В-клеточные лимфомы маргинальной зоны CD20, CD23.
Лимфома из клеток зоны мантии
CvDl
Фолликулярная лимфома 1-й ст.,
с диффузным характером роста
Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз
Т-лимфобластный лейкоз/лимфома
В-лимфобластный лейкоз/лимфома
Лимфома из клеток зоны мантии, бластоидный вариант
Часть 1. Теоретическая гематология
216
Окончание таблицы 5
Признак
Фолликулярный
рост лимфоидной
гкани
Труппа
Фолликулярная лимфома
Фолликулярная гиперплазия
Фолликулярная лимфома
Л имфоцитарная лимфома
В-клеточные лимфомы маргинальной
зоны
Лимфома из клеток зоны мантии
Лимфогранулематоз, нодулярный тип
лимфоидного преобладания
Диффузная пролиДиффузная крупноклеточная В-клеферация крупных
точная лимфома
лимфоидных клеток Лимфома Беркитта
Диффузная полиАнгиоиммунобластная лимфома
морфноклеточная
Лимфома из клеток с иммунофенотилимфоидная проли- пом периферических Т-лимфоцитов.
ферация
неуточненная
Экстранодальная NK/T-клеточная
лимфома, назальный тип
Классическая лимфома Ходжкина, с
Диффузная пролиистощением лимфоидной ткани
ферация анаплазированных лимфоид- Анапластическая крупноклеточная
лимфома
ных клеток
Лимфогранулемато- Классическая лимфома Ходжкина.
смешанно-клеточный вариант
зоподобная гистологическая картина Классическая лимфома Ходжкина. нодулярный склероз
Анапластическая крупноклеточная
лимфома
Состав панели
к. A. BCL-2.
Ki-67
CD3poly,
CD5, CDIO.
CD20. CD23.
CyDl
CD3poly.
CDIO. CD20.
Ki-67
CD3polv.
CD4. CD5,
CD8. CD20.
CD30.
CD45R0.
CD56. LMP1
CD3poly.
CD 15. CD20,
CD30,
CD45RB.
CD45R0,
EMA,
ALKl.Clusterin
Общие принципы иммуногистохимического исследования в диагностике лимфом предусматривают применение в каждом случае не
одного какого-либо антитела, а панели антител (набора, составленного в соответствии с диагностической гипотезой, возникшей в результате рутинного гистологического исследования биоптата) и учета
комбинации позитивных и негативных результатов реакции в соответствии с известной информацией о морфологическом строении
опухоли и иммунофенотипе опухолевых клеток.
Неотъемлемым элементом иммуногистохимического исследования в каждом случае должно быть изучение контрольных реакций. Поскольку ложнонегативные результаты встречаются значительно чаще, чем ложнопозитивные, особое значение следует придать проведению исследований с позитивными контрольными
объектами. Особенно удобны позитивные внутренние контрольные
реакции, которые позволяют показать, что реакция с данным антителом прошла успешно.
Глава 9. Иммуногистохимия
217
Для В- и Т-клеточных антигенов это реактивные лимфоидные
клетки, которые всегда есть и в опухолевой, и в неопухолевой лимфоидной ткани. Гранулоцпты дают реакцию с CD 15, а плазматические клетки — с CD30 и ЕМА. Основной причиной ложнонегативных результатов являются артефакты, вызванные фиксацией
тканей. Чл'вствительным индикатором повреждения антигенных
детерминант является реакция эндотелия сосудов с антителами к
виментпну — слабое окрашивание эндотелия указывает на плохую
сохранность антигенов.
Ложноположительные результаты чаще всего возникают из-за
пассивной абсорбции иммуноглобулинов из межклеточной жидкости. В некоторых случаях такая пассивная абсорбция делает невозможным выявление рестрикции легких цепей иммуноглобулинов при моноклональных лимфопролиферативных процессах.
Следует подчеркнуть, что применение классификации ВОЗ опухолей лимфоидной ткани без иммуногистохимического исследования невозможно в подавляющем большинстве случаев.
Литература
Anagnostopoulos I., Hansmann M. L., Franssila К., Harris M., Harris Л'. L.,Jaffe E. S.,
HanJ., van KriekenJ. Л/., Роррета 5., Marafioti Т.. FranklinJ., Sext.ro M., Diehl V..
Stein H. European Task Force on Lymphoma project on lymphocyte predominance
Hodgkin disease: histologic and immunohistologic analysis of submitted cases reveals 2 types of Hodgkin disease with a nodular growth pattern and abundant lymphocytes // Blood. 2000. V. 96. P. 1889-1899.
Ashton-Key M., Thorpe P. A., Allen]. P., Isaacson P. G. Follicular Hodgkin's disease /
/Am. J. Surg. Pathol. 1995. V. 19. P. 1294-1299.
Baitl R., Frisch В., Burkhardt R., Fateh-Moghadam A., Mahl G., Gierster P., Sund M.,
Kettner G. Bone marrow histology in myeloma: its importance in diagnosis, prognosis,
classification and staging // Br. J. Haematol. 1982. V. 51. P. 361-375.
Ben Ezra]., Burke J. 5., Swartz W. G., BrownellM. D., Brynes R. K., Hill L. R., NathwaniB.N., Oken M. M., Wolf В. С, Woodruff R. Small iymphocytic lymphoma:
a clinicopathologic analysis of 268 cases // Blood. 1989. V. 73. P. 579-587.
Benhanoch D., Meguerian-Bedoyan Z, Lamant L, Amin C, Brugieres L.. TerrierLacombe M.J., Haralambieva E., Pulford K., Pileri S., Morris S. W., Mason D. Y.,
DelsolG. ALK-positive lymphoma: a single disease with a broad spectrum of
morphology // Blood. 1998. V. 91. P. 2076-2084.
Bonato M., Pittaluga S., Tierens A., Criel A., Verhoef G., Wlodarska I., Vanutysel L., MichanxL., Vandekerckhove P., Van den B. H., Wolf-Peelers C. Lymph node histology in
typical and chronic Iymphocytic leukemia // Am. J. Surg. Pathol. 1998. V. 22. P. 49-56.
Boroicitz M.J., CrokerB. P., MetzgarR. S. Lymphoblastic lymphoma with t he phenotype
of common acute lymphoblastic leukemia // Am.J. Clin. Pathol. 1983. V. 79. P. 387 39 i.
Bouroncle B. A. Thirty-live years in the progress of hairy cell leukemia // Leuk.
Lymphoma. 1994. V. 14 (Si. 1). P. 1-12.
http://www.bestmedbook.com/
Глава 10
ПРОГРАММИРОВАННАЯ КЛЕТОЧНАЯ СМЕРТЬ
(АПОПТОЗ)
Апоптоз — это процесс программированной клеточной гибели.
Слово «апоптоз» по-гречески означает «опадающий, словно листья
с дерева».
Существуют два вида гибели клеток — некроз и апоптоз. Некроз связан с действием повреждающих агентов, приводящих к
нарушению целостности клеточной мембраны вследствие ее повреждения или формирования пор и к изоляции внутренней среды
клетки от ее окружения. Апоптоз же представляет собой активный
процесс реализации программы ее гибели; он может быть вызван
действием поступающих извне сигналов, которые сами по себе не
являются токсичными или деструктивными. В зависимости от индуцирующих факторов различают несколько вариантов апоптоза,
которые можно дифференцировать по биохимическим проявлениям. Как правило, все эти варианты имеют одинаковые заключительные этапы развития и морфологические проявления.-В иммунной системе чаще других реализуются три формы апоптоза:
апоптоз вследствие дефицита ростовых факторов; апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами и другими сходно действующими агентами; и «активационный» апоптоз, развивающийся вследствие дисбаланса активационных сигналов (Ярилин А. А., 1996).
Апоптоз — это регулируемый процесс, контролируемый множеством вне- и внутриклеточных сигналов, который служит для координированной гибели избыточных, «опасных» или поврежденных соматических клеток. Апоптотические процессы включают
в себя также механизмы, организующие как упаковку, так и удаление остатков клеток, таким образом предотвращая воспаление окружающих тканей. Заболевания, связанные с угнетением апоптоза,
222
Часть 1. Теоретическая гематология
включают в себя рак, аутоиммунные заболевания (например, системную красную волчанку) и многие вирусные инфекции. Заболевания, протекающие с усиленным апоптозом, — это СПИД, нейродегенеративные заболевания, миелодиспластический синдром, ишемические повреждения (инфаркт миокарда), токсический цирроз
печени и др. (Zornig M. et al, 2001).
В отличие от некроза, который, включая воспаление, может вовлекать длинную цепь событий, апоптоз развивается стремительно.
С того времени как клетка получает информацию, чтобы начать
процесс апоптотической гибели, до его завершения проходит лишь
несколько часов. Морфологические признаки апоптоза: уменьшение размеров клетки, ее сморщивание, уплотнение и фрагментация
хроматина. В ядре формируются осмиофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Данные изменения
служат самыми ранними проявлениями апоптоза, предшествующими процессам деградации. На этой стадии прогрессирование
апоптоза может быть приостановлено действием ингибиторов. Данная стадия обозначается как преапоптоз. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называются апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходят
конденсация и сморщивание гранул без их разрушения, расширение эндоплазматического ретикулума. Для апоптоза характерны
потеря ворсинок и нормальной складчатости клеточной мембраны
и формирование пузырей на поверхности клетки. Лизис клеток,
обнаруживаемый по проницаемости для пррпидиума йодида, регистрируется позже, чем события, связанные с фрагментацией хроматина. Так, если признаки фрагментации могут регистрироваться
уже через 1 час после воздействия индуктора, то проникновение
пропидиума йодида — только через 3-5 часов.
Апоптоз, в отличие от некроза, когда гибнут одновременно массы соседствующих клеток, развивается изолированно в единичных
клетках. Если при некрозе клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что может привести к развитию и прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные
явления отсутствуют. Клетки, подвергшиеся апоптозу, и апоптотические тельца быстро фагоцитируются, причем не только макрофагами, но и «непрофессиональными» фагоцитами, например мезангиальными клетками почек.
Одно из основных проявлений апоптоза реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК (700,200-250,50 -70 тыс. пар осно-
Глава 10. Программированная клеточная смерть (аноптоз)
223
ваний), несколько позже — 30-50 тыс. пар оснований. Уже на этой
стадии регистрируются конденсация хроматина и выпячивание
ядерной мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно этот начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после которого процесс становится
необратимым. Заключительный этап фрагментации ДНК — ее межнуклеосомная деградация, т. е. расщепление в результате формирования разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 пар оснований. Именно эти фрагменты
выявляются в виде «лесенки» при электрофорезе ДНК, который
широко используется в качестве метода идентификации апоптоза.
Деградация ДНК обусловливает выход в растворимую фазу низкомолекулярных фрагментов ДНК — полидезокснрибонуклеотидов, определение которых также используется для регистрации
апоптоза. Межнуклеосомная деградация ДНК происходит с участием CaL>*, Mg^-зависимой эндонуклеазы.
К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию сериновых и цистеиновых протеаз, или каспаз
(CASPASES — Cysteine Aspartate-Specific Proteases). Эти протеазы ответственны за систематическое лишение оболочки тех клеток, которые становятся комиттированными к гибели. Каспазы
являются рдними из наиболее специфичных протеаз, и это свойство делает их особенно подходящими для тонкой регуляции контроля протеолиза в процессе апоптотической гибели. С 1993 г. было
идентифицировано более 12 каспаз, играющих ключевую роль в
инициации или реализации апоптоза. Каспазы синтезируются в
виде про-ферментов-предшественников, которые затем переходят
в активные формы в результате протеолиза. Ключевая роль каспаз
в реализации апоптотической программы делает их очевидными
терапевтическими мишенями для контроля за неадекватным апоптозом. Повышенная активность каспаз ускоряет процессы апоптоза, что может лежать в основе таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Так, каспаза-3 и -12 участвуют в тфотеолитическом расщеплении амилоид-р прекурсорного протеина при болезни Альцгеймера и образовании апоптоз-индуцирующего амилоидогенного Ар-пептида.
Инактивация каспаз может также ускорять онкогенез.
Большинство внешних сигналов к развитию апоптоза являются
физиологическими. Pix источниками служат глюкокортикоиды,
антигены или их аналоги — некоторые цитокины (фактор некроза
опухолей альфа (ФНОа), интерфероны). Существует индуктор с
единственно направленными на осуществление апоптоза функци-
224
Часть 1. Теоретическая гематология
ями — Fas-лиганд (FasL) и Fas-рецептор (Fas, APO-1, CD95). Fasантиген является трансмембранным гликопротеином I чина, состоящим из 335 аминокислот, с молекулярным весом 36 кД. Он
имеет структурную гомологию с рецепторами ФНО и фактора роста нервов, экспрессируется на многих типах клеток, включая как
лимфоидные, так и нелимфоидные ткани, в том числе сердца, печени, почек и яичников, причем экспрессия Fas усиливается при
активации клеток. Внутриклеточный домен Аро I/Fas структурно
гомологичен «домену гибели» рецептора ФНО и является необходимым для передачи апоптотического сигнала. FasL — трансмембранный протеин II типа, массой 40 кД семейства ФНО. Он
экспрессируется преимущественно на активированных Т-клетках,
В-клетках, естественных киллерах, тканях яичка, передней глазной камеры, почки, легкого. Мембраносвязанная форма FasL может в результате действия металлопротеиназы конвертироваться в
растворимую форм)', которая может действовать как патологический агент, вызывая повреждение тканей (Berke G., 1997).
Гены Fas и FasL выполняют критические функции в осуществлении апоптоза, неоходимые для развития, функционирования-и
регуляции иммунной системы. Эти функции включают в себя делецию аутореактивных Т-клеток, наряду с элиминацией актвированых Т-клеток. Неожиданным оказался тот факт, что FasL может
играть важную роль в лммунопривилегированных сайтах, являющихся уникальными анатомическими образованиями, где гнетонесовместимые или злокачественные ткани могут длительно существовать.
Способность различных ростовых факторов, включая цитокины, защищать клетки от развития апоптоза хорошо известна для
развивающихся кроветворных клеток. В случае апоптоза лимфоцитов (активационного и индуцированного кортикоидами) показан защитный эффект интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4,
ИЛ-7, у-интерферона, тогда как ФНОос является апоптогенным
фактором.
В реализации апоптоза участвует система циклического АМФ
(цАМФ), повышение уровня которого внутри клетки вследствие
активации аденилатциклазы и фосфолипазы А2 или ингибирования фосфодиэстеразы цАМФ может стать сигналом к быстрой
фрагментации ДНК и гибели клеток. Эффект цАМФ реализуется
через активацию протеинкиназы А. Непосредственной причиной
гибели клеток при апоптозе служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации полп(АОР-рибоза)полимеразы в ответ на повреждение ДНК.
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз)
9')-
Функцию регуляторов выбора клетками, содержащими множественные разрывы ДНК (например, вследствие действия радиации), между вступлением в цикл (с последующей гибелью) и остановкой в фазе G, выполняют продукты протоонкогенов — ранний
актнвационный белок с-птус и онкосупрессор р53. В обычных условиях активации экспрессия с-шус сопутствует выходу клеток в
цикл. При удалении ростовых факторов его экспрессия ослабляется п клетка задерживается в фазе Gr В случае повышенной экспрессии с-пгус на фоне устранения ростового фактора клетки входят в S-фазу и подвергаются апоптозу.
Белок р53 играет важную роль, в норме являясь отрицательным
регулятором пролиферации клеток; те же клетки, в которых р53
инактивирован, имеют преимущество в ростовых потенциях. Утрата или мутации его гена приводят к подавлению апоптоза и в то
же время — к учащению развития опухолей после действия ионизирующей радиации. Наоборот, трансфекция гена р53 в опухолевые клетки обусловливает их апоптоз. После действия факторов,
вызывающих повреждение ДНК (радиация, УФ-излучение), экспрессия р53 в клетках существенно усиливается. Под влиянием
р53 клетки, имеющие множественные разрывы ДНК, задерживаются в фазе G,, а если входят в S-фазу (например, в случае опухолевой
трансформации), то подвергаются апоптозу. Мутации гена р53 позволяют таким клеткам сохранять жизнеспособность в митозе, что
чревато выживанием клеток, подвергшихся опухолевой трансформации; при этом опухолевые клетки оказываются резистентными
к лучевой и химиотерапии (Tokino Т., Nakamura Y, 2000). Мутация
гена р53 обнаруживается более чем в половине случаев злокачественных опухолей, частота ее повышается при длительной химиотерапии. У детей мутация р53 чаще наблюдается при остром лимфобластном лейкозе, составляя около 12%, и всегда является неблагсшриятным прогностическим фактором.
Активная природа апоптоза и родство его сигнальных путей с
активационными предполагают существование внутриклеточных
механизмов ингибирования апоптоза, а также возможность создания подходов к его модификации, в том числе медикаментозной.
Наиболее известным ингибитором апоптоза является ген bcl-2, продукт которого имеет молекулярную массу 26 кД и экспрессируется
на мембране митохондрий и в меньшей степени — на поверхности
клеток. Вс1-2 был сначала идентифицирован в клетках В-клеточной лимфомы (отсюда его название — B-cell lymphoma) как результат хромосомной транслокации t( 14; 18), ведущей к высокой
экспрессии Вс1-2 в этих опухолях. Вс1-2 содержится в юных крове8 Гематология. Нов. справочник
226
Часть 1. Теоретическая гематология
творных клетках, про-В-лимфоцитах, CD4 CD8 тимоцитах, зрелых долгоживущих Т- и В-клетках, клетках памяти. Вне кроветворной и иммунной систем bcl-2 обнаруживается в быстро делящихся эпителиальных клетках, клетках секреторного эпителия,
нейронах. У этого гена есть гомолог-антагонист — bcl-x (или Ьах),
экспрессия которого предотвращает развитие апоптоза, но может
также отменять защитное действие bcl-2. Белок Вс1-2 препятствует повышению концентрации Са2' в ядре, необходимого для запуска апоптоза. Однако иногда в результате различных генетических
процессов (чаще всего — хромосомных транслокаций) ген bcl-2
претерпевает неадекватную активацию, приводящую к гиперпродукции белка Bcl-2 в различных клеточных популяциях, в результате чего клетки теряют способность к своевременному отмиранию. Появление среди них клеток с опухолевой трансформацией
приводит к неконтролируемому росту и развитию злокачественного процесса. Кроме того, белок Bcl-2 играет одну из главных ролей
в развитии химиорезистентности.
Повышенный синтез Bcl-2 обнаруживается в большинстве случаев В-клеточных фолликулярных лимфом и в 1/3 случаев диффузных крупноклеточных лимфом. Уровень Bcl-2 повышен при
широком спектре онкологических заболеваний, включая рак молочной железы, простаты, толстого кишечника и легкого.
Развитию лимфопролиферативных процессов способствуют
ситуации, при которых ослабляется апоптотическая элиминация
генетически дефектных клеток, в норме контролируемая белком
р53. Это может происходить не только при мутации соответствующего гена, но и в связи с ослаблением других механизмов реализации апоптоза. Так, при хроническом лимфолейкозе, волосатоклеточном лейкозе, лимфомах, лимфогранулематозе обнаружено
ослабление активности Са~*-, Mg-'-зависимой эндонуклеазы, что
может способствовать развитию злокачественной лимфопролиферации. Связь между апоптозом и злокачественными новообразованиями проявляется еще и формированием множественной лекарственной резистентности при повышенной экспрессии факторов,
подавляющих развитие апоптоза — продуктов генов bcl-2, bcl-x и
ингибиторов каспаз.
Генетически обусловленные нарушения апонтотического механизма приводят к развитию заболевания с очерченной клинической и иммунологической картиной, которое получило название
аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома (АЛПС). Вначале св. зь подобного синдрома с дефектом апоптоза была обнаружена у лабораторных животных: в 1978 г. описана мышиная линия,
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз)
227
характеризовавшаяся лимфоаденопатией, спленомегалией и аутоиммунными нарушениями. Соответствующая аутосомно-рецессивная мутация, открытая в 1991 г., получила название 1рг
(lymphoproliferation). Далее было установлено, что данная мутация относится к гену Fas. Вскоре в гене FasL была обнаружена
другая мутация со сходным фенотипом, названная gld (generalized
lymphoproliferative disease). У линейных lpr- и gld-мышей наблюдалась высокая продукция аутоантител классов IgG и IgM, кроме
того, у них обнаруживались анти-ДНК-антитела и ревматоидный
фактор; эти животные погибали от нефрита и артрита.
У человека хроническая лимфоаденопатия, симулирующая злокачественную лимфому, в сочетании с аутоиммунными проявлениями была описана еще в 1967 г. и названа синдромом CanaleSmith. В 1995 г. были обнаружены мутации в гене Fas у больных
lpr-подобным синдромом, затем эти мутации удалось выявить у
многих больных с синдромом Canale-Smith (Rieux-Laucat F. et al.,
1995). В последующем были описаны случаи АЛИС без мутации в
гене Fas; так, обнаружена мутация в гене FasL у больного системной красной волчанкой в сочетании с лимфопролиферацией.
Методы терапевтического воздействия на процессы апоптоза
Уничтожение опухолевых клеток под действием химиолрепаратов основано на генерации различных повреждений, ко орые
клетка интерпретирует как сигнал к запуску апоптотической программы. Для реализации этой программы необходимы следующие
условия: проникновение препарата в клетку, создание адекватной
внутриклеточной концентрации активной формы препарата; наличие внутриклеточных мишеней, воспринимающих действие препарата и включающих при этом программу апоптоза; возможность
для опухолевой клетки осуществить генетически детерминированную программу самоуничтожения.
Наиболее чувствительны к внешним неблагоприятным воздействиям клетки в фазе синтеза ДНК, наименее — в G(|- фазе. Противоопухолевые препараты включают апоптоз в основном через две
сигнальные системы: через ген р53 и через Fas-рецептор/ФНО.
Антрациклиновые антибиотики, проникнув в плазматическую мембрану, участвуют в запуске механизма CD95 (Раз)-индуцированного апоитоза. Указанные препараты вызывают блок G,-M фазы в
низких концентрациях и аккумуляцию клеток в середине S-фазы
при высоких концентрациях. Например, идарубицин вызывает
апоптоз опухолевых клеток в 5 раз эффективнее, чем дауноруби-
228
Часть 1. Теоретическая гематология
цин. Пусковым механизмом апоптоза, связанным с индукцией FAS/
ФНО-региона, может являться в некоторых случаях и образование активных форм кислорода (ROS — Reactive Oxygen Species).
Алкалоиды, в частности, винкристин, в низких дозах способны
вызывать увеличение экспрессии гена Ьах, который участвует в
запуске апоптоза, и блокировать путем гиперфосфорилирования
ген bcl-2. Антиметаболиты, в частности цитозар, вызывают апоптоз в G, - и S-фазе клеточного цикла.
Опухолевые клетки, в том числе и лейкемические, имеют свои
метаболические особенности, связанные, как правило, с нарушениями в механизмах апоптоза. Эти нарушения могут способствовать тому, что опухолевая клетка не будет элиминироваться даже
при наличии в ней повреждений, вызванных химиопрепаратами.
Дефекты механизмов апоптоза должны отражаться на чувствительности лейкозных клеток к химиопрепаратам. Выявление плохой чувствительности к ним в тестах in vitro в сочетании с низким
уровнем спонтанного апоптоза бластных клеток в дебюте заболевания при остром лейкозе дает основания для прогнозирования
развития лекарственной резистентности и коррекции тактики терапии (перевод на лечение по высокому риску) (Астрелина Т. А.,
2000).
Установление при опухолях мутаций, ведущих к снижению апоптоза, имеет не только академический интерес, но и ведет к развитию новых способов противоопухолевой терапии, т. е. мутации
генов, контролирующих процессы клеточной гибели, нарушают
чувствительность опухолевых клеток к воздействию противоопухолевых препаратов, механизм действия которых связан с индукцией апоптоза. Так, например, эффективность химиотерапии может зависеть от уровня экспрессии Вс1-2 опухолевыми клетками.
Подход, направленный на снижение Вс1-2 с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, уже показал обнадеживающие результаты в доклинических и клинических испытаниях.
Метод краткосрочного культивирования клеток опухоли in vitro
в присутствии химиотерапевтических препаратов для оценки эффективности их действия в качестве индукторов апоптоза находит
все более широкое применение как в России, так и за рубежом.
Данный тест достаточно прост и удобен для определения чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам. Так, в США
действует специальная программа рациональной противоопухолевой терапии, которая предполагает определение в лабораторных
условиях чувствительности опухолевых клеток конкретного больного к индукции апоптоза различными противоопухолевыми пре-
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз)
229
паратами. Это позволяет не только выбрать оптимальную схему
терапии, но и исключить применение препаратов, которые неэффективны в тестах in vitro (Абраменко И. В., Фильченков А. А.,
2003).
Основные методы определения апоптоза
1. Учет апоптотических клеток по характерной морфологии ядра
(конденсированный и фрагментированный хроматин) с использованием флуоресцентных красителей акридинового оранжевого и
этидиум бромида и флюоресцентного микроскопа.
2. Выявление изменений в плазматической мембране с помощью белка аннексина V. В апоптотических клетках фосфолипид
фосфатидилсерин (ФС) переориентируется и локализуется на поверхности клеточной мембраны. Его локализация на мембране наблюдается, начиная с ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Связываясь с ФС на поверхности клетки, аннексии V,
конъюгированный с флуорохромом, служит маркером апоптоза.
Обычно аннексии V используют в комбинации с пропидиум йодидом (ПИ), что позволяет определять одновременно интактные клетки, клетки в раннем апоптозе (положительные по аннексину V и
отрицательные по ПИ) и в «позднем» апоптозе или в некрозе (положительные и по аннексину V, и по ПИ).
3. Определение межнуклеосомной деградации (фрагментации)
ДНК — регистрация образования «лесенки» ДНК с помощью гельэлектрофореза.
4. Оценка фрагментации ДНК in situ в гистологических срезах —
TUNEL-метод, основанный на флюоресцентной метке окончаний
отрезков ДНК (З'-ОН-окончания, образовавшиеся в результате
фрагментации ДНК) с использованием биотин-конъюгированного дезоксиуридинтрифосфата (dUTP) в реакции, катализируемой
экзогенной терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT).
5. Определение экспрессии Fas-антигена на поверхности клетки с помощью моноклональных антител к CD95. Это позволяет, с
использованием проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии, выявить популяцию клеток, несущих Fas-антиген, т. е.
потенциально способных вступить в апоптоз.
6. Определение экспрессии внутриклеточного bcl-2 с помощью
моноклональных антител и проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии.
Таким образом, апоптоз является одним из основных механизмов поддержания тканевого гомеостаза. Особенно важен этот ме-
230
Часть 1. Теоретическая гематология
ханизм для иммунной и кроветворной систем, так как с его помощью осуществляется контроль клеточной пролиферации и элиминация аутоагрессивных клонов. Изучение факторов, модулирующих развитие апоптоза, может стать основой для разработки подходов к фармакологическому контролю апоптоза, который играет
важную роль в развитии многих заболеваний.
Литература
Абраменко И. В., Фильченков А. А. Оценка параметров апоптоза в диагностике
онкологических заболевании, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопросы онкологии. 2003. Т. 49. № 1. С. 21-31.
Астрелина Т. А. Механизм действия антилейкемических препаратов при лечении острых нелимфобластных лейкозов // Гематология и трансфузиология.
2000. Т. 45, № 4. С. 34-38.
Ярилин А. А. Агюптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996.
№ 6 . .С. 10-23.
Berke G. The Fas-based mechanism of lymphocytotoxicity // Human Immunol.
1997. V. 54, N 1 . P. 1-7.
Rieux-Laucat F., LeDeist F., Hivros C. et al. Mutations in Fas-associated with human
lymphoproliferative syndrome and autoimmunity// Science. 1995. V. 268. P. 13471358.
Tokino Т., Nakamura Y. The role of p53 target genes in human cancer // Critical
Review in Oncology/Hematology. 2000. V. 33. P. 1-6.
Zornig M., Hueber A., Baum W., Evan G. Apopiosis regulators and their role in
tumorigenesis// Biochimicaet Biophysica Ada. 2001. N 1551. P. 1-37.
Глава 11
СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА
Более 125 лет прошло со времени опубликования (1876 г.) Александром Шмидтом ферментативной теории свертывания крови,
которая до сих пор является основой современного представления
о данном процессе. Открытие фибриногена в 1856 г. и знаменитая
триада Р. Вирхова о патогенезе тромбозов, сформулированная в
том же году, до сих пор актуальны.
Триада Вирхова:
• нарушение поверхности (сосудистой стенки);
• замедление кровотока (стаз);
• аномалия клеточных и плазменных составляющих крови.
В основу первой схемы свертывания крови были положены
4 фактора, включающие I — фибриноген, II — протромбин, III —
тромбопластин, IV — ионы кальция и 2 стадии свертывания крови — тромбиногенез и фибринообразование.
В 1964 г. был завершен процесс формирования современной
теории свертывания крови (R. G. Macfarlane), основанной на последовательной активации плазменных факторов свертывания, так
называемой теории ферментативного каскада. Указанная теория
включала 3 фазы (стадии):
I — образование протромбиназы (тромбопластина);
II — превращение протромбина в тромбин — тромбиногенез;
III — трансформация фибриногена в фибрин.
В это же время были открыты основные плазменные прокоагулянты, факторы системы фибринолиза и физиологические ингибиторы (антитромбопластины и антитромбины), принята международная номенклатура. На протяжении последующих почти 40 лет
уточнялись детали ферментативного каскада. Принято сч итать. что
активация прокоагулянтов и образование активной протромбиназы происходит двумя путями: внутренним (кровяным) и внешним
(тканевым) (рис. 17).
Часть 1. Теоретическая гематология
232
ПДФгТ]^
X.Y
D.E
>
,
!пЛАТМИН
Ингибитор активатора
плазминогена (PAi-l;
I
Тканевый зхтиватор
плазминогена (t-PA)
L
Плззминоген
вмкАРС - зктиеироззнный
| протеин С
ПДФн:
DIM-;
DYft D
DXD/YY
Активатор плазминогека
урокиназного типа fu-PA)
Активация
Ингибирова!-(ие
•••-••••••••.
Деградация
Комплекс +
Рис. 17. Схема свертывания крови
.^-.-.гг^
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
233
Новая трактовка процесса свертывания крови, предлагаемая в настоящее время, основанная на активации системы гемостаза, утверждает тканевой путь (внешний) и исключает кровяной.
При этом тканевой фактор и ингибитор активации тканевого пути
признаются важнейшими в инициации и регуляции гемостаза
(RoldeH.J.,2001).
Идея иервно-гуморалыюй регуляции свертывания крови была
высказана задолго до создания данной теории. В 1914 г. Н. В. Cannon, Н. Gray, W. L. Mendelhall показали, что инъекции адреналина
или раздражение чревных нервов вызывают ускорение свертывания крови. В 60-70 гг. XX столетия была открыта регулирующая
роль нервно-гуморальной противосвертывающей системы. В настоящее время система гемостаза рассматривается как совокупность и взаимодействие компонентов крови, стенки сосудов и органов, принимающих участие в синтезе и разрушении факторов,
обеспечивающих резистентность и целостность сосудистой стенки, остановку кровотечения при повреждении сосудов и жидкое
состояние крови в сосудистом русле. При этом многие гуморальные компоненты системы гемостаза синтезируются клетками различных органов, а их функция осуществляется экстрацеллюлярно.
Система гемостаза является частью клеточно-тканевого гомеостаза.
Саморегулирующаяся клеточно-гуморальная система гемостаза с обратной связью обеспечивает оптимальную для кровообращения вязкость крови и целостность сосудистого русла, необходимые для жизни и функционирования всех органов и систем организма, а при повреждении тканей в экстремальных ситуациях
(травме, операции) — образование тромба для остановки кровотечения, сохранения жизни, реконструкции сосудов и заживления ран.
Данная система обеспечивает оптимальную текучесть крови и
оптимальное агрегатное состояние жидкой крови, необходимые
для осуществления жизнеобеспечивающего кровообращения, несмотря на наличие в крови мощного гемостатического потенциала.
Важной функцией системы гемостаза является остановка кровотечения при повреждении сосуда, образование тромба, лизис тромба,
восстановление целостности сосуда и непрерывности циркуляции
крови.
Систему гемостаза обычно принято изображать, как показано
на рис. 18, в виде уравновешенных весов (норма-коагуляция).
Колебания гемостатического потенциала в диапазоне определенных величин являются нормальными. Отклонения от нормы,
234
Часть 1. Теоретическая гематология
Гиперкоагуляция
Норма
Гипокоагуляция
Рис. 18. Система гемостаза
сдвиги в оценочных лабораторных реакциях расценивают как гиперкоагуляцию (активация системы гемостаза или увеличение количества прокоагулянтов, снижение фибринолиза) — склонность
к тромбозам; гипокоагуляция (ингибиция или истощение — снижение концентрации свертывающих факторов, активация фибринолиза) '— склонность к кровоточивости. При оценке состояния
фибринолиза должна быть применена противоположная трактовка, так как его действие имеет антагонистическую направленность.
Для оценки состояния гемостаза необходимо определять активность и количество клеточных и плазменных компонентов этой
системы в циркулирующей крови. При этом снижение функции
(активности) вышеуказанных компонентов, зависящей от многих
причин, может вызывать клинические проявления (тромбозы или
кровотечения) иногда даже на фоне отсутствия количественного дефицита (нарушение продукции или истощение-потребление
/consumption/ в ходе диссеминированного внутрисосудистого свертывания). Точная диагностика указанных нарушений в системе
гемостаза определяет тактику корригирующей терапии. При этом
определяется необходимость применения фармацевтических
средств, направленных на стимуляцию или ингибицию нарушенной активности. Восполнение количественного дефицита возможно замещением препаратами или гемокомпонентами. Основные
компоненты, входящие в систему гемостаза, представлены на
рис. 19.
Остановка кровотечения при повреждении тканей зависит от
всех составляющих компонентов системы гемостаза. Однако различают первичный гемостаз, осуществляемый за счет сосудистотромбоцитарного звена, и вторичный -•• окончательную остановку
кровотечения за счет формирования прочного тромба с участием
плазменных компонентов гемостаза, превращения фибриногена в
фибрин. Общим оценочным тестом, характеризующим сосудистотромбоцитарный гемостаз, является «длительность кровотечения».
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
235
ПЛАЗМЕННЫЕ ФАКТОРЫ
Прокоагулянты (система свертывания крови)
Эндогенные антикоагулянты (противосвертывающая система)
Фибринолитическая система (субстрат, активаторы и ингибиторы)
СОСУДИСТАЯ СТЕНКА
эндотелий
мезотелий
тучные клетки
КЛЕТКИ КРОВИ
тромбоциты
эритроциты
лейкоциты
Рис. 19. Система свертывания крови
определяемая как время от момента стандартного укола или пореза до остановки кровотечения.
Соотношение жидкой и клеточной частей крови — гематокрит
(Ht) — определяют путем сопоставления их объемов после разделения центрифугированием в капилляре нестабилизированной крови (норма — 45-55 л/л). Отклонения этого показателя от нормы
влияют на конечный результат гемокоагуляции.
При извлечении крови из сосудистого русла жидкая кровь свертывается, при этом образуются сгусток, сыворотка, 3-я фракция
крови (выпавшие из сгустка эритроциты). Скорость этого процесса и соотношение фракций зависят от качества поверхности (пробирки, предметного стекла, кюветы прибора и т. д.), с которой соприкасается кровь, и совокупности всех гуморальных и клеточных
компонентов системы гемостаза.
Время свертывания крови (по: Lee&White) — это общий оценочный тест: время свертывания 1 мл венозной крови в стеклянной пробирке (норма — 6-10 минут). Данный тест можно проводить вручную с помощью секундомера или специальным прибором — фибринтаймером.
Сыворотку крови, полученную после образования сгустка в пробирке, используют для определения различных биохимических,
иммунологических, серологических или изосерологических характеристик крови. У здорового человека фибриноген как основной
субстрат, образующий сгусток, в сыворотке не содержится, и все
факторы свертывания крови определяются в плазме.
Плазменные факторы свертывания крови — прокоагулянты.
Для получения плазмы необходимо сохранение крови в жидком
состоянии после извлечения ее из сосудистого русла. «Стабилизировать» кровь, предотвратить ее спонтанное свертывание можно
236
Часть 1. Теоретическая гематология
путем связывания необходимых для коагуляции ионов кальция.
Это осуществляют двумя способами: добавляют растворы солей,
связывающих кальций (смешивают с раствором цитрата натрия,
трилона Б и другими), или удаляют из крови ионы кальция с помощью ионообменных сорбентов. Гепарин, часто используемый для
стабилизации крови, предотвращает свертывание крови более сложным способом, ингибируя тромбиногенез, действие тромбина и
связывая кальций (для исследования системы гемостаза стабилизация крови гепарином не используется).
Плазмой крови называют жидкую часть стабилизированной или
консервированной крови, отделенную отстаиванием или центрифугированием от эритроцитов и других клеточных элементов. В зависимости от режима и условий центрифугирования получают различную плазму: богатую или бедную тромбоцитами (PRP — platelet
rich plasma, PPP — platelet poor plasma), которые используют для
исследования активности плазменных компонентов гемостаза и
функции тромбоцитов. Тринадцать плазменных факторов свертывания крови обозначают римскими цифрами, а тромбоцитарные —
арабскими цифрами.
Факторы свертывания крови находятся в циркулирующей крови и в плазме в неактивном состоянии. Для обозначения активированного фактора свертывания крови к цифре добавляют букву «а».
Перечень общепринятых факторов и их обозначения представлены в табл. 6.
Таблица 6
Плазменные факторы свертывания крови,
номенклатура международного комитета по тромбозу и гемостазу,
1954-1957 гг.а
Знак
в номенклатуре
Название
FI
Фибириноген
FII
Протромбин
Fill
Тканевой
фактор тромоопластин
Молекулярный
вес,Д
340 000
Концентрация
в плазме
крови
2-4 г/л
70 000
0,1-0.15 г/л
Нет в циркуляции
Место синтеза
(особенности)
Печень (термолабилен;
преобразуется
в фибрин)
Печень (необходимо присутствие витамина К;
преобразуется
в тромбин)
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
237
Продолжение таблицы 6
Знак
в номенклатуре
FIV
Кальций
FV
Проакцсллерин
FVI
Лкпеллерин
FV1I
Проконвертин
60 000
FVIII
AHF
Антигемофильный фактор (гемофилия А)
270 000340 000
0.5 мг/мл
Эндотелий, печень (в комплексе с фактором
Виллебранда)
FIX
КристмасфактОр (гемофилия В)
72 000
3 мг/мл
Печень (необходимо присутствие витамина К)
FX
Фактор Стюарт-Прауэра
55 000
10-15 мг/мл
Печень(необходимо присутствие витамина К;
активирует протромбин)
FXI
РТА
Плазменный
усилитель
тромбопластина
160 000
5 мг/мл
Печень (термолабилен)
FXII
Фактор контакта Хагемана
110 000
FXI1I
Фибринстабилизирующий
фактор (ФСФ)
340 000
Название
Молекулярный
вес, Д
Концентрация
в плазме
крови
Место синтеза
(особенности)
0,9-0,11 г/л
Другие двухвалентные катионы
270 000
5 15 мг/мл
Печень (самый
лабильный фактор)
—
—
Активированная
форма FV
Печень (необходимо присутствие витамина К;
стабильный)
Активируется
коллагеном калликреином и субэндотелием,
инородной поверхностью.
Активирует
свертывание и
фибринолиз
20 мг/мл
Печень (поли-,
меризует фибрин-мономер
в полимер)
Не имеют номера цифрового обозначения прекалликреин —
фактор Флетчера и высокомолекулярный киншюген — фактор
238
Часть 1. Теоретическая гематология
Фицжеральда, которые связывают калликреин-кининовую и свертывающую системы крови.
Факторы II, VII, IX, X и ингибиторы свертывания протеины С
(PC) и S (PS) синтезируются в печени, при их синтезе необходимо
присутствие витамина К. Белки, обнаруженные в плазме при отсутствии витамина К, получили название PIVKA (protein induced
by vitamin K absence) протеины.
Последовательная активация плазменных факторов — ферментативный каскад свертывания крови — представлен схематически
на рис. 17.
Активация системы гемостаза и так называемое постоянное
внутрисосудистое свертывание контролируется противосвертывающей системой эндогенных антикоагулянтов. Теоретически при
свертывании 1 мл крови может образоваться 150 ед. тромбина, и
чтобы свернуть всю циркулирующую кровь человека (5 л), было
бы достаточно тромбина, полученного из 10 мл крови. Однако практически этого не происходит, так как в кровеносном русле образуется тромбина не более 10-15 ед/мл, и он очень быстро нейтрализуется. Тромбинообразование и диссеминация внутрисосудистого
свертывания (ДВС) в физиологических условиях сдерживается
действием эндогенных антикоагулянтов.
Физиологические ингибиторы коагуляции. Основная группа
гуморальных ингибиторов — серпины — это ингибиторы сериновых протеаз системы свертывания крови. К ним относятся:
• антитромбин III (ATIII);
• al-ингибитор протеиназ (al-антитрипсин);
• а2-макроглобулин;
• кофактор II гепарина — антитромбин II (АТП), ингибитор Ха.
зависимый от протеина Z (ZPI);
• протеазный нексин 1.
Главными естественными ингибиторами Ха-фактора и всех сериновых протеаз (более 95%), участвующих в каскаде гемокоагуляции, является антитромбин — GAG-комплекс (антитромбпны
Ш и II — кофакторы клеточных и плазменных гликозаминогликанов (GAG), тромбомодулина). Конформационная стабильность
комплекса возрастает при участии низкомолекулярных гепаринов,
что делает эти препараты гепарина антикоагулянтом выбора при
лечении.
Особое место в ограничении активации каскада гемокоагуляции занимает система протеина С (PC), действующего совместно с
протеином S (PS) и тромбомодулином (ТМ) сосудистой стенки.
Активированный минимальными дозами тромбина PC (АРС) пред-
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
239
отвращает чрезмерную активацию плазменных FVa и FVIIIa. Резистентность к протеину С, обозначаемая как АРС-резистентность,
связана чаще всего с мутацией гена FV, что приводит к развитию
тромбозов и тромбоэмболии.
Кроме того, в ограничении активации гемостаза и нейтрализации образовавшегося тромбина участвуют 6 антитромбинов (AT),
обозначаемых римскими цифрами:
• AT I — фибрин;
• AT II — кофактор дерматан-сульфата, 2-й кофактор гепарина;
• AT III — 1-й кофактор гепарансульфата и других гликозаминогликанов;
• AT IV — патологический ингибитор тромбина при коллагенозах;
• AT V — в комплексе с AT IV при патологии соединительной
ткани;
• AT VI — продукты деградации (фрагменты) фибриногена и
фибрина (ПДФ), патологический ингибитор, обладающий
антитромбнновым и антитромбоцитарным действием, в зависимости от величины фрагмента.
Фибринолитические компоненты системы гемостаза. В здоровом организме активация коагуляционного каскада, тромбшюгенеза и непрерывное образование микроколичеств фибрина приводят к активации фибринолиза.
Плазминогеп (ПГ) — плазменный ^-глобулин с молекулярной
массой 90 000 Д, синтез которого осуществляется в печени, костном мозге и почках. Период полужизни ПГ в плазме составляет
2,24 суток. Данный компонент имеет большое сродство к фибрину
и под влиянием тканевых активаторов фибрннолиза превращается
в плазмин — протеолитический фермент, который лизирует (расщепляет) фибрин, активирует контактную фазу каскада гемокоагуляции (калликреин-кининовую систему, фактор Хагемана), создавая порочный круг активации свертывания крови и фибринолиза. Этот процесс лежит в основе синдрома диссеминированного
внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром), развития
коагулопатии потребления и фибринолитических кровотечений.
В результате фибринолиза в циркулирующей крови появляются
продукты (фрагменты) деградации фибриногена и фибрина.
Одновременно активный тромбин, являясь сериновой протеазой, расщепляет фибриноген и также образует фрагменты. Каждый фрагмент имеет иммунологическую специфичность, и его наличие может быть выявлено лабораторными тестами. В табл. 7
приведен перечень известных фрагментов, которые определяются
http://www.bestmedbook.com/
210
Часть 1. Теоретическая гематология
иммунологическими методами с помощью специфических антисывороток.
Обнаружение в крови больных фрагментов фибриногена и фибрина, образовавшихся при их расщеплении тромбином и плазмином, позволяет диагностировать ДВС и определить стадию ДВСсиндрома и степень активности фибринолиза еще до появления
клинических признаков.
Таблица 7
Моноклональные антитела к специфическим антигенам
фибриногена и фибрина и к их фрагментам
Реакция
с натнвным
фибриногеном
Тип иммуноглобулина
Фибрин(оген) Аа-цепь (Аа 559-539)
Да
IgGI,k
Фибрин(оген) Аа-цепь (Аа 24-^76)
»
»
Антигенная специфичность
Нет
»
Фибриноген: фибрин I: Вр-цепь (Вр 1-42)
Да
IgG2a. k
Фибрин II; Фибрин 11 Р цепь ((Вр 1-42)
Нет
IgGl.k
Фибрин(оген) у-цепь ф92-406)
»
»
Фибриноген D/фибрин D-димер только
))
»
>)
»
Фибрин(оген) у-цепь (у-15-35)
»
»
Фнбрин(оген) у-цепь (у-95-265)
»
»
Да
»
Фибринопептид A (FPA, Аа 1-16) только
Фибрин(оген) у-цепь (Аа)
Фибрин(оген) Аа-цепь (Аа)
Особая значимость в диагностике ДВС-синдрома придается
выявлению Д-Димера. Переход п.тазминогена в плазмин происходит под влиянием активаторов плазминогена, таких как тканевой
активатор плазминогена (t-PA) и урокиназный активатор плазминогена (и-РА).
Кроме того, активация фибринолиза происходит через контактную фазу (фактор XII) и через иммунную систему (комплемент).
К физиологическим ингибиторам фибринолиза относятся антиактиваторы (ингибитор активатора п.тазминогена — PAI), ингибиторы плазмина (а2-антиплазмин, а-2-макроглобулин, cd-антитрипсин и комплекс антитромбин -гепарин).
Помимо специфических активаторов плазминогена фибринолизис вызывается протеазами поджелудочной железы (трипсин,
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
241
хемотрипсин), эластазой, лизосомальными ферментами, ферментами из микроорганизмов и грибов (стрептаза, бриназа, охраза,
триаза и т. д.). При выделении в кровь больших количеств этих
ферментов или при постоянном их поступлении через активацию
контактной фазы коагуляции, калликреин-юшиновой и иммунной системы активируется тромбиногенез, что при недостаточности эндогенных антикоагулянтов и ингибиторов фибринолиза приводит к ДВС. Коагулопатия потребления — нарушение в системе
гемостаза, связанное с образованием микросгустков в сосудистом
русле при генерализованной ДВС, в результате чего возникает дефицит полноценных плазменных прокоагулянтов (снижение количества тромбоцитов, фибриногена и протромбина). При этом
нарушается полимеризация фибрина, полноценный сгусток не образуется.
Сосудистая стенка. Свертывание крови инициируется при повреждениях сосудистой стенки и дисфункциях эндотелия, вызываемых бактериальными токсинами, вирусной инфекцией, цитокинами (TNF, ИЛ-1 и другие), свободными радикалами, иммунными комплексами, острой гииертензией, никотином или другими
токсическими продуктами. Нарушается хрупкий гемостатический
баланс, меняется фенотип эндотелиальных клеток из тромборезистентного в прокоагулянтпое, воспалительное и вазоконстрикторпое состояние. Из телец Вейбела-Пэлейда эндотелия высвобождается 3-селектин и фактор Виллебранда, который связывает коллаген субэндотелия и рецептор тромбоцитов гликопротеин lb, a
затем через повышение внутриклеточного кальция и фактора Виллебранда происходит активация других поверхностных тромбоцитарных гликопротеидов ПЬ/Ша — рецепторов фибриногена и
плазменного фактора Виллебранда. Эти механизмы способствуют
сохранению целостности и функции эндотелия. Постоянное сохранение жидкой циркулирующей крови в сосудистом русле и образование тромба в месте повреждения эндотелия — двойная функция системы гемостаза, которая обеспечивается участием сосудов
в продукции как прокоагуляитных, так и антикоагулянтных субстанций.
Прокоагулянтные свойства сосудов связаны с синтезом:
• фактора Виллебранда (vWF) — кофактора адгезии тромбоцитов — пластинок (platelet), и антигемофилыгого фактора
(FVIII);
• тканевого фактора (TF) — активация коагуляции крови;
• ингибитора активатора плазминогена (PAI-1) — ингибирование фибринолиза.
242
Часть 1. Теоретическая гематология
Антикоагулянтные свойства сосудов обусловлены синтезом:
• простациклинов — ингибиторов адгезии и агрегации тромбоцитов;
• тромбомодулина (ТМ) — кофактора эндогенных антикоагулянтов, и протеина С;
• тканевого активатора плазминогена (t-PA);
• гепарансульфата и других гликозаминогликанов (GAG) —
кофакторов антитромбинов III и II (AT III, AT II), участвующих в нейтрализации тромбина и других сериновых протеаз
ферментативного каскада гемокоагуляции.
В нормальном функционировании системы гемостаза принимают участие практически все клеточные элементы крови и эндотелий. Одна из основных особенностей процесса свертывания локализация его на поверхности поврежденного эндотелия и активированных клеток крови. Эта особенность обусловлена связыванием ферментов (факторов Vila, IXa и Ха) с отрицательно заряженной поверхностью клеток и взаимодействием факторов Vila и
Ха с рецепторами клеток. Установлено, что две сериновые протеиназы и тромбин, а также антикоагулянт протеин С и его кофактор
протеин S имеют рецепторы на мембране клеток. Активация этих
рецепторов приводит к инициации свертывания вследствие образования ферментов и стимуляции синтеза, секреции и экспонирования на мембране клеток новых рецепторов и адгезивных молекул. Как видно из табл. 8, взаимодействие активированных протенназ с клетками в кровеносном русле происходит через тканевой
фактор и другие лиганды.
Установлено, что тромбин и Ха-фактор увеличивают прокоагулянтные свойства эритроцитов, уменьшают их осмотическую и кислотную резистентность и выход из них субстанций, ускоряющих
свертывание крови. Тромбин и Ха-фактор индуцируют функциональную активность иммунокомпетентных клеток, стимулируют
фагоцитарную активность макрофагов и уменьшают их миграционную способность. Усиливая специфическую активность макрофагов, тромбин вызывает секрецию тканевого фактора и активатора плазминогена.
Тромбоциты, или кровяные пластинки platelet (PL) — оба термина приняты в международной номенклатуре. Наибольшее значение в образовании тромба из всех клеток крови имеют кровяные
пластинки.
Основные физиологические функции тромбоцитов: участие в
гемостазе (остановке кровотечения), первичном гемостазе, тромбообразовании и тромболизисе, участие в поддержании целостно-
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
243
Таблица 8
Рецепторы сери новых протеаз и их лиганды в сосудистой системе
(по: Струкова С, М., 2002)
Протеиназа
Рецептор
ФУНКЦИЯ
Фактор
VII/VIIa
Тканевой фактор
(ТФ) (эндотелий, моноциты)
Инициирование свертывания крови
(активация FX-FXa). активация клеток
Фактор Ха
EPR-1 (эндотелий и
др.)
Генерация тромбина, независимая от
FVa. активация клеток
Фактор Ха
МАС-1 (моноциты)
Генерация FXa
Фактор Ха
PAR-2 (эндотелий и
лр.)
PAR-1/-3/-4 (тромбоциты, эндотелий и
лр.)
Активация клеток
Тромбин
Тромбомодулин (эндотелий )
Активация системы протеина С, ингибирование тромбина, активация
TAFI (ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином)
Тромбин
GPIb/X/V
Ускорение свертывания крови на
тромбоцитах, кофактор PAR-1 (протеиназой активируемого рецептора)
Протеин
С/АРС
Протеин S
EPCR (эндотелий)
Кооперация с ТМ (тромбомодулином). ингибироваиие воспаления
Рецептор тирозинкиназ (TYROZ). сосудистые клетки, аннексии
II
Активация клеток
Тромбин
То же
сти эндотелия, в депонировании и транспорте биологически активных веществ.
Эти клетки содержат аналогичные плазме прокоагулянты и сократительный белок (тромбостенин). Активируясь, они изменяют
форму, осуществляют «динамическую» функцию: адгезию (прилипание) друг к другу н к соединительной ткани поврежденной
сосудистой стенки. Затем кровяные пластинки образуют агрегаты
и первичную гемостатическую пробку. Активированные кровяные
пластинки выделяют гранулы (релиз-реакция), содержащие прокоагулянты (тромбопластиновый — 3-й тромбоцитарный фактор и
антигепариновый — 4-й тромбоцитарный фактор, (3-тромбог.тобулин), серотонин, адениновые нуклеотиды и т. д. Тромбоцитарные
мембранные фосфолипиды играют роль матрицы, па которой
активируются плазменные факторы свертывания, фибриноген превращается в фибрин и образуется тромб. Тромбоцитарное звено
гемостаза вносит важнейший вклад в осуществление физиологи-
244
Часть 1. Теоретическая гематология
ческой функции всей системы гемостаза, поэтому с нарушениями
в этом звене системы связана тяжелейшая патология, проявляющаяся в виде геморрагических диатезов и тромбозов.
Клинические манифестации могут быть связаны с изменением
количества тромбоцитов и нарушением динамической или выделительной функции. Тромбоцитопения — это уменьшение количества тромбоцитов (ниже 150 х 109/л), тромбоцитоз или тромбоцитемия — увеличение их количества (выше 350 х 109/л).
Причиной кровоточивости и тромбозов нередко может быть приобретенная тромбоцитопатия — нарушение функциональной активности тромбоцитов, которая может быть измененной при нормальном содержании, а также при сниженном и повышенном их числе.
Тромбоцитарные нарушения могут быть наследственными, связанными с недостатком синтеза различных тромбоцитарных субстанций, гранул хранения или с генетическими дефектами мембранных гликопротеинов. Нарушения тромбоцитарного звена могут быть связаны с дефектами кроветворения. Приобретенные
нарушения тромбоцитарного звена чаще всего являются результатом их активации и истощения при латентно протекающем или
остром синдроме ДВС, спровоцированным инфекционными и вирусными заболеваниями.
Большое значение в осуществлении процессов свертывания крови и поддержания ее в жидком состоянии имеет тканевой фактор
(ТФ) гемостаза, признанный провоцирующим фактором его внутрисосудистой активации. ТФ является трансмембранным гликопротеином, который служит клеточным рецептором и кофактором
для плазменного F Vila, который инициирует коагуляционный
ферментативный каскад, приводя к образованию тромбина и фибрина. Тканевой фактор — член семейства рецепторов цитокинов
II класса, может продуцироваться появившимися циркулирующими моноцитами, стимулированными специфическими факторами
воспаления. Для своей оптимальной функции тканевой фактор
интегрирует с анионными фосфолипидами клеточной мембраны.
Гранулоциты повышают липопротеин-зависимую экспрессию ТФ
в моноцитах.
Экспонирование тканевого фактора на клетках — ключевой
момент свертывания и тромбообразования. Показано, что внешний путь свертывания, запускаемый тканевым фактором, является основным в процессах внутрисосудистого свертывания крови
и тромбообразования, включающего 2 основные фазы (рис. 20):
1-я — триггерная (фаза инициации); 2-я — фаза распространения
(каскад).
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
ТКАНЕВЫЙ
ФАКТОР
Ха
1 TEPI
245
\ia
Рис. 20.
Этот принцип положен в основу новой трактовки механизма
аутоактивации ферментативного каскада свертывания крови. Стимулом для активации внешнего пути свертывания крови служит
экспонирование ТФ на поверхности клеток — рецептора фактора
VII/VIIa, 1% которого находится в кровотоке в активном состоянии, но в конфирмации не способен контактировать с плазменными факторами и активировать их. Комплекс ТФ/VIIa активирует
клетки, вызывая повышение внутриклеточного кальция и фосфорилирование активируемых митогеном протеинкиназ (МАР-киназ), приводя в конечном счете к адгезии клеток и миграции.
246
Часть 1. Теоретическая гематология
Комплекс ТФ/FVIIa активирует FIX, FIXa и FV, FVIII, и процесс переходит в фазу распространения. При этом происходит образование тенназы (комплекса FIXa — FVIIIa), которая активирует комплекс FX/FV на мембранных фосфолипидах (ФЛ) пластинок, что приводит к образованию протромбиназы (комплекса FXa/
FVa), расщепляющей протромбин с образованием тромбина.
Показано, что FXa, взаимодействуя с рецепторами на эндотелии и моноцитах, может стимулировать образование тромбина механизмами, независимыми от ТФ. Активация моноцитов приводит к экспонированию на их поверхности адгезивных белков, а
также FIXa и Ха, что стимулирует появление следов тромбина,
достаточных для активации интегринов аМ|32 (называемых также Мас-1 или CDllb/CD18), принадлежащих к семейству р2-интегринов, которые связывают (наряду с другими белками) FXa.
Катепсин G, освобождающийся из активированных лейкоцитов,
вызывает ограниченный протеолиз FX, мобилизованного на мембранах, превращая его в активную форму, способную преобразовывать протромбин в тромбин. В отличпе от FXa тромбин участвует в
регуляции процессов, направленных как на ускорение свертывания, так и на его торможение (Кудряшов Б. А., 1975).
Тромбин, иммобилизованный на тромбом одул пне, теряет способность свертывать фибриноген и активировать плазменные и
клеточные прокоагулянты, он приобретает новые функции. Так,
тромбин активирует протеины С и S-эндогенные антикоагулянты,
ограничивающие активацию FV и FVIII, и блокирует фибринолиз,
так как активирует ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином TAFI (карбоксипептидаза), тем самым лишая модифицированный фибрин способности связываться с плазминогеном.
Тромбин, взаимодействуя со специфическими рецепторами, стимулирует клетки, участвующие в процессах воспаления и репарации тканей, в том числе моноциты, Т-лимфоциты, клетки эндотелия, гладкомышечные, фибробласты, тучные и нервные клетки.
Активируя семейство протеиназой активируемых рецепторов
(PAR), тромбин стимулирует ряд механизмов передачи сигнала,
конечным результатом которых может быть активация факторов
транскрипции, регулирующих экспрессию тканевого фактора, адгезивных белков, факторов роста, цитокинов и других лигандов,
вовлекаемых в сопряженные процессы воспаления, миграции и
пролиферации клеток.
При очень низких концентрациях тромбин может быть регулятором воспаления, так как блокирует адгезию моноцитов к эндотелию, агрегацию тромбоцитов, освобождая оксид азота из клеток.
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
247
Рецепторы семейства PAR осуществляют связь между протеолитическими системами, участвующими в воспалении, свертывании и фибринолизе.
Коагуляционное и антикоагулянтное звенья гемостаза, действующие через сосудистый эндотелий и тромбоциты, конкурируют
друг с другом за контроль образования тромба. Фибринолитические и антифибринолитические компоненты в нормальных условиях также уравновешивают свое действие. Сосудистый эндотелий и тромбоциты в этих процессах играют важнейшую роль. Непрерывное внутрисосудистое свертывание (НВС) контролируется
нервно-гуморальными физиологическими механизмами (Зубаиров Д. М. А., 1978). Патологическая диссеминация свертывания
крови — ДВС-синдром — развивается в условиях декомпенсации
приспособительных механизмов при длительном или многократном действии провоцирующих активацию гемостаза патологических воздействий и только при наличии дефекта гуморально-рефлекторной регуляции системы гемостаза на фоне наследственной
или приобретенной тромбофилии.
Тромбофилия — термин, определяющий наследственную или
приобретенную склонность к активации гемостаза: тромбозам,
тромбоэмболиям и ДВС. Причиной наследственной тромбофилии
являются генетические дефекты, определяющие синтез патологических молекул факторов свертывания крови (мутации генов протромбина, V фактора Лейден, полиморфизм в генах фибриногена,
тромбоцитарных гликопротеинов, фактора VII, ингибитора активатора плазминогена (PAI), метилтетрафолатредуктазы, ответственной за гипергомоцистеинемию).
Приобретенная тромбофилия возникает на фоне аутоиммунных заболеваний и первичного или вторичного антифосфолипидного синдрома (АФЛС), при котором выработка и накопление аутоантифосфолипидных антител (АФЛА) приводит к диспротеинемиям и нарушению взаимодействия плазменных белков и
мембранных фосфолипидов. Мишенью АФЛА являются тромбоциты и эндотелиальные клетки, поэтому на таком фоне могут развиваться тромбозы и геморрагии. Приобретенная тромбофилия
развивается также на фоне хронических заболеваний печени и почек, которые способствуют нарушению синтеза эндогенных антикоагулянтов (АТШ, эндогенных GAG) и факторов свертывания
крови (фибриногена, протромбина и др.). Наличие тромбофилин
требует постоянного клшшко-лабораторного наблюдения за пациентом, особенно в тех случаях, когда эпизоды тромбозов или геморрагического диатеза уже были у него в анамнезе.
2 48
Часть 1. Теоретическая гематология
Для диагностики нарушений гемостаза в настоящее время используются скрининговые клоттинговые (коагуляционные) тесты:
• протромбиновый индекс;
• активированное парциальное тромбопластиновое время
АПТВ;
• фибриноген;
• эуглобулиновый тест;
• рептилазное (ядовое) время — выявление ингибитора;
• время кровотечения (длительность);
• активность FVIII, FIX;
• активность и антиген фактора Виллебранда;
• активность отдельных прокоагулянтов (факторов свертывания крови), факторов противосвертывающей системы и фибринолиза.
Содержание антигенов факторов системы гемостаза определяется иммунологическими методами.
Маркеры активации гемостаза (маркеры тромбинемии):
• фрагменты протромбина F1+2;
• тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ);
• фибрин-мономер;
• фибринопептид A (FPA);
• антигепариновый фактор кровяных пластинок (Pf4);
• (3-тромбоглобулин пластинок (J3-TG);
• Д-Димер и другие ПДФ.
Таким образом, более чем столетний путь накопления знаний
по проблемам, связанным с физиологией и патологией гемостаза,
позволил уточнить патогенез тромбозов и кровотечений и разработать методы достаточно точной диагностики нарушений в различных звеньях этой системы. Своевременная диагностика и коррекция нарушений гемостаза позволяет избежать локальных нарушений микроциркуляции крови и профилактировать почечную и
сердечную недостаточность, улучшать качество жизни онкогематологических больных.
Литература
Балуда В. П., Балуда М. В., Деяние И. И., Тлепшуков И. К. Физиология системы
гемостаза. Москва, 1995. 243 с.
Баркамн 3. С. Геморрагические заболевания и синдромы. М.: Медицина, 1988.
Бокарев И. Н., Щегютинин Б. М., Ена Я. М. Внутрисосудистое свертывание
крови. Киев: Здоровье, 1989.
Гаврилов О. К. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. М.: Медицина, 1981.285 с.
Часть 2
КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 12
АНЕМИИ
Анемия (дословный перевод — бескровие), или малокровие, —
это заболевания и патологические состояния, сопровождающиеся
снижением уровня гемоглобина и (или) эритроцитов в единице
объема крови и, соответственно, снижением гематокрита, отражающего общий объем форменных элементов в крови.
В настоящее время единой общепринятой классификации обширной группы анемических состояний не существует. Анемии
делят на группы в зависимости от ряда признаков. Так, этиологически их подразделяют на врожденные анемии, обусловленные
внутриэритроцитарными факторами (аномалии мембраны, ферментопатии, гемоглобинопатии), и анемии, обусловленные внеэритроцитарными факторами — обычно приобретенные.
По степени тяжести выделяют тяжелую (уровень гемоглобина
75 г/л и ниже), умеренную или среднюю (80-100 г/л) и легкую
(100-110 г/л)анемии.
По эритроцитарным параметрам анемии различают по:
1) размерам эритроцитов — микроцитарные (средний диаметр
эритроцитов — СДЭ — менее 6,7 мкм; средний объем эритроци3
тов — СрОбЭ (MCV) — менее 80 мкм ), нормоцитарные (СДЭ —
3
7-8 мкм; СрОбЭ — 80 -100 мкм ) и макроцитарные (СДЭ — более
7,7 мкм; СрОбЭ - более 95- 100 мкм3);
2) степени насыщения гемоглобином — гипохромные (с цветовым показателем — ЦП — менее 0,85 и средней концентрацией
гемоглобина в эритроцитах — СКГЭ (МСНС) — ниже 30 г/дл),
Глава 12. Анемии
251
нормохромные (ЦП — 0,9-1,1: СКГЭ — 30-38 г/дл) и гиперхромные (ЦП — выше 1,1; СКГЭ — более 38 г/дл).
Число ретикулоцитов как показатель продукции молодых эритроцитов является чувствительным тестом для определения сохранности и адекватности реакции костного мозга на снижение уровня
гемоглобина и эритроцитов в крови. С учетом этого показателя
анемии могут быть разделены на гипорегенераторные (при уровне
ретикулоцитов менее 1 — 1,2% при наличии анемии), связанные с
нарушением продукции эритроцитов в костном мозге, а также нормо- или гиперрегенераторные (уровень ретикулоцитов повышен
умеренно или значительно — до 20-30% и более). Повышение числа ретикулоцитов указывает на то, что малокровие, скорее всего,
обусловлено гемолизом (то есть повышенным разрушением эритроцитов) или кровотечением.
Основной и наиболее часто используемой классификацией является патогенетическая — по ведущему механизму развития. В упрощенном варианте по М. П. Кончаловскому (1939) данная классификация выглядит следующим образом.
1. Постгеморрагические анемии — острые и хронические.
2. Анемии, являющиеся результатом нарушения кровообразования, — мегалобластные, железодефицитные, апластическая
и др.
3. Гемолитические анемии.
По патогенетическому механизму возможен следующий вариант группировки анемий, обусловленных (Абдулкадыров К. М. и
др., 1999):
1) преимущественно нарушением синтеза гемоглобина;
2) снижением продукции эритроцитов в костном мозге;
3) повышенным разрушением эритроцитов и (или) эритрокариоцитов в костном мозге.
П. А. Воробьев (2001) предложил несколько иной вариант классификации анемий.
1. Железодефицитные.
2. Сидероахрестические — дефицит гемсинтетазы (связанные с
нарушением синтеза гема).
3. Мегалобластные (связанные с нарушением синтеза ДНК).
4. Атрансферринемия (обусловленная нарушением транспорта
железа).
5. Гемолитические.
6. Связанные с костномозговой недостаточностью.
7. Связанные с нарушением регуляции эритропоэза (повышение уровня ингибиторов эритропоэза).
252
Часть 2. Клиническая гематология
В то же время международная классификация болезней ВОЗ
(МКБ-10) предусматривает основные рубрики, касающиеся анемий, с соответствующим кодом отдельных нозологических форм,
которые приведены ниже.
1. D50-D53 — анемии, связанные с питанием:
D50 — железодефицитная;
D51 — витамин Вр-дефицитная;
D52 — фолиеводефицитная;
D53 — другие анемии, связанные с питанием.
2. D55-D59 — гемолитические анемии:
D55 — связанные с ферментативными нарушениями;
D56 — талассемия;
D57 — серповидно-клеточная;
D58 — другие наследственные гемолитические анемии;
D59 — острые (приобретенные) гемолитические.
3. D60-D64 — апластическая и другие анемии:
D60 — приобретенная красноклеточная аплазия (эритробластопения);
D61 — другие апластические анемии;
D62 — острая постгеморрагическая анемия;
D63 — анемия хронических заболеваний;
D64 - другие анемии (МКБ-10, ВОЗ, 1992).
В разделах справочника, посвященных отдельным формам анемий, приведены классификации, которые наиболее широко применяют в клинической практике.
Железодефицитная анемия
Железодефицитная анемия (ЖДА) — патологические состояния, в основе которых лежит дефицит железа в организме, сопровождающиеся нарушением синтеза железосодержащего пигмента
гема в молекуле гемоглобина и, как следствие этого, развитием
анемии.
ВОЗ железодефицитная анемия признана одной из важных социальных проблем с учетом широкого распространения данной
патологии, в том числе среди женщин детородного возраста и детей, а также того, что социальные факторы (уровень жизни, образования, здравоохранения) влияют на частоту заболеваемости.
Распространенность. Железодефицитная анемия является широко распространенным патологическим состоянием и составляет
более 80% среди всех анемий. Наиболее часто заболевание встречается в развивающихся странах, а в различных группах населения
Глава 12. Анемии
253
высокая предрасположенность к дефициту железа и железодефицитной анемии отмечена у детей первых лет жизни, подростков и
женщин детородного возраста (Соболева М. К., 1990; Вуд М.,
БаннП.,2001).
По данным различных авторов, ЖДА в среднем страдает 510% населения планеты. Кроме того, латентный дефицит железа
выявляется у 12-15% и более обследованных, а среди женщин
репродуктивного возраста — у 50% (Шевченко Н. Г., 1997; Александрова В. А. и др.. 2002); в отдельных группах населения этот
показатель значительно выше. Так, в 1990-х гг. в Дагестане почти
90% рожениц имели признаки ЖДА. Среди детей от многоплодной беременности и детей с ростом, опережающим обычные нормы, ЖДА на первом году жизни выявляется более чем в 60% случаев (Соболева М. К., 1990). Латентный дефицит железа в нашей
стране может быть выявлен более чем у половины всех детей в
возрасте до 3 лет и примерно у 1/3-1/4 детей более старшего
возраста (Александрова В. А. и др., 2002; Малова Н. Е. и др.,
2002). Даже в экономически благополучных странах, несмотря на
развитую систему здравоохранения, железодефицитные состояния у детей в возрасте до 3 лет остаются серьезной проблемой
(Kazal L. А., 2002).
Классификация. Единой общей классификации ЖДА нет, но
обычно выделяют следующие варианты:
1) хроническая постгеморрагическая железодефицитная анемия (составляет основную часть ЖДА);
2) ювенильная анемия (связана с дисбалансом обмена железа
на фоне интенсивного роста и началом менструального периода у
девочек);
3) по степени тяжести (в зависимости от уровня гемоглобина) — тяжелая анемия (при уровне Hb менее 75 г/л), средняя (Hb
80-100 г/л) и умеренная (Hb 100-110 г/л);
4) по стадиям — прелатентный дефицит железа, стадия латентного дефицита железа и собственно ЖДА
Этиология. Основная причина развития ЖДА — дисбаланс между потребностями и поступлением железа в организм.
В организме взрослого человека содержится около 4 г железа,
из которых:
60-70%'находится в составе гема молекулы гемоглобина — гемоглобиновый (эритроцитарный) фонд;
20-25% — депо железа — резервный фонд в виде ферритина и
гемосидерина;
5-10% — в составе миоглобина;
25-1
Ч а с т ь 2. К л и н и ч е с к а я г е м а т о л о г и я
около 1% — в составе внутриклеточных ферментов (цитохромы,
каталаза и других) и неферментных железосодержащих биокатализаторов;
до 0,1% — в плазме крови.
Основное депо железа находится в печени, костном мозге, селезенке и мышцах. Потери железа происходят с желчью, потом — со
слущивающимся эпителием и менструальными кровопотерями.
В обычных условиях потребности организма в железе удовлетворяются преимущественно за счет внутренних запасов железа (поступление железа из разрушенных эритроцитов, из депо и пр.) и
поступлений с пищей. У здоровых лиц суточная потеря железа в
полной мере компенсируется пищевым железом, всасывающимся
в виде двухвалентного железа (гемовое железо или трансформированное из трехвалентного в желудке под действием соляной кислоты ) в двенадцатиперстной кишке и проксимальных отделах тощей
кишки.
Железо в форме гема, содержащееся в мясе, лучше всасывается,
чем негемовое железо, за счет специфических гемсвязывающих
участков в кишечнике. Из железа гема всасывается 20-30%, из
негемового железа (из молочных продуктов, яиц и всей растительной пищи) — около 5%, а степень всасывания железа из материнского молока составляет в среднем около 50%. Нормальному усвоению железа препятствует геликобактерная инфекция. Кроме того,
некоторые вещества, содержащиеся в растительной и молочной
пище, и таннины в чае и кофе препятствуют всасыванию железа.
Абсорбцию соединений железа также ухудшают фосфаты. Витамин С, лимонная и янтарная кислоты, сорбит, метионин, цистеин,
микроэлементы (медь), напротив, противодействуют этим ингибиторным эффектам (Идельсон Л. И., 1987; Циммерман Я. С, Бабушкина Г. Д., 1997; Вуд М„ Бани П., 2001; Крылов А. А., 2002).
Всосавшееся железо в соединении с транспортным белком трансферрином переносится к органам и тканям, где оно поглощается
эритроидными клетками костного мозга и захватывается тканевыми макрофагами, откладывается внутриклеточно в виде ферритина и, частично, гемосидерина и расходуется но мере необходимости. В итоге около 80% сывороточного пула железа расходуется на
синтез гемоглобина, начинающийся уже на стадии эритробластов.
После высвобождения и депонирования железа трансферрин связывается со специфическим трансферриновым рецептором (TfR)
на клеточной мембране. Часть трансферриновых рецепторов находится в сыворотке крови и может быть определена соответствующими методами. При низком внутриклеточном уровне железа син-
Глава 12. Анемии
255
тез TfR усиливается, а синтез ферритина, напротив, подавляется
(Шевченко Н. Г.. 1997; Шиффман Ф. Д., 2000; Kongo Y. et al,
2002).
При повышенном расходе железа в организме (хронические
кровопотери, интенсивный рост) и при нарушенном поступлении
(в результате несбалансированного питания и (или) нарушенного
всасывании), особенно при сочетании этих факторов, создаются
условия для развития ЖДА. Причиной повышенных трат железа
чаще всего являются хронические кровопотери (меноррагии, кровопотери из ЖКТ при геморрое, язвенной болезни, опухолях, дивертикулезе и другие; гематурия различного генеза и гемоглобинурия). Наиболее частыми являются кровопотери из желудочнокишечного тракта (ЖКТ) у мужчин и женщин в менопаузе или у
женщин при менструациях в пременопаузальном периоде. Такие
малые хронические кровопотери, как 1-2 мл, в конце концов приводят к дефициту железа из-за его невысокого поступления при
большинстве диет (Идельсон Л. И., 1987; Вуд М., Банн П., 2001).
К повышенной потребности в железе ведут быстрый рост в детском и подростковом возрасте и интенсивные физические нагрузки, а также беременность, при которой для поддержания баланса
дополнительная потребность в железе составляет 0,7-0,9 г и более,
роды и лактация. Потери менструирующих женщин эквивалентны
дополнительным 0,5-1 мг/день, а беременным женщинам требуется 4 -6 мг/день железа для самой матери и плода и для возмещения
потери крови при родах (Идельсон Л. И.. 1987; Шиффман Ф. Д.,
2000 и др.).
Активное донорство или частое взятие крови из вены у длительно болеющих и многократно обследующихся пациентов может быть причиной дефицита железа.
Пациенты с почечной патологией и хронической почечной недостаточностью, в программу терапии которых входит гемодиализ, предрасположены к дефициту железа, так как потеря крови в
процессе диализа и наклонность к повышенной кровоточивости
сопутствуют уремии. К потере железа с мочой приводит также
внутрисосудистый гемолиз, обусловленный протезами сердечных
клапанов или пароксизмальной ночной гемоглобинурией, что может определяться по наличию в ней гемосидерина.
Возможно появление ЖДА у больных с анемиями, связанными
с. нарушением образования эритропоэтина (при почечной, эндокринной и других патологиях) в период лечения его препаратами.
Это связано с тем, что увеличение гематокрита в ходе терапии
требует массивного поступления железа из пула хранения к эри-
256
Часть 2. Клиническая гематология
троидным предшественникам. Если пул хранения истощен, это приведет к дефициту железа и задержке восстановления гемопоэза.
Предрасполагающими к развитию ЖДА факторами, связанными с нарушением всасывания железа, могут быть хронические энтеропатии, резекции участка тонкой кишки и желудка, целиакия.
Формированию ЖДА способствует неполноценное питание с преобладанием мучных и молочных продуктов, а также имеет определенное значение и сниженное содержание микроэлементов (меди,
марганца, кобальта) в воде и пище. Существуют данные, что гипоэлементозы часто сочетаются со скрытым дефицитом железа.
К группам риска развития ЖДА относятся:
а) люди с хроническими кровопотерями, в том числе женщины
с гиперменореей (менструациями продолжительностью свыше
5 дней, особенно при появлении первых менструаций до 15 лет);
б) доноры (отмечается прямая зависимость от числа кроводач);
в) женщины с повторными беременностями (4 и более), родами
(3 и более), длительной лактацией (свыше года);
г) дети от матерей с анемией, из многодетных семей и недоношенные;
д) люди, длительно находящиеся на молочно-растительной диете;
е) люди с высоким ростом, большой массой тела.
Повышен риск развития дефицита железа у детей, живущих в
неблагоприятных социально-экономических условиях, вскармливавшихся коровьим молоком в первые 6 месяцев без дополнительного назначения препаратов железа или с низким весом при рождении (Соболева М. К.,1990; Вуд \1„ Банн П., 2001).
В то же время данные молекулярно-генетических исследований
последних лет показали возможное участие генетических механизмов в предрасположенности к развитию к ЖДА. Так, отмечено
достоверное повышение частоты встречаемости мутантной формы
гена цитохрома Р-4501А1 у больных ЖДА, на основании чего выдвинуто предположение о возможности определения молекулярногенетических маркеров повышенного риска ЖДА (Сафаунова Г. Ш.,
2002). Имеются данные о зависимости частоты выявления ЖДА
у женщин молодого возраста от полиморфизма гена GPIa-807 С/Т
(Carlsson L. E. et al., 2002).
Патогенез. Развитие дефицита железа в организме закономерно проходит несколько стадий: прелатентный дефицит железа, стадию латентного дефицита железа и собственно ЖДА. При этом в
первую очередь снижается количество железа, депонированного в
органах и тканях, затем уменьшается количество транспортного
Глава 12. Анемии
257
железа, несколько позже — железа гемсодержащих ферментов и
затем железа, необходимого для синтеза гемоглобина. Таким образом, анемии предшествует длительный период истощения депо
железа и латентного дефицита железа без клинических проявлений.
Поскольку железо является структурным компонентом гемоглобина и миоглобина, а также ряда ферментов, кофактором ряда
энзимных процессов, включая синтез коллагена, при развитии железодефицитного состояния в организме происходят соответствующие изменения. Нарушение синтеза гемоглобина приводит к развитию гипохромной анемии, миоглобина — к миастении. А следствием снижения активности железосодержащих ферментов
является изменение клеточного метаболизма и дистрофические
изменения органов и тканей с превалированием процессов катаболизма коллагена. С последними из указанных изменений в настоящее время связывают формирование и прогрессирование атрофических процессов в слизистой желудка, усугубляющих дисбаланс
в потребности и поступлении железа, в то время как ранее атрофичеекпй гастрит рассматривался как один из основных этиологических факторов (Дворецкий Л. И., 1999).
Дефицит железа приводит к нарушению функции иммунокомпетентных клеток и к снижению иммунологической резистентноети. При этом уменьшается содержание Т-лимфоцитов и снижается
реакция блаеттрансформации лимфоцитов в ответ на митогены, а
также нарушаются процессы перекисного окисления липидов
(Циммерман Я. С, Бабушкина Г. Д., 1997; Александрова В. А. и др.,
2002).
Страдает и центральная нервная система (ЦНС), поскольку в
условиях дефицита железа не только имеет место гипоксия за счет
анемии, но и снижается катаболизм катехоламинов с повышением
их концентрации в тканях ЦНС.
Клиническая картина. Поскольку анемия развивается медленно, то у многих больных она бессимптомна. Клиническая картина
заболевания складывается из неспецифических проявлений общеанемического синдрома (слабость, вялость, бледность кожных покровов, тахикардия и одышка при физической нагрузке и т. д.) и
проявлений тканевого дефицита железа — так называемого сидеропенического синдрома. Последний включает в себя следующие
симптомы:
а) изменения ногтей (слоение, исчерченность, ломкость, «корявость» и «койлонихии» — ногти ложкообразной формы);
б) затруднение глотания сухой пищи;
9 Гематология. Нов. справочник
258
Часть 2. Клиническая гематология
в)извращение обоняния;
г) извращение вкуса (pica chlorotica);
д) сглаженность сосочков языка;
е) «заеды» в углах рта (ангулярный стоматит).
Последние три симптома наиболее показательны для ЖДА, и
выраженность их зависит от уровня гемоглобина (Дворецкий Л. И.,
1999). Кроме того, обычно отмечаются сухость кожи, повышенная
ломкость ногтей и волос. У некоторых больных заметно проявление ангулярного стоматита в виде трещинок в уголках рта, глоссита, сопровождающегося жжением языка. Дефицит железа способствует разрушению эмали зубов и множественному кариесу.
У детей может наблюдаться задержка физического и умственного развития, снижение памяти, быстрая утомляемость и, как следствие, снижение способности к обучению.
Больные часто жалуются на выраженную общую слабость, не
соответствующую степени анемии, и мышечную слабость, что
объясняется нарушением синтеза миоглобина. Синдром мышечной гипотонии выявляется почти у 80% детей с ЖДА (Малова Н. Е.
и др., 2002). С миастенией и слабостью сфинктеров может быть
связано иногда наблюдающееся у девочек и женщин недержание
.мочи при кашле или смехе. Слабостью глоточных мышц и дистрофическими изменениями слизистой оболочки обусловлена сидеропеническая дисфагия с затруднением глотания сухой и твердой
пищи. При осмотре пациентов с ЖДА нередко обращает на себя
внимание алебастровый или зеленоватый оттенок кожных покровов, в связи с чем одно из первых названий ЖДА — «хлороз», а
также голубоватый оттенок склер («симптом голубых склер»), как
отражение дистрофических изменений роговицы с нарушением
гидроксилирования пролина и лизина в условиях дефицита железа (Кассирский И. А., Алексеев Г. А., 1962; Идельсон Л. И., 1987;
Александрова В. А. и др., 2002).
Извращение аппетита проявляется в желании есть крахмал (амилофагия), лед (пагофагия), известку, землю и глину (геофагия),
сырое тесто и т. д. Может появляться пристрастие к неприятным
запахам: бензина, лака, ацетона, нафталина и др.
Следует отметить, что проявления тканевого дефицита железа
обычно значительно опережают развитие анемии.
Имеющаяся у больного ЖДА отягощает течение ряда заболеваний и, в первую очередь, сердечно-сосудистых, причем нередко
имеет место кардиоанемический синдром с развитием миокардиодистрофии. Угнетение иммунного статуса приводит к повышению
заболеваемости различными инфекциями, включая респираторно-
Глава 12. Анемии
259
вирусные и кишечные, а также формированию очагов хронической
инфекции. В фертильном периоде железодефицитные состояния
отягощают течение беременности и родов, увеличивают частоту
преждевременных родов, ведут к повышению частоты послеродовых осложнений, оказывают влияние на здоровье детей. По некоторым данным, новорожденные дети у матерей с ЖДА имеют меньшую массу тела (Крылов А. А., 2002). Наличие ЖДА приводит к
нарушению физического и интеллектуального развития детей и
подростков, способствует формированию иммунодефицита и эндокринных нарушений. Так, у девушек-подростков повышается
частота патологии щитовидной железы, нарушений менструального цикла. У детей ЖДА может сопровождаться проявлениями
периферической нейропатии, патогенез которой не вполне ясен
(KabakusN.etal.,2002).
Диагностика. Диагноз основывается на характерных жалобах и
клинической картине заболевания с выявлением признаков сидеропенического синдрома-и лабораторных показателях.
Для ЖДА характерно наличие гипохромной микроцитарной
анемии. Цветовой и другие показатели насыщения эритроцитов
гемоглобином (среднее содержание гемоглобина в эритроците —
МСН — норма 80-94 фл; средняя концентрация гемоглобина в
эритроците — МСНС — норма 27-31 пг) снижены. При глубокой
анемии отмечается выраженный анизоцитоз и пойкилоцитоз эритроцитов, могут появляться единичные мишеневидные клетки. Количество ретикулоцитов обычно в норме, так как регенераторная
способность эритроидного ростка костного мозга сохранена. Транзиторный ретикулоцитоз может наблюдаться при выраженной кровопотере или приеме препаратов железа незадолго до проведения
анализов.
При оценке мазка крови обращает на себя внимание бледность
эритроцитов, встречаются эритроциты в виде колец с широким
просветлением в центре (анулоциты). При специальной окраске
на гранулы железа отмечается снижение числа железосодержащих
эритроцитов — сидероцитов. Важную информацию может дать
оценка эритроцитарных параметров. При ЖДА уменьшены средний диаметр и средний объем эритроцитов. Средний корпускулярный объем - MCV (как и среднее содержание гемоглобина в эритроците — МСН) имеет отношение к среднему (или общему) объему эритроцитов и должен интерпретироваться с учетом показателя
распределения эритроцитов по степени анизоцитоза (разброс размеров эритроцитов относительно среднего значения — RDW), являющимся отражением гомогенности популяции красных клеток
260
Часть 2. Клиническая гематология
крови по размеру. В норме среднее значение RDW составляет около 14-15%. При дефиците железа этот показатель повышен, а в
мазках крови отмечается анизоцитоз эритроцитов. У отдельных
больных возможна умеренная лейкопения и может отмечаться
тромбоцитопения (чаще у детей) или тромбоцитоз (по некоторым данным, у 30% детей и более чем у половины взрослых пациентов), особенно на фоне кровопотерь (Идельсон Л. И., 1987;
Кузнецова Ю. В. и др., 2000; Гусева С. А. и др., 2001; Вуд М,
Бани П., 2001).
В костном мозге у больных ЖДА, как правило, отмечаются
эритроидная гиперплазия (компенсаторное усиление эритропоэза) и пониженное количество железосодержащих клеток: сидероцитов и сидеробластов (нормальное содержание последних составляет 10-20%). Именно специфическая окраска препаратов костного мозга на содержание железа может быть прямым достоверным
показателем железодефицитного состояния. Однако из-за сложности и высокой стоимости исследования обычно ограничиваются
более доступными непрямыми показателями.
Для достоверной диагностики ЖДА необходимо исследование
показателей обмена железа и оценка депо железа. В качестве показателей транспортного фонда железа определяются содержание железа в сыворотке крови (сывороточное железо), общая железосвязывающая способность крови (ОЖСС) и латентная железосвязывающая способность (ЛЖСС). При типичной ЖДА уровень
сывороточного железа (в норме в пределах 9-30 мкмоль/л) и насыщение трансферрина снижены. ОЖСС, показывающая, какое
количество железа может связаться белками в 1 л сыворотки (нормальные колебания 45-60 мкмоль/л) и отражающая степень «нехватки» железа в сыворотке, увеличена. ЛЖСС определяется как
разность между показателем ОЖСС и сывороточным железом и в
случаях ЖДА бывает значительно повышена по сравнению с нормой, составляющей 30-75 мкмоль/л. О концентрации трансферрина в сыворотке судят чаще по показателю ОЖСС, так как методы достоверного определения самого трансферрина (метод радиальной иммунодиффузии, лазерной нефелометрии) более сложны.
Соотношение железа сыворотки и ОЖСС (в %) является показателем насыщения трансферрина железом (в норме 16-50%). Однако указанные показатели не всегда достаточно чувствительны. Они
могут быть нормальными даже тогда, когда предполагается истощение запасов железа, что определяется по уровню сывороточного
ферритина (15-150 мкг/л). В то же время уровень железа сыворотки и ЖСС могут снижаться не только при гипосидерозе, но и при
Глава 12. Анемии
261
различных инфекционных и воспалительных процессах, онкопатологии и заболеваниях печени. Недостоверными будут и анализы, произведенные в ближайшие дни после окончания приема железосодержащих препаратов.
Для ЖД А характерным является достоверное повышение уровня растворимых трансферриновых рецепторов в сыворотке крови
(s-TfR). Трансферриновые рецепторы представлены на эритроидных предшественниках и попадают в сыворотку в повышенных
количествах при неадекватном поступлении железа. Однако, поскольку уровень s-TfR бывает повышенным также при ряде опухолевых заболеваний, диагноз ЖДА не может основываться только
на нем (Вуд М., Банн П., 2001; Bierner J. et. al., 2002).
Для оценки запасов железа обычно используют непрямые методы: определение коэффициента насыщения трансферрина (Кнас)
и содержания ферритина в плазме крови. Кнас (в %) является
расчетным показателем, определяемым по соотношению содержания железа в плазме и концентрации трансферрина. В норме он
составляет около 20-30%, при ЖДА снижается. Причем в случаях
снижения уровня сывороточного железа и ЖСС, не связанных с
дефицитом железа, соотношение остается в пределах 20% и выше,
что имеет дифференциально-диагностическое значение.
Уровень ферритина — важный показатель запасов железа, поскольку именно ферритин является основной формой депонирования железа и синтезируется в печени в соответствии с содержанием железа в организме, причем его определенная доля находится
в плазме. При отсутствии других патологических факторов концентрация данного белка в сыворотке крови прямо коррелирует с
количеством депонированного в организме железа. Уровень ферритина определяется в сыворотке радиоиммунологическим или
иммуноферментным методом. Низкий сывороточный ферритин
при нормальном гемоглобине указывает на истощение запасов.
Считается, что о дефиците железа говорит концентрация ферритина менее 12 нг/мл. Если имеется анемия при нормальном или увеличенном уровне ферритина, следует начать поиск других причин
ее возникновения. Однако этот показатель не является абсолютно
достоверным и специфичным, так как уровень ферритина может
снижаться также при наличии гипотиреоза и дефиците витамина
С и, напротив, повышен при заболеваниях печени, инфекционновоспалительных процессах, злокачественных новообразованиях и
других состояниях, при которых ферритин выступает как острофазовый белок (Шевченко Н. Г., 1997; Шиффман Ф. Д., 2000;
Frewin R., 1997).
262
Часть 2. Клиническая гематология
Кроме того, запасы железа могут быть оценены с помощью десфералового теста путем определения содержания железа в моче
после введения больному комплексом десферрамина (десферала). При ЖДА содержание железа в моче снижено.
В «стандартный набор» минимальных необходимых исследований для диагностики, как правило, входят клинические анализы
крови, определение сывороточного железа и уровня ферритина.
Из ранних же скрининговых тестов, позволяющих распознать железодефицитное состояние еще до развития анемии, предлагается
определение эритроцитарного протопорфирина IX и контроль индекса анизоцитоза — RDW (Идельсон Л. И., 1987; Шевченко Н. Г.,
1997; Hagar W. et al., 2002; Kazal L. A., 2002).
Определенным этапам развития дефицита железа в организме
соответствуют следующие лабораторные показатели (Александрова В. А. и др., 2002).
1. Прелатентный дефицит железа — снижение уровня сывороточного ферритина ниже 12 мкг/л (при определении радиоиммунным методом); в десфераловом тесте уменьшение выделения железа с мочой менее 0,4-0,2 мг; уменьшение количества сидеробластов
в стернальном пунктате до 15% и менее.
2. Латентный дефицит железа (с появлением клинических признаков сидеропении) — сывороточное железо менее 14 мкмоль/л;
ОЖСС и ЛЖСС превышают нормальные показатели; снижение
коэффициента насыщения трансферрина.
3. Железодефицитная анемия — появление гипохромной анемии.
Важным моментом на этапе диагностики является установление причин ЖДА, активное выявление источников скрытой кровопотери. Для этого используется широкий арсенал методов исследования. Важное место, в частности, принадлежит, эндоскопическим методам. Так, по данным отдельных авторов, при проведении
эндоскопических исследований у пациентов с клинико-гематологическими признаками ЖДА серьезные заболевания желудочнокишечного тракта выявляются более чем в 60% случаев (Ioannou G. N. et al., 2002). У большинства больных источник кровопотери располагается в верхних отделах ЖКТ (часто это язвенная
болезнь), а у 20-30% имеется такой источник кровопотери, как
полип, опухоль или ангиодисплазия. У больных в возрасте 50 лет и
старше должна рассматриваться возможность колоноскошш, даже
если обнаружен источник кровопотери в верхних отделах ЖКТ.
так как возможно сочетание кровотечения из верхних и нижних
отделов. Могут возникать сложности при кровопотерях в закры-
Глава 12. Анемии
263
тые полости (гломические опухоли и др.). и в таких случаях в
диагностике помогает компьютерная томография. Для уточнения
источника кровопотери и ее объема могут быть применены радиологические методы с мечеными эритроцитами, при подозрении на
легочное кровотечение — исследования мокроты и промывных вод
бронхов для выявления макрофагов, содержащих гемосидерин.
Дифференциальная диагностика. Известно, что всякая железодефицитная анемия пшохромная, но не всякая шпохромная анемия — железодефицитная. Поэтому дифференциальный диагноз в
первую очередь проводят с другими гипохромными анемиями, к
которым, в частности, относятся сидероахрестические («железоненасыщенные» ) анемии (с нарушением синтеза гема в результате
угнетения активности ферментов, включающие железо в состав
гема), В эту группу входят наследственные сидероахрестические и
приобретенные (медикаментозные) анемии, а также анемия при
свинцовой интоксикации. Данная группа анемий принципиально
отличается от ЖДА тем. что при них в организме имеется не недостаток, а избыток железа, который можно определить соответствующими тестами. При просмотре мазка крови в случае свинцового
отравления базофильная пунктация в эрнтроцитах выглядит более грубой, тогда как при ЖДА отмечается более нежная зернистость. В этом случае скрининговым тестом может служить и определение свободного эритроцитарного протопорфирина (норма 2,79,0 мкмоль/л), уровень которого обычно повышен при ЖДА и,
напротив, при свинцовой интоксикации — с нарушенным порфириновым обменом. (Идельсон Л. И., 1987: Гусева С. А. и др., 2001:
ВудМ.. Бани П., 2001).
К гипохромным анемиям относится талассемия — наследственная гемолитическая анемия с нарушением синтеза гемоглобина.
В дифференциальной диагностике при талассемии имеют значение семейный анамнез, наличие признаков гемолиза и определение фракций гемоглобина. Кроме того, в случаях выявления микроцитоза при анемии умеренной степени тяжести очень важно
определить показатель RDW - повышенного при ЖДА и нормального при талассемии, где имеется более гомогенная популяция эритроцитов.
Может возникнуть необходимость в дифференциальной диагностике с так называемой анемией хронических заболеваний
(АХЗ) — железоперераспределителыюй анемией со сложным патогенетическим механизмом, при которой, так же как при ЖДА,
гипохромная анемия сочетается с невысоким уровенем ретикулоцитов. При АХЗ. так же как и при других вышеуказанных состоя-
264
Часть 2. Клиническая гематология
ниях (талассемии, сидеробластной анемии), сывороточный ферритин в норме или повышен. Однако если уровень сывороточного
ферритина на нижней границе нормы, может быть сложно отличить анемию при хронических заболеваниях от дефицита железа.
Более того, у некоторых больных сочетаются эти два состояния.
Ранним дифференциально-диагностическим критерием в отношении ЖДА и АХЗ считается показатель соотношения концентрации растворимых трансфсрриновых рецепторов сыворотки и уровня ферритина (Kongo Y. et al., 2002). Уровень рецепторов сывороточного трансферрина нормален в случаях анемии при хронических
заболеваниях. Одновременное определение уровня TfR сыворотки
и ферритина обеспечивает очень высокую чувствительность и специфичность при выявлении истощения запасов железа и в перспективе может заменить такие общепринятые в настоящее время
показатели обмена железа, как определяемые отдельно сывороточное железо, трансферрин и ферритин (Вуд М, Багга П., 2001).
Нельзя также забывать о вероятности полидефицитных анемий, особенно у лиц старшего и пожилого возраста, нередко зависящих от ряда географических и социально-демографических факторов. Высока вероятность сочетанного характера анемии при заболеваниях или резекции тонкой кишки (Шевченко Н. Г.. 1997;
Крылов А. А., 2002). Нормальный MCV при высоком RDW указывает па возможность смешанной этиологии анемии, в частности,
сочетание железо- и В1?-фолиеводефицита (Кузнецова Ю. В. и др.,
2000; Вуд М., Банн П.. 2001).
Лечение. В первую очередь, лечение ЖДА должно быть направлено на устранение причины заболевания, лечение «фоновых»
болезней. Одновременно проводят коррекцию дефицита железа
соответствующими медикаментозными препаратами.
Диета с повышенным содержанием пищевого железа и аскорбиновой кислоты и ограничением продуктов, снижающих его усвоение (молочные продукты), имеет значение только в проведении
профилактических мероприятий и при латентном дефиците железа. В случае уже развившейся ЖДА, что отражает истощение депо
железа, полноценная коррекция дефицита железа пищей практически невозможна.
Основные принципы медикаментозной терапии ЖДА;
1) выбор наиболее эффективного препарата;
2) выбор максимальной индивидуально переносимой дозы;
3) расчет необходимой курсовой дозы.
Так как полноценная коррекция дефицита железа в организме
больных ЖДА требует длительного (в течение нескольких меся-
Глава 12. Анемии
265
цев) активного лечения, то применяемые лекарственные препараты должны быть достаточно эффективны, удобны в применении и
иметь минимум побочных эффектов.
В настоящее время имеется большой выбор средств пероральной терапии. Современные железосодержащие препараты, использующиеся в лечении ЖДА, делятся на две группы: препараты на
основе солей железа и гидроксид-полимальтозного комплекса.
Многие годы основными в терапии железодефицитных состояний были ионные железосодержащие полисахаридные препараты,
а также монокомпонентные и комбинированные соединения солей
железа, которые успешно и широко используются и в настоящее
время. Всасывание железа из данных препаратов происходит преимущественно в двухвалентной форме посредством механизма пассивной диффузии, соответственно суточная и курсовая доза, а также эффективность отдельных средств этой группы определяется
содержанием Fe2* («элементарного железа») с учетом того, что в
конечном итоге всасывается лишь 10-15% поступающего в организм железа (Захарова И. Н. и др., 2003). Спектр железосодержащих препаратов для перорального применения достаточно широк,
однако не все они достаточно эффективны, может отмечаться плохая переносимость отдельных лекарственных форм. Как правило,
применяют лекарственные формы, содержащие двухвалентное железо в виде солей: сульфата (ферроградумет, тардиферон, сорбифер, актиферрин), глюконата (тотема), фумарата (ви-фер) и др.
Степень дефицита железа в организме и, соответственно, общей
дозы железосодержащих препаратов, необходимых для коррекции
анемии и восполнения запасов железа, можно рассчитать по следующей формуле:
Железо (вмг) = (НЬ в норме - НЬ больного) х
х масса тела (в кг)х2,21 + 1000.
В настоящее время расчет курсовой дозы для перорального приема не считается обязательным, и препараты обычно назначаются
в стандартных терапевтических дозах. Эффективная суточная доза
элементарного железа должна быть такой, чтобы всосавшаяся
часть обеспечивала суточную потребность и оптимальный среднесуточный рост гемоглобина. Для взрослых такая доза составляет
4-5 мг/кг массы тела или 100-400 мг Fe2^. В пределах этого диапазона суточная доза для каждого конкретного пациента определяется индивидуальной переносимостью. Средняя эффективная суточная доза двухвалентного железа для детей - до 6 мг/кг (Pediatrics
at a Glance, 1998; Вуд М., Банн П., 2001; Крылов А. А., 2002). Для
266
Часть 2. Клиническая гематология
лучшего усвоения пероральные препараты солей железа назначаются за час до приема пищи или не ранее чем через 2 часа посте
него, поскольку в просвете кишечника солевые препараты взаимодействуют с компонентами пищи и другими лекарственными препаратами.
Побочные эффекты при использовании препаратов солей железа обычно проявляются в виде тяжести и болей в эпигастрии, тошноты, расстройства стула и бывают связаны с количеством элементарного (двухвалентного) железа, содержащегося в данном средстве. Также могут появиться металлический привкус во рту,
головокружение, аллергические реакции, потемнеть зубная эмаль
и десна. Следует учитывать и возможность передозировки железосодержащих препаратов, а также риск развития гемосидероза.
У некоторых больных выраженность дисфункции ЖКТ служит
причиной отмены препарата или отказа больных от лечения. Если
эти симптомы появились, дозу рекомендуется уменьшить до 12 таблеток в день и принимать препарат во время еды. При плохой
переносимости препаратов железа возможно применение лекарств
(покрытых оболочкой) пролонгированного действия (сорбифердурулес) для одно-двухкратного приема в сутки. Однако такие
препараты всасываются хуже.
Большинство предлагаемых средств комплексные — с дополнительным содержанием фолиевой кислоты, комплекса витаминов и
микроэлементов в целях повышения эффективности терапии. Так,
аскорбиновая кислота, входящая в состав многих комбинированных препаратов (ферроплекс, тардиферон), обладает восстанавливающими свойствами и переводит двухвалентное железо в трехвалентное, повышая его резорбцию. Ряд препаратов, наряду с солями
железа, также включает фолиевую кислоту. Применение таких
средств, в частности, у беременных целесообразно для профилактики и лечения сочетапного дефицита железа и фолиевОй кислоты.
В последние годы наряду с солями железа в лечении ЖДА активно стали использовать неионпые препараты трехвалентного
железа в виде гидроксидполимальтозного комплекса (феррум-лек),
максимально приближенного к структуре естественных соединений железа с ферритином. При использовании средств этой группы всасывание железа является активным процессом, причем эффективность препаратов сопоставима с солями железа, но частота
развития побочных эффектов достоверно снижается и практически отсутствует опасность передозировки. Прием пищи не уменьшает абсорбцию железа из полимальтозного комплекса. Кроме того,
неионная структура комплекса делает его более стабильным и пред-
Глава 12. Анемии
26/
отвращает свободную диффузию ионов железа в организме и образование свободных радикалов (Александрова В. А. и др.. 2002; Захарова И. Н. и др., 2003).
Существуют специальные, как правило, жидкие лекарственные
формы препаратов железа для детей: сироп феррум-лек, сироп актиферрин (сульфат железа в комплексе с D-, L-серином, уменьшающим риск развития побочных реакций). Причем сиропы можно
смешивать с фруктовыми и овощными соками и искусственными
питательными смесями (Казакова Л. М., 1998).
Парентеральные препараты показаны только при невозможности использования энтеральных препаратов железа из-за мальабсорбции, тяжелой непереносимости пероральных форм и при декомненсированном дисбактериозе. Существенных преимуществ в
темпах прироста гемоглобина препараты для парентерального применения не имеют и могут вызывать серьезные побочные эффекты, такие как анафилаксия, лихорадка, гипотензия, крапивница
или боли в грудной клетке, животе или спине, наблюдающиеся
примерно в 10% случаев. В связи с этим при использовании парентеральных препаратов внутривенно рекомендуется вводить
пробную дозу в виде инфузии длительностью 4-6 часов (Вуд М.,
Банн П., 2001; Александрова В. А. и др., 2002). При парентеральном введении расчет числа ампул для введения необходимой суточной дозы железа проводят по соответствующим формулам.
1. Расчет дозы феррум-лек:
Количество ампул = масса тела больного х
х(100-0,6 х уровень гемоглобина в г/л).
2. Расчет общей дозы парентеральных препаратов (в мл) для
детей:
Общая доза (в мл) = масса ребенка в кг х
х (78-0,25 х уровень гемоглобина в г/л)/
содержание железа в 1 мл препарата.
Число инъекций на курс терапии и длительность лечения определяют с учетом суточных доз элементарного железа в разных возрастных группах: детям первого года жизни — до 25 мг/сут, от 1 до
3 лет — 24-40 мг/сут и старше 3 лет — 40-50 мг/сут (РЛС —
Энциклопедия лекарств, 2000; Александрова В. А. и др., 2002).
В терапии ЖДА выделяют два этапа: этап нормализации уровня гемоглобина (занимает в среднем 1,5-2 месяца) и этап восстановления резервных фондов железа. Так что в целом продолжи-
268
Часть 2. Клиническая гематология
телыюсть лечения ЖДА составляет 4-6 месяцев. При этом на первом этапе даются максимальные дозы железосодержащих препаратов, на втором — переходят на поддерживающие дозы. Суточная
доза железосодержащих препаратов при достижении уровня гемоглобина НО г/л может быть снижена, и дальнейшая терапия
продолжается умеренными дозами.
Обычно первый положительный симптом в ходе терапии у больных ЖДА — уменьшение мышечной слабости. Повышение гемоглобина может быть постепенным или скачкообразным и чаще
бывает заметно на 3-4-й неделе терапии. Начиная с 3-4-го дня у
большинства больных наблюдается повышение уровня ретикулоцитов, достигая максимума к 10-12-му дню, хотя значительный
ретикулоцитоз отмечается редко. При оценке результатов лечения
в первую очередь обращают внимание на такие показатели, как
достижение нормального уровня гемоглобина, а в ходе терапии —
на прирост гемоглобина более 1 г/л в сутки. Оценку состояния
тканевого и резервного фонда целесообразно проводить, ориентируясь на уровень ферритина в сыворотке крови: повышение концентрации сывороточного ферритина более 50 нг/мл является показателем адекватности проведенной терапии (Шиффман Ф. Д.,
2000; Вуд М, Банн П., 2001; Крылов А. А., 2002; Захарова И Н. и
др., 2003).
Больным с комбинированным дефицитом наряду с препаратами железа одновременно проводится терапия витамином В,., и (или)
фолиевой кислотой. Причем беременным женщинам с ЖДА рекомендуется дополнительно назначать фолаты, независимо от сывороточного уровня последних, поскольку, как показали рандомизированные исследования, эффективность такого лечения для беременных значительно выше (Juares-Vazquez J. et al., 2002).
Прогноз благоприятный. Терапия может быть неэффективна
при:
а) продолжающихся потерях железа в организме, когда кровопотеря превышает способность к повышенному всасыванию железа при дополнительном назначении железосодержащего препарата;
б) повышенном потреблении продуктов, снижающих всасывание железа;
в) наличии воспалительных и злокачественных заболеваний или
неверно установленном диагнозе ЖДА (Соболева М. К., 1990;
Frewin R., 1997).
Таким образом, при правильной диагностике и адекватной терапии заболевание полностью излечимо.
Глава 12. Анемии
269
Профилактика. Первичная профилактика ЖДА заключается
в выявлении лиц из группы риска с латентным дефицитом железа и проведении соответствующих профилактических мероприятий: диета с повышенным содержанием железа и прием препаратов
железа.
Важность проведения профилактических мероприятий и соответствующей терапии уже на стадии латентного дефицита железа
обусловлена как широкой распространенностью заболевания, так
и социальной значимостью проблемы, поскольку железодефицитные состояния приводят к снижению работоспособности и ухудшению качества жизни у взрослых, развитию осложнений во время беременности и родов у женщин, задержке развития и роста,
снижению интеллекта и нарушению поведения у детей и подростков.
Должно быть оценено поступление железа с пищей, и если оно
неадекватно, следует пересмотреть рацион или обеспечить профилактический прием железосодержащих препаратов. Особенное значение в рационе имеют продукты, являющиеся источниками оптимально всасывающегося гемового железа. Предпочтительны нежирные сорта говядины и свинины и телятина. Наряду с этим
рекомендуется употреблять фрукты и соки, содержащие ряд витаминов и кислот (аскорбиновой,глутаминовой,янтарной и др.) и
улучшающие усвоение организмом железа. Также необходимыми
источниками микроэлементов для профилактики железодефицитных состояний могут служить морепродукты (Соболева М. К.,
1990).
В целях активного выявления ЖДА гемоглобин или гематокрит должны контролироваться в следующие периоды: младенчество (возраст между 6 и 9 месяцами), поздний детский возраст
(между 5 и 12 годами), подростковый и юношеский возраст (между 14 и 20 годами). В ряде стран Европы и в США разработаны
программы по профилактике ЖДА, в частности, для детей первых
лет жизни, предусматривающие ряд профилактических мероприятий в зависимости от возраста ребенка, особенностей вскармливания (грудное, смешанное, искусственное), данных скрининговых
тестов и наличия группы риска (Kazal L. А., 2002).
Профилактику ЖДА у детей следует начинать еще в антенатальном периоде. Всем беременным женщинам, особенно во второй половине беременности, показана поддерживающая терапия
препаратами железа. Считается, что адекватное поступление данного элемента на протяжении беременности обеспечивается 30 мг
элементарного железа (150 мг сульфата железа или 250 мг глюко-
270
Часть 2. Клиническая гематология
пата). В постнатальном периоде детям от многоплодной беременности, а также с большой массой тела при рождении рекомендуется в возрасте 3-6 месяцев проводить профилактичесие курсы железосодержащих препаратов в дозе 2-3 мг/кг элементарного железа в сутки (Вуд М., Банн П., 2001: Александрова В. А. и др., 2002).
Причем для недоношенных детей с целью полного восполнения
запасов железа в организме рекомендуемая длительность профилактической терапии может доходить до 2 лет (Захарова И. Н. и
др., 2003).
Для профилактики рецидивов ЖДА необходимо устранение,
по возможности, этиологических факторов, полноценное, достаточно продолжительное для восполнения запасов железа в организме лечение железосодержащими препаратами, диспансерное
наблюдение за пациентами. При невозможности полного устранения причины ЖДА проводят профилактические курсы препаратов железа: дозы солей железа составляют 30-60 мг элементарного
железа в сутки.
Анемия хронических заболеваний
Анемией при хронических заболеваниях (анемия хронических
заболеваний — АХЗ) или хронического воспаления (АХВ) называют малокровие, сопровождающее хронические инфекции, воспалительные заболевания и неопластические процессы, для которых
характерно снижение продукции эритроцитов в костном мозге при
адекватных запасах железа в депо.
Распространенность. АХЗ по распространенности занимает
второе место после ЖДА среди всех форм анемий (Луговская С. А..
1997). В группе лиц пожилого возраста доля АХЗ достигает 3050% (Дворецкий Л. И., 1999).
Имеются данные о том, что среди больных системными заболеваниями соединительной ткани анемия встречается почти у половины пациентов, причем преобладает АХВ (Мазуров В. И., 2001).
При хронических заболеваниях почек анемия с уровнем гемоглобина менее 100 г/л регистрируется более чем у 25% больных
(Kammerer J. et al., 2002).
Этиопатогенез. При данной патологии нарушается использование железа организмом с пониженным выходом железа из макрофагов. Характерными изменениями при этом заболевании является наличие железа в ретикулоэндотелиальной системе костного
мозга (РЭС), но не в эритроидных предшественниках. Обычно
ЛХЗ встречается при активном ревматоидном артрите, остеомие-
Глава 12. Анемии
271
лите, туберкулезе легких, подостром бактериальном эндокардите,
хронических почечных инфекциях, опухолевых заболеваниях и лр.
Однако часто определить причину анемии, длительное время не
удается.
Анемия хронических заболеваний относится к анемиям со смешанным патогенезом, и в развитии заболевания играют роль следующие нарушения:
1) гипорегенераторное состояние костного мозга с понижением чувствительности эритроидных предшественников к эритропоэтину;
2) нарушение цитокиновой регуляции обмена железа и эритропоэза - повышение образования ИЛ-1, ФНОа, ИЛ-6 и ИНФ;
3) нарушение обмена железа элементами раздраженной ретикулоэндотелиальной системы, в том числе выхода железа из макрофагов;
4) повышенное потребление железа неэритроидными клетками;
5) дефицит эритропоэтина за счет нарушения его продукции и
присутствия в крови неспецифического ингибитора активности
эритропоэтина;
6) ДВС-синдром, сопровождающийся внутрисосудистым гемолизом и кровопотерями;
7) действие лекарственных препаратов на обмен железа.
Кроме того, возможен истинный дефицит железа и гемолиз эритроцитов. Длительность жизни эритроцитов при АХЗ снижена на
20-30%, замедлена скорость созревания эритроцитов (Соболева М. К., 1994; Луговская С. А., 1997; Воробьев П. А., 2001; Црschitz D. А., 1990; Шиффман Ф. Д., 2000).
Иногда Отдельно выделяют такой вариант АХЗ, как анемия при
хронической почечной недостаточности, основным патогенетическим механизмом которой является угнетение эритропоэза токсическими веществами и, как дополнительный фактор, кровопотери
с развитием дефицита железа при проведении повторных сеансов
гемодиализа. Причем в этом случае часто имеется прямая зависимость глубины анемии от степени нарушения функции почек и
концентрации креатинина в сыворотке крови (Kammerer J. et al.,
2002).
Клиническая картина. В клинической картине преобладают
симптомы основного заболевания. Анемия, как правило, умеренно выражена с уровнем гемоглобина 70-110 г/л (Lipschitz D. А.,
1990; Гусева С. А., 2001). При значительном снижении гемоглобина имеют место проявления анемического синдрома, гипоксии
тканей.
272
Часть 2. Клиническая гематология
Диагностика. На начальных этапах болезни анемия обычно носит нормохромный характер; средний диаметр и средний объем
эритроцитов остаются в норме. По мере прогрессирования заболевания эритроциты становятся гипохромными, меньшего размера,
то есть анемия приобретает характер гипохромиой микроцитарной, а это требует проведения дифференциальной диагностики с
ЖДА. В пользу АХЗ свидетельствует повышенный уровень железа и ферритина в сыворотке и нормальный индекс анизоцитоза —
RDW (разброс размеров эритроцитов относительно среднего значения), свидетельствующий о гомогенности популяции эритроцитов. При этом для АХЗ характерно опережающее снижение средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (МСНС) в сравнении с показателем среднего объема эритроцитов (MCV), в то время
как для ЖДА свойственна обратная картина и типично повышение RDW (Кузнецова Ю. В. и др., 1996).
Уровень ретикулоцитов в норме или несколько снижен. Осмотическая стойкость эритроцитов, как правило, существенно не изменяется. Часто отмечается повышенная СОЭ.
В миелограмме больных существенных изменений не отмечается. Характерным для АХЗ является наличие адекватных или повышенных запасов железа в клетках РЭС при сниженном его количестве в эритроидных предшественниках, то есть количество
сидеробластов в костном мозге уменьшено.
Нередко наблюдаются диспротеинемия, повышение в плазме
С-реактивного белка, гаптоглобина, церулоплазмина и (^-компонента комплемента. Содержание сывороточного эритропоэтина может
быть умеренно повышено (Гусева С. А., 2001; Мазуров В. И., 2001).
У больных с АХЗ наблюдается пониженный уровень общей
железосвязывающей способности (ОЖСС). Уровень ферритина в
норме или повышен, что отражает наличие нормальных или даже
повышенных запасов железа в РЭС, с одной стороны, и реактивное
изменение концентрации ферритина в плазме как острофазового
белка, с другой стороны (Шиффман Ф. Д., 2000). Снижение в сыворотке уровня феррнтина или увеличение сывороточных трансферриновых рецепторов указывает на сочетание истощения запасов железа и воспаления.
Лечение. Положительные результаты лечения анемии могут
быть достигнуты при успешной терапии основного заболевания.
При ряде заболеваний (ревматоидный артрит и др.) положительный терапевтический эффект дает применение глюкокортикоидов
(ГК) за счет снижения образования воспалительных цитокинов, а
также андрогенов (Вуд М., Банн П., 2001; Гусева С. А., 2001).
Глава 12. Анемии
2'73
Терапия препаратами железа обычно бесполезна и даже противопоказана, учитывая риск развития гемосидероза внутренних органов.
Для коррекции анемии у больных с низким уровнем эндогенного эритропоэтина (Эпо) успешно применяют препараты рекомбинантного Эпо (Эритростим, Эпрекс — препараты рекомбинантного эпоэтина-альфа; Рекормон — препарат бета-эритропоэтина; Эпомакс — эпоэтин-омега и др.) в относительно больших дозах —
100-150 МЕ/кг. К этой категории больных в первую очередь относятся пациенты с анемией при почечной недостаточности, при ряде
злокачественных опухолей, множественной миеломе, ВИЧ-инфекции и ревматоидном артрите (Lipschitz D. А., 1990; Шпффмаи Ф. Д.,
2000). В случаях тяжелой анемии и при наличии выраженного
гипоксического синдрома показаны трансфузии эритрошпарной
массы.
Мегалобластные анемии
В ^дефицитная анемия
Вр-дефицитная анемия (В р -ДА) входит в группу мегалобластных анемий, связанных с нарушением синтеза ДНК и РНК; развивается в условиях дефицита витамина Вр (кобаламина) в организме и характеризуется мегалобластическим типом кроветворения.
Мегалобластоз относится к патологическим процессам, характеризующимся задержкой созревания я/iep гемопоэтических клеток-предшественников при продолжающемся развитии и нормальной гемоглобинизации цитоплазмы. Результатом такой ядерно-цитоплазматической диссоциации является продукция клеток
больших размеров, чем нормальных. •
Первые подробные описания Вр-ДА под названием пернициозной (гибельной) анемии сделаны в 1855 г. Т. Аддисоном (Addison Т.), затем в 1870-1980-е гг. А. Бирмером (Biermer А.). Однако патогенез заболевания был окончательно выяснен только в 2030-е годы XX столетия благодаря работам Дж. Майнота (Minot G. R.) и В. Мерфи (Murphy W. Р.), В. Б. Касли (Castle W. В.) и
других исследователей.
Распространенность. В Северной Европе Вр-ДА встречается у
0,1% всего населения, а среди пожилых лиц частота встречаемости
увеличивается до 1%. По данным широкомасштабных исследований последних лет, до 20% пожилых лиц в Соединенных Штатах
имеют различной степени выраженности дефицит кобаламина, вероятно, из-за сниженного всасывания (так называемой пищевой
кобаламиновой малабсорбщш) (Вуд М., Банн П., 2001). Заболева-
274
Часть 2. Клиническая гематология
емость пернициозной анемией (вариант'В,,-ДА) среди лиц старше
40 лет на 100 тысяч составляет 25 человек в год (Шиффман Ф. Д.,
2000).
Этиология. Этиология заболевания может быть экзогенной
(алиментарной) и эндогенной.
Алиментарная недостаточность редко встречается среди лиц, в
рацион которых входит пища животного происхождения, так как
В г, имеется во всех видах животной пищи и содержится в мышцах,
паренхиматозных тканях, а дневные потребности в кобаламине
невелики (около 1 мкг). При этом в организме имеются определенные запасы В р , так что дефицит накапливается за годы, как правило, среди пациентов с нарушенным всасыванием и у строгих вегетарианцев.
Пищевой витамин В р , иногда называемый внешним фактором,
попадает в желудок в комплексе с белками, которые отщепляются
под действием пепсина, а кобаламин образует комплекс со специфическими белками желудочного секрета, в первую очередь транскобаламином I. В дальнейшем указанный комплекс переносится в дистальную часть двенадцатиперстной кишки к внутреннему фактору (ВФ) пли фактору Касла — белку, который секретируется париетальными клетками желудка. Вновь образованный
комплекс ВФ-кобаламин абсорбируется в дистальном отделе подвздошной кишки при участии мембраносвязывающих рецепторов.
В сыворотке крови кобаламин связывается с транспортным белком транскобаламином II и целенаправленно переносится в органы и ткани (Шиффман Ф. Д., 2000; Воробьев П. А., 2001). Нарушение в любом из указанных звеньев может стать причиной дефицита витамина В12 в организме.
Эндогенные причины дефицита витамина В ]2 включают резекцию тонкого кишечника, тотальную гастрэктомию, частичную гастрэктомию и создание тощекишечных или других кишечных обходных путей. Недостаточность поджелудочной железы и чрезмерное
развитие микрофлоры тонкого кишечника, разрушающей витамин,
также могут быть причиной малабсорбции кобаламина. В частности, В|7-ДА сопровождает синдром Золлингера-Эллисона, при котором имеется сочетание гиперпаратиреоза, множественных язв
желудка и двенадцатиперстной кишки и множественных аденом
островкового аппарата поджелудочной железы со сниженной активностью протеолитических ферментов, участвующих во всасывании кобаламина. К эндогенной Вр-ДА относят анемию Аддисона-Бирмера, обусловленную атрофией слизистой фундального отдела желудка с прекращением секреции внутреннего фактора Касла
Глава 12. Анемии
275
и нарушением всасывания В р . Редко встречается врожденное отсутствие Вр-связывающих компонентов (синдром ИммерслундаГрасбека) или нарушения структуры их молекул (Абдулкадыров К. М. и др., 1999; Шиффман Ф. Д., 2000).
Определенная часть больных с тяжелым дефицитом кобаламина страдает аутоиммунным заболеванием — периициозноп анемией. Термин предложен А. Бирмером в 1872 г.. когда патогенез
данного вида анемии был еще неясен и к этой категории относили всех больных Вр-ДА. В настоящее время под пернициозной
анемией подразумевают нарушение аутоиммунной природы, характеризующееся нарушением секреции ВФ слизистой желудка.
У больных с пернициозной анемией имеется желудочная ахлоргидрия и атрофия париетальных клеток желудка, которые продуцируют внутренний'фактор. необходимый для нормального всасывания витамина В р . При обследовании более чем у 90% больных определяются антитела к париетальным клеткам желудка,
относящиеся к классу иммуноглобулинов G, однако они не являются специфичными только для першщиозной анемии. Более показательно выявление антител к ВФ, которые могут быть обнаружены примерно у 60% больных (Шиффман Ф. Д., 2000). Не исключается вероятность генетической предрасположенности к
развитию пернициозной анемии с наследованием, по всей вероятности, по аутосомно-рецессивному типу (Гусева С. А. и др.,
2001). Иногда это аутоиммунное заболевание сочетается с другими заболеваниями аутоиммунной природы, особенно касающимися щитовидной железы (тиреоидит Хашимото и др.), и с витилиго. Пернициозную анемию обычно выявляют у лиц среднего
или пожилого возраста, но возможно ее развитие и у молодых
больных (Вуд М., Банн П., 2001 и др.).
Таким образом, к основным причинам развития В]7-ДА относятся:
1) гастрэктомия, резекция тонкой кишки;
2) атрофический гастрит с отсутствием внутреннего фактора и
нарушением всасывания В,,,;
3) рак фундального отдела желудка;
4) энтериты с нарушением всасывания;
5) гельминтозы (инвазия широким лентецом) и чрезмерное развитие микрофлоры кишечника (в условиях множественного дивертикулеза и др.), при которых имеет место конкурентное потребление витамина паразитами или микрофлорой;
6) недостаточное поступление В12 с пищей — строгое вегетарианство.
276
•
Часть 2. Клиническая гематология
Патогенез. В организме человека кобаламин участвует в двух
основных процессах: метаболизме нуклеиновых кислот и синтезе
и регенерации миелина. Одновременно витамин В12 участвует в
обмене жирных кислот и нейтрализации токсичной метилмалоновой кислоты. Соответственно в условиях дефицита кобаламина
(витамина В р ) эти процессы нарушаются в большей или меньшей
степени.
Замедление синтеза ДНК ведет к остановке митозов на более
ранних фазах (в S фазе при частичной репликации ДНК), нарушению синхронности созревания клетки и гемоглобинообразования.
В результате ядросодержащие клетки костного мозга приобретают
вид мегалобластов с характерными признаками анаплазии. Мегалобласты частично разрушаются в костном мозге, частично переходят в мегалоциты и выходят в циркуляцию.
Поскольку В р -ДА обусловлена нарушениями в синтезе ДНК,
большинство клеток костного мозга страдает в той или иной степени. Также могут наблюдаться мегалобластные изменения со стороны других быстро делящихся клеток, таких как поверхностный
эпителий языка и оболочка желудочно-кишечного тракта.
При тяжелой мегалобластной анемии созревающие эритроидные клетки разрушаются в костном мозге до выхода в циркуляцию. Это интрамедуллярное разрушение эритроидных клеток увеличивает сывороточный уровень непрямого билирубина и лактатдегидрогеназы.
Кобаламин выполняет роль кофактора двух важных внутриклеточных ферментов — метионинсинтетазы в цитоплазме и в
митохондриях катализирует переход метилмалонил-КоА (метилмалонил коэнзим А) в сукцинил-КоА (сукцинил-коэнзим А). В первой реакции метилтетрагидрофолат превращается в тетрагидрофолат, необходимый для работы ряда ферментов синтеза ДНК.
В ходе этой же реакции сульфгидрилсодержащая аминокислота
гомоцистеин превращается в метионин. Следовательно, дефицит
кобаламина приводит к повышению уровня общего сывороточного гомоцистеина. Кобаламин также необходим для реакции, в которой потенциально токсичный метилмалонил-КоА переходит в
легко метаболизирующийся сукцинил-КоА. Когда кобаламиновый
кофактор снижен, избыток метилмалонил-КоА гидролизируется в
метилмалоновую кислоту, которая может быть определена и в плазме, и в моче. Увеличение содержания метилмалоновой кислоты
имеется у 99% больных с клинически значимыми проявлениями
дефицита кобаламина, такими как мегалобластная анемия (Шиффман Ф. Д., 2000; Вуд М., Банн П., 2001). Нервной системе для
Глава 12. Анемии
277
нормального роста и функционирования требуется кобаламин в
достаточном количестве. У лиц с его дефицитом может развиться
демиелинизирующее нарушение, захватывающее головной мозг,
задние столбы спинного мозга и иногда периферические нервы.
Причем неврологическая симптоматика может опережать развитие анемии.
Клиническая картина. Заболевание развивается постепенно, и
часто пациенты обращаются за медицинской помощью уже при
значительном снижении уровня гемоглобина. Клиническая картина болезни определяется нарушениями со стороны желудочно-клшечного тракта (ЖКТ), а также кроветворной и нервной системы
(Кассирский И. А., Алексеев Г. А., 1970). Больные предъявляют
жалобы на диспепсические явления, нарастающую слабость, повышенную утомляемость, головокружения и другие проявления,
связанные с прогрессирующей анемией. У ряда больных теряются
вкусовые ощущения, появляется отвращение к мясной и другим
видам пищи. На различных этапах заболевания могут появляться
боли и жжение в языке, особенно при употреблении кислых продуктов, и при осмотре нередко определяется характерный для
В12-ДА глоссит. Первоначально определяются участки воспаления
по краям и на кончике языка, затем процесс распространяется на
весь язык и другие слизистые ротовой полости. Язык может приобретать вид «малинового». Позднее сосочки языка атрофируются, и он приобретает вид «лакированного языка».
Одновременно пациенты нередко отмечают нарушения сна, парестезии в виде «ползанья мурашек», онемения дистальных отделов конечностей, чувства «ватных ног», иногда возникают боли
корешкового характера. Неврологические нарушения при В12-ДА
известны под названием фуникулярного миелоза. Наиболее частыми симптомами являются болезненные парестезии и атактическая походка. В патологический процесс могут вовлекаться глазные
нервы и вегетативная нервная система. Иногда у больного имеются нервно-психические нарушения в виде депрессии, эмоциональной лабильности, нарушений памяти или органического психоза.
При отсутствии адекватной терапии и прогрессировании патологического процесса у больных могут наблюдаться тяжелые трофические расстройства, парезы и параличи нижних конечностей, нарушение функции тазовых органов, возможны психические нарушения с появлением бреда, галлюцинаций и эпилептических
приступов (Кассирский И. А., Алексеев Г. А., 1970). Причем могут
иметь место значительные расхождения между тяжестью неврологических проявлений и мегалобластной анемией. Так, у 25% боль-
2/8
Часть 2. Клиническая гематология
ных с дефицитом кобаламина имеют место главным образом неврологические нарушения при нормальных или почти нормальных гематологических показателях (Вуд М., Банн П., 2001).
Для внешнего вида больных В12-ДА характерны бледность кожи
с лимонно-желтым оттенком, субиктеричность склер, лицо часто
одутловато. Возможно появление диффузной или локальной гиперпигментации кожи. Нередко определяется увеличенная безболезненная печень мягкой консистенции. Реже может быть выявлена умеренная спленомегалия.
При физикальном обследовании могут быть определены нарушения вибрационной и проприоцептивной чувствительности.
Классификация. В12-ДА, как и другие виды анемий, подразделяется на группы в зависимости от степени тяжести и этиологического фактора.
Ниже представлены основные варианты В|7-ДА.
I. Экзогенная ВГ,-ДА.
I. Алиментарная В)2-ДА.
II. Эндогенная ВГ,-ДА.
1. В12-ДА, обусловленная резекцией желудка, тонкого кишечника.
2. Вр-ДА, обусловленная энтеритами с нарушением всасывания, глистной инвазией.
3. Анемия Аддисона-Бирмера, обусловленная атрофией слизистой фундального отдела желудка.
4. Пернициозная анемия — аутоиммунная атрофия париетальных клеток.
5. Врожденное отсутствие или структурные и функциональные
аномалии Вг,-связывающих компонентов (синдром Иммерслунда-Грасбека, наследственный дефицит транскобаламинаПидр.).
Диагностика. Сбор анамнеза и обследование должны быть ориентированы как на обнаружение признаков самой В,,-ДА, так и на
выявление вероятной причины заболевания.
При опросе пациента с предполагаемой В,,-ДА особое внимание обращается на режим питания больного, наличие патологии
ЖКТ, неврологических и аутоиммунных' нарушений. Из данных
объективного обследования в пользу мегалобластной анемии свидетельствуют такие признаки, как сочетание бледности и желтушности кожных покровов и видимых слизистых, глоссит, неврологические признаки и симптомы дефицита кобаламина.
Основное значение в диагностике ВГ,-ДА принадлежит морфологическим исследованиям крови и костного мозга. В анализах
Глава 12. Анемии
279
крови обращает на себя внимание нормо- или гиперхромный характер анемии и наличие макроцитоза. Средний диаметр и средний объем эритроцитов увеличен (СД - 8,5 мкм и выше, СрОЭ
или MCV — 100 фл или выше). Эритроциты, диаметр которых
превышает 11-12 мкм, обозначают как мегалоциты. Высокий МС\*
при нормальном индексе анизоцитоза (RDW) указывает на гомогенный макроцитоз, вероятной причиной которого является мегалоб.таетная анемия. Для макро- и мегалоцитов характерна гиперхромия — повышенная насыщенность гемоглобином в цитоплазме
клеток. Отмечаются анизо-, пойкилоцитоз и базофильная зернистость эритроцитов за счет наличия элементов РНК. Во многих
эритроцитах обнаруживаются остатки ядра в виде телец Жолли и
колец Кебота. Характерен низкий уровень ретикулоцитов, возможны умеренная лейко- и тромбоцитопения. Тромбоциты нередко
увеличены в размерах и имеют необычную форму. Как правило,
выявляется гиперсегментация полиморфноядерных гранулоцитов
(наличие 5 и более ядерных долей), что является отражением нарушения синтеза ДНК во всех клеточных рядах.
Для подтверждения мегалобластоидного типа кроветворения
показано исследование пунктата костного мозга. В костном мозге
при В,.,-ДА отмечается.эритроидная гиперплазия с мегалобластической реакцией. Клетки эритроидного ряда увеличены в размерах, вследствие нарушения синхронности в созревании ядро выглядит менее зрелым, чем цитоплазма. Имеет место картина так
называемого «синего костного мозга». В мегалобластах структура
ядер более нежная, чем в соответствующих клетках эритроидного
ряда при нормоблаетическом кроветворении. Эритроидные клетки крупные, с повышенным содержанием гемоглобина. Выявляются гигантские формы предшественников гранулоцитов, а зрелые
гранулоциты часто полисегментированы. Количество мегакариоцитов в норме, но иногда при тяжелой ВГ)-ДА и при наличии мегалобластоидных изменений ядер клеток оно снижено.
Как результат интрамедуллярного гемолиза эритроцитов и сниженной продолжительности жизни циркулирующих эритроцитов
за счет непрямой фракции у больных отмечается гипербилирубинемия и повышается уровень ЛДГ в сыворотке крови. Уровень
сывороточного железа в норме или несколько повышен.
Имеются методы определения концентрации Вр в сыворотке
крови, что служит отражением запасов кобаламина в организме.
Однако существует мнение, что только существенно сниженный
сывороточный уровень является указанием на клинически значимый дефицит витамина В , а очень высокий уровень исключает
280
Часть 2. Клиническая гематология
его. В ситуации, при которой обследуется больной с умеренной
мегалобластной анемией и уровнем сывороточного кобаламина на
нижней границе нормы, необходима комплексная оценка клинических и лабораторных данных, так как уровень витаминов в сыворотке не всегда точно отражает внутриклеточные биохимические
процессы. В сомлительных случаях клиницист может назначить
терапию соответствующим витамином и внимательно следить за
клиническим эффектом и динамикой анализов крови или же продолжить исследования определением метилмалоновой кислоты и
общего гомоцистеииа. Уровень метилмалоновой кислоты в сыворотке повышен при дефиците В12. В то же время уровень данной
кислоты в плазме бывает пов