Гематология. Нов. справочник

гематология
Под общей редакцией
доктора медицинских наук,
профессора К. М. Абдулкадырова
.Г о с у д а р с т в е н ны й
научная би^б^
C
Университет
http://www.bestmedbook.com/
•
Москва эксмо)
Санкт-Петербург «Сова»
2004
О
, V i
УДК 616
ББК 54.11
Г 33
Оформление художника Е. Брынчик
Г 33
Гематология: Новейший справочник / Под общ. ред.
К. М. Абдулкадырова. — М.: Иза-во Эксмо; СПб.: Изд-во
Сова, 2004. - 928 с, илл.
ISBN 5-699-05074-4
В справочнике изложены современные аспекты теоретической и
клинической гематологии, приведены самые последние данные о кроветворении, морфологии и функциях клеток крови и костного мозга,
гемопоэтического микроокружения, а также сведения о цитогенетике,
иммуногематологии, иммуногистохимии и системе гемостаза. Представлены современные методы диагностики и лечения заболеваний системы
крови, рассмотрены вопросы их этиопатогенеза.
Издание предназначено для врачей гематологов, терапевтов, онколо гов, лаборантов, а также студентов медицинских учебных заведений.
УДК 616
ББК 54.11
ISBN 5-699-05074-4
© К. М. Абдулкадыров, Т. А. Андреева,
B. А. Балашова, С. С. Бессмельцев,
Л. Н. Бубнова, Т. В. Глазанова,
C. В. Грицаев, Ю. Л. Кацадзе,
Ю. А. Криволапое, М. С. Мартынкевич,
С. И. Моисеев, Н. А. Романенко,
В. И. Ругаль, И. Г. Самускевич,
В. Ю. Удальева, Е. Р. Шилова,
А. В. Шмидт, 2004
© Оригинал-макет. ООО «Сова», 2004
© ООО «Издательство «Эксмо», 2004
http://www.bestmedbook.com/
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие
7
Часть 1
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 1. Кроветворение. Номенклатура клеток костного мозга и крови.
К. М. Абдулкадыров, В. А. Балашова
Глава 2. Пункция костного мозга. Методика его исследования.
Миелограмма. К. М. Абдулкадыров, В. А. Балашова
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови.
В. А. Балашова
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга. Стромальное микроокружение:
структурная организация и участие в гемопоэзе. К. М. Абдулкадыров,
В.И.Ругалъ
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга. В. А. Балашова
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии. В. А. Балашова
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах.
К. М. Абдулкадыров, И. С. Мартынкевич
Глава 8. Клиническая иммуногематология. Л. Н. Бубнова
Глава 9. Иммуногистохимия. Ю.А. Криволапое
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз). Т. В. Глаэанова
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза. Ю. Л. Кацадзе
9
34
39
62
75
100
122
145
164
221
231
Часть 2
КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 12. Анемии. К. М. Абдулкадыров, Е. Р. Шилова
250
Железодефицитная анемия
252
Анемия хронических заболеваний
270
Мегалобластные анемии
273
В ( -дефицитная анемия
273
Фолиеводефшцитная анемия
284
Мембранопатии
287
Наследственная сфероцитарпая анемия (наследственный сфероцитоз) 287
Наследственный эллиптоцитоз
293
6
Оглавление
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия
(болезнь Маркиафавы-Микели)
Ферментопатии
Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Дефицит пируваткиназы
Гемоглобинопатии (гемоглобинозы)
Серповидно-клеточная анемия
Талассемия
Иммунные гемолитические анемии
Аутоиммунная гемолитическая анемия
Апластическая анемия
Парциальная красноклеточная аплазия
Глава 13. Идиопатическаятромбоцитопеническаяпурпура. С. С. Бессмелъцев ..
Глава 14. Гемофилия. Т.А.Андреева
Глава 15. Болезнь Виллебранда. Т. А. Андреева
Глава 16. Острые лейкозы. С. И. Моисеев, К. М. Абдулкадыров
Глава 17. Миелодиспластические синдромы. К. М. Абдулкадыров,
С.В.Грицаев
Глава 18. Хронический миелолейкоз. К. М. Абдулкадыров, С. С. Бессмельцев...
Глава 19. Хронический идиопатический миелофиброз. С. С. Бессмельцев....
Глава 20. Истинная полицитемия. В. Ю. Удальева, К. М. Абдулкадыров
Глава 21. Эссенциальная тромбоцитемия. К. М. Абдулкадыров,
В. Ю. Удальева
Глава 22. Множественная миелома. С. С. Бессмелъцев, К. М. Абдулкадыров
Глава 23. Макроглобулинемия Вальденстрема. С. С. Бессмельцев
Глава 24. Болезни тяжелых цепей. С. С. Бессмельцев
Глава 25. Лимфомы. К. М. Абдулкадыров, И. Г. Самускевич
Неходжкинские лимфомы
Хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз
(лимфома из малых лимфоцитов)
Пролимфоцитарный лейкоз
Волосатоклеточный лейкоз
Другие формы В-клеточных неходжкинских лимфом
Т-клеточные неходжкинские лимфомы
Лимфогранулематоз (лимфома Ходжкина)
Глава 26. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток костного
мозга, периферической и пуповинной крови при заболеваниях
системы крови. С. И. Моисеев, К. М. Абдулкадыров
Глава 27. Гемокомпонентная терапия при заболеваниях системы крови.
К. М. Абдулкадыров, С. И. Моисеев
Глава 28. Терапия поддержки у больных гемобластозами.
К. М. Абдулкадыров, С. И. Моисеев
Глава 29. Центральные венозные катетеры в гематологии: приоритеты и
проблемы. К. М. Абдулкадыров, А. В. Шмидт
Глава 30. Заготовка, хранение и лабораторное тестирование пуповинной
крови. К. М. Абдулкадыров, Я. А. Романенко
Предметный указатель
294
299
300
306
307
308
314
320
321
327
337
349
373
390
402
468
496
556
572
583
593
666
687
696
698
705
723
724
726
741
755
770
813
830
851
890
902
Часть 1
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 1
КРОВЕТВОРЕНИЕ.
НОМЕНКЛАТУРА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И КРОВИ
Кроветворение, или гемопоэз — это сложный многоэтапный процесс образования в специализированных органах клеток крови.
Как образуются первые кроветворные клетки?
В результате дробления оплодотворенной яйцеклетки формируется бластоциста, затем бластула и гаструла. Внутренняя клеточная масса бластоцисты (ВКМ) содержит 30-150 эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Это поистине стволовые клетки,
клетки-прародительницы, обладающие тотипотентностью, т. е. способностью давать начало как собственно эмбриону, так и всем без
исключения клеткам и тканям организма. На стадии гаструлы в
результате сложных перемещений клеток образуется 3 зародышевых листка — экто-, мезо- и эндодерма. Мезодерма — средний
зародышевый листок — дает начало костному мозгу, крови, сердечно-сосудистой системе. Мезенхима, называемая иногда 4-м зародышевым листком, также является производной мезодермы и дает
начало костям, хрящам, мышцам, дерме и всей соединительной
ткани организма. Формирование органов из ЭСК, включая гемопоэтические — костный мозг, тимус, селезенку, лимфоузлы, Пейеровы бляшки, мукозоассоциированную лимфоидную ткань, — осуществляется благодаря транскрипции генов, реализующих генетическую программу в клетке. В частности, известна роль ядерных
10
Часть 1. Теоретическая гематология
белков GATA-2* в развитии ранних кроветворных предшественников (Martin D. I. К. ct al., 1990; Romeo P. H. el al., 1990).
Кроветворение у человека начинается на 3-4-й неделе гестации
одновременно в желточном мешке (внеэмбриональное кроветворение), а также в самом эмбрионе и хорионе (внутриэмбриональное кроветворение) в виде кровяных островков, окруженных клетками эндотелия, происходящего, по-видимому, из общих с гемопоэтическими стволовых клеток (Приндулл Г., 1998). К. Choi и
соавторы (1998) подтвердили идею существования бшготентных
гемангиобластов, прослеживая путь развития кроветворной клетки по схеме: мезодерма—эндотелий—кровь. Однако еще в 1932 г.
А. В. Румянцев отметил, что «как кровяные клетки, так и сосуды,
по которым движется кровь, — дериваты мезенхимы». М. Tavian и
соавторы (1996) показали, что в области парааорталыюй спланхоплевры эмбриона одновременно с желточным мешком возникают первые стволовые кроветворные клетки (СКК), которые мигрируют затем в фетальную печень, костный мозг и другие места
гемопоэза. Только эти клетки по праву могут называться стволовыми кроветворными, но в силу сложившейся традиции это название сохранилось и за некоторыми более поздними их потомками.
В период гаструляции ЭСК начинают формировать гемопоэтическую мезенхиму (Приндулл Г., 1998), а также синтезируется экстрацеллюлярный протеиновый матрикс, включающий фибронектин,
ламинин и коллаген; экспрессируются рецепторы молекул клеточной адгезии — интегрины; секретируются цитокины. Эндотелиальные клетки, сливаясь в капилляры, соединяют желточный мешок с эмбрионом. По этим капиллярам из желточного мешка на 45-й неделе гестации двигаются примитивные гемопоэтические
клетки и колонизируют образующуюся к тому времени печень.
На 8-10-й неделе происходит колонизация вилочковой железы.
Таким образом, закладка кроветворной системы осуществляется при координированном взаимодействии трех клеточных пулов — производных мезодермы — гемопоэтического, стромального
и сосудистого.
Первыми клетками, которые к концу 4-й недели образуются в
желточном мешке, являются примитивные эритробласты-мегало* GATA — семейство ядерных белков, которые наряду с другими факторами
транскрипции генов не только ответственны за пролиферацию и дифференцировку стволовых кроветворных клеток (GATA-2), но и участвуют в закладке эритропоэза и синтезе глобина, в развитии мегакариоцитопоэза (GATA-1,
GATA-5). базофилов и нейтрофилов (GATA-1) и Т-лимфоцитов (GATA-3).
Глава 1. Кроветворение
11
бласты, синтезирующие фетальный гемоглобин. На 4-5-й неделе
развития эмбриона в желточном мешке возникают различные генерации кроветворных клеток, в том числе полипотентные клетки-предшественники гранулоцито-эритро-моноцито-мегакариоцитопоэза, образующие в агаре смешанные колонии в составе этих
клеток — КОЕ-ГЭММ (колониеобразующие единицы гранулоэритро-моноцито-мсгакариоцитопоэза). Данные клетки экспрессируют рецепторы ранних миелоидных стволовых клеток CD34
(CD — кластер дифференцировки, т. е. группа дифференцировочных антигенов). Одновременно с ними в желточном мешке появляются биопотентные грануломоноцитарные клетки-предшественники, способные образовывать в условиях клеточных культур колонии из гранулоцитов и моноцитов, поэтому их называют
КОЕ-ГМ. В эти же сроки развития эмбриона в желточном мешке
также обнаружены эритроидные клетки-предшественники. По способности образовывать в культуре крупные эритроидные колонии
из нескольких агрегатов — бурсты или просто эритроидные колонии — их называют соответственно бурстобразующими единицами эритропоэза (БОЕ-Э) и колониеобразующими единицами эритропоэза (КОЕ-Э) (Migliaccio G., 1986; Приндулл Г., 1998). Активный гемопоэз в желточном мешке продолжается до 8-й недели и
полностью заканчивается к 16-й неделе (Чертков И. Л. и др., 2002).
Эмбриональная печень, закладка которой происходит на 4-й неделе развития, становится главным местом гемопоэза. Это второй,
печеночный, период кроветворения. Печеночная ткань представлена гепатоцитами — производными эндодермы и кроветворными
клетками — производными мезодермы. К 30-му дню в эмбриональной печени определяются первые гемопоэтические клетки, несущие маркер ранних кроветворных клеток-предшественников —
CD34. В эмбриональной печени гемопоэз в основном эритроидный, позже, в фетальной печени, усиливается миелоидный гемопоэз и количество гранулоцитов, макрофагов и мегакариоцитов
возрастает (Балашова В. А., Абдулкадыров К. М., 1984). К 9-й неделе в печени плода наблюдается В-лимфопоэз (Tavian M. et al,
1999 a, b).
Третий период кроветворения происходит в костном мозге, и
его начало относится к 11-12-й неделе развития плода. Хрящевой
скелет образуется уже у 6-8-недельного эмбриона. Костные рудименты окружаются сетью капилляров, клеток-предшественников
остеобластов и макрофагов. Макрофаги быстро переваривают хрящ,
оставляя небольшие островки хондроцитов, где при участии остеобластов начинается процесс костеобразования, и к 10-й неделе
12
Часть 1. Теоретическая гематология
между костными трабекулами образуются большие сосудистые синусы и костномозговые полости (Charbord P. et al, 1996). К 11-й неделе в костном мозге начинается активный гемопоэз и количество
эритроцитов и гранулоцитов быстро увеличивается. С этого времени костный мозг навсегда становится главным местом гемопоэза у человека.
Всю общность гемопоэтических клеток во взрослом организме
весьма условно подразделяют на 5-6 этапов дифференцировки,
границы которых размыты и которые содержат много переходных
промежуточных форм (Чертков И. П. и др., 2002). В процессе этих
дифференцировок происходит постепенное снижение пролиферативной активности клеток и их потентности, т. е. способности развиваться сначала во все кроветворные линии, а затем во все более
ограниченное количество линий. В схеме (рис. 1) приведены последовательные этапы развития кроветворных клеток, начиная от
тотипотентных стволовых клеток и заканчивая зрелыми элементами крови.
Пул поли- или мультипотентных СКК (II отдел) образуется из
тотипотентной ЭСК, стоящей на самом верху этой иерархической
лестницы (I отдел).
В эмбриональном периоде ЭСК экспрессируют гены, индуцирующие дифференцировку в направлении гемопоэза, что инициирует возникновение СКК и начало кроветворения. Количество СКК
невелико — около 0,01% (Шкловская Е. В. и др., 1998), а вместе с
потомками — клетками-предшественниками — около 0,05%
(Weissman I. L. et al., 1997). Их морфологические характеристики
не выяснены, однако предполагают, что они подобны лимфоцитам
малого и среднего диаметра. Методы их исследования не морфологические, а функциональные, и информация о них получена экспериментальным путем. В отличие от тотипотентной клетки СКК не
обладают неограниченным пролиферативным потенциалом и не
являются бессмертными. Возможно, что нелимитированное самовозобновление и бессмертность СКК явились бы условием, угрожающим их жизни, так как подобные клетки скорее подвержены
неоплазии (Ploemacher R. Е., 1999). В настоящее время доказана
полипотентность данных клеток, способность развиваться во все
8 линий гемопоэза, а также способность к Ограниченному самоподдерживанию ранних СКК (Воробьев А. И. и др., 1985, 2002). Их
саморепликация ограничена, как полагают, приблизительно 50 клеточными делениями (Vaziri H. et al., 1994), однако они поддерживают продукцию клеток крови в течение всей жизни индивидуума.
Большая часть СКК находится в состоянии покоя, в глубоком ре-
Глава 1. Кроветворение
13
зервс, обладая при этом огромным пролиферативным потенциалом (Чертков И. Л. и др., 2002; Ploemacher R. Е., 1999). Согласно
характеристикам и свойствам этих клеток, полученным экспериментальным путем, гетерогенный пул СКК II отдела подразделяют на клетки, способные: .
1) репопулировать кроветворение смертельно облученных мышей длительно (в течение всей жизни) — КРКМ-Д или кратковременно - КРКМ-К;
2) формировать колонии в селезенке смертельно облученных
мышей через 8 или 12 дней — колониеобразующие единицы селезенки - КОЕс-8 дн., КОЕс-12 дн.;
3) образовывать в длительной культуре через 5 недель на адгезивном слое так называемые области «булыжника» — очень
плотно прилегающие друг к другу клетки бластного типа —
КООБ-5 нед.
СКК, имплантированные в организм животных, демонстрируют клональный рост, т. е. формируют клоны-колонии, состоящие
из однотипных клеток различных клеточных линий, или смешанные, что является доказательством их полипотентности (способности развиваться во все клеточные линии). Полипотентность СКК
доказана также с помощью метода маркирования отдельных СКК
чужеродным геном (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 1996; Lemischka I. R. et al., 1986; Keller G. et al., 1990). Перенос гена производится
благодаря встраиванию в ДНК клетки специального ретровируса.
Имплантированные в организм облученной мыши «меченные» таким образом СКК способны полностью репопулировать кроветворение животного, а донорские клетки обнаруживаются в различных участках его кроветворной системы.
Ранние CD38 СКК экспрессируют антиген CD34, который является их маркером, и рецепторы к фактору стволовой клетки
(ФСК), фактору, подобному тирозинкиназе (ФЛТ 3-лиганд); рецептор к интерлейкину 6 (IL-6R); рецептор к CD45 (CD45R). Однако среди ранних СКК выделены клетки, не экспрессирующие
CD34 — CD34 CD38CKK. Возможно, они являются предшественниками CD34XKK (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2001).
По мере снижения пролиферативного потенциала СКК дифференцируются в полиолигопотентные коммитированные клеткипредшественники (III отдел). (Коммитирование — от англ. commit —
принятие на себя обязательств.) Клетки этого уровня имеют уже
ограниченную потентность, так как коммитированы к дифференцировке в направлении лишь 2-5 гемопоэтических клеточных линий. В этот отдел включены клетки, способные образовывать в
14
Часть 1. Теоретическая гематология
Отдел тотипотентных
клеток
ЭС
скк
Отдел стволовых
мультипотентных клеток
КРКМ-Д
КРКМ-К
КОЕс-12 дн, КООБ- 5 нед
КОЕс-8дн
Отдел полиолигопотентных
коммитированных
предшественников
КОЕ-Бл, КОЕ-ВПП
КОЕ-ГЭММ
2-5 потентные КОЕ (в любом наборе)
Отдел моноолигопотентных
коммитированных
предшественников
КОЕ-М
%т
Отдел морфологически
узнаваемых клеток
Т-лимфобласт
В-лимфобласт
Т-пролимфоцит
В-пролймфоцит
Т-лимфоцит
В-лимфоцит
Т-иммунобласт
В-иммунобласт
МоноВласт
Промочоцит
Проплаэмоцит
Дендритная
НК-клетка
клетка
{натуральный
•
•—
киллер)
Активный
Т-лимфоцит
'•
Плазмоц^т
;—
Тумкая
МОНОЦ!
МАКРОФАГИ
Ч
Гистиоииты
и купферовские клетки
Свободные и фиксированные
селезенки
костного мозга
лимфоузлов
W.4
Альвеолярный
Рис. 1. Схема кроветворения
(И. Л. Чертков, Н. И. Дризе, А. И. Воробьев, М. Д. Бриллиант;
схема из кн.: Руководство по гематологии / Пол ред. А. И. Воробьева.
М, 2002. Т. 1.)
ЭС — эмбриональная стволовая клетка; СКК -- стволовая кроветворная клетка;
КРКМ-Д — клетка, репопулирующая костный мозг длительно; КРКМ-К — клетка, репопулирующая костный мозг кратковременно; КОЕс-12 дн. (8"дн.) — колониеобразующая
единица селезенки, дающая колонии через 12 дней (8 дней): КООБ-э нед. — клетка, образующаяся в культуре области «булыжника» через 5 недель; КОЕ-Бл — колониеобразующая единица бластная; КОН-ВВП — колониеобразующая единица высокого пролиферативного потенциала; КОЕ-ГЭММ — колониеобразующая единица гранулоцитарная,-эритроцитарная, моноцитарная (макрофагальная), мегакариоцитарная; КОЕ-ГМ — коло-
Глава 1. Кроветворение
кбе-гм
15
БОЕ-Э
КОЕ-Г
=51
> I 1-Эоз
—
(ОЁ-БазКОЕ
КОЕ-Нейтр
КОЕ-Э
:зофильный Эоэинофилышй НейгрЦильный эрч^Зблзст
КОЕ-Мгкц
Мвга^ариобласт
Промегакариоцит
Базофильиый
нормоцит
-'-' Полихроматофильны!
ш
С е г м е и т о я д е р ч ы е
& •
щ
^•>
1*,
Ппевр зльиый Перито
льный Остеокласт
Оксиф ильный
нормоцит
Ретику'поцит
Эритроцит
Г
Клетки
микрсглии
. '"-.'Мегакариоциг
•/?,[*/.Тромбоциты
Ф
Дендритные
клетки
ниеобразующая единица гранулоцитарно-моноцитарная (макрофагальная); КОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитарная; КОЕ-М — колониеобразующая единица
моноцитарная (макрофагальная); КОЕ-Баз — колониеобразующая единица базофильная ц
тучноклеточная; КО К-Эоз — колониеобразующая единица эозинофильная; КОЕНейтр — колониеобразующая единица нейтрофильная; КОЕ-Э -- колониеобразующая
единица эритроцитарная; КОЕ-Мгкц — колониеобразующая единица мегакариоцитарная; БОЕ-Э — бурстообразующая единица эритроцитарная; пре-Т — клетка-предшественник Т-лимфоцитов; пре-В — клетка-предшественник В-лимфоцитов.
16
Часть 1. Теоретическая гематология
культуре бластные колонии (КОЕ-Бл), клетки, дающие в культуре
рост смешанных колоний, состоящих из гранулоцитов, эритроидных клеток, макрофагов, мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), и 25-потентные КОЕ (в любом составе). КОЕ-ГЭММ являются общим
предшественником миелопоэза. Они несут маркер CD34, а также
маркер, специфичный для клеток миелоидной линии, — CD33 и
детерминанты гистосовместимости — HLA-A, HLA-B, HLA-C и
HLA-DR. Ранние эритроидные предшественники экспрессируют
стволовоклеточный антиген CD34, ранний миелоидный CD33 и
антигены HLA-DR. Поздние эритроидные предшественники несут
на мембране рецепторы к эритропоэтину и трансферрину и специфический маркер гликофорин А. Их способность образовывать
колонии в полутвердых и вязких культуральных средах под влиянием колониестимулирующих факторов (КСФ) позволила доказать их существование и способность данных клеток к клональному росту.
Клетки IV отдела — коммитированные предшественники отдельных клеточных линий являются моноолигопотентными. Они
коммитированы в направлении 1-2-й клеточных линий. Среди них
находятся: КОЕ-Г — клетка-предшественник нейтрофилов, эозинофилов, базофилов; КОЕ-Мгкц — предшественники мегакариоцитов; БОЕ-Э и КОЕ-Э — предшественники эритроидных клеток;
КОЕ-Баз — предшественник базофилов; КОЕ-М —предшественник моноцитов и макрофагов; КОЕ-ГМ — общий предшественник
гранулоцитов и макрофагов; КОЕ-Эоз — предшественник эозинофилов; КОЕ-Нейтр — предшественник нейтрофилов; предшественники Т- и В-лимфоцитов — пре-Т и пре-В клетки. КОЕ-ГМ экспрессируют CD34, CD33, HLA-DR и антиген более зрелых миелоидных клеток — CD 13, по мере созревания которых на мембране
унипотентных моноцитарных и гранулоцитарных КОЕ появляются новые маркеры, но они утрачивают антиген CD34. Близость
путей дифференцировки эритроидных и мегакариоцитарных предшественников, существование бипотентных бурстобразугощих единиц эритро-мегакариоцитопоэза (БОЕ-ЭМгкц), выделенных из фракции CD34+CD38* клеток, доказаны цитогенетически (McLeod D. L.
et al., 1980) и методом клеточных культур, где общий предшественник этих двух линий требует для пролиферации комбинации фактора стволовой клетки (ФСК), интерлейкина-3 (ИЛ-3) и эритропоэтина (ЭРП) (Hunt P., 1995; Debili N. et. al., 1996).
V отдел морфологически узнаваемых клеток включает дифференцирующиеся, созревающие и зрелые клетки всех 8 клеточных
линий, начиная с бластов. Морфоцитохимическая характеристика
Глава 1. Кроветворение
17
в световом микроскопе позволяет идентифицировать большинство
бластных клеток этого уровня. Таким образом, собственно стволовыми кроветворными могут быть названы только клетки I отдела и
ограниченно — II отдела, длительно репопулирующие костный мозг,
или СКК, получаемые в длительных культурах на стромальной
подложке — LTCIC (Longterm Culture Initial Cells — клетки, инициирующие длительную культуру), обладающие, как известно, высокой способностью к самоподдержанию. Эти СКК не несут лииешгоспецифических маркеров и дают рост всем линиям гемопоэтических клеток (Weissman 1. L. et al., 1997). В норме они находятся
в состоянии глубокого покоя (Laitha L. G., 1963; Ladd А. С. et al.,
1997; Traycoff С. М. et al., 1998).
Известно, что отдел стволовых кроветворных клеток представляет из себя пул клеток с различной потентностью и пролиферативным потенциалом. Истинные стволовые кроветворные клетки,
единые для всех кроветворных линий, существование которых гениально предсказал Maximov А. А. (1909), располагаются, возможно, в отделе мезенхимальных клеток, или гемангиобластов (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2001).
Изучение СКК сопряжено с решением многих проблем, связанных с трудностью их выделения, расшифровки механизмов регуляции на клеточном и молекулярном уровне, направляющих клетку на путь самоподдержания или дифференцировки. Знание этих
механизмов имеет большое значение для понимания патогенеза
лейкозов.
В последние годы широко обсуждается вопрос о способности
СКК к дедифференцировке и трансдифференцировке, о так называемой пластичности СКК. Под пластичностью СКК понимают
способность развиваться в другие типы клеток, не свойственные
им в норме. Трансдифференцировка СКК предполагает перепрограммирование ее генома, что позволило бы ей проявить истинную
мультипотентность, если не тотипотентность.
Недавние исследования поколебали представление об СКК как
о клетках, потенциал которых ограничивается лишь дифференцировкой в клетки крови, т. е. гемопоэтической специализацией.
Пластичность СКК внутри гемопоэтической системы давно доказана. Однако множество работ сообщают о том, что любой тип
тканей взрослого организма имеет свои стволовые клетки, способные при трансплантации репопулировать гемопоэтическую систему. Появилось большое количество сообщений о способности СКК
при определенных условиях развиваться в клетки неродственных
тканей — кле ГК8ЁС.К
•О
научная би
Инв.№
18
Часть 1. Теоретическая гематология
клетки ЖКТ (Okada Т. S., 1991; Shi Q. et a]., 1998; Krause D. S. et al.,
2001; Kornblung M. et al., 2002). E. Lagasse и соавторы (2000) показали в экспериментах на мышах трансформацию СКК в гепатоциты. Т. R. Brazelton с соавторами (2000) и Е. Mezey с соавторами (2000) сообщили о трансформации СКК мышей в нейроны головного мозга и способности СКК преодолевать барьер между
кровью и головным мозгом. По данным К. A. Jackson и соавторов
(1999) и С. R. Bjornson и соавторов (1999), стволовые мышечные
или нейральные клетки способны мигрировать в костный мозг и
производить там клетки крови. Slack I. M. W., Tosh D. (2001), Tosh D.,
Slack I. M. W. (2002) в экспериментах на животных показали, что
взрослые стволовые клетки способны продуцировать дифференцированные клетки из неродственных тканей. По их мнению, подобная метаплазия показывает, что обязательства, взятые на себя
клеткой в период эмбриогенеза, могут быть полностью отменены.
В работах D. Orlik и соавторов (2001) и К. A.Jackson и соавторов
(2001) было показано, что клетки донорского костного мозга трансформировались в клетки миокарда и сосудов у мыши с экспериментальным инфарктом.
В то же время существует очень много критических замечаний
по поводу заявлений о возможности трансдифференцировки клеток взрослого организма (Дыбан А. П., Дыбан П. А., 2002; Morrison S. I., 2001; Abkowitz I. L, 2002; Orkin S. H., Zon L. I., 2002).
Учитывая, что гепатоциты, эпителий кишечника и клетки крови
происходят из разных зародышевых листков, выводы о возможности их трансдифференцировки в клетки других тканей вызывают
много вопросов. Действительно ли тогда специализированные ткани происходят из соответствующих специальных листков? Ведь
этот факт всегда был главным принципом, догмой эмбриологии.
Однако то, что негемопоэтические клетки могут быть получены из клеток костного мозга, еще не доказывает, что они происходят из СКК. Причиной может быть то, что обогащенная стволовыми кроветворными клетками клеточная взвесь, используемая
для трансплантации, может содержать как гемопоэтические предшественники, так и прекурсоры, коммитированные в направлении
других негемопоэтических линий. Доказано, что костный мозг содержит мезенхимальные, эндотелиальные клетки, способные развиваться в различные негемопоэтические ткани — остеокласты,
хондроциты, адипоциты, эндотелий (Сухих Г. Т. и др., 2002). Очевидно, что костный мозг может также содержать различные эндодермальные предшественники, способные развиваться в клеточные компоненты пищеварительной системы, а их физические и
Глава 1. Кроветворение
19
фенотипические свойства могут способствовать их попаданию в обогащенную популяцию СКК (Dorshkind К., 2002). Кроме того, полагают, что СКК могут находиться в покоящемся состоянии не только
в костном мозге, но и в других негемопоэтических тканях (Kawada H., Ogawa ML, 2001; Lewis R., 2002). Terada N. и соавторы (2002) и
Ying Q. L. с соавторами (2002) показали в эксперименте, что происходит не трансдифференцировка, а слияние клеток донора и реципиента, в результате чего клетки реципиента приобретают донорский фенотип. К тому же, существование во взрослом организме
тотипотентных эмбриональных клеток, а также плюрипотентных
мезенхимальных стволовых клеток многими исследователями уже
не подвергается сомнению (Weissinan I. L, 2000; Сухих Г. Т. и др.,
2002). Авторы полагают, что эти клетки способны, по-видимому,
покидать зоны своего распределения и мигрировать, циркулируя в
кровотоке. Источником ЭСК в экспериментальных условиях является внутренняя клеточная масса (ВКМ) in vitro фертилизированной человеческой бластоцисты (Schuldiner M. et al., 2000). ЭСК имеют также и гемопоэтический потенциал. Они персистируют в организме, очевидно, в очень небольших количествах и пребывают в
состоянии глубокого покоя. ЭСК взрослого организма могут быть
коммитированы к образованию эндо-, мезо- или эктодермы и могут
либо циркулировать в крови, либо оставаться в тканях, в том числе и
в костном мозге. Под влиянием сигналов микроокружения их потенциал может быть реализован (Gussoni E. et al., 1999; Lagasse E.
et al., 2000; Krause D. S. et al., 2001; Dorshkind K., 2002). Тотипотентность ЭСК, имеющих неограниченный потенциал, обеспечивается
выключением программы специализации клеточных линий. Если
тотипотентную клетку удастся выделить из тканей, то окажется, что
отвергать концепцию эмбриогенеза о зародышевых листках преждевременно (Dorshkind К., 2002). В настоящее время обсуждают роль
микроокружения тотипотентных клеток, способного сыграть решающую роль в их судьбе. С одной стороны, индуцирующие сигналы
могут вызвать экспрессию определенных генов и дифференцировку
ЭСК в направлении этой ткани. Так, в костном мозге эти клетки
могут быть стимулированы к развитию в СКК, чей потенциал ограничен клетками крови. С другой стороны, микроокружение может
ингибировать другие программы развития ЭСК, к которым она потенциально способна, и если эти негативные сигналы ослабеют, то в
ткани могут появиться клетки, не характерные для нее. Это скорее
объяснило бы метаплазию в тканях, чем возможность трансдифференцировки стволовых клеток. Решение этих вопросов нуждается
в дальнейших исследованиях.
20
Часть 1. Теоретическая гематология
Конечной целью процесса кроветворения является образование
зрелых, функционально полноценных клеток крови — лейкоцитов,
эритроцитов и тромбоцитов.
Гемопоэз — очень динамичная, четко сбалансированная и непрерывно обновляющаяся система. В постнатальном периоде он
происходит в плоских костях скелета, а также в позвонках, проксимальных отделах бедренных и плечевых костей, лимфоузлах, селезенке, тимусе. Ежесуточно в организме человека весом около 70 кг
вырабатывается более 300 миллиардов клеток: 20 х 10" — эритроцитов, 45 х 10" — нейтрофилов; 109 — моноцитов, 175 х 109 — тромбоцитов (DanceyJ. Т. et al, 1976; Erslev A. I., 1983; Огава М„ 1990).
В течение жизни у человека в среднем вырабатывается приблизительно 460 кг эритроцитов, 5400 кг гранулоцитов, 40 кг тромбоцитов, 275 кг лимфоцитов; всего — 5-6 т. Это обеспечивается за счет
пролиферации и дифференцировки СКК и их коммитированных
потомков. В крови взрослого человека в каждый данный момент
находится около 25 х 1012 эритроцитов, 15 х 10 й тромбоцитов и
3 х 109 лейкоцитов. Более 300 млн клеток производится в каждую
минуту жизни человека (Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2002). Кроветворный красный костный мозг располагается среди элементов
кости и стромы, образующих его микроокружение. Кость, ее балки
и трабекулы образуют главную опорную структуру, ограничивающую зоны кроветворения. Клеточными элементами костной ткани
являются остеобласты, остеокласты и остеоциты. Строма, или подстилка из клеток, является производной мезенхимы и состоит из
большого количества высокоспециализированных клеток — адипоцитов, фибробластов, эпителиальных, адвентициальных, эндотелиальных, ретикулярных клеток. Строму также образуют кровеносные сосуды, нервные окончания и макрофаги. Производным
стромы является внеклеточный матрикс, включающий коллагеновые и ретикулиновые волокна и серию нерастворимых белков —
фибронектин, ламинин, тромбоспонин, тенасцин, гликозаминогликаны и др. Гемопоэтические клетки находятся в тесном контакте с клетками стромы. Адгезивное межмембранное взаимодействие
клеток стромы и гемопоэтических клеток обеспечивает передачу
регуляторных сигналов и необходимых клетке веществ. В этом
процессе большую роль играют молекулы клеточной адгезии, относящиеся к мембраносвязанному классу регуляторов гемоноэза
(Ploernacher R., 1999) и являющиеся производными клеток стромы. Главный маркер СКК — CD34 также является молекулой клеточной адгезии и поэтому участвует в адгезии СКК со стромальными клетками костного мозга. В костном мозге находятся СКК и
Глава 1. Кроветворение
21
все их потомство, в том числе ранние предшественники лимфопоэза. Окончательная дифференцировка В-лимфоцитов завершается
в лимфоузлах, селезенке и Пейеровых бляшках. Специализация и
дифференцировка Т'лимфоцитов осуществляется в вилочковой
железе.
Процесс кроветворения в костном мозге схематично можно представить следующим образом: костные трабекулы, клетки стремы и
прежде всего фибробласты, эндотелиальные и адвентициальные
клетки образуют в костях полости, ниши или синусоиды, в которых в виде гроздьев размещаются кроветворные клетки (Натан Д. Г.,
Зифф К. А., 1994; Spardling A. et al, 2001). Это отдельные клоны,
содержащие клетки различной степени зрелости. Полагают, что
СКК и их потомство находятся в кроветворных зонах преимущественного расположения миелоидных или эритроидных клеток
(Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А., 1980; Wolf N. S., 1978; Трентин Д. Д., 1982). Ниши не омываются кровью, и система полностью замкнута. Ниши являются смежными с венозными синусами, у них общие стенки, выстланные со стороны венозного синуса
эндотелием, а со стороны гемопоэтических ниш — адипоцитами,
клетками адвентиция, между которыми находится базальная мембрана. Созревшие клетки должны преодолеть этот барьер в виде
стенки, чтобы оказаться в венозном синусе, а затем в кровотоке.
Показано, что в определенных нишах находятся клетки различных
кроветворных ростков, а на границах ниш кроветворение смешанное. Способность гемопоэтических клеток распознавать соответствующие клетки стромы и размещаться в своих определенных
зонах называется хомингом.
Созревая, клетка продвигается ближе к стенке венозного синуса. Теперь она должна протиснуться между слоями клеток стенки.
Для этого в цитоплазме эндотелиальных клеток находятся отверстия в 1-2 мкм, через которые клетки могут проходить, если обладают достаточной эластичностью. Клетки с поврежденными или
потерявшими эластичность мембранами не могут пройти через отверстия и расщелины в стенке и гибнут. В прохождении нормобластов через стенку принимают участие макрофаги, освобождающие
нормоцит от ядра. Мегакариоциты плотно прижаты к промежуткам между клетками стенок, их цитоплазма в виде отростков выпячивается в эти трансмуральные отверстия и отделяет в просвет
венозного синуса тромбоциты (Натан Д. Г., Зифф К. А., 1994).
Иногда созревшие клетки могут проходить непосредственно через
мегакариоциты. Это явление, называемое эмпериополезисом, опосредовано способностью мегакариоцитов к эндоцитозу — захвату
22
Часть 1. Теоретическая гематология
других гемопоэтических клеток. В норме только зрелые, функционально полноценные клетки крови проходят через барьер и попадают в кровеносное русло. Способность зрелых клеток покидать
нишу и перемещаться в направлении стенки венозного синуса называется хемотаксисом. Этот процесс опосредован влиянием на
клетку специальных веществ — хемоаттрактантов, продуцируемых
пристеночными клетками.
Регуляция гемопоэза
Процессы регуляции кроветворения до сих пор изучены недостаточно. «...Мы по-прежнему не понимаем, как регулируется сложный процесс вступления стволовой клетки в цикл и выбор ею направления дифференцировки» (Чертков И. Л. и др., 2002). Необходимость непрерывно поддерживать гемопоэз, адекватно отвечать
на все запросы организма, удовлетворяя его потребности в различных специализированных клетках, обеспечивать постоянство и равновесие внутренней среды — гомеостазис — все это предполагает
существование сложных и тонких регуляторных механизмов, действующих по принципу обратной связи. В первую очередь таким
регулятором являются сами СКК и их коммитированные потомки,
обеспечивающие поликлональный гемопоэз, а также индуцирующее гемопоэз микроокружение (ИГМ). Микроокружение играет
огромную роль в регуляции гемопоэза. Клетки стромы, наряду с
гемопоэтическими и некоторыми соматическими клетками, а также молекулами экстрацеллюлярного матрикса продуцируют регулирующие гемопоэз факторы — цитокины. Особая роль принадлежит классу мембраносвязанных глюкозаминогликанов. Гемопоэз
инициируется этими факторами и непрерывно поддерживается
благодаря пулу СКК. Как уже упоминалось, пул СКК мал и, так
как он находится у истоков гемопоэза, бесценен для организма, и
поэтому должны быть механизмы, защищающие его от истощения.
СКК покоятся в специальных нишах и почти не отвечают на сигналы, запросы организма, на гуморальные факторы регуляции
(Laitha L. G., 1979). Полагают, что их количество регулируется
стохастически, т. е. случайно. Регуляция пула СКК осуществляется в соответствии с некой генетически обусловленной случайной
вероятностью пролиферации и дифференциации, как бы заданной периодичностью этих процессов (Чертков И. Л., Гуревич О. А.,
1984; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985; Гольдберг Е. Д. и др.,
2000; Laitha L. G., 1963; Nakahata et al, 1982; Mctcalf D., 1984; OraваМ., 1990).
Глава 1. Кроветворение
23
Стволовые кроветворные клетки стромозависимы и воспринимают короткодистантные регулятор.ные стимулы, получаемые ими
при тесном межклеточном контакте с клетками стромального
окружения. Однако существуют основания полагать, что регуляция
СКК не ограничена влиянием только корохкодистантных стимулов и что факторы ИГМ влияют на СКК, находящиеся в кроветворных зонах преимущественного расположения миелоидных и
эритроидных предшественников (Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А.,
1980; Wolf N. С, 1978; Трентин Д. Д., 1982). По мере дифференциации клетка начинает отвечать на дальнедействующие гуморальные стимулы. Эндогенная регуляция всех звеньев гемопоэза осуществляется цитокинами, которые инициируют клеточную пролиферацию, дифференциацию, воспаление, иммунный ответ, апоптоз.
Влияние цитокинов осуществляется через рецепторы на клеточной мембране, которые проводят сигнал в клеточное ядро, где происходит активация соответствующих генов. Цитокины включают
в себя интерлейкины, имеющие цифровые обозначения (ИЛ-1,
ИЛ-2 и т. д.), и ростовые факторы, включая колониестимулирующие факторы (КСФ) с буквенными обозначениями. Основными
продуцентами цнтокинов являются моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты и стромальные элементы — фибробласты, эндотелиальные
клетки и др. (Лурия Е. А., Фриденштейн М. Я., 1981; Теста Н., 1991).
Стволовые кроветворные клетки самообновляются медленно и
при готовности к дифференцировке (процесс коммитирования)
выходят из состояния покоя (С(1-фаза клеточного цикла) и становятся коммитированными. Это значит, что процесс стал необратимым и такие рестриктированные клетки, управляемые соответствующими цитокинами, пройдут все стадии развития вплоть до
конечных зрелых элементов крови, т. е. «погибнут через дифференцировку» (Till J. E., McCulloch Е. А., 1961). Стволовые кроветворные клетки способны дифференцироваться в одном из трех
главных направлений гемопоэза: миелоидном, В- и Т-лимфоцнтарном. Факторы регуляции гемопоэза подразделяют на близкодистантные (для СКК) и дальнедействующие гуморальные ростовые факторы для коммитированных предшественников и других
дифференцирующихся и созревающих клеток. В зависимости от
уровня развития клетки факторы регуляции делятся на 3 основных класса.
1. Факторы, влияющие на ранние СКК. К ним относятся: фактор стволовой клетки (ФСК, или фактор Стила), ФЛТ 3лиганд, колониестимулирующий фактор для гранулоцитопоэза — Г-КСФ, ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-12, а также ингибиторы,
24
Часть 1. Теоретическая гематология
которые тормозят выход СКК в клеточный цикл из состояния покоя, — воспалительный белок макрофагов (М1Р-1а,
ф ) , трансформирующий рост фактор (TGF-(3), фактор некроза опухоли (ФНО), кислые изоферритины и др. Фактор
стволовой клетки экспрессируется фибробластами и эндотелиальными клетками стромы. Он действует на СКК непосредственно, инициируя их вхождение в клеточный цикл,
или влияет на клетку как ко-стимулятор других цитокинов,
например ИЛ-3, являясь синергическим цитокином (Bernstein I. D. et al., 1991). Эта фаза регуляции СКК не зависит от
запросов организма.
2. Срсднедействующие линейно неспецифические факторы:
ИЛ-3, ИЛ-4, ГМ-КСФ (КСФ для грануломоноцитопоэза).
3. Позднедействующие линейно специфические факторы, которые поддерживают пролиферацию и созревание коммитированных предшественников и их потомков. Они включают:
для эритроидной серии клеток — гормон эритропоэтин
(ЭРП), для мегакариоцитов — гормон тромбопоэтин, а также
ИЛ-5, М-КСФ и Г-КСФ (Чертков И. Л. и др., 2002: Огава М.,
1990; Натан Н., Зифф К, 1994).
Эритроидные предшественники отличаются по чувствительности к ЭРП, которая возрастает по мере их созревания. Ранние эритроидные прекурсоры (БОЕ-Э) для своего развития нуждаются в
специфическом стимуляторе роста — бурстстимулирующей активности (БСА). Наибольшей чувствительностью к ЭРП обладают
КОЕ-Э. Присутствие этого гормона также требуется при развитии
эритробластов. иначе клетка погибнет.
Ингибиторы гемопоэза являются плеотропными факторами,
которые могут оказывать как стимуляторное, так и ингибиторное
влияние на различные клетки. Например, TGF-P, стимулирует
предшественников миелопоэза — поздние КОЕ-ГМ и в то же время
прямо ингибирует все виды ранних гемопоэтических предшественников (Axelrad А. А., 1990; Ploemacher R. E. et al., 1993). Для
взаимодействия клеток со стимуляторами и ингибиторами роста
необходима локальная презентация этих факторов. Вероятно, контакты клетка—клетка, клетка—экстрацеллюлярный матрикс опосредованы молекулами адгезии. Кроме этих факторов предположительно существуют и другие, более интимные уровни регуляции
СКК, включающие соединение внутриклеточных образований
смежных клеток через места соединения — лакуны, окна.
К регуляторам гемопоэза относятся также некоторые интерфероны и ядерные белки, например семейства GATA. Стимуляторы и
Глава 1. Кроветворение
25
ингибиторы действуют одновременно, одни и те же клетки вырабатывают как позитивные, так и негативные регуляторы, и этот синергизм определяет понятие «цитокинового каскада». Фаза регуляции гемотюэза средне- и позднедействующими цитокинами является чувствительной к запросам организма. Благодаря влиянию
этих факторов костный мозг способен быстро обеспечить потребности организма в специализированных клетках.
На смену представлению о бессмертии СКК и их неограниченном самоподдержании (способности к неограниченному количеству делений без снижения пролиферативного потенциала и воспроизведению абсолютно идентичных дочерних клеток) пришло
понятие клональной сукцессии, смене клонов СКК в течение жизни организма. В 1965 г. Н. Е. М. Кау и соавторы предложили гипотезу о поочередном участии клонов СКК в гемопоэзе. Клоновая (каскадная) теория получила экспериментальное подтверждение и сегодня имеет много последователей (Чертков И. Л., Дризе Н. И.,
1996; Огава М., 1990). Было доказано, что на протяжении жизни
индивидуума в организме существуют десятки одновременно функционирующих небольших короткоживущих клонов, состав которых меняется в течение 1-4 месяцев, а исчезнувшие клоны никогда больше не появляются. Авторы показали, что различные зоны и
органы кроветворной системы заселены разными локально расположенными клонами, где СКК и совершают свой жизненный цикл.
Существуют СКК как глубокого, так и быстромобилизуемого резерва. Клетки последнего могут возвращаться в состояние покоя
после 1-3 делений. Эти СКК, имеющие уже дифференцировочные
маркеры, способны быстро отвечать на запрос организма. Согласно И. Л. Черткову и Н. И. Дризе СКК закладываются только в эмбриогенезе и затем экономно расходуются в течение жизни, образуя короткоживущие, сменяющие друг друга клоны. Следовательно, система структурирована таким образом, что, несмотря на
отсутствие непрерывного самоподдержания индивидуальных СКК,
имеет место самоподдержание всей популяции стволовых клеток в
целом за счет непрерывно сменяющихся клонов.
Еще одним регулятором гемопоэза является апоптоз — запрограммированная клеточная смерть или генетически обусловленная программа самоубийства. Понятие «апоптоз» было введено
J. F. R. Кегг с соавторами в 1972 г. Учитывая, какое огромное количество клеток крови вырабатывается в организме взрослого человека (более 300 г в сутки и около 5-7 т в течение жизни), очевидно, что для поддержания гомеостаза и сохранения клеточного баланса должен существовать механизм удаления избыточных
26
Часть 1. Теоретическая гематология
клеток. Этим механизмом является апоптоз, и основной закон
клеточной кинетики состоит в том, что в единицу времени рождается и умирает одно и то же количество клеток (Владимирская Е. Б. и др., 1997). Апоптоз необходим для элиминации поврежденных, старых и избыточных или потенциально опасных
клеток. В организме происходит дифференцировка и активация
большого числа лимфоцитов, и только часть их в результате селекции отбирается для выживания. Лимфоциты, не получившие
сигналы выживания, погибают, при этом апоптозу подвергается
75% В-клеток-предшественников и 95% Т-клеток-предшественников (Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 2001). В норме апоптоз, в
отличие от некроза, не представляет собою патологическую форму смерти клеток, и удаление умирающих клеток происходит без
развития воспаления.
Апоптоз — это контролируемое самоперевариванис. в процессе которого клетка сморщивается, происходит конденсация и фрагментация ее ядра, разрушение цитоскелета. Фрагменты апоптической клетки поглощаются фагоцитами. Программа самоуничтожения клетки, для включения которой существуют внутренние и
внешние сигналы, уравновешивается программой ее блокирования. Рецептор, воспринимающий сигнал клеточной смерти, называется АРО-1, или FAS, или CD95 (Nagata S., 1998). Апоптоз
регулируется онкогеном р53 и семейством онкогенов BCL-2, причем ген р53 индуцирует апоптоз, a BCL-2 и BCL-X его блокируют.
Недавние работы показали, что митохондрии, семейство генов
BCL-2 и клеточные белки семейства ICE (IL-1-converting enzime)
взаимодействуют внутри клетки в регуляции апоптоза. Так, большая часть противоопухолевой терапии, такая как химиотерапия,
облучение, опосредуют клеточную смерть через активацию белков ICE (Debatin K.-M., 1999). Эти механизмы еще недостаточно
ясны, но нарушение взаимодействия апоптоз—ингибиция апоптоза может привести к развитию тяжелых заболеваний. В результате
мутации гена р53 клетка теряет способность к апоптозу и могут
возникнуть опухоль (рак, лейкоз) или аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка,-гломерулонефрит) (Thompson С. В., 1995). Повышенное саморазрушение клеток лежит в
основе патогенеза таких заболеваний, как апластическая анемия,
миелодиспластический синдром, СПИД, болезни Альцгеймера и
Паркинсона (Барышников А. Ю., 2001; Maciejewski J. P. et al,
1995; Gersuk G. M. et al., 1996). Причиной возникновения опухоли
может быть снижение противоопухолевого иммунного надзора
вследствие усиления апоптоза иммунокомпетентных клеток. В здо-
Глава 1. Кроветворение
27
ровом организме эти процессы уравновешены и апоптоз является
важным физиологическим регулятором гемопоэза.
Номенклатура клеток костного мозга и крови
Костный мозг включает кроветворную ткань (паренхима — красный костный мозг) и клетки стромального микроокружения. Клетки стромы костного мозга представлены большим количеством
высокоспециализированных элементов, принимающих прямое участие в регуляции гемопоэза. К ним относятся фибробласты, адипоциты (жировые клетки), эндотелиальные, эпителиальные, адвентициальные клетки. Среди клеток микроокружения кроветворной
ткани обычно рассматривают и такие, как остеокласты, мастоциты, макрофаги, хотя они являются дериватами кроветворных клеток. К клеткам микроокружения относятся остеобласты, участвующие в образовании кости. Жизненный цикл пролиферирующих.
дифференцирующихся и созревающих кроветворных клеток совершается в костном мозге, подчиняясь сложным законам регуляции, опосредованным множеством взаимодействующих факторов,
способных обеспечивать интерактивные связи клетки и ее микроокружения. К этим факторам относятся многочисленные цитокины, включающие ростовые стимулирующие факторы и ингибиторы роста, различные интерлейкины, а также интерфероны, ядерные белки, факторы внеклеточного матрикса, молекулы адгезии,
гормоны, белки, контролирующие апоптоз, и др. Данные факторы
действуют на кроветворные клетки, направляя их к пролиферации
или дифференцировке, и многие из них продолжают оказывать
свое влияние на клетки, циркулирующие и находящиеся в тканях.
Отдел морфологически узнаваемых клеток включает бластные
клетки-предшественники зрелых клеток всех клеточных линий,
которые, пройдя заключительные этапы дифференцировки, через
несколько промежуточных стадий развития превращаются в зрелые клетки, готовые выполнять свои функции.
Первой морфологически распознаваемой клеткой нейтрофильного ряда в костном мозге является миелобласт. Его пролиферация и дифференциация под влиянием позднедействующих регуляторных факторов приводит последовательно к образованию
нейтрофильного промиелоцита, миелоцита, метамиелоцита, палочкоядерного и сегментоядерного нейтрофилов.
Процесс дифференциации и созревания эозинофилов и базофилов происходит аналогично таковому у клеток нейтрофильного
28
Часть 1. Теоретическая гематология
ряда: эозинофильный и базофильный бласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты и, наконец, палочко- и сегментоядерные
эозинофилы и базофилы.
Монобласт является предшественником линии морфологически идентифицируемых моноцитарных клеток. Его дифференцировка и созревание приводят к образованию промоноцита, затем
моноцита. Моноциты после циркуляции в периферической крови
поступают в ткани, где превращаются в макрофаги.
В отделе морфологически распознаваемых клеточных элементов идентификация клеток эритроидной линии становится возможной начиная с эритробласта (проэритробласта). Последующая
эритроидная дифференцировка приводит к образованию базофильного нормобласта (нормоцита), затем, по мере гемоглобинизации
клетки, полихроматофильного и оксифильного нормобласта (нормоцита) — последней ядросодержащей клетки эритроидной линии. После энуклеации оксифильного нормобласта образуется ретикулоцит и наконец зрелый эритроцит.
Морфологическое распознавание клеток мегакариоцитарного
ряда в костном мозге начинается с мегакариобласта. В результате
эндомитоза и полиплоидизации мегакариобласт превращается в
промегакариоцит, базофильный, полихроматофильный и оксифильный мегакариоциты. Эффекторными клетками мегакариоцитарного ряда являются тромбоциты, главным продуцентом которых служит полихроматофильный мегакариоцит.
Лимфобласты — клетки-предшественники Т- и В-лимфоцитов
в составе V отдела кроветворных клеток — подразделяются на
Т-лимфобласты и В-лимфобласты, количество которых в костном
мозге слишком мало, а морфологические характеристики недостаточно убедительны для их распознавания.
Следующими за лимфобластами клетками этого ряда идут Т- и
В-пролимфоциты, которые созревают в зрелые Т- и В-лимфоциты.
Жизненный цикл этих клеток после костного мозга проходит в
основном в лимфоидных органах, куда они поступают после циркуляции в крови.
Продолжением В-лимфоцитарной серии клеток является линия плазматических клеток, которые берут свое начало от В-иммунобласта — активированного антигеном В-лимфоцита. В этом ряду
самой молодой клеткой является плазмобласт, который созревает
в проплазмоцит и плазмоцит — клетку иммунного ответа, продуцирующую антитела. Конечные стадии дифференциации и созревания клеток всех 8 клеточных линий преодолевают костномозговой барьер и поступают в кровеносное русло. Вместе с жидкой
Глава 1. Кроветворение
29
частью (плазмой) клетки, именуемые форменными элементами,
образуют периферическую кровь.
Огромный пул циркулирующих и функционирующих в тканях
кровяных клеток представляет собою чрезвычайно гетерогенный
состав. Это объясняется очень тонкой дальнейшей специализацией клеток и нахождением их в различных зонах распределения и
влияния.
Клетки так называемой белой крови — лейкоциты — включают
палочкоядерные и сстментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты и плазматические клетки. Клетки
красной крови представлены ретикулоцитами и эритроцитами. Еще
одна категория клеток — кровяные пластинки, или тромбоциты.
Непрерывное поступление этих клеток из костного мозга и естественная адекватная убыль обеспечивают постоянство и равновесие клеточного состава крови.
Литература
Афанасьев Б. В., Алмазов В. А. Родоначальные кроветворные клетки. Л.: Наука.
1985.204 с.
Балашова В. А., Абдулкадыров К. М. Клеточный состав гемопоэтической ткани
печени и селезенки у плодов человека // Арх. анат., гнет, и змбр. 1984. Т. 4.
С. 80-83.
Барышников А. Ю. Программированная клеточная смерть (Апоптоз)// Онкогематология / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 36-43.
Владимирская Е. В., Масчан А. А., Румянцева А. Г. Апоптоз и сю роль в развитии
опухолевого роста // Гематол. и трансфузиол. 1997. Т. 42. № 5. С. 4-9.
Воробьев А. И. Клетка // Руководство по гематологии / Под ред. А. II. Воробьева. М., 2002. Т. 1.С. 1-28. "
Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Шерстобоев Е. Ю. Механизмы локальной регуля-
ции кроветворения. Томск, 2002. С. 8-76.
Дыбан А. П., Дыбан П. А. Стволовые клетки в экспериментальной и клинической медицине // Мед. академ. журн. 2002. Т. 2, № 3. С. 3-24.
Лурия Е. А., Фриденштейн А. Я. О стромальной и Т-клеточной регуляции стволовых кроветворных клеток // Терапевт, архив. 1981. Т. 53, № 9. С. 116-120.
Натан Д. Г., Зифф К. А. Регуляция кроветворения // Гематол. и транефузиол.
1994. Т. 39, №2. С. 3-10.
Огава М. Стволовая кроветворная клетка: стохастическая дифференцировка и
гуморальный контроль пролиферации // Гематол. и трансфузиол. 1990. Т. 35,
№ 2. С. 24-32.
Приндулл Г. Гемопоэз в желточном мешке // Гематол. и трансфузиол. 1998.
Т. 43, №3. С. 14-15.
Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.: Медицина, 1985.
2 т.
Сухих Г. Т., Малайцев В. В., Богданова И. М. Мезенхимальная стволовая клетка // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2002. № 2. С. 124-131.
Глава 2
ПУНКЦИЯ КОСТНОГО МОЗГА.
МЕТОДИКА ЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ. МИЕЛОГРАММА
Пункция костного мозга производится главным образом при
заболеваниях системы крови для оценки клеточного состава костного мозга и его функционального состояния, установления диагноза и уточнения стадии заболевания (рецидив, ремиссия при лейкозах), оценки эффективности проводимой терапии, исключения
(или подтверждения) фазы лейкемпзации злокачественных лимфом, обнаружения метастазов рака.
Наиболее простой и доступный способ получения костного мозга
из грудины, который применяется до настоящего времени, был
предложен в 1927 г. М. И. Аринкиным. Пункция костного мозга
производится специальными иглами (Кассирского, швейцарской
фирмы Unimed, разовыми иглами итальянской фирмы Bauer и
др.). Костный мозг получают посредством аспирационной биопсии
в области тела грудины на уровне третьего-четвертого межреберий или в области рукоятки грудины, а также гребня или бугристости подвздошной кости. Место прокола обрабатывают раствором
йода или другим антисептиком. Проводится местная анестезия 12% раствором новокаина послойно: кожа—подкожная клетчатканадкостница.
Пункция костного мозга производится врачом в процедурном
кабинете при соблюдении правил асептики. Пункционная игла и
шприц должны быть тщательно стерилизованы и обезвожены эфиром. Иглу вводят строго перпендикулярно поверхности грудины в
костномозговой канал; щиток иглы устанавливают на расстоянии
0,8-2 см от грудины, в зависимости от конституции пациента. После извлечения мандрена из иглы на нее насаживается 10-20-миллиметр. вый шприц и производится аспирация костного мозга, после чего иг.,у извлекают и обрабатывают место прокола антисепти-
Глава 2. Пункция костного мозга. Миелограмма
35
ком. Количество аспирированной взвеси клеток зависит от объема
и характера предполагаемых исследований. Для целей диагностики достаточно 0,1-0,2 мл во избежание примеси крови, однако для
проведения цитогенетических, культуральных, иммунологических,
цитохимических и других исследований требуется несколько миллилитров костного мозга. Костный мозг из шприца помещают на
парафинированное часовое или предметное стекло и часть материала немедленно вносят в пробирки для определения клеточности
костного мозга и количества мегакариоцитов. Сразу после этого на
предметных стеклах углом шлифованного стекла делают тонкие
мазки для оценки клеточного состава костного мозга. Во избежание свертывания костного мозга все перечисленные процедуры
делаются очень быстро.
Методика исследования
Подсчет миелокариоцитов производится в счетной камере Горяева под световым микроскопом. Пунктат разводят уксусной кислотой, для этой цели во время пункции в одну пробирку с 4 мл 35% уксусной кислоты вносят 0,02 мл клеточной взвеси (для подсчета миелокариоцитов), во вторую пробирку с 0,4 мл уксусной
кислоты помещают 0,02 мл клеточной взвеси (для подсчет;! мегакариоцитов). Содержимое пробирок тщательно перемешиьают п
заполняют счетные камеры. Через 2 минуты в камере Горяеь а под
микроскопом подсчитывают количество миелокариоцитов с пересчетом на 1 мкл. Подсчет ядросодержащих клеток костного мезга
производят в 100 больших квадратах и искомую цифру определяют по формуле
их 200x250
= п х500,
100
где х — количество миелокариоцитов в 1 мкл пунктата;
п — количество миелокариоцитов в 100 квадратах сетки счетной камеры;
200 — разведение пунктата;
250 — множитель для приведения к 1 мкл.
Число миелокариоцитов в 100 больших квадратах достаточно
просто умножить на 500. Нормальные показатели и количество
миелокариоцитов колеблется в довольно широких пределах — от
42 до 195 х 109/л (Соколов В. В., Грибова И. А., 1972). Клиническое
значение имеет как повышение, так и понижение клеточности костного мозга.
х=
36
Часть 1. Теоретическая гематология
Подсчет мегакариоцитов осуществляется в счетной камере Фукса -Розенталя. Разведенным пунктатом заполняют камеру и подсчитывают мегакариоциты на всей площади сетки камеры. При
расчете на 1 мкл костномозговой взвеси используют формулу
«х20
,
3,2
где х — количество мегакариоцитов в 1 мкл взвеси;
п — количество клеток в камере;
20 — степень разведения;
3,2 — объем камер Фукса-Розенталя в мкл.
У здоровых людей нормальные показатели мегакариоцитов колеблются от 50 до 150 в 1 мкл (0,050-0,150 х 109/л) (Соколов В. В.,
Грибова И. А., 1972; Лабораторные методы исследования в клинике, 1987; Грибова И. А., Воробьев А. И., 2002; Медицинские лабораторные технологии, 1998).
х=
Миелограмма
Состав костного мозга в норме подвержен значительным колебаниям и зависит от возраста обследуемого, функционального состояния костного мозга в момент пункции и качества произведенной пункции. Разбавленность пунктата периферической кровью и
фиброз костного мозга сильно влияют на клеточный состав миелограммы. В световом микроскопе анализируют мазки костного
мозга, окрашенные принятым в лаборатории методом (по Романовскому-Гимзе, Нохту, Крюкову-Паппенгейму и др.). Анализ
начинают с просмотра мазков под 100-кратным увеличением с
целью определения клеточности пунктата, ориентировочной оценки его состава, количества мегакариоцитов, наличия атипичных
клеток и их скоплений. Затем на окрашенный сухой мазок наносят
каплю иммерсионного масла и начинают подсчет всех попадающих в поле зрения окуляра ядросодержащих клеточных элементов
в количестве 500 или более клеток. Считают в различных участках
нескольких (2-3) препаратов, используя 1000-кратное увеличение, иммерсионный объектив и счетные клавишные машинки. После подсчета 500 клеточных элементов определяют содержание всех
клеток в составе их клеточных рядов (в %), располагая их в зависимости от стадии созревания. Распределенные таким образом клеточные элементы всех клеточных линий представляют собой миелограмму. В состав миелограммы входят все ядросодержащие клетки нейтрофильного ряда, начиная с миелобластов и заканчивая
сегментоядерными нейтрофилами (в среднем 60,8%), все эозино-
37
Глава 2. Пункция костного мозга. Миелограмма
филы и базофилы (-3,2% и 0,2% соответственно), клетки эритроидного ряда от эритробласта до оксифильного нормобласта
(-20,5%), моноциты (-1,9%), лимфоидные элементы (-9%), а также плазмоциты, мегакариоциты. Отмечают наличие тучных клеток, макрофагов, остеобластов, остеокластов и др. (см. табл. 1; по:
Грибовой И. А., Воробьеву А. И., 2002).
Таблица 1
Клеточный состав костного мозга в норме
Показатели
миелограммы
Ретикулярные клетки
Бласты
Миелобласты
Нейтрофильные клетки:
промиелоциты
миелоциты
метамиелоциты
палочкоядерные
cei ментоядерные
Все нейтрофильные элементы
Эозинофилы (всех генераций)
Базофилы
Эритробласты
Пронормоциты
Нормоциты
базофильные
полихроматофильные
оксифильные
Все эритроидные элементы
Лимфоциты
Моноциты
Плазматические клетки
Количество мегакариоцитов (клеток в 1 мкл)
Лейкоэритробластическое отношение
Индекс созревания нейтрофилов
Количество миелокариоцитов (тыс. в 1 мкл)
Среднее
Предел нормальных
значение, %
колебаний
0.9
0.6
1.0
0,1-1,6
0.1-1,1
0,2-1,7
2,5
1,0-4,1
7.0-12,2
8,0-15,0
12,8-23.7
13.1-24.1
52,7-68,9
0,5-5,8
0-0,5
0.2-1,1
0,1-1,2
9,6
11.5
18,2
18,6
60.8
3.2
0.2
0,6
0.6
3.0
12,9
3,2
20,5
9.0
1.9
0,9
3,3
0.7
118,4
1.4^,6
8.9-16,9
0,8-5,6
14,5-26.5
4,3-13,7
0,7-3,1
0,1-1,8
50-150
2,1-4,5
0,5-0,9
41,6-195,0
Определяют лейкоэритробластическое соотношение (отношение клеток белого ряда к клеткам красного ряда), которое в норме
равно 4 (3) : 1. При необходимости высчитывают индексы созревания нейтрофилов (0,6-0,8), эритрокариоцитов (0,8-0,9), парциальные эритрограммы и мегакариоцитограммы (Воробьев А. И.,
38
Часть 1. Теоретическая гематология
1985; Абрамов М. Г., Воробьев А. И., 2002). Миелограмму выписывают на специальном бланке, где кроме количественного анализа
клеточного состава пунктата (содержание клеток в %) производят
качественный анализ — морфологическое описание клеточных элементов в составе их клеточных рядов. Прежде всего дают оценку
клеточностн пунктата, например: пунктат костного мозга клеточный, гиперклеточный, скудный или клеточность пунктата нормальная, умеренная, пониженная, повышенная. Затем дается описание
каждого клеточного ряда, начиная с количества клеток и их соотношения внутри него. Употребляют выражения: росток сохранен,
в пределах нормальных колебаний, на нижней границе нормы; или
сужен, редуцирован, угнетен; или, напротив, усилен, раздражен,
гиперплазирован. Отмечают увеличение или уменьшение содержания клеток какой-либо стадии созревания (например: содержание миелобластов увеличено до 15%), подчеркивают особенности
морфологии клеток, их созревания, признаки дисплазии, наличие
патологических включений в цитоплазме (палочки Ауэра в лейкозных миелобластах и др.) (Коленкин С. М., Михеева А. И., 1999).
Таким образом, после тщательного просмотра мазков, подсчета
миелограммы и последующего анализа всех клеточных линий результат аналитического исследования мазков костного мозга выписывается на бланке с цифровой и описательной характеристиками пунктата, заключением по каждому клеточному ряду и предполагаемым диагнозом, основанным на данных лабораторных
исследований.
Литература
Абрамов М. Г., Воробьев А. И. Костный мозг, клеточный состав. Пункционная
диагностика //' Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.,
2002. Т. 1.С. 47-53.
Грибова И. А., Воробьев А. И. Гематологическая норма // Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М„ 2002. Т. 1. С. 61-63.
Коленкин С. М., Михеева А. И. Основные правила исследования пунктата костного мозга // Клинич. лаб. диагностика. 1999. № 2. С. 41-43.
Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /11од ред. В. В. Меньшикова. М„ 1987. С. 140-145.
Медицинские лабораторные технологии: Справочник / Под ред. А. II. Карпищенко. СПб.: Интермедицина, 1998. 406 с.
Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М.: Медицина, 1985.
Т. 2. 448 с.
Соколов В. В., Грибова И. А. Гематологические показатели здорового человека.
М„ 1972.
Глава 3
МОРФОЛОГИЯ И ФУНКЦИИ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
И КРОВИ
Морфологическое распознавание клеток костного мозга становится возможным, начиная с бластных клеток V отдела костномозгового кроветворного пула (Чертков И. Л. и др., 2002). Властные
клетки предшествуют созревающим и зрелым клеткам костного
мозга и подразделяются на бласты миелоидной и лимфоидной линий. Миелопдные бластные клетки включают миелобласты, монобласты, эритробласты и мегакариобласты. Миелобласты подразделяются в свою очередь на 3 гранулоцитарных типа: бласты нейтрофильные, базофильные и эозинофильные. Лимфоидные клетки
также имеют бласты, предшествующие В- и Т-лимфоцитам, а именно Т-лимфобласты и В-лимфобласты.
Нейтрофильные гранулоциты
Нейтрофильный миелобласт созревает из унипотентной клетки-предшественника гранулоцитопоэза и затем — нейтрофилопоэза (в агаровой культуре из колониеобразующей единицы гранулоцитопоэза — КОЕ-Г и колониеобразующей единицы нейтрофилопоэза — КОЕ-Нейтр). Его диаметр — 15-20 мкм, ядро круглое, с
нежнозернистой структурой ядерного хроматина, 2-4 нуклеолами. Цитоплазма умеренная, голубого или синего цвета. Редкие миелобласты содержат в цитоплазме единичные азурофильные гранулы. Количество миелобластов в норме составляет в среднем 1%
миелокариоцитов. Пролиферация и созревание миелобластов под
влиянием специфических цитокинов приводит к образованию более зрелых клеток — промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов.
40
Часть 1. Теоретическая гематология
Нейтрофильный промиелоцит — самая крупная клетка этого
ряда, ее диаметр может достигать 25 мкм. Округлое ядро, расположенное несколько эксцентрично, имеет нежнозернистую структуру хроматина, четко прослеживаются 1-3 ядрышка. Цитоплазма
более широкая, чем у миелобласта, голубая или базофильная и
содержит яркую азурофильную (окрашивающуюся азуром) зернистость, которая представляет собою первичные лизосомальные
гранулы. Гранулы содержат миелопероксидазу, кислую фосфатазу,
(3-глюкуронидазу, арилсульфатазу, лизоцим, сульфатированные
мукополисахариды, основные белки и др. На стадии промиелоцита начинают формироваться вторичные гранулы. В миелограмме
определяется 1-4% промиелоцитов.
Миелоцит — более зрелая клетка, ее размер меньше, чем размер
промиелоцита (12-15 мкм). Это последняя клетка данного ряда,
способная к делению. Эксцентрично расположенное овальное или
бобовидное ядро отличается более грубой структурой хроматина.
В «молодых» миелоцитах можно видеть отчетливые нуклеолы, в
более зрелых миелоцитах ядрышки не видны. Цитоплазма клетки
уже не базофильная, а полихроматофильная, розоватая или сероголубоватая. Кроме первичных она содержит вторичные гранулы,
более мелкие, розовато-коричневые, а позднее в ней появляются
еще более мелкие — третичные гранулы. Маркером вторичных гранул является щелочная фосфатаза. Содержание миелоцитов в костном мозге колеблется от 7 до 12%.
Нейтрофильный метамиелоцит и все последующие стадии созревания клеток этой серии уже не способны к делению (Fibbe W. Е.,
Ploemacher R. Е., 1999). Диаметрметамиелоцита — 12-14мкм,ядро
бобовидное, грубое, ядрышки не видны. Ядерно-цитоплазматическое соотношение низкое, цитоплазма светлая, розоватая и содержит мелкую специфическую зернистость. Содержание метамиелоцитов в костном мозге — 8-15%.
Небольшая часть палочкоядерных нейтрофилов и сегментоядерные нейтрофилы, представляющие из себя зрелые, функционально полноценные клетки, способны преодолевать костномозговой барьер и выходить в кровеносное русло. Ядро палочкоядерного нейтрофила лентовидной формы и может быть изогнуто в виде
подковы, закручено и т. д. Ядро сегментоядерного нейтрофила имеет
2-4 фрагмента, соединенных мостиками из ядерной мембраны и
тонких нитей хроматина. Структура хроматина грубая, цитоплазма розоватого цвета и содержит мелкую специфическую коричневатую зернистость и небольшое количество первичных азурофильных гранул. Содержание палочко- и сегментоядерных нейтрофи-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
41
лов в костном мозге колеблется от 25 до 47%. Увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов в периферической крови (в норме 2-3,5%) является чаще всего следствием воспаления, бактериальной инфекции. Сегментоядерные нейтрофилы созревают в
костном мозге за 1-2 дня, после чего поступают в периферическую
кровь, образуя 2 пула — циркулирующий и пристеночный, в соотношении 1 :3 (Френкель М. А., 2001). В крови нейтрофилы
остаются 6-8 часов перед тем как проникнуть в ткани, где они
выполняют свои основные функции фагоцитов (Тотолян А. А.,
Фрейндлин И. С, 1999). Среднее содержание клеток нейтрофильного ряда в костном мозге составляет около 60% миелокариоцитов.
Функции нейтрофилов
Нейтрофилы, называемые также микрофагами, являются главными эффекторными клетками при остром воспалении, первой
линией защиты, и их основные функции заключаются в фагоцитозе — захвате и переваривании чужеродного материала (микробных
агентов, грибов и других частиц) и секреции цитокинов. Работы
И. И. Мечникова (1898) явились пионерскими в открытии явления фагоцитоза, а П. Эрлих (1900) обосновал секреторную способность нейтрофилов. Учитывая относительно ограниченную длительность их жизни, понятно, что большие количества нейтрофилов должны ежедневно восполняться, особенно при возникновении
инфекции, когда их количество увеличивается в 10-30 раз. Во
взрослом организме в 1 минуту продуцируется до 120 млн нейтрофилов (Dexter Т. М., 1984). Быстрая трансмиграция нейтрофилов через
клетки эндотелия опосредована действием многих цитокинов,
в том числе хемокинов, которые являются медиаторами воспаления, активируя нейтрофилы. Они продуцируются многими
клетками крови и тканей, и прежде всего моноцитами, макрофагами, Т-лимфоцитами, нейтрофилами, фибробластами и эндотелием
сосудов, на поверхности которых происходит маргинация нейтрофилов. К хемокинам для нейтрофилов относятся ИЛ-1, ИЛ-8,
ФНО (фактор некроза опухоли) и др. Хемоаттрактантной активностью — способностью обеспечить направленное движение фагоцита к очагу воспаления — обладают также некоторые компоненты системы комплемента; пептиды, секретируемые тучными клетками; гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
(Г-КСФ); эндотоксины бактерий; N-формил-олиго-пептиды
(FMLP), выделяемые из бактерий; содержимое лизосом разруша-
42
Часть 1. Теоретическая гематология
ющихся нейтрофилов; вазоактивные амины (серотонин, гистамин)
и многие другие факторы. Прикреплению нейтрофилов к эндотелию сосудов способствуют молекулы адгезии — интегрины, к которым нейтрофилы экспрессируют рецепторы. После трансмиграции пейтрофилов в ткань и их встречи с антигеном начинается
сложный процесс фагоцитоза — захвата чужеродного объекта нейтрофилом. Нейтрофил может захватывать только опсонизированные частицы. Опсонизация осуществляется специфическими сывороточными факторами, опсонинами, которые обволакивают бактерии или другие антигены, готовя их к фагоцитозу. К опсонинам
относятся некоторые компоненты системы комплемента, иммуноглобулины, фибронектин, липополисахарид-связывающий белок
(LBP) и другие факторы, которые соединяются со специфическими антигенами бактерий и обеспечивают их адсорбцию к нейтрофилу. Далее нейтрофил путем инвагинации мембраны формирует
фагосому, окружающую объект фагоцитоза, и замыкает его в полости фагосомы. Гранулы нейтрофила перемещаются к фагосоме и
проникают в нее. Происходит внутриклеточная дегрануляция.
Внутри образованной фаголизосомы происходит киллинг микроорганизмов протеолитическими ферментами, содержащимися в
гранулах, а также за счет образующихся в результате «респираторного взрыва» перекиси водорода и гидроксильных радикалов при
кислородзависимом механизме киллинга. Последняя стадия фагоцитоза — переваривание. В результате эффективного фагоцитоза
нейтрофил погибает. Секреторная функция нейтрофилов опосредована наличием в их гранулах многих секреторных продуктов,
взаимодействующих как с микроорганизмами, так и с окружающими тканями. Нейтрофилы высвобождают активные вещества путем внутриклеточной (при фагоцитозе) и внеклеточной дегрануляции. При внеклеточной дегрануляции, когда объект слишком
велик и не может быть включен в фагосому, происходит экзоцитоз — выброс содержимого гранул в межклеточное пространство.
Нейтрофил взаимодействует с инфицированной клеткой также
через межклеточные контакты. В месте контакта образуются трансмембранные каналы, через которые проходит секреторное содержимое гранул нейтрофила, и это может привести к дегенерации
клеточных органелл и ядра зараженной клики и ее деструкции.
Факторами лнзосомальных гранул являются протеазы, фосфолипазы, гликозидазы. лизоцим, другие белки и пептиды, лактоферрин и эластаза (Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1983; Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 1999). Первичные и вторичные гранулы нейтрофилов содержат более 20 протеолитических ферментов.
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
43
Эозинофильные гранулоциты
Эозинофильный миелобласт происходит из монопотентной
эозпнофилыюй клетки-предшественника. Существуют доказательства, что эозинофилы имеют также общую с базофилами бипотентную клетку-предшественника (Тотолян А. А., Фрейндлин И. С,
2001). Эозинофильный миелобласт редко встречается в костном
мозге, и распознавание клеток этой линии начинается с зозинофильного промиелоцита. Это крупная клетка с округлым тонкодисперсным ядром и 2-3 нуклеолами. Цвет цитоплазмы плохо различим из-за обилия зернистости. На стадии промиелоцита наблюдаются 2 вида гранул: преобладающие первичные крупные почти
базофильные гранулы и специфические вторичные эозинофильные (окрашиваются кислым эозином). Вторичные гранулы активно формируются в основном на стадии миелоцита. Миелоцит имеет меньший диаметр, более грубое округлое ядро, плохо контурируемые ядрышки. Цитоплазма заполнена обильной специфической
эозшюфи.тьной зернистостью ярко-оранжевого цвета и содержит
очень мелкие третичные гранулы, содержащие кислую фосфатазу
и арилсульфатазу. Входящая в состав вторичных гранул эозинофильная пероксидаза вместе с перекисями и галлоидами обеспечивает киллерный, противопаразитарный эффект эозинофилов.
Миелоцит созревает в метамиелоцит, затем в палочко- и сегментоядерный эозинофил. Диаметр последнего 12-15 мкм. Ядро менее
фрагментировано, чем у зрелого нейтрофила, и обычно состоит
из двух долей. В костном мозге эозинофилы остаются в течение 25 дней, а в кровеносном русле — 6-12 часов, затем мигрируют в
ткани. Тканевые эозинофилы расположены в слизистых тканях
дыхательного, пищеварительного и мочеполового трактов, ближе
к поверхности. Эозинофилы составляют 0,4-5% (в среднем 2,5%)
миелокариоцитов костного мозга.
Функции эозинофилов
Главные функции эозинофилов — клеток иммунной системы —
заключаются в участии в механизмах защиты при гельминтозах,
паразитозах и в. реакциях гиперчувствительности немедленного
типа, связанных с острой аллергией. Эозинофилы предупреждают
генерализацию иммунного ответа. В уничтожении антигенов (паразитов, аллергенов) участвуют различные факторы, включая гистамин базофилов и тучных клеток (Струков А. И., Кауфман О. Я..
1989). Эозинофилы контролируют избыточное выделение гистамина и нейтрализуют его. Они способны ограничить очаг пораже-
44
Часть 1. Теоретическая гематология
ния с помощью местного некроза и фиброзирования вокруг этого
участка (Виноградова Ю. Э., 2002). Эозинофилы способны быстро проникать из сосудистого русла в ткани и концентрироваться
там в больших количествах в очаге поражения. Это приводит сначала к эозинофилопении, так как эозинофилы не формируют пристеночный пул, но ответное усиление продукции эозинофилов в
костном мозге сопровождается нормализацией их уровня в периферической крови и затем эозинофилией (Тотолян А. А., ФрейндлинИ. С, 2001).
Факторами активации эозинофилов служат липиды (лейкотриены), пептиды, белки (иммуноглобулины, в частности IgG),
компоненты комплемента (СЗа, С5а), некоторые цитокины (ИЛ-3,
ИЛ-5-и ГМ-КСФ — колониестимулирующий фактор для грануломоноцитопоэза). Хемотаксическими факторами для эозинофилов,
опосредующими их движение к месту поражения в тканях, являются гистамин, иммунные комплексы, ИЛ-8, воспалительный белок макрофагов (М1Р-1а) и фактор RANTES (регулятор активации, экспрессируемый и секретируемый Т-лимфоцитами) — один
из основных хемоаттрактантов для эозинофилов. RANTES способен быстро и в больших количествах рекрутировать эозинофилы в
очаг поражения.
Эозинофилы обладают цитотоксичностью по отношению к гельминтам. Они способны соединяться с паразитами и вводить содержимое своих гранул в их цитоплазму. Специфические белки цитоплазмы эозинофилов повреждают личинки паразитов. При реализации «респираторного взрыва» эозинофилы образуют активные
метаболиты кислорода — токсичные кислые радикалы. Эозинофилы обладают способностью к фагоцитозу и киллингу чужеродных
клеток. Они способны к фагоцитозу бактерий, грибов и других
частиц, осуществляя сходный с нейтрофилами метаболизм и механизм дегрануляции, но не столь эффективный (Козинец Г. И., Макаров В. А., 1997). Эозинофильные катионные белки принимают
участие в реакциях воспаления и механизме свертывания крови,
повреждая эндотелий сосудов и эндокард при длительных гиперэозинофилиях.
Секреторная функция эозинофилов состоит, в продукции и секреции ИЛ-2, ИЛ-3, ФИО, ИЛ-4, ИЛ-5, ИНФ-у (гамма-интерферон). Цитоплазматические гранулы эозинофилов секретируют
большое количество катионных белков, ферментов, в том числе
эозинофильную миелопероксидазу, арилсульфатазу В, гистаминазу и фосфолипазу D, но не содержат, в отличие от нейтрофилов и
моноцитов, лизоцим.
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
45
Базофильные гранулоциты
Базофилы имеют монопотентную клетку-предшественника базофилов (в культуре клеток — КОЕ-Баз — колониеобразующая
единица базофилов). Есть доказательства того, что базофилы имеют общую с эозинофилами бипотентную клетку-предшественника, дифференцирующуюся из общей гранулоцитарной клетки-предшественника (Тотолян А. А., Фрейдлин И. С, 2001). Базофильный
бласт — очень редкая клетка, которую обычно не удается увидеть в
костном мозге здорового человека. Базофильный промиелоцит и
миелоцит также очень редкие клетки. Миелограмма содержит всего 0,1-0,5% этих клеток. Базофильный промиелоцит и миелоцит
имеют ядра округлой или овальной формы с трудноразличимой
структурой ядерного хроматина, особенно когда гранулы покрывают ядро клетки. Зрелые базофилы в диаметре составляют 810 мкм, их ядра отличаются неопределенной формой, иногда билобулярной, лопастной и окрашены в фиолетово-розовый цвет.
В клетках этой линии определяется специфическая крупная метахроматическая (отличная от цвета красителя) темно-фиолетовая,
не обильная зернистость. По причине ее водорастворимости она
частично теряется при окраске, и на месте гранул остаются пустоты, вакуоли. Базофилы, как и тканевые тучные клетки (мастоциты), являются гистаминсодержащими клетками (Valent P. et al.,1990).
В процессе созревания базофилов и тучных клеток в зоне их пластинчатого комплекса происходит синтез гепарина и содержимое
гранул формируется путем образования комплекса белок-гистамин-гепарин. Базофилы находятся в крови в течение 6 часов, после чего поступают в ткани, где по истечении 1-2 суток, после дегрануляции, выброса гистамина и других веществ погибают (Проценко В. А. и др., 1987).
В росте и созревании базофилов принимают участие ИЛ-3,
ГМ-КСФ, ИЛ-5. В регуляции базофилов особая роль отводится
ИЛ-4, для которого на его клеточной мембране имеется много рецепторов. ИЛ-4 — мультипотентный лимфокин, он играет важную
роль в регуляции иммунного ответа и во взаимодействии различных гемопоэтических клеток. Существуют доказательства, что
ИЛ-4 является важным медиатором роста и активации базофилов
и тучных клеток, регулируя продукцию IgE и В-клеток (Valent P.
et al., 1990).
Количество базофилов возрастает при миелопролиферативных
заболеваниях (хроническом миелолейкозе, истинной полицитемии,
базофильных лейкозах) и уменьшается в начале воспалительного
Часть 1. Теоретическая гематология
процесса и особенно аллергических реакций типа крапивницы,
бронхиальной астмы, характеризующихся гиперчувствительностью немедленного типа, за счет быстрого перехода базофилов в
ткани. Тканевые тучные клетки очень варьируют в размерах (от 5
до 30 мкм). Они имеют неопределенное, скорее округлое ядро и
большое количество довольно крупных красно-фиолетовых гранул. В них выявляют полисахариды, амины, металлы, ферменты,
белки, ферменты триптазу и химазу. Триптаза снижает свертываемость крови и является маркером анафилактической реакции. Мастоциты содержат много органелл — рибосомы, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Рецептор к IgE
является главным рецептором на поверхности тучных клеток, которые, как и базофилы, отвечают секрецией гистамина на опосредованную IgE активацию. Кроме того, они экспрессируют рецепторы к IgG, CD28 и молекулам адгезии. Тучные клетки наряду с
базофилами ведут свое начало от общей клетки-предшественника
гранулоцитопоэза (Чертков И. Л. и соавт., 2002). Доказательства
того, что базофилы и тучные клетки принадлежат к одной и той
же популяции клеток, приводят Т. Nakahata и соавторы (1982).
Клетка-предшественник тканевых базофилов зкспрессирует антиген CD34, маркер ранних миелоидных предшественников (Тотолян А. А., Фрейндлин И. С, 2001). Специфическим маркером мастоцитов является CD 123. В развитии тучных клеток принимают
участие ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИНФ-у (гамма1
интерферон), TGF-p (трансформирующий рост фактор), ГМ-КСФ,
IgE. В слизистых тканях описаны слизистые (атипичные) тучные
клетки, которые называют глобулярными лейкоцитами. Тучная
клетка представлена в тканях ЖКТ, легких, урогенитальном тракте, в соединительных тканях вблизи сосудов, в коже, дыхательных путях.
Функции базофилов и тучных клеток
Базофилы и тканевые мастоциты способны к фагоцитозу, но их
главная функция связана с высоким содержанием в их гранулах
гистамина — главного медиатора реакции, гиперчувствительности
немедленного типа (Струков А. И., Кауфман О. Я., 1989). Гистамин — двуосновной вазоактивный амин, вызывающий сокращение
гладких мышц бронхов, трахеи, кишечника. Он повышает проницаемость СОСУДОВ крови и принимает участие в возникновении кожной
гиперемии, аллергического ринита, астмы, оказывает хемотаксическое действие на нейтрофилы и эозинофилы. Гепарин, продуцируемый тучными клетками и базофилами, является антикоа-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
47
гулянтом. Среди многих его функций нужно отметить участие в
регуляции клеточной пролиферации, подавление действия комплемента, стимуляцию фагоцитоза и пиноцитоза и др. Базофилы и
тучные клетки могут быть источником образования и секреции
ряда хемокинов и цитокинов, включая ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6,
ИЛ-13, ГМ-КСФ, ФНО (тучные клетки), макрофагальный воспалительный протеин — MIP-loc (базофилы), фактор стволовой клетки (ФСК) и др. Секреции мастоцитами ИЛ-4 придают особое значение, так как он является одним из важных регуляторов В-лимфоцитов, базофилов, моноцитов, дендритных клеток и участвует в
аллергических, противоопухолевых и противовоспалительных процессах (Виноградова Ю. Э., 2002). Базофилы секретируют также
простагландины, тромбоксаны, лейкотриены, фактор хемотаксиса
эозинофилов и нейтрофилов серотонин, протеазы, фактор активации тромбоцитов. Доказана способность тканевых базофилов к
фагоцитозу—эндоцитозу.
Моноциты и макрофаги
Моноциты имеют общую с гранулоцитами клетку-предшественника и затем унипотентного предшественника моноцитарной линии (КОЕ-М - в культуре). Все клетки этой линии, особенно зрелые моноциты и макрофаги, относятся к системе мононуклеарных
фагоцитов (СМФ) и занимают особое место в гемоиоэзе. R. Van
Furth и соавторы обосновали выделение моноцитов и тканевых
макрофагов, ранее объединяемых в ретикуло-эндотелиальную систему, в систему мононуклеарных фагоцитов — клеток с особыми
функциями, что было официально утверждено в бюллетене ВОЗ в
1972 г. (Van Furth R. et al, 1968, 1972, 1979). Первой распознаваемой клеткой этого ряда является монобласт. Морфологически его
трудно отличить от миелобласта. Это клетка диаметром 15-20 мкм,
имеет овальное или круглое ядро с пежносетчатой структурой, 24 нуклеолы, более широкую, чем у миелобласта, цитоплазму светло-серого или светло-голубого цвета без зернистости или со скудной пылевидной зернистостью. Следующая клетка — промоноцит,
диаметром 11-15 мкм, характеризуется более грубым волокнистым хроматином ядра, имеющего овальную или бобовидную форму и слабоконтурируемые ядрышки. Цитоплазма промоноцита
серо-голубая, довольно широкая и часто содержит нежную пылевидную азурофильную зернистость. Моноцит — зрелая клетка
данной клеточной линии, диаметром 12-20 мкм, имеет ядро часто неправильной формы (бобовидное, рассеченное, лопастное),
Часть 1. Теоретическая гематология
светлую серо-голубую цитоплазму с пылевидной зернистостью.
В периферической крови моноциты образуют циркулирующий и
пристеночный пулы. В тканях они создают субпопуляции дифференцированных органо- и тканеспецифических макрофагов. Моноциты циркулируют в крови от 12 до 48 часов перед тем, как мигрировать в ткани, где они превращаются в макрофаги (Яворковский Л. И., 1987: Fibbe М. Е., Ploemacher R. Е„ 1999). В крови моноциты составляют 1-5% лейкоцитов, в костном мозге 1-3% миелокариоцитов.
Регуляция роста и дифференцировки моноцитов и макрофагов осуществляется группой ростовых факторов — стимуляторов
(ИЛ-3, ГМ-КСФ, М-КСФ) и ингибиторов (интерферон-а и -р,
простагландин, ИЛ-10). Часть моноцитов остается в костном мозге, где превращается в резидентные или оседлые макрофаги (Van
Furth R. et al., 1979).
Функции моноцитов и макрофагов
Одной из основных функций мононуклеарных фагоцитов является неспецифическая антибактериальная защита организма, которая обеспечивается способностью к фагоцитозу и секрецией цитокинов про- и противовоспалительного действия. Эти цитокины
активируют и мобилизуют как моноциты и макрофаги, так и другие
клетки иммунной системы — лимфоциты, NK-клетки, гранулоциты.
Миграция моноцитов в ткани опосредована действием молекул
адгезии — интегринов — и активаторов моноцитов (хемоаттрактантов) — ИЛ-8, компонента комплемента С5а, тромбоцитактивирующего фактора (PAF), воспалительного макрофагального
протеина (М1Р-1(3), макрофагального хемоаттрактантного протеина (МСР-1), фактора, ингибирующего миграцию (MIF) и др.
(Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 1999). Следующей после адгезии
фазой является трансмиграция моноцита через эндотелий сосуда и
движение к очагу воспаления под влиянием хемотаксических факторов, которыми могут быть эндотоксины бактерий, продукты деструкции ткани и др. Киллинг и переваривание микроорганизмов
происходит при участии протеолитических ферментов, включая
лизоцим и другие факторы. Характерным для моноцитарных макрофагов является метаболический, или респираторный, «взрыв» в
процессе фагоцитоза, который проявляется повышенным потреблением кислорода и продукцией микробицидных кислородных
радикалов, перекиси водорода и супероксиданиона, обладающих
мощными цитотоксическими и бактерицидными свойствами (Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1983). В тканях, где моноциты/макро-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
49
фаги выполняют свои функции, они специализируются в иммунокомпетентные клетки 2 классов:
1-й — антигенперерабатывающие макрофаги;
2-й — антигенпредставляющие макрофаги.
Относящиеся к первому классу антигенперерабатывающие, или
резидентные макрофаги называют также профессиональными фагоцитами. И. И. Мечников, открывший явление фагоцитоза как
защитной функции организма против микробов, называл их «клетками-мусорщиками». Открытие И. И. Мечниковым фагоцитоза и
его работы по иммунитету были удостоены Нобелевской премии.
Резидентные макрофаги — это большое сообщество клеток, которое включает фиксированные макрофаги печени, плевральные и
перитонеальные макрофаги, альвеолярные макрофаги легких, макрофаги соединительной ткани, клетки микроглин, астроциты, макрофаги селезеночных синусов, костномозговые макрофаги, макрофаги лимфоузлов; в почках — интрагломерулярные и мезангиальные макрофаги, гигантские клетки очагов воспаления и другие.
Эти клетки имеют различные морфологические характеристики и
функциональные особенности, но их принадлежность к единой
клеточной линии, моноцитарное происхождение подтверждается
наличием ряда общих свойств — они содержат большое количество фермента лизоцима (мурамидазы), неспецифическую моноцитарную эстеразу, кислую фосфатазу и сходный иммунофенотип,
в частности они экспрессируют моноцитарный антиген CD 14. Данные клетки характеризуются также очень развитым лизосомальным аппаратом (Лукина Е. А., 2002). Это оседлые макрофаги, не
способные к рециркуляции. Продолжительность их жизни исчисляется месяцами и годами. Диаметр тканевых макрофагов колеблется от 18 до 80 мкм (Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Они
имеют рыхлое, относительно небольшое ядро без четких ядрышек,
широкую, слабо очерченную голубую или светло-серую цитоплазму, содержащую гранулы и вакуоли. В световом микроскопе можно видеть клетки с пенистой цитоплазмой, фагировавшие липиды, — липофаги или пигментофаги, фагировавшие гемоглобин. При
некоторых заболеваниях (гистиоцитозах, лейкозах) можно видеть
макрофаги, фагировавшие другие клетки, например эритрофаги.
Пул макрофагов пополняется за счет моноцитов периферической
крови, так как их способность к делению очень ограничена. Их
основной функцией является фагоцитоз микроорганизмов, фрагментов клеток, циркулирующих иммунных комплексов и других
частиц. Они осуществляют также пиноцитоз — поглощение растворимого антигена. В процессе фагоцитоза макрофаги включают
50
Часть 1. Теоретическая гематология
в свою цитоплазму объект фагоцитоза и формируют фагосому, в
которой под влиянием лизоцима и других ферментов происходит
киллинг и переваривание фагоцитированного материала.
Второй класс — антигенпредставляющие (антигенпрезентируюгдие) макрофаги (Van Furth R. et al, 1979; Knight S., Stagg A.,
1993). К ним в настоящее время относят в основном дендритные
клетки (ДК). Морфология большинства дендритных клеток имеет
звездчатую форму со множеством тонких отростков — дендритов.
Эта форма и их подвижность позволяют Д К задерживать антигены
и фиксировать их, а также взаимодействовать с Т-лимфоцитами.
В тканях они часто находятся в незрелом состоянии. Активацию
ДК инициирует встреча с антигеном — микробами или продуктами воспаления. Активаторами ДК являются ИЛ-1, ГМ-КСФ,
ФНОос, бактерии, липополисахариды микробов. ИЛ-10 блокирует
процесс активации ДК. В процессе созревания ДК их способность
активировать лимфоциты увеличивается (Птушкин В. В., 2001).
Дендритные клетки продуцируют ИЛ-8, ИЛ-12, MIP-а и р\ Этапы
презентации антигена включают захват антигена и его ферментативную обработку, транспортировку пептидных фрагментов антигена — эпитопов — в соединении с главным комплексом гистосовместимости I и II на поверхность дендритной клетки для презентации и распознавания Т-лимфоцитами. Активированные дендритными клетками Т-лимфоциты осуществляют запуск иммунных
реакций, стимулируя В-лимфоциты к продукции антител. Таким
образом, клетки СМФ обеспечивают специфический иммунный
ответ организма.
Антигенпредставляющие ДК — иммунные акцессоры, включают
клетки Лангерганса (эпидермоциты), интердигитачьные Д К и дендритные ретикулярные ДК (интерстициальные ДК) (Птушкин В. В.,
2001). Клетки Лангерганса (КЛ) расположены в эпидермисе, их диаметр 14-20 мкм, они имеют широкую светлую цитоплазму, бобовидное или округлое ядро. В КЛ ультраструктурным методом выявляют гранулы Бирбека (их маркеры). Эти клетки экспрессируют
антиген С D 1а и S-100 протеин и содержат аденозинтрифосфатазу
(Chu Т., Jaffe R., 1994). После связывания антигена КЛ поступают
в региональные лимфоузлы, где дифференцируются в интердигитальные ДК, способные представлять антиген Т-лимфоцитам
(Strunk D. et al.. 1997). Клетки Лангерганса не экспрессируют моноцитарный антиген CD 14, обладают слабой фагоцитарной активностью, не содержат лизоцим и не могут превращаться в макрофаги.
В настоящее время предполагают 3 пути развития ДК: из моноцитов крови, лимфоцитов и клеток-предшественников гемопоэза.
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
51
Интерстициальные ДК, как считают, имеют миелоидное (моноцитарное) происхождение и, в отличие от КЛ, стимулируют В-лимфоциты к продукции антител (Птушкин В. В., 2001; Peters J. Н.
et al., 1991). Они могут превращаться в макрофаги под влиянием
М-КСФ или ГМ-КСФ и экспрессируют CD14. В то же время установлен другой путь развития ДК — из лимфоцитов. Дендритные
клетки могут принимать участие в индукции иммунной толерантности. Они способны подавлять незрелые Т-лимфоциты тимуса
или зрелые Т-лимфоциты лимфоузлов, направленные против собственных антигенов. Установлено, что ДК толерантности происходят из общего с Т-лимфоцитами предшественника. Аргументы в
пользу лимфоидного происхождения некоторых ДК у человека
привели V. Soumelis с соавторами (1997), показавшие противоположный эффект ИЛ-4 на ДК миелоидного и лимфопдного происхождения. По их данным, лимфоидные ДК имеют морфологию
плазматических клеток, низкую экспрессию миелондных маркеров CD13 и CD33, позитивный эффект на их клеточный рост от
ИЛ-3 и отсутствие эффекта от миелоидного ГМ-КСФ.
ДК используют в терапии злокачественных заболеваний в качестве фактора, стимулирующего противоопухолевый иммунитет и
инициирующего иммунный ответ на антиген.
Таким образом, клетки СМФ обеспечивают специфический
иммунный ответ, а также участвуют в процессах репарации и заживления ран и очистке кровяного русла в основном за счет макрофагов печени и селезенки (Маянский Д. Н., 1981). Они участвуют в обмене железа, углеводов и липидов, регуляции гемостаза
и гемопоэза, продуцируя как стимуляторы гемопоэза (М-КСФ,
ГМ-КСФ, ИЛ-1), так и ингибиторы (TNF-a, TGF-a). Как секреторные клетки они продуцируют медиаторы воспаления, протеазы, интерлейкины, факторы роста, адгезивные молекулы (Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Клетки макрофагалыгой системы
обладают цитотоксической активностью против опухолевых, инфицированных и других измененных клеток.
Эритроидные клетки
Первой морфологически распознаваемой клеткой эритроидного
ряда является эритробласт, который происходит из унипотентной
эритроидиой клетки-предшественника. Последняя проходит несколько этапов дифференциации, постепенно ограничивающих ее
пролиферативный потенциал. Это происходит в результате осуществления эритроидной программы генной экспрессии (Romeo P.-H.,
52
Часть 1: Теоретическая гематология
1999). Большую роль в регуляции экспрессии эритроидно-специфических генов, таких как гены глобина, порфобилиногена, гликофорина А и В, гена эритропоэтина играют ядерные белки семейства GATA. Поздние этапы эритропоэза полностью зависят от
присутствия эритропоэтина (ЭРП), для которого эритроидные
клетки-предшественники экспрессируют рецептор (ЭРГТ-R). Эритропоэтин необходим для эритроидной дифференцировки вплоть
до позднего базофильного (раннего полихроматофильного) нормоцита, после чего эритроидная клетка больше не нуждается в
ЭРП для своего созревания (Долгов В. В. и др., 2001; Romeo P.-H.,
1999).
Эритробласт — крупная клетка диаметром 15-25 мкм. Круглое
ядро с мелкозернистой структурой ядерного хроматина содержит
2-3 крупные нуклеолы. Умеренная цитоплазма резко базофильна,
часто содержит 1-2 выступа в виде «ушек». Вокруг ядра находится
перинуклеарная зона просветления. Синтез гемоглобина (Hb)
начинается на стадии эритробласта. После митоза количество гемоглобина сокращается наполовину и в течение интерфазы полностью восстанавливается. Клетка совершает от 3 до 7 делений, и один
эритробласт продуцирует в среднем 32 эритроцита. Эритробласты
составляют 0,2—1,0% миелокариоцитов. По мере созревания эритробласт превращается в пронормоцит и затем в нормоцит, который
в процессе развития уменьшается в размере, ядерный хроматин
становится все более грубым, приобретая колесовидную структуру. Количество гемоглобина в нормоцитах прогрессивно нарастает,
в результате чего цитоплазма утрачивает базофилию, и в зависимости от ее гемоглобинизации различают 3 вида нормоцитов —
базофильные, полихроматофильные и оксифильные. Последней
клеткой, способной к пролиферации, является полихроматофильный нормоцит. После деления раннего полихроматофильного нормоцита концентрация гемоглобина в дочерних клетках достигает
критической величины — 13,5 пг (пикограммов), синтез ДНК в
ней прекращается и она выводится из митотического цикла. Оксифильный нормоцит — клетка, которая не делится и не синтезирует
НЬ. Часть эритрокариоцитов уже на стадии базофильного нормоцита достигает критической массы НЬ и выключается из митотического цикла. Эти незрелые клетки гибнут в костном мозге, подчиняясь законам апоптоза и демонстрируя таким образом неэффективный эритропоэз. Последний является одним из факторов
регуляции эритрона, поддержания необходимого уровня эритроцитов в крови. Ядро оксифильного нормоцита конденсировано,
пикнотично («вишневая косточка»). Клетка лишается его в период
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
53
нахождения в костном мозге. Цитоплазма оксифильного нормоцита розовая, насыщенная гемоглобином. Стадия созревания после
энуклеации оксифильного нормоцита перед зрелым, полностью
гемоглобинизированным эритроцитом называется ретикулоцитом.
Ретикулоцит характеризуется активным метаболизмом. Время его
пребывания в костном мозге 1-2 дня, после чего он покидает его и
еще от 1 до 3 дней дозревает в периферической крови, лишаясь
остатков сетчатой ретикулофиламентозной субстанции, представляющей собою фрагменты рибосом, митохондрий и других органелл. Зрелый эритроцит (клетка, основным содержимым которой
является гемоглобин) — это двояковогнутый диск диаметром 7,5—
8 мкм. Его эластичность и деформируемость при сохранении структуры клетки обусловлены особенностями цитоскелета и позволяют ему проходить даже через стенки синусов селезенки. В костном
мозге содержание клеток эритроидного ряда колеблется от 14 до
26%, в среднем около 20%. Длительность жизни эритроцита — 100—
120 дней.
Функции эритроцитов
Основная функция эритроцитов заключается в снабжении тканей кислородом и транспорте углекислоты. Она осуществляется за
счет присутствия в клетке гемоглобина. Гемоглобин — дыхательный пигмент, хромопротеид. У взрослого человека гемоглобин представлен двумя типами: НЬА — взрослым гемоглобином (98%) и
HbF — фетальным гемоглобином (2%). Его небелковая часть, включающая железо, называется гемом, белковый компонент — глобином. Гемоглобин переносит кислород от легочных альвеол к тканям, транспортирует углекислый газ от тканей к легким и участвует в поддержании буферного кислотно-основного равновесия крови.
В самих эритроцитах совершается много ферментативных реакций. Они участвуют в иммунных процессах, взаимодействуя с циркулирующими иммунными комплексами, так как на мембране эритроцитов имеется Fc-рецептор к иммуноглобулинам. На своей мембране они адсорбируют аминокислоты, липиды, токсины. Среди
них выделяют эритроциты-супрессоры, участвующие в подавлении иммунного ответа (Козинец Г. И., Макаров В. А., 1997).
Мегакариоциты. Тромбоциты
Мегакариобласт является первой морфологически распознаваемой клеткой этого ряда в костном мозге. Предшественником мегакариобласта является унипотентная клетка-предшественник
54
Часть 1. Теоретическая гематология
мегакариоцитов. Тромбоциты, или кровяные пластинки, самые маленькие клетки крови, происходят из мегакариоцитов — самых
крупных, гигантских клеток костного мозга. Мегакариобласт, по
данным ряда авторов (Paulus J.-H., Aster R. H., 1983) и нашим
наблюдениям, — крупная клетка, имеющая большое округлое или
складчатое ядро и слабо различимые нуклеолы. Структура хроматина сетчатая, узкая базофильная цитоплазма иногда имеет выросты. В результате процессов эндомитоза (многократного удвоения
числа хромосом без разрушения ядерной оболочки и без деления
клетки) и по.пшлоидизации (возникновения более чем диплоидного набора ДНК) ядро мегакариобласта увеличивается, оставаясь
в пределах той же цитоплазмы, и возникает мегакариоцит. Большой размер этих клеток обусловлен очень высоким содержанием
в них ДНК. Среди мегакариоцитов различают более молодые 6азофильные и более зрелые гранулярные формы. Среди гранулярных выделяют полихроматофильные и оксифильные мегакариоциты. Мегакариоциты достигают в диаметре 120 мкм и более
(в среднем — 40-50 мкм). Ядро базофильного мегакариоцита нелобулярное, ядрышки плохо различимы. Неширокая темно-голубая или базофильная цитоплазма не содержит зернистости и в
норме не отделяет пластинки.
Диаметр полихроматофильного мегакариоцита (клетка окрашивается основными и кислыми красителями) колеблется от 40 до
120 мкм. Ядро грубое, без нуклеол, форма ядра вариабельная, причудливая, может быть сегментированной; в цитоплазме содержится азурофильная зернистость. Клетка является главным продуцентом пластинок, в ее цитоплазме видны тромбоциты и можно
наблюдать процесс их отделения. В процессе эндомитоза клетка
становится полиплоидной (4N, 8N, 16N, 32N, 64N).
Оксифильный мегакариоцит характеризуется очень слабой функциональной активностью и, как правило, не отделяет пластинки.
Это крупная клетка с грубым полиморфным ядром, широкой розовой цитоплазмой с остатками скудной зернистости. Различают также инволютивные формы — старые, разрушающиеся клетки и свободные ядра мегакариоцитов. Жизненный цикл мегакариоцита —
10 суток. Стимулятором его роста и дифференцировки является
тромбопоэтин (ТП). В развитии и дифференцировке мегакариоцитов принимают участие многие другие факторы, среди которых:
ИЛ-1, ИЛ-3. ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, НЛ-11, ЭРП, лейкозингибирующий фактор (ЛИФ), колониестимулирующие факторы ГМ-КСФ,
М-КСФ и многие другие (Chatelain С, 1999). Регулятором мегакариопоэза является также количество тромбоцитов, избыток кото-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
55
рых тормозит тромбоцитопоэз, и наоборот. В цитоплазме зрелых
мегакариоцитов находятся гранулы, содержащие большое количество белков, среди которых фактор Виллебранда, тромбоспондин,
тромбоцитарный фактор 4, фибронектин, фибриноген, тромбоцитарный ростовой фактор, IV7 и V факторы свертывания крови и др.
Ультраструктурным маркером мегакариоцитов является выявляемая при электронной микроскопии тромбоцитарная пероксидаза.
Мегакариоциты составляют 0,2-0,6% миелокариоцитов.
Функции тромбоцитов
Эффекторными клетками мегакариоцитоноэза, участвующими
в процессах свертывания крови, являются тромбоциты — производные мегакариоцитов. Это сферические образования диаметром
1-4 мкм, их количество составляет в среднем 250 тыс. в 1 мкл.
В кровяном русле тромбоциты находятся в активированном (40%)
и неактивированном состоянии. Они имеют периферическую зону,
условно называемую цитоплазмой, или гиаломером, и зону-гель, а
также мембраны и органеллы (Иванов Е. П., 1991). Зона-гель содержит гранулы, включающие множество факторов, обеспечивающих функции тромбоцитов. Главные функции тромбоцитов — ангиотрофическая и адгезивно-агрегационная. Известно 11 пластинчатых факторов свертывания, которые содержатся в тромбоцитах.
Среди них тромбоцитарный тромбопластин, акцелератор тромбина, активатор фибринолиза, фибринстабилизирующий фактор, ссротонин, антигепаригговый фактор, фибриноген тромбоцитов и др.
(Козинец Г. И., Макаров А. А., 1997). Тромбоциты обеспечивают
тромбоцитарное звено гемостаза. Повреждение сосуда немедленно
влечет за собою его спазм и прилипание (адгезию) тромбоцитов к
коллагеновым волокнам и другим адгезивным белкам субэндотелия. Пластинки агрегируют в месте повреждения под влиянием
многих факторов, в частности тромбина, и в результате фазы обратимой или первичной агрегации образуется тромбоцптарная пробка. Дальнейшая агрегация и уплотнение пробки обеспечивают необратимую, вторичную агрегацию — первичный гемостаз (Петрищев Н. Н., Папаяп Л. П., 1999). На основе первичного тромба
образуется фибриновый сгусток и формируется тромбоцитарнофибриновая пробка, обеспечивающая окончательный, или вторичный гемостаз. Плазменно-коагуляционный механизм гемостаза также происходит при непосредственном участии тромбоцитов, которые секретируют многие факторы, активирующие плазменный
гемостаз.
56
Часть 1. Теоретическая гематология
Лимфоциты
Лимфопиты имеют общую с миелоидными элементами клеткупредшественника на уровне СКК, но затем они приобретают независимую линию дифференцировки (Morrison S.J.etal., 1997). Лимфоциты представлены в основном тремя клеточными линиями —
В-, Т- и NK-клетками, — и имеют общую для них клетку-предшественника, коммитированную в направлении лимфопоэза. В костном мозге В- и Т-лимфобласты присутствуют в очень небольшом
количестве (-0,5%). Лимфобласт характеризуется более мелкими
размерами, чем миелобласт, круглым ядром с 1-2 нуклеолами и
нежнозернистой структурой хроматина. Его неширокая голубая
цитоплазма в норме лишена зернистости.
Следующие клетки — пролимфоцит и лимфоцит. Пролимфоцит характеризуется более грубым ядерным хроматином и реже
выявляемыми нуклеолами. Лимфоциты даже морфологически
очень гетерогенная группа, которая объединяет многие типы этих
иммунокомпетентных клеток. Давая морфологическую характеристику лимфоцитам, учитывают их форму и размеры, структуру
хроматина, особенности цитоплазмы, наличие или отсутствие в
ней включений и другие признаки. Обычный лимфоцит крови имеет размер 7-12 мкм. Он имеет овальное или круглое ядро, глыбчатую структуру ядерного хроматина, отличается отсутствием нуклеол. Клетка чаще не содержит зернистости, но есть категории
гранулированных лимфоцитов, например большие гранулированные лимфоциты размером 9-15 мкм. По ширине цитоплазмы их
делят на узко-, средне- и широкоцитоплазменные. Первые из них —
это малые лимфоциты диаметром 6-7 мкм с плотным ядром. Деление лимфоцитов на В- и Т-типы обусловлено их специализацией
и функциями. В костном мозге В-лимфоциты при участии цито*
кинов проходят антигеннезависимую стадию созревания и дифференцировку от про-В-типа, через пре-пре-В-тип, пре-В тип до
В-типа — зрелого лимфоцита. В костном мозге формируется антигенраспознающий иммуноглобулиновый рецептор В-лимфоцитов — BCR. Из костного мозга В-лимфоциты, зкепрессирующие
IgM и IgD, поступают в периферическую кровь и заселяют В-зависимые зоны лимфоидных органов — фолликулы, в зародышевых
центрах которых они проходят антигензависимую пролиферацию
и дифференцировку в плазматические клетки, продуценты антител, или В-клетки памяти (Фрейндлин И. С, Тотолян А. А., 2001;
Тупицын Н. Н., 2002). Активированный антигеном В-лимфоцит
превращается в В-иммунобласт, затем плазмобласт. Это крупная
клетка диаметром 15-22 мкм. Она имеет округлое ядро, располо-
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
57
женное эксцентрично, 2-4 нуклеолы, резкобазофильную ••цитоплазму без включений. Иногда наблюдается зона просветления вокруг ядра. Проплазмоцит характеризуется эксцентрично расположенным ядром, боле плотной структурой ядерного хроматина,
менее отчетливыми нуклеолами и базофильной цитоплазмой.
Плазмоциты очень различаются по размеру. Они имеют округлое,
эксцентрически расположенное ядро с грубым хроматином. Ядрышки отсутствуют; цитоплазма базофильна, часто вакуолизирована.
Плазматические клетки продуцируют антитела, одной специфичности и одного класса иммуноглобулинов. Предшественники Т-лимфоцитов — протимоциты — из костного мозга мигрируют в корковый слой тимуса — центральный орган Т-лимфопоэза. Здесь они
подвергаются антигеннезависимой дифференцировке и проходят
стадии про-Т-клетки, пре-Т-клетки и Т-клетки. На стадии про-Тлимфоцита начинает формироваться антигенраспознающий Т-клеточный рецептор — TCR. При переходе из коркового слоя в мозговой Т-лимфоциты превращаются в СО4+Т-хелперы (Th) и C D 8 предшественники цитотоксических лимфоцитов (киллеров).
«Наивные» СО4*Т-лимфоциты после встречи с антигеном и активации представляют собою ThO, секретирующие ИЛ-2, ИЛ-4,
ИНФ-у, и могут дифференцироваться в ТЫ и Th2. Thl способны
активировать макрофаги, участвовать в клеточном иммунном ответе. Th2 активируют В-лимфоциты к продукции антител, т. е.
участвуют в гуморальном ответе. Эти две популяции продуцируют цитокины, которые способны противодействовать дифференцировке и активации противоположной субпопуляции (Фрейндлин И. С, 2000). Морфологически различить Т- и В-лимфоциты
практически невозможно. Единственно надежным способом их
идентификации является иммунофенотипирование с использованием моноклональных антител.
Классические NK-клетки (natural killer — естественные киллеры) — 3-я очень небольшая популяция лимфоцитов — не несет на
своей поверхности маркеров В- или Т-клеток. Они составляют около 5% от числа лимфоцитов периферической крови. Морфологически это большие гранулированные лимфоциты, способные непосредственно, без помощи антител убивать клетки-мишени — опухолевые или инфицированные вирусом — или микроорганизмы,
т. е. они обладают клеточной цитотоксичностью. Специфический
белок NK-клетоК — перфорин способен разрушать мембрану клетки-мишени. Полагают, что NK-клетки, возможно, включают в себя
+
супрессорные цитотоксические СО38 Т-клетки. Вся популяция
лимфоцитов в костном мозге составляет 8-9% миелокариоцитов.
58
Часть 1. Теоретическая гематология
Функции лимфоцитов
Основной функцией лимфоцитов является распознавание собственных и чужеродных антигенов и обеспечение гуморального и
клеточного иммунитета. В-лимфоциты получили свое название от
слова «bursa» — сумка, так как впервые были обнаружены у птиц в
органе, называемом «бурса Фабрициуса». Они ответственны за
гуморальный иммунитет и способны распознавать антигены с помощью экспрессируемых ими на мембране специфических рецепторов. В-лимфоциты способны самостоятельно распознавать антигены и отвечать продукцией соответствующих антител, но в основном для реализации иммунного ответа они нуждаются в
кооперации с Т-лимфоцитами, которые представляют им антиген
и стимулируют к дифференцировке в плазматические клетки и
выработке антител. Т-лнмфоциты обеспечивают клеточный иммунитет и распознают антигены с помощью антигенпрезентирующих
клеток, к которым относятся макрофаги и главным образом дендритные клетки. В результате этих контактов происходит активация Т-лимфоцитов хелперов и секреция ими цитокинов, стимулирующих к пролиферации и дифференциации макрофаги, В-лимфоциты и сами Т-клетки.
Цитокины, секретируемые Т-лимфоцитами, инициируют выход нейтрофилов из крови в ткани к очагам воспаления, и сами
активированные Т-лимфоциты — Т-цитотоксические лимфоциты — способны лизировать клетки, несущие чужеродные антигены
и внутриклеточные паразиты: грибы, микобактерии туберкулеза,
вирусы и простейшие. Цитотоксические Т-лимфоциты принимают прямое участие в реакции отторжения трансплантата.
Лимфоциты находятся в состоянии постоянной циркуляции
между кровью, лимфой и лимфоидными органами, и это делает
возможной встречу каждого антигена с соответствующей очень
немногочисленной популяцией лимфоцитов, несущих специфические маркеры для распознавания именно данного антигена. Одной
из форм иммунного ответа является иммунологическая память,
которая формируется при контакте лимфоцита с чужеродным антигеном и способствует быстрой выработке соответствующих антител при повторном контакте с тем же антигеном. Это вторичный
иммунный ответ, который обеспечивается клоном долгожнвущих
клеток памяти - соответствующих Т- и В-лимфоцитов.
Т-лимфоциты являются секреторными клетками, и их цитокины играют большую роль в регуляции гемопоэза. иммунного ответа, процессов воспаления и др. Они секретируют:
Глава 3. Морфология и функции клеток костного мозга и крови
59
1) гемопоэтины ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10,
ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17,ТМ-КСФ;
2) интерфероны, в том числе ИНФ-у;
3) факторы некроза опухоли — ФНОа, ФНОр и др.;
4) хемокины — цитокины, обладающие активностью хемоаттрактантов, в частности М1Р-1а и -1(3 и RANTES — хемоаттрактант для эозинофилов и базофилов, принимающий участие в аллергических реакциях;
5) TGF-J3 н фактор, ингибирующий миграцию, — MIF и др.
Синтез и секреция иммуноглобулинов В-лимфоцитами - завершающая стадия специфического гуморального иммунного ответа.
Продукты иммунного ответа — иммуноглобулины — относятся к
фракции гамма-глобулинов. Активированные В-лимфоциты также
способны секретировать некоторые цнтокины, например ИНФ-а,
IUI-12,TGF-p.
Таким образом, координированное взаимодействие клеток крови, опосредованное влиянием регуляторов пролиферации и дифференциации — цитокинов, обеспечивает постоянство клеточного
состава крови и равновесие внутренней среды организма.
Литература
ВиноградоваJO. Э. Строение и функции лейкоцитов. Гранулоциты // Руководство по гематологии / Под рел. А. И. Воробьева. М., 2002. С. 88-106.
Воробьев А. И. Клетка// Руководство по гематологии / Пол ред. А. И. Воробьева. М., 2002. Т. 1.С. 13-28."
Долгов В. В., Луговская С. А., Морозова В. Т. и др. Лабораторная диагностика
анемий: Пособие для врачей. Тверь, 2001. 88 с.
Иванов Е. П. Руководство по гемостазиологии. Минск, 1991.
Козинец Г. И., Макаров В. А. Исследование системы крови в клинической практике. М., 1997. 480 с.
Лукина Е. А. Моноциты и макрофаги // Руководство по гематологии / Под ред.
А. И. Воробьева. М„ 2002. Т. 1. С. 100 - 106.
Маянскип Д. Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. Новосибирск: Наука, 1981. 168 с.
Мая некий А. Н., Маянскип Д. II. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1983. 256 с.
Петрищев А. Л., Напаян Л. П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. СПб., 1999.
117с.
Проценко В. А., Шпак С. И., Доценко С. М. Тканевые базофилы и базофильные
гранулоциты крови. М., 1987. 128 с.
Птушкин В. В. Дендритические клетки и роль цитокинов is их дифференцировке и функционировании /'/' Клиническая онкогематология / Под ред. М. А. Волковой. М.: Медицина, 2001. С. 72-76.
Глава 4
ТРЕПАНОБИОПСИЯ КОСТНОГО МОЗГА.
СТРОМАЛЬНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ:
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И УЧАСТИЕ В ГЕМОПОЭЗЕ
Главным кроветворным органом человека является деятельный
костный мозг губчатого вещества костной ткани. Являясь сложнорегулируемой иерархической системой, гемопоэз возможен только
при обязательном условии взаимодействия со стромой костного
мозга. Как известно, в основе интенсивного обновления различных клеточных форм гемолимфопоэза .[ежит единая клеточная
линия. Мультипотентная стволовая кроветворная клетка является
общим предшественником всех известных линий гемопоэтическоп
дифференцировки и всей мозаики лимфоидных элементов. Процессы, лежащие в основе самоподдержания, коммитирования, пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, определяются
регуляторными механизмами на уровне генома и эпигеномными
факторами.
Ведущими среди эпигеномных факторов, играющих ключевую
роль в жизнедеятельности стволовых клеток, являются межклеточные взаимодействия гемопоэтических предшественников с элементами стромального микроокруженйя, которые представлены в
костном мозге синусоидальными сосудами, ретикулярными,
жировыми и эндостальными клетками (Ругаль В. И. и др., 1991;
Mayany H. et al., 1992; Van Damme A. et al, 2002). Регуляторный
потенциал указанных элементов реализуется путем их непосредственных контактов с кроветворными предшественниками, а также благодаря широкому спектру стимуляторов и ингибиторов гемолимфопоэза, продуцируемых стромой костного мозга — цитокинов, рестриктинов, циклинов, адгезшюв и других, локальный
эффект которых обеспечивается как их продукцией in situ, так и
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
63
иммобилизацией на компонентах внеклеточного матрикса. Строма костного мозга является источником сигналов, которые воспринимаются рецепторами плазматических мембран гемопоэтических клеток, преобразуются при участии сложных взаимодействий клеточных органоидов и поступают в ядро, где происходит
запуск экспрессии генов, необходимых для клеточной пролиферации и дифференцировки. В результате этого начинают реализовываться генетические программы, ответственные за формирование
тканеспецифических и стадиеспецифических клеточных фенотипов с соответствующими морфофункциональными особенностями клеток гемолимфопоэза.
Одним из доступных и информативных методов изучения костного мозга в целом и стромы костного мозга в частности является
трепанобиопсия (Теодорович В. П., Абдулкадыров К. М., 1977).
Признавая неоценимое диагностическое значение при заболеваниях системы крови стернальной пункции, необходимо подчеркнуть,
что метод трепанобиопсии костного мозга позволяет получить более полную информацию о состоянии костномозгового кроветворения. Так, с помощью трепанобиопсии возможно изучить истинное соотношение кроветворной ткани и жировой субстанции. При
трепанобиопсии также легко выявляются и изменения со стороны
костной ткани, стромы костного мозга и гемопоэтического микроокружения. Однако данный метод не может заменить, тем более
вытеснить стернальную пункцию. Он является весьма информативным, объективным и обязательным при диагностике заболеваний системы крови.
Методика исследования
При трепанобиопсии забор губчатого вещества костной ткани
осуществляют иглой Jamshidi или Islam из задней ости подвздошной кости. Для исследования необходим столбик костной ткани не
менее 2 см длиной, поскольку субкортикальные лакуны не отражают состояние кроветворения. Материал фиксируется в 10% водном растворе формальдегида или жидкости Карнуа. Объем фиксирующих сред должен превышать объем трепаната не менее чем в
10 раз. Кусочек ткани после фиксации декальцинируется и проводится через ряд спиртов восходящей концентрации, хлороформ и
жидкий парафин. Обезвоженный материал, пропитанный парафином, погружают в специальные кассеты с жидким парафином. Полученные после охлаждения блоки закрепляют в микротоме и приготовляют гистологические препараты толщиной около 5 мкм. Срезы прикрепляют к предметным стеклам, депарафинируют и
64
Часть 1. Теоретическая гематология
окрашивают Азур-2-эозином или гематоксилин-эозином, заключают в оптически прозрачную среду и покрывают покровным стеклом. При необходимости производится окраска азотнокислым серебром по Гомори или пикрофуксином по Ван-Гизону.
При ря/[е патологических состояний бывает трудно, даже невозможно с помощью указанных методов окраски определить тип
клеток и их происхождение (гистогенез). В связи с этим, наряду с
гистологическим методом, используют дополнительно иммуногистохимические исследования трепанобиопсий подвздошной кости. При использовании этого метода на гистологические препараты наносят раствор с антителами к определенным антигенам. Антитела иснользуемых сывороток имеют на себе метку флюорохром
либо красящий фермент. Более распространен иммунопероксидазный метод, при котором антитела красящей сыворотки несут фермент — пероксидазу хрена. Для иммуногистологических реакций
используют два типа антител: поли- и моноклональные. Имеется
большое количество коммерческих наборов (kits) сывороток к различным антигенам. Использование маркеров позволяет дагь иммунофенотипическую характеристику кроветворных и лимфоидных клеток костного мозга для диагностики заболеваний, назначения и оценки лечения. Ниже представлены результаты исследований структурной организации стромы костного мозга на основании
изучения трепанобиоптатов подвздошной кости здоровых лиц с
использованием стандартных методов гистологических, морфометрических и ультрамикроскопических исследований.
Стромалыюе микроокружение:
структурная организация и участие в гемопоэзе
Синусоидальные сосуды
Клетки крови человека формируются в экстравазальных секторах костного мозга и в сосудистое русло проникают через васкулярную стенку. Ежесуточно у взрослого человека образуется около
1/3 триллиона клеток. Их миграция в кровоток обеспечивается
особенной структурной организацией сосудистого русла костного
мозга. Как известно, активный гемопоэз происходит в тех участках
костной ткани, которая имеет губчатую структуру и, в отличие от
компактной, не обладает системой гаверсовых каналов, обеспечивающих кровоток. В губчатой кости снабжение кровью костных
балок и интрамедуллярной кроветворной паренхимы осуществляется за счет периостальных артерий, которые в виде a. perforans
входят внутрь костного мозга через плотную кортикальную плас-
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
65
тинку. Указанные сосуды в лакунах губчатого вещества разделяются на костномозговые артерии, переходящие в артериальные капилляры. Последние, расширяясь в виде воронки, образуют синусоиды костного мозга. Венозный отток осуществляется посредством балочковых синусов, которые проходят через компактный
слой губчатой кости, вливаясь в периостальные вены. Таким образом, синусы костного мозга — это «чудесная сеть» внутри венозного русла. Именно в этих участках в условиях нормального кроветворения происходит миграция клеток крови в сосудистое русло. .
В гистологических препаратах подвздошной кости здоровых
людей синусы представлены тонкостенными сосудами, которые на
разрезе имеют вытянутую, овальную или округлую форму. Их вид
зачастую зависит от размеров. Мелкие и средние синусоиды имеют преимущественно удлиненную и вытянутую форму. Для более
редко встречающихся крупных синусоидальных сосудов характерны овальные или округлые очертания. В интрамедуллярных пространствах костного мозга иногда выявляются синусоиды неправильной формы вследствие неравномерного расширения просвета
(грушеобразные, колбовидные и др.).
Представляя собой начальное звено венозного русла, синусоидальные сосуды образуются в результате слияния узких капилляров или ветвления артериол. Венозные сосуды, следующие за
синусами, имеют значительно меньший диаметр. Однако в гистологических препаратах синусоидальные сосуды не всегда представлены с их приносящими и выносящими ветвями. В большинстве
наблюдений морфологический рисунок синусоидального русла
представлен преимущественно только синусоидами. Стенка синусоида состоит из одного слоя эндотелиоцитов, цитоплазма которых имеет вид истонченного тяжа, ограничивающего просвет.
Встречаются клетки как с увеличенными просветленными, так и
пикнотическими ядрами. В просветах сосудов находились эритроциты, небольшое количество гранулоцитов, а в некоторых — незрелые элементы эритроидного ряда. Фагоцитоз эндотелиальным клеткам не свойственен. При морфометрическом исследовании площадь, занимаемая в гистологических препаратах синусоидальными
сосудами, составляет около 5%.
При обзорном просмотре электронно-микроскопических срезов
обнаруживаются синусоиды двух видов. В одних эндотелиоциты
имеют уплощенную форму с длинными, резко истонченными цитоплазматическими отростками. Ядра в этих клетках плоские, с
грубым, конденсированным по всему сечению хроматином. Ядрышки не выявляются. Как в перикарионе, так и в маргинальных
3 Гематология. Нов. справочник
66
Часть 1. Теоретическая гематология
участках цитоплазмы обнаруживается небольшое количество органоидов: единичные митохондрии с небольшим числом крист и
матриксом умеренной плотности, незначительное количество nvзырьков, гетерогенные по размеру электронноплотные гранулы,
тельца Вейбеля-Палладе. В просвете синусоидов выявляются только зрелые клетки гранулоцитарного ряда, эритроциты и тромбоциты. В состав стенки таких синусов входит тонкая базальная мембрана.
В синусоидах другого типа эндотелиоциты отличаются от описанных выше структурой ядра и содержанием органелл в цитоплазме. Как правило, эти клетки выбухают в просвет синусов и имеют
крупные ядра с у меренной конденсацией хроматина по периферии и
четким преобладанием эурохроматина. Цитоплазма богата органоидами и имеет хорошо выраженные признаки пино- и экзоцитоза.
Базальная мембрана имеет прерывистую структуру. В синусах такого тина наблюдается трансмуральный проход зрелых клеток, а в их
просветах наря!су со зрелыми элементами гемопоэза обнаруживаются эритроидные клетки на стадии эритробластов.
Полученные ультрамикроскопические данные подтверждают
существование в костном мозге человека замкнутой системы кровообращения. Вместе с этим наблюдается отчетливая функциональная мозаичность эндотелия. Трансцеллюлярная миграция клеток крови происходит в местах наличия прерывистой базальной
мембраны и расположения функционально активных, богатых органеллами эндотелиоцитов с признаками пино- и экзоцитоза. Вполне вероятно, что миграция стволовых гемопоэтических клеток также осуществляется в этих зонах.
Учитывая сведения о непосредственном влиянии эндотелиальных клеток на кроветворение, можно предполагать, что богатые
органоидами эндотелиоциты способны не только передавать, но и
секретировать функционально активные вещества, регулирующие
процессы дифференцировки и созревания гемопоэтических предшественников. Резкое увеличение диаметра просвета синусоидальных сосудов приводит к значительному снижению в них скорости
кровотока, поэтому синусы могут выполнять роль своеобразного
отстойника, создавая условия для созревания ядросодержащих гемопоэтических клеток. Это предположение подтверждается обнаружением эритробластов в просветах синусов.
Несомненно, что синусоиды, обеспечивая упорядоченное поступление в кровоток физиологически важных веществ и клеток
крови, создают благоприятные условия для деятельности костного
мозга как кроветворного органа. Их значение не ограничивается
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
67 •
функцией гистогематического барьера. Входящие в их состав эндотелиальные клетки могут играть инструктивную роль в гемопоэзе, а регуляторный эффект может осуществляться посредством секреции ростовых факторов либо путем межклеточных контактов
эндотелиоцитов с гемопоэтическими предшественниками.
Интрамедуллярные ретикулярные клетки
Ретикулярные клетки костного мозга являются одним из основных клеточных компонентов кроветворного микроокружения.
В интрамедуллярных пространствах трубчатой кости цитоплазматические отростки ретикулярных клеток контактируют с отростками соседних клеток, а также с периваскулярными адвентициальными и покрывающими поверхность костных балок клетками, формируют цитоплазматическую сеть — ретикулум, в ячейках которого
располагаются гемопоэтические клетки. В костномозговых пространствах подвздошной кости человека в одном поле зрения иммерсионного увеличения микроскопа заметны около трех ретикулярных клеток. Размеры и форма ретикулярных клеток весьма
изменчивы. Чаще обнаруживаются крупные клеточные элементы
с деформациями и длинными цитоплазматическими выростами.
Как правило, цитоплазма интрамедуллярных стромальных клеток
слабо базофильна, мелкоячеистого строения. Ядра неправильной
формы с мелкодисперсной структурой хроматина. Также встречаются малоотростчатые клетки с овальными светлыми ядрами.
В центральных отделах лакун, вокруг них в виде островков располагаются эритроидные клетки. Когда ретикулярные клетки выявляются вблизи поверхности костных трабекул, их цитоплазма находится в тесном контакте с властными элементами гранулоцитарного ростка. Наряду с цитоплазматическими отростками ретикулярные клетки костного мозга способны образовывать тонкие
волокна, которые могут располагаться свободно либо связываться
с цитоплазматическими отростками.
В гемопоэтической ткани в зависимости от локализации можно
выделить два основных типа ретикулярных клеток, отл ичающихся
по ультраструктуре. Клетки первого типа с очень длинными цитоплазматическими отростками располагаются диффузно и формируют сеть, в ячейках которой располагаются кроветворные элементы. Ядра с мелкодисперсным хроматином иногда содержат ядрышки. Цитоплазма содержит большое количество рибосом,
хорошо развитую сеть канальцев эндоплазматического ретикулума и пучки микрофнламентов.
68
Часть 1. Теоретическая гематология
В эндостальных и периваскулярных зонах среди кроветворных
элементов гранулоцитарного ряда выявляются ретикулярные клетки другого типа — малоотростчатой формы со светлым ядром и
наличием ядрышек. Они имеют тесный контакт с гемопоэтическими бластными элементами. Довольно часто в местах контактов
таких клеток их плазмолеммы как самостоятельные структуры не
определяются. Отмечается их способность к фагоцитозу.
Как разновидность ретикулярных клеток рассматриваются адвентициальные клетки, тесно прилегающие к стенкам капилляров
и синусов. Большинство периваскулярных клеток имеют темное
ядро и умеренных размеров цитоплазму. В части клеток обнаруживаются крупные жировые капли, окруженные богатым органеллами ободком цитоплазмы. Наличие переходных форм между указанными клетками и адипоцитами указывает на возможности развития жировой ткани костного мозга человека из адвентициальных
ретикулярных клеток.
Полученные в ходе исследований ретикулярной стромы результаты прежде всего свидетельствуют о функциональной мозаичное ти клеток стромального ретикулума. Кроме того, они указывают на
существование функциональных взаимосвязей стромальной и кроветворной ткани.
Отростчатые ретикулярные клетки первого типа своими длин-'
ными цитоплазматическими ответвлениями пронизывают интрамедуллярные пространства, формируют механический каркас, на
котором располагаются гемопоэтические клетки. Они, вероятно,
выполняют роль своеобразного якоря, который задерживает клетки крови и участвует в их движении в циркуляцию. Контактируя
между собой, а также с костью и сосудами, они создают прочную
основу для синусов, не позволяя спадаться их стенкам, состоящим
из единственного слоя эндотелия.
Кроме того, в их цитоплазме обнаружены микрофиламенты.
Известно, что ретикулярные клетки лимфатических узлов способствуют транспортировке лимфоцитов в межуточной ткани и далее
в лимфатические сосуды. По всей вероятности, в костном мозге
ретикулярные клетки первого типа вместе с опорной функцией
способствуют, по аналогии с лимфатическими узлами, миграции
клеток крови в интрамедуллярных пространствах костномозговых
лакун.
Нельзя исключить, что ретикулярные клетки первого типа наряду с отмеченными свойствами выполняют и более специфические функции. Имея в цитоплазме хорошо развитый белоксинтезирующий аппарат, дендритические клетки ретикулума являются
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
69
основным источником образования экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микросреду интрамедуллярных пространств
костного мозга. Синтезируя коллаген, гликозаминогликаны и другие физиологически активные субстанции, ретикулярные клетки
способны непосредственно влиять на процессы пролиферации и
дифференцировки кроветворных предшественников. Особенно
следует отметить роль коллагена. Как известно, экстрацеллюлярный коллагеновый матрикс интрамедуллярных пространств костного мозга представлен коллагеном первого и третьего типов. Химическая структура коллагена и его биологические функции хорошо изучены. Роль этого белка не ограничивается только опорной
функцией. Он необходим в процессах эмбрио- и морфогенеза, оказывает влияние на рост и дифференцировку клеток различных
органов и систем организма.
В гемопоэтических очагах, преимущественно гранулоцитарных
и в меньшей мере эритроидных, выявляются ретикулярные клетки
второго типа. Они характеризуются отсутствием цитоплазматических отростков, наличием молодого ядра, содержащего ядрышки. Их отличительной особенностью является тесный контакт с
молодыми гемопоэтическими элементами. В местах контактов наблюдаются структурные перестройки мембран. На наличие функциональных взаимоотношений указывают отмеченные анатомические характеристики, а также перемещение гемопоэтических
клеток, по мере созревания, от центра кроветворного очага с расположенными в нем стромальными клетками к периферии фокусов
гемопоэза. Эритрокариоциты чаще ассоциированы с макрофагами. Однако, учитывая возможность трансформации ретикулярных
клеток в элементы, обладающие фагоцитарной способностью, можно предположить, что среди макрофагальных элементов эритроцидных островков имеются ретикулярные клетки, способные к
фагоцитозу.
Тесная гистотопографическая взаимосвязь ретикулярных и гемопоэтических клеток подтверждает положение о функциональных взаимоотношениях между ними. Таким образом, совершенно
очевидно, что гетерогенность популяции ретикулярных клеток может быть проявлением их функциональных различий и отражением специфической роли в формировании кроветворного микроокружения.
Адипоциты
. В условиях нормального кроветворения жировые клетки заполняют у взрослых все пространство костномозговой полости, не
70
Часть 1. Теоретическая гематология
занятое миелоидной тканью. Как правило, форма адипоцитов шаровидная или слегка овальная. Обычно клетка содержит единственную крупную жировую вакуоль, занимающую практически всю
цитоплазму. Последняя видна в виде небольших участков по краям
ядер. В зрелых адипоцитах ядра всегда расположены эксцентрично, имеют ровные контуры, вытянутую форму, мелкозернистую
структуру хроматина с конденсацией по периферии. В промежутках между жировыми клетками диффузно расположены гранулоциты. Иногда адипоциты тесно прилежат к поверхности костных
балок. В таких участках молодые гемопоэтические клетки не выявляются. В интрамедуллярных пространствах подвздошной кости
взрослых объем жировой ткани составляет около 30% площади
гистологического препарата.
При ультраструктурном исследовании органеллы обнаруживаются в перинуклеарной зоне. Выявляются в небольшом количестве канальцы незернистой эндоплазматической сети, свободные
рибосомы, крупные митохондрии с элетроннопрозрачным матриксом и короткими кристами. Наряду с такими зрелыми адипоцитами встречаются молодые формы, имеющие широкую цитоплазму с
большим количеством органелл и пусками микрофиламентов, проходящих в различных направлениях.
Каких-либо ультраструктурных особенностей в местах межклеточных контактов зрелых адипоцитов с гемопоэтическими предшественниками, которые позволили бы предположить наличие
функциональной связи, не выявлено. В то же время при электронно-микроскопическом исследовании можно отметить тесные взаимоотношения незрелых жировых клеток (преадипоцитов) с молодыми гранулоцитарными элементами. У незрелых адипоцитов
отмечена высокая функциональная активность, а в местах межклеточных контактов с кроветворными предшественниками обнаружены перестройки плазмолемм преадипоцитов, подобные тем, которые наблюдали в межклеточных контактах ретикулярных и кроветворных клеток. По всей видимости, незрелые жировые клетки
оказывают влияние на гранулоцитопоэз. Как известно, in vitro показана способность молодых жировых клеток влиять на пролиферацию и дифференцировку гранулоцитарных предшественников с
помощью гуморальных факторов и межклеточных контактов. Что
касается зрелых жировых клеток, то они являются энергетическими депо костного мозга и лабильным матриксом, легко теряющим
липиды для обеспечения плацдарма развития гемопоэтических
клеток в условиях повышенного запроса при различных экстремальных ситуациях. Способность адипоцитов адсорбировать на
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
71
своей поверхности широкий спектр физиологически активных субстанций позволяет жировым клеткам непосредственно участвовать в гуморальной регуляции процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических предшественников.
Эндостальные клетки
При морфометрическом исследовании площадь трабекул губчатого вещества подвздошной кости в норме составляет 20,0 ± 4%.
Костные балки правильной формы, имеют гладкие ровные края.
Их эндостальная поверхность выстлана сплошным слоем клеток,
среди которых выявляются клетки двух основных типов. Первые
характеризуются резко уплощенной вытянутой формой, небольшим объемом цитоплазмы, темными узкими ядрами. Вторые отличаются полигональными очертаниями, более обильной цитоплазмой, округлыми, содержащими ядрышки ядрами. В некоторых
участках отчетливо прослеживается двуслойное расположение эндостальных клеток. Число клеток первого и второго типов в единице площади эндостальной поверхности составляет соответственно
1,17 ±0,26 и 0,09 ±0,02.
Молодые кроветворные клетки (миелобласты, промиелоциты)
и мононуклеары типа лимфоцитов зачастую определяются вблизи
трабекулярной поверхности в местах расположения эндостальных
клеток с просветленными ядрами. В таких очагах количество стромальных клеток увеличено. Часть из них находится в тесном контакте с кроветворными клетками. По мере созревания гранулоциты смещаются в центральные отделы лакун.
Электронно-микроскопический анализ эндостальной и субэндостальной зон подвздошной кости показывает присутствие в них
довольно гетерогенной группы стромальных клеток, отличающихся ультраструктурной организацией. Непосредственно на поверхности кости наиболее часто выявляются резко уплощенные вытянутые клетки с небольшим количеством органоидов и электронноплотной цитоплазмой, распространявшей остростки в костное
вещество. Реже встречаются крупные клетки со сравнительно гладкими контурами. Их цитоплазма характеризуется большим количеством внутриклеточных органелл. Округлые ядра всегда имеют
электронноплотные ядрышки. Оба типа клеток располагаются на
матриксе, который состоит из большого количества примерно одинаковой толщины коллагеновых фибрилл с отчетливой поперечной исчерченностью.
Кроме описанных двух видов зндостальных элементов на костных балках обнаруживаются стромальные клетки третьего типа.
.72
Часть 1. Теоретическая гематология
Вне зон активного гемопоэза, когда к кости прилежит жировая ткань
или зрелые гемопоэтические элементы, кроветворная паренхима
отделяется от эндоста истонченным клеточным пластом, элементы
которого обозначаются как клетки «костномозгового мешка».
Толщина слоя эндостальных клеток в различных участках трабекулярной кости варьирует. Прежде всего клеточность эндоста и
его структура находится в зависимости от присутствия в эндостальной зоне молодых гемопоэтических клеток гранулоцитарного
ряда. В тех местах, где определяются признаки повышенной пролиферативной активности гемопоэтической ткани, эндостальная
зона отличается увеличенным количеством стромальных клеток в
состоянии повышенной функциональной активности, которые тесно прилежат к молодым кроветворным элементам. Характер межклеточных контактов указывает на существование функциональных взаимосвязей между стромальными элементами эндоста и гемопоэтическими предшественниками. Кроме этого, эндостальные
клетки играют роль сеплективно проницаемой мембраны, регулирующей ионный обмен между костным матриксом и интрамедуллярной средой костного мозга. При этом особо важное значение
имеет обмен кальция, который, как известно, играет значительную
роль в развитии гемопоэтических клеток. Этому способствует присутствие в популяции эндостальных клеток — остеобластов, объем
которых достигает 10%. Также хорошо известно, что в костном
мозге наибольшая концентрация стволовых кроветворных клеток
обнаруживается эндостально, а пролиферативная активность эндостальных зон значительно выше таковой на расстоянии от эндоста. С одной стороны, это связано с оптимальной концентрацией
ионов кальция, с другой, — со способностью стромальных клеток
создавать соответствующее микроокружение для стволовых клеток и влиять на развитие гемопоэтических предшественников посредством межклеточных контактов и широкого спектра гуморальных факторов.
Следует отметить, что кроме охарактеризованных выше клеточных элементов в состав стромы костного мозга входят также
миоциты сосудов, фибробласты и фиброциты, располагающиеся
по ходу части сосудов, нервные клетки. Естественно, они принимают участие в поддержании функции костного мозга как кроветворного органа. При этом их влияние сводится к обеспечению
кровотока. Инструктивная, регуляторная роль процессов самоподдержания, пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников осуществляется эндотелием синусоидальных сосудов, жировыми, ретикулярными и эндостальными клетками.
Глава 4. Трепанобиопсия костного мозга
73
Совершенно очевидно, что функциональные и структурные изменения элементов микроокружения могут быть причиной нарушений кроветворной функции костного мозга. В связи с этим ключевым является вопрос об участии стромы костного мозга в развитии патологических состояний гемопоэза. В настоящее время твердо
установлено значение дефектов стромы костного мозга в развитии
апластической анемии, миелодисплазий, острых и хронических
форм лейкозов, иммунодефицитных состояний (Duhrsen U.,
Hossfeld D., 1996; Tauros S. et al., 2002). В связи с этим учет изменений стромального микроокружения необходим как для определения оптимального лечения, так и для целей прогнозирования заболеваний.
Как известно, клетки стромы костного мозга, так же как и все
клеточные линии гемолимфопоэза, имеют мезенхимальное происхождение. Также установлено присутствие мезенхимальных стволовых клеток, подобных эмбриональным, в костном мозге взрослых. Указанные клетки являются источником развития стромы
костного мозга в течение жизни человека и, по мнению некоторых
исследователей, они обладают способностью развиваться в кроветворные предшественники. Интерес к стволовым клеткам вообще
и стволовым клеткам костного мозга в частности повысился в связи с обнаруженным свойством пластичности стволовых клеток,
т. е. способности стволовых клеток одной линии развиваться в другие клеточные линии (Yannaki Е., 2001; Krause D., 2001; La Russa V.
et al., 2002). Так, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга взрослого человека могут дифференцироваться в кардиомиоциты, гепатоциты, нервные клетки и др. В связи с этим использование стволовых клеток костного мозга взрослых не ограничивается
их применением только в лечении гематологических заболеваний.
В настоящее время стволовые клетки костного мозга, периферической и пуповиннои крови начинают использовать в лечении ряда
соматических заболеваний.
Литература
Ругань В. И., Блинова Т. С, Пономаренко В. М., Абдулкадыров К. М. Ультраструктурная организация кроветворного микроокружения костного мозга человека //' Гематология и трансфузиология. 1991. № 3. С. 11-14.
Теодорович В. П., Абдулкадыров К. М. Трепанобиопсия костного мозга при некоторых гематологических заболеваниях. Л.: Медицина, 1977. 95 с.
Duhrsen i'., Hossfeld D. Stromal abnormalities in neoplastic bone marrow diseases //
Ann. Hematol. 1996. V 73. P. 53-70.
Krause D. Plasticity of marrow-derived stem cells // Gene Ther. 2001. V. 9, N 11.
P. 754-758.
Глава 5
ЦИТОХИМИЯ КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА
Среди многих современных и высокоинформативных методов
диагностики лейкозов морфоцитохимия прочно сохраняет свое
место, и необходимость применения морфоцитохимических методов диагностики лейкозов не вызывает сомнений.
Цитохимия основывается на использовании цветных химических реакций для определения химической природы клеток и выявления в них метаболически активных энзимов и веществ. Химический состав нормальных клеток крови и костного мозга изучен
достаточно хорошо. Диагностическая цитохимия лейкозов базируется на том, что лейкозные клетки, особенно до начала химиотерапии, сохраняют особенности метаболизма и многие из основных
свойств, присущих их нормальным аналогам. Поэтому идентификация лейкозных бластов, а значит, и установление варианта лейкоза в немалой степени основываются на выявлении этих свойств.
Одним из способов идентификации клеток и определения их принадлежности к соответствующей клеточной линии является определение с помощью цитохимических реакций характеризующих
их субстанций и энзимов. Среди них наибольшее диагностическое
значение имеют ферменты — миелопероксидаза, кислая и щелочная фосфатазы, неспецифические эстеразы (а-нафтилацетат-эстераза, кислая неспецифическая эстераза, сх-нафтилбутират-эстераза и хлорацетат-эстераза), а также такие субстанции, как липиды и
углеводы.
Цитохимическая характеристика клеток крови
Углеводы играют важную роль в клеточном метаболизме. Их
расщепление сопровождается выделением большого количества
энергии, обеспечивая таким образом энергетические потребности
76
Часть 1. Теоретическая гематология
клетки. Разнообразные соединения углеводов включают моно- и
полисахариды, в том числе гликоген, кислые мукополисахариды, а
также гликопротеиды, гликолипиды и др. Для выявления углеводов применяют реакцию с использованием реактива Шифф и йодной кислоты — ШИК-реакция, она же PAS-реакция (Periodic Acid
Schiff). Реакция выявляет в клетках не только гликоген, но и некоторые другие углеводы, однако гликоген — самый распространенный и основной полисахарид.
В миелобластах полисахариды могут отсутствовать или может
наблюдаться слабая диффузная или мелкогранулярная реакция.
По мере созревания клеток нейтрофильного ряда их количество
возрастает. Наибольшее количество полисахаридов содержится в
зрелых нейтрофилах, где они выявляются в виде ярко-малиновых
гранул или интенсивной диффузной окраски цитоплазмы. Целесообразно использование контрольной реакции с амилазой, которая устраняет розовое окрашивание цитоплазмы в случае гликогеновой природы углевода. В эозинофилах полисахариды диффузно
окрашивают цитоплазму и не содержатся в гранулах. По данным
Д. Ф. Глузмана (1978), Ф. Г. Дж. Хейхо и Д. К. Кваглино (1983), в
базофилах они не определяются, в то же время S. J. Galli и соавторы
(1983) выявили PAS-положительное вещество в этих клетках. Лимфоциты содержат умеренное количество полисахаридов в виде мелких немногочисленных гранул, иногда в виде венчика вокруг ядра,
на фоне неокрашенной цитоплазмы. Согласно Ф. Г. Дж. Хейхо,
Д. К. Кваглино, в норме 10-40% лимфоцитов содержат PAS-положительное вещество. В моноцитах оно распределяется в виде мелких пылевидных гранул на фоне бледно-розовой цитоплазмы. Реакция тромбоцитов на полисахариды высокоположительна. Мегакариоциты содержат их в виде рассеянных гранул на диффузном
фоне. Контрольный тест с амилазой подтверждает гликогеновую
природу полисахарида в этих клетках.
Кислые сульфатированные мукополисахариды включают хондроитин-4-сульфат и выявляются цитохимически, главным образом в незрелых миелоидных клетках (Морозова В. Т., 1977; Харченко М. Ф. и др., 1986; Kolset S. О., Gallagher J. Т., 1990).
Оксидазы — ферменты, катализирующие окислительные процессы молекулярным кислородом. Среди них особое значение имеет
миелопероксидаза (МП). Энзим миелопероксидаза является очень
важным компонентом клеток, особенно нейтрофилов. Она служит
маркером клеток нейтрофильного ряда и располагается в основном в первичных лизосомальных гранулах (Бронштейн М. И.,
Френкель М. А., 2002). Этот фермент катализирует окисление раз-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
77
личных субстратов, например фенолов и некоторых аминокислот
в присутствии перекиси водорода, которую он расщепляет. Активность МП обнаруживается уже на стадии миелобласта и возрастает в процессе созревания клетки, однако наибольшую активность
фермента демонстрируют промиелоциты. Слабое окрашивание
цитоплазмы эритроцитов и нормобластов выявляет псевдопероксидазу — продукт реакции с гемоглобином (Koike T. et al., 1986).
В эозинофилах выявляется специфическая эозинофильная пероксидаза. По данным одних авторов, МП никогда не выявляется в
базофилах (Глузман Д. Ф. и др., 2000), в то время как другие находят, что она содержится в базофильных про- и миелоцитах и почти
отсутствует в зрелых базофилах (Parwaresch M. R., 1976). Мы же не
наблюдали активность МП в зрелых базофилах. В мегакариоцитах
и тромбоцитах присутствует специфическая тромбоцитарная МП,
которая определяется с помощью электронной микроскопии. Часть
моноцитов дает реакцию на пероксидазу от умеренной до слабой.
Липиды — важная составная часть лейкоцитов — представляют
собой разнообразные соединения, включающие простые липиды:
эфиры жирных кислот, в том числе нейтральные жиры, и сложные
липиды в составе фосфолипидов, гликолипидов (цереброзидов),
аминолипидов, сульфолипидов и др. Они содержатся во многих
клетках крови, за исключением лимфоцитов и эритроидных клеток. Для выявления липидов существует несколько методов, но
чаще применяют метод Sheehan и Storey (1947) и Ackerman (1952)
с Суданом черным Б, который окрашивает фосфолипиды в черный
цвет. Наибольшее их количество содержится в клетках нейтрофильного ряда, начиная с миелобласта, и реакция усиливается с
увеличением зрелости клетки. Половина нейтрофилов содержит
фосфолипиды в составе специфической зернистости. Эозинофилы демонстрируют'сильно положительную реакцию на липиды,
которые содержатся в их гранулах. Реакция на липиды в базофилах, особенно незрелых, положительна, хотя и очень вариабельна
(Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Моноциты могут давать
отрицательную реакцию на липиды, но чаще в них выявляется
вариабельное количество мелких гранул, иногда в виде пылевидной зернистости.
Фосфатазы входят в состав гидролаз. Эти ферменты широко
распространены в клетках человека и животных. Они участвуют в
обменных процессах с жирами, полисахаридами и нуклеопротеидами.
Кислые фосфатазы (КФ) включают изоферменты, катализирующие освобождение фосфата из спиртовых или фенольных
78
Часть 1. Теоретическая гематология
моноэфиров при кислой рН среды. Кислые фосфатазы локализованы в лизосомах и цитохимически выявляются благодаря образованию окрашенных участков красного цвета в местах гидролиза
субстрата. В качестве субстрата могут быть использованы нафтолAS-фосфат, а-нафтилфосфат натрия, нафтол-А8-О-фосфат и др.
Кислая фосфатаза присутствует в большинстве клеток крови и
костного мозга. В гранулоцитах, моноцитах, эозинофилах и базофилах она выявляется, начиная с незрелых клеток этих рядов, где
ее активность наиболее высокая. Во многих клетках, в том числе в
моноцитах, она ингибируется ионами тартрата (Глузман Д. Ф. и
др., 2000). Активность фермента определяется в лимфобластах и
лимфоцитах, где она очень вариабельна. Наибольшая активность
среди клеток этой серии наблюдается в Т-лимфоцитах. Реакция
положительна в плазматических клетках, мегакариоцитах, тромбоцитах и эритробластах. Высокую активность КФ демонстрируют макрофаги. Активность фермента снижена в лимфоцитах при
хроническом миелолейкозе (ХМЛ). В нейтрофилах повышение ее
активности наблюдается при ХМЛ, истинной полицитемии и миелофиброзе.
Щелочные фосфатазы (ЩФ) также относятся к группе гидролитических ферментов. Они способны освобождать фосфат, катализируя отщепление фосфатных групп из фосфомоноэфиров в
щелочной среде. ЩФ принимают участие в обмене липидов и нуклеиновых кислот (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Активность ЩФ присуща только зрелым гранулоцитам. Иногда она
может выявляться в метамиелоцитах (Бронштейн М. И., Френкель М. А., 2002). Фермент локализуется во вторичных гранулах и
пластинчатом комплексе. В эритроцитах, тромбоцитах, моноцитах
ЩФ не выявляется. Небольшая ее активность наблюдается в единичных лимфоцитах. Базофилы реагируют отрицательно, а эозинофилы могут демонстрировать слабую фоновую окраску (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Содержание ЩФ повышается
при воспалительных состояниях, бактериальных инфекциях, лёйкемоидных реакциях, миелофиброзе, полицитемии и снижается
при хроническом миелолейкозе, некоторых миелодиспластических синдромах и пароксизмалыюй ночной гемоглобинурии. Фермент выявляется в виде желто-коричневых гранул в цитоплазме.
Изофермент N-щелочная фосфатаза определяется иногда в лимфоидных клетках у больных хроническим лимфолейкозом, при
лимфомах мантийной зоны (Nanba К. et.al., 1975).
Неспецифические эстеразы (НЭ) также относятся к гидролазам. Эти ферменты способны гидролизовать простые эфиры N-CBO-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
79
бодных спиртов жирных кислот. Это весьма неоднородная группа
энзимов, названия которых обусловлены субстратом, который они
гидролизу ют. Получено более 9 шоферментов НЭ. Фракции 1, 2,
7, 8, 9 выявляются при использовании нафтол-АБ-О-хлорацетата
и представляют активность хлорацетат-эстеразы (ХАЭ), которая
присутствует в гранулоцитах. Фракции 3, 4, 5, 6 взаимодействуют
с эфирами а-нафтилацетата или ос-нафтилбутирата и представляют собою НЭ, выявляемые в моноцитах, плазматических клетках и
тромбоцитах (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983). Наибольший
интерес для гематологов представляют хлорацетат-эстераза, ос-нафтилацетат-эстераза (аНАЭ), а-нафтилбутират-эстераза (осНБЭ).
Неспецифические эстеразы являются лизосомальными ферментами. Существует мнение, что эстеразы участвуют в киллерной функции Т-лимфоцитов (Fcrluga I. J. et al., 1972). а-Нафтилацетатэстераза обнаруживается во всех миелоидных клетках (Wachstein M., Wolf G., 1958), но наибольшая ее активность определяется
в моноцитах, в которых присутствует изоформа аНАЭ, подавляемая фторидом натрия и свойственная только клеткам моноцитарной линии (Дульцина С. М. и др., 1986; Fischer R., Schmalze F.,
1964). Реакция на осНАЭ может быть положительной в нейтрофилах, эозинофилах, лимфоцитах, но в них она не подавляется фторидом натрия. В лимфоцитах, преимущественно Т-клетках, фермент располагается локально, фокусно или в виде 1-2 гранул в
цитоплазме. Фермент выявляется в мегакариоцитах и тромбоцитах. Высокая, нечувствительная к ингибитору активность аНАЭ
наблюдается в макрофагах. В клетках эритроидного ряда в норме
она не определяется.
Кислая НЭ — это фермент, локализующийся в лизосомальных
гранулах. Его активность выявляется в реакции с а-нафтилацетатом в кислой среде при рН 5,8. Она характерна для Т-хелперов и,
по мнению J. Kullenkampf и соавторов (1977), может служить маркером Т-лимфоцитов. Кроме того, она выявляется в клетках моноцитарного ряда.
Хлорацетат-эстеразу (ХАЭ) называют гранулоцитарной, в
отличие от моноцитарных аНАЭ и аНБЭ. Как и миелопероксидаза, она является маркером нейтрофилов. Хлорацетат-эстераза выявляется чаще всего, начиная с промиелоцита, редко миелобласта,
и ее активность постепенно снижается по мере созревания клетки
(Глузман Д. Ф., 1978). Активность фермента выявляется в виде
гранул синего цвета. Часть эозинофилов и моноцитов может демонстрировать слабую активность ХАЭ. Эритроидные клетки отрицательно реагируют в реакции на ХАЭ. Возможно, хлорацетат-
80
Часть 1. Теоретическая гематология
эстераза принимает участие в иротеолитической и переваривающей функции нейтрофилов (Ferluga J. et al, 1972).
Сдвоенную реакцию на ХАЭ и аНАЭ проводят последовательно на одном мазке. Это позволяет разделить клетки гранулоцитарной и моноцитарной линий, что имеет значение при диагностике
миеломоноцитарного лейкоза. При выявлении клеток, демонстрирующих одновременно активность двух ферментов, есть основание диагностировать бифенотипичный вариант этого лейкоза.
Цитохимическая диагностика лейкозов
Франко-американо-британская классификация миелоидных и
лимфоидных опухолей (ФАБ-классификация) (Bennet J. M. et al.,
1976, 1985) основана на морфоцитохимических особенностях незрелых лейкозных клеток. Одновременно с появлением ФАБ-классификации и на смену подобным ей пришли классификации морфоиммуноцитогенетические (MlС-working classification, 1986,
1988), иммунологические — EGIL (Бене М. К. и др., 1996) и др.
В последнее время появились классификации миелоидных и лимфоидных опухолей, которые дополнили существовавшие прежде и
кроме морфоиммуноцитогенетических свойств клеток учитывают
их молекулярно-генетические характеристики (Воробьев А. И. и
др., 2002;"Классификация ВОЗ /Хэррис Н. Л. и др., 2000/; Wardiman J. W. и др., 2002). Кроме острых лейкозов, представленных в
ФАБ-классификации, они включают ряд новых наименований, в
частности вторичные миел областные лейкозы, связанные с проводимым лечением алкилирующими препаратами и радиационным
облучением, ряд лейкозов со специфическими цитогенетическими
и молекулярно-генетическими нарушениями, миел областный лейкоз с мультилинейной дисплазией и др. Согласно рекомендациям
создателей классификации ВОЗ, диагноз острого лейкоза может
быть установлен при достижении 20%-ного уровня бластных клеток в костном мозге (30%-ного — по ФАБ-классификации).
С развитием техники получения моноклональных антител
(МКА) появилась возможность изучения иммунологических маркеров клеток различных клеточных линий (линейные маркеры)
и маркеров различных уровней дифференцировки клеток. Методы проточной цитометрии, иммуноцитохимические, метод непрямой иммунофлюоресценции и другие позволяют выявить экспрессию поверхностных клеточных иммунных маркеров, объединяемых в группы дифференцировочных антигенов — кластеров дифференцировки (CD), — определить принадлежность клеток к
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
81
миелоидной или лимфоидной клеточным линиям и стадию созревания клетки на пути ее дифференцировки. Благодаря иммунофенотипированию клеток среди Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) были выделены в зависимости от стадии
дифференцировки про-Т-тип, пре-Т-тип, кортикальный Т-тип, зрелый Т-тип. Среди В-клеточных ОЛЛ выделены про-В-тип, тип
Common, пре-В-тип, зрелый В-тип ОЛЛ. Кроме этого, выделены
иммунологические варианты так называемых стволовоклеточных
лейкозов.
Значительная часть острых миелобластных лейкозов диагностируется морфоцитохимически. Определение иммунофенотипа
миелобластов необходимо при отсутствии в лейкозных клетках
основных цитохимических маркеров — миелопероксидазы, хлорацетат-эстеразы, липидов или их слишком слабой активности.
Поэтому определение антигенного профиля субстратных клеток
лейкозной популяции необходимо при острых миелобластных лейкозах с минимальной дифференцировкой, монобластных, мегакариобластных лейкозах, эритромиелозе и эритробластном лейкозе.
Диагностике некоторых типов миелобластных лейкозов, вошедших в новейшие классификации, помогают выявленные корреляции между цитогенетическими аномалиями в лейкозных клетках и
их иммунологическими детерминантами. Трудно ассоциировать
иммунофенотип и цитогенетические особенности клеток с их морфоцитохимическими характеристиками и проводить корреляции
между ними. Однако названия лейкозов базируются по-прежнему
на морфологических особегпгостях клеток, а в основе новейших
классификаций лежат морфоцитохимические характеристики, и
диагностическая работа во многих лабораториях начинается с морфоцитохимического анализа клеточного субстрата. Тем не менее
необходимо еще раз подчеркнуть, что только комплексное использование всех современных методов может сделать диагностику лейкоза успешной.
Цитохимическая окраска клеток позволяет разделить острые
лейкозы на 2 основные группы — острые лимфобластные лейкозы
(ОЛЛ) и острые нелимфобластные лейкозы (ОНЛЛ), а также,
основываясь на морфоцитохимических характеристиках клеток,
выделить среди ОНЛЛ несколько основных вариантов. Классификация ОЛЛ в настоящее время полностью основана на иммунофенотипировании и цитогенетике, и тем не менее в ряде случаев морфоцитохимия может иметь некоторое вспомогательное значение в
предварительной дифференциальной диагностике Т- и В-клеточных форм ОЛЛ.
82
Часть 1. Теоретическая гематология
Цитохимические реакции проводятся на мазках крови, лейкоконцентратов, костного мозга, на отпечатках и срезах биопсийного
материала из лимфоузлов, селезенки, кости и других органов и
тканей.
Проведение цитохимических реакций требует строгого соблюдения многих правил, связанных с приготовлением препаратов и
рабочих растворов из реактивов, фиксацией мазков, условиями их
инкубации в процессе реакции и дальнейшей окраской.
Цитохимические реакции следует проводить до начала терапии
лейкоза. Результаты исследований, которые проводятся в процессе лечения, в период рецидивов заболевания, сильно зависят от
химиотерапии, в результате которой может не только измениться
характер и интенсивность цитохимических реакций, но также может быть полностью редуцирована активность некоторых ферментов.
Очевидно, что просто морфологическая диагностика вариантов
острого лейкоза без цитохимических исследований чаще всего невозможна, и в то же время любое цитохимическое исследование
начинается с анализа морфологических особенностей исследуемых клеток, с обычной паноптической окраски. Поэтому правильно говорить о морфоцитохимических исследованиях клеток.
Цитохимические методы иссчедования лейкозов
Перед началом цитохимических исследований производится
морфологический анализ окрашенных по Романовскому- Гимзе или
Май-Грюнвальду мазков костного мозга и/или периферической
крови. Для осуществления цитохимической диагностики лейкозов
широко используются следующие цитохимические реакции:
1. Определение содержания полисахаридов в PAS-реакции по
методам McManus (1946), R. D. Hotchkiss (1948) (Лецкий В. Б.,
1973; Глузман Д. Ф. и др., 2000 ).
2. Определение содержания фосфолипидов в реакции с Суданом черным Б, по методам Shneehan и Storey (1947); Ackerman
(1952).
3. Определение активности миелопероксидазы по методу Sato
(1928) и Quaglino (1958), W. Loele (1936) (Глузман Д. Ф. и др.,
2000; Лецкий В. Б., 1973 ).
4. Определение активности хлорацетат-эстеразы по методу
Moloney с соавт. (1960).
5. Определение активности кислой фосфатазы по методам
Р. П. Нарциссова (1968); Гольдберга и Барка (1962); Берстона
(1958).
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
83
6. Определение активности а-нафтилацетат-эстеразы по методам Хейхо с соавт. (1964); Э. Пирса (1960) в модификации Леффлера(1961).
7. Определение активности щелочной фосфатазы по методам
Kaplow (1955); Ф. Г. Дж. Хейхо. Д. К. Кваглино (1958); М. Г. Шубич (1967) (ЛецкийВ. Б., 1973; Глузман Д. Ф. и др., 2000; Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д. К., 1983).
Общепринятый способ оценки реакции в световом микроскопе
был предложен Kaplow в 1955 г. и в 1957 г. модифицирован Астальди и Верга. Он основан на оценке интенсивности реакции. Прежде
всего в окрашенном препарате подсчитывают не менее 100 исследуемых клеток. При острых лейкозах оценку реакции проводят в
бластных элементах; определяют процент положительно реагирующих клеток (ППК), а также средний цитохимический коэффициент окраски (СЦК).
Реакция считается положительной при наличии 3 и более процентов клеток, в которых выявлена положительная реакция, при
этом количество клеток с положительной окраской может колебаться от 3 до 100%.
Вторым показателем реакции является интенсивность окраски,
которая отражает активность фермента или количество исследуемого вещества в клетке. Она выражается средним цитохимическим коэффициентом — СЦК. Для его вычисления учитывают
различную степень интенсивности окраски клеток. При подсчете
100 клеточных элементов любого типа различают 4 степени реакции: 0 (нулевая) — с отрицательной реакцией; I — со слабоположительной реакцией; II — с положительной реакцией; III — с выраженной реакцией.
Цитохимический коэффициент (СЦК) вычисляют по формуле:
100
где
цифры означают степень интенсивности окраски, а буквы количество клеток (в %), соответствующее указанным в формуле
степеням окраски. Максимальный СЦК равен 3,0.
При 0 (нулевой) степени интенсивности окраски окрашивание
клеток отсутствует.
При I степени интенсивности окраски имеют место единичные
окрашенные гранулы в цитоплазме, либо слабое диффузное окрашивание всей цитоплазмы, либо наличие небольшого окрашенного участка — фокусное или локальное окрашивание.
Часть 1. Теоретическая гематология
84
При II степени интенсивности окраски наблюдается заполнение окрашенными зернами или диффузно почти всей цитоплазмы,
но неокрашенные ее участки имеются.
При III степени окраски интенсивно окрашенные гранулы заполняют всю цитоплазму, иногда частично покрывая ядро. При
диффузном характере реакции наблюдается очень яркая интенсивная реакция во всей цитоплазме. Таким образом, СЦК свидетельствует, как уже было сказано, о содержании вещества или о его
активности в клетке.
Пример: из 100 подсчитанных клеток одного типа (бластных
клеток при остром лейкозе) 50 клеток реагировали отрицательно и
50 клеток — положительно. При этом окрашенные клетки распределились по степени интенсивности окраски следующим образом: I степень — 30 клеток; II степень — 18 клеток; III степень —
2 клетки.
Согласно формуле:
„тт„
v, LLrv =
0x50 + 1x30+2x18 + 3x2
—
U,
/
z,
100
СЦК =0,72; ППК=50%.
При оценке реакции, особенно при отсутствии окрашивания
клеток, необходимо быть уверенным, что нулевая степень интенсивности окраски не зависит от качества реакции. Поэтому надо
обязательно найти в. мазке положительно реагирующие клетки
любого типа. В противном случае реакцию нужно повторять.
Для оценки реакции ориентируются на нормальные цитохимические показатели клеток здоровых людей (Лецкий В. Б., 1973).
Острые миелоидныё лейкозы (ОМЛ)*
Авторы ФАБ-классификации острых миелобластных лейкозов
выделяют 3 типа миелобластов при ОМЛ: I— клетки с узкой голубой или базофильной, не содержащей азурофильных гранул, цитоплазмой, ядром с нежнозернистой структурой хроматина и одной крупной нуклеолой; II — клетки с 2-4 мелкими нуклеолами,
отличаются более широкой цитоплазмой, содержащей от нескольких до 20 азурофильных гранул; III —в периферической крови и
костном мозге больных ОМЛ иногда выявляют бласты с много* Придерживаясь новейшей классификации лейкозов ВОЗ, мы все же сохраняем в тексте нумерацию острых миелоидных лейкозов, рекомендованную
авторами ФАБ-классификации.
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
85
численными азурофильными гранулами; наличие таких бластов в
некоторых случаях ОМЛ с созреванием (М2) коррелирует с транслокацией t(8;21) (Bennet J. M. et al., 1985).
Острый миелобластный лейкоз с минимальной дифференцировкой (ОМЛ МО), или острый недифференцируемый лейкоз
характеризуется отрицательными реакциями на МП, липиды, ХАЭ
и КФ. Может наблюдаться слабоположительная PAS-реакция типичного для ОМЛ диффузного или мелкогранулярного характера.
Очень редко в небольшом количестве бластов выявляется слабая,
не подавляемая фторидом натрия реакция на осНАЭ (Cuneo A.
et al., 1995). Морфологические особенности бластных клеток при
МО преимущественно I типа неоднородны, но преобладают клетки среднего диаметра. Их содержание может достигать 95%. Характерные только для этой формы лейкоза хромосомные аберрации не выявлены (Воробьев А. И. и др., 2002). МО диагностируется по результатам иммунофенотипирования — наличия маркеров
CD13, CD33, CD34, CD117 (Bene M. С. et al., 1998). Дифференциальная диагностика проводится с ОМЛ М7 и ОЛЛ.
Острый миелобластный лейкоз без созревания (ОМЛ М1)
характеризуется наличием в пунктате костного мозга более 90%
бластных клеток. Наблюдаются преимущественно бласты I типа,
без зернистости. Азурофильная зернистость определяется менее
чем в 10% бластов. Согласно Д. Ф. Глузман и соавторам (2000),
палочки Ауэра обнаруживаются приблизительно у 50% больных
ОМЛ Ml. По нашим наблюдениям, палочки Ауэра при этом варианте лейкоза отсутствуют. Властные клетки характеризуются средними и крупными размерами, округлыми, иногда неправильной
формы ядрами с 1-4 нуклеолами и нежнозернистой структурой
ядерного хроматина. Иммунофенотип бластов включает CD33,
CD13, CD117, CD14, CD64, CD15, HLA-DR и МПО, реже CD34,
CD117 (Bene M. С. et al., 1998). Дифференциальный диагноз проводится с ОМЛ М2, ОМЛ М5, ОМЛ М7 и ОЛЛ.
Острый миелобластный лейкоз с созреванием (ОМЛ М2)
отличается от ОМЛ Ml меньшим содержанием бластных клеток в
пунктате костного мозга (менее 89% бластов). Властные клетки I и,
главным образом, II типов характеризуются средними и крупными
размерами и заметным полиморфизмом. Их ядра могут быть
округлыми или неправильной формы. Структура ядерного хроматина тонкодисперсная. Значительная часть бластов содержит азурофильную зернистость (бласты II типа), встречаются палочки Ауэра,
которые могут обнаруживаться в более зрелых гранулоцитах. Созревающие гранулоциты составляют более 10% клеток (Bennet J. M.
86
Часть 1. Теоретическая гематология
et al., 1985). Иммунофенотипические маркеры при ОМЛ М2 —
CD13, CD15, CD33, CD64, МПО, HLA-DR. Небольшое количество бластов экспрессирует CD34 и CD117 (Воробьев А. И. и др.,
2002; Бене М. К. и др., 1996).
Для этих двух вариантов ОМЛ характерна положительная реакция бластов на миелопероксидазу липиды и ХАЭ, которые являются маркерными для миелобластов. Выраженность реакции в бластах на МП вариабельна, по нашим наблюдениям, она колеблется
от 7 до 100% МП позитивных клеток. При ОМЛ М2 процент клеток, положительно реагирующих в реакции на МП, липиды и ХАЭ,
значительно выше, чем при ОМЛ без созревания — Ml. Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме в виде гранул золотисто-желтого цвета при использовании в реакции ортотолидина или в виде
гранул темно-синего цвета при использовании бензидина. Количество гранул различно от случая к случаю — от небольшого их числа
в одном участке цитоплазмы до полного ее заполнения. Реакция на
МП, как и реакция на липиды, часто лучше выявляет палочки
Ауэра, чем обычная паноптическая окраска. Согласно нашим наблюдениям и сообщениям других авторов (Френкель М. А., 1999),
у части больных ОНЛЛ (Ml, M2) могут выявляться только один
или два цитохимических маркера. В ряде случаев при отсутствии в
бластах МП большая часть зрелых нейтрофилов может быть также
пероксидазоотрицательна. В процессе лечения клетки иногда утрачивают фермент.
Вторая маркерная реакция для ОМЛ с созреванием и без созревания — реакция на липиды с Суданом черным Б. По мнению некоторых исследователей и согласно нашим наблюдениям, она даже
более надежна, чем миелопероксидаза (Ковалева Л. Г., 1990). Фосфолипиды выявляются в 14-100% бластов в виде черных гранул,
которые часто заполняют всю цитоплазму клетки. Интенсивность
реакции различна.
Реакция на гранулоцитарную эстеразу — ХАЭ — также является маркерной для нейтрофилов, но имеет меньшее значение в диагностике, особенно для ОМЛ Ml, так как фермент начинает выявляться в основном со стадии промиелоцита. По мере созревания
клеток активность фермента снижается. Реакция на полисахариды не имеет особого диагностического значения. В миелобластах
PAS-положительное вещество может отсутствовать или иметь диффузный или диффузномелкогранулярный характер распределения.
Мелкие, реже средние гранулы темно-малинового цвета беспорядочно располагаются на фоне диффузно окрашенной бледно-розовой цитоплазмы.
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
87
Реакция на а-нафтилацетат-эстеразу способствует дифференциальной диагностике ОМЛ Ml и ОМЛ М2 с острыми моноцитарными лейкозами. Она может быть отрицательной в миелобластах,
однако в случае положительной реакции диагностическое значение имеет отсутствие ингибиции реакции в миелобластах фторидом натрия в отличие от монобластов, в которых она подавляется
ингибитором.
Фермент выявляется в виде буровато-коричневых гранул (при
использовании в реакции синего прочного В или ВВ) на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.
Кислая фосфатаза не имеет диагностического значения для этих
двух вариантов ОМЛ. При наличии положительной реакции необходимо обратить внимание на взаимодействие фермента с ингибитором — ионами тартрата. В отличие от моноцитарных клеток реакция в бластных клетках при мнелобластных лейкозах не подавляется тартратом натрия.
Очень редкий вариант ОМЛ М2 — острый базофильный лейкоз
(классификация ВОЗ, 2000,2002) — характеризуется содержанием
более 5% базофилов от неэритроидной популяции костного мозга. При этом типе ОМЛ выявляется транслокация t(6;9)(p23;q34) и
делеция или транслокация короткого плеча хромосомы 12. Выделяют редкий вариант этого лейкоза, содержащий вариабельное,
иногда значительное, количество базофильных клеток различной
степени зрелости. Клетки характеризуются средним диаметром и
неширокой голубой цитоплазмой. Ядра могут иметь неправильную форму; ядрышки, как это свойственно базофилам, почти не
видны. В бластах выявляется крупная базофильная зернистость.
Реакция на МП, липиды и гранулоцитарную эстеразу отрицательная, но положительная с альциановым синим (Френкель М. А.,
1999). PAS-реакция в виде крупных гранул и блоков. Пунктат костного мозга малоклеточный, кроме базофильных бластов в нем обнаруживают более зрелые клетки этого ряда.
Острый промиелоцитарный лейкоз (ОМЛ МЗ). Особый тип
бластнвгх клеток наблюдается при остром промиелоцитарном лейкозе (ОПЛ, или ОМЛ МЗ). Это название было дано из-за наличия
в лейкемических клетках обильной зернистости. Властные клетки,
или атипичные промиелоциты при ОПЛ характеризуются выраженным полиморфизмом и анаплазией. Их ядра имеют неправильную форму, часто лопастную, двудольчатую, складчатую и могут
располагаться эксцентрично. Цитоплазма — от голубого до базофильного цвета, иногда имеет выросты. В ней выявляется обильная зернистость 2 типов: грубые крупные темно-фиолетовые гра-
Часть 1. Теоретическая гематология
пулы IT более мелкие пурпурного цвета. Гранулы заполяют цитоплазму и иногда покрывают ядро клетки. Как правило, бласты
содержат палочки Ауэра, иногда в виде пучков. Кроме этих бластов
наблюдаются клетки с мелкой зернистостью и не более 8—10%
обычных миелобластов. Это типичный макрогранулярный вариант ОПЛ.
Нетипичный, редкий микрогранулярный вариант этого лейкоза — О МЛ M3v — характеризуется бластами с очень скудной, мелкой, иногда пылевидной зернистостью. Палочки Ауэра немногочисленны. При этом варианте ОПЛ бласты отличаются уродливостью ядер (бобовидные, двудольчатые, лопастные, рассеченные, с
глубокими выемками) и могут напоминать бласты при остром монобластном лейкозе с созреванием (ОМЛ М5в). Из-за этого сходства необходимо проводить дифференциальную диагностику между этими двумя типами лейкоза, тем более что своевременная диагностика ОПЛ важна в связи с возможностью достижения полной
ремиссии под воздействием дериватов ретиноевой кислоты (Савченко В. Г. и др., 2001, а, о; Huang M.-E., 1988). Клетки при ОМЛ
МЗ содержат главные маркеры миелоидных клеток — МП, липиды, ХАЭ в максимальных количествах. Даже реакции на а-нафтилацетат-эстеразу, не подавляемую фторидом натрия, и полисахариды значительно более выражены, чем в бластных клетках при
Ml и М2 вариантах ОМЛ. Основываясь на нашем опыте, следует
отметить, что интенсивность реакций на МП, ХАЭ и осНАЭ хотя и
достаточно высокая, тем не менее в некоторых случаях M3v ниже,
чем при макрогранулярном ОПЛ. При дифференциальной диагностике с монобластным лейкозом с созреванием помогает отсутствие миелоидных цитохимических маркеров или их слабая выраженность и яркая реакция на аНАЭ, подавляемую фторидом натрия в монобластах в отличие от бластов при ОПЛ (Bennet J. М.
et al, 1976). Гранулы лейкозных клеток при ОПЛ содержат кислые
сульфатированные мукополисахариды (Абду'лкадыров К. М. и др.,
1978). С помощью цитогенетических исследований при ОПЛ обнаруживается транслокация t(15;17)(q22;ql2-21) и ряд других аберраций. Иммунофенотипически клетки ОПЛ характеризуются экспрессией антигенов CD13, CD33, МПО, CD64 и CD15. Клетки
не несут антигены CD34, HLA-DR (Савченко В. Г. и др., 2001, а;
Paietta E. et al., 1994).
Острый миеломонобластный лейкоз (ОММЛ, или М4) — билинейный лейкоз, и его клеточный субстрат представлен клетками
нейтрофилыгого и моноцитарного рядов, которые эксирессируют
антигены обеих линий - CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD64,
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
CDllc, CD117, CD4 и HLA-DR. Наиболее частые цитогенетические аберрации — t(9;ll), трисомия 4, t(l;7), t(8;21), связанные с
Hq23. При этом варианте лейкоза обе клеточные линии характеризуются заметной дифференцировкой до зрелых форм. Сумма
миелобластов I и II типов и монобластов в костном мозге обычно
не превышает 60%, а на долю созревающих и зрелых гранулоцитов
и моноцитов приходится в общей сложности от 20 до 40% клеток.
Моноциты периферической крови составляют не менее 5 х 109/л.
Цитохимически выявляются миелобласты, дающие положительную реакцию на МП, липиды, ХАЭ и монобласты, характеризующиеся присутствием в них моноцитарной а-нафтилацетат-эстеразы, подавляемой фторидом натрия (Fischer R., Schmalze E, 1964) и
КНЭ. Дифференциальный диагноз проводится с ОМ Л М2 и ОМ Л
М5в.
Подвариантом билинейного типа ОММЛ является миеломоноцитарный лейкоз с эозинофилией (М4эоз). Количество эоэинофилов в костном мозге составляет более 6%. Имеют место и характерные цитогенетические аберрации, в частности инверсия хромосомы 16 (pl3;q22) и t(16;16)(pl3;q22). Атипичные эозинофилы содержат крупные незрелые пурпурно-фиолетовые гранулы. Имеет
место ядерная гиперсегментация. Эозинофилы дают положительную реакцию на полисахариды и ХАЭ. Властные клетки и даже
зрелые нейтрофилы могут содержать палочки Ауэра.
Бифенотипичный вариант ОММЛ составляет около 1% случаев ОНЛЛ. При этом варианте лейкоза бласты содержат одновременно МП, липиды, ХАЭ и аНАЭ, подавляемую фторидом натрия. В таких случаях при диагностике проводят реакцию на двойную эстеразу — ХАЭ и аНАЭ. Здесь можно увидеть, что одни и те
же клетки содержат цитохимические маркеры как неитрофильнои,
так и моноцитарной линий.
Острый монобластный лейкоз (ОМоЛ, или М5) подразделяется на монобластный лейкоз без созревания (М5а) и с созреванием
(М5в). При М5а-варианте более 80% клеток — монобласты. Это
клетки большого диаметра с округлыми или овальными ядрами,
1-2 нуклеолами, с нежносетчатой структурой ядерного хроматина
и достаточно широкой голубой или базофильной цитоплазмой.
В части клеток наблюдается скудная пылевидная зернистость.
В редких случаях можно видеть очень нежные, едва заметные палочки Ауэра. В бластах "содержится большое количество неспецифической эстеразы (аНАЭ и аНБЭ), подавляемой фторидом натрия и КНЭ. Неспецифическая эстераза, чувствительная к ингибитору, служит маркером моноцитов и монобластов и имеет
90
Часть 1. Теоретическая гематология
большое значение для диагностики острых монобластных лейкозов, будучи высокоспецифичной для этих клеток. Положительная
реакция выявляется в виде красновато- или буровато-коричневых
обильных мелких гранул, заполняющих цитоплазму, поэтому иногда реакция кажется диффузной. Ингибиция реакции вариабельна — от частичной до тотальной. В отдельных монобластах выявляется слабая реакция на миелопероксидазу и липиды в виде редких рассеянных гранул. R. МсКеппа и соавторы (1975) описали
несколько случаев монобластного лейкоза с высокой активностью
аНАЭ, подавляемой фторидом натрия, и слабой активностью ХАЭ
в большинстве клеток. Авторы считают, что в этих случаях бластные клетки обладают свойствами моноцитарных и гранулоцитарных клеток. В литературе приводятся примеры аНАЭ негативных
случаев ОМоЛ (Scott С. S. et al., 1993). Наблюдается умеренная
активность КФ, подавляемая ионами тартрата. Дифференциальный диагноз М5а нужно проводить с ОМЛ МО, ОМЛ Ml.
При ОМоЛ с созреванием (М5в) содержание бластных клеток
колеблется от 20 до 80%, остальные клетки представлены промоноцитами, моноцитами и гранулоцитами. Моноцитарные клетки
при ОМоЛ с созреванием отличаются полиморфизмом. Властные
клетки — крупного размера, с бобовидными, иногда расщепленными, лопастными, вдавленными ядрами, содержащими несколько
нуклеол. Структура ядерного хроматина нежносетчатая; цитоплазма умеренная, со скудной пылевидной азурофильной зернистостью. Как и при ОМоЛ без созревания, при этом варианте лейкоза монобласты содержат большое количество подавляемой фторидом натрия неспецифической эстеразы (Яворковский Л. И., 1987)
и КНЭ. Липиды и пероксидаза содержатся в части бластов в небольших количествах. В сыворотке и моче, как и при ОМоЛ без
созревания, определяется большое количество фермента лизоцима. Бласты при ОМоЛ экспрессируют CD13, CD15, CD33, CD11,
CD4, CD7 и моноцитарные CD 14. При М5а может выявляться
CD34 — антиген ранних клеток-предшественников. Установлены
цитогенетические аберрации — транслокации t(9;ll); t(10;ll);
t(ll;17), связанные с Ilq23.
Нужно еще раз отметить, что в отличие от монобластных лейкозов при Ml, М2, МЗ и М7 вариантах ОМЛ, с которыми нужно
проводить дифференциальный диагноз, позитивная реакция на
аН АЭ обусловлена экспрессией общих или немоноцитарных эстераз (Хейхо Ф. Г. Дж., Кваглино Д., 1983). Реакция в этих случаях
резистентна к ингибиции, но эта резистентность тоже может быть
очень вариабельной. Диагностическое значение имеет высокая
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
91
активность кислой фосфатазы в монобластах при ОМоЛ, которая
ингибируется ионами татрата в отличие от других, не моноцитарных клеток (Яворковский Л. И., 1987; Глузман Д. Ф. и др., 2000).
Гранулоцитарная эстераза (ХАЭ) не свойственна моноцитарным клеткам. Гликоген выявляется в части бластов в виде бледнорозового диффузного или мелкогранулярного окрашивания. ОМЛ
М5в необходимо дифференцировать с ОМЛ M3v и ОМЛ М4.
Острый эритромиелоз (Мб). При остром эритромиелозе число
лейкемических эритрокариоцитов в костном мозге достигает 50%
и более, а содержание бластных клеток составляет более 20% от
числа неэритроидных клеток (классификация ВОЗ, 2000, 2002).
При подсчете бластов эритробласты не учитываются (Wardiman J. W. et al., 2002). Содержание бластов имеет решающее значение при дифференциальной диагностике с В,,-дефицитной и некоторыми другими гемолитическими анемиями, рефрактерной анемией с увеличением бластов, при которых содержание бластных
клеток менее 20%. Властные клетки представлены эритробластами, миелобластами, недифференцированными бластами. Эритроидные клетки имеют признаки выраженной дисплазии, наблюдаются мегалобласты, макроциты, многоядерные эритрокариоциты,
асинхронность в созревании ядра и цитоплазмы, дольчатость ядер.
Могут наблюдаться явления эритрофагоцитоза лейкозными эритробластами. В миелобластах могут обнаруживаться палочки Ауэра.
Признаки дисплазии отмечены в мегакариоцитах и нейтрофилах
(гигантские уродливые ядра метамиелоцитов и палочко- и сегментоядерных нейтрофилов). Наблюдается созревание эритрокариоцитов, и в пунктате можно видеть все стадии эритроидных клеток.
Вообще картина костного мозга при этом варианте лейкоза очень
вариабельна. Миелобласты I и II типов демонстрируют положительные реакции на МП, липиды, ХАЭ. Дополнительное диагностическое значение имеет позитивная PAS-реакция в эритрокариоцитах. PAS-положительное вещество располагается в цитоплазме
незрелых красных клеток в гранулярной форме, а в более зрелых
„аритрокариоцитах — в диффузной форме. Реакция вариабельна и
непостоянна. Это не абсолютно специфичный признак, так как
известны случаи эритромиелоза, когда эритрокариоциты PAS-негативны. Нужно также учитывать, что PAS-позитивная реакция в
ядросодержащих эритроидных клетках встречается при некоторых гемолитических анемиях. В эритрокариоцитах при остром эритромиелозе может быть обнаружена слабоположительная реакция
на ссНАЭ, резистентная к ингибитору, КНЭ и КФ (Глузман Д. Ф. и
др., 2000). Иммунологическими маркерами этого лейкоза являются
92
Часть 1. Теоретическая гематология
CD 13, CD33, CD41, CD71 и гликофорин А. Имеют место хромосомные аберрации, относящиеся к 5 и 7 хромосомам (Воробьев А. И. и др., 2002; Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., 2001, б;
Савченко В. Г. и др., 2001, а).
Вариантом острого эритромиелоза является острый эритролейкоз (Мбв), при котором в костном мозге преобладают эритробласты без признаков созревания (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Френкель М. А., 2001). Лейкемические эритробласты содержат полисахариды в гранулярной форме и в виде блоков. Установить диагноз
острого эритролейкоза помогает иммунофенотипирование, в результате которого выявляется экспрессия эритробластами специфического для них маркера — гликофорина А и В, а также CD36,
CD71, CD33, CD117 (Глузман Д. Ф. и др., 2000; Френкель М. А.,
2001). Дифференциальный диагноз проводится с О МЛ МО, М7
(мегакариоцитарный лейкоз).
Острый мегакариоцитарный лейкоз (М7) — редкая форма острого лейкоза, которая характеризуется очень полиморфной картиной костного мозга. Морфоцитохимическая диагностика этого лейкоза затруднена. Властные клетки в количестве не менее 20% представлены недифференцированными бластами, миелобластами и
микрогенерациями мегакариобластов. Последние почти таких же
размеров, как лимфобласты или миелобласты. Ядра мегакариобластов характеризуются плотной структурой ядерного хроматина,
неотчетливыми нуклеолами, узкой отростчатой базофильной цитоплазмой. Аспират из кости, как правило, беден вследствие миелофиброза и потому часто малоинформативен. В пунктате встречаются микрогенерации мегакариоцитов, свободные ядра мегакариоцитов и их обломки. Иногда можно видеть мегакариоциты,
отделяющие пластинки. Мегакариобласты не содержат липидов,
МПО и ХАЭ. При электронной микроскопии в них выявляется
тромбоцитарная нероксидаза. Они демонстрируют довольно высокую активность осНАЭ, КНЭ и умеренную активность аНБЭ, несколько чувствительных к ингибитору — фториду натрия (Луговская С. А. и др., 1999). Полисахариды располагаются в них в виде
скоплений у края мембраны на фоне диффузно окрашенной в розовый цвет цитоплазмы. Важно исследование периферической крови, где выявляются фрагменты мегакариоцитов и иногда наблюдается гипертромбоцитоз. Нужно проводить дифференциальную диагностику с МО, Ml, M5a и острым лимфобластным лейкозом,
которая возможна только по результатам иммунофенотипирования, выявляющего характерные для М7 маркеры: CD41, CD42 и/
или CD61, CD36. Не менее 50% клеток должны иметь иммунофе-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
93
нотип мегакариоцитов (Логинский В. Е. и др., 1996; Глузман Д. Ф.
и др., 2000). В 5% случаев находят цитогенетические нарушения,
наиболее частыми из которых являются моносомия 7 или трисомия 8, 10 и 21. Таким образом, из острых миелобластных лейкозов
острый недифференцируемый лейкоз, эритролейкоз и острый мегакариоцитарный лейкоз прежде всего нуждаются в обязательном
иммунофенотипировании для установления антигенного профиля
их бластных клеток.
Острый плазмобластный лейкоз — очень редкая форма острого
лейкоза. Одни авторы считают, что он является лейкозом de novo,
следствием пролиферации и экстрамедуллярного распространения незрелых плазматических клеток (Воробьев А. И. и др., 2002;
Mufti G. J. et al.,1996). По мнению других авторов, это может быть
проявлением множественной миеломы, ее бластной трансформацией (Dimopoulos M. A., Palumbo A.,1994). Плазмобластный лейкоз характеризуется анемией и нейтропенией. Костный мозг инфильтрирован плазмобластами и более зрелыми клетками этого
ряда. Маленькие плазматические клетки могут циркулировать в
крови в большом количестве, в отличие от множественной миеломы. Плазмоциты имеют выраженную базофилию цитоплазмы, сгущающуюся к краю мембраны, и перинуклеарную зону. В цитоплазме могут встречаться азурофильные включения, подобные тельцам Ауэра. В некоторых случаях плазмобласты могут достигать
больших размеров и напоминать бластные клетки при некоторых
миелобластных лейкозах или крупные бласты злокачественной
лимфомы (Mufti G. J. et al, 1996). Цитохимически в плазмобластах выявляется высокая активность кислой фосфатазы и р-глюкуронидазы в виде гранул (Глузман Д. Ф., 1978; Хейхо Ф. Г. Дж.,
Кваглино Д. К, 1983). Плазмобласты продуцируют патологические иммуноглобулины. Рекомендовано обязательное иммунофенотипирование для выявления обычных антигенов В-клеточной
лимфоидной дифференцировки и поздних В-клеточных антигенов, например CD38 (Mufti G. J.,1996).
Под нашим наблюдением находилось двое больных с плазмобластным лейкозом. В обоих случаях имело место тотальное замещение костного мозга плазмоцитами различной степени зрелости — от плазмобластов до зрелых плазматических клеток. Плазматические клетки циркулировали в периферической крови, наблюдалась спленомегалия. При проведении цитохимических реакций
у обоих больных в большинстве клеток определялась высокая активность кислой фосфатазы. В части клеток была выявлена аНАЭ
и слабая диффузная реакция на полисахариды.
94
Часть 1. Теоретическая гематология
Острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ). Внедрение метода
иммунофенотипирования позволило разделить ОЛЛ на Т- и IBклеточные типы, включающие иодварианты, соответствующие различным уровням дифференцировки лимфоидных клеток. Возрастные, клинические, прогностические особенности ОЛЛ также показали, что лимфобластные лейкозы представляют собою весьма
гетерогенную группу заболеваний. Авторы последних классификаций лейкозов (классификация ВОЗ, 2000, 2002) сочли нецелесообразным сохранение терминологии ФАБ-классификации для
ОЛЛ (LI, L2, L3) в связи с тем, что диагностические и прогностические критерии морфологических вариантов L1 и L2 недостаточны, их корреляции с иммунофенотипом и генетическими маркерами чаще всего не наблюдается, а форма L3 ОЛЛ является эквивалентом лимфомы Беркитта в фазе лейкемизации. Классификация
ВОЗ включает вместо лимфобластного лейкоза В-лимфобластный
лейкоз/лимфому и Т-лимфобластный лейкоз/лимфому. В то же
время А. И. Воробьев с соавторами (2002) сочли необходимым выделять ранее описанные основные формы В- и Т-лимфобластных
острых лейкозов у детей и взрослых.
Морфологические особенности лейкозных лимфобластов
варьируют в широких пределах. Микрогенерации лимфобластов
(7-10 мкм) характеризуются очень узкой цитоплазмой, плотным
ядерным хроматином, слаборазличимыми единичными нуклеолами. Существуют варианты ОЛЛ, отличающиеся более гетерогенным составом бластной популяции, включающей как мелкие,
так и средние и крупные бластные клетки с ядрами различных
очертаний, более тонкой структурой ядерного хроматина и четкими одним-двумя ядрышками. Их цитоплазма достаточно выражена, и в таких случаях необходима дифференциальная диагностика с ОМЛ — Ml, МО, Мбв. М7. Бластные клетки при беркиттоподобном ОЛЛ/лимфоме Беркитта характеризуются средними и
большими размерами, резко базофильной вакуолизированной цитоплазмой. В настоящее время главным критерием в классификации ОЛЛ являются не морфоцитохимические характеристики
бластов, а их иммунофенотипическая характеристика и выявление линейных (Т- или В-клетки) или стадиеснецифических маркеров. Кроме того, для диагностики имеет значение выявле?ше
различных патогенетических аномалий в лимфобластах. В то же
время в ряде случаев морфоцитохимические особенности лимфобластов могут быть дополнительным критерием в дифференциальной диагностике как между Т- или В-клеточными вариантами ОЛЛ, так и между ОЛЛ и некоторыми формами нелимфо-
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
95
бластных лейкозов. Литературные данные (Глузман Д. Ф. и др.,
1975: Глузман Д. Ф. и др., 1987; Глузман Д. Ф. и др., 2000) и наш
опыт показали, что Т- и В-лимфобласты имеют морфоцитохимическпе особенности. В-лимфобласты отличаются большим полиморфизмом, в то время как Т-лимфобласты — небольшие клетки
с высоким ядерноцитоплазматическим соотношением. Признаком В-лимфобластов является наличие в них, в большинстве случаев, полисахаридов. В миело- и монобластах реакция имеет слабый диффузный или мелкогранулярный характер, причем гранулы располагаются беспорядочно на фоне диффузно окрашенной
цитоплазмы. В В-лимфобластах средние и крупные темно-малиновые гранулы гликогена располагаются в виде венчика на фоне
неокрашенной цитоплазмы, иногда сливаясь в блоки. Могут выявляться лишь 1-2 крупные гранулы в небольшом количестве
клеток, иногда располагаясь над ядром клетки. В Т-лимфобластах полисахариды чаще всего не выявляются или имеют характер
скудной мелкой зернистости в части клеток. В то же время в Т-лимфобластах обнаруживается высокая активность кислой фосфатазы, ос-нафтилацетат-эстеразы и КНЭ. Кислая фосфатаза может
располагаться в цитоплазме этих клеток в виде крупных гранул
или фокусно — в виде пятна. Такой характер распределения фермента, а также отсутствие или слабая реакция на полисахариды
типичны для Т-клеточного ОЛЛ, хотя нужно учитывать, что подобный характер реакции наблюдается иногда в эритро-, моно- и
мегакариобластах. осНАЭ располагается в Т-лимфобластах локально, в виде 1-2 небольших, интенсивно окрашенных пятнышек. Реакция не чувствительна к фториду натрия. Активность
КФ, аНАЭ и КНЭ в В-лимфобластах чаще всего не определяется
или слабо выражена.
Для подтверждения диагноза ОЛЛ имеет значение не только
выявление полисахаридов или кислой фосфатазы, но и отрицательные реакции на маркерные для миелоидных клеток миелопероксидазу, липиды и хлорацетат-эстеразу.
Диагностика редких вариантов бифенотипичных, гибридных
(бласты несут одновременно антигены двух различных клеточных
линий) или стволовоклеточных лейкозов (клетки экспрессируют в
основном антигены ранних предшественников гемопоэза) целиком основана на иммунофенотипировании.
Хронический миелолейкоз (ХМЛ). Роль цитохимических исследований при хронических лейкозах не столь велика, как при
ОНЛЛ, однако нужно отметить важность реакции на щелочную
фосфатазу (ЩФ) в зрелых нейтрофилах при ХМЛ. Щелочная фос-
96
Часть 1. Теоретическая гематология
фатаза является маркером этой формы лейкоза. При ХМЛ в развернутой фазе заболевания активность ЩФ в нейтрофилах резко
снижена или может вообще отсутствовать. Дефицит ЩФ в нейтрофилах ассоциирован с хромосомными нарушениями при ХМЛ и
является скорее всего результатом транслокации t(9;22) и существования химерного гена BCR-ABL.
Властный криз ХМЛ характеризуется повышением активности
ЩФ и иногда ее полной нормализацией. Определение активности
ЩФ имеет значение при дифференциальной диагностике ХМЛ с
миелофиброзом, полицитемией и лейкемоидными реакциями, при
которых активность ЩФ нормальна или даже повышена. Использование цитохимических реакций на МП, фосфолипиды и полисахариды способствует идентификации БК ХМЛ миелоидного или
лимфоидного типа.
Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ). При ВКЛ более чем в
90% случаев клетки имеют иммунофенотип зрелых В-лимфоцитов. Они экспрессируют пан-В-клеточные антигены CD19, CD20,
CD22. Кроме обычного варианта ВКЛ описывают лейкемический
тип этого заболевания, при котором, как считают, лейкемические
клетки менее зрелые. Особенностью ВКЛ является присутствие в
костном мозге и периферической крови специфических лейкемических клеток, морфология которых послужила основанием для
появления названия этого лейкоза. Это мононуклеары, цитоплазма которых имеет отростчатые, ворсинчатые очертания. Ядра клеток круглые, овальные, лопастные, имеют нежносетчатую структуру хроматина и слабо контурируемые 1-2 нуклеолы. Цитоплазма
голубого или серо-голубого цвета. Для диагностики ВКЛ имеет
значение выявление активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы, которая обнаруживается у 95% больных (Луговская С. А.
и др., 1999), и НЭ. Одно-, двух- или трехростковая цитопения,
нейтропения и моноцитопения, а также спленомегалия очень характерны для ВКЛ (Волкова М. А., 2001).
Таким образом, вопреки мнению некоторых авторов, предлагающих отказаться от морфоцитохимического анализа клеток при
диагностике лейкозов (Бене М. К. и др., 1996), в настоящее время'
общепризнано, что первоначальная диагностика большинства
ОНЛЛ основана на результатах морфоцитохимических исследований, которые являются в этих случаях достаточно информативными и доступными методами. В то же время для диагностики
таких вариантов штелобластных лейкозов, как ОМЛ Ml, ОМЛ
МО, ОМЛ Мбв, ОМЛ М7, для дифференциальной диагностики
между М2 и M3v, М5в и M3v вариантами ОМЛ, а также для всех
Глава 5. Цитохимия клеток крови и костного мозга
97
лимфобластных лейкозов необходимо проводить иммунофенотипирование и цитогенетические исследования.
Литература
Абдулкадыров К. М., Харченко М. Ф., Шляпочникова Г. П. и др. Цитоморфологические и некоторые биохимические особенности бластных клеток при остром
промиелоцитарном лейкозе // Пробл. гематол. 1978. № 23(9). С. 18-20.
Бене М. К., Кастольди Г., Harm В. и др. Предложения для иммунологической
классификации острых лейкозов (Европейская группа по иммунологической
классификации лейкозов) // Гематол. и трансфузиол. 1996. № 6. С. 43-45.
Бронштейн М. И., Френкель М. А. Гистохимические особенности лейкоцитов
крови и костного мозга в норме /'/ Руководство по гематологии / Под ред.
А. И. Воробьева. М, 2002.Т. 1. С. 137-145.
Волкова М. А. Волосато-клеточный лейкоз // Клиническая онкогематология:
Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 396-410.
Воробьев А. И., Бриллиант М. Д., Савченко В. Г. Гемобластозы // Руководство по
гематологии / Под ред. А. И. Воробьева. М., 2002. Т. 1. С. 147-236.
Глузман Д. Ф., Юдин В. М., Сидоренко С. П. и др. Морфологические критерии
распознавания Т- и В-лимфоцитов и их возможное применение при изучении
неопластических процессов // Иммунология опухолей. Киев, 1975. С. 57-59.
ГлузманД. Ф. Диагностическая цитохимия гемобластозов. Киев, 1978. 215 с.
Глузман Д. Ф., Скляренко Л. М., Надгорная В. А. и др. Рецепторы поверхностных
мембран, дифференцировочные антигены и цитохимические признаки клеток
крови при остром лимфобластном лейкозе у детей // Эксп. онкол. 1987. № 3.
С. 36-39.
Глузман Д. Ф., Абраменко И. В., Скляренко Л. М. и др. Диагностика лейкозов:
Атлас и практическое руководство / Под ред. Д. Ф. Глузмана. Киев, 2000.
Дульцина С. М., Дягилева О. А., Кореневская М. К. и др. Исследование активности ос-нафтилбутират-эстеразы в клетках периферической крови здоровых людей // Лаборат. дело. 1986. № 10. С. 590-594.
Ковалева Л. Г. Острые лейкозы. М„ 1990. 272 с.
Лецкип В. Б. Цитохимические исследования лейкоцитов. Л., 1973. 36 с.
Логинский В. Е., Выговская Я. И., Масляк 3. В. и др. Значение иммунологического фенотипирования бластных клеток в диагностике острой миелоидной лейкемии у взрослых // Эксп. онкол. 1996. № 18. С. 146-149.
Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е. Лабораторная диагностика лейкозов: Учебное пособие. Тверь, 1999. 78 с.
Морозова В. Т. Лабораторная диагностика лейкозов. Л., 1977.152 с.
Пирс Э. Гистохимия. М., 1962. 944 с.
Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., Исаев В. Г. и др. Острые промиелоцитарные
лейкозы: Эпоха новых знаний и достижений // Гематол. и трансфузиол. 2001.
№ 46 (3). С. 26-34 (а).
Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н. Острые лейкозы // Клиническая онкогематология. Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М, 2001. С. 156-207 (б).
Френкель М. А. Современная диагностика острых лейкозов // Заочная академия последипломного образования. М., 1999. С. 25-33.
Френкель М. А. Лабораторная диагностика острых лейкозов // Клиническая
онкогематология: Руководство для врачей / Под ред. М. А. Волковой. М., 2001.
С. 146 151
4 Гематология. Нов. справочник
Глава 6
КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ В ГЕМАТОЛОГИИ
Кроветворные клетки животных и человека начали культивировать в конце XIX—начале XX в. (Скворцов И. П., 1885; Arnold,
1887; Maximov A. A., 1927).
Под культурой клеток понимают совокупность жизнеспособных клеточных элементов, полученных в результате их выращивания и сохранения при определенных условиях вне организма хозяина. Для культивирования клеток и тканей, а также поддержания
их жизнедеятельности применяют различные культуральные системы. Культуральные системы с использованием сред на гелевой
основе (агар, метилцеллюлоза, коллаген), в отличие от жидких
культур, ограничивают способность имплантированных в среду
клеток к движению, фиксируют их в одном месте, не позволяя
«расползаться» в процессе деления материнской клетки. Таким
образом, клетки, способные пролиферировать, образуют в полутвердых и вязких средах дискретные колонии — клеточные агрегаты, представляющие из себя клон, т. е. потомство одной делящейся
клетки, состоящее из однотипных клеточных элементов, которые
можно анализировать. Поэтому методы культивирования клеток в
полутвердых и вязких средах, а также колониеобразование в условиях in vivo, называют методами клонирования.
Изучение кроветворных клеток и клеток стромы костного мозга
с использованием методов клонирования относится к 70-м годам
прошлого столетия. С этого времени, благодаря работам J. E. Till,
Е. A. McCulloch (1961), а также исследованиям A. J. Friedenstein и
соавторов (1968), Т. R. Bradley, D. Metcalf( 1966) и других исследователей, методы клонирования кроветворных и стромальных клеток заняли прочное место среди других функциональных методов
изучения системы крови. Клонирование кроветворных клеток открыло новые огромные возможности для понимания процессов
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
101
кроветворения. Благодаря этому удалось доказать клоногенный
характер стволовых кроветворных клеток (СКК), т. е. происхождение клона однотипных клеток из одной исходной клетки.
Выявление клонов, содержащих клетки двух и более клеточных
типов (смешанные колонии), доказало полипотентность СКК, то
есть способность их к развитию в направлении всех кроветворных
ростков. Разработка воспроизводимых методов клеточных культур для различных типов гемопоэтических клеток-предшественников послужила мощным импульсом для изучения нормального
и патологического кроветворения. Культуральные методы, позволившие изучать гемоноэз ex vivo, оказались очень полезными для
исследования СКК, коммитированных (направленных к дифференцировке) клеток-предшественников (ККП) и их потомства, а
также для различных манипуляций с гемопоэтическими клетками
в культуре, изучения экспрессируемых ими медиаторов кроветворения — цитокинов, влияния на эти клетки различных экзо- и
эндогенных факторов, таких как радиация, медикаментозные средства и различные гуморальные и физические факторы.
Методы клонирования клеток позволили оценить величину пула
СКК в костном мозге, охарактеризовать потомство этих клеток,
объединенных в клоны, выявить промежуточные этапы их дифференцировки от мультипотентной СКК через стадии коммитированных поли- и моноолигоиотентных клеток-предшественников
различных клеточных линий до уровня морфологически распознаваемых в световом микроскопе бластных клеток костного мозга, а также доказать клоногенные свойства стволовых клеток и
клеток-предшественников стромы костного мозга. Поли- и моноолигопотентные клетки-предшественники способны дифференцироваться в направлении 2-5 кроветворных линий. Клетки, дающие
рост колоний в условиях вне организма, называют колониеобразующими единицами (КОЕ). Например КОЕ, образующие в агаре,
метилцеллюлозе или селезенке облученного животного смешанные колонии из гранулоцитов, эритрокариоцитов, макрофагов и
мегакариоцитов, называют КОЕ-ГЭММ и т. д.
Результаты этих исследований, ставшие возможными благодаря внедрению методов клонирования, изучение кинетики гемопоэтических клеток, открытие явления апоптоза — запрограммированной клеточной смерти — оказались чрезвычайно важными для
понимания механизма гомеостаза — равновесия внутренней среды
организма и сбалансированности всего процесса кроветворения.
Сегодня значение культуральных исследований гемопоэтических
клеток для науки и практической медицины трудно переоценить.
102
Часть 1. Теоретическая гематология
В то же время необходимо решать многие проблемы, связанные с
особенностями культуральных методик, в частности, с вариабельностью роста и качеством колоний в зависимости от типа культуральной системы, количества и концентрации различных компонентов культуральных сред, применяемых в различных лабораториях.
Стандартизация и оптимизация культуральных сред и условий
культивирования призваны уменьшить возможные ошибки и повысить адекватность и информативность этих методов. Среди необходимых условий культивирования нужно отметить прежде всего использование качественных культуральных сред, содержащих
необходимые колониестимулирующие факторы (КСФ), а также
температурные условия, влажность, газовую среду и т. д. Нарушение условий культивирования приводит к снижению эффективности клонирования и изменению качества и морфологического состава клеточных агрегатов в культуре.
Методы культивирования клеток
По способу культивирования клеток различают культуры ех
vivo — вне организма и in vivo — в организме. Для выращивания
клеток ex vivo применяют различные культуральные системы и
среды. Культуралыгая среда призвана обеспечить оптимальный режим жизнедеятельности клеток и тканей. Среды для культивирования делят на естестественные (сыворотка, плазменный сгусток и
др.) и синтетические (среды Игла, МакКоя, Пскова и их модификации — D-MEM, IMDM, RPMI и многие другие). Хорошо зарекомендовали себя среды IMDM (среда Дульбекко, модифицированная Исковым), среды с метилцеллюлозой (Methylcellulose Culture
Medium), «полные» среды с эмбриональной телячьей сывороткой
(ЭТС), эритропоэтином (ЭРП) и всеми необходимыми для роста
СКК и коммитированных клеток-предшественников ростовыми
факторами, а также «неполные» — без ЭРП, или ЭТС, или какихлибо цитокинов. Культуральные среды предназначаются для поддержания жизнедеятельности непролиферирующих соматических
клеток (поддерживающие среды) или для обеспечения процессов
пролиферации и дифференциации клеток (ростовые среды с ростовыми факторами).
Культуральные среды могут быть жидкими, вязкими, полутвердыми и твердыми. Синтетические среды состоят из воды, солевых
растворов, буферных систем, витаминов, аминокислот, ростовых
факторов и т. д. Составной частью многих сред являются сыворотки: крови человека, эмбриональная телячья, бычья, лошадиная,
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
103
свиная, новорожденных телят и ягнят, сыворотка плаценты здоровых рожениц (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985; Гольдберг Е. Д.
и др., 1992). Культуры могут быть краткосрочными (4-24 часа). 814-дневными и длительными (5-8 недель и более), в зависимости
от поставленных задач.
По характеру базового субстрата культуральные системы делятся на: 1) суспензионные, где клетки находятся в жидкой питательной среде в разобщенном состоянии; 2) на основе плазменного
сгустка; 3) на основе полутвердых агаровых или коллагеновых сред;
4) на основе вязких сред — метилцеллюлозы. Кроме того, клональный рост стволовых кроветворных клеток и коммитированных клеток-предшественников изучают in vivo, например, в селезенке смертельно облученных мышей или в диффузионных камерах с агаром
или плазменным сгустком, имплантированные облученным животным интраперитонеально или под капсулу почки, а также в
длительных культурах на стромальной подложке. Основным условием для получения колоний, образованных различными гемопоэтическими предшественниками, является присутствие в культуре
необходимых колониестимулирующих факторов (факторов роста
клеток).
Метод селезеночных колоний (Till J. E., McCulloch E. A., 19G1)
заключается в том, что внутривенно вводят костномозговую клеточную взвесь смертельно облученной мыши, собственный гемопозз которой тотально подавлен, после чего в ее селезенке образуются макроскопически видимые скопления кроветворных клеток,
каждое из которых является клоном, т. е. представляет собою потомство одной клетки — колониеобразующей единицы селезенки
(КОЕс). Среди них наблюдаются колонии, состоящие из однотипных клеток (гранулоцитов, макрофагов, эозинофил'ов, эритроидных
клеток и др.), и смешанные колонии, включающие представителей
двух и более клеточных линий. Так был доказан клоногенный
характер КОЕс и их полипотентность — способность развиваться в
направлении нескольких клеточных линий. При переносе отдельных клеток из этих колоний в новую культуральную систему снова получали дискретные колонии из однотипных клеток или смешанные колонии, что говорит о способности этих клеток к самоподдержанию. Полагают, что в селезенке облученных животных
клональные свойства проявляют СКК с ограниченной способностью к самоподдержанию, а также их потомки — коммитированные клетки-предшественники клеточных линий (коммитирование — необратимая направленность стволовой клетки к дифференцировке).
104
Часть 1. Теоретическая гематология
Различные культурадьные системы обладают различной «разрешающей» способностью для клонирования клеток. Простые агаровые системы, в которых источником КСФ для клоногенных клеток служат лейкоциты донорской крови, обеспечивают клональный рост только моно- и бнпотентных КОЕ, или КОЕк — колониеобразующих единиц в культуре, где они формируют локализованные клеточные агрегаты — колонии, которые могут быть идентифицированы и анализированы под обычным световым микроскопом. Среди них различают КОЕ-Г (гранулоцитарные), КОЕ-М
(моноцитарно-макрофагальные), КОЕ-Эоз (эозинофильные),
КОЕ-ГМ (гранулоцито-макрофагальные) и др. Более сложные
культуральные системы, оптимизированные кондиционированными средами (КС) или различными КСФ, обеспечивают клональный рост не только уни- и бипотентных клеток-предшественников, но и КОЕ-ГЭММ.
Для культивирования клеток используют стерильные пластиковые или стеклянные чашки Петри, флаконы Карреля, Эрла и др.
Культивирование производят либо в инкубационных камерах
при +37 °С, с постоянной газовой атмосферой (кислорода — 5%,
углекислого газа — 10% и азота — 85%) и 100% влажностью, либо в
термостате при +37 °С, в герметически закрытых стеклянных эксикаторах или пластиковых контейнерах, где также поддерживается необходимая влажность и газовая атмосфера.
Для достижения эффекта клонирования в культуральную среду
должны быть внесены стимуляторы роста клеток (специфические
ростовые факторы). Характер и количество ростовых факторов
зависят от типа культуралыгой системы и поставленных задач.
Культивирование клеток в агаре
Клетки-предшественники грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ).
Полутвердые агаровые среды используют в одно- и двухслойных
агаровых культурах для выращивания и поддержания жизнедеятельности моноцитарно-макрофагальных, гранулоцитарных, гранулоцито-макрофагальных и других миелоидных клеток-предшественников. Агар, получаемый из морских водорослей, образует
гелевый субстрат, позволяющий клонировать клетки. Используют
такие образцы агара, как бактоагар Difco (США), агар-агар, бактоагар Serva (Германия) и др.
В 1966 г. Т. R. Bradley и D. Metcalf в двуслойной агаровой системе культивировали костный мозг мыши и получили рост гранулоцито-макрофагальных колоний. В 1970 г. В. L. Pike и W. A. Robinson
использовали двуслойную агаровую среду для культивирования
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
105
человеческих кроветворных клеток. При данном методе в чашку
Петри помещают 0,5%-ный расплавленный агар с донорскими лейкоцитами (источник КСФ) и после застывания на него наслаивают верхний слой 0,3%-ного агара с тестируемыми клетками в количестве 1,0-1,5 х 10'миелокариоцитов. Таким образом, нижний слой
служит питательной средой для клеток верхнего слоя.
Колониестимулирующим фактором для гранулоцитов и макрофагов в этой системе является КСФ, продуцируемый моноцитами
и макрофагами донорской крови. Чашки Петри помещают в термостат при описанных выше условиях на 7-8 дней. По истечении
этого срока оценивают количество выросших клеточных агрегатов-колоний и кластеров в световом микроскопе. За кластер принимают клеточные агрегаты, содержащие от 3 до 40-50 клеток.
Агрегаты в составе 40-50 и более клеток оцениваются как колонии. Количество гранулоцитарных, моноцитарно-макрофагальных
и гранулоцито-моноцитарных колоний в норме колеблется от 8 до
150 на 1 х 105 миелокариоцитов — в среднем около 30, количество
кластеров — от 10 до 340 на 1 х 105 миелокариоцитов — в среднем
около 70 (Афанасьев Б. В. и др., 1980; Балашова В. А., 1985; Entriiiger M. A. et al., 1977). Соотношение кластер/колония в норме колеблется в среднем от 2 до 5 и не превышает 12 (Metcalf D. et al.,
1979). Эта культуральная система пригодна для клонирования
КОЕ-Г, КОЕ-М и КОЕ-ГМ. В культуре доказана их высокая чувствительность к радиации, воздействию химиопрепаратов и таких
физических факторов, как излучение лазера, УФО, магнитные излучения, соединения перфторуглеродов и т. д. (Балашова В. А. и
др., 1988; Абдулкадыров К. М. и др., 1992, 1995).
Культивирование гемопоэтических клеток в системе
«агаровая капля—жидкая среда»
Эта система предложена Б. В. Афанасьевым в 1983 г. и предназначена главным образом для клонирования КОЕ-Г, КОЕ-М и
КОЕ-ГМ. В отличие от системы Пайка и Робинсона она не содержит нижнего агарового слоя. Вместо верхнего слоя агара используется агаровая капля — гель. Тестируемые клетки имплантируют в
0,3%-ный агар (Difco, США) в количестве 1,0-1,5 х 105 миелокариоцитов на 0,5 мл агаровой среды, включающей также ЭТС и
питательную среду типа D-MEM, IMDM и др. С помощью шприца
и тупоконечной иглы жидкий агар с клетками размещается на дне
чашки Петри, где и застывает в форме капли-геля. После застывания капли в чашку наливают 2,5 мл питательной среды с донорски6
ми лейкоцитами в концентрации 1 х 10 клеток на 1 мл жидкой
IOG
Часть 1. Т е о р е т и ч е с к а я г е м а т о л о г и я
среды (фидер). В состав среды входят также ЭТС и антибиотики.
Фидер служит источником гранулоцитарно-моноцитарного КСФ,
основным продуцентом которого являются моноциты донорской
крови. Эффективность клонирования возрастает при внесении в
жидкую фазу системы специальной среды, кондиционированной
стимулированными ФГА (фитогемагглютинин) монойуклеарными лейкоцитами периферической крови, или добавлении коктейля
из рекомбинантных цитокинов (McNiece I. К. et al., 1991; Bernstein I. D. et al., 1991; Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995).
В таких системах растут не только КОЕ-ГМ, но и КОЕ-ГЭММ, и
КОЕ-Бл (бластные колонии). Преимуществом системы «агаровая
капля—жидкая среда» является способность поддерживать клональную пролиферацию не только нормальных, но и лейкозных
клеток (Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). Система также более оптимальна для межклеточных взаимодействий тестируемых
клеток с клетками фидера (лейкоцитами донора) и позволяет изучать влияние на КОЕ-ГМ различных веществ, препаратов и физических факторов.
Клонирование клеток-предшественников эритропоэза
и мегакариоцитопоэза (БОЕЭ, КОЕЭ, БОЕ- Мгщ КОЕ Мгкц)
Для клонирования клеток-предшественников эритропоэза
(КПЭр) используют различные культуральные системы, но главным образом системы с применением плазменного сгустка, агара
или метилцеллюлозы. Получение максимально обогащенной клетками-предшественниками эритропоэза клеточной взвеси достаточно трудоемко и состоит из нескольких этапов, одним из которых
является осаждение клеток в градиентах плотности (Stephenson I. R.
et al., 1971; Tepperman A. D. et al., 1974). Культивирование КПЭр в
агаровых культурах практически не отличается от культивирования КОЕ-ГМ, однако при клонировании эритроидных предшественников необходимо внесение в культуру главного регулятора
эритропоэза — эритропоэтина (ЭРП) и некоторых кондиционных
сред (бурстстимулирующей активности — БСА), полученных в
результате стимулирования ФГА клеток селезенки или лейкоцитов (ФГА-ЛКС). Более ранние примитивные предшественники
эритропоэза называют бурстобразующие («бурст» — взрыв) единицы эритропоэза (БОЕ-Э). Они формируют в метилцеллюлозе,
оптимизированной кондиционированными средами и/или ростовыми факторами, большие агрегаты из 16 и более кластеров и содержат до 104 клеток. Более зрелые БОЕ-Э образуют малые бурсты из 3-8 кластеров и могут содержать 200-500 гемоглобинизи-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
107
рованных эритроидных клеток. КОЕ-Э (колониеобразующие единицы эритропоэза) образую! агрегаты, содержащие 100-200 эритрокариоцитов (Eaves С. I., Eaves А. С, 1978; McNiece et al, 1991).
Для идентификации клеток в эритроидных колониях и бурстах
используют также пероксидазную окраску с бензидином (Гольдберг Е. Д. и др., 1992), производят оценку колоний по способности
клеток утилизировать железо (59Fe) или проводят иммунофенотипирование для выявления маркера эритроидных клеток — гликофорнна А.
Для клонирования клеток-предшественников мегакариоцитопоэза (БОЕ-Мгкц и КОЕ-Мгкц) используют различные культуральные системы: культивирование в агаре, плазменном сгустке,
на коллагене и агарозе. Разработана система с использованием свободной от ЭТС среды, так как ЭТС, содержащая TGF-p и обычно
используемая в системах для клонирования эритроидных и гранулоцитарно-моноцитарных клеток-предшественников, ингибирует
рост мегакариоцитов (Kaushansky К.,1995; Bertolini F. et al., 1997).
Рекомбинантные цитокины, особенно тромбопоэтин, а также IL3 и
IL6, позволяют оптимизировать условия для пролиферации и дифференциации КОЕ-Мгкц. Кроме того, использование гелевых полутвердых сред па коллагене (среда Mega-Cult) позволяет клональному потомству одной клетки оставаться вместе для образования колоний. Коллаген, как считают, удобен и предпочтителен
для формирования стабильного гелевого матрикса, который поддерживает рост и развитие КОЕ-Мгкц и позволяет in situ производить иммуногистохимическую окраску колоний с использованием
антител против CD41 (маркера мегакариоцитов) после дегидратации геля. При окраске на кислую фосфатазу мегакариоциты окрашиваются в розовый цвет, а их ядра — в голубой.
Мегакариоцитарные колонии должны содержать от 4 до 50 клеток. Выделяют три типа колоний: I — колонии из 4-30 зрелых
мегакариоцитов; II — колонии из более чем 30 клеток мегакариоцитарного ростка; III — колонии из мононуклеаров, экспрессирующих маркеры мегакариоцитов и дифференцирующиеся позже в
мегакариоциты (Гольдберг Е. Д. и др., 1992).
Клонирование полипотентных коммитированных
предшественников в агаре и метилцеллюлозе
В полутвердой агаровой и вязкой метилцеллюлозной средах в
присутствии кондиционированных сред (КС) и ЭРП происходит
рост смешанных колоний - КОЕ-ГЭММ, КОЕ-ГЭМ, КОЕ-ГММ,
КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭ, КОЕ-ЭМ (Колесникова А. И., Смирнов А. Н.,
108
Часть 1. Теоретическая гематология
2002; Johnson G. R., Metcalf D., 1977; Fauser A. A., Messner H. A.,
1979). Разработаны высокоэффективные «полные» среды IMDM
на метилцеллюлозе с коктейлем из рекомбинантных цитокинов.
Компоненты этих сред поддерживают рост в культуре СКК и обеспечивают рост мультилинейных колоний (КОЕ-ГЭММ), эритроидных колоний (БОЕ-Э, КОЕ-Э), грануломоноцитарных (КОЕТМ)
и др. (Bernstein I. D. et al, 1991). «Полная» среда может включать
кроме метилцеллюлозы с IMDM эмбриональную телячью сыворотку, бычий сывороточный альбумин, 2-меркаптоэтанол, L-глютамин, ростовый фактор стволовых клеток (ФСК), ГМ-КСФ, ИЛ-3,
ИЛ-6, Г-КСФ и ЭРП. В таких системах СКК способны в течение
2-3 недель образовывать очень большие (>10 3 клеток) колонии,
состоящие только из бластов. Перенесенные в свежую среду бласты генерируют дочерние бластные колонии, демонстрируя способность к самоподдержанию. Оптимизировать рост бластных колоний, в состав которых входят СКК, можно, используя взвесь костномозговых клеток, обогащенных субпопуляциями СВ34*-клеток,
являющихся ранними предшественниками гемопоэтических клеток.
Длительные клеточные культуры
Эти культуры растут на подложке — выращенном слое стромальных клеток — фибробластов, адипоцитов, макрофагов, эндотелиальных клеток (Чертков И. Л., Гуревич О. А., 1984; Dexter Т. М.
et al., 1977). Клетки в этих культурах можно многократно пересевать, они выдерживают несколько пассажей и не теряют полипотентности (Moore M. A. S. etal, 1978; Petzer A. L. etal., 1996). Это
происходит благодаря контакту кроветворных тестируемых клеток со стромальными клетками подложки, питающими их. В длительных культурах кроме уни- и бипотентных КОЕ достигается
рост ранних гранулоцитарных, эритроидных и мегакариоцитарных
клеток-предшественников уровня КОЕ-ГЭММ, КОЕс, КОЕ-Бл,
КООБ, а также Т-лимфоцитов (Дерюгина Е. И. и др., 1990;
Fanning S. F. et al., 1993). КООБ — клетки, образующие области
«булыжника», были названы так потому, что клеточные элементы
в них тесно прилегают друг к другу. Каждая КООБ является клоном, состоящим из бластов, среди которых находятся и СКК. Кроме того, в длительных культурах на стромальной подложке выявлено большое количество мезенхимальных полипотентных клеток, которые, как известно, являются предшественниками не только
клеток стромы, но и при определенных условиях могут трансформироваться в гемопоэтические клетки (Friedenstein A. J. et al.,1968;
Репин В. С, 2001; Сухих Г. Т. и др., 2002; Seshi В. et al.. 2000).
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
109
Длительные клеточные культуры, оптимизированные жидкой
средой типа MyeloCult (Myeloid Long-term Culture Medium) (Канада), в присутствии рекомбинантных цитокинов позволяют:
1) создать слой стромальных клеток для поддержания примитивных гемопоэтических клеток; 2) охарактеризовать ростовые факторы, ингибиторы и молекулы адгезии, продуцируемые стромальными клетками; 3) проанализировать факторы, влияющие на нормальные и лейкемические клетки на модели костномозгового
микроокружения ex vivo; 4) исследовать клетки, индуцирующие
длительную культуру; 5) нарастить популяцию гемопоэтических
клеток.
При исходной плотности костномозговых клеток более 10ь на
1 мл в длительной культуре сначала образуется «прилипающий»
слой мезенхимальных стромальных клеток. Примитивные гемопоэтические клетки при наличии соответствующей среды и добавок,
условий инкубирования и графика питания, в течение многих недель взаимодействуя со стромальной подложкой, образуют миелоидные клоногенные предшественники и зрелые гранулоциты. Жидкую среду MyeloCult при добавлении кондиционированных сред
или рекомбинированных цитокинов также можно использовать
для наращивания массы гемопоэтических предшественников в свободной от стромы суспензионной культуре.
Методы клонирования гемопоэтических клеток
при гематологических заболеваниях
Разработка и внедрение методов клонирования кроветворных
клеток открыли новые возможности для понимания природы
лейкозной стволовой клетки, уровня ее поражения лейкозогенными факторами, патогенеза лейкозов (Чертков И. Л., Фриденштейн А. Я., 1966; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). Культуральные системы обеспечивают клональный рост костномозговых
клеток и делают возможным изучение процессов пролиферации и
этапов дифференцировки клеток-предшественников и их потомков в условиях ex vivo. При культивировании клеток крови и костного мозга клоногенные свойства могут проявлять как лейкозные,
так и нормальные клетки. D. Metcalf (1984) справедливо отметил,
что говорить с уверенностью о принадлежности колониеобразующих клеток в культуре к лейкозному клону можно только при
проведении кариологических, иммунофенотипических и других исследований клеток каждой отдельной колонии. Сегодня такой анализ стал возможным.
110
Часть 1. Теоретическая гематология
Колониеобразующая способность (КОС)
клеток-предшественников гранулоионоцитопоэза
при острых лейкозах
Результаты многочисленных исследований лейкозных клеток в
культуре свидетельствуют о том, что при острых нелимфобластных лейкозах (ОНЛЛ) в острой фазе заболевания клоногенные
свойства нормальных КОЕк чаще всего угнетены и имеет место
патологическое колониеобразование лейкозными клетками-предшественниками (Афанасьев Б. В., Алмазов В.. А., 1985; Bull I. M.
et al., 1973; Moore M. A. S. et al, 1974). При острых лейкозах наблюдается угнетение нормального гемопоэза и замещение нормальной
гемопоэтической ткани лейкозными клетками. В то же время при
клонировании клеток костного мозга больных малопроцентным
лейкозом было показано, что развитие панцитопении у них связано не только с вытеснением нормальных клеток, по и с высвобождением из лейкозных клеток кислых изоферритинов, ингибирующих рост нормальных гемопоэтических клеток. Экспериментально было доказано, что рекомбинантный изоферритин ингибирует
рост в культуре СКК и ККП (Cassileth P. А. 1984; Broxmeyer H. Е.
et al., 1981, 1982), а развитие колоний из нормальных КОЕк подавляется при добавлении в культуральную среду лейкозных клеток
(Spitzer G. et al., 1978; Broxmeyer H. E. et al., 1987; Olofsson Т.,
Olsson I., 1980). Кроме того, известно, что лейкозные клетки при
ОНЛЛ более чувствительны к низким дозам колониестимулирующего фактора (КСФ), чем нормальные. Возможно, это является
одной из причин преимущественного роста лейкозных клеток in
situ по сравнению с нормальными клетками, учитывая, что при
острых лейкозах, по данным некоторых авторов, клетки крови не
вырабатывают достаточного количества КСФ (Takaku E, 1982;
Metcalf D., 1984) и при снижениии уровня КСФ может возникать
«старение» нормальных клоногенных клеток (Senn I. S. et al., 1974).
Пролиферативное преимущество лейкозных клеток подтверждается высоким уровнем «тимидинового самоубийства» клеток при
ОЛ, в отличие от нормальных клеток.
При ОНЛЛ в большинстве случаев КОС и КЛОС (кластерообразующая способность) клоногенных миелоидных предшественников в агаровых культурах отсутствует или при резком снижении
КОС наблюдается повышенное кластерообразование (лейкемический тип роста) (Афанасьев Б.В., 1980; Мур М. А. С, Меткалф Д.,
1973). Колонии и кластеры могут состоять из незрелых миелоидных клеток — про- и миелоцитов или из одних миелобластов (Spitzer G. et al., 1978).
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
111
G. Spitzer с соавторами (1978) выделили три типа колониеобразования при острых лейкозах:
1. Отсутствие роста колоний и кластеров либо наличие отдельных колоний с нормальной морфологией клеток.
2. Множество мелких кластеров (до 20 клеток).
3. Агрегаты лейкозного типа с числом клеток более 20. У больных 3-й группы реже достигалась ремиссия, которая была менее
продолжительной, чаще развивалась резидуальная болезнь. Авторы сделали вывод, что характер колониеобразования может служить прогностическим признаком при лейкозе.
Б. В. Афанасьев (1980) предложил следующие типы роста КОЕк
в агаровой культуре.
1. Нормальный тип роста — КОС от 8 до 67 колоний на 1 х 101
ядросодержащих клеток. Соотношение кластер: колония менее 12.
2. Гипопластический тип роста — КОС менее нижней границы
нормы (от 0 до 7), а КлОС — менее 84.
3. Гиперпластический рост — КОС более верхней границы нормы (>67), соотношение кластер : колония не превышает 12.
4. Лейкемический рост — КОС от 0 до 7, КлОС превышает 84,
соотношение кластер : колония более 12.
Главным критерием для установления лейкемического типа роста является резкое увеличение соотношения кластер/колония.
М. A. S. Moore и соавторы (1974) отмечали наиболее высокую способность к образованию кластеров при остром промиелоцитарном
лейкозе. Это подтверждают данные М. А. Френкель и соавторов
(1994) и наши наблюдения.
Плохим прогностическим признаком считается отсутствие роста клеток в культуре или повышенное образование крупных кластеров (Moore M. A. S. et al, 1976), хотя есть и прямо противоположные сообщения.
Отмечены высокая частота ремиссий у больных с нормальным
типом роста в культуре (Moore M. A. S. et al., 1974) и плохой прогноз у больных с лейкемическим типом роста в сочетании с высокой клонирующей эффективностью (Алмазов В. А. и др. 1981; Афанасьев Б. В., Алмазов В. А., 1985). После проведения химиотерапии рост колоний и кластеров, как правило, отсутствует.
В период ремиссии часто происходит восстановление нормального типа колонне- и кластерообразования (Bodey L. P., Rodriguez V., 1978), а цитогенетические исследования подтверждают происхождение клеток из нормальных предшественников. Показатели КОС являются ранним прогностическим признаком реакции на
химиотерапию, гак как часто ее восстановление происходит рань-
112
Часть 1. Теоретическая гематология
ше, чем восстанавливается нормальная морфологическая картина
костного мозга (Moore М. А. S., 1976; Spitzer G. et al, 1977). Нормализация КОС и КлОС — достоверный признак, указывающий на
близкую ремиссию.
В то же время С. В. Miller и В. A. Zehnbaucer (1991) выявили у
части больных ОМЛ, обследованных ими в период полной ремиссии, характерный лейкемический рост КОЕ-ГМ. Мы ни разу не
отмечали этого, но, по нашим наблюдениям, отсутствие какого бы
то ни было роста в культуре в период ремиссии не редкость.
Острый лимфобластный лейкоз чаще всего характеризуется отсутствием роста в агаровых системах, приспособленных для КОЕГМ, или наличием небольшого числа мелких кластеров и колоний
в костном мозге и повышенным колонне- и кластерообразованием
в крови.
При использовании культуральных систем с метилцеллюлозой,
средой IMDM и рекомбинантными цитокинами при остром лейкозе наблюдается отсутствие роста нормальных КОЕ-Э, БОЕ-Э,
КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ. В то же время, как и в агаровых культурах, нередко присутствие большого количества мелких кластеров
из бластных клеток. При наступлении ремиссии происходит снижение (до исчезновения) числа бластных кластеров и появляются
нормальные эритроидные и миелоидные колонии (Atlas of Human
Hematopoietic Colonies, 1995). Рецидив ОНЛЛ часто характеризуется появлением большого количества мелких кластеров. Происходит возвращение к колониеобразованию лейкозного типа, но в
этот период наблюдается очень пестрая картина, так как в костном
мозге одновременно персистирует колониеобразование за счет нормальных КОЕк (Spitzer G. et al., 1976). Резкое снижение КОС
костного мозга обнаруживают уже за 2-8 недель до развертывания
рецидива (Greenberg P. L. et al., 1971).
С. В. Miller и В. A. Zehnbaucer (1991) на примере больных ОНЛЛ,
у которых была выполнена аутологичная ТКМ, показали, что вероятность развития рецидива острого лейкоза существенно выше
у тех из них, у кого был выявлен лейкемический тип роста колоний
в культуре.
Колониеобразующая способность КОЕ-ГМ
при хронических миелопролиферативных заболеваниях
При хроническом миелолейкозе (ХМЛ) поражение происходит
на уровне полипотентной стволовой клетки, что, в частности,
подтверждается фактом нахождения Ph'-хромосомы во всех мие-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
113
лоидных клетках и в некоторых популяциях В-лимфоцитов
(Bernheim A., Berger R., 1981). Хронический миелолейкоз до развития бластного криза (БК) характеризуется гиперпластическим типом роста в агаре КОЕк, костного мозга и особенно крови (Забелина Т. С. и др., 1980; Френкель М. А. и др., 1982).
Гиперплазия пула КОЕк и КЛОЕк у больных ХМЛ может быть
объяснена либо увеличением способности лейкемичсских клетокпредшественников к самоподдержанию, либо увеличением притока КОЕк из пула полипотентных СКК, тем более что пролиферация лейкозных клеток не увеличена и процент «тимидинового самоубийства» снижен (Забелина Т. С. и др., 1980). Все клетки в
колониях и кластерах содержат Ph'-хромосому. Морфология клеток и соотношение кластер/колония нормальное, хотя число агрегатов может быть в 500 раз больше, чем в норме. При ХМЛ наблюдается повышение уровня КСФ в сыворотке. Прогрессировать
заболевания ведет к еще большему росту КОС и КлОС, иногда с
преобладанием эозинофилытых агрегатов.
При успешном лечении количество КОЕк уменьшается одновременно со снижением числа гранулоцитов. В период ремиссии
КОС костного мозга нормализуется. В стадии БК ХМЛ количество КОЕ-ГМ и КОЕ-ГЭММ в культуре резко снижается, наблюдается лейкемический или гипопластический тип роста КОЕк, как
при ОЛ (Афанасьев Б. В. и др., 1980). Появление лейкемического
типа роста на ранних этапах, за несколько недель до начала терминальной фазы, позволяет заподозрить развитие БК ХМЛ (Афанасьев Б. В. и др., 1980; Афанасьев Б. В., 1980). В период ремиссии
БК показатели КОС и КлОС близки к таковым в хронической
стадии болезни. Типичным для ХМЛ является наличие бластных
колоний и значительное увеличение числа макрофагов.
При клонировании клеток больных ХМЛ в среде IMDM с метилцеллюлозой, оптимизированной КС или рекомбинантными
цитокинами, также наблюдается резкое увеличение всех типов миелоидных колоний, в том числе КОЕ-Э и БОЕ-Э (Atlas of Human
Hematopoietic Colonies, 1995). Для хронического миеломоноцитарного лейкоза наиболее характерен гиперпластический тип роста КОЕк, а для хронического эритромиелоза — лейкемический тип
роста в культуре.
У больных миелофиброзом найдено увеличение КОЕ-ГМ в периферической крови и у части больных — в костном мозге.
Истинная полицитемия (ИП). Это миелопролиферативное заболевание, которое характеризуется повышенной репродуктивной
способностью общей для миелопоэза клетки-предшественника.
http://www.bestmedbook.com/
114
Часть 1. Теоретическая гематология
Уровень циркулирующего КСФ при ИП повышен (Spitzer G. et al.,
1978; Eaves С. I., Eaves A. C, 1978).
По данным Л. В. Филева и соавторов (1982), в агаровой культуре клеток костного мозга больных ИП число КОЕ-ГМ и
КЛОЕ-ГМ на 1 х 10' клеток соответственно в 3-7 раз превышало
нормальные показатели. В период ремиссии данные показатели
снижались, хотя оставались высокими. Эта особенность ИП помогает в дифференциальной диагностике с симптоматическими эритроцитозами (СЭ), при которых КОС клоногенных миелоидных
клеток ниже, чем в норме, так как СЭ характеризуется угнетением
функциональной активности КОЕ-ГМ.
В метилцеллюлозе со средой IMDM, оптимизированной КС
или коктейлем рекомбинантных цитокинов, колон иеобразующая
способность БОЕ-Э и КОЕ-Э при ИП резко увеличена. Образуются колонии из созревающих эритробластов, причем более чем 10%
КОЕ-Э и БОЕ-Э продуцируют гемоглобинизированные колонии в
отсутствие ЭРП, хотя их размер, степень созревания и гемоглобинизация ниже, чем в культурах с ЭРП. Эта ненормальная эритропоэтин-незавнеимость неопластических эритроидных предшественников сохраняется даже после многих лет лечения больного, что
используют для диагностики ИП. Не так постоянно, но такие ЭРПнезависимые колонии могут развиваться и при ХМЛ и эссенциальной тромбоцитемии.
Миелодиспластический синдром (МДС)
При МДС, учитывая выраженную гетерогенность этой группы
заболеваний, наблюдается различная КОС костного мозга. G. Spitzer с соавторами (1978), L. P. Bodey, V. Rodriguez (1978) показали
3 типа роста КОЕк в агаре при МДС:
1-й — формирование нормальных колоний и кластеров с их
нормальным соотношением;
2-й — развитие колоний и кластеров как нормального, так и
лейкозного типа;
3-й — формирование клеточных агрегатов только лейкозного
типа (маленькие кластеры, состоящие из бластов, при отсутствии
колоний. Их число может быть очень большим).
У больных со 2-м и 3-м типом роста клеток в культуре острый
лейкоз развивался за 0,5-3 месяца. У остальных наблюдался постепенный переход от 1-го к 3-му типу. Число КОЕк обычно снижено, и степень снижения коррелирует с вероятностью развития
лейкоза. По мере прогрессировав ия заболевания наблюдается сме-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
115
на типа роста: нормальный —> лейкемический; гипопластический
—» лейкемический —> более лейкемический. Происходит увеличение клонирующей эффективности лейкозных бластов и нарушение созревания клеток (Афанасьев Б. В. и др., 1982). Анализ зависимости между течением МДС и характером колониеобразования
показал, что при наличии лейкемического типа роста в агаре резко
возрастает риск возникновения лейкоза (Tennant G. В. et al., 1991).
Гипопластический тип роста при МДС также является неблагоприятным, и выживаемость больных с нормальным и гиперпластическим ростом в агаре больше. При ранних вариантах МДС (РА
и РАКС) наблюдается чаще всего нормальный характер роста (Ruutu Т. et al, 1984). При клонировании клеток костного мозга больных МДС в максимально обогащенных ростовыми факторами и
интерлейкинами средах с метилцеллюлозой и средой IMDM
наблюдается резкое снижение или отсутствие КОЕ-Э, БОЕ-Э,
КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ. В некоторых случаях нормальные гранулоцитарные или эритроидные колонии соседствуют с маленькими
бластными колониями.
Апластическая анемия (АА)
Заболевание характеризуется гипопластическим типом роста
КОЕк у подавляющего большинства больных в период развернутой картины заболевания, и лишь у части больных величина КОС
близка к нижней границе нормы (Балашова В. А. и др., 1994; Абдулкадыров К. М. и др., 1995). В период ремиссии КОС костного
мозга увеличивается и может нормализоваться.
При нейтропениях различного генеза может иметь место как
нормальное, так и пониженное и повышенное колониеобразование в агаре (Афанасьев Б. В., 1980). По-видимому, происходит
нарушение гуморальной регуляции, так как в присутствии КСФ
гранулоцитарные предшественники костного мозга больных некоторыми нейтропениями начинают нормально дифференцироваться и формируют нормальное количество колоний (Barack Y.
et al., 1971). S. Nakino с соавторами (1997) показали, что
СВ34+кроветворные клетки, которые культивировали в количе6
стве 5 х 10 в течение 14 дней в метилцеллюлозе со средой IMDM
в присутствии ИЛ-3, ИЛ-6, Г-КСФ и фактора стволовой клетки,
генерировали 2 х 109 миелоидных клеток и 5 х 10' КОЕ-ГМ. Предпринимаются попытки лечения нейтропений после высокодозной химиотерапии инфузией таких клеточных популяций (Williams S. F. et al., 1996).
116
Часть 1. Теоретическая гематология
Хронический лимфолейкоз и другие лимфопролиферативные
заболевания характеризуются гипопластическим типом роста или
его отсутствием в рассмотренных выше культуральных системах,
приспособленных для миелоидной серии клеток.
Таким образом, культивирование гемопоэтических клеток позволяет:
1) производить количественную и качественную оценку пула
СКК и ККП костного мозга, периферической и пуповинной
крови;
2) изучать процессы пролиферации и дифференциации СКК и
ККП;
3) изучать процессы пролиферации и дифференциации стволовых клеток стромы костного мозга и их потомков;
4) производить дифференциальную диагностику и прогнозирование гематологических заболеваний;
5) осуществлять контроль за эффективностью и адекватностью
проводимой терапии;
6) выявлять и оценивать ростовые факторы и другие регуляторы гемопоэза, экспрессируемые кроветворными клетками в
культуре;
7) оценивать влияние на СКК и ККП различных регуляторов
кроветворения и других гуморальных и физических факторов;
8) оценить качество и жизнеспособность трансплантата при аллогенной и аутологичной трансплантации костного мозга;
9) наращивать массу СКК и ККП для различных исследований
как источника клеток для трансплантации;
10) контролировать поступление в периферическую кровь из
костного мозга миелоидных клоногенных клеток, используемых затем для пересадки.
Стимуляция костного мозга для выхода в кровяное русло стволовых и коммитированных клеток-предшественников осуществляется с помощью рекомбинантных цитокинов — нейпогена, граноцита и других миелоидных КСФ.
Культуральные исследования с целью определения количества
КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ являются одними из самых информативных
методов оценки качества трансплантата при пересадке костного
мозга, а также определения жизнеспособности криоконсервированного костного мозга и крови, предназначенных для трансплантации. Культуры клеток используют при изучении гемопоэтического потенциала пуповинной крови. Клонирование клеток пуповинной крови показало, что она является альтернативным источ-
Глава 6. Клеточные культуры в гематологии
117
ником СКК и ККП для целей трансплантации (Абдулкадыров К. М.
и др., 2003; Нао О. L. et al, 1995; Hunt С. J. et al, 2003).
Достижения последних лет, связанные с клонированием эмбриональных стволовых клеткок (ЭСК), совершили настоящую революцию в биологии и медицине (Thomson J. A. et al., 1998). Появилась возможность крупномасштабного выращивания специализированных клеток человека, в том числе и гемопоэтических (Репин В. С, 2001; Сухих Г. Т. и др., 2002). Сегодня перспективы ЭСК
в медицине очень велики. Возможности тотипотентных ЭСК уже
используют в медицине для заместительных клеточных трансплантаций. Большое внимание привлекают сегодня исследования, связанные с мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), которые отличаются низкой антигенной активностью и наличием иммуносупрессорных белков. Поэтому применение МСК как биосырья для тканевой регенерации имеет большие перспективы в
медицине. Уже сегодня аллогенные и аутологичные пересадки МСК
используют для лечения множественной миеломы, апластической
анемии и цитопений — заболеваний, связанных с дефектами стромы (Репин В. С, 2001). Результаты культивирования эмбриональных, мезенхимальных и дефинитивных стволовых клеток в средах
с ростовыми факторами показали возможность репрограммирования стволовых клеток и направленного изменения их свойств (Дыбан А. П., Дыбан П. А., 2002).
Литература
Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, Балашова В. А. и др. Использование
лазерного и СВЧ-излучения при лечении больных злокачественными заболеваниями системы кроветворения // Эксп. онкол. 1992. Т. 14. С. 67-70.
Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, Балашова В. А. и др. Колониеобразующая
способность клеток-предшественников грануломоноцитопоэза у больных
апластической анемией на фоне различных методов лечения // Архив анат.,
гистол., эмбриол. 1995. № 3. С. 58-62.
Абдулкадыров К. М., Романенко Н. А. Организационные проблемы создания
банка пуповинной крови // Гематол. и трансфузиол. 2003. Т. 3. № 2. С. 49-53.
Алмазов В. А., Афанасьев Б. В., Кулибаба Т. Г. и др. Клонирование кроветворных
клеток при различных формах острого лейкоза в двуслойной агаровой системе //
Тер. архив. 1981. Т. 53. № 9. С, 110-115.
Афанасьев Б. В. Использование результатов клонирования клеток крови и костного мозга в двуслойной агаровой системе для дифференциального диагноза
различных заболеваний системы крови // Тер. архив. 1980. Т. 52. № 9. С. 71-76.
Афанасьев Б. В., Сайдали М. А., Зарицкий А. Ю. и др. Пролиферация и созревание гемопоэтических клеток больных хроническим миелолейкозом в стадии
бластного криза // Проблемы гематол. и перелив, крови. 1980. № 4. С. 15-21.
Афанасьев Б. В., Кулибаба Т. Г., Забелина Т. Н. и др. Клонирование кроветворных клеток больных с различными формами гемопоэтических дисплазнй в
Глава 7
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АНОМАЛИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ
Немецкие ученые Arnold (1879) и von Hansemann (1891) еще в
конце XIX в. первыми начали анализировать хромосомы. В начале
XX в. исследователи попытались не только определить число и
форму хромосом, но и установить их роль в неопластических процессах. Первый труд, обобщающий работы в этой области, был
опубликован Boveri в 1914 г. Согласно его представлениям злокачественно перерожденные клетки характеризуются аномалиями в
структуре хроматина. Современная же цитогенетика берет свое
начало с 1956 г., когда Tjio и Levan установили истинное диплоидное число хромосом — 46 и описали основные морфологические
характеристики хромосом. В 60-е гг. было проведено множество
исследований, посвященных изменениям хромосом опухолевых
клеток.
Американские ученые P. S. Nowell и D. A. Hungerford в 1960 г.
описали первый генетический маркер опухоли — делению примерно половины длинного плеча одной из хромосом G группы в клетках крови больных хроническим миелолейкозом. Измененную хромосому назвали филадельфийской (Ph'), по названию города, где
ее обнаружили. Rubkin и соавторы в 1964 г. с помощью цитоспектрофотометрического метода измерения количества ДНК установили, что в Ph'-xpoMoco.vie отсутствует около 40% генетического
материала.
Огромные возможности для идентификации как нормальных,
так и измененных хромосом человека появились после того, как
были внедрены в практику новые методы дифференциального
окрашивания хромосом. Сначала был предложен метод флюоресцентной окраски с помощью кинакрина — Q-окраски, затем — R-, С-,
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах 123
G-окрасок препаратов хромосом, в результате которых каждая хромосома приобретает специфическую исчерченность, позволяющую
ее идентифицировать.
В 1971 г. на Парижской конференции была предложена Международная классификация хромосом человека и их исчерченности
(ISCN, 1971). В 1981 г. опубликована используемая до сих пор
стандартная номенклатура нормальных хромосом человека (ISCN,
1981).
Если первоначально цитогенетические исследования проводили преимущественно в случаях гематологических неоплазий, то в
последнее время, благодаря развитию методов интерфазной цитогенетики, возросла интенсивность исследований солидных опухолей. Одновременно с накоплением данных цитогенетических исследований в 80-е гг. получены результаты молекулярно-биологпческих исследований, которые значительно расширили наши
представления о механизмах неопластических процессов.
Основные термины
Кариотипом называют совокупность определенного вида и числа митотических хромосом данного индивидуума. В норме соматические клетки человека содержат диплоидный (2и = 46), а половые
клетки — гаплоидный (п = 23) наборы хромосом. У мужчин и женщин одинаковый набор (22 пары) аутосомных хромосом, 23-я пара — половые хромосомы: у женщин — XX, у мужчин — ХУ.
Хромосома разделена центромерой на два плеча: длинное — q и
короткое — р. По положению центромеры хромосомы делятся на
метацентрическис, субметацентрические и акроцентрические. В метацентрических хромосомах центромера располагается приблизительно посередине р- и q-плечи приблизительно одинаковой длины. В субметацентрических хромосомах центромера занимает промежуточное положение и р-плечо по длине гораздо короче q-плеча.
В акроцентрических хромосомах центромера находится в верхнем
конце q-плеча. На концевых участках хромосомы располагаются
теломеры. С их помощью хромосомы сохраняют свою морфологию и не соединяются друг с другом.
Парижская номенклатура предназначена для описания по единой форме линейной структуры каждой хромосомы. Ее обозначение строится на следующих принципах. Каждая хромосома рассматривается как непрерывная совокупность сегментов, независимо от их окраски. Хромосомные плечи (р и q) подразделяются па
районы (regions), а районы, в свою очередь, на сегменты (bands) —
участки хромосом, четко отличающиеся от соседних по интенсив-
124
Часть 1. Теоретическая гематология
ности окраски. Районы и сегменты нумеруются арабскими цифрами — от центромеры к теломере, отдельно для каждого плеча. По
этой системе обозначение индивидуального сегмента включает
информацию о хромосоме, плече и районе, в котором он находится.
Так, символ 1р22 означает второй сегмент в районе 2 короткого
плеча хромосомы 1. Если возникает вопрос о выделении субсегментов того или иного сегмента, для их обозначения вводят следующий ряд цифр, принцип нумерации остается прежним.
Известны следующие структурные изменения кариотипа:
1) транслокация (t) — обмен участками между хромосомами (чаще
двумя); 2) делеция (del) — утрата хромосомой части своего материала; 3) инверсия (inv) — поворот района в пределах одной хромосомы на 180°; 4) инсерция (ins) — включение в хромосому нового материала; 5) изохромосома (i) — хромосома, состоящая из двух
одинаковых плеч; 6) дериват (der) — измененная хромосома.
Численные изменения кариотипа — это наличие дополнительных или потеря целых хромосом, что обозначается соответственно
знаком «+» или «-». Клетки с числом хромосом более 46 называют
гипердиплоидными, а менее 46 — гиподиплоидными. Выявление
структурной аномалии в двух и более клетках свидетельствует о
наличии клонального нарушения. Обнаружение дополнительных
хромосом в двух и более клетках, а потеря — в трех и более говорит
о численном нарушении кариотипа.
Стандартное цитогенетическое исследование позволяет анализировать весь хромосомный набор клетки целиком. При этом стоит помнить, что даже при максимальном разрешении этот метод
способен выявить только сравнительно крупные аномалии хромосом (размером > 10 6 -10' пар оснований ДНК) и что анализируются
только клетки в митозе. В ряде случаев эти ограничения удается
преодолеть с помощью молекулярно-генетических методов.
Наиболее широкое применение для молекулярной диагностики
гемобластозов получили методы FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) и ПЦР (полимеразная цепная реакция).
FISH основан на способности хромосомной ДНК-мишени связываться с отрезками ДНК-зонда, содержащими комплементарные ДНК-мишени последовательности. ДНК-мишенью при FISH
является ядерная ДНК интерфазных клеток или ДНК метафазных
хромосом, нанесенных на стекло. Визуализация гибридизовавшихся зондов проводится при помощи флуоресцентной микроскопии.
С помощью FISH возможно определение нормальной или аномальной локализации гена, числа его копий и наличия хромосомных перестроек. Следует заметить, что при помощи FISH-метода
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
125
возможен анализ только тех участков хромосом, молекулярные
зонды которых используются, а не всего хромосомного набора, как
при цитогенетическом исследовании. Недавно разработано многоцветное спектральное кариотипирование (multicolor spectral
karyotyping - SKY), основой которого является метод FISH.
ПЦР — метод амплификации (многократного копирования)
специфических последовательностей ДНК с помощью специфического фермента — термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-noлимераза). ПЦР представляет собой циклический процесс, включающий фазы денатурации ДНК, отжига (присоединение праймеров) и синтеза заданных участков ДНК. В каждом цикле ДНК
происходит удвоение числа копий исследуемого участка, что позволяет по истечении 25-30 циклов накопить в реакционной смеси от 10''до 109 молекул ДНК заданной длины (обычно 150-900 оснований) и известной нуклеотидной последовательности. Чувствительность ПЦР метода высока: он позволяет обнаружить одну
опухолевую клетку со специфической ДНК- или РНК-последовательностью среди 10'-10" нормальных клеток. ПЦР является чрезвычайно быстрым, дешевым и чувствительным методом обнаружения минимальной резидуальной болезни.
Клиническое и биологическое значение
хромосомных аберраций при гемобластозах
К настоящему времени накоплена обширная информация по
хромосомным аномалиям. Общее число случаев новообразований
с описанными хромосомными нарушениями составляет более
26 тыс., причем 73% из них относятся к лейкозам и другим гематологическим заболеваниям.
Анализ хромосом при этих состояниях вошел в перечень обязательных исследований как на этапе диагностики, так и в динамике
заболевания. Некоторые геномные нарушения строго ассоциируются с характерной клинической и иммунологической картинами,
посредством чего обеспечивают основу для определения подтипа
заболевания. Во время диагностики кариотип является также важным прогностическим фактором. Современные терапевтические
схемы оказывают огромное влияние на прогноз при острых лейкозах (ОЛ), где 2/3 детских и 1/4 взрослых пациентов имеют длительную безрецидивную выживаемость. Цитогенетические исследования повышают количество надежных прогностических факторов, способствующих подбору адекватной терапии этим пациентам
по распространенным схемам. Корреляцию между кариотипом,
126
Часть 1. Теоретическая гематология
прогнозом и диагнозом при ОЛ впервые продемонстрировали
L. Seeker-Walker и соавторы в 1978 г. и подтвердили многие исследователи. Отмечалось, что цитогенетическая картина всегда информативнее других показателей относительно прогноза заболевания. Особенно значимы обнаружения специфических хромосомных нарушений, изменений модального числа хромосом и, наконец,
присутствие или отсутствие клональных аномалий.
В настоящее время разрабатывается генетическая классификация лейкозов, которая объединяет и дополняет предшествующие,
основанные только на фенотипических особенностях опухолевых
клеток. Генетическая классификация выделяет группы гемобластозов, имеющих одинаковые генетические аномалии, сходство морфологии, иммунофенотипа и биологических свойств опухолевых
клеток. Основой генетической классификации является комплекс
цитогенетических и молекулярно-генетических методов исследований. Это позволяет более точно определить степень злокачественности опухоли и прогноз заболевания.
Хромосомные нарушения при остром лимфобластном
лейкозе
Изучение хромосомных аномалий при остром лпмфобластном
лейкозе (ОЛЛ) представляется крайне важной задачей. Цитогенетический анализ случаев ОЛЛ долгое время был связан со значительными методическими трудностями из-за плохой морфологии
метафазных хромосом, патогномичной для лимфобластных клопов. Усовершенствование методик позволило установить изменения кариотипа примерно у 70% (55-90%) больных, причем, в отличие от других форм лейкозов, модальное число хромосом при
ОЛЛ — самостоятельный прогностический признак.
У 25-30% пациентов клоны клеток содержат более 50 хромосом. Этот кариотип ассоциирован с pre-B/common иммунофенотипом.
Гипердиплоидия (и > 50 хромосом), как правило, ассоциируется с наибольшей продолжительностью первой ремиссии и высокой безрецндивной выживаемостью (медиана составляет 50 месяцев). Предполагается, что гипердиплоидные клетки высокочувствительны к терапии фазовоспецифичными противоопухолевыми
препаратами вследствие большой продолжительности S-фазы. Почти в половине случаев гипердиплоидии п > 50 обнаруживаются
дополнительные структурные хромосомные аберрации. Чаще других встречаются: t(9;22), t(4;ll) и iso(17q). Наличие в кариотипе
опухолевых клеток перечисленных неслучайных структурных ано-
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемоблаетозах
127
малий обусловливает у таких пациентов возникновение ранних
рецидивов или плохой ответ на терапию.
Промежуточный прогноз заболевания характерен для группы
больных с модальным числом хромосом в лейкозных клетках — от
47 до 50 (гипердиплоидия п = 47-50). Довольно сложно оценить
прогноз у пациентов с околотриплоидным набором хромосом из-за
недостаточного числа подобных наблюдений. По некоторым данным, случаи с околотетраплоидным набором хромосом часто ассоциируются с Т-клеточным фенотипом ОЛЛ и могут иметь неблагоприятный прогноз. Наиболее часто в трисомии вовлекаются следующие хромосомы: 4, 6, 10, 14, 17, 18, 21 и X. Дополнительные
структурные аномалии, как правило, являются типичными для
ОЛЛ.
Частота встречаемости гиподиплоидии (и < 46) при ОЛЛ составляет 7-8%. Как правило, такие клоны характеризуются высокой злокачественностью и резистентностью к химиотерапии.
Основной интерес относительно патогенетической роли хромосомных нарушений при ОЛЛ все же сконцентрирован вокруг структурных аберраций. В настоящее время при ОЛЛ описано около
40 типичных хромосомных нарушений. Некоторые из них, наиболее характерные, приведены в табл. 2 с указанием иммунофенотипа лейкозных клеток и генов, вовлекающихся в аберрации.
Среди выявляемых маркеров важное диагностическое и прогностическое значение имеет филадельфийская (Ph') хромосома
(рис. 2).
rrtt
19
20
Рис. 2. Кариограмма пациентки М. Ы. Ю.: 46, XX, t(9;22)(q34;qll)
128
Часть 1. Теоретическая гематология
Таблица 2
Первичные хромосомные аберрации при ОЛЛ
Нарушение
Вовлекаемые гены
Типичный иммунофенотип
t(l;ll)(p32;q23)
AF1P;MLL
Mixed lineage
t(l;19)(q23;pl3)
РВХ!;Е2А
Mixed lineage
Dup(l)(ql2-21q31-32)
Не определены
Prc-B, B-cell
t(2;8)(pl2;q24)
IGK;MYC
t(4;ll)(q21;q23)
AF4:MLL .
B-cell
Early B-precursor,
Biphenotypic
del(6q)
MYB
B- or T-lineage
+8
Не определены
B- or T-lineage
t(8;14)(q24;qll)
MYCTCRA/
TCRD
T-lineage
t(8;14)(q24;q32)
MYC;IGH
B-cell
t(8;22)(q24;qll)
MYCIGL
B-cell
del(9p)
Не определены
B- or T-lineage
T/dic(9;12)(pll-13)
Не определены
Pre-B
i(9q)
Не определены
Pre-B
t(9;22)(q34;qll)
ABL;BCR
B-lineage.
t(10;14)(q24;qll)
HOXlhTCRD
T-lineage
t(ll;14)(pl5;qll)
RBTN1:TCRD
T-lineage
t(ll;14)(pl3;qll)
RBTN2;TCRD
T-lineage
T/dcl(12p)
He определены
B- or T-lineage
t(14;18)(q32;q21)
TGH;BCL2
B-lineage
i(17q)
He определены
Mixed lineage
-20
He определены
B-lineage
+21
He определены
B-lineage
Выявляется она в три раза чаще .у взрослых больных, чем при
детских ОЛЛ. Встречаемость Ph'-маркера у взрослых пациентов с
ОЛЛ составляет 15-20%, а у детей — 5%. Характерны высокий
лейкоцитоз с большим количеством бластных клеток и поражение
центральной нервной системы (ЦНС). Ph'-хромосома при ОЛЛ,
как и при хроническом миелолейкозе (ХМЛ), образована вследствие реципрокной транслокации между дистальными частями
длинных плеч хромосом 9-й и 22-й пар: t(9;22)(q34;ql 1). На хромосоме 9 в области поломки находится с-abl онкоген, который вследствие транслокации переносится на 22-ю хромосому и соединяется с находящимся там bcr-геном. В итоге на хромосоме 22 образуется новый химерный ген bcr-abl, белковый продукт которого
обладает повышенной тирозинкиназной активностью.
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
129
Цитогенетически Ph'-хромосома у больных ОЛЛ и ХМЛ не
отличается. Однако молекулярно-генетические исследования показывают, что уровень поломки bcr-гена может быть различным.
Обнаружены два основных типа перестройки данного гена при
ОЛ. Один из них точно такой же, как и при ХМЛ, когда образуется
белок р 210-bcr-abl, кодируемый мРНК длиной 8,5 kb, Ь2-а2. Другой вариант поломки — внутри первого нитрона bcr-гена. При этом
образуется белок р 190-bcr-abl, кодируемый мРНК длиной 7,5 kb,
el-a2.
Наличие клонов с t(9;22) определяет крайне неблагоприятный
прогноз заболевания. Полную ремиссию удается получить примерно у 60% пациентов, медиана ремиссии составляет 5-10 мес, а
3-летняя выживаемость — всего 13%. У некоторых больных Ph'-хромосома отсутствует при цитогенетическом исследовании, тогда как
на молекулярном уровне обнаруживается типичная t(9;22). Следовательно, для молекулярио-генетической диагностики и мониторинга Ph'-позитивного ОЛЛ целесообразно использовать кроме
цитогенетического анализа молекулярные методы: ГЩР или FISH.
Иммунологически больные с Ph'-позитивными ОЛЛ чаще имеют
смешанную лимфоидную и миелоидную картину, чем пациенты с
другими хромосомными нарушениями (исключая ОЛЛ с 1 Iq23
поломкой).
Аберрации, затрагивающие ii(q23), встречаются при различных формах острых лейкозов. Обусловлено это тем, что данные
аномалии происходят в полипотентной стволовой кроветворной
клетке, которая способна дифференцироваться как в миелоидную,
так и в лимфоидную линию. При ОЛЛ перестройки, вовлекающие'
11(q23), в число которых входят r(4; 11 )(q21;q23), t( 1; 11 )(p32;q23),
t(6;l I)(q21;q23),t(ll;19)(q23:pl3) и del(llq23), встречаются в 1015% случаев и ассоциированы с pre-pre-В-иммунофенотипом бластов и плохим прогнозом.
Наиболее важная цитогенетическая патология, которая встречается у 5% взрослых больных ОЛЛ, — транслокация t(4;il)
(q21;q23) (рис.3).
Пациенты характеризуются очень высоким лейкоцитозом с
большим числом бластов и выраженной опухолевой инфильтрацией органов. Это нарушение впервые обнаружено Oshimura с соавторами в 1977 г. и впоследствии описано как типичное для ОЛЛ
Van Den Berghe с соавторами в 1979 г. На Ilq23 картирован ген
MLL, на 4q21 — ген AF4. Вследствие транслокации на der(ll)
образуется химерный ген AF4/MLL. Данная аномалия кариотипа
выявляется чаще у молодых пациентов с недифференцированным
5 Гематология. Нов. справочник
130
Часть 1. Теоретическая гематология
'
4
5
Ц II
п\
13
**»
19
14
15
14
20
16
*•
21
12
17
18
§*
|а
22
ху
Рис 3. Кариограмма пациента Р. А. А.: 46. XY. t(4;ll)(q21;q23)
иммунологически фенотипом лейкоза. Lampert с соавторами обнаружили у больных с t(4;l 1) перестройку генов тяжелых цепей иммуноглобулинов, что позволяет говорить о В-клеточной природе
заболевания. Описаны также врожденные ОЛЛ с t(4;ll). При наличии у пациентов этой аберрации прогноз заболевания крайне
тяжелый. Ремиссии удается достичь примерно у 50-60% больных,
а ее продолжительность составляет всего 3 месяца. Для мониторинга минимальной резидуальной болезни можно использовать
методы ПЦР и FISH.
Для больных ОЛЛ характерны нарушения кариотипа, затрагивающие хромосому 8-й пары, где расположен с-тус онкоген, и
области локализации генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов - 2р12,14q32 и 22qll. Образуется t(2;8)(pl2;q24) и ее варианты: t(8;14)(q24;q32), t(8;22)(q24;qll), которые приводят к активации онкогена с-тус, увеличивающейся его транскрипции и, в
конечном счете, к неопластической трансформации. Иммунологически характерен В-клеточный вариант. Для пациентов с описанными выше аберрациями типичны поражение ЦНС, гепатоспленомегалия, лимфаденопатия, резко повышенные уровни мочевой
кислоты и лактатдегидрогеназы в крови. Ранее такие нарушения
кариотипа относили к прогностически неблагоприятным хромосомным аномалиям. Используя современные протоколы терапии,
полную ремиссию удается достичь у 86% взрослых больных, а
3-летняя выживаемость у них составляет 74%.
Для больных с Т-клеточным вариантом ОЛЛ типичными являются изменения кариотипа, затрагивающие точки локализации ге-
http://www.bestmedbook.com/
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
19
131
20
Рис. 4. Кариограмма пациента С. Ю. В.: 46, XY. del8(q24)
нов Т-клеточных рецепторов. Примером может служить t(8;14)
(q24;qll), при которой с-тус онкоген патологически экспрессирован. В результате слияния генов MYC, картированного на 8(j24, и
TCRD, локализованного на 14q, образуется химерный ген, кодирующий протеин с новыми свойствами. Эта транслокация обусловливает крайне тяжелый прогноз заболевания (медиана выживаемости составляет 5 месяцев).
Приблизительно у 5% больных ОЛЛ встречается изолированная делеция del8(q24), которая также ассоциируется с крайне неблагоприятным прогнозом заболевания (рис. 4).
Делеция длинного плеча 6 хромосомы (del 6(q21)) (рис. 5) является характерным нарушением для ОЛЛ и встречается у 5-10%
пациентов. На уровне 6q21-24 располагается онкоген c-myb, гиперэкспрессия которого обнаруживается во всех случаях заболеваний
с del6(q21). Большей частью аномалия встречается при common
ОЛЛ. Прогноз заболевания при данном нарушении кариотипа относительно благоприятный, медиана выживаемости составляет
около 38 месяцев.
Однако описываются случаи обнаружения del6(q) и при ОНЛЛ
и ХМЛ. В этих случаях пациенты часто имеют дополнительные
хромосомные нарушения.
Данная аномалия обнаруживается при всех вариантах ОНЛЛ,
но чаще наблюдается при ОНЛЛ Мб (26% всех eq-ОНЛЛ случаев). Как правило, уровни поломок находятся на ql2 27. причем в
80% наблюдений вовлекается 6q21—23 район. Экспрессия c-myb
обнаруживается во всех случаях.
132
Часть 1. Теоретическая гематология
Н h
,#
10
13
14
»
i
11
12
17
15
18
22
Рис. 5. Кариограмма пациентки К. А. С: 46, XX, del 6(q21)
?! U tl
1
2
ti it м
6
7
8
" M «I
13
J
19
14
II 4
3
15
4
it I* >f
10
*i
16
••
*
20
21
11
41
17
12
|>;
18
**1 1
22
x
Рис. 6. Кариограмма пациентки Я.Р. А.: 46, XX, t(l;19)(q23;pl3)
Транслокация t(l;19)(q23;pl3) (рис. 6) встречается в 3% всех
случаев ОЛЛ с кариологическими нарушениями.
Это нарушение ассоциируется с pre-B-ОЛЛ фенотипом. Молекулярные особенности t(i;19) в настоящее время до конца не изучены. Однако известно, что аберрация приводит к слиянию Е2А
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
133
гена, картированного на 19р13, с РВХ1 геном, расположенным на
Iq23. Dedera и соавторы обнаружили в экспериментах на животных, что данный химерный ген индуцирует не только пролиферацию и апоптоз, но и злокачественные лимфомы у животных.
Прогностические особенности t(l;19) не совсем ясны, однако
большинство исследователей показывают, что данная аберрация
обусловливает неблагоприятный исход заболевания. У большинства больных рецидив наступает в течение года после достижения
ремиссии.
Транслокация t(12;21)(pl3;q22) — наиболее часто встречающаяся при В-клеточном ОЛЛ аномалия кариотипа у детей. Она
является криптической (скрытой), не выявляющейся при стандартном цитогенетическом исследовании. Данная аберрация выявляется при помощи молекулярно-генетических методов исследования в 19-27% детских ОЛЛ. У взрослых описаны лишь единичные
случаи. На молекулярном уровне вследствие транслокации образуется химерный ген из генов TEL (12р13) и AML1 (21q22). Клинически данная транслокация ассоциируется с возрастом больных от
1 до 10 лет, относительно невысоким лейкоцитозом (<50 000/мкл),
хорошим ответом на терапию и практически 100% безрецидивной
выживаемостью пациентов.
Нарушения кариотипа больных острым нелимфобластным
лейкозом
В настоящее время клональные аномалии хромосом обнаруживаются у 70-80% нелеченных больных с ОНЛЛ. Встречающиеся
хромосомные нарушения носят неслучайный характер — наблюдается определенное соответствие между типом цитогенетической
аберрации и типом лейкоза по FAB-классификации. Установлено
два основных типа нарушений: сбалансированные аберрации —
реципрокные транслокации и инверсии, а также несбалансированные — потеря целой хромосомы и/или ее части. Наиболее часто
встречающиеся нарушения кариотипа при ОНЛЛ представлены в
табл. 3.
Важное клиническое значение имеет реципрокная аберрация
t(8;21)(q22;q22) (рис. 7), обнаруживающаяся у 7-8% всех наблюдаемых пациентов с ОНЛЛ и у 46% с М2 вариантом ОНЛЛ. Данная аберрация редко наблюдается при Ml, М4 и М5 ОНЛЛ.
В транслокацию вовлекаются гены AML1, расположенный на 21-й хромосоме, и ЕТО (eight twenty one), картированный на 8-й хромосоме. Так образуется слитый химерный ген AML1/ETO. и молекулярно-генетические исследования показывают, что располагается
Часть 1. Теоретическая гематология
134
Таблица 3
Первичные хромосомные аберрации при ОНЛЛ
Вариант заболевания*
Типичные хромосомные нарушения
Ml
del или t с 3q26 и 1р36, 2р13-22, 5q31-35
М2
t(8;21)(q22;q22)
t(6;9)(p23;q34) (с базофилией)
del(2)(p23)Hdel(2)(p21)
МЗ
t(15;17)(q22;q21)
М4
inv(16)(pl3q22) (с эозинофилией)
t(16;16)(pl3;q22) (с эозинофилией)
del(16)(q22)
del или t e l l q23
М5
del или t 1 Iq23 (напр. t(6;ll)(q27;q23),
t(9;ll)(p21;q23),
t(10;ll)(pl5;q23)
t(3;3)(q21;q26) (с нарушениями тромбоцитов
и мегакариоцитов)
Мб
inv(3)(q21;q26)
del(2O)(qll)
dup( 1 q)
* При всех вариантах заболевания встречаются следующие аберрации:
del(5q); -7 или del(7q): +8
If И Ji
IS M
3
it* it H
и
8
If
4b
И U
10
11
»l
13
17
I ft
Я Я
19
20
22
Si
Рис. 7. Кариограмма пациентки Ж. О. С: 46, XX. t(8;21)(q22; q 22)
-5 или
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
135
он всегда на der(8) хромосомы. Локализация точек разрывов в
обоих генах у различных больных примерно одинаковая, что
приводит к формированию только одного типа РНК-транскриптов.
Транслокация t(8;21) чаще обнаруживается у молодых больных. Примерно у 70% больных мужчин с t(8;21) в кариотипе обнаруживается дополнительная потеря Y-хромосомы, а у 25% женщин — Х-хромосомы.
У 90% пациентов с данной аберрацией удается получить полные ремиссии, а около 60% больных живут 5 лет и более, что указывает на благоприятное прогностическое значение данной аномалии.
Реципрокная t(15;17)(q22;q21) является высокоспецифическим маркером МЗ варианта ОНЛЛ (рис. 8). Эта хромосомная аберрация встречается почти в 100% всех наблюдаемых ОПЛ (острых
промиелоцитарных лейкозов).
Впервые она описана в 1975 г. в лаборатории Rowley. В 1987 г.
ген, кодирующий рецептор ретиноевой кислоты (RARa), был картирован на участке 17 q21 хромосомы. На хромосоме 15, в локусе
15q22, — идентифицирован ген PML. Вследствие t( 15; 17) они объединяются в химерный ген PML/RARa. Хотя разрывы гена RARa
на 17-й хромосоме всегда происходят в интроне 2, точки разрыва
!
1
2
* *
II
1 у
*•
f f
6
К
13
7 «
7
а
*
li
4
* ; /
10
14
11
*
1*
.•V
16
••».
н
с;
12
••* « г
*ч
\
17
•*
18
• .
19
20
21
22
X
Рис. 8. Кариограмма пациентки М. Е. Л.: 46, XY, t(15;17)(q22;qll)
Часть 1. Теоретическая гематология
136
на 15-й хромосоме группируются в двух разных интронах и одном
экзоне гена PML. Это приводит к появлению различных слитых
белков, для которых еще не придумано общепринятых названий.
Корреляции между локализацией точек разрыва в гене PML и клиническими характеристиками, такими как морфология, ответ на
проводимую терапию и выживание, пока не обнаружено.
Последние данные показывают, что ген PML/RARa может доминантно делокализовать PML-ген из его нормального ядерного
положения, и этот процесс устраняется действием трансретиноевой кислоты. Научные открытия в области онкологии редко бывают настолько исключительными, что немедленно меняют лечебную тактику н существенно улучшают понимание механизмов
заболевания. Однако открытие специфической молекулярно-генетической аномалии рецепторов к ретиноидам и универсальная эффективность трансретиноевой кислоты при лечении больных ОПЛ
существенно углубили научное понимание патогенеза лейкоза и
радикально изменили подходы к терапии этого заболевания.
r
Нарушения 16-й пары хромосом — (in\ (16)(pl3;q22),
t(16;16)((pl3;q22), del(16)(q22) (рис. 9)) являются характерными
аберрациями для пациентов с ОНЛЛ М4Е и М4 вариантами. На
молекулярном уровне и при inv(16), и при t( 16; 16) происходит
слияние фрагментов гена CBFb, локализованного в районе 16q22,
и гена MYH11, картированного на 16р13. Продукт химерного гена
CBFb/MYHl 1 является фактором транскрипции.
Обнаружение перечисленных аномалий ассоциируется с хорошим прогнозом заболевания и длительной безрецидивной выживаемостью. Полные ремиссии удается получить у 90% пациентов с
19
20
21
22
x
Рис. 9. Кариограмма пациента Д. А. М.: 46, XY, del(16)(q22)
у
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
137
данными аберрациями, а медиана выживаемости составляет 80 месяцев.
При стандартном цитогенетическом исследовании обнаружение inv( 16) и t( 16; 16) часто затруднено. Надежно диагностировать
перечисленные аномалии позволяют молекулярно-генетические
методы исследования ПЦР и FISH.
У больных М5 вариантом ОНЛЛ изменения кариотипа прежде
всего касаются длинного плеча хромосомы 11 (в локусе q23-24).
Впервые эта связь была установлена Berger и соавторами в 1982 г.
Кроме изолированной делении del H(q23) (рис. 10) обнаружено,
что с хромосомой 11 -й пары могут вступать в реципрокные обмены
различные хромосомы — 1, 2, 6, 10, 17, 19 и др.
Наиболее известная перестройка, в которую вовлекается 1 Iq23, —
это t(9;ll)(p22;q23). Впервые она была описана Rowley и соавторами в 1975 г. Kabwinski и соавторы провели сравнительный анализ заболевания у больных ОНЛЛ с патологией длинного плеча
11 -й хромосомы и с другими изменениями кариотипа. Было отмечено, что t(9;ll) обнаруживается только у больных ОНЛЛ М5
вариантом.
Больные с повреждениями 11-й хромосомы отличаются более
молодым возрастом, высоким уровнем лейкоцитов в периферической крови, более частой встречаемостью геморрагических осложнений и нейролейкемией. Больные нуждаются в более интенсивной терапии.
Ряд изменений хромосом, такие как потеря из кариотипа целой
или части хромосомы 5-й пары и/или 7-й пары, встречается как у
< 1
ii
Рис. 10. Кариограмма пациентки С. А. Б.: 46, XX, dell I(q23)
Часть 1. Теоретическая гематология
138
i *
1
•+
1
i
•
i
2
7
-rf
8
9
14
15
1
21
*
22
12
и
<1-2
17
16
"It "«I
20
i !« It
w
I g ft I h
19
10
"ITS
13
%
4
3
•
6
Ш
*-«;
1 4
(—-
18
^ j
X
L
1
у
Рис. 11. Кариограмма г [ациентки М. Н . A.: 46. XX, de!5(q31)
больных ОНЛЛ, так и у пациентов с ОЛЛ. Примером таких нарушений может служить кариограмма больной ОНЛЛ с del5(q31)
(рис. 11).
Характерной особенностью данных цитогенетических патологий является то, что они выявлены у пациентов с вторичными
острыми лейкозами, индуцированными воздействиями ионизирующей радиации, алкилирующих агентов и других мутагенов.
Однако эти нарушения описаны и при de novo острых лейкозах.
У пациентов с потерей из кариотипа части или целой хромосомы
5-й и/или 7-й пар отмечены общие клинические особенности.
А именно — резистентность или непродолжительный ответ на проводимую терапию и плохой прогноз. Смерть больных наступает,
как правило, на ранних стадиях заболевания вследствие тяжелых
инфекционных или геморрагических осложнений.
Изменения кариотипа при хроническом миелолейкозе
Приблизительно у 95% больных с клинико-морфологическими
признаками хронического миелолейкоза (ХМЛ) выявляется специфический маркер — филадельфийская (Ph') хромосома, образующаяся в результате реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql 1).
Примерно в 5% случаев Ph'-хромосома является результатом сложных или простых вариантных (атипичных) транслокаций t(9;22).
При сложных транслокациях в перестройках участвуют три и более хромосом, причем две из них — 9-я и 22-я — постоянно.
В большинстве случаев диагноз ХМЛ можно поставить и без
цитогенетического исследования, на основании клинико-гематологнческих данных. Однако нередко необходимо дифференциро-
Глава /. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
139
вать ХМЛ с другими гематологическими заболеваниями (например, «ювенильный» ХМЛ, хронический миеломоноцитарный лейкоз), и обнаружение Ph'-хромосомы или химерного гена BCR/ABL
помогает подтвердить диагноз.
Огромное значение имеет цитогенетическое исследование и при
мониторинге эффективности терапии больных ХМЛ препаратами
интерферона. Для ХМЛ характерна связь между эволюцией кариотипа и прогрессированием заболевания. Так, у большинства больных (70%) за 3-6 месяцев до развития властного криза появляются дополнительные к Ph'-хромосоме структурные и/или численные хромосомные аберрации: +8, +19, +17, дополнительная Ph'хромосома, iso(17q), t(3;21) и другие. На рис. 12 представлена
кариограмма больного ХМЛ (бластный криз) с Ph'-хромосомой и
рядом дополнительных нарушений.
ТТ
4
Ч1
I i
IT
5
i I"H"it
Рис. 12. Кариограмма пациента 3. А. Я.: 46, XY. -7, t(9;22)(q34;qll),
dei(der9)(p21),+mar
Для оценки минимальной остаточной болезни при ХМЛ можно
использовать молекулярно-генетические методы ПЦР и FISH.
Хромосомные аномалии,
выявляемые при миелодиспластическом синдроме
При миелодиспластическом синдроме (МДС), как и при лейкозах, клоновый характер кроветворения подтверждается вместе с
другими характеристиками и цитогенетическими исследованиями, при помощи которых у пациентов обнаруживаются те или иные
хромосомные аберрации. Нарушения кариотипа выявляются приблизительно у 60% больных с МДС. Среди аномалий преобладают
Часть 1. Теоретическая гематология
140
ftt)
ft 'He
13
14
19
20
15
16
21
17
18
x
y
22
Рис. 13. Кариограмма пациентки М. Е. А.: 46, XX, del 7(q31)
**DC(2;21)
1
6
2
3
d e i ; 6 q i
7 tJel<7q)
13
ШИК
}
14
*-1
19
м, м2 м3
\
2 0 -20
g
и
9
*9
15
10
11
16
н*—тИ w» * •
21
\
-21
22
12
17
'!•
™
18
г<
х
Л
*
(
"-1
у
Часе
Рис. 14. Кариограмма пациентки Д. 3. Я.: 46, ХО, -4.+9.-13.+14-17,-20,-21,-Х,
DC(2 ; 21),add5(q36),del6(q21),del7(q31), +М1.+ М2, +МЗ, асе
потери целой или части хромосом и трисомии. Реже наблюдаются
транслокации (кроме случаев вторичных МДС).
Наиболее частыми изменениями кариотипа при первичном МДС
являются потеря хромосом 5-й и 7-й пар, дополнительная 8-я хромосома и делеции длинного (q) плеча хромосом 5-й. 7-й и 20-й пар
(около 30% всех исследованных пациентов). Кариограммы некоторых из них представлены ниже.
Для вторичного МДС характерны потеря целой и/или части
7-й и/или 5-й хромосом (рис. 13). Кроме этого, приблизительно у
50% больных встречаются комплексные нарушения кариотипа.
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
141
h г - » Ь*~гн I]
ИМИ H - * i •-Ж-т-HI-*--** И
if
-8
8
-:Д
13
^-10
10
9
11
-15
14
15
16
17
18
<§>., (
19
20
-°
21
22
1
-22
~-DC(8;10)(q24:p15)
Рис. 15. Кариограмма пациентки С. А. А.: 46, XX, -2,add4(pl6), -8,+ 10,+ 12,
-14,-15,-20,-22,DC(8;10)(q24;pl5),+Ml.+M2.+M3,+M4
1
2
aer(2j
3
'—*—I
9
13
19
14
20
15
21
22
10
11
12
16
17
18
x
у
Рис. 16. Кариограмма пациента Ю. В. Ц.: 45, XY, -12,t(2;5)(p24;ql4),del8(pl2)
Примерами таких изменений могут служить кариограммы двух
пациентов (рис. 14, 15). Делеция 5q при вторичном МДС редко
обнаруживается как изолированное нарушение (рис. 16). Значительно чаще, чем при первичном МДС, встречаются изменения
12р, 3 q n l l q .
Имеются данные, что у больных с МДС и нормальным кариотипом риск трансформации в ОЛ меньше и сроки выживаемости
142
Часть 1. Теоретическая гематология
больше, чем у больных аномалиями хромосомы 7-й, 8-й и 11-й.
Относительно благоприятным считается прогноз заболевания в
тех случаях, когда выявлены клоны клеток с единственной перестройкой: 5q- или 20q-. Обнаружение клона с комплексными нарушениями кариотипа является крайне неблагоприятным прогностическим признаком.
Нарушения кариотипа при множественной миеломе
У больных множественной миеломой аномалии кариотипа обнаруживаются, по различным сообщениям, в 20-60% исследованных случаев. Из них у 30% пациентов обнаруживается гиподиплоидия, у 30% — псевдодиплоидия и у 30/о — гипердиплоидия. Типичными для данного варианта заболевания являются: моносомия 13, трисомии 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19.
Среди структурных нарушений чаще других выявляется 14q+ маркер, присутствующий у 30% пациентов с цитогенетическими аномалиями. В перестройки вовлекается локус 14q32, аберрации которого при молекулярно-гснетическом исследовании FISH обнаруживаются у 75% больных с аномальным кариотипом в два раза
чаще, чем при цитогенетическом. Как правило, локус
14q32 вовлекается в транслокацию t( I I;14)(ql3;q32).
Приблизительно у 30% пациентов с аберрациями выявляются
аномалии 1р11-22. С вовлечением данного локуса описаны транслокации, делеции — терминальная и интерстициальная, а также
частичная дупликация.
Наилучший прогноз заболевания у больных с нормальным кариотипом. Огромное прогностическое значение имеют некоторые
структурные нарушения. Так, резистентны к терапии пациенты с
t(l I;14)(ql3;q32), частичной или полной потерей 13-й хромосомы,
делецией длинного плеча 11-й хромосомы. Крайне неблагоприятным прогностическим признаком являются множественные нарушения кариотипа.
Заключение
Необходимо подчеркнуть, что в настоящее время прослеживается четкая тенденция к активному расширению исследований по
изучению хромосомных аномалий при гемобластозах. Это связано
с тем, что большинство сообщений, позволивших установить прогностическое значение различных аберраций, относится к 90-м годам XX в. Изменения в терапевтических режимах, очевидно, потребуют внесения корректив в прогностические оценки значимое-
Глава 7. Генетические аномалии опухолевых клеток при гемобластозах
143
ти цитогенетических исследований. Кроме того, далеко не все часто встречающиеся хромосомные аномалии описаны в достаточной
степени. Для некоторых из них отсутствуют данные о прогностической ценности и диагностическом значении. Важной задачей
представляется также определение редких вариантов хромосомных нарушений и генов и/или онкогенов, расположенных вблизи
точек разрывов.
Так как события, происходящие на генетическом уровне, лежат
в основе любой лейкозной трансформации и опухолевой прогрессии, определение кариотипа больных гемобластозами как важного
прогностического фактора является патогенетически обоснованным. Интенсификация лечения сопряжена с целым рядом осложнений, следовательно, определение прогностических групп риска,
в том числе и цитогенетических, становится все более важным.
Накопление сведений о прогностической роли генетических аберраций при гемобластозах в условиях использования интенсивных
программ лечения позволит применять данные цитогенетического
исследования для адекватного выбора современных методов лечения.
Известно, что препараты метафазных пластин, полученные из
опухолевых клеток, отличаются плохим качеством хромосом. В настоящее время в лабораторной практике исследователи используют компьютерные анализаторы изображений, что позволяет значительно упростить и ускорить цитогенетическое исследование.
Такая система анализа изображений, которая в течение последних
нескольких лет используется нами, помогает не только улучшить
качество исходного изображения, но и выводить результаты исследования на. печать, создавать базу изображений и результатов
анализа.
Литература
Генкин А. А. Новая информационная технология анализа медицинских данных.
СПб.. 1999. С. 24-32.
Кобзев Ю. Н., Домрачева Е. В. Молекулярная цитогенетика в диагностике острых лейкозов и миелодиспластических синдромов. 1996. Т. 4. С. 32-38.
Кобзев Ю. Н., Флейшман Е. В. Хромосомные изменения при гемобластозах:
Руководство для врачей. 2001. С. 92-114.
Сергеев А. Г., Иванов Р. А. Генодиагностика лейкозов: Пособие для врачей. 1998.
An Atlas of Malignant Haematology. 1997. P. 5-25.
Appelbaum F. et al. The biology and treatment ol acute myeloid leukemia //
Haematology. Education Program Book. 1998. P. 15-43.
BergerR., Bemheim A., DanielM.-T. Karyotypes and cell phenotypes in acute leukemia
following other diseases // Blood Cells. 1993. V. 7. P. 93-299.'
Глава 8
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ
Ни один раздел современной науки не обходится без иммунологических исследований. В гематологии эти исследования ведутся по следующим основным направлениям: исследование особенностей иммунного статуса больных, где используются общеиммунологические методы; иммунофенотипирование лейкозной клетки,
позволяющее уточнить диагноз; иммуногематологические исследования, изучающие антигены и антитела составных частей крови.
Некоторые аспекты клинической иммунологии
Как известно, главной функцией иммунной системы является
иммунологический надзор за постоянством внутренней среды организма и элиминация чужеродных агентов как экзогенной, так и
эндогенной природы. В выполнении этой задачи участвуют гуморальный и клеточный иммунитет, системы фагоцитов, комплемента и др. Все эти компоненты выполняют свои функции в тесном
взаимодействии друг с другом.
Нарушения иммунитета прежде всего проявляются в развитии
иммунодефицитных состояний, которые бывают первичными (генетически детерминированными) и приобретенными, или вторичными (например, СПИД). Проявлением нарушений в иммунной
системе являются также различные аутоиммунные заболевания,
связанные с отменой толерантности и нарушением распознавания
«своего» и «чужого». Под вторичными иммунодефицитами подразумевают такие нарушения иммунной системы, которые возникают через какой-то определенный промежуток времени после рождения, и их развитие связано с воздействием на организм какоголибо повреждающего фактора (например, лучевая, цитостатическая
терапия).
146
Часть 1. Теоретическая гематология
В основе изучения клеточного иммунитета лежит количественное определение Т-лимфоцитов и их субпопуляций, идентификация продуцируемых ими цитокинов и выявление способности осуществлять эффекторные функции. К тестам гуморального иммунитета относят определение уровня сывороточных и секреторных
иммуноглобулинов. Выделяют также факторы неспецифического
иммунитета, к которым относят фагоцитоз, системы комплемента
и естественных клеток-киллеров (ЕК).
Развитие современной техники оценки различных клеточных
субпопуляций связано с двумя крупными научно-техническими
достижениями: созданием панели моноклональных антител (МАТ)
к различным поверхностным антигенам клеток и разработкой нового типа проточных цитофлуориметров. В настоящее время с помощью МАТ идентифицировано множество поверхностных антигенов лимфоцитов. В большинстве случаев определены их молекулярная масса, химическая структура и функция. Лейкоцитарные
антигены называют кластерами дифференцировки и обозначают
буквами CD и соответствующим номером. На 7-м Международном рабочем совещании (2000 г.) обозначено уже около 200 кластеров дифференцировки лейкоцитов, включая антигены лимфоцитов, моноцитов/макрофагов, миелоидных клеток, ЕК-клеток, рецепторы к цитокинам и колониестимулирующим факторам.
Наиболее значимыми поверхностными маркерами для определения Т-лимфоцитов являются CD3 и CD7, для Т-хелперов и
Т-цитотоксических/супрессорных клеток — CD4 и CD8 соответственно. Для характеристики В-лимфоцитов используют маркеры CD19,
CD20, CD21, CD22, CD24 и CD72, а также определяют экспрессию поверхностных иммуноглобулинов (slg). Для ЕК-клеток применяют маркеры CD 16, CD56 и CD57. Однако следует помнить,
что CD16 — низкоаффинный Fc-рецептор — присутствует практически на всех гранулоцитах и на некоторых моноцитах. Маркерами миелоидных клеток являются CD13, CD 14 (экспрессируется
на моноцитах), CD15 и CD33. На мегакариоцитах и тромбоцитах
экспрессированы молекулы CD41 и CD42, которые играют существенную роль в адгезии тромбоцитов в месте повреждения сосудов. Наиболее важными маркерами гемопоэтических стволовых
клеток являются CD34 и CD117. Кроме того, на всех кроветворных клетках выявляются молекулы CD45. Для большинства цитокинов в настоящее время также установлены рецепторы в соответствии с кластерами дифференцировки (Фрейдлин И. С, Тотолян А. А., 2001).
Наилучшим методом выявления поверхностных маркеров является проточная цитофлуориметрия. Она позволяет дифферен-
Глава 8. Иммуногематология
147
пировать большое число субпопуляций лимфоцитов в очень короткие сроки. Определение осуществляется по двум параметрам:
интенсивности свечения лимфоцитов, окрашенных МАТ. конъюгированными с флуоресцентными красителями, и размерам и зернистости, позволяющим дифференцировать лимфоциты от нейтрофилов и моноцитов. С помощью проточной цитометрип осуществляют идентификацию клеток, определяют частоту их встречаемости и количественные характеристики. При использовании
двухцветной цитофлуориметрии имеется возможность получить
информацию о двух и более антигенах на одной и той же клетке.
Например, при сепарации гемопоэтической стволовой клетки можно установить уровень ее дифференцировки: CD34 CD33 или
CD34 CD33+.
Определение уровня иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM, IgD и
IgE) является очень важным при диагностике и клиническом мониторинге иммунодефицитов, моноклональных гаммапатий, аутоиммунных заболеваний и других патологических состояний. Так, IgG
является особенно активным против грамотрицательных бактерий,
токсинов и вирусов. С помощью IgG-антител микробы и чужеродные клетки агглютинируются и лизируются. Комплемент взаимодействует с СН1- и СН2-доменами IgG. С помощью СН2- и
СНЗ-доменов IgG взаимодействует с Fc-рецептором макрофагов,
моноцитов, нейтрофилов, киллеров и клеток плаценты. IgG состоит
из 4 подклассов, которые отличаются количественно. Наибольшим
по количеству является IgG 1, наименьшим — IgG4. IgA нейтрализует вирусы и бактериальные токсины, может активировать систему
комплемента. В секретах слизистых оболочек IgA находится в димерной форме. Секреторный IgA имеет два вида Н-цепи: od и а2. Он
выявляется в слюне, молозиве и грудном молоке. Концентрация IgA
у детей первых лет жизни очень низка и только к 10-14 годам приближается к уровню взрослых. IgM с эволюционной точки зрения
является старейшим. Он образуется на ранних этапах иммунного
ответа и совместно с комплементом лизирует бактерии и другие
чужеродные клетки. При первичном контакте с антигеном синтезируются сначала IgM-, а затем IgG-антитела. При повторном введении того же антигена IgG-аптитела синтезируются быстрее и в большем количестве, чем IgM, который в сыворотке находится в виде
пентамера и имеет наибольший молекулярный вес.
Иммуноглобулин Е относится к минорным компонентам сывороточных Ig. После секреции В-клетками IgE присоединяется к тучным клеткам и базофилам с помощью Fc-фрагмента. При взаимодействии IgE с антигеном происходит освобождение вазоактивных
148
Часть 1. Теоретическая гематология
аминов из этих клеток, т. е. он является главным иммуноглобулином, участвующим в аллергических реакциях. Полагают, что
IgE-антитела участвуют в борьбе против паразитарных инфекций.
Иммуноглобулин D является рецепторным иммуноглобулином
только В-лимфодитов, и наличие сывороточного IgD рассматривается как результат сбрасывания рецепторного IgD с В-клеток
при их активации. В настоящее время накапливаются данные, что
IgD может местно синтезироваться в подслизистых оболочках
слюнной железы. Иными словами, так же, как секреторный IgA,
этот класс иммуноглобулинов выполняет определенную роль при
защите слизистых оболочек от инфекционных агентов.
Экзо- или эндогенные антигены могут образовывать в организме иммунные комплекы с соответствующими антителами. Этот
процесс может стать причиной системной или органной патологии. Судьба циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) зависит от их величины и индивидуальной активности фагоцитирующей системы. Антитела в составе иммунных комплексов могут включать каскад активации комплемента. Кроме того, IgG- и IgM-антитела
могут оказывать влияние на функции клеток, связываясь с их
Fc-рецепторами. Концентрация ЦИК, как правило, повышена при
системных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях (лепра,
шистозоматоз), а также при злокачественных новообразованиях.
Величина и состав их зависят как от свойств антигена, так и от свойств
антител, и в то же время от их абсолютной и относительной концентрации. Соотношение антиген : антитело в составе ЦИК зависит от
относительных концентраций обоих компонентов. Принято считать,
что ЦИК, возникающие в условиях небольшого избытка антигена,
представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплементактивирующей способности.
Цитокины — это множество факторов полипептидной природы,
синтезируемых стромальными (фибробласты, эндотелий), дендритными, эпителиальными, нейроэндокринными и другими видами
клеток. Однако основными продуцентами цитокинов являются активированные клетки иммунной системы. Цитокины осуществляют регуляцию всего многообразия межклеточных взаимодействий
при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении и межсистемных взаимодействиях. В основе механизма их действия лежит свойство вызывать дифференцировку, пролиферацию и программируемую гибель клеток — апоптоз.
Наиболее важные характеристики цитокинов:
1. Индуцибельность - генетически детерминированная зависимость выработки цитокинов от стимулирующих воздействий.
Глава 8. Иммуногематология
149
Индукция экспрессии генов цитокинов или усиление их активности, приводящее к усиленному синтезу цитокинов, происходит под
влиянием внешних факторов (микроорганизмов, их продуктов, конкретных антигенов, других цитокинов).
2. Локальность функционирования - действие цитокинов происходит в определенном микрообъеме (местно), куда проникает
инфекционный агент (носитель антигена) и где активируются клетки-продуценты цитокинов и клетки-мишени. В норме цитокины,
образуемые при первичном иммунном ответе, практически не поступают в кровоток, и только при патологии их содержание в сыворотке крови повышается.
3. Избыточность - каждый тип клеток способен продуцировать
несколько цитокинов и каждая разновидность цитокинов может
секретироваться разными клетками. Цитокины избыточны в биологических свойствах, для них характерна полифункциональность
с сильным перекрыванием эффектов.
4. Взаимосвязанность и взаимодействие компонентов. Цитокины оказывают сильное влияние на выработку друг друга, они могут как усиливать продукцию цитокинов, вызванную другими агентами, так и ингибировать ее, проявляя плейотропность.
В соответствии с особенностями структуры цитокинов и цитокиновых рецепторов их разделяют на несколько основных семейств:
гемопоэтины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических
предшественников; интерфероны (ИНФ), осуществляющие естественную защиту организма от вирусов; факторы некроза опухоли
(ФИО), обладающие провоспалительными, иммуностимулирующими и многими другими свойствами; хемокины, привлекающие в
очаг воспаления лимфоциты и лейкоциты из циркулирующей крови; «бессемейственные» цитокины, не отнесенные пока к какомулибо семейству (Ярилин А. А., 1997).
Исходя из общих закономерностей функционирования системы цитокинов, представители разных семейств могут оказывать
однотипные воздействия на клетки и представители одного семейства — вызывать разные эффекты. Так, в регуляции гемопоэза участвуют не только гемопоэтины, но и ФНО и ИНФ. А в реакции
воспаления провоспалительные свойства проявляют не только
ФНО и ИНФ, но и целый ряд интерлейкинов (ИЛ), относящихся
к другим семействам.
В группу провоспалительных цитокинов включают ИЛ-1, ИЛ-6,
ИЛ-8, ИЛ-12, ФНОа, ИНФ и др. Они действуют на HMMVHOKOMпетентные клетки на ранней стадии воспалительного ответа, участвуют в запуске специфического иммунного ответа и в его эффекторной
150
Часть t. Теоретическая гематология
фазе. Альтернативную группу представляют противовоспалительные
цитокины: ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, тканевой фактор роста (ТФР) и др.
Цитокины оказывают существенное влияние на гемопоэз, регулируя процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза
клеток. В зависимости от характера этого влияния их условно разделяют на позитивные и негативные регуляторы гемопоэза. К позитивным относятся те факторы, которые поддерживают пролиферацию полипотентных стволовых клеток, эритроидных, миелоидных и лимфоидных предшественников, стимулируя соответствующие ростки кроветворения. Это, прежде всего, фактор стволовой клетки, различные колониестимулирующие факторы, зритропоэтин и целый ряд интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4,
ИЛ-6, ИЛ-11 и др.). Другие цитокины (ФИО, ИНФ, ТФР), напротив, могут снижать клоногенность всех типов предшественников
гемопоэтических клеток, в силу чего их относят к негативным регуляторам гемопоэза. Цитокины являются наиболее многочисленной группой биологически активных веществ, влияние которых на
процесс апоптоза считается доказанным. Так, выявлена большая
группа цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-3, ИЛ-10, факторы роста),
при действии которых на клетку запускается эндогенная программа защиты клеток от апоптоза, опосредованная через белки Вс1-2,
Bcl-х и др. Тем не менее ряд цитокинов обладает способностью
индуцировать апоптоз (ФНОа, ИНФ-у, ИЛ-1 и др.); при этом
наиболее апоптогенным цитокином считается ФНОа.
Таким образом, цитокины характеризуются полифункциональностью, плейтропностью, действуют в синергизме друг с другом
или являются антагонистами и в зависимости от условий могут
оказывать как ингибирующее, так и стимулирующее действие на
клетки. Регуляторные эффекты цитокиновой сети построены на
равновесии оппозитных пулов молекул, нарушение которого, по
всей видимости, ведет к патологии.
Иммуногематология — раздел иммунологии и гематологии, изучающий антигены и антитела составных частей крови, их роль в
организме, а также патологические состояния, связанные с иммунологическими реакциями. Иммуногематология как наука появилась в 1900 г., когда проведенные 32-летним венским ученым
К. Ландштейнером исследования по изучению антител эритроцитов человека привели к открытию групповых, а затем и резусантигенов и впервые позволили эффективно и безопасно осуществлять переливание крови.
Этот успех, пожалуй, оставался единственным достижением
иммуногематологии в течение полувека, пока в середине 50-х го-
Глава 8. Иммуногематология
151
дов, продолжая идеи К. Ландштейнера, J. Dosset, R. Payne и
J. van Rood, не начали изучать антитела к ядерным клеткам крови — лейкоцитам, что привело к открытию главного комплекса
гистосовместимости и стало огромным вкладом в успешное развитие трансплантации органов и тканей в качестве лечебного метода.
Главный комплекс гистосовместимости, или major histocompatibility complex (MHC) — генетическая система, ответственная за развитие специфического иммунного ответа. У человека эта
система получила название HLA — human leukocyte antigens "человеческие лейкоцитарные антигены, поскольку впервые они
были обнаружены на белых клетках крови.
Первый антиген системы HLA — MAC — открыл в 1958 г. J. Dosset, который в 1980 г. был удостоен Нобелевской премии (Доссе Ж., 1959). Кроме него наибольший вклад в развитие учения об
этой системе внесли R. Cepellini, впервые предложивший на основании семейного анализа концепцию о существовании единой
генетической системы; J. van Rood, впервые показавший многоаллельность системы и предложивший компьютерную обработку
результатов серологических реакций, и P. Terasaki, разработавший микролимфоцитотоксический тест, который до настоящего
времени является основным методом серологического исследования.
Вторая Нобелевская премия за изучение системы HLA была
присуждена в 1996 г. Zinkernagel и Doherty за установление роли
молекул главного комплекса гистосовместимости в иммунном ответе — так называемую теорию «двойного распознавания» — своего и чужого для организма. Присуждение за столь короткий период двух наиболее престижных наград мирового научного сообщества свидетельствует как о чрезвычайно быстром прогрессе в
изучении этого раздела медицинской науки, так и об огромной
важности этих открытий.
Генетическая структура системы HLA
Гены, кодирующие молекулы HLA, локализуются на коротком плече 6-й хромосомы, занимая участок, вмещающий более
4000 пар нуклеотидов, и состоят из трех групп генов — I, II и III
класса. К I классу относятся гены локусов А, В, С («классические»,
открытые первыми), а также Е, F, G, Н. Во II класс входят гены
локусов DR, DQ, DP, а также DO, DM, TAP, MICA. И к III классу
относятся гены, собственно генами комплекса гистосовместимо-
Часть 1. Теоретическая гематология
152
сти не являющиеся (но расположенные на 6-й хромосоме между
классами I и II): это гены компонентов комплемента С2 и С4, белков теплового шока HSP70, факторы некроза опухоли и некоторые
другие (Histocompatibility testing, 1993).
Наследование генов HLA происходит по ко-доминантному типу — ребенок наследует половину признаков от отца и половину —
от матери. Это позволяет использовать HLA-фенотип в качестве
маркера при установлении спорного отцовства в судебной медицине.
Продукты HLA-генов — мембранные гликонротеины. Здесь молекула I класса состоит из а-цепи и Р-2 микроглобулина, а молекула II класса состоит из а- и (З-цепей. Молекулы как I, так и II
классов являются трансмембранными гетеродимерами, имеющими внутриклеточную и внеклеточную части. Большинство вариабельных аминокислотных остатков сосредоточены в верхней части молекулы, где она образует глубокую полость, или бороздку для
связывания чужеродного пептида. Продукты различных HLA-генов отличаются друг от друга по аминокислотным последовательностям и, следовательно, по конфигурации антигенсвязывающей
бороздки.
Экснрессированы молекулы HLA I класса практически на всех
ядросодержащих клетках организма. Наибольшее количество этих
молекул представлено на лимфоцитах. Молекулы HLA II класса
экспрессированы на так называемых профессиональных антигенпредставляющих клетках — это дендритные клетки,-В-лимфоциты
и макрофаги.
Функции продуктов ШЛгенов
Первичная роль адаптивной иммунной системы заключается в
распознавании и элиминации различных агентов, которые могут
причинить вред организму. Важной особенностью этой функции
является то, что иммунная система должна правильно выявить
различия между собственными (безвредными) и чужими (потенциально вредными) антигенами. Молекулы МНС играют ключевую роль в том процессе, посредством которого организм проводит
разделение на молекулярном, клеточном, а возможно, и организменном уровне между собственными и чужими элементами.
Эта роль определяется основными биологическими функциями
продуктов HLA-гснов, к которым в настоящее время относят: определение молекулярного репертуара Т-клеточных антигенных рецепторов; презентацию пептидов Т-клеткам; регуляцию цитотоксической активности ЕК-клеток; защиту вынашиваемого плода.
Глава 8. Иммуногематология
.
153
МНС и селекция репертуара Т-клеточного рецептора. Распознавание Т-клетками антигенов, несущих генетически чужеродную
информацию, осуществляется антигенными рецепторами Т-клеток. Для развития адекватного иммунного ответа Т-клеточный рецептор должен четко отличать «свое» от «чужою», и при непосредственном участии МНС-молекул в тимусе происходит «позитивная» и «негативная» селекция репертуара Т-клеточного рецептора,
в результате которой Т-клстки, обладающие повышенной аутореактивностью или, наоборот, не распознающие собственные антигены, подвергаются апоптозу. В результате окончательный репертуар слабоаутореактивных Т-клеток содержит рецепторы, которые
распознают изменение собственных МНС, вызванных воздействием «чужих» пептидов, в нем отсутствуют рецепторы, которые распознают немодифицированные собственные МНС-молекулы или
аутологичные пептиды, связанные с собственными МНС-молекулами.
Презентация антигенов Т-клеткам является второй важной
функцией МНС-молекул. Т-клеточные рецепторы распознают комплекс, который состоит из пептида, связанного внутри бороздки
МНС-молекулы. Конфигурация этой комбинации определяет аффинитет данного комплекса для набора Т-клеточных рецепторов и
последующей активации Т-клеток. Большинство чужеродных пептидов, представляемых Т-клеточным рецепторам МНС-молекулами, образуются из более крупных белковых цепей путем частичного переваривания в специализированных цитоплазматических образованиях — эндосомах внутри клеток. Две молекулы Т-клеточной
дифференцировки — CD8 и CD4 — прямо взаимодействуют с молекулами МНС I и II классов соответственно и участвуют в Т-клеточной активации и иммунной функции клетки-эффектора.
Комплекс молекулы HLA I класса — пептид взаимодействует с
CD8'Т-клетками. Пептиды, презентируемые молекулами I класса,
происходят преимущественно из протеинов, которые продуцируются самими клетками. Этот путь назывется эндогенным путем
презентации антигена. CD8 T цитотоксические Т-лимфоциты первично распознают и убивают аутологичные клетки, которые экспрессируют чужеродные вирусные или другие антигены. При аллогенной трансплантации цитотоксические Т-лимфоциты также убивают ал.тогенные клетки-мишени, экспрессирующие как чужие
молекулы HLA I класса, так и чужие пептиды.
Основной функцией HLA II класса является презентация CD4*
клеткам пептидов, которые происходят из экзогенных источников. Данная популяция Т-клеток включает клетки, которые могут
154
Часть 1. Теоретическая гематология
функционировать или как Т-хелперы при продукции антител В-клетками, или как регуляторные клетки, регулирующие продукцию
цитокинов, в зависимости от типа сигналов, которые Т-клетки
получают во время их активации. В этом случае чужеродные белки, микроорганизмы и другие антигены захватываются антигенпрезентирующими клетками и перерабатываются в пептиды внутри цитоплазматических эндосом. CD4" клетки необходимы для
начального распознавания экзогенных пептидов таким образом,
чтобы клеточные и гуморальные ответы были направлены на элиминацию внедрившегося агента (Ройт А. и др..'2000).
Регуляция активности естественных клеток-киллеров. Естественные киллеры — ЕК-клетки — весьма разнообразная и широкая популяция лимфоцитов, которая осуществляет прямую цнтотоксичпость, антнтелозависимую клеточную цитотоксичность. а
также вырабатывает провоспалительные цитокины — такие как
ИНФ, ФНО и колониестимулирующие факторы. ЕК-клетки, которые являются фактором врожденного иммунитета, в эволюционном отношении являются «двоюродными братьями» Т-клеток.
Функция ЕК-клеток как цитотоксических клеток заключается в
особом свойстве убивать некоторые типы опухолевых клеток-мишеней in vitro, но точный механизм распознавания был неизвестен в течение многих лет. В настоящее время установлено, что
ЕК-клеточная активация угнетается присутствием молекул МНС.
Каждая ЕК-клетка имеет множественные рецепторы распознавания, которые активируют или ингибируют эффекторную функцию. Рецепторы активации распознают широко распространенные
структуры клеточной поверхности, такие как некоторые Fc-рецепторы. Рецепторы ингибиции распознают общие («публичные») эпитопы HLA-молекул, включая Bw4 эпитоп, некоторые продукты
генов локуса HLA-C и неклассические HLA-молекулы — HLA-E и
HLA-G.
Защита вынашиваемого плода. Во время внутриутробного развития плод, являющийся своего рода аллотрансплантатом, защищен от иммунной агрессии со стороны иммунной системы матери
благодаря наличию разнообразных механизмов. Местно вырабатываемые гормоны плаценты — стероиды и гонадотропные гормоны хориона — обладают иммуносупрессивным действием. В дополнение классические продукты генов I класса — HLA А, В и С —
не экспрессированы на клетках трофобласта плаценты, в интерфейсе соприкосновения плода и матери.
Следовательно, Т-клетки должны быть индифферентны в отношении трофобласта и плода. Однако ЕК-клетки в большом коли-
Глава 8. Иммуногематология
155
чес i ве находятся в плаценте и по всем правилам должны бы были
атаковать HLA-негативные клетки трофобласта. Причиной, почему они не распознают эти клетки, по-видимому, является наличие
двух специализированных молекул I класса - HLA-G и -Е, которые в значительном количестве экспрессированы в тканях трофобласта. Преимущественным сайтом для распознавания одного из глав-,
ных ингибиторных рецепторов ЕК-клеток являются HLA-E-MOлекулы. Таким образом, неклассические HLA-молекулы - HLA-E
и -G - играют специальную биологическую роль - предохраняют
развивающийся плод от атак как Т-клсток, так и ЕК-клеток (Abbas A. et al., 1991).
Популяционная иммуногенетика
HLA-система невероятно разнообразна, у человека насчитывается более тысячи аллельных специфичностей. У индивидуума
может быть до 22 различных классических продуктов HLA-генов,
функционирующих как лиганды Т-клеточного рецептора.
Яркие примеры необходимости функционального разнообразия продуктов HLA-генов представляют исследования генетически замкнутых популяций индейцев Центральной и Южной Америки. Народы Северной Азии, которые заселили Северную и Южную Америку примерно 30 тыс. лет назад, разделились на отдельные
племена, поселившиеся в различных географических и экологических зонах. Изучение HLA в этих изолятах в 1970-е годы показало наличие очень ограниченного числа продуктов HLA-генов
I класса на основании серологического типироваиня. Это ограничение заставляет предположить, что популяции имели либо очень
высокий уровень смертности до или после заселения, либо крайне
ограниченное число родоначальных особей (эффект основателя).
Примечательно, что последующее изучение HLA-генов у изолированных туземных американских популяций с использованием метода секвенирования показало, что внутри ранее наблюдавшихся ограниченных специфичностей имеется большее количество аллельных вариантов. Основным механизмом создания
разнообразия в течение относительно короткого периода (столетий) является конверсия генов, при которой небольшие участки
нуклеотидов других HLA-аллелей внутри HLA-комнлекса замещают существующую последовательность в гене. Этот процесс воссоздает репертуар продуктов HLA-генов для эффективной защиты
от патогенов, которые существуют в новой окружающей среде (Коненков В. И., 1999).
156
Часть 1. Теоретическая гематология
Таким образом, теоретически набор продуктов HLA-генов, обнаруженных у большинства нелинейных индивидуумов, имеет достаточное разнообразие для того, чтобы дать возможность Т-клеткам распознавать пептиды любого патогена. Избыточность функции — отличительный признак иммунной системы, позволяющий
снизить опасность того, что новые микробные мутации смогут победить хозяина.
HIA и болезни
Поскольку характер иммунного ответа во многом определяется
индивидуальным HLA-генотипом, естественно предположить, что
это может оказывать существенное влияние на течение различных
заболеваний. В 1973 г. появилось сообщение о поразительной по
силе ассоциации между HLA-B27 и анкилозирующим спондилитом: оказалось, что более 80% больных имеют эту специфичность.
В последующем были изучены сотни заболеваний на предмет связи с HLA и обнаружены статистически значимые ассоциации более чем для 50 из них (Rodey G., 2000).
За некоторыми исключениями, HLA-ассоциированные заболевания у людей — это незлокачественные хронические заболевания.
Важной характеристикой многих из них являются аутоиммунные
проявления. Большинство болезней имеет мультифакторную этиологию, вовлекая несколько генов и один или более факторов внешней среды. Многие из этих заболеваний, по-видимому, инициируются микроорганизмами.
Клиническая значимость HLA-ассоциаций - это возможность
диагностировать или предсказать вероятность развития заболевания у индивидуума на основании типирования. Оценка силы ассоциаций между HLA-фактором и заболеванием определяется путем
расчета относительного риска развития заболевания. При этом важно, чтобы и больные, и группа сравнения принадлежали к одной и
той же расовой и этнической группе, так как частота HLA-антигенов в различных популяциях варьирует.
В 1980-е гг. картирование комплекса HLA было неполным, поэтому полагали, что комплекс содержит кроме собственно HLA-генов гены иммунного ответа, которые определяют восприимчивость
к заболеванию. В настоящее время известно, что большинство феноменов, приписываемых ранее генам иммунного ответа, по-видимому, являются функциональными характеристиками известных
генов I и II классов.
Поскольку главные функции HLA-молекул включают презентацию антигенов Т-клеткам и селекцию репертуара Т-клеточного
Глава 8. Иммуногематология
157
рецептора, логично предположить, что восприимчивость к некоторым заболеваниям отражает нарушение этих процессов. Определенные унаследованные HLA-молекулы могут, в частности, эффективно презентировать аутологичные пептиды (или микробные
пептиды, которые имеют сходство с аутологичными), что приводит к развитию аутоиммунного заболевания (HLA in health and
disease, 2000).
С другой стороны, финальный репертуар Т-клеток, отобранный
набором HLA-молекул данного индивидуума, может не включать
рецепторы, распознающие те или иные вирусные пептиды, что является необходимым для распознавания и удаления вируса. Нарушение может привести к хронической вирусной инфекции.
Заболевания, при которых HLA-молекулы напрямую влияют
на их развитие либо из-за нарушения связывания определенных
пептидов, либо из-за избыточного связывания, — это анкилозирующий спондилит и сахарный диабет 1 типа. Анкилозирующий спондилит ассоциирован с HLA-B27 во всех изученных популяциях.
Аллели восприимчивости характеризуются специфическим «карманом» в пептид-связывающей бороздке, который аккомодирован
к восприятию боковой цепи аргинина. Другие заболевания, ассоциированные с В27, включают болезнь Рейтера, передний увеит,
некоторые формы постинфекционных артритов, связанные с грамотрицательными организмами (Salmonella, Yersinia, Shigella,
Neisserid).
Ревматоидный артрит ассоциирован с очень специфическими
HLA-аллелями: DRBl*0401, *0402, *0404, *0408, и, менее часто, с
DRBl*0101 (кавказоиды), *0405 (японцы) и *1402 (американские
индейцы).
Аллель HLA-DRB1*O3 является маркером генетической предрасположенности ко многим аутоиммунным заболеваниям (сахарный диабет 1 типа, системная красная волчанка, диффузный токсический зоб, аутоиммунный тиреоидит). Объяснение этого факта, по-видимому, заключается в особенностях биохимической
структуры рецепторов, кодируемых данным аллелем: связывающий участок является высокоаффинным, но низкоспецифичным
по отношению к антигенам. Так, более 90% больных сахарным диабетом 1 типа (жители Санкт-Петербурга) имеют в своем генотипе
аллели-провокаторы DRB1*O3 и DRB1*O4, при этом те больные, у
которых встречаются оба этих аллеля, значительно чаще заболевают в более раннем возрасте — до 15 лет. У больных диффузным
токсическим зобом при наличии в генотипе сочетания DRB1*O3 и
DQAl*0501 риск развития эндокринной офтальмопатии увеличн-
158
Часть 1. Теоретическая гематология
вается в 10 раз (Глазанова Т. В. и др., 2002). Механизм HLA-accoциированности аутоиммунных заболеваний рассматривается как
предпочтительное связывание аутоантигенных пептидов и представление их потенциально аутореактивным клеткам.
Значение иммуногематологии
для трансплантации органов и тканей
Одно из важных достижений иммуногематологии XX в. — это
открытие в начале века групп крови, которое позволило успешно
осуществлять переливания крови, а открытие в середине XX столетия антигенов гистосовместимости сделато реальным преодоление иммунологического барьера при трансплантации других органов и тканей.
Открытие новых HLA-специфичностей главного комплекса гистосовместимости шло одновременно с изучением их влияния на
результаты пересадки органов и тканей. Было однозначно показано, что совпадение пар донор—реципиент по антигенам HLA значительно повышает выживаемость аллогенных органов. Хотя созданные в последние годы эффективные методы иммуносупрессии
позволяют функционировать в течение длительного времени не
полностью совпадающим трансплантатам, однако влияние степени иммунологического подбора по-прежнему остается значительным.
В результате коллективного исследования Collaborative
Transplant Study (CTS), в котором принимати участие более 300 лабораторий Европы и Америки, включая Санкт-Петербургский
центр трансплантации почки, была показана прямо пропорциональная зависимость выживаемости почечного трансплантата от
числа совпадений, в особенности по антигенам II класса: так, пятилетняя выживаемость при отсутствии несовпадений возрастает
на 20%. Поэтому в трансплантационных центрах как Европы, так и
Америки аллогенные трансплантаты почек распределяются в соответствии со степенью HLA-совместимости.
В Санкт-Петербурге круглосуточную службу типирования и
подбора пар донор—реципиент осуществляет Республиканский
центр иммунологического типирования тканей на базе Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.
Трансплантация костного мозга
Трансплантация костного мозга в настоящее время является
методом лечения многих гематологических заболеваний. При этом
Глава 8. Иммуногематология
159
установлено, что успешное приживление и функционирование аллогенных гемопоэтических стволовых клеток возможно только при
высокой степени точности подбора пар донор—реципиент. Так, например, при полном совпадении больных хроническим миелолейкозом и доноров костного мозга по А-, В-, С-, DRB1- и DQ-специфичностям пятилетняя выживаемость после трансплантации составила 61%, тогда как при расхождении по антигенам/генам двух
локусов — всего 33%.
Особенностью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток по сравнению с трансплантацией других органов и тканей является то, что пересаживается иммунологически активный материал. В связи с этим возникает риск развития реакции «трансплантат против хозяина», отсутствующий, например, при пересадке
почки. В связи с этим требования к подбору пар донор- реципиент
гораздо более высокие, требуется практически полное совпадение
по всем основным локусам (А, В, DR, DQ).
Регистры потенциальных доноров костного мозга. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток имеет то преимущество
перед трансплантацией сердца, печени и даже почки, что материал
для трансплантации может быть взят у донора в достаточном количестве практически без ущерба для его здоровья. Это позволяет
располагать теоретически неограниченным пулом доноров и проводить подбор с высокой степенью точности. Однако для того чтобы значительному числу больных и в достаточно короткие сроки
был подобран HLA-совместимый донор, необходимо иметь большое количество доноров, типированных по HLA-A, -В и -DR локусам. Поэтому успех аллогенной трансплантации костного мозга в
значительной-степени зав.исит от величины донорского регистра,
которым располагает лечебное учреждение.
Стимулом для создания донорских регистров послужил быстрый рост числа аллогенных трансплантаций в разных странах. Так,
в США с 1986 по 1996 гг. количество ежегодно проводимых аллогенных трансплантаций возросло в 5 раз. Первые донорские регистры в Европе были созданы в Англии, Голландии, Италии в середине 80-х гг. В США этот раздел медицинской помощи был признан
государственно важным, и в 1991 г. Конгресс США принял закон
«Об улучшении трансплантации» с разделом «О национальном
регистре доноров костного мозга».
Национальные регистры достаточно быстро пришли к пониманию необходимости объединения для повышения эффективности
подбора доноров, и в настоящее время они объединены в организацию «Всемирный регистр доноров костного мозга».
160
Часть 1. Теоретическая гематология
На Международной конференции по донорским регистрам в
Германии в 2001 г., в которой участвовали представители России,
было указано, что очередная ядерная авария, произошедшая в Японии, — казалось бы, в благополучной и технически развитой стране — показывает, что техногенные катастрофы возможны в любом
месте земного шара, и всем участникам было настоятельно указано
на необходимость расширения собственных регистров, поскольку
поиск донора значительно более эффективен в пределах собственной популяции.
В России же до настоящего времени не существует ни законодательной базы, ни целевого финансирования, а имеющиеся малочисленные регистры поддерживаются исключительно за счет внутренних резервов учреждений, в которых они находятся.
Регистр доноров костного мозга Российского НИИ гематологии и трансфузиологии насчитывает около 4000 человек, что, безусловно, крайне мало. Однако имеются особенности распределения генетических характеристик, связанных с национальной и расовой принадлежностью, и поэтому для больного из России
с гораздо большей вероятностью подходящий донор может быть
найден именно в Российском регистре (Бубнова Л. Н., 2000).
Благодаря этому обстоятельству, в апреле 2002 г. в отделении
трансплантации костного мозга Российского НИИ гематологии
и трансфузиологии (руководитель — з. д. н. РФ д. м. н. проф.
К. М. Абдулкадыров) проведена первая в России аллогенная неродственная трансплантация стволовых периферических клеток
от донора, подобранного в собственном регистре.
Значение антигенов гистосовместимости
для трансфузиологии
Известно, что природных антител против антигенов HLA не
существует — они возникают в результате сенсибилизации во время переливания крови или у женщин, иммунизированных антигенами плода во время беременности. В последнем случае частоста
их появления увеличивается с числом беременностей. При этом
хотя несовместимость матери и плода по системе AB0 и резусфактору не оказывает значительного влияния на синтез антител к
антигенам HLA, однако они чаще встречаются в сыворотках, содержащих антитела против эритроцитарных антигенов. Антитела
появляются на разных сроках беременности, и время, в течение
которого они персистируют в сыворотке матери, очень сильно
варьирует — от нескольких месяцев до нескольких лет.
Глава 8. Иммуногематология
161
Появление антилейкоцитарных антител после переливания крови отмечается достаточно часто — от 20 до 50%, и вероятность их
выработки возрастает с числом перенесенных переливаний. Однако приблизительно у половины пациентов антитела не обнаруживаются, хотя им многократно переливают компоненты крови. Такая кажущаяся резнстентность к иммунизации может быть вызвана разными причинами, например перекрестными реакциями
между епсцпфпчностямп одного локуса пли блокирующими антителами, а также типом иммунного ответа реципиента.
Клиническое значение ант игенов главного комплекса гистосовместимости для трансфузиологии состоит в том, что они представлены на ядерных клетках крови и тромбоцитах и являются главной причиной аллоиммунизации к ним. Повторные трансфузии от
разных доноров приводят к появлению антител к HLA-антигенам.
Клинически такая аллонммунизация проявляется развитием негемолитических реакций, к которым относятся лихорадка (80%) и
крапивница (20%). Фебрпльные реакции, по данным некоторых
авторов, могут возникать у 1 3% больных, которым выполняются
повторные гемотраисфузии. Иногда тяжелые формы трансфузионных реакций, вызываемых антилейкоцитарными антителами,
сопровождаются развитием острой легочной патологии и обычно
проявляются как некардиогенный острый отек легких. Среди методов предотвращения или снижения нежелательных эффектов,
связанных с лейкоцитами, присутствующими в компонентах крови, используют удаление лейкоцитов из переливаемой эритроцитной массы с помощью фильтрации. Максимальное количество
лейкоцитов, еще не вызывающее развитие иоеттрансфузпонной фебрнльной реакции у аллопммунпзированных больных, — до 0,5 х 10я
клеток на трансфузию.
Трансфузии донорских тромбоцитов представляют мощное
средство современной терапии больных с повышенной кровоточивостью, обусловленной эндогенной депрессией кроветворения или
воздействием экзогенных факторов (лучевая, цитостатпческая терапия). Успешное проведение лечения аллогенными тромбоцитами в значительной степени связано с сохранением их высокой функциональной активности. Однако второе нежелательное последствие аллоиммунизации против HLA-антигенов состоит в том, что
даже при отсутствии негемолитических реакций" срок выживания
тромбоци- ток сокращается. Поскольку на поверхности тромбоцитов хорошо выражены HLA-антигены I класса, то продолжительность жизни тромбоцитов напрямую зависит от степени совместимости донора п реципиента по антигенам гистосовместимости.
6 Гематология. Нов. справочник
162
Часть 1. Теоретическая гематология
Тромбоциты, взятые у сиблинга, идентичного по HLA с реципиентом, имеют нормальную продолжительность жизни даже у тех больных, которые не переносят переливания тромбоцитарной массы от
неродственных доноров. Тромбоциты, введенные от HLA идентичного неродственного донора, имеют почти нормальный срок выживания.
Трансфузии тромбоцитов пациентам, которые иммунизированы к HLA-антигенам, не только могут сопровождаться негемолитическими реакциями, но и не приводят к увеличению числа тромбоцитов. Это происходит из-за быстрого удаления и деструкции
покрытых антителами тромбоцитов макрофагами в ретикулоэндотелиальных органах. Поэтому трансфузии тромбоцитов у аллоиммунизированных пациентов обречены на неудачу и не могут облегчить или предотвратить тромбоцитопенические осложнения. Рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов является одним из
главных препятствий в трансфузионном обеспечении пациентов,
получающих химиотерапию.
В настоящее время при трансфузиях тромбоконцентрата, способных вызвать образование у реципиентов HLA-антител и связанную с ними рефрактерность к тромбоцитотерапии, считается
необходимым производить типирование доноров тромбоцитов и
переливать HLA-совместимый концентрат. Это достигается или за
счет использования родственных доноров, или за счет регистров
типированных неродственных доноров. Использование генетически идентичных больному доноров, а также разработка упрощенных иммунологических методов скрининга совместимых доноров
тромбоцитов позволит повысить эффективность и снизить расходы на проведение весьма дорогостоящей тромбоцитотерапии.
Таким образом, иммунологические и иммуногенетические исследования являются неотъемлемой частью современной гематологии.
Литература
Бубнова Л. Н. Создание регистра доноров костного мозга и значение селекции
по HLA-специфичностям // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2000.
№ 1.С. 21-22.
Глазанова Т. В., Бубнова Л. П., Кузмичев А. С. и соавт. Фенотипические и функциональные особенности лимфоцитов периферической крови и иммуногенетическая характеристика больных с диффузным токсическим зобом и узловым
эутиреоидным зобом // Медицинская иммунология. 2000. Т. 2, № 4. С. 385393.
ДоссеЖ. Иммуногематология. М.: Мир, 1959.637 с.
Глава 9
ИММУНОГИСТОХИМИЯ
Иммуногистохимия — метод морфологической диагностики, в
основе которого лежит визуализация и оценка с помощью микроскопа результатов реакции антиген-антитело в срезах биопсированной ткани. В качестве антигена выступают компоненты клеточных структур или межклеточного вещества ткани. Антитела
получают из сыворотки крови животных, иммунизированных интересующим антигеном, или от культуры ткани гибридомы, которую создают слиянием «бессмертных» клеток плазмоцитарной
опухоли (миеломы) и активированных интересующим антигеном
В-лимфоцитов. Уникальность последнего метода состоит в том,
что все клетки гибридомы являются потомками одной-единственной клетки и поэтому синтезируют абсолютно идентичные молекулы антител. Такие антитела называют моноклональными, в отличие от поликлональных, получаемых иммунизацией животных.
Способ окрашивания клеточных и тканевых компонентов с помощью специфических антител для микроскопического исследования был предложен A. Coons с соавторами в 1941 г. Антитела
метили флюоресцирующей краской, что позволило обнаружить
комплекс тканевого антигена и диагностического антитела в гистологических срезах с помощью люминесцентного микроскопа.
Следующий шаг в развитии иммуногистохпмии связан с разработкой антител, меченных не флюорохромами, а ферментами. Для
обнаружения места связывания меченных ферментом антител применяют субстрат, в котором под воздействием ферментных меток
образуются окрашенные продукты. Ферментные метки позволяют
получить постоянные гистологические препараты, которые могут
длительно храниться, а результаты иммуногистохимической реакции точнее привязаны к структуре тканей.
Глава 9. Иммуногистохимия
165
Принципиальным отличием иммуногистохимии от других методов иммунологической диагностики, использующих реакцию
антиген-антитело, является структурная специфичность исследования. Это означает, что в реакции оценивается не только наличие
сигнала (есть окрашивание или нет) и его сила (интенсивность
окрашивания), но и пространственное распределение в гистологическом препарате (окрашивание мембран клеток, цитоплазмы, ядра
и других структурных элементов).
В морфологической (биопсийной) диагностике иммуногистохимические методы позволяют решать следующие главные задачи.
1. Уточнение гистогенеза опухолей.
2. Определение характера патологического процесса в плохо
сохранившихся биоптатах или биоптатах с недостаточным
объемом материала.
3. Уточнение вероятного источника метастазирования.
4. Оценка функционального состояния клеток опухоли.
5. Иммунофенотипирование опухолей кроветворной и лимфоидной тканей.
6. Диагностика иммунокомплексных и аутоиммунных заболеваний (гломерулопатии, буллезные дерматозы, синдром Гудпасчера и др.).
7. Поиск инфекционных агентов (токсоплазма, микобактерии,
хламидии, вирусы и др.).
Иммунологические маркеры,
используемые в гистологической диагностике лимфом*
Лимфомы представляют собой гетерогенную группу опухолей,
различающихся по клиническому течению, морфологическим, иммунологическим и генетическим признакам. За последние годы
достигнуты значительные успехи в понимании биологических основ этой гетерогенности. Развитие гибридомной технологии привело к созданию огромного числа моноклональных антител (мкАТ)
к широкому спектру линейных, дифференцировочных и субпопуляционных антигенов кроветворных и лимфоидных клеток, которые успешно используют в качестве иммунофенотипических маркеров для диагностики и классификации лейкозов и лимфом. Тысячи мкАТ были охарактеризованы на шести Рабочих совещаниях
(Париж, 1982; Бостон, 1984; Оксфорд, 1986; Вена, 1989; Бостон,
1993; Кобэ, 1996), результатами которых было принятие стандарт* Раздел подготовлен при участии Л. Ь. Салтыковой.
166
Часть 1 Теоретическая гематология
ной номенклатуры. Для лейкоцитарных антигенов, выявляемых
различными антителами, была разработана CD-классификация
(CD-cluster of differentiation — кластер дифференцировки). Кластер дифферснцировки включает группу антител, реагирующих с
одним или разными эпигонами определенного антигена. К настоящему времени получены данные по 247 кластерам.
Ниже приведены лейкоцитарные антигены согласно их принадлежности к тому или иному кластеру дифференцировки (в соответствии с материалами VI Рабочего совещания по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека, проведенного в 1996 г.
в г. Кобэ, Япония). В скобках указаны клоны соответствующих
антител, пригодных для применения на парафиновых срезах.
CDla (010, МТВ1, JPM30, ICA04). Антиген незрелых Т-клеток. Диагностическое значение для тканей, фиксированных в формалине, имеет детекция CDla. Молекулы CDla в норме обнаруживаются на кортикальных и, в меньшей степени, медуллярных
тимоцитах, клетках Лангерганса и других дендритных клетках и
не экспрессируются зрелыми Т-клетками в состоянии покоя. Экспрессия CDla отмечена в цитоплазме активированных Т-клеток и
на активированных моноцитах.
Антитела к CDla используют для дифференциальной диагностики Т-лимфобластной лимфомы/лейкоза от периферических
Т-клеточных лимфом. При лимфомах из зрелых Т- клеток экспрессия CDla, как правило, отсутствует.
CD2 (АВ75). Пан-Т-клеточный антиген (LFA-2). CD2 экспрессируется всеми тимоцитами. Т-лимфоцитами, субпоиуляцией
естественных киллеров (NK-клеток), незрелыми клетками миелоидного ряда, гистиоцитами. Выявляется при Т-лимфобластной
лимфоме/лейкозе, большинстве периферических Т-клеточных лимфом, ангиоцентрической лимфоме, Т-клеточной лимфоме/лейкозе взрослых, Т-клеточпом хроническом лимфолейкозе, Т-клеточном лейкозе из крупногранулярных лимфоцитов, грибовидном
микозе/синдроме Сезари. Может экспрессироваться бластными
клетками при остром миелоидном лейкозе. Окрашивание мембранное.
CD3 (CD3poly, PS1, РСЗ/188А, CD3-12). Пан-Т-клеточный антиген. СОЗ-антигенный комплекс состоит из 5 полипептидных цепей (гамма-, дельта-, эпсилон-, зета- и эта-), ковалентно связанных
с Т-клеточным рецептором (TCR). Поликлональные и большинство моноклональных антител к CD3 реагируют с цитоплазматпческим доменом эпсилон цепи CD3/TCR-aHTnreHHoro комплекса,
экспрессируемого Т-клетками. CD3- антиген появляется на более
Глава 9. Иммуногистохимия
167
ранней стадии Т-клеточной дифференцировки, чем CD2, и у кортикальных тимоцптов преимущественно обнаруживается в цитоплазме. Цитоплазматическая экспрессия CD3 характерна для
Т-лимфобластной лимфомы/лейкоза, а также фетальных, зрелых активированных и нсоиластических NK-клеток. Поверхностная
экспрессия CD3 антигена возникает на стадии медуллярных тимоцитов и сохраняется у зрелых Т-клеток. СОЗ-антиген является
высокоспецифичным маркером Т-лимфоцитов: на других клетках
он не обнаружен, за исключением, возможно, клеток Пуркинье в
мозжечке. Практически все Т-клеточные лимфомы экспрессируют
CD3. кроме редко встречающихся опухолей, при которых данный
антиген утрачивается в процессе малигнизации. Это явление наиболее характерно для анапластических крупноклеточных лимфом.
Экспрессия антигена CD3 выявляется в отдельных случаях злокачественного гистиоцитоза и лимфогранулематоза.
CD4 (1F6, 4В12). Антиген Т-лимфоцитов-хелперов и индукторов. Экспрессируется большинством Т-клеток периферической
крови и 80-90% кортикальных тимоцитов. Слабая экспрессия
обнаружена на моноцитах и гистиоцитах. СО4-антиген ассоциирован с комплексом CD3/TCR, является рецептором молекул
HLA II класса и ВИЧ; участвует в Т-В-клеточной адгезии, дифференцировке тимоцитов. МкАТ 1F6 и 4В12, которые реагируют
с CD4 в парафиновых срезах, являются необходимым компонентом диагностической панели Т-клеточных опухолей, так как экспрессия антигена CD4 характерна для неопластических клеток
большинства периферических Т-клеточных лимфом. CD4 выявляется также при Т-лимфобластной лимфоме/лейкозе, Т-клеточном лейкозе/лимфоме взрослых, большинстве случаев грибовидного микоза/синдрома Сезари, Т-клеточном пролимфоцитарном
лейкозе, при ангиоиммунобластной лимфоме. Окрашивание —
мембранное.
CD5 (4С7, CD5/54/F6, CD/54/B4). Пан-Т-клеточный антиген. CD5-aHTiiren присутствует в норме на клеточной поверхности
большинства Т-лимфоцитов, начиная с кортикальных тимоцитов,
и В1а — субпопуляции В-клеток. Диагностическое значение антитела к CD5 имеют при В-клеточных опухолях: В-клеточном хроническом лимфолейкозе/лимфоцитарной лимфоме, лимфоме из клеток зоны мантии, некоторых диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфомах. Для детекции CD5 в парафиновых срезах на
опухолевых клетках (не реактивных) чувствительность методов
визуализации может оказаться недостаточной. Выявляется на клетках рака вилочковой железы. Окрашивание мембранное.
168
Часть 1. Теоретическая гематология
CD7 (CD7-272). Пан-Т-клеточный антиген. Экспрессия CD7
на предшественниках Т-клеток возникает в эмбриональной печени, во время реарранжнровки гена дельта-цепи TCR. Кроме клеток
Т-ряда экспрессируется на костномозговых полипотентных CD34T
клетках-предшественниках, NK-клетках и моноцитах. Участвует в
активации Т-клеток. Антитела к CD7 используются для характеристики Т-клеточпых лимфом/лейкозов.
CD8 (С8/144В, 4В11, 1А5). Антиген супрессорных/цитотоксических Т-клеток, нормальных и опухолевых. Антитела реагируют с цитоплазматическим доменом а цепи молекулы CD8.
СО8-аптиген экспрессирует примерно 30% периферических мононуклеарных клеток и 60-85% кортикальных тимоцитов. В норме
антитела к CD8 могут окрашивать NK-клетки, а также клетки
эндотелия, клетки, выстилающие тяжи Бильрота в селезенке.
Окрашивание опухолевых клеток антителами к CD8 наблюдается
обычно при Т-клеточном хроническом лимфолейкозе, некоторых
Т-лимфобластных лимфомах/лейкозах, Т-клеточном лейкозе из
крупногранулярных лимфоцитов и кишечных Т-клеточных лимфомах с проявлениями энтеропатии. Экспрессия CD8 отсутствует
при грибовидном микозе/синдроме Сезари. Окрашивание мембранное.
CD10 (56С6). В-клеточный антиген (CALLA, common lymphoblastic leukaemia antigen). Эксирессируется различными типами
нормальных и опухолевых клеток, включая гемоноэтнческие (клетки зародышевого центра, плазматические клетки, зрелые гранулоциты, субпопуляция тимоцитов), эпителиальные (проксимальные
почечные канальцы, желчные канальцы) и стромальные клетки
(фибробласты), и не является исключительным маркером В-лимфобластов при ОЛЛ «общего типа». Экспрессия CD10 наблюдается не только при В-лимфобластной лнмфоме/лейкозе, но также и
при фолликулярной лимфоме (окрашивание от слабого до среднего), в большинстве случаев лимфомы Беркитта и в 30% случаев
диффузной крупноклеточной В-клеточнойлимфомы. CD 10 не экспрессируется при В-клеточном хроническом лимфолейкозе, лимфоплазмоцитарной лимфоме и, за редким исключением, лимфоме
из клеток зоны мантии (в том числе при бластоидном варианте).
Слабая экспрессия CDIO отмечается в ряде случаев множественной мпеломы. За исключением Т-лимфобластной лимфомы/лейкоза, CD 10 редко экспрессируется при других Т-клеточных опухолях. При всех подтипах острого миелоидного лейкоза и лимфоидном варианте бластного криза хронического миелолейкоза отмечена
экспрессия CDlO-антигена. Окрашивание — мембранное.
Глава 9. Иммуногистохимия
169
CD15 (C3D-1, LeuMl, MMA, TU9, BY87). Антиген гранулоцитов, активированных лейкоцитов, эпителиальных клеток. Более
95% гранулоцитов периферической крови и 80% циркулирующих
.моноцитов, а также дендритические ретикулярные клетки экспрессируютСО15-антиген. Экспрессия CD 15 не выявлена на лимфоцитах и тромбоцитах. В диагностике антитела к CD15 используют при иммунофенотипировании лимфогранулематоза и исследовании лейкозов миелоидного происхождения. Реакция с антителами проявляется в сильном окрашивании клеток БерезовскогоШтернберга-Рид и клеток Ходжкина в области клеточной мембраны, цитоплазмы или комплекса Гольджи (околоядерная область).
Экспрессия CD15 при лимфомах не ограничивется лимфогранулематозом: данный антиген выявляется на опухолевых клетках ряда
Т- и В-клеточных неходжкннекпх лимфом.
CD16a (2H7). Антиген NK-клеток и клеток миеломоноцитарного происхождения. Экспрессируется всеми покоящимися естественными киллерами, нейтрофилами, макрофагами, а также небольшой субпопуляцией Т-клеток. CD16a также является рецептором при антитело-зависимой клеточной цитотоксичности.
Диагностическое значение антитела к CD 16а имеют при лимфомах/лейкозах из NK-клеток и некоторых лимфобластных лимфомах из предшественников Т-клеток. Окрашивание — мембранное.
CD20 (L26, 7D1, MJ1, CD20poly). Пан-В-клеточный антиген.
Экспрессия на В-клетках совпадает но времени с реарранжировкой генов легких цепей Ig. Это маркер нормальных и опухолевых
В-клеток, фолликулярных дендритических клеток. Экспрессируется в 50% случаев В-лимфобластных лимфом/лейкозов и в большинстве случаев зрелоклеточных лимфом/лейкозов В-клеточного
происхождения. В 40% случаев «классического» лимфогранулематоза некоторые клетки Березовского-Штернберга-Рид могут в различной степени интенсивности экспрессировать антиген CD20,
тогда как опухолевые (pop-corn, L&H) клетки при нодулярном
типе лимфоидного преобладания практически всегда имеют сильную экспрессию данного антигена. CD20 утрачивается плазматическими клетками, но экспрессируется в некоторых случаях при
плазмоцитоме/миеломе. Окрашивание — мембранное. Неспецифичным является окрашивание ядрышек в некоторых случаях применения высокочувствительных систем визуализации.
CD21 (1F8, BL13, 2G9). В-клеточный антиген. В лимфоидных
фолликулах экспрессируется зрелыми В-лимфоцитами (slg+) и
фолликулярными дендритическими клетками в норме и при различных типах В-клеточных лимфом/лейкозов; экспрессируется
170
Часть 1. Теоретическая гематология
субпопуляцией тимоцитов и некоторыми видами эпителия и не
экспрессируется циркулирующими лимфоцитами, Т-клетками,
гранулоцитами и моноцитами. Антитела к CD21 используются
для идентификации изменений сети фолликулярных дендритных клеток при В-клеточных лимфомах, ангиоиммуноблас т о й
лимфоме, ассоциированных с ВИЧ-инфекцией поражениях лимфоидной ткани, лимфогранулематозе. Характер окрашивания —
мембранный.
CD22 (FPC1). В-клеточный антиген. Экспрессия CD22 возникает в цитоплазме про- и ранних пре-В-клеток и на поверхности
зрелых В-лимфоцитов. Поверхностная экспрессия антигена CD22
вариабельна и может утрачиваться в процессе дифференцировки.
Антиген CD22 слабо экспрессирован при В-клеточных лимфомах/
лейкозах из клеток-предшественников; сильная экспрессия антигена CD22 наблюдается при волосатоклеточном лейкозе. Т-лимфоциты периферической крови и Т-клеточные лимфомы/лейкозы, а также гранулоциты и моноциты не экспрессируют антиген
CD22.
CD23 (МНМ6, BU38, 1В12). В-клеточный антиген. В слабой
степени CD23 экспрессирует большинство зрелых В-лимфоцитов.
Высокий уровень экспрессии характерен для фолликулярных дендритических клеток и особенно для трансформированных вирусом Epstein-Barr В-лимфобластов. CD23 экспрессируется также
на других клетках — моноцитах, зозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, Т-клетках, тромбоцитах, клетках Лангерганса и
субпопуляции эпителиальных клеток тимуса. Для В-клеток CD23
является маркером дифференцировки, который утрачивается Ig-секретирующими клетками. В лимфоидной ткани антитела к CD23
реагируют с субпопуляциями лимфоцитов зоны мантии и фолликулярных дендритических клеток, при этом реакции с лимфоцитами маргинальной зоны селезенки не обнаруживается. CD23 экспрессируется опухолевыми клетками при фолликулярных лимфомах, В-клеточных лимфоцитарных лимфомах/хронических лейкозах и не экспрессируются при других лимфомах, включая лимфому из клеток зоны мантии. Характер окрашивания - мембранный.
CD30 ( Ber-H2, 15B3, МР-1, 1G12 ). Активационный антиген
лимфоцитов и макрофагов, ранее известный как Ki-1-антиген.
Антиген CD30 экспрессируется активированными В-, Т-, NK-клетками, моноцитами, клетками Березовского- Штернберга- Рид и
Ходжкина при лимфогранулематозе, опухолевыми клетками анапластических крупноклеточных лимфом и при лимфоматоидном
Глава 9. Иммуногистохимия
171
папулезе. СОЗО-позитивными могут быть некоторые Т-клеточные
лимфомы с иммунофенотипом периферических лимфоцитов (в
частности, ангиоиммунобластные) и некоторые диффузные крупноклеточные В-клеточные лимфомы (иммунобластные). В нормальной лимфоидной ткани антитело Вег-Н2 реагирует с небольшой популяцией крупных клеток, располагающихся преимущественно вокруг В-клеточных фолликулов. Вне лимфоидной ткани
Вег-112 реагирует с клетками ацинуса поджелудочной железы и с
некоторыми карциномами, происходящими из этих клеток. Экспрессия CD30 характерна также для эмбрионального рака. Окрашивание — мембранное и в зоне комплекса Гольджи.
CD34 (QBendlO, MylO). Антиген гемопоэтических клетокпредшественников, в норме избирательно экспрессирующийся на
ранних гемопоэтических клетках-предшественниках и клетках эндотелия капилляров; нейронах, эмбриональных фибробластах. Участвует в межклеточной адгезии. Выявляется примерно в 33% случаев острых лейкозов миелоидиого происхождения, 50% В-лимфобластных лимфом/лейкозов и 5% Т-лимфобластных лимфом/
лейкозов из клеток-предшественников.
CD35 (Ber-MAC-DRC, To5, El I, RLB-25). Рецептор компонентов комплемента СЗЬ, СЗс! и других. Экспрессирован на эритроцитах, лейкоцитах, В-клетках, 10-15% Т-клеток, фолликулярных
дендритических клетках, астроцитах и подоцитах.
CD38 (SPC32, АТ13/5). Маркер плазматических клеток. Экспрессирован на тимоцитах, пре-В-клетках, активированных Т-клетках, моноцитах, NK-клетках; плазматических клетках, секретирующих иммуноглобулины; костномозговых клетках-предшественниках эритроидного и миелоидного ряда, клетках мозга. Антитела
к CD38 используются в диагностике плазмоклеточной миеломы,
дифференциальной диагностике лимфоплазмоцитарной лимфомы
и лимфоцитарной лимфомы/хронического лимфолейкоза. CD38
выявляется в части случаев хронического лимфолейкоза. Окрашивание — мембранное.
CD43 (МТ1, DF-T1, Leu22, L60, 84-ЗС1). Антиген, ассоциированный с Т-лимфоцитами, в парафиновых срезах сильно экспрессируется нормальными Т-лимфоцитами (в том числе 90% тимоцитов), NK-к.тетками, гранулоцитами, гистиоцитами, субпопуляцией плазматических клеток и не экспрессируется покоящимися В-лимфоцитами. Молекулы CD43 участвуют в процессе
активации Т-лимфоцитов. Антитела к CD43 реагируют с опухолевыми клетками Т-клеточных лимфом, по также и 20% лимфом и
лейкозов В-клеточного происхождения и гранулоцитарных сарком,
172
Часть 1. Теоретическая гематология
поэтому с диагностической целью должны использоваться совместно с другими Т- и В-клеточными маркерами. Характер окрашивания — мембранный.
CD45R0 (UCHL1, А6, OPD4). Ассоциированная с Т-лимфоцитами низкомолекулярная изоформа общелейкоцитарного антигена LCA/CD45. Сейчас известно 5 гликопротеинов, входящих
в состав LCA/CD45 и присутствующих на клеточной поверхности
большинства лейкоцитов. Гликопротеины кодируются одним геном CD45, и существующие три СО45-изоформы (RO, RA и RB)
являются продуктами альтернативного сплайсинга трех экзонов
(А, В и С) данного гена. CD45R0 выявляется на большинстве тимоцитов, зрелых активированных Т-клетках, субпопуляции покоящихся Т-лимфоцитов (как среди CD4% так и среди CD8 + ). Антитело UCHL1 реагирует с гранулоцитами и моноцитами, но не реагирует с NK-клетками и нормальными В-лимфоцитами. Экспрессия
CD45R0, характерная для Т-клеточных лимфом, может выявляться также в редких случаях диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом и в миеломонобластных инфильтратах. Окрашивание — мембранное.
CD45RB/LCA (LCA, 2B11, PD7/26, МЕМ55). Изоформа обгцелейкоцитарного антигена (Leukocyte Common Antigen), кодируемая экзоном В гена CD45 (см. выше). Антитела к CD45RB
имеют важное значение в дифференциальной диагностике злокачественных лимфом и низкодифференцированных опухолей другого гистогенеза. Мембранная позитивность, иногда выявляется
диффузное цитоплазматическое окрашивание и в участке комплекса Гольджи.
CD56 (1В6,123СЗ, 123C3D5). Маркер естественных киллеров
(NK-клеток). Экспрессируется всеми покоящимися и активированными NK-клетками и субпопуляцией NK-подобных цитотоксических у/5 Т-клеток, клетками нервной ткани. С помощью антител
к антигену CD56 были выделены новые категории T/NK-клеточных опухолей: NK/T-клеточные лимфомы типа лимфом верхних
дыхательных путей (ангиоцентрические), агрессивный NK-клеточный лейкоз, бластная NK-лимфома, а также NK-вариант Т-клеточного лейкоза из крупногранулярных лимфоцитов. CD56 экспрессируется при NK/T-клеточных лимфомах верхних дыхательных
путей и гепатолиенальной Т-клеточной лимфоме, редких случаях
кишечных Т-клеточных лимфом с проявлениями энтеропатии, а
также множественной миеломе, миелоидных лейкозах, нейробластоме* опухоли Юинга, мелкоклеточном раке легкого. Окрашивание — мембранное.
Глава 9. Иммуногистохимия
173
CD57 (Leu7, HNK-1, NCI, NK1). Антиген естественных киллеров. В лимфоидной ткани CD57 экспрессируется покоящимися
NK-клетками, субпопуляцией Т-клеток и некоторыми патологическими В-клетками. При активации NK-клетки перестают экспрессировать CD57, поэтому часто случаи NK-клеточных лимфом/
лейкозов являются СВ57-негативными. CD57 часто экспрессируется опухолевыми клетками при T/NK-клеточном лейкозе из
крупногранулярных лимфоцитов. CD57 экспрессируют реактивные Т-клетки, окружающие неопластические (L&H) клетки при
лимфогранулематозе с нодулярным типом лимфоидного преобладания, но не при классических типах лимфогранулематоза. Вне
лимфоидной ткани антитела к CD57 окрашивают нормальные и
опухолевые эктодермальные и нейроэктодермальные клетки. Окрашивание — мембранное.
CD68 (КР1, PG-M1, 514Н12). Маркер моноцитов и гистиоцитов. CD68 экспрессируется в цитоплазматических гранулах и, в
меньшей степени, на клеточных мембранах моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, базофилов и NK-клеток. Позитивными по CD68
могут быть также активированные Т-клетки, субпопуляция зрелых
В-клеток и эпителий (в цитоплазме). Характер окрашивания антителами гранулярный. Антитела к антигену CD68 обладают различной иммунореактивностью по отношению к одной и той же популяции клеток, так как выявляют разные эпитопы данного антигена.
Опухоли лимфоидного происхождения обычно негативны в отношении антител к CD68, за исключением'отдельных случаев волосатоклеточного лейкоза и В-клеточной лимфоцитарной лимфомы.
Антитела к CD68 используются для выявления реактивных макрофагов в тканевых срезах при иммунофенотипировании опухолей.
CD79oc (JCB117, 11ЕЗ, 11D10, НМ47/А9). Пан-В-клеточный
антиген. Экспрессия CD79a возникает на стадии предшественников В-лимфоцитов и сохраняется до стадии плазматических клеток, когда антиген локализуется внутри клетки. Антитела к CD79a
используются для идентификации всех опухолей В-клеточного
происхождения.
CD138 (5F7, МП5). Маркер плазматических клеток. Экспрессия CD138 специфична для плазматических клеток, содержащих
иммуноглобулины в цитоплазме. Антитела к CD 138 дают позитивную реакцию при плазмоклеточной миеломе, лимфоплазмоцитарной лимфоме, хроническом лимфолейкозе. Среди негемопоэтических тканей антиген CD138 в норме экспрессирован на фибробластах, клетках эпителия и эндотелиальных клетках; может
утрачиваться при малигнизации.
174
Часть 1. Теоретическая гематология
BCL-2 (124, BCL-2-100, 100/D5). Белок-супрессор апоптоза
(программируемой клеточной гибели). BCL-2 кодируется соответствующим геном, который вовлекается в хромосомную транслокацию t( 14; 18)(q32;q21), обнаруживаемую в подавляющем большинстве фолликулярных лимфом. Юкстапозиция гена bcl-2 к промотору гена тяжелых цепей lg приводит к аберрантной транскрипции
гена bcl-2 и избыточному синтезу его белкового продукта. Наличие
транслокации t(14;18) не является необходимым условием экспрессии белка BCL-2, так как в большинстве случаев BCL-2 синтезируется в отсутствие данной хромосомной перестройки. В нормальной лимфоидной ткани BCL-2 обнаруживается в малых лимфоцитах зоны мантии фолликулов, множестве Т-клеток в Т-зонах,
но лишь в единичных клетках зародышевых центров и отсутствует
в моноцитоидных В-клетках. В тимусе антителами к BCL-2 интенсивно окрашиваются клетки мозгового вещества, тогда как кортикальные тимоциты остаются BCL-2-негативными или слабопозитивными. Антитела к BCL-2-нротенну реагируют с опухолевыми
клетками большинства фолликулярных лимфом, что дает возможность отличать опухолевые фолликулы от зародышевых центров
при реактивных лимфопролиферативных процессах. Следует учитывать, что только 75% фолликулярных лимфом 3 степени (крупноклеточных) BCL-2-позитивны. Многие диффузные лимфоидные опухоли также экспрессируют протеин BCL-2: лимфобластные лимфомы, анапластические крупноклеточные лимфомы,
агрессивные Т- и В-клеточные лимфомы и волосатоклеточный лейкоз. Часто BCL-2 экспрессируется клетками Березовского-Штернберга-Рид при лимфогранулематозе.
Необходимо знать, что эпитоп протеина BCL-2 не всегда сохраняется в парафиновых срезах. Окрашивание — цитоплазматическое и мембранное.
BCL-6 (PG-B6p, P1F6). Репрессор транскрипции. В лимфоидной ткани антитела выявляют белок BCL-6, в основном в ядрах
центробластов и центроцитов зародышевых центров и в клетках
соответствующих лимфом. С антителом PG-Вбр реагируют 10%
Т-клеток зародышевых центров. Установлено, что при неходжкинских лимфомах ген BCL-6 вовлекается в хромосомные перестройки с участием 3q27. Реарранжировки гена BCL-6 выявлены примерно в 10% случаев фолликулярных лимфом и 30% диффузных
крупноклеточных В-клеточных лимфом. Продукт гена BCL-6 выявляется иммуногистохимически при фолликулярных лимфомах,
диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфомах, лимфоме
Беркитта, Т- и 0-клеточных анапластических крупноклеточных
Глава 9. Иммуногистохимия
175
лимфомах и лимфогранулематозе (тип лимфоидного преобладания). BCL-6 не экспрессируется при В-ХЛЛ, волосатоклеточном
лейкозе, лимфомах зоны мантии и маргинальной зоны. Окрашивание — ядерное.
BSAP (анти-BSAP). Фактор транскрипции. Белок BSAP (В-се11
specific activator protein), или фактор транскрипции, специфичный для В-клеток, кодируется геном РАХ5. Методами ИГХ BSAP
выявляется в клетках Березовского-Штернберга-Рид в 90% случаев классического лимфогранулематоза и отсутствует при анапластических крупноклеточных лимфомах.
Clusterin (7D1). Маркер CD30+ анапластической крупноклеточной лимфомы. Сверхэкспрессия кластерина обнаружена в опухолях различного генеза и при ряде других заболеваний. В реактивных лимфоидных тканях кластерии иммуногистохимически
выявляется только в фолликулярных дендритических и фибробластических ретикулярных клетках. Экспрессия кластерина, составляющая 100%, отличает анапластическую крупноклеточную
лимфому от других лимфоидных опухолей, в том числе от первичной анапластической крупноклеточной лимфомы кожи и лимфогранулематоза. Окрашивание преимущественно цитоплазматическое, но может наблюдаться также мембранное и внеклеточное.
CyclinDi(DCS-6,5D4,HD64,CyDlp,P2DllFll).Il,HioiHHDlпозитивный регулятор клеточного цикла. В норме в лимфоидной
ткани не экспрессируется. Избыточная продукция белка циклина
D1 в опухолевых клетках обнаружена иммуногистохимически в
60-100% случаев лимфомы из клеток зоны мантии и является
характерным диагностическим признаком данного заболевания,
хотя циклин D1 может выявляться и в редких случаях ХЛЛ (<2%),
лимфоплазмоцитарной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза и
плазмоклеточных опухолей. Антитела к циклину D1 дают ядерное
или ядерно-цитоплазматическое окрашивание: отсутствие ядерного окрашивания свидетельствует об отрицательном диагностическом результате ИГХ реакции.
DBA.44. Маркер волосатоклеточного лейкоза. Антиген еще
не охарактеризован. В срезах реактивных лимфоузлов и селезенки
антитело DBA.44 реагирует с мембранами клеток зоны мантии и
некоторых иммунобластов вне лимфоидных фолликулов; иногда
позитивную реакцию дают отдельные клетки зародышевых центров. DBA.44 реагирует с опухолевыми клетками при волосатоклеточном лейкозе в 97% случаев и примерно в 30% случаев В-клеточных лимфом высокой и низкой степени злокачественности. Тем не
менее антитело DBA.44 может использоваться для дифференци-
176
Часть 1. Теоретическая гематология
альной диагностики волосатою сточного лейкоза с другими В-клеточными неоплазиями, принимая во внимание морфологию позитивных клеток.
EMA (E29. МС5, GP1.4). Эпителиальный мембранный антиген
(epithelial membrane antigen). Белки EMA присутствуют в различных типах эпителия, как нормального, так и опухолевого. При лимфоидных опухолях экспрессия ЕМА часто обнаруживается в клетках анапластических крупноклеточных лимфом, что имеет важное
диагностическое значение. Примерно в 50% случаев лимфогранулематоза с иодулярным типом лнмфоидного преобладания, в отличие от классических типов, опухолевые (L&H) клетки реагируют с антителами к ЕМА. В тканевых срезах положительную реакцию с антителами к ЕМА могут давать нормальные и опухолевые
плазматические клетки. Мембранное и цитоплазматическое окрашивание, даваемое антителом Е29. часто ассоциировано с точечным (dot-like) окрашиванием зоны комплекса Гольджи. Антиген в
демаскировании не нуждается.
Granzyme В (GB9. 11F1). Гранзим В — маркер активированных цитотоксических клеток. Гранзим В, наряду с гранзимами А
п 3, является основным компонентом цитотоксических гранул
Т- и NK-клеток. Выявляется в опухолевых клетках при Т-клеточном лейкозе из крупногранулярных лимфоцитов, КК-/Т-клеточт
ных лимфомах верхних дыхательных путей и ]\ К-/Т-клеточных
лимфомах типа лимфом верхних дыхательных путей, кишечных
лимфомах с проявлениями энтеропатии, первично кожных CD30+
Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях, Т-клсточной панникулитоподобной лимфоме подкожной клетчатки, ряде
случаев Т-клеточной анапластической крупноклеточной лимфомы и классического лимфогранулематоза. Характер окрашивания — диффузно-гранулярный пли перинуклеарный точечный
(dot-like). Антиген в демаскировании не нуждается.
IgM (IgMpoly. HP6083). Иммуноглобулин М. Молекулы IgM
экспрессируются в цитоплазме пре-В-клеток и на клеточной поверхности зрелых В-лимфоцитов. Антитела к IgM реагируют с
тяжелыми (и) цепями поверхностных, цитоплазматических или
внеклеточных молекул IgM; совместно с другими антителами используются в дифференциальной диагностике В-клеточных лимфом из клеток с периферическим иммунофенотипом.
Ki-67 (Ki-67poly, Ki-67, MIB-1. Ki-S5, MM1, MB67). Маркер
пролиферативной активности. Антиген Ki-67 является ядерным
белком, не имеющим структурной гомологии ни с одной из других
известных полипептидных последовательностей. Антитела к анти-
Глава 9. Иммуногистохимия
177
гену Ki-67 реагируют с пролиферирующими (Gl, S. М и G2 стадии
клеточного цикла), но не с покоящимися клетками (стадия GO),
что находит применение для оценки фракции роста в опухолях.
Окрашивание — ядерное и ядрышковос.
NPM-ALK, р80 (ALK1, 5А4, ALK01). Маркер CD30+ анапластической крупноклеточной лимфомы. Белок NPM-ALK (Nucleophosmin-Anaplastic Lymphoma Kinase) (80 кД) является продуктом
химерного (гибридного) гена, возникающего в результате хромосомной транслокащш t(2;5)(p23;q35). Хромосомная транслокация
t (2:5) и соответствующая экспрессия химерного NPM/ALK протеина обнаруживается в 30-50% случаев CD30* анапластических
крупноклеточных лимфом и не встречается в нормальных лимфоцитах. Антитела к NPM/ALK протеину дают ядерное и ядерно-цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток анапластических крупноклеточных лимфом. В недавно выделенном редком
подтипе крупноклеточных В-клеточных лимфом, не несущих транслокации t(2;5), антитела ALK1 и 5А4 выявляют экспрессию ALK
протеина нормальной длины (200 кД) исключительно is цитоплазме.
Oct2 (Oct2p). Фактор транскрипции. Специфичен для В-лимфоцитов и нейронов. Индуцирует синтез иммуноглобулинов в
В-клетках путем активации промотора иммуноглобулиновых генов совместно с ко-активатором ВОВ.1. Экспрессирован в нормальных и неопластических зародышевых центрах. Сильная экспрессия Oct2 в L&H клетках отличает вариант лимфогранулематоза с нодулярным типом лимфоидного преобладания от вариантов классического лимфогранулематоза: клетки БерезовскогоШтернберга Рид в 75% случаев Oct2 не экспрессируют, а в 25% —
экспрессируют очень слабо. Окрашивание — ядерное.
TdT (Tdfp, 8-1E4. SEN28, NPT26, DT01). Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (terminal deoxyiiucleotidyl transferase),
классический маркер лимфоидных клеток-предшественников как
Т-, так и В-клеточного типа. В норме присутствует в ядрах Т-клеток тимуса и в небольшом количестве костномозговых лимфоцитов. TdT экспрессируется во всех случаях Т- и В-лимфобластных
лимфом/лейкозов из соответствующих клеток-предшественников,
в большинстве случаев бластного криза хронического миелолейкоза и 20% острых нелнмфобластных лейкозов. Определение TdT
используется для дифференциальной диагностики лпмфобластных лпмфом, бластоидного варианта лимфомы из клеток зоны мантии и лимфомы Беркитта. Антитела к TdT дают ядерное окрашивание.
178
Часть 1. Теоретическая гематология
TIA-1 (TIA-1, 2G9). Маркер цитотоксических лимфоцитов.
TIA-1 (T-Cell Intracellular Antigen-1) является эффекторным белком мембран цитоплазматических гранул покоящихся и активированных цитотоксических клеток. МкАТ TIA-1 реагирует с соответствующим антигеном как цитотоксических Т-лимфоцитов,
так и NK-клеток. Возможна перекрестная реакция с гранулоцитами, но гранулярный характер окрашивания при этом менее отчетлив, чем в цитотоксических лимфоцитах. Слабую диффузную
цитоплазматическую реакцию могут давать эпителиоидные гистиоциты. Антиген TIA-1 экспрессируется опухолевыми клетками
при МК-/Т-клеточных лимфомах верхних дыхательных путей и
КК-/Т-клеточных лимфомах типа лимфомы верхних дыхательных
путей, NK-клеточном лейкозе, гепатолиенальной Т-клеточной лимфоме, Т-клеточной панникулитоподобной лимфоме подкожной
клетчатки; часто выявляется при первично кожных CD301 лимфопролиферативных заболеваниях, Т-клеточных анапластических
крупноклеточных лимфомах, кишечной Т-клеточной лимфоме с
проявлениями энтеропатии, в ряде случаев классического лимфогранулематоза. Среди нелимфоидных опухолей фокально позитивную реакцию с TIA-1 могут давать клетки гранулоцитарной
саркомы.
VS38c. Маркер плазматических клеток. Антитело VS38c распознает внутриклеточный белок, ассоциированный с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Реакция с антителом VS38c
вызывает сильное окрашивание плазматических клеток, что используется в комплексе с другими антителами для диагностики
миеломы/плазмоцитомы и иммуноцитомы в тканевых срезах. Следует учитывать, что VS38c реагирует также с меланоцитами и целым рядом эпителиальных клеток.
Vimentin (V9, Vim3B4, 1905.5). Виментин - белок промежуточных филаментов. Антитела к виментину в норме реагируют с
клетками мезенхимального происхождения и не реагируют с гемопоэтическими клетками. Экспрессия виментина выявлена в клетках Березовского-Штернберга-Рид при классическом лимфогранулематозе, что помогает при дифференциальном диагнозе между
морфологически сходными случаями классического лимфогранулематоза (подтип «с большим количеством лимфоцитов») и
лимфогранулематоза с нодулярным типом лимфоидного преобладания, а также В-клеточной лимфомы с большим количеством
Т-клеток. Сохранность эпитопа виментина зависит от качества гистологической обработки материала. Окрашивание — цитоплазматическое.
Глава 9. Иммуногистохимия
179
Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика
неходжкинских лимфом
Классификация ВОЗ объединяет опухоли кроветворной и лимфоидной ткани. В раздел опухолей лимфоидной ткани включены
неходжкинские лимфомы и лимфогранулематоз. Классификация
неходжкинских лимфом — перечень клинико-морфологических
рубрик (форм), не имеющих иерархической соподчиненности. Рубрики (формы) описываются следующими классификационными
признаками (табл. 4.):
1) морфология (гистология и цитология);
2) иммунофенотип;
3) генетические признаки;
4) первичная локализация;
5) характер диссеминации;
6) другие клинические признаки.
Таблица 4
Перечень рубрик (форм) опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ (по кн.: Е. S. Jaffe, N. L. Ham's et al., 2001)
Формы опухолей лимфоидной i кани
в классификации ВОЗ
B-cell neoplasms (В-клеточные опухоли)
Precursor B-cell neoplasms
Опухоли из предшественников В-лимфоцитов
2
Precursor В lymphoblastic leukemia'/lymphoblastic lymphoma
(precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia)
В-лимфобластный лейкоз'/лимфома2 из предшественников
В-клеток (острый лимфобластный лейкоз из предшественников В-клеток)
Mature B-cell neoplasms
В-клеточные опухоли с фенотипом зрелых лимфоцитов
:
Chronic lymphocytic leukemia'/small lymphocytic lymphoma
Хронический лимфоцитарный лейкоз'/лимфоцитарная
лимфомаB-cell prolymphocytic leukemia
В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз
Lymphoplasmocytic lymphoma
Лимфоплазмоцитарная лимфома
Splenic marginal zone lymphoma
Селезеночная лимфома маргинальной зоны
Hairy cell lymphoma
Волосаюклеточный лейкоз
Колы
заболеваний
(ICD-O код)
9835/3'
9728/3"
9823/3'
9670/39833/3
9671/3
9689/3
9940/3
Часть 1. Теоретическая гематология
180
Продолжение таблицы 4
Формы опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ
Коды
заболеваний
(ICD-O код)
Plasma cell myeloma
Плазмоклеточная миелома
9732/3
Monoclonal gammapathy of undetermined significance
(MGUS)
Моноклональная гаммапатия неопределенного значения
9765/1
Solitary plasmacytoma
Солитарнаяплазмоцитома
9731/3
Extraosseous plasmacytoma
Внекостная плазмоцитома
9734/3
Primary amyloidosis
Первичный амилоидоз
Heavy chain diseases
Болезни тяжелых цепей
9769/1 с
9762/3
Extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosaassociated lymphoid tissue (MALT-lymphoma)
Экстранодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми
оболочками (MALT-лимфома)
Nodal marginal zone B-cell lymphoma
Нодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны
Follicular lymphoma
Фолликулярная лимфома
9699/3
9699/3
9690/3
Mantle cell lymphoma
Лимфома из клеток зоны мантии
9673/3
Diffuse large B-cell lymphoma
Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома
9680/3
Mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma
Медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома
9679/3
Intravascular large B-cell lymphoma
Внутрисосудистая крупноклеточная В-клеточная лимфома
9680/3
Primary effusion lymphoma
Первичная лимфома серозных полостей
9678/3
:
Burkitt lymphomaUeukemia
Лимфома Беркитта1/Лейкоз Беркитта 2
9687/3'
9826/32
B-cell proliferations of uncertain malignant potential
В-клеточные лимфопролиферативные процессы с неопределенным опухолевым потенциалом
Lymphomatoid granulomatosis
Лимфоматоидный гранулематоз
9766/1
Post-transplant lymphoproliferative disorder, polymorphic
Посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание, полиморфно-клеточное
9970/1
Глава 9. Иммуногистохимия
181
Продолжение таблицы 4
Формы опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ
Коды
заболеваний
(ICD-O код)
T-cell neoplasms (Т-клеточные опухоли)
Precursor T-cell neoplasms
Опухоли из предшественников Т-лимфоцитов
Precursor T-lymphoblastic leukemia'/lymphoblastic lymphoma 2 (precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia)
Т-лимфобластный лейкоз'/лимфома 2 из предшественников
Т-клеток (острый лимфобластный лейкоз из
предшественников Т-клеток)
9837/3'
9729/32
Mature T-cell and NK-cell neoplasms
T- и NK-клеточные опухоли с фенотипом зрелых лимфоцитов
Leukemic/disseminatcd
Лейкозы/первично диссеминировашые лимфомы
T-cell prolymphocytic leukemia
Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз
9834/3
T-cell large granular lymphocytic leukemia
Т-клеточный лейкоз из крупных гранулярных лимфоцитов
9831/3
Aggressive NK-cell leukemia
Агрессивный NK-кле точный лейкоз
9948/3
Adult T-cell leukemia/lymphoma
Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых
9827/3
Cutaneous
Кожные лимфомы
Mycosis fungoides
Грибовидный микоз
9700/3
Sezary syndrome
Синдром Сезари
9701/3
Primary cutaneous anaplastic large cell lymphoma
Первичная кожная крупноклеточная анапластическая
лимфома
9718/3
Lymphomatoid papulosis
Лимфоматоидный папулез
9718/1
Other extranodal
Другие экстранодальные лимфомы
Extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type
Экстранодальная NK/T-клеточная лимфома, назальный
тип
9719/3
Enteropathy-type T-cell lymphoma
Т-клеточная лимфома типа энтеропатии
9717/3
Hepatosplenic T-cell lymphoma
Гепатолиенальная Т-клеточная лимфома
9716/3
Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma
Подкожная панникулитоподобная Т-клеточная лимфома
9708/3
Часть 1. Теоретическая гематология
182
Окончание таблицы 4
Формы опухолей лимфоидной ткани
в классификации ВОЗ
Коды
заболеваний
(ICD-Окод)
Nodal
Лимфомы лимфатических узлов
Angioimmunoblastic T-cell lymphoma
Ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома
9705/3
Peripheral T-cell lymphoma. unspecified
Лимфома in клеток с иммунофенотипом периферических
Т-лимфоцитов, неуточненная
9702/3
Anaplastic large cell lymphoma
Анапластическая крупноклеточная лимфома
9714/3
Xeoplasm of uncertain lineage and stage of differentiation
Опухоль неопределенной дифференцировки
Blastic NK-cell lymphoma
Властная NK-клеточная лимфома
9727/3
Hodgkin lymphoma (Лимфома Ходжкина)
Nodular lymphocyte predominant Hodgkin lymphoma
Лимфогранулематоз, нодулярный гип лимфоидного преобладания
9659/3
Nodular sclerosis classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. нодулярный склероз
9663/3
Mixed cellularity classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. смешанно-клеточный
вариант
9652/3
Lymphocyte-rich classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. с большим количеством лимфоцитов
9651/3
Lymphocyte-depleted classical Hodgkin lymphoma
Классическая лимфома Ходжкина. с истощением лимфоидной ткани
9653/3
Краткое описание клинико-морфологических рубрик (фЪрм)
неходжкинских лимфом включает морфологические и иммуногистохимические признаки этих опухолей.
Лимфобластные лимфомы/лейкозы из клеток
с иммунофенотипом В-клеток-предшественников
Лимфобластные лимфомы/лейкозы из предшественников
В-клеток характеризуются монотонной пролиферацией мелких
или среднего размера округлых клеток, которые в пораженных
лимфатических узлах замещают лимфоидную ткань. Довольно часто поражается средостение. Ядра бластов овальной, округлой пра-
Глава 9. Иммуногистохимия
183
внльной формы; встречаются варианты лимфобластных лимфом с
ядрами, имеющими «конволютную» форму. Более точно строение
ядер лимфобластных лимфом из клеток с «копволютными» ядрами описывают определения «извитой», <<с мозговидной извилистой поверхностью», «измятый», «зазубренный» и «изборожденный». Все это многообразие определений описывает особый характер строения ядерной мембраны и распределения гетерохроматина
в ядрах лимфобластов. Феномен легче наблюдать в заметно более
толстых, чем это требуется для диагностики, гистологических срезах. Поверхность ядра при небольших движениях микровинтом
микроскопа выглядит измятой, с вдавлениями и складками. Гетерохроматин пылевидный, однородный, равномерно распределен
по всем}' объему ядра. Ядра содержат 1-3 небольших ядрышка.
При окраске азур Н-эозином узкий ободок цитоплазмы окрашивается в бледно-голубой или серый цвет. Много фигур митозов. В некоторых случаях среди лимфобластов располагаются фагоцитирующие макрофаги («звездное небо»),
Иммунофенотип. В препаратах из ткани, фиксированной в формальдегиде, обезвоженной и залитой в парафин (далее — парафиновые срезы), В-клеточные лимфобластные лимфомы экспрессируют пан-В-клеточные антигены CD79a и в 50% случаев — CD20,
кроме этого, интенсивные положительные реакции дают антитела
к CD10, CD34 и TdT. Могут экспрессироваться гранулоцитарные
антигены CD13 и CD33, что не исключает диагноза опухоли из
предшественников В-клеток. Опухолевые клетки ранних стадий
дифференцировки (В-ОЛЛ из ранних предшественников) экспрессирует CD19, в цитоплазме — CD79a и CD22, а в ядре — TdT.
На промежуточной стадии дифференцировки (общий ОЛЛ —
CALLA) бласты экспрессируют CD10. Поздние стадии дифференцировки (пре-В-ОЛЛ) характеризуются появлением цитоплазматической экспрессии ц-цепей. Поверхностные иммуноглобулины,
как правило, не экспрессируются. CD5 и циклин D1 не экспрессируются (Borowitz M. J., Croker В. P. et aL 1983; Navid E, MosijczukA. D. era!.. 1999).'
Лимфомы из теток с штунофенотипом периферических
В-лимфоцитов
Лимфоцитарная лимфома/хронический лимфолейкоз. Основным компонентом лимфоцитарной лимфомы является опухолевый аналог лимфоцита. Эти клетки имеют округлое ядро, содержащее плотные глыбки гетерохроматина, которое окружено узким,
часто неразличимым ободком бледно окрашенной цитоплазмы.
184
Часть 1. Теоретическая гематология
Клетки большего размера, с более нежным хроматином в ядрах и
более широк: гм ободком цитоплазмы, которые цитологически можно определить как пролимфоциты, обнаруживаются в меньшем
количестве. Иногда опухолевые клетки могут дифференцироваться до стадии плазматических клеток, но это еще не является основанием для д] [агноза лимфоплазмоцитарной лимфомы. Всегда среди клеток лимфоцитарной лимфомы встречаются активированные лимфоидные клетки («бластные» формы). Это довольно
крупные клетки с округлым ядром и заметным ядрышком, лежащим в его центре. Гетерохроматина в ядре мало, он имеет нежное
строение, ядра клеток выглядят светлыми. При окраске срезов азур
П-эозином цитоплазма «бластов» не имеет выраженной базофилии, как у иммунобластов, описанные клетки получили название
«параиммунобластов» (Ben Ezra J., Burke J. S. et al., 1989).
От больного к больному и при выполнении нескольких биопсий у одного н того же больного соотношение количества малых
лимфоцитов, пролимфоцитов и параиммунобластов может отличаться. Про.'шмфоциты и параиммунобласты могут располагаться
достаточно компактно, и при исследовании препаратов при малом
увеличении эти нечетко очерченные скопления выглядят как более светлые пятна, создавая псевдофолликулярный тип строения
опухолевой ткани. Частота обнаружения маркеров пролиферативHoi'i активности (Ki-67) в клетках псевдофолликулов выше (центры пролиферации). Диффузный тин строения имеют лимфоцитарные лимфомы с примесью небольшого количества пролимфоцитов н параиммунобластов, которые не образуют заметных
скоплений. Обширные ноля пролимфоцитов и параиммунобластов при опухолевидном типе строения довольно четко отграничены от участков лимфоцитарной лимфомы, содержащих почти одни
малые лимфоциты (Bonato M., Pittaluga S. et al., 1998).
В клинической практике не следует пытаться разграничить лимфоцитарную лимфому и хронический лимфоцитарный лейкоз на
основании гистологического, иммуногистохимпческого и молекулярно-генетического анализа биопсированного лимфатического
узла, учитывая единую биологическую природу этого вида опухолей. Для диагноза лимфоцитарной лимфомы при клиническом обследовании должно быть доказано отсутствие поражения костного
мозга и периферической крови у пациента.
Иммунофенотип. Лимфоцитарные лимфомы (хронические лимфолейкозы) с В-клеточным иммунофенотипом слабо экспрессируют на опухолевых клетках поверхностные IgM или IgM и IgD,
сильно экспрессированы пан-В-клеточные антигены CD20 и
Глава 9. Иммуногистохимия
185
CD79a. В отличие от нормальных малых В-лимфоцитов обнаруживается экспрессия CD5 и CD43. Для получения результата с
CD5 в парафиновых срезах необходимо применение систем амплификации сигнала Экспрессия антигена CD23. характерная для
В-клеточных лимфоцитарных лимфом, может оказаться полезной
для дифференциальной диагностики этих опухолей и лимфом из
клеток зоны мантии, клетки которой не экспрессируют CD23. Примесь реактивных Т-клеток может быть весьма значительной, обычно больше их в центрах пролиферации. Интенсивность экспрессии
CD5 реактивными Т-клетками выше, чем опухолевыми В-лимфоцитами (Matutes E., Owusu-Ankomah К. et al, 1994).
В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз. Опухолевые клетки имеют средние размеры (вдвое больше лимфоцита), округлое
ядро п явно различимые ядрышки. Диагноз устанавливается, когда доля опухолевых пролимфоцитов в периферической крови превышает 55%. Случаи с меньшей долей пролимфоцитов относят к
хроническому лимфолейкозу с увеличенным количеством пролимфоцитов. Заболевание характеризуется выраженной спленомегалией без периферической лимфаденопатии и быстро растущим
лимфоцитозом, часто более 100 х 10 9 / л (Melo J. V., Catovsky D.,
GaltonD. A., 1986).
Опухолевые пролимфоциты имеют округлую форму ядра,
иногда встречаются формы с зазубренным ядром. Хроматин умеренно конденсирован, ядрышки отчетливо различимы и располагаются центрально. Неширокий ободок слабобазофильной цитоплазмы окружает ядро. Опухолевая ткань в лимфатических
узлах растет диффузно, не образуя псевдофолликулярного рисунка строения.
Иммунофеногпип. Выявляется сильная экспрессия поверхностных иммуноглобулинов М или М и D, В-клеточных антигенов
CD19, CD20, CD22, CD79cx. CD5 обнаруживается только в трети
случаев, CD23 обычно отсутствует. Поражение лимфатических узлов опухолью из пролимфоцитов, имеющих зазубренное ядро и
В-клеточный иммунофенотип с CD5"CD23 , может создать большие трудности в дифференциальной диагностике с лимфомой из
клеток зоны мантии. В таких случаях необходимо исследовать экспрессию циклина D1, который должен обнаруживаться в ядрах
большинства клеток лпмфомы из клеток зоны мантии (Matutes E.,
Owusu-Ankomah К. et al., 1994).
Лимфоплазмоцитарная лимфома. Опухолевые клетки в лимфоплазмоцитарной лимфоме — малые В-лимфоциты, плазмоцитоидные лимфоциты и плазматические клетки. Иммуноглобулины
186
Часть 1 Теоретическая гематология
(IgM) определяются в клетках с плазмоцитарной дифференцировкой в цитоплазме или в качестве внутриядерных включений —
телец Дютчера (Dutcher). Иммуноглобулины могут выявляться и
в сыворотке крови в качестве парапротеина, когда заболевание
клинически проявляется как макроглобулннемии Валденстрема.
В большинстве случаев моноклональная протеинемия обусловливает криоглобулинемию и вязкость крови (Dimopoulos M.,
Panayiotidis P. el al., 2000).
Опухоль в лимфатических узлах растет диффузно, без образования псевдофолликулярного рисунка строения. В составе опухолевого пролпферата в разнообразных долевых соотношениях обнаруживаются малые В-лимфоциты, плазмоцитоидные лимфоциты (клетки с ядром, характерным для лимфоцита, и широкой
базофильной цитоплазмой) и плазматические клетки. Нередко обнаруживаются внутриядерные ШИК-позитивные включения —
тельца Дютчера. Это не вакуоли, а глубокие инвагинации ядерной
мембраны, в бухтах которой оказывается цитоплазма.
Иммунофенотип. Большинство клеток позитивно реагируют с
антителами к CD79a, CD20, CD 19 и CD22 и не дают реакций на
CD5, CD 10 и CD23. Экспрессия CD43 вариабельна. В клетках
обнаруживаются поверхностные иммуноглобулины, в некоторых —
цитоплазматические. Обычно это иммуноглобулины класса М, реже
G или А. Характерно отсутствие экспресии IgD.
Другие лимфомы В-к.теточного происхождения (лимфоцитариая, маргинальной зоны и фолликулярная лимфомы) также могут
иметь плазмоцитарную дифференцировку. Поэтому диагноз лимфоплазмоцитарной лимфомы устанавливается методом исключения.
Волосатоклеточный лейкоз характеризуется наличием в мазках периферической крови и костного мозга клеток с ворсинчатой
поверхностью и бобовидным ядром. Поражение костного мозга и
селезенки приводит к нанцитопении и выраженной спленомегалии. Инфильтрация лимфатических узлов происходит редко
(Bouroncle В. Л., 1994).
Иммунофенотип. Клетки экспрессируют (в дополнение к типичным антигенам В-клеток) CD lie, рецептор интерлепкина-2
(CD25) и интегрин CD103 (молекулы клеточной адгезии). CD5,
CD10 и CD23 не экспрессированы (Frassoldati A., Lamparelli Т.
et al.. 1994).
Плазмоцитома/плазмоклеточнаямиелома. Плазматические
клетки характерны для миеломы, или плазмоцитомы. Термин плазмоклеточная миелома употребляется, когда опухоли находятся в
Глава 9. Иммуногистохимия
187
костном мозгу и вызывают разрушение скелета. Термин плазмоцитома относится к более редко встречающимся опухолям, которые
возникают экстрамедуллярно, или к солитарному поражению кости (Bartl R., Frisch В. et al, 1982).
Иммунофенотип. Поверхностные антигены В-клеток практически отсутствуют, так же как и у нормальных зрелых плазматических клеток, но обнаруживается цитоплазматический моноклональнын иммуноглобулин (или только легкие пени иммуноглобулинов). В большинстве случаев не экспреесированы общелейкоцитарный антиген, В-клеточныс антигены CD19 и CD20, а экспрессироваи CD79a (LingN. R., McLennan I. С, Mason D. Y, 1987).
Характерна экспрессия CD38, CD138, антигена эпителиальных
мембран. В некоторых случаях обнаруживается аномальная коэкспрессия миеломоноцитарных антигенов.
Лимфома из клеток зоны мантии — это современное определение лимфом, которые ранее назывались центроцитарными.
Опухолевые клетки обнаруживают многие характеристики лимфоцитов из зоны мантии. Обычно они бывают малого или среднего размера с неправильным или «расщепленным» ядром, иногда
могут иметь «бластный» вид. Опухолевых трансформированых
лимфоидных клеток (центробластов, иммунобластов и параиммунобластов) и псевдофолликулов (пролиферативных центров)
в опухоли нет. Характер роста нередко подулярный, возможен
диффузный и мантийный рост. Хроматин опухолевых клеток негрубо зернистый или мелкоглыбчатый, равномерно распределен
по объему ядра. Ядрышки неразличимы (Ott G., Kalla J. et al.,
1998).
Иммунофенотип. Выявляется умеренная экспрессия поверхностных иммуноглобулинов М или М и D, В-клеточных антигенов
CD19, CD20, CD22,'CD79oc. CD43 и CD5 обычно экспрессированы, но лимфома из клеток зоны мантии отличается от других
СВ5-иоложительных В-клеточных новообразований (лимфоцитарные лимфомы/лейкозы) отсутствием CD23 или только слабой
экспрессией в некоторых случаях. Не экспрессируется CD10 и
Bcl-6-протеин. Антитела к фолликулярным дендритическим клеткам (CD21, CD23 или CD35) дают возможность увидеть выраженную гиперплазию этих клеток в виде сети с тенденцией к образованию скоплений фолликулярных дендритических клеток в местах
нодулярного строения.
Часто встречающаяся транслокация между хромосомой 11 и
участком хромосомы 14, кодирующим тяжелые цепи иммуноглобулинов, ассоциирована с усиленной экспрессией гена, кодирующего
188
Часть 1. Теоретическая гематология
циклин D1. Антитела к циклину D1 выявляют ядерную экспрессию в большинстве случаев лимфом из клеток зоны мантии. Для
исследования необходима система усиления сигнала (с биотинилированным тирамидом или другие), при этом только сильная экспрессия в большинстве ядер должна иметь диагностическое значение. Цитоплазматическое окрашивание с антителами к циклину
D1 не имеет значения в диагностике лимфом из клеток зоны мантии (De Boer С. J., Schuuring E. et al.,1995).
Выделение бластоидного варианта лимфомы из клеток зоны
мантии имеет клиническое значение. Этот вариант опухоли характеризуется более крупным размером клеток, напоминающих лимфобласты с зазубренным ядром, мелкодисперсным хроматином в
нем и высокой митотической активностью. Опухолевые клетки в
бластоидном варианте лимфомы из клеток зоны мантии экспрессируют В-ассоциированные антигены CD20 и CD79a, а также CD43
и CD5. Ядерная экспрессия циклина D1 делает диагноз несомненным, но обнаруживается не во всех случаях. В отличие от лимфобластных лимфом не экспрессируются TdT, CD 10 и CD34.
Фолликулярные лимфомы представляют собой группу лимфоидных опухолей, происходящих из светлых центров размножения фолликулов и включающих все их элементы: центробласты,
центроциты, фолликулярные дендритические клетки и макрофаги. Опухоль обычно имеет фолликулярное или фолликулярное и
диффузное строение, реже — только диффузное. Между опухолевыми фолликулами встречаются зоны, состоящие из Т-лимфоцитов. Слои Т-клеток заметно менее массивны, чем при фолликулярной гиперплазии лимфатических узлов.
Гистологическое исследование выявляет практически полное
замещение лимфатического узла тканью опухоли, нередко простирающейся за пределы капсулы в перинодальную клетчатку. Синусы лимфатического узла в некоторых случаях сохраняются и даже
могут быть расширены. Учитывая характер роста фолликулярных
лимфом, выделяют опухоли с фолликулярным характером роста,
фолликулярным и диффузным и, наконец, диффузным.
Весьма полезен простой прием микроскопии, позволяющий
обнаружить фолликулярный тип роста лимфомы. Для этого необходимо исследовать препарат, окрашенный гематоксилин-эозином или азур П-эозином, с помощью объектива с 3,2-кратным
увеличением или меньшим при сильно ослабленном освещении.
Особенно удобен для этой цели осветитель с реостатом для изменения накала лампочки. Фолликулярный рисунок строения лимфомы, незаметный при ярком освещении с объективами с 8-
Глава 9. Иммуногистохимия
189
10-кратным увеличением, становится отчетливо различимым под
лупой в слабо освещенном препарате.
Клеточный состав опухолевых фолликулов определен происхождением фолликулярных лимфом. Большинство клеток составляют центроциты — клетки, в 1,5-2 раза превышающие по размерам малый лимфоцит, с неправильной формы угловатым ядром,
имеющим скорее многоугольную или клиновидную форму. Другое
свое название — пролимфоцит с расщепленным ядром — центроциты в гистологических срезах оправдывают не всегда. Расщелина, довольно отчетливая в цитологических препаратах, в срезах
только иногда видна как бороздка или черта на ядре. Ядро содержит грубо глыбчатый гетерохроматин и не всегда различимое ядрышко. Ободок цитоплазмы практически не виден. Центробласты
крупнее центроцитов, имеют округлую форму и отчетливый ободок базофилыгой цитоплазмы. Ядра содержат небольшое количество гетерохроматина в виде мелких зерен и глыбок, располагающихся преимущественно на периферии ядра, возле ядерной мембраны располагаются обычно 2-4 ядрышка. Атипия строения
опухолевых центробластов может проявляться в виде глубоких
вдавлений ядерной мембраны, иногда в двуядерности клетки или в
многодольчатом строении ядра.
Центроциты и центробласты образуют довольно однородную
смесь. Зоны с диффузным характером роста в фолликулярных
лимфомах также образованы однородной смесью центроцитов, центробластов и малых лимфоцитов. Поскольку признано, что фолликулярные лимфомы с фолликулярным и диффузным и только с
диффузным характером роста имеют худший прогноз, и в гистологическом заключении необходимо отражать обнаружение зон диффузного роста (Nathwani В. N., Metter G. E. et al., 1986).
Для уточнения прогноза имеет значение цитологический состав опухоли. В зависимости от доли центробластов выделяют типы
(степени) фолликулярных лимфом: 1) содержащие менее 50 центробластов на площади среза, равной 1,6 мм2 (10 полей зрения большого увеличения площадью 0,159 мм2); 2) содержащие 50-150 центроцитов на площади среза 1,6 мм-; 3) фолликулярные лимфомы с
2
более чем 150 центробластами на площади среза, равной 1,6 мм .
Необходимо провести подсчет в 10 полях зрения в различных случайно выбранных в срезе фолликулах. Если в фолликулярной лимфоме преимущественно 1-й или 2-й степени строения обнаруживают зону, имеющую 3-ю степень строения, то это обстоятельство
должно быть отражено в заключении с указанием примерного соотношения объемных долей отличающихся компонентов.
190
Часть 1. Теоретическая гематология
Третий тип фолликулярных лимфом подразделяется на опухоли За степени, в которых при наличии более 150 центробластов на
площади среза 1,6 мм2 центроциты все же присутствуют; и на опухоли ЗЪ степени, образованные солидными полями фолликулярного строения, состоящими только из центробластов.
При наличии зон диффузного строения в фолликулярной лимфоме обозначают тип роста: преимущественно фолликулярный,
если доля фолликулярного компонента превышает 75%, фолликулярный и диффузный, если фолликулярный компонент занимает
25-75% объема, и очагово-фолликулярный, если фолликулярный
компонент составляет менее 25% объема опухоли.
Для фолликулярных лимфом диффузного строения на площади среза 1,6 мм2 выделяют два типа (степени): 1-й —от 0 до 50 центробластов и 2-й — от 51 до 150.
Появление в ткани фолликулярной лимфомы участка, имеющего строение диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфомы, означает агрессивную трансформацию и должно быть отражено в заключении с указанием доли каждого компонента.
В участках с диффузным характером роста в фолликулярных
лимфомах чаще обнаруживаются поля склероза, в целом довольно
характерного для лимфом фолликулярного происхождения. Особенно часто склеротические изменения встречаются в висцеральных лимфатических узлах, пораженных фолликулярной лимфомой. Среди пеходжкинских злокачественных лимфом тотальный
некроз пораженных лимфатических узлов встречается практически только в фолликулярных лимфомах.
Иммунофенотип. Фолликулярные лимфомы являются опухолевым эквивалентом нормальных центров размножения. Если фолликулярный рисунок строения неходжкинской лимфомы очевиден, иммуногистохимическое исследование для определения В- или
Т-клеточной природы процесса особой диагностической ценности
не имеет. Клетки опухолевых фолликулов экспрессируют В-ассоциированные антигены CD 19, CD20, CD22 и CD79a. Фолликулярные дендритические клетки обнаруживаются с помощью CD21
или CD23. В отличие от лимфом из клеток зоны мантии фолликулярные лимфомы (в том числе и с диффузным характером роста)
CD 10 очень часто позитивны, CD5 и CD43 — негативны.
В большинстве случаев фолликулярных лимфом выявляется
транслокация между 14-й и 18-й хромосомами. Перемещение онкогена bcl-2 к гену, кодирующему тяжелую цепь Ig, сопровождается экспрессией протеина Вс1-2. В этом состоит отличие опухолевых клеток фолликулярных лимфом от нормальных В-лимфоци-
Глава 9. Иммуногистохимия
191
тов зародышевых центров, в которых отсутствует экспрессия протеина Вс1-2. Фолликулярные лимфомы, в которых транслокация
t(14;18) отсутствует, обычно также экспрессируют протеин Вс1-2.
Указанный факт позволяет использовать антитела к протеину Вс1-2
для дифференциальной диагностики фолликулярных лимфом и
фолликулярных реактивных гиперплазии лимфатических узлов.
Экспрессия опухолевыми клетками протеина Вс1-2 обнаруживается почти в 100% случаев фолликулярных лимфом 1-й степени, в
лимфомах 3-й степени частота экспрессии уменьшается до 75%
(Lai R., Arber D. A. et al.,1998).
При общепризнанной В-клеточной природе фолликулярных
лимфом применение с терапевтической целью антител к CD20
(ритуксимаб) у больного невозможно без положительного результата иммуногистохимического исследования, который доказывает
экспрессию CD20 клетками лимфомы у этого пациента.
В-клеточные лимфомы маргинальной зоны. Экстраиодальная, нодальная лимфомы маргинальной зоны MALT-типа и селезеночная лимфома маргинальной зоны имеют морфологически
сходный опухолевый субстрат - моноцитоидные В-клетки. Моноцитоидные В-лимфоциты характеризуются определенными цитологическими признаками. Они имеют овальное или бобовидное
ядро с небольшими зазубринами и широкий ободок оптически пустой цитоплазмы. Гетерохроматин ядра довольно гомогенный, ядрышки неотчетливы (Nathwani В. N., Anderson J. R. et al, 1999;
Isaacson P. G., Matures E. et al., 1994).
При поражении лимфатических узлов опухолевые аналоги моноцитоидных В-клеток могут располагаться вокруг лимфоидных
фолликулов, замещая мантийную зону, могут заполнять синусы
или распространяться диффузно. В некоторых случаях встречаются любые сочетания этих трех типов роста. Скопления моноцитоидных В-клеток имеют характерный вид из-за довольно широких
светлых промежутков, заполненных неокрашивающейся цитоплазмой, между ядрами бобовидной или неправильной формы. Часто
встречается другой тип моноцитоидной В-клеточной лимфомы из
клеток с округлыми ядрами. Ядра имеют правильную форму, но
неодинаковые размеры, и в одних случаях в опухоли преобладают
клетки с мелкими ядрами, в других — с более крупными. Довольно
много фигур митозов.
Поражение лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, сопровождается инфильтрацией эпителиальных
структур опухолевыми моноцитоидными В-клетками. Этот важный диагностический признак получил название лимфоэпители-
192
Часть 1 Теоретическая гематология
альных повреждений. Применение антител к цитокератинам контрастно выявляет эпителиальные структуры и упрощает обнаружен ие повреждений.
Резидуальная лимфоидная ткань представлена светлыми центрами размножения фолликулов, которые имеют обычный состав
из центроцитов, центробластов и макрофагов. В межфоллнкулярной ткани среди моноцитоидных В-к.теток часто обнаруживают
несколько более крупные лимфоциты и плазматические клетки.
Количество плазматических клеток мо'жет быть весьма значительным, и тогда возникают трудности в дифференциальной диагностике с лимфоплазмоцитарной лимфомой.
Иммунофенотип. Опухолевые моноцитеидные В-лимфоциты
экспрессируют В-ассоциированные антигены (CD20, CD79a) и
обычно не дают реакции с антителами к CD5, CD43 и CD23 (дифференциальная диагностика с лимфоцитарными лимфомами и
лимфомами из клеток зоны мантии), CD 10 (дифференциальный
диагноз с фолликулярными лимфомами) и циклином D1 (дифференциальный диагноз с лнмфомами из клеток зоны мантии) (Isaacson P. G., Norton A. J., 1994).
Диффузные крупноклеточные В-клеточные лимфомы. Морфологические проявления диффузных крупноклеточпых В-клеточных лимфом очень многообразны. Гистологическая картина
может сильно отличаться от случая к случаю, в пределах конгломерата пораженных лимфатических узлов у одного и того же пациента и далее в пределах одного лимфатического узла.
В опухолевой ткани могут преобладать центрооласты пли иммунобласты. Иногда ядра опухолевых клеток отличает многодольчатость или значительная атшшя строения, встречаются центроцитоидные центробласты.
Центрооласты могут быть довольно крупными (в 2-3 раза больше малого лимфоцита) и имеют округлую форму. Заметный ободок цитоплазмы с выраженной базофилией окружает светлое «пузырьковидное» ядро. Ядра выглядят светлыми из-за малого количества мелкодисперсного гетерохроматина, большая часть которого
в клетках, при обработке биоптата фиксирующими жидкостями,
оказывается возле ядерной мембраны. Отчетливо различимы небольшие ядрышки, количество которых колеблется от 2 до 4, и
располагаются они также на периферии ядра. Среди центробластов встречаются в небольшом количестве центроциты, центроцитоидные центробласты, иммунобласты и макрофаги с фрагментами фагоцитированного ядерного вещества. Много фигур митозов,^
в том числе патологических.
Глава 9. Иммуногистохимия
193
Клетки с многодольчатыми ядрами обычно имеют несколько
меньшие размеры, чем иммунобласты, хотя могут быть очень крупными. Ядро в них разделено на 2-4 доли, гетерохроматин имеет
нежное строение, ядрышки трудноразличимы. Цитоплазма базофильная или светлая. Обнаружение в лимфоме многодольчатых
клеток является косвенным указанием на ее происхождение из
лимфоидных клеток светлых центров размножения и, следовательно, на В-клеточную природу опухоли.
Форма ядер центроцитоидных центробластов вытянутая, овальная, полигональная, как у центроцитов, но размеры заметно больше и гетерохроматин в ядрах имеет «бластный» вид. Строение
гетерохроматина в ядрах центроцитоидных центробластов может
отличаться от его нежно глыбчатого строения в типичных центробластах: тонкая гомогенная пылевидная структура гетерохроматина по всему ядру без конденсации возле ядерной мембраны
придает ядрам центроцитоидных центробластов довольно светлый
однородный вид. Встречаются центроцитоидные центробласты
с грубым глыбчатым хроматином, который делает их более похожими на центроциты. В ядрах разных клеток обнаруживается 25 мелких базофильных ядрышек.
Иммунобласты — клетки с большим светлым пузырьковидным
ядром, одним центрально расположенным большим базофильным
ядрышком и ободком базофильной цитоплазмы вокруг ядра. Выраженная базофилия цитоплазмы обусловлена хорошо развитым
шероховатым эндоплазматическим ретикулумом с большим количеством рибосомальной РНК в цитоплазме. Иногда цитоплазма
содержит ШИК-положительные включения моноклоналыгого иммуноглобулина.
Опухоль может выглядеть однообразной, состоящей из почти
одинаковых клеток, но может иметь очень полиморфное строение
из-за большой вариабельности размеров иммунобластов. Митотическая активность высокая, встречаются многочисленные фигуры
патологических митозов. Большой объем опухоли может спонтанно некротизироваться, но иногда встречаются многочисленные
фигуры индивидуальной клеточной гибели (апоптоз). В случаях с
апоптозом в ткани диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом обнаруживают макрофаги, которые активно фагоцитируют
фрагменты погибших клеток (Engelhard M., Brittinger G. et al,
1997).
Иммунофенотип. Несмотря на весьма разнообразные гистологические проявления диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом. все опухолевые клетки экспрессируют общелейкоцитарный
7 Гематология. Нов. справочник
194
Часть 1. Теоретическая гематология
антиген и В-клеточные антигены (CD20, CD79a и др.). В отдельных случаях удается обнаружить экспрессию CD5 (10%) и CD43,
чаще — CD 10 (25-50%). В тех случаях, когда клетки В-клеточной
лнмфомы экспрессируют CD30 и ЕМА, но антитела ALK1 не обнаруживают в клетках ALK-протеин, опухоль относят к диффузным
крупноклеточным В-клеточным лимфомам, а не к анапластическим крупноклеточным СВЗО^лимфомам (Delsol G., Lamant L. et
al., 1997). Пролиферативная активность (Ki67) высокая, иногда
более 90%, но 100% не достигает (Miller Т. P., Grogan Т. М. et al.,
1994).
Классификация ВОЗ выделяет некоторые подтипы диффузных
крушюклеточных В-клеточных лимфом.
Первичные крупноклеточные В-клеточные лимфомы средостения составляют около 0,9% всех неходжкинских лимфом, уступая по частоте поражения средостения лимфобластным лимфомам
и лимфогранулематозу. Чаще болеют молодые (25-35 лет) женщины (2,5 : 1). Течение заболевания сопровождается метастазированием в почки, надпочечники, головной мозг и другие внутренние органы. Поражение периферических лимфатических узлов и костного
мозга менее характерно. Прогноз несколько хуже, чем у других диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом. Гистологическое
строение опухоли в каждом случае довольно однородно, но у разных
больных размеры и вид клеток опухоли значительно отличаются.
Опухолевые клетки имеют характерную бледную цитоплазму и происходят, как считается, от внутритимических В-клеток (Perrone Т.,
Frizzera G., Rosai J., 1986; Kirn D., Mauch P. et al., 1993).
В-клеточная лимфома с большим количеством Т-клеток/гистиоцитов в прошлом диагностировалась как лимфогранулематоз,
малочисленные крупные клетки (центробласты, клетки с многодольчатыми ядрами, клетки типа Березовского-ШтернбергаРид) с В-клеточным моноклональным происхождением располагаются в плотном реактивном инфильтрате из мелких Т-клеток и
гистиоцитов (Ramsay A. D., Smith W. J., Isaacson P. G., 1988). Выделить опухоль в самостоятельную клинико-морфологическую
форму стало возможным с помощью иммунофенотипирования и,
главным образом, молекулярно-генетического анализа.
Внутрисосудистая лимфома (интраваскулярный лимфоматоз)
характеризуется полиорганной пролиферацией опухолевых клеток в просвете артерий, капилляров и мелких вен. Стенки сосудов
и прилежащие ткани оказываются не тронуты опухолевой инфильтрацией или она очень незначительна. Клетки опухоли внутри кровеносных сосудов имеют морфологию крупных активированных
http://www.bestmedbook.com/
Глава 9. Иммуногистохимия
195
лимфоидных клеток, что вместе с иммунофенотипом позволяет
отнести лимфому к диффузным крупноклеточным В-клеточным
(Di Giuseppe J. A., Nelson W. G. et al* 1994).
Первичная лимфома серозных полостей с выпотом встречается очень редко и почти всегда у пациентов со СПИДом. Лимфома
растет в серозных полостях в виде клеточной взвеси из опухолевых иммунобластов или анаплазированных клеток. Во всех немногочисленных описаниях опухоль была ассоциирована с вирусом герпеса человека 8-го типа (вирус герпеса саркомы Капоши)
(Nador R. G., Cesarman E. et al., 1996).
Лимфома/'лейкоз Беркитта впервые была описана у африканцев. Опухоль обычно состоит из В-клеток среднего размера с
большой фракцией пролиферирующих клеток. В большинстве эндемических африканских случаен в злокачественных клетках обнаруживается ДНК вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Описание гистологически и фенотипически идентичных заболеваний встречается иногда и на Западе. Эти новообразования могут возникать у
пациентов с иммунодефицитом, и в таких случаях часто выявляется
присутствие вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Однако «спорадические» неафриканские лимфомы возникают и при отсутствии ослабления иммунной системы, и тогда данный вирус обнаруживается
редко. Практически все случаи, независимо от места проживания
больного, характеризуются хромосомными транслокациями, захватывающими ген туе на 8-й хромосоме и ген тяжелой цепи иммуноглобулина или, более редко, один из двух генов легких цепей.
Лимфатический узел полностью замещен монотонным диффузным опухолевым пролифератом, состоящим из тесно расположенных лимфобластов небольшого размера. Клетки расположены настолько плотно, что сдавливают друг друга и в срезах имеют не
округлую, а многоугольную форму. Ядра клеток содержат довольно много нежнозернистого гетерохроматина и поэтому выглядят
темными. В ядрах располагаются 2-3 базофильных ядрышка. В них
отчетливо различим узкий ободок базофилыгой цитоплазмы. В цитологических препаратах в цитоплазме клеток обнаруживаются
мелкие округлые вакуоли. В тонких гистологических препаратах
из хорошо фиксированного материала с помощью большого увеличения удается увидеть, что ядра лнмфобластов имеют неправильные очертания и окружены едва различимой узкой зоной просветления цитоплазмы. Эта зона просветления в базофильной цитоплазме имеет четкообразное строение.
Митотическая активность обычно очень велика, встречается
много фигур апоптоза, что свидетельствует о коротком жизненном
196
Часть 1. Теоретическая гематология
цикле клеток и быстром росте опухоли. В ткани опухоли беспорядочно рассеяны крупные макрофаги с обильной светлой цитоплазмой, которая содержит фагоцитированные многочисленные обломки ядер распавшихся лимфобластов. Количество макрофагов может быть разным в разных случаях. Такое гистологическое строение
лимфомы традиционно обозначают как «звездное небо». Необходимо подчеркнуть, что феномен «звездного неба» не является патогномоничным признаком лимфомы Беркитта и встречается в
других лимфомах из бластных или активированных лимфоидных
клеток. Может оказаться непросто провести дифференциальную
диагностику лимфомы Беркитта и диффузной крупноклеточной
В-клеточной лимфомы.
Иммунофенотип. По иммунологическому фенотипу клетки относятся к периферическим В-клеткам, CD10 также часто экспрессируется, это дает основание предполагать их происхождение от
клеток зародышевых центров лимфоидных фолликулов. Не обнаруживается реакция с антителами к CD43, TdT и Т-клеточным
антигенам. Диагностическое значение имеет выявление пролиферирующей фракции опухолевых клеток. Лимфома Беркитта характеризуется очень высокой пролиферативной активностью, и
практически 100% клеток метятся антителом Ki-67 (Spina D.,
Leoncini L. et al, 1997).
Лимфобмстные лимфамы/лейкозы из клеток
силтунофенотипач Т-клетокпредшественников
Морфология Т-лимфобластныхлимфом/лейкозов, образующихся из предшественников Т-клеток, обычно неотличима от морфологии лимфобластных В-клеточных лимфом. Они проявляются
как острые лейкозы, но иногда развиваются как опухоли в лимфатических узлах или тимусе. Пролиферат из опухолевых Т-лимфобластов чаще всего полностью вытесняет лимфоидную ткань
пораженного лимфатического узла и инфильтрирует капсулу. Могут встречаться участки с макрофагами, расположенными среди
лимфобластов поодиночке, — «звездное небо». Если лимфоидная
ткань замещена не полностью, опухолевые клетки чаще находятся
в паракортикальной зоне. В биоптатах из средостения нередко можно обнаружить своеобразное расположение опухолевых лимфобластов, которые выстраиваются в узкие линейные ряды или цепочки. В некоторых случаях ткань опухоли содержит эозинофильные гранулоциты.
Иммунофенотип. Т-клеточные лимфобластные лимфомы экспрессируют TdT и обнаруживают вариабельную экспрессию анти-
Глава 9. Иммуногистохимия
197
генов Т-клеток (CDla, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 и CD43).
В зависимости от степени дифференцировки опухолевых бластов
возможна экспрессия только некоторых Т-клеточных антигенов,
таких как CD7 или CD3 (обычно CD3 обнаруживается только в
цитоплазме), возможна коэкспрессия CD4 и CD8 (Czuczman M. S.,
Dodge R. К. et al., 1999). Встречаются случаи с экспрессией пан-Вклеточного антигена CD79a. Почти в 80% случаев обнаруживается экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45RB, в половине — CD45RO. Наличие гранулоцитарных антигенов CD 13 и CD33,
как и в В-клеточных лимфобластных лимфомах, диагноз Т-лимфобластной лимфомы не исключает. Экспрессия различных Т-клеточных антигенов может отражать степень дифференцировки опухоли. Незрелые опухоли экспрессируют цитоплазматический CD3,
а также CD2 и CD7. Следующие стадии дифференцировки связаны с экспрессией CD5 и CDla. Наиболее дифференцированные
Т-лимфобластные лимфомы экспрессируют CD3 на мембране опухолевых клеток.
Лимфомы из клеток с иммунофенотипом периферических
(посттимических) Т-лимфоцитов и естественных киллеров
Учитывая клинические особенности лимфом с иммунофенотипом периферических (посттимических) Т-лимфоцитов, их можно
разделить на первично лейкемические опухоли, первично нодальные и первично экстранодальные.
Первично лейкемические формы объединяют Т-пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз из крупногранулярных лимфоцитов, NK-клеточный лейкоз IT Т-клеточный лейкоз/лимфому
взрослых.
Т-клеточные пролимфоцитарные лейкозы напоминают лимфоцитарные лейкозы В-клеточного происхождения, так как часто
проявляются лейкемической картиной крови. Опухолевые клетки схожи, хотя у Т-клеток более явно выделяются ядрышки и обильнее цитоплазма, что более соответствует описанию пролимфоцита. В отличие от В-клеточных лимфоцитарных лимфом никогда не
обнаруживаются пролиферативные центры (псевдофолликулы).
В ткани опухоли при поражении лимфатического узла Т-клеточным пролимфоцитарным лейкозом могут обнаруживаться довольно многочисленные древовидно-ветвящиеся посткапиллярные венулы с набухшим эндотелием, а в некоторых участках в толще
стенки венул располагаются опухолевые лимфоидные клетки. В хорошо приготовленных тонких гистологических препаратах отчет-
198
Часть 1. Теоретическая гематология
ливо заметно неправильное строение ядер, отличающееся от округлых клеток В-.тимфоцитарных лимфом.
Иммунофенотип. Эти лимфомы экспрессируют Т-клеточные антигены, CD7 и обычно бывают СО4-позитивными (CD4+CD8~ —
60%, CD4XD8+ - 25%, CD4CD8 + - 15%). Не экспрессируются
TdT и CDla (Matutes E., Brito-Babapulle V. et al, 1991).
T-клеточный лейкоз из крупных гранулярных лимфоцитов диагностируют при обнаружении в периферической крови крупных
лимфоидных клеток (15- 18 мкм) с обильной цитоплазмой, содержащей азурофильные гранулы, и бобовидным ядром. В норме количество крупногранулярных лимфоцитов находится в пределах
2 -4 х 108/л. У больных количество превышает 2 х 109/л (медиана
8 х 109/л). При нормальном количестве лейкоцитов очень важно
тщательно исследовать мазки крови для поиска и подсчета крупногранулярных лимфоцитов. Для заболевания характерны анемия,
нейтропения, поражение костного мозга, спленомегалия, частые
бактериальные инфекции, ассоциация с ревматоидным артритом.
Иммунофенотип. Встречается несколько иммунофенотшшческих вариантов. Наиболее частый имеет профиль CD3 , CD4 ,
CD8^, TCRaP'; редкие варианты - CD3', CD4*. CD8 , TCRccP ;
CD3 , CD4+. CD8\ TCRaP"; CD3", TCRyS". CD4 и CDS экспрессируются неотчетливо. В каждом случае по-разному экспрессируются CD lib, CD56 и CD57. Обычно обнаруживается TIА-1 (Lamy Т.,
Loughran Т. Р., 1999).
Агрессивный NK-клеточный лейкоз — заболевание, встречающееся у лиц молодого возраста в странах Востока, характеризуется
спленомегалией, большим полиморфизмом и более бластным видом опухолевых лимфоидных клеток. В цитоплазме этих клеток
различимы нежные азурофильные гранулы.
Иммунофенотип. CD2\ sCD3 , CD3e+, CD4 , CD8 *, CD16*,
CD56*, TIA1\ CD57 обычно не экспрессирован (ChanJ. К., 1998).
Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых характеризуется
выраженной вариабельностью морфологических проявлений —
смесь мелких и крупных атипичных лимфоидных клеток с полиморфными ядрами — имеет в зависимости от преобладающего
компонента различный вид от случая к случаю. В периферической крови опухолевые клетки часто имеют характерные многодольчатые ядра. Заболевание встречается у взрослых, эндемично
для Японии, Бразилии и стран Карибского бассейна, ассоциировано с вирусом HTLV1. Протекает в тлеющей, хронической, острой (с гиперкальциемией) лейкемических формах и в виде лимфомы.
Глава 9. Иммуногистохимия
199
Иммунофенотип. Клетки экспрессируют CD2, CD3, CD4. CD5.
CD25, редко CD30, не экспрессируют CD7, CD8, TIA-1, granzyme
В, ALK (Shimoyama М„ 1991).
Раздел Т-к.теточных лимфом с первичной локализацией в лимфатических узлах появился в гистологических классификациях
после того, как иммунологические методы стали широко применяться в исследовании гистологических срезов. Сопоставление
иммунофенотипа Т-клеточных лимфом с их гистологическим строением и клиническими особенностями обнаружило, что существуют признаки, которые позволяют с большой вероятностью предположить диагноз Т-клеточной лимфомы с иммунофенотипом периферических (посттимических) лимфоцитов.
Вполне чувствительными и специфичными для предположительного гистологического диагноза следует считать следующие
морфологические признаки принадлежности неходжкинских лимфом к Т-клеточному типу: 1) диффузный характер роста лимфомы
с поражением в начальных стадиях развития опухоли паракортикальной зоны; 2) появление большого количества посткапиллярных венул с набухшим эндотелием; 3) гнездный вид расположения
(компартментализация) опухолевых клеток, разделенных тонкими пучками коллагеновых волокон; 4) широкие вариации размеров и формы ядер, отсутствие клеток с расщепленными ядрами;
5) клетки лимфомы имеют светлую цитоплазму с четкой мембраной, иногда образуя рисунок «булыжной мостовой»; 6) наличие
полиморфных клеток, в том числе подобных клеткам Березовского-Штернберга-Рид; 7) примесь гистиоцитов, эпителиоидных клеток, эозинофильных лейкоцитов и плазматических клеток.
Ангиоиммунобластнаялимфома. При ангиоиммунобластной
лимфоме нормальные анатомические структуры лимфатического
узла замещает богато васкуляризированный инфильтрат, который
может распространяться через капсулу в перинодальную жировую
ткань. Нередко удается увидеть остатки лимфоидных фолликулов
в виде неотчетливо очерченных скоплений малых лимфоцитов.
Характерные структуры из фолликулярных дендритических клеток в виде округлых образований с концентрическими рядами вытянутых (CD21 и CD35 позитивных) клеток встречаются за пределами остатков В-зоны лимфатического узла и не всегда имеют
отношение к предсуществовавшим «выгоревшим» лимфоидным
фолликулам.
Опухолевый инфильтрат не очень плотный, межклеточные пространства заполнены аморфным или нежнозернистым ШИК-положительным материалом. Многочисленные древовидно-ветвя-
200
Часть 1. Теоретическая гематология
щиеся посткапиллярные венулы с высоким набухшим эндотелием
имеют утолщенную стенку, содержащую ШИК-положительное гомогенное вещество базальной мембраны.
Цитологический состав опухолевого инфильтрата весьма разнообразен. Преобладают мелкие и среднего размера клетки с полиморфными ядрами, заметными ядрышками и бледной серой или
голубоватой цитоплазмой при окраске азур П-эозином. Характерны клетки с объемной, оптически пустой цитоплазмой («светлые»
клетки), их количество варьирует весьма значительно: от единичных, которые легко не заметить, до сплошных полей среди посткапиллярных венул. Содержимое цитоплазмы «светлых» клеток
ШИК-реакцию не дает (Jaffe E. S., 1995).
Иммунофенотип. Крупные клетки обычно экспрессируют CD3
и CD4. Малые лимфоциты в составе полиморфного инфильтрата
могут иметь фенотип CD8T. Всегда в небольшом количестве встречаются довольно крупные базофильные бласты с В-фенотипом и в
некоторых случаях — единичные многоядерные клетки, имеющие
сходство с клетками Березовского-Штернберга-Рид. С развитием процесса увеличивается количество иммунобластов и фигур
митозов. Крупные клетки (в большем или меньшем количестве)
экспрессируют CD30.
Обязательным компонентом сложной гистологической картины являются поликлональные плазматические клетки и плазмобласты, более или менее многочисленные эозинофильные гранулоциты, небольшие скопления эпителиоидных гистиоцитов
(Nakamura S., Suchi Т., 1991).
Первично нодальные Т-клеточные лимфомы с иммунофенотипом периферических лимфоцитов в Усовершенствованной Кильской классификации занимали несколько самостоятельных рубрик,
отличаясь размерами и морфологическими признаками опухолевых клеток, характером реактивного компонента. Довольно часто
было почти невозможным однозначно отнести лимфому из этого
круга к определенной категории Кильской классификации. Поэтому классификация ВОЗ объединяет лимфомы из этих рубрик в
единую категорию «лимфом из клеток с иммунофенотшюм периферических Т-лпмфоцитов», но добавляет определение «неуточненные», что указывает на наличие нескольких различных морфологических вариннтог, лимфом (Suchi Т., Lennert К. et al., 1987).
Лимфомы с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов', неуточиенные. Данные опухоли образованы смесью из
крупных и мелких клеток, часто с ядрами неправильной формы.
Глава 9. Иммуногистохимия
201
Возможна значительная примесь неопухолевых клеток, включающих макрофаги, эозинофильные гранулоциты и в некоторых случаях скопления эпителиоидных клеток. Набор экспрессированных
Т-клеточных антигенов варьирует: так, CD4 экспрессируется чаще,
чем CD8. Крупные скопления и целые поля эпителиоидных гистиоцитов — признак, который сразу бросается в глаза при гистологическом исследовании лимфатического узла с лимфоэпителиоидной лимфомой (лимфомой Леннерта). Гистиоциты имеют широкий ободок светлой цитоплазмы и овальное или бобовидное ядро
с отчетливо различимым ядрышком. В скоплениях иногда встречаются гигантские многоядерные клетки с ядрами такого же строения. Диффузно распределены немногочисленные плазматические
клетки и эозинофильные гранулоциты. Это придает опухоли внешнее сходство с лимфогранулематозом.
Собственно клетки опухоли располагаются между скоплениями эпителиоидных гистиоцитов. Главным критерием для гистологического диагноза лимфомы Леннерта являются цитологические
особенности опухолевого компонента. Атипичные лимфоидные
клетки несколько крупнее малого лимфоцита. Ядро клетки округлое, овальное или несколько вытянутое со «смятой» или «жатой»
поверхностью. Встречаются среднего размера иммунобласты и
крупные одноядерные и многоядерные опухолевые клетки с грубым хроматином в ядрах, мелкими базофильными ядрышками и
базофильной цитоплазмой, которые отличаются от клеток Ходжкина и Березовского-Штернберга-Рид.
Энителиоидные клетки могут муфтообразно окружать кровеносные сосуды лимфатического узла и распространяться за пределы капсулы. Посткапиллярные венулы лучше выявляются в препаратах, окрашенных ШИК-реактивом или импрегнированных солями серебра.
Характер роста и состав клеточного инфильтрата другого варианта лимфомы из клеток с иммунофенотипом периферических
Т-лимфоцитов позволили дать ей название лимфомы Т-зоны. При
исследовании под малым увеличением на стадиях, когаа лимфома
еще не захватила весь лимфатический узел, всегда удается увидеть
лимфоидные фолликулы, окруженные более светлой, довольно однородной межфолликулярной опухолевой тканью. В некоторых
случаях лимфоидные фолликулы имеют большой светлый центр
размножения, который окружен компактной зоной мантии, иногда
резидуальная В-клеточная зона состоит из фолликулов без активных центров размножения. Постепенно фолликулы начинают исчезать, пока полностью не будут вытеснены лимфомой.
202
Часть 1. Теоретическая гематология
В опухолевом инфильтрате преобладают мелкие лимфоидные
клетки с компактными, несколько полиморфными, иногда слегка
овальными или церебриформными ядрами. Клетки немного крупнее малых лимфоцитов, которые можно увидеть в составе резидуальных фолликулов. Доля иммунобластов и промежуточных форм
между ними и мелкими лимфоидными клетками может быть очень
разной. Иммунобласты имеют обычный вид с менее выраженной
базофилией цитоплазмы и ядрышка, чем у В-иммунобластов. Выделяются скопления и целые поля мелких лимфоидных клеток с
объемной, оптически пустой цитоплазмой — «светлые» клетки.
В отдельных случаях обнаруживаются одноядерные и многоядерные гигантские клетки, напоминающие клетки БерезовскогоШтернберга-Рид. Сходство с лимфогранулематозом усиливается
при обнаружении эозшюфильных гранулоиитов, плазматических
клеток и элителноидных гистиоцитов. Во всех случаях в состав
опухолевой ткани, занимает ли она паракортикальную зону или
заполнила уже весь лимфатический узел, вместе с реактивным компонентом входят многочисленные посткапиллярные венулы с высоким набухшим эндотелием.
Плеоморфноклеточные лимфомы из мелких клеток в классификации ВОЗ принадлежат к лимфомам из клеток с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов. Эти опухоли состоят из
довольно однообразного инфильтрата, в котором опухолевые клетки незначительно отличаются друг от друга но размеру. Полиморфизм проявляется в неправильной форме ядер, которые часто имеют зазубренную вогнутую поверхность с одной стороны и гладкую
с противоположной, выпуклой. Ободок цитоплазмы обычно узкий,
с серо-голубой окраской (азур И-эозин), иногда встречаются «светлые» клетки с широкой, оптически пустой цитоплазмой. Гетерохроматин ядер умеренно плотный, глыбчатый, ядрышки мелкие, одиночные. Среди мелких полиморфных клеток почти не встречаются
клетки других типов, исключая немногочисленные эозинофильные
гранулоциты. Гиперплазия посткапиллярных венул менее характерна для этого типа лимфом. Опухолевые клетки инфильтрируют стенки мелких и среднего диаметра кровеносных сосудов.
Плеоморфноклеточные лимфомы из средних и крупных клеток состоят из клеток в 1,5-2 и 2-3 раза больших ядра малого
лимфоцита, опухолевые клетки иногда образуют однородную смесь.
Ядра клеток отличаются выраженным разнообразием формы (плеоморфизм), часто имеют зазубренную с вдавлениями вогнутую
поверхность с одной стороны и более гладкую поверхность выпуклой стороны. У некоторых клеток ядра с церебриформной поверх-
Глава 9. Иммуногистохимия
203
ностью. Гетерохроматпн отличается более нежной структурой в ядрах крупных клеток и более грубой, глыбчатой в клетках среднего
размера. Ядрышек в ядрах может быть несколько, и они имеют
разнообразную форму и базофильную окраску. Цитоплазма клеток умеренно базофильная и окружает ядро в виде заметного
ободка.
Среди опухолевых клеток встречаются в большем или меньшем
количестве эозинофильиые гранулоциты, тканевые тучные клетки, интердигитирующие ретикулярные клетки. Картину выраженного полиморфизма в опухоли дополняют обнаруживаемые иногда гигантские опухолевые клетки.
Иммупофенотип. Большинство Т-клеточных лимфом может
быть диагностировано при иммуногистохимическом исследовании
парафиновых срезов материала, фиксированого в формалине. Используют антитела к CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45RO и
CD43. Весьма характерным является аберрантный иммунофенотип с утратой экспрессии каких-либо пан-Т-клеточных антигенов
или невозможной в норме коэкспрессией антигенов (Hastrup N.,
Ralfkiaer E., Pallcsen G., 1989; Pinkus G. S., O'Hara С J., Said J. W..
1990). Опухоли с крупноклеточным компонентом обнаруживают
от слабой до умеренной силы экспрессию CD30, характерную для
активированных лимфоидных клеток. Чаще CD30+ клетки располагаются периваскулярно. Эти случаи не следует относить к анапластическим крупноклеточным лимфомам.
Анапластические крупноклеточные лимфомы могут быть
разделены на первичные и вторичные (сочетанные и последовательные). Выделяют 3 гистологических варианта анапластических
крупноклеточных лимфом: обычный, мелкоклеточный и лимфогистиоцитарный. Опухоль может замещать ткань лимфатического
узла полностью или частично. Весьма характерным считается распространение опухоли в синусах лимфатического узла. Пласты
опухолевых клеток при частичном поражении лимфатического узла
чаще располагаются в паракортикальной зоне, перивазально или
окружают атрофичные фолликулы. Опухолевые клетки могут быть
очень немногочисленны и часто с трудом различимы, так как рассеяны среди клеток реактивного компонента. Реактивный инфильтрат содержит смесь из нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов, лимфоцитов, плазматических клеток, гистиоцитов. Количественное соотношение этих клеток неодинаково от случая к
случаю и меняется от места к месту в одном и том же биоптате.
Опухолевые клетки анапластической крупноклеточной лимфомы крупные и очень крупные, овальные, круглые, полигональные
204
Часть 1. Теоретическая гематология
с полиморфными атипичными ядрами. Для них характерна «эмбрионогюдобная» форма ядер, когда выпуклая поверхность ядра
имеет довольно правильное гладкое очертание, а вогнутая — глубокие погружные зазубрины. Детальное изучение морфологии ядер
с помощью большого увеличения микроскопа в ряде случаев дает
возможность увидеть в ядрах сквозное отверстие, являющееся инвагинацией ядерной мембраны, что придает ядрам вид кольца неправильной формы. Некоторые варианты опухоли характеризуются
появлением очень крупных клеток с многочисленными округлыми небольшим ядрами, которые располагаются по кругу на периферии клетки и, налегая друг на друга, формируют некое подобие
кольца с цитоплазмой в центре. Хроматин ядер собирается при
фиксации в глыбки, чередующиеся с участками нежносетчатой
структуры, ядрышки крупные, округлые или вытянутые, иногда —
уродливой формы. Некоторые клетки имеют двуядерное строение
и очень напоминают диагностические клетки Березовского- Штернберга-Рид. Их появление на фоне реактивного компонента, состоящего из плазматических клеток, гистиоцитов и эозинофильных
гранулоцитов, делает иногда невозможной дифференциальную
диагностику лимфогранулематоза и анапластической крупноклеточной лимфомы без применения иммуногистохимического исследования.
Тинкториальные свойства цитоплазмы опухолевых клеток очень
различаются от случая к случаю. Цитоплазма бывает интенсивно
базофильной, эозинофидьной, амфофильной, бледной или оптически пустой. Если цитоплазма базофильна, при хорошей окраске
препаратов почти всегда удается обнаружить участок перинуклеарного просветления с заметной эозинофилией, соответствующий
комплексу Гольджи.
В лимфатических узлах с анапластической крупноклеточной
лимфомой обнаруживается фиброз разной степени выраженности. Иногда это дуги фиброзной ткани, которые рассекают опухоль
на узлы, и картина при этом весьма напоминает нодулярный склероз при лимфогранулематозе. В других случаях это могут быть
довольно нежные пучки соединительной ткани, охватывающие
группы клеток или отдельные клетки (Benharroch D., MeguerianBedoyan Z. et al, 1998).
Иммунофенотип. Практически во всех случаях анапластической крупноклеточной лимфомы клетки экспрессируют CD30. Антитела к CD30 Ki-1 и Hefi-1 позволяют обнаружить экспрессию
только в нативной или замороженной ткани. Антитела Вег-Н2 распознают эпитоп CD30, резистентный к фиксации, обезвоживанию
Глава 9. Иммуногистохимия
205
и заливке ткани в парафин. Продукт иммуногистохимической реакции, свидетельствующий об экспрессии CD30, должен обнаруживаться на мембране клеток, в зоне комплекса Гольджи или одновременно на этих структурах.
••
Более чем в половине случаев анапластические крупноклеточные лимфомы экспрессируют антиген эпителиальных мембран
(ЕМА). Эта особенность данного вида лимфоидных опухолей вместе с довольно частым отсутствием экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45RB (до 40% случаев) может быть причиной
неверного диагноза эпителиальной опухоли, если панель применяемых антител недостаточна. Есть немногочисленные наблюдения
цитокератин-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом. Типична экспрессия активационных антигенов: рецептора
интерлейкина-2 (CD25), рецептора трансферрина (CD71), HLA-DR.
Экспрессия антигена CD15 встречается редко и только в небольшой доле опухолевых клеток. Ассоциированными с анапластическими крупноклеточными лимфомами считаются антигены, выявляемые антителами BNH9 и CBF78, экспрессия которых обнаруживается не всегда. Моноклональное антитело ALK-1 позволяет
выявить в парафиновых.срезах химерный белок NPM/ALK, возникающий в результате транслокацйи t(2;5). Анапластические
крупноклеточные лимфомы имеют Т-клеточный или 0-клеточный
иммунофенотип. Чем более широкая панель антител применяется
к Т-клеточным антигенам, тем реже встречается 0-клеточный фенотип. Экспрессия CD3 встречается только в 25% случаев, а антигены CD5, CD7 и CD8 часто отсутствуют. Более часто экспрессированы CD2 и CD4. Нередко выявляется цитотоксический фенотип (ТГА-1, granzyme В, perform) (Krenacs L, Wellmann A. et al,
1997). В отличие от лимфогранулематоза клетки анапластической
лимфомы экспрессируют кластерин.
CD30" крупноклеточные опухоли с В-клеточным иммунофенотипом относят к диффузным крупноклеточным В-клеточным лимфомам.
Грибовидный микоз — первичная Т-клеточная лимфома кожи
из мелких клеток с церебриформной поверхностью ядер. Эти клетки с глубокими инвагинациями ядерной поверхности получили
название клеток Лютцнера (Lutzner). Начальные проявления грибовидного микоза не сопровождаются поражением лимфатических узлов и костного мозга. Клинически выделяют три формы
грибовидного микоза и вариант с эритродермией, лимфаденопатией и лейкемической картиной крови, называемый синдромом Сезари (Sezary).
206
Часть 1. Теоретическая гематология
Морфогенез классической формы грибовидного микоза клинически и морфологически может быть разделен на три стадии: эритематозную, бляшечную и опухолевую. Деление в некоторой степени условное, поскольку у одного больного в различных участках
кожного покрова могут быть обнаружены проявления всех стадий
грибовидного микоза, а иногда развитие опухоли ограничивается
эритематозной стадией.
Ранние стадии поражения кожи характеризуются различной
плотности полосовидным инфильтратом в наружном слое дермы с
распространением на эпидермис (эпидермотропизм). Инфильтрат
образован мелкими клетками Лютцнера (с церебриформными ядрами), интердигитирующими и плазматическими клетками, а также клетками Лангерганса и эозинофильными гранулоцитами. С
развитием заболевания плотность опухолевых клеток в инфильтрате растет, и с появлением внутриэпидермальных полостей, заполненных клетками Лютцнера и интердигитирующими клетками
(микроабсцессы Потрие), более заметным становится поражение
эпидермиса.
Опухолевая стадия грибовидного микоза проявляется массивной инфильтрацией всех слоев кожи, а иногда и подкожной жировой клетчатки, полиморфной клеточной смесью, в которой обнаруживаются клетки Лютцнера. Встречаются заметно более крупные
полиморфные клетки с многодольчатыми ядрами и ободком базофильной цитоплазмы («микотические» клетки). Строение опухолевой ткани в этой стадии заболевания может быть сходным практически с любым вариантом Т-клеточной лимфомы высокой степени злокачественности.
Гистологическое исследование пораженной кожи при синдроме
Сезари обнаруживает изменения, сходные с грибовидным микозом. В периферической крови циркулируют клетки Лютцнера, хотя
поражение костного мозга нехарактерно вплоть до терминальной
стадии заболевания (Kim Y. H., Hoppe R. Т., 1999).
Начальные проявления грибовидного микоза (синдрома Сезари) сопровождаются дерматопатической лимфаденопатией. Паракортикальная зона лимфатических узлов расширена и заполнена большим количеством интердигитирующих ретикулярных клеток. Ядра этих клеток светлые, с четкой тонкой ядерной мембраной,
образующей углубления и складки на поверхности ядра. Форма
ядер весьма разнообразна, чаще вытянутая или изогнутая. Ядра
окружает широкая, оптически пустая цитоплазма. Среди интердигитирующих ретикулярных клеток, которые, возможно, происходят от клеток Лангерганса из эпидермиса, встречаются малочис-
Глава 9. Иммуногистохимия
207
ленные лимфоциты и гранулоциты. Лимфоидные фолликулы сохранены и могут быть оттеснены к капсуле лимфатического узла
(Scheffer E. M.. Meijer С. J., van Vloten W. A., 1980).
При поражении лимфатических узлов грибовидным микозом
среди интердигитирующих ретикулярных клеток удается обнаружить сначала немногочисленные атипичные лимфоциты с неребриформной поверхностью ядер и единичные микотические
клетки. С развитием опухолевого поражения лимфоидной ткани
клетки Лютцнера замещают все другие клеточные элементы в паракортикальной зоне, оставляя только единичные рассеянные интердигитирующие ретикулярные клетки. Все более очевидной становится атипия лимфоидного опухолевого инфильтрата, увеличивается количество митозов. Возрастает доля крупных ми котических
клеток. Появляются посткаииллярные венулы с набухшим эндотелием. Если лимфоидные фолликулы сохраняются, изменения
в лимфатическом узле могут напоминать лимфому Т-зоны. В дальнейшем лимфоидные фолликулы вытесняются опухолью и рисунок строения лимфатического узла становится полностью диффузным. Синдром Сезари с ранних стадий сопровождается инфильтрацией лимфатических узлов клетками Лютцнера, и встретить картину дерматопатической лимфаденопатии с небольшим
количеством опухолевых клеток практически не удается.
Иммунофенотип. Опухолевые клетки при грибовидном микозе
и синдроме Сезари имеют сходные иммунологические характеристики. Экспрессированы Т-клеточные антигены CD2, CD3, CD4,
+/
CD5 , не экспрессируются CD7, CD8, CD30, TIA-1. Клетки с
цитотипическими признаками бластов могут быть СОЗО-позитнвными.
Первично кожные CD30* Т-клеточные лимфопролиферативные заболевания объединяют первично кожную анапластическую
крупноклеточную лимфому и лимфоматоидный папулез. Заболевания, встречающиеся у взрослых, имеют вариабельную морфологию и при гистологическом исследовании весьма сходны. Анапластические крупноклеточные лимфомы кожи — солитарные опухоли; которые в некоторых случаях могут подвергатвея спонтанной
регрессии. Лимфоматоидный папулез проявляется множественными спонтанно разрешающимися папулами.
Иммунофенотип. Опухолевые клетки на клеточной мембране и
в зоне Гольджи экспрессируют CD30, часто экспрессированы антигены CD45RB. CD3, CD45RO, TIA-1, гранзим В, не реагируют с
антителами к ЕМА и ALK. Также не удается обнаружить транслокацию между 2 и 5 хромосомами (Willemze R., Kerl H. et al., 1997).
208
Часть 1. Теоретическая гематология
Т-клеточная панникулитоподобная лимфома подкожной
клетчатки проявляется подкожными узлами на туловище и конечностях с гиперемией кожи над ними. Характерны симптомы
интоксикации, панцитопения, гепатоспленомегалия, высокий уровень ферритина и проявления гемофагоцитоза в костном мозге и
селезенке. При гистологическом исследовании биоптата подкожной жировой ткани обнаруживают полиморфные лимфоидные
клетки средних размеров, окружающие в один ряд жировые клетки и образующие небольшие скопления в прослойках соединительной ткани между жировыми дольками. Клетки опухоли инфильтрируют стенки кровеносных сосудов. Все это становится причиной некрозов жировой ткани с омылением жиров и фагоцитозом
продуктов распада жира.
Иммунофенотип. При иммуногистохимическом исследовании
лимфоидных клеток инфильтрата выявляется экспрессия CD3 и
CD8, TIA1 и гранзима В, не выявляется CD4 (Kumar S., Krenacs L.
eta]., 1998).
Экстранодальные NK-/T-клеточные лимфомы верхних дыха тельных путей. Выраженную тенденцию к инфильтрации стенок
кровеносных сосудов с окклюзией их просвета опухолевыми клетками обнаруживают МК-/Т-кл сточные лимфомы верхних дыхательных путей. Массивные изъязвления слизистых оболочек верхних
дыхательных путей и некрозы тканей срединных структур лицевого
черепа с реактивным гранулематозным воспалительным компонентом при этом виде лимфомы, агрессивное течение обусловили название, под которым существовало заболевание, — летальная срединная гранулема и злокачественный срединный ретикулез. Местом первичной локализации кроме верхних дыхательных путей могут
быть кожа, мягкие ткани, желудочно-кишечный тракт и яички.
Опухолевые клетки имеют весьма разнообразную морфологию —
от атипичного малого лимфоцита до активированных лимфоидных
клеток. Всегда присутствует массивный реактивный компонент —
плазматические клетки, гистиоциты, эозинофильные гранулоциты.
Иммунофенотип. Для опухолевых клеток характерна экспрессия CD2, CD3e (в цитоплазме), CD56, TIA-1, гранзима В. Не экспрессируется CD3 на мембране клеток, CD4, CD5, CD8, CD16 и
CD57. В редких случаях экспрессированы CD7 и CD30. Диагноз
предполагает цитотоксический фенотип и ВЭБ*. При отсутствии
экспрессии цитотоксических молекул и ВЭБ лимфомы верхних
дыхательных путей с CD3e* относят к Т-клеточным лимфомам с
иммунофенотипом периферических лимфоцитов (Chan А. С,
HoJ. W. etal, 1999).
Глава 9. Иммуногистохимия
209
Кишечные Т-клеточные лимфомы с проявлениями энтеропатии. Изменения при кишечных Т-клеточных лимфомах с про
явлениями энтеропатии в течение долгого времени ОТНОСИЛИ К
осложнениям целиакии, а позднее — к опухолям гистноцнтарного
происхождения. В начале 1980 г. было доказано, что они являются
Т-клеточными лимфомами с весьма разнообразной морфологией.
Эта опухоль характеризуется мелкими изъязвлениями в кишечни-ке и типичными гистологическими проявлениями целиакии (виллезная атрофия), которые иногда могут отсутствовать. Некоторые
пациенты имеют документированный анамнез целиакии. но иногда лимфома проявляется de novo. Клинический прогноз плохой,
поскольку лимфома часто является многоочаговой.
Иммунофенотип. Опухолевые клетки экспрессируют пан-Т-клеточные маркеры и в большинстве случаев CD103 молекулу интегрина, обнаруживаемую в нормальных Т-лимфоцитах кишки
(Wright D. Н., 1997).
Гепатолиенальная Т-клеточная лимфома — заболевание мужчин молодого возраста, для которого основные проявления связаны с печенью и селезенкой, не характерны лимфаденопатия и лейкемическая картина крови. В синусах (синусоидах) печени, селезенки, костного мозга обнаруживаются малые лимфоциты с
невыраженными признаками атигши.
Иммунофенотип. Опухолевые лимфоциты имеют фенотип
CD2+, C D 3 \ CD4-, CD5 , CD8 , CD56 + , Т1А1+, гранзим В
(Cooke С. В., Krenas L. et al.. 1996).
Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика
лимфогранулематоза (лимфомы Ходжкина)
Лимфогранулематоз — злокачественная опухоль лимфоидной
ткани, в которой малочисленные опухолевые клетки характерного строения располагаются среди преобладающего реактивного
клеточного окружения. Выделяют две принципиально различные формы заболевания: лимфогранулематоз, нодулярный тип
лимфоидного преобладания и классический лимфогранулематоз.
Классический лимфогранулематоз представлен четырьмя гистологическими вариантами, среди них: с нодулярным склерозом, смешанно-клеточный, с истощением лимфоидной тканн и с большим
количеством лимфоцитов.
Гистологический диагноз лимфогранулематоза предполагает
идентификацию двух неотъемлемых составных частей патологического процесса: 1) опухолевых диагностических клеток Березов-
210
Часть 1. Теоретическая гематология
с кого- Штернберга- Рид и клеток Ходжкина; 2) окружающих неопухолевых клеток, формирующих один из типичных гистологических вариантов строения опухоли.
Клетки Березовского-Штернберга-Рид типичного строения —
крупные (20-30 мкм), с дву- или многодольчатым ядром или двуили многоядерного строения. Ядра округлые, с четкой ядерной
мембраной и небольшим количеством довольно гомогенного гетерохроматина. Ядра содержат, как правило, одно крупное (1/4 диаметра ядра) округлое гомогенное ядрышко, иногда оксифильное.
В диагностических клетках Березовского-Штернберга-Рид должно быть не менее двух ядрышек в двух долях ядра (по одному и
более в каждой доле). Вокруг ядрышка в ядре видна узкая зона
просветления. В клетках с двудольчатым ядром иногда заметна
центральная или зеркальная симметрия строения. Цитоплазма
широким ободком окружает ядро (ядра), амфофильна или слабо
базофильна, в препаратах, окрашенных азур П-эозином, часто
хорошо различима слабо эозинофильная зона перинуклеарного просветления (зона Гольджи). Одноядерные клетки сходного строения называют клетками Ходжкина. Встречаются опухолевые клетки с плотной компактной цитоплазмой и пикнотичным бесструктурным ядром — мумифицированные клетки. Еще один вариант
диагностических клеток — лакунарные — чаще всего обнаруживаются в ткани, фиксированной в формалине, в результате чего объемная цитоплазма клеток сморщивается и клетка остается в «лакуне», сформированной окружающими клетками.
Обнаружения клеток Березовского-Штернберга-Рид в гистологических препаратах для диагноза лимфогранулематоза недостаточно: морфологически сходные клетки могут встретиться при
неходжкинских лимфомах и некоторых реактивных- изменениях
лимфоидной ткани.
Особым вариантом клеток Березовского-Штернберга-Рид являются Ь&Н-клетки (лимфо-гистиоцитарный тип) или рор-согпклетки («воздушная кукуруза»). Они отличаются крупным складчатым, многодольчатым ядром с тонкой ядерной мембраной, однородным гетерохроматином и многочисленными базофильными
мелкими ядрышками. Цитоплазма необъемная, бледно окрашенная (Mauch P., ArmitageJ. О., Diehi V., 1999).
Лимфогранулематоз, нодулярный тип лимфоидного преобладания. Ткань лимфатического узла полностью или частично замещена довольно однообразным инфильтратом нодулярного строения. Могут быть различимы резидуальные фолликулы, оттесненные к капсуле узла. Часто обнаруживаются зоны диффузного рос-
Глава 9. Иммуногистохимия
211
та. Нодулярный тип роста бывает плохо различим, особенно при
исследовании тонких препаратов. В таких случаях полезной может быть импрегнация ретикулинового каркаса солями серебра.
Опухолевые клетки представлены L&H вариантом'клеток Березовского-Штернберга-Рид. L&H клетки чаще располагаются в центральной зоне нодулярных структур и не образуют явных скоплений. Среди клеток инфильтрата преобладают малые лимфоциты, в
меньшем количестве обнаруживаются гистиоциты, которые могут
образовывать небольшие скопления. На периферии нодулярных
образований иногда встречаются реактивные плазматические клетки. Эозинофильные и нейтрофильные лейкоциты почти всегда отсутствуют.
Иммунофенотип. Опухолевые L&H клетки экспрессируют В-линейные антигены CD20 и CD79a, общелейкоцитарный антиген
CD45RB и антиген эпителиальных мембран. В отличие от классических клеток Березовского-Штернберга-Рид не экспрессируют
CD 15 и CD30, в редких случаях обнаруживается слабая экспрессия CD30. L&H клетки окружены кольцом Т-клеток, которые часто экспрессируют CD57. Такие розетки CD57 позитивных лимфоцитов нехарактерны для классического лимфогранулематоза
и В-клеточной лимфомы с большим количеством Т-клеток. Выявление с помощью антител к CD21 или CD23 гиперплазированной
сети фолликулярных дендритических клеток, образующих шаровидные структуры, подчеркивает нодулярный рисунок строения
опухоли (Anagnostopoulos I., Hansmann M. L. et al., 2000).
Лимфогранулематоз, вариант с нодулярным склерозом. Изменения в лимфатическом узле могут захватывать весь объем или
обнаруживаться только в части узла. Обычно капсула лимфатического узла значительно утолщена, а в ткани узла обнаруживаются кольца и дуги васкуляризированной фиброзной ткани, которые
окружают округлые образования из опухолевой лимфоидной ткани. В некоторых случаях склероз развит слабо, тогда для выявления фиброзных дуг может оказаться полезной микроскопия в поляризованном свете — коллагеновые волокна выделяются из-за
двойного лучепреломления. Принято считать, что для того чтобы
отнести лимфогранулематоз к варианту с нодулярным склерозом,
достаточно обнаружить хотя бы одну дугу фиброзной ткани.
В нодулярных структурах опухолевая ткань состоит из клеток
Березовского-Штернберга-Рид, которые при этом гистологическом варианте лимфогранулематоза чаще всего имеют вид лакунарных клеток. Лакунарные клетки располагаются среди клеток реактивно-воспалительного компонента - малых лимфоцитов, плазма-
212
Часть 1. Теоретическая гематология
тических клеток, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов,
гистиоцитов и фибробластов. Количественные соотношения опухолевых и неопухолевых клеток меняются не Только от случая к
случаю, но и в пределах одного биоптата, так что клеточный состав
нодулярных образований может быть выраженно различаться.
Опухолевые лакунарные клетки могут располагаться поодиночке,
группами или крупными скоплениями. Обнаружение обширных
слоев и скоплений опухолевых клеток позволяет выделить синцитиальный вариант нодулярного склероза. Иногда опухолевые клетки довольно однообразны, а в некоторых случаях оказываются резко полиморфными. Клетки Березовского-Штернберга-Рид типичного строения встречаются редко.
Довольно часто в нодулярных образованиях обнаруживаются
очаги некрозов, в этих зонах возможна нейтрофильная реакция,
такая картина напоминает абсцедирование. Очаги некрозов могут
иметь ландкартообразныс очертания.
Разделение нодулярного склероза на две группы (градации, или
степени) основано на оценке клеточного состава нодулярных структур. Ко второй группе относят случаи, в которых: а) более 25%
нодулярных структур содержат многочисленные уродливые анаплазированные клетки Березовского-Штернберга-Рид на клеточном фоне без истощения лимфоидной ткани; б) более 25% нодулярных структур характеризуются истощением лимфоидной ткани, особенности строения клеток Березовского-Штернберга-Рид
во внимание не принимаются; в) более 80% нодулярных структур
обнаруживают фиброзно-гистиоцитарное содержимое с некоторым
количеством лакунарных клеток или типичных клеток Березовского-Штернберга-Рид. Синцитиальный вариант также относят
к группе 2.
Остальные случаи, сомнительные и пограничные относят к
1-й группе (McLennan К. A., Bennett M. H. et al, 1992). Данные о
прогностическом значении выделения этих групп лимфогранулематоза с модулярным склерозом противоречивы. Классификация
ВОЗ рекомендует в гистологическом диагнозе лимфогранулематоза с нодулярным склерозом указывать группу, к которой этот
случай относится, с целью накопления информации о прогностическом значении такого подразделения.
Лимфогранулематоз, смешанно-клеточный вариант. Лимфоидная ткань в лимфатическом узле частично или полностью замещена диффузной, довольно однородной смесью, в которой клетки Березовского-Штернберга-Рид располагаются среди малых
лимфоцитов, лимфоидных клеток среднего размера с угловатыми
Глава 9. Иммуногистохимия
213
ядрами, плазматических клеток, гистиоцитов, фибробластов, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов. Не все опухолевые
клетки имеют типичное строение, некоторые из них могут напоминать активированные крупные лимфоидные клетки или иммунобласты. В реактивно-воспалительном клеточном окружении количественный состав может сильно отличаться от случая к случаю.
Иногда эозинофильные гранулоциты очень редки и их нужно тщательно разыскивать, а иногда они так многочисленны, что формируют подобие «эозинофильных абсцессов». Некоторые случаи отличаются большим количеством эпителиоидных гистиоцитов, могут также обнаруживаться очаги некрозов и зоны фиброза.
Фиброзная ткань при смешанно-клеточном варианте лимфогранулематоза не образует слоев, полос или дуг и не обладает свойством
двойного лучепреломления в поляризованном свете.
Лимфогранулематоз, вариант с истощением лимфоидной
ткани. В биоптатс лимфатического узла изменения могут быть
двух типов. Истощение лимфоидной ткани по типу диффузного
фиброза характеризуется довольно однородным по плотности диффузным сетчатым недвулучепреломляющим фиброзом с аморфным
гомогенным эозинофильным бесклеточным веществом в петлях
коллагеновых волокон и очень большим количеством клеточных
элементов. Диагностические клетки Березовского- Штернберга Рид редки. Другой тип называется ретикулярным и отличается
большим количеством клеточных элементов, среди которых резко преобладают и типичные, и уродливые клетки БерезовскогоШтернберга-Рид. Клетки реактивно-воспалительного окружения
единичны. Опухолевая ткань при лимфогранулематозе с истощением лимфоидной ткани часто некротизируется (Neiman R. S., Rosen P. J., Lukes R.J., 1973).
Классический лимфогранулематоз с большим количеством
лимфоцитов. Клетки Ходжкина и Березовского-Штернберга-Рид
располагаются среди малых лимфоцитов. Диагностические клетки
Березовского-Штернберга-Рид встречаются редко, L&H клетки
не встречаются. Гранулоциты и гистиоциты очень редки или их
нет совсем. Малые лимфоциты располагаются диффузными полями или формируют фолликулярные структуры. Фолликулярные структуры имеют редуцированные центры размножения и широкую зону мантии, в которой располагаются опухолевые клетки
(Ashton-Key М„ Thorpe P. A. et al, 1995; Anagnostopoulos I., Hansmann M. L. et al., 2000).
Иммунофенотип. Все варианты клеток Березовского-Штернберга-Рид при классическом лимфогранулематозе имеют сходный
214
Часть 1. Теоретическая гематология
профиль экспрессии иммунологических маркеров. Эти клетки почти никогда не экспрессируют общелейкоцитарный антиген, почти во всех случаях экспрессируют CD30. Экспрессия обнаруживается на клеточной мембране и в перинуклеарной зоне цитоплазмы (зоне Гольджи). Антиген CD15 экспрессируется реже (75% случаев), в зоне Гольджи и на клеточной мембране, мембранное окрашивание может отсутствовать. Клетки Березовского-Штернберга-Рид экспрессируют виментин, фасцин и в ряде случаев CD20
на клеточной мембране (окрашивание ядрышек неспецифично).
Окрашивание с антителами к иммуноглобулинам, к- и Х-легким
цепям иммуноглобулинов связано с пассивной абсорбцией этих
белков из межклеточного пространства. Опухолевые клетки не экспрессируют антиген эпителиальных мембран, кластерин, очень редко обнаруживается экспрессия Т-линейных антигенов.
Лимфоидные клетки неопухолевого окружения — чаще CD4позитивные Т-клетки, CD8 T клеток немного. Т-клетки нередко обнаруживают экспрессию цитотоксических молекул. Не экспрессируют CD57.
Дифференциальная диагностика лимфом, характеризующихся
общими чертами гистологического строения
Гистологическая диагностика опухолей лимфоидной ткани —
раздел частной онкоморфологии, где в силу особенностей этой группы новообразований для установления диагноза необходимо изучение иммунофенотипа клеток опухоли.
Особенности опухолей лимфоидной ткани:
1. Многообразие морфологических вариантов.
2. Морфологическое сходство нормальных и опухолевых клеток.
3. Морфологическое сходство некоторых гистологических вариантов опухолей.
4. Морфологическое сходство некоторых реактивных процессов и опухолей.
В основе гистологического исследования биопсий лимфатических узлов, как и всех других органов и тканей, лежит детальное
исследование тканевой структуры (архитектоники) и клеточного
состава биоптата.
Изучение препаратов начинается с оценки пригодности срезов
для гистологического исследования и характеристики обнаруженных дефектов технологии приготовления препаратов.
Гистологическое исследование препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином или азур П-эозином, позволяет отнести иссле-
Глава 9. Иммуногистохимия
215
дуемую опухоль лимфоидной ткани к одной из групп лимфом,
объединенных выраженным морфологическим сходством.
Ниже перечислены гистологические признаки, объединяющие
лимфомы лимфатических узлов в группы.
1. Пролиферация бластных клеток.
2. Диффузная пролиферация мелких клеток.
3. Диффузная пролиферация крупных клеток.
4. Фолликулярный рост лимфоидной ткани.
5. Нодулярный характер роста опухолевой ткани.
6. Анапластическая морфология лимфоидных клеток.
7. Диффузная гюлиморфноклеточная димфоидная пролиферация опухоли.
8. Лимфогранулематозоподобное строение опухоли.
Специфичность рутинных гистологических методов для дифференциальной диагностики внутри группы в большинстве случаев недостаточна. Применение классификации ВОЗ опухолей лимфоидной ткани в практической работе обусловлено возможностью
использования иммуногистохимического метода.
С целью дифференциальной диагностики необходимо выбрать
рациональный состав панели иммунологических маркеров (антител), который позволяет различить гистологически сходные варианты лимфом между собой. С учетом высокой стоимости и трудоемкости нммуногистохимического исследования, набор антител
для каждой группы лимфом должен быть минимально достаточным (табл. 5).
Таблица 5
Состав панелей иммуногистохимических маркеров,
необходимых для дифференциальной диагностики
наиболее часто встречающихся лимфом
Признак
Пролиферация
лимфоидных
клеток с бластной морфологией
Диффузная
пролиферация
мелких лимфоидных клеток
Группа
Состав панели
TdT.
CD3po!v.
CD5.
CD79a,
CyDl
Лимфоцитарная лимфома
CD3poly.
Лимфоплазмоцитарная лимфома
CD5. CD 10.
В-клеточные лимфомы маргинальной зоны CD20, CD23.
Лимфома из клеток зоны мантии
CvDl
Фолликулярная лимфома 1-й ст.,
с диффузным характером роста
Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз
Т-лимфобластный лейкоз/лимфома
В-лимфобластный лейкоз/лимфома
Лимфома из клеток зоны мантии, бластоидный вариант
Часть 1. Теоретическая гематология
216
Окончание таблицы 5
Признак
Фолликулярный
рост лимфоидной
гкани
Труппа
Фолликулярная лимфома
Фолликулярная гиперплазия
Фолликулярная лимфома
Л имфоцитарная лимфома
В-клеточные лимфомы маргинальной
зоны
Лимфома из клеток зоны мантии
Лимфогранулематоз, нодулярный тип
лимфоидного преобладания
Диффузная пролиДиффузная крупноклеточная В-клеферация крупных
точная лимфома
лимфоидных клеток Лимфома Беркитта
Диффузная полиАнгиоиммунобластная лимфома
морфноклеточная
Лимфома из клеток с иммунофенотилимфоидная проли- пом периферических Т-лимфоцитов.
ферация
неуточненная
Экстранодальная NK/T-клеточная
лимфома, назальный тип
Классическая лимфома Ходжкина, с
Диффузная пролиистощением лимфоидной ткани
ферация анаплазированных лимфоид- Анапластическая крупноклеточная
лимфома
ных клеток
Лимфогранулемато- Классическая лимфома Ходжкина.
смешанно-клеточный вариант
зоподобная гистологическая картина Классическая лимфома Ходжкина. нодулярный склероз
Анапластическая крупноклеточная
лимфома
Состав панели
к. A. BCL-2.
Ki-67
CD3poly,
CD5, CDIO.
CD20. CD23.
CyDl
CD3poly.
CDIO. CD20.
Ki-67
CD3polv.
CD4. CD5,
CD8. CD20.
CD30.
CD45R0.
CD56. LMP1
CD3poly.
CD 15. CD20,
CD30,
CD45RB.
CD45R0,
EMA,
ALKl.Clusterin
Общие принципы иммуногистохимического исследования в диагностике лимфом предусматривают применение в каждом случае не
одного какого-либо антитела, а панели антител (набора, составленного в соответствии с диагностической гипотезой, возникшей в результате рутинного гистологического исследования биоптата) и учета
комбинации позитивных и негативных результатов реакции в соответствии с известной информацией о морфологическом строении
опухоли и иммунофенотипе опухолевых клеток.
Неотъемлемым элементом иммуногистохимического исследования в каждом случае должно быть изучение контрольных реакций. Поскольку ложнонегативные результаты встречаются значительно чаще, чем ложнопозитивные, особое значение следует придать проведению исследований с позитивными контрольными
объектами. Особенно удобны позитивные внутренние контрольные
реакции, которые позволяют показать, что реакция с данным антителом прошла успешно.
Глава 9. Иммуногистохимия
217
Для В- и Т-клеточных антигенов это реактивные лимфоидные
клетки, которые всегда есть и в опухолевой, и в неопухолевой лимфоидной ткани. Гранулоцпты дают реакцию с CD 15, а плазматические клетки — с CD30 и ЕМА. Основной причиной ложнонегативных результатов являются артефакты, вызванные фиксацией
тканей. Чл'вствительным индикатором повреждения антигенных
детерминант является реакция эндотелия сосудов с антителами к
виментпну — слабое окрашивание эндотелия указывает на плохую
сохранность антигенов.
Ложноположительные результаты чаще всего возникают из-за
пассивной абсорбции иммуноглобулинов из межклеточной жидкости. В некоторых случаях такая пассивная абсорбция делает невозможным выявление рестрикции легких цепей иммуноглобулинов при моноклональных лимфопролиферативных процессах.
Следует подчеркнуть, что применение классификации ВОЗ опухолей лимфоидной ткани без иммуногистохимического исследования невозможно в подавляющем большинстве случаев.
Литература
Anagnostopoulos I., Hansmann M. L., Franssila К., Harris M., Harris Л'. L.,Jaffe E. S.,
HanJ., van KriekenJ. Л/., Роррета 5., Marafioti Т.. FranklinJ., Sext.ro M., Diehl V..
Stein H. European Task Force on Lymphoma project on lymphocyte predominance
Hodgkin disease: histologic and immunohistologic analysis of submitted cases reveals 2 types of Hodgkin disease with a nodular growth pattern and abundant lymphocytes // Blood. 2000. V. 96. P. 1889-1899.
Ashton-Key M., Thorpe P. A., Allen]. P., Isaacson P. G. Follicular Hodgkin's disease /
/Am. J. Surg. Pathol. 1995. V. 19. P. 1294-1299.
Baitl R., Frisch В., Burkhardt R., Fateh-Moghadam A., Mahl G., Gierster P., Sund M.,
Kettner G. Bone marrow histology in myeloma: its importance in diagnosis, prognosis,
classification and staging // Br. J. Haematol. 1982. V. 51. P. 361-375.
Ben Ezra]., Burke J. 5., Swartz W. G., BrownellM. D., Brynes R. K., Hill L. R., NathwaniB.N., Oken M. M., Wolf В. С, Woodruff R. Small iymphocytic lymphoma:
a clinicopathologic analysis of 268 cases // Blood. 1989. V. 73. P. 579-587.
Benhanoch D., Meguerian-Bedoyan Z, Lamant L, Amin C, Brugieres L.. TerrierLacombe M.J., Haralambieva E., Pulford K., Pileri S., Morris S. W., Mason D. Y.,
DelsolG. ALK-positive lymphoma: a single disease with a broad spectrum of
morphology // Blood. 1998. V. 91. P. 2076-2084.
Bonato M., Pittaluga S., Tierens A., Criel A., Verhoef G., Wlodarska I., Vanutysel L., MichanxL., Vandekerckhove P., Van den B. H., Wolf-Peelers C. Lymph node histology in
typical and chronic Iymphocytic leukemia // Am. J. Surg. Pathol. 1998. V. 22. P. 49-56.
Boroicitz M.J., CrokerB. P., MetzgarR. S. Lymphoblastic lymphoma with t he phenotype
of common acute lymphoblastic leukemia // Am.J. Clin. Pathol. 1983. V. 79. P. 387 39 i.
Bouroncle B. A. Thirty-live years in the progress of hairy cell leukemia // Leuk.
Lymphoma. 1994. V. 14 (Si. 1). P. 1-12.
http://www.bestmedbook.com/
Глава 10
ПРОГРАММИРОВАННАЯ КЛЕТОЧНАЯ СМЕРТЬ
(АПОПТОЗ)
Апоптоз — это процесс программированной клеточной гибели.
Слово «апоптоз» по-гречески означает «опадающий, словно листья
с дерева».
Существуют два вида гибели клеток — некроз и апоптоз. Некроз связан с действием повреждающих агентов, приводящих к
нарушению целостности клеточной мембраны вследствие ее повреждения или формирования пор и к изоляции внутренней среды
клетки от ее окружения. Апоптоз же представляет собой активный
процесс реализации программы ее гибели; он может быть вызван
действием поступающих извне сигналов, которые сами по себе не
являются токсичными или деструктивными. В зависимости от индуцирующих факторов различают несколько вариантов апоптоза,
которые можно дифференцировать по биохимическим проявлениям. Как правило, все эти варианты имеют одинаковые заключительные этапы развития и морфологические проявления.-В иммунной системе чаще других реализуются три формы апоптоза:
апоптоз вследствие дефицита ростовых факторов; апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами и другими сходно действующими агентами; и «активационный» апоптоз, развивающийся вследствие дисбаланса активационных сигналов (Ярилин А. А., 1996).
Апоптоз — это регулируемый процесс, контролируемый множеством вне- и внутриклеточных сигналов, который служит для координированной гибели избыточных, «опасных» или поврежденных соматических клеток. Апоптотические процессы включают
в себя также механизмы, организующие как упаковку, так и удаление остатков клеток, таким образом предотвращая воспаление окружающих тканей. Заболевания, связанные с угнетением апоптоза,
222
Часть 1. Теоретическая гематология
включают в себя рак, аутоиммунные заболевания (например, системную красную волчанку) и многие вирусные инфекции. Заболевания, протекающие с усиленным апоптозом, — это СПИД, нейродегенеративные заболевания, миелодиспластический синдром, ишемические повреждения (инфаркт миокарда), токсический цирроз
печени и др. (Zornig M. et al, 2001).
В отличие от некроза, который, включая воспаление, может вовлекать длинную цепь событий, апоптоз развивается стремительно.
С того времени как клетка получает информацию, чтобы начать
процесс апоптотической гибели, до его завершения проходит лишь
несколько часов. Морфологические признаки апоптоза: уменьшение размеров клетки, ее сморщивание, уплотнение и фрагментация
хроматина. В ядре формируются осмиофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Данные изменения
служат самыми ранними проявлениями апоптоза, предшествующими процессам деградации. На этой стадии прогрессирование
апоптоза может быть приостановлено действием ингибиторов. Данная стадия обозначается как преапоптоз. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называются апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходят
конденсация и сморщивание гранул без их разрушения, расширение эндоплазматического ретикулума. Для апоптоза характерны
потеря ворсинок и нормальной складчатости клеточной мембраны
и формирование пузырей на поверхности клетки. Лизис клеток,
обнаруживаемый по проницаемости для пррпидиума йодида, регистрируется позже, чем события, связанные с фрагментацией хроматина. Так, если признаки фрагментации могут регистрироваться
уже через 1 час после воздействия индуктора, то проникновение
пропидиума йодида — только через 3-5 часов.
Апоптоз, в отличие от некроза, когда гибнут одновременно массы соседствующих клеток, развивается изолированно в единичных
клетках. Если при некрозе клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что может привести к развитию и прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные
явления отсутствуют. Клетки, подвергшиеся апоптозу, и апоптотические тельца быстро фагоцитируются, причем не только макрофагами, но и «непрофессиональными» фагоцитами, например мезангиальными клетками почек.
Одно из основных проявлений апоптоза реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК (700,200-250,50 -70 тыс. пар осно-
Глава 10. Программированная клеточная смерть (аноптоз)
223
ваний), несколько позже — 30-50 тыс. пар оснований. Уже на этой
стадии регистрируются конденсация хроматина и выпячивание
ядерной мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно этот начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после которого процесс становится
необратимым. Заключительный этап фрагментации ДНК — ее межнуклеосомная деградация, т. е. расщепление в результате формирования разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 пар оснований. Именно эти фрагменты
выявляются в виде «лесенки» при электрофорезе ДНК, который
широко используется в качестве метода идентификации апоптоза.
Деградация ДНК обусловливает выход в растворимую фазу низкомолекулярных фрагментов ДНК — полидезокснрибонуклеотидов, определение которых также используется для регистрации
апоптоза. Межнуклеосомная деградация ДНК происходит с участием CaL>*, Mg^-зависимой эндонуклеазы.
К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию сериновых и цистеиновых протеаз, или каспаз
(CASPASES — Cysteine Aspartate-Specific Proteases). Эти протеазы ответственны за систематическое лишение оболочки тех клеток, которые становятся комиттированными к гибели. Каспазы
являются рдними из наиболее специфичных протеаз, и это свойство делает их особенно подходящими для тонкой регуляции контроля протеолиза в процессе апоптотической гибели. С 1993 г. было
идентифицировано более 12 каспаз, играющих ключевую роль в
инициации или реализации апоптоза. Каспазы синтезируются в
виде про-ферментов-предшественников, которые затем переходят
в активные формы в результате протеолиза. Ключевая роль каспаз
в реализации апоптотической программы делает их очевидными
терапевтическими мишенями для контроля за неадекватным апоптозом. Повышенная активность каспаз ускоряет процессы апоптоза, что может лежать в основе таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Так, каспаза-3 и -12 участвуют в тфотеолитическом расщеплении амилоид-р прекурсорного протеина при болезни Альцгеймера и образовании апоптоз-индуцирующего амилоидогенного Ар-пептида.
Инактивация каспаз может также ускорять онкогенез.
Большинство внешних сигналов к развитию апоптоза являются
физиологическими. Pix источниками служат глюкокортикоиды,
антигены или их аналоги — некоторые цитокины (фактор некроза
опухолей альфа (ФНОа), интерфероны). Существует индуктор с
единственно направленными на осуществление апоптоза функци-
224
Часть 1. Теоретическая гематология
ями — Fas-лиганд (FasL) и Fas-рецептор (Fas, APO-1, CD95). Fasантиген является трансмембранным гликопротеином I чина, состоящим из 335 аминокислот, с молекулярным весом 36 кД. Он
имеет структурную гомологию с рецепторами ФНО и фактора роста нервов, экспрессируется на многих типах клеток, включая как
лимфоидные, так и нелимфоидные ткани, в том числе сердца, печени, почек и яичников, причем экспрессия Fas усиливается при
активации клеток. Внутриклеточный домен Аро I/Fas структурно
гомологичен «домену гибели» рецептора ФНО и является необходимым для передачи апоптотического сигнала. FasL — трансмембранный протеин II типа, массой 40 кД семейства ФНО. Он
экспрессируется преимущественно на активированных Т-клетках,
В-клетках, естественных киллерах, тканях яичка, передней глазной камеры, почки, легкого. Мембраносвязанная форма FasL может в результате действия металлопротеиназы конвертироваться в
растворимую форм)', которая может действовать как патологический агент, вызывая повреждение тканей (Berke G., 1997).
Гены Fas и FasL выполняют критические функции в осуществлении апоптоза, неоходимые для развития, функционирования-и
регуляции иммунной системы. Эти функции включают в себя делецию аутореактивных Т-клеток, наряду с элиминацией актвированых Т-клеток. Неожиданным оказался тот факт, что FasL может
играть важную роль в лммунопривилегированных сайтах, являющихся уникальными анатомическими образованиями, где гнетонесовместимые или злокачественные ткани могут длительно существовать.
Способность различных ростовых факторов, включая цитокины, защищать клетки от развития апоптоза хорошо известна для
развивающихся кроветворных клеток. В случае апоптоза лимфоцитов (активационного и индуцированного кортикоидами) показан защитный эффект интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4,
ИЛ-7, у-интерферона, тогда как ФНОос является апоптогенным
фактором.
В реализации апоптоза участвует система циклического АМФ
(цАМФ), повышение уровня которого внутри клетки вследствие
активации аденилатциклазы и фосфолипазы А2 или ингибирования фосфодиэстеразы цАМФ может стать сигналом к быстрой
фрагментации ДНК и гибели клеток. Эффект цАМФ реализуется
через активацию протеинкиназы А. Непосредственной причиной
гибели клеток при апоптозе служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации полп(АОР-рибоза)полимеразы в ответ на повреждение ДНК.
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз)
9')-
Функцию регуляторов выбора клетками, содержащими множественные разрывы ДНК (например, вследствие действия радиации), между вступлением в цикл (с последующей гибелью) и остановкой в фазе G, выполняют продукты протоонкогенов — ранний
актнвационный белок с-птус и онкосупрессор р53. В обычных условиях активации экспрессия с-шус сопутствует выходу клеток в
цикл. При удалении ростовых факторов его экспрессия ослабляется п клетка задерживается в фазе Gr В случае повышенной экспрессии с-пгус на фоне устранения ростового фактора клетки входят в S-фазу и подвергаются апоптозу.
Белок р53 играет важную роль, в норме являясь отрицательным
регулятором пролиферации клеток; те же клетки, в которых р53
инактивирован, имеют преимущество в ростовых потенциях. Утрата или мутации его гена приводят к подавлению апоптоза и в то
же время — к учащению развития опухолей после действия ионизирующей радиации. Наоборот, трансфекция гена р53 в опухолевые клетки обусловливает их апоптоз. После действия факторов,
вызывающих повреждение ДНК (радиация, УФ-излучение), экспрессия р53 в клетках существенно усиливается. Под влиянием
р53 клетки, имеющие множественные разрывы ДНК, задерживаются в фазе G,, а если входят в S-фазу (например, в случае опухолевой
трансформации), то подвергаются апоптозу. Мутации гена р53 позволяют таким клеткам сохранять жизнеспособность в митозе, что
чревато выживанием клеток, подвергшихся опухолевой трансформации; при этом опухолевые клетки оказываются резистентными
к лучевой и химиотерапии (Tokino Т., Nakamura Y, 2000). Мутация
гена р53 обнаруживается более чем в половине случаев злокачественных опухолей, частота ее повышается при длительной химиотерапии. У детей мутация р53 чаще наблюдается при остром лимфобластном лейкозе, составляя около 12%, и всегда является неблагсшриятным прогностическим фактором.
Активная природа апоптоза и родство его сигнальных путей с
активационными предполагают существование внутриклеточных
механизмов ингибирования апоптоза, а также возможность создания подходов к его модификации, в том числе медикаментозной.
Наиболее известным ингибитором апоптоза является ген bcl-2, продукт которого имеет молекулярную массу 26 кД и экспрессируется
на мембране митохондрий и в меньшей степени — на поверхности
клеток. Вс1-2 был сначала идентифицирован в клетках В-клеточной лимфомы (отсюда его название — B-cell lymphoma) как результат хромосомной транслокации t( 14; 18), ведущей к высокой
экспрессии Вс1-2 в этих опухолях. Вс1-2 содержится в юных крове8 Гематология. Нов. справочник
226
Часть 1. Теоретическая гематология
творных клетках, про-В-лимфоцитах, CD4 CD8 тимоцитах, зрелых долгоживущих Т- и В-клетках, клетках памяти. Вне кроветворной и иммунной систем bcl-2 обнаруживается в быстро делящихся эпителиальных клетках, клетках секреторного эпителия,
нейронах. У этого гена есть гомолог-антагонист — bcl-x (или Ьах),
экспрессия которого предотвращает развитие апоптоза, но может
также отменять защитное действие bcl-2. Белок Вс1-2 препятствует повышению концентрации Са2' в ядре, необходимого для запуска апоптоза. Однако иногда в результате различных генетических
процессов (чаще всего — хромосомных транслокаций) ген bcl-2
претерпевает неадекватную активацию, приводящую к гиперпродукции белка Bcl-2 в различных клеточных популяциях, в результате чего клетки теряют способность к своевременному отмиранию. Появление среди них клеток с опухолевой трансформацией
приводит к неконтролируемому росту и развитию злокачественного процесса. Кроме того, белок Bcl-2 играет одну из главных ролей
в развитии химиорезистентности.
Повышенный синтез Bcl-2 обнаруживается в большинстве случаев В-клеточных фолликулярных лимфом и в 1/3 случаев диффузных крупноклеточных лимфом. Уровень Bcl-2 повышен при
широком спектре онкологических заболеваний, включая рак молочной железы, простаты, толстого кишечника и легкого.
Развитию лимфопролиферативных процессов способствуют
ситуации, при которых ослабляется апоптотическая элиминация
генетически дефектных клеток, в норме контролируемая белком
р53. Это может происходить не только при мутации соответствующего гена, но и в связи с ослаблением других механизмов реализации апоптоза. Так, при хроническом лимфолейкозе, волосатоклеточном лейкозе, лимфомах, лимфогранулематозе обнаружено
ослабление активности Са~*-, Mg-'-зависимой эндонуклеазы, что
может способствовать развитию злокачественной лимфопролиферации. Связь между апоптозом и злокачественными новообразованиями проявляется еще и формированием множественной лекарственной резистентности при повышенной экспрессии факторов,
подавляющих развитие апоптоза — продуктов генов bcl-2, bcl-x и
ингибиторов каспаз.
Генетически обусловленные нарушения апонтотического механизма приводят к развитию заболевания с очерченной клинической и иммунологической картиной, которое получило название
аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома (АЛПС). Вначале св. зь подобного синдрома с дефектом апоптоза была обнаружена у лабораторных животных: в 1978 г. описана мышиная линия,
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз)
227
характеризовавшаяся лимфоаденопатией, спленомегалией и аутоиммунными нарушениями. Соответствующая аутосомно-рецессивная мутация, открытая в 1991 г., получила название 1рг
(lymphoproliferation). Далее было установлено, что данная мутация относится к гену Fas. Вскоре в гене FasL была обнаружена
другая мутация со сходным фенотипом, названная gld (generalized
lymphoproliferative disease). У линейных lpr- и gld-мышей наблюдалась высокая продукция аутоантител классов IgG и IgM, кроме
того, у них обнаруживались анти-ДНК-антитела и ревматоидный
фактор; эти животные погибали от нефрита и артрита.
У человека хроническая лимфоаденопатия, симулирующая злокачественную лимфому, в сочетании с аутоиммунными проявлениями была описана еще в 1967 г. и названа синдромом CanaleSmith. В 1995 г. были обнаружены мутации в гене Fas у больных
lpr-подобным синдромом, затем эти мутации удалось выявить у
многих больных с синдромом Canale-Smith (Rieux-Laucat F. et al.,
1995). В последующем были описаны случаи АЛИС без мутации в
гене Fas; так, обнаружена мутация в гене FasL у больного системной красной волчанкой в сочетании с лимфопролиферацией.
Методы терапевтического воздействия на процессы апоптоза
Уничтожение опухолевых клеток под действием химиолрепаратов основано на генерации различных повреждений, ко орые
клетка интерпретирует как сигнал к запуску апоптотической программы. Для реализации этой программы необходимы следующие
условия: проникновение препарата в клетку, создание адекватной
внутриклеточной концентрации активной формы препарата; наличие внутриклеточных мишеней, воспринимающих действие препарата и включающих при этом программу апоптоза; возможность
для опухолевой клетки осуществить генетически детерминированную программу самоуничтожения.
Наиболее чувствительны к внешним неблагоприятным воздействиям клетки в фазе синтеза ДНК, наименее — в G(|- фазе. Противоопухолевые препараты включают апоптоз в основном через две
сигнальные системы: через ген р53 и через Fas-рецептор/ФНО.
Антрациклиновые антибиотики, проникнув в плазматическую мембрану, участвуют в запуске механизма CD95 (Раз)-индуцированного апоитоза. Указанные препараты вызывают блок G,-M фазы в
низких концентрациях и аккумуляцию клеток в середине S-фазы
при высоких концентрациях. Например, идарубицин вызывает
апоптоз опухолевых клеток в 5 раз эффективнее, чем дауноруби-
228
Часть 1. Теоретическая гематология
цин. Пусковым механизмом апоптоза, связанным с индукцией FAS/
ФНО-региона, может являться в некоторых случаях и образование активных форм кислорода (ROS — Reactive Oxygen Species).
Алкалоиды, в частности, винкристин, в низких дозах способны
вызывать увеличение экспрессии гена Ьах, который участвует в
запуске апоптоза, и блокировать путем гиперфосфорилирования
ген bcl-2. Антиметаболиты, в частности цитозар, вызывают апоптоз в G, - и S-фазе клеточного цикла.
Опухолевые клетки, в том числе и лейкемические, имеют свои
метаболические особенности, связанные, как правило, с нарушениями в механизмах апоптоза. Эти нарушения могут способствовать тому, что опухолевая клетка не будет элиминироваться даже
при наличии в ней повреждений, вызванных химиопрепаратами.
Дефекты механизмов апоптоза должны отражаться на чувствительности лейкозных клеток к химиопрепаратам. Выявление плохой чувствительности к ним в тестах in vitro в сочетании с низким
уровнем спонтанного апоптоза бластных клеток в дебюте заболевания при остром лейкозе дает основания для прогнозирования
развития лекарственной резистентности и коррекции тактики терапии (перевод на лечение по высокому риску) (Астрелина Т. А.,
2000).
Установление при опухолях мутаций, ведущих к снижению апоптоза, имеет не только академический интерес, но и ведет к развитию новых способов противоопухолевой терапии, т. е. мутации
генов, контролирующих процессы клеточной гибели, нарушают
чувствительность опухолевых клеток к воздействию противоопухолевых препаратов, механизм действия которых связан с индукцией апоптоза. Так, например, эффективность химиотерапии может зависеть от уровня экспрессии Вс1-2 опухолевыми клетками.
Подход, направленный на снижение Вс1-2 с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, уже показал обнадеживающие результаты в доклинических и клинических испытаниях.
Метод краткосрочного культивирования клеток опухоли in vitro
в присутствии химиотерапевтических препаратов для оценки эффективности их действия в качестве индукторов апоптоза находит
все более широкое применение как в России, так и за рубежом.
Данный тест достаточно прост и удобен для определения чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам. Так, в США
действует специальная программа рациональной противоопухолевой терапии, которая предполагает определение в лабораторных
условиях чувствительности опухолевых клеток конкретного больного к индукции апоптоза различными противоопухолевыми пре-
Глава 10. Программированная клеточная смерть (апоптоз)
229
паратами. Это позволяет не только выбрать оптимальную схему
терапии, но и исключить применение препаратов, которые неэффективны в тестах in vitro (Абраменко И. В., Фильченков А. А.,
2003).
Основные методы определения апоптоза
1. Учет апоптотических клеток по характерной морфологии ядра
(конденсированный и фрагментированный хроматин) с использованием флуоресцентных красителей акридинового оранжевого и
этидиум бромида и флюоресцентного микроскопа.
2. Выявление изменений в плазматической мембране с помощью белка аннексина V. В апоптотических клетках фосфолипид
фосфатидилсерин (ФС) переориентируется и локализуется на поверхности клеточной мембраны. Его локализация на мембране наблюдается, начиная с ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Связываясь с ФС на поверхности клетки, аннексии V,
конъюгированный с флуорохромом, служит маркером апоптоза.
Обычно аннексии V используют в комбинации с пропидиум йодидом (ПИ), что позволяет определять одновременно интактные клетки, клетки в раннем апоптозе (положительные по аннексину V и
отрицательные по ПИ) и в «позднем» апоптозе или в некрозе (положительные и по аннексину V, и по ПИ).
3. Определение межнуклеосомной деградации (фрагментации)
ДНК — регистрация образования «лесенки» ДНК с помощью гельэлектрофореза.
4. Оценка фрагментации ДНК in situ в гистологических срезах —
TUNEL-метод, основанный на флюоресцентной метке окончаний
отрезков ДНК (З'-ОН-окончания, образовавшиеся в результате
фрагментации ДНК) с использованием биотин-конъюгированного дезоксиуридинтрифосфата (dUTP) в реакции, катализируемой
экзогенной терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT).
5. Определение экспрессии Fas-антигена на поверхности клетки с помощью моноклональных антител к CD95. Это позволяет, с
использованием проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии, выявить популяцию клеток, несущих Fas-антиген, т. е.
потенциально способных вступить в апоптоз.
6. Определение экспрессии внутриклеточного bcl-2 с помощью
моноклональных антител и проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии.
Таким образом, апоптоз является одним из основных механизмов поддержания тканевого гомеостаза. Особенно важен этот ме-
230
Часть 1. Теоретическая гематология
ханизм для иммунной и кроветворной систем, так как с его помощью осуществляется контроль клеточной пролиферации и элиминация аутоагрессивных клонов. Изучение факторов, модулирующих развитие апоптоза, может стать основой для разработки подходов к фармакологическому контролю апоптоза, который играет
важную роль в развитии многих заболеваний.
Литература
Абраменко И. В., Фильченков А. А. Оценка параметров апоптоза в диагностике
онкологических заболевании, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопросы онкологии. 2003. Т. 49. № 1. С. 21-31.
Астрелина Т. А. Механизм действия антилейкемических препаратов при лечении острых нелимфобластных лейкозов // Гематология и трансфузиология.
2000. Т. 45, № 4. С. 34-38.
Ярилин А. А. Агюптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996.
№ 6 . .С. 10-23.
Berke G. The Fas-based mechanism of lymphocytotoxicity // Human Immunol.
1997. V. 54, N 1 . P. 1-7.
Rieux-Laucat F., LeDeist F., Hivros C. et al. Mutations in Fas-associated with human
lymphoproliferative syndrome and autoimmunity// Science. 1995. V. 268. P. 13471358.
Tokino Т., Nakamura Y. The role of p53 target genes in human cancer // Critical
Review in Oncology/Hematology. 2000. V. 33. P. 1-6.
Zornig M., Hueber A., Baum W., Evan G. Apopiosis regulators and their role in
tumorigenesis// Biochimicaet Biophysica Ada. 2001. N 1551. P. 1-37.
Глава 11
СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА
Более 125 лет прошло со времени опубликования (1876 г.) Александром Шмидтом ферментативной теории свертывания крови,
которая до сих пор является основой современного представления
о данном процессе. Открытие фибриногена в 1856 г. и знаменитая
триада Р. Вирхова о патогенезе тромбозов, сформулированная в
том же году, до сих пор актуальны.
Триада Вирхова:
• нарушение поверхности (сосудистой стенки);
• замедление кровотока (стаз);
• аномалия клеточных и плазменных составляющих крови.
В основу первой схемы свертывания крови были положены
4 фактора, включающие I — фибриноген, II — протромбин, III —
тромбопластин, IV — ионы кальция и 2 стадии свертывания крови — тромбиногенез и фибринообразование.
В 1964 г. был завершен процесс формирования современной
теории свертывания крови (R. G. Macfarlane), основанной на последовательной активации плазменных факторов свертывания, так
называемой теории ферментативного каскада. Указанная теория
включала 3 фазы (стадии):
I — образование протромбиназы (тромбопластина);
II — превращение протромбина в тромбин — тромбиногенез;
III — трансформация фибриногена в фибрин.
В это же время были открыты основные плазменные прокоагулянты, факторы системы фибринолиза и физиологические ингибиторы (антитромбопластины и антитромбины), принята международная номенклатура. На протяжении последующих почти 40 лет
уточнялись детали ферментативного каскада. Принято сч итать. что
активация прокоагулянтов и образование активной протромбиназы происходит двумя путями: внутренним (кровяным) и внешним
(тканевым) (рис. 17).
Часть 1. Теоретическая гематология
232
ПДФгТ]^
X.Y
D.E
>
,
!пЛАТМИН
Ингибитор активатора
плазминогена (PAi-l;
I
Тканевый зхтиватор
плазминогена (t-PA)
L
Плззминоген
вмкАРС - зктиеироззнный
| протеин С
ПДФн:
DIM-;
DYft D
DXD/YY
Активатор плазминогека
урокиназного типа fu-PA)
Активация
Ингибирова!-(ие
•••-••••••••.
Деградация
Комплекс +
Рис. 17. Схема свертывания крови
.^-.-.гг^
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
233
Новая трактовка процесса свертывания крови, предлагаемая в настоящее время, основанная на активации системы гемостаза, утверждает тканевой путь (внешний) и исключает кровяной.
При этом тканевой фактор и ингибитор активации тканевого пути
признаются важнейшими в инициации и регуляции гемостаза
(RoldeH.J.,2001).
Идея иервно-гуморалыюй регуляции свертывания крови была
высказана задолго до создания данной теории. В 1914 г. Н. В. Cannon, Н. Gray, W. L. Mendelhall показали, что инъекции адреналина
или раздражение чревных нервов вызывают ускорение свертывания крови. В 60-70 гг. XX столетия была открыта регулирующая
роль нервно-гуморальной противосвертывающей системы. В настоящее время система гемостаза рассматривается как совокупность и взаимодействие компонентов крови, стенки сосудов и органов, принимающих участие в синтезе и разрушении факторов,
обеспечивающих резистентность и целостность сосудистой стенки, остановку кровотечения при повреждении сосудов и жидкое
состояние крови в сосудистом русле. При этом многие гуморальные компоненты системы гемостаза синтезируются клетками различных органов, а их функция осуществляется экстрацеллюлярно.
Система гемостаза является частью клеточно-тканевого гомеостаза.
Саморегулирующаяся клеточно-гуморальная система гемостаза с обратной связью обеспечивает оптимальную для кровообращения вязкость крови и целостность сосудистого русла, необходимые для жизни и функционирования всех органов и систем организма, а при повреждении тканей в экстремальных ситуациях
(травме, операции) — образование тромба для остановки кровотечения, сохранения жизни, реконструкции сосудов и заживления ран.
Данная система обеспечивает оптимальную текучесть крови и
оптимальное агрегатное состояние жидкой крови, необходимые
для осуществления жизнеобеспечивающего кровообращения, несмотря на наличие в крови мощного гемостатического потенциала.
Важной функцией системы гемостаза является остановка кровотечения при повреждении сосуда, образование тромба, лизис тромба,
восстановление целостности сосуда и непрерывности циркуляции
крови.
Систему гемостаза обычно принято изображать, как показано
на рис. 18, в виде уравновешенных весов (норма-коагуляция).
Колебания гемостатического потенциала в диапазоне определенных величин являются нормальными. Отклонения от нормы,
234
Часть 1. Теоретическая гематология
Гиперкоагуляция
Норма
Гипокоагуляция
Рис. 18. Система гемостаза
сдвиги в оценочных лабораторных реакциях расценивают как гиперкоагуляцию (активация системы гемостаза или увеличение количества прокоагулянтов, снижение фибринолиза) — склонность
к тромбозам; гипокоагуляция (ингибиция или истощение — снижение концентрации свертывающих факторов, активация фибринолиза) '— склонность к кровоточивости. При оценке состояния
фибринолиза должна быть применена противоположная трактовка, так как его действие имеет антагонистическую направленность.
Для оценки состояния гемостаза необходимо определять активность и количество клеточных и плазменных компонентов этой
системы в циркулирующей крови. При этом снижение функции
(активности) вышеуказанных компонентов, зависящей от многих
причин, может вызывать клинические проявления (тромбозы или
кровотечения) иногда даже на фоне отсутствия количественного дефицита (нарушение продукции или истощение-потребление
/consumption/ в ходе диссеминированного внутрисосудистого свертывания). Точная диагностика указанных нарушений в системе
гемостаза определяет тактику корригирующей терапии. При этом
определяется необходимость применения фармацевтических
средств, направленных на стимуляцию или ингибицию нарушенной активности. Восполнение количественного дефицита возможно замещением препаратами или гемокомпонентами. Основные
компоненты, входящие в систему гемостаза, представлены на
рис. 19.
Остановка кровотечения при повреждении тканей зависит от
всех составляющих компонентов системы гемостаза. Однако различают первичный гемостаз, осуществляемый за счет сосудистотромбоцитарного звена, и вторичный -•• окончательную остановку
кровотечения за счет формирования прочного тромба с участием
плазменных компонентов гемостаза, превращения фибриногена в
фибрин. Общим оценочным тестом, характеризующим сосудистотромбоцитарный гемостаз, является «длительность кровотечения».
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
235
ПЛАЗМЕННЫЕ ФАКТОРЫ
Прокоагулянты (система свертывания крови)
Эндогенные антикоагулянты (противосвертывающая система)
Фибринолитическая система (субстрат, активаторы и ингибиторы)
СОСУДИСТАЯ СТЕНКА
эндотелий
мезотелий
тучные клетки
КЛЕТКИ КРОВИ
тромбоциты
эритроциты
лейкоциты
Рис. 19. Система свертывания крови
определяемая как время от момента стандартного укола или пореза до остановки кровотечения.
Соотношение жидкой и клеточной частей крови — гематокрит
(Ht) — определяют путем сопоставления их объемов после разделения центрифугированием в капилляре нестабилизированной крови (норма — 45-55 л/л). Отклонения этого показателя от нормы
влияют на конечный результат гемокоагуляции.
При извлечении крови из сосудистого русла жидкая кровь свертывается, при этом образуются сгусток, сыворотка, 3-я фракция
крови (выпавшие из сгустка эритроциты). Скорость этого процесса и соотношение фракций зависят от качества поверхности (пробирки, предметного стекла, кюветы прибора и т. д.), с которой соприкасается кровь, и совокупности всех гуморальных и клеточных
компонентов системы гемостаза.
Время свертывания крови (по: Lee&White) — это общий оценочный тест: время свертывания 1 мл венозной крови в стеклянной пробирке (норма — 6-10 минут). Данный тест можно проводить вручную с помощью секундомера или специальным прибором — фибринтаймером.
Сыворотку крови, полученную после образования сгустка в пробирке, используют для определения различных биохимических,
иммунологических, серологических или изосерологических характеристик крови. У здорового человека фибриноген как основной
субстрат, образующий сгусток, в сыворотке не содержится, и все
факторы свертывания крови определяются в плазме.
Плазменные факторы свертывания крови — прокоагулянты.
Для получения плазмы необходимо сохранение крови в жидком
состоянии после извлечения ее из сосудистого русла. «Стабилизировать» кровь, предотвратить ее спонтанное свертывание можно
236
Часть 1. Теоретическая гематология
путем связывания необходимых для коагуляции ионов кальция.
Это осуществляют двумя способами: добавляют растворы солей,
связывающих кальций (смешивают с раствором цитрата натрия,
трилона Б и другими), или удаляют из крови ионы кальция с помощью ионообменных сорбентов. Гепарин, часто используемый для
стабилизации крови, предотвращает свертывание крови более сложным способом, ингибируя тромбиногенез, действие тромбина и
связывая кальций (для исследования системы гемостаза стабилизация крови гепарином не используется).
Плазмой крови называют жидкую часть стабилизированной или
консервированной крови, отделенную отстаиванием или центрифугированием от эритроцитов и других клеточных элементов. В зависимости от режима и условий центрифугирования получают различную плазму: богатую или бедную тромбоцитами (PRP — platelet
rich plasma, PPP — platelet poor plasma), которые используют для
исследования активности плазменных компонентов гемостаза и
функции тромбоцитов. Тринадцать плазменных факторов свертывания крови обозначают римскими цифрами, а тромбоцитарные —
арабскими цифрами.
Факторы свертывания крови находятся в циркулирующей крови и в плазме в неактивном состоянии. Для обозначения активированного фактора свертывания крови к цифре добавляют букву «а».
Перечень общепринятых факторов и их обозначения представлены в табл. 6.
Таблица 6
Плазменные факторы свертывания крови,
номенклатура международного комитета по тромбозу и гемостазу,
1954-1957 гг.а
Знак
в номенклатуре
Название
FI
Фибириноген
FII
Протромбин
Fill
Тканевой
фактор тромоопластин
Молекулярный
вес,Д
340 000
Концентрация
в плазме
крови
2-4 г/л
70 000
0,1-0.15 г/л
Нет в циркуляции
Место синтеза
(особенности)
Печень (термолабилен;
преобразуется
в фибрин)
Печень (необходимо присутствие витамина К;
преобразуется
в тромбин)
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
237
Продолжение таблицы 6
Знак
в номенклатуре
FIV
Кальций
FV
Проакцсллерин
FVI
Лкпеллерин
FV1I
Проконвертин
60 000
FVIII
AHF
Антигемофильный фактор (гемофилия А)
270 000340 000
0.5 мг/мл
Эндотелий, печень (в комплексе с фактором
Виллебранда)
FIX
КристмасфактОр (гемофилия В)
72 000
3 мг/мл
Печень (необходимо присутствие витамина К)
FX
Фактор Стюарт-Прауэра
55 000
10-15 мг/мл
Печень(необходимо присутствие витамина К;
активирует протромбин)
FXI
РТА
Плазменный
усилитель
тромбопластина
160 000
5 мг/мл
Печень (термолабилен)
FXII
Фактор контакта Хагемана
110 000
FXI1I
Фибринстабилизирующий
фактор (ФСФ)
340 000
Название
Молекулярный
вес, Д
Концентрация
в плазме
крови
Место синтеза
(особенности)
0,9-0,11 г/л
Другие двухвалентные катионы
270 000
5 15 мг/мл
Печень (самый
лабильный фактор)
—
—
Активированная
форма FV
Печень (необходимо присутствие витамина К;
стабильный)
Активируется
коллагеном калликреином и субэндотелием,
инородной поверхностью.
Активирует
свертывание и
фибринолиз
20 мг/мл
Печень (поли-,
меризует фибрин-мономер
в полимер)
Не имеют номера цифрового обозначения прекалликреин —
фактор Флетчера и высокомолекулярный киншюген — фактор
238
Часть 1. Теоретическая гематология
Фицжеральда, которые связывают калликреин-кининовую и свертывающую системы крови.
Факторы II, VII, IX, X и ингибиторы свертывания протеины С
(PC) и S (PS) синтезируются в печени, при их синтезе необходимо
присутствие витамина К. Белки, обнаруженные в плазме при отсутствии витамина К, получили название PIVKA (protein induced
by vitamin K absence) протеины.
Последовательная активация плазменных факторов — ферментативный каскад свертывания крови — представлен схематически
на рис. 17.
Активация системы гемостаза и так называемое постоянное
внутрисосудистое свертывание контролируется противосвертывающей системой эндогенных антикоагулянтов. Теоретически при
свертывании 1 мл крови может образоваться 150 ед. тромбина, и
чтобы свернуть всю циркулирующую кровь человека (5 л), было
бы достаточно тромбина, полученного из 10 мл крови. Однако практически этого не происходит, так как в кровеносном русле образуется тромбина не более 10-15 ед/мл, и он очень быстро нейтрализуется. Тромбинообразование и диссеминация внутрисосудистого
свертывания (ДВС) в физиологических условиях сдерживается
действием эндогенных антикоагулянтов.
Физиологические ингибиторы коагуляции. Основная группа
гуморальных ингибиторов — серпины — это ингибиторы сериновых протеаз системы свертывания крови. К ним относятся:
• антитромбин III (ATIII);
• al-ингибитор протеиназ (al-антитрипсин);
• а2-макроглобулин;
• кофактор II гепарина — антитромбин II (АТП), ингибитор Ха.
зависимый от протеина Z (ZPI);
• протеазный нексин 1.
Главными естественными ингибиторами Ха-фактора и всех сериновых протеаз (более 95%), участвующих в каскаде гемокоагуляции, является антитромбин — GAG-комплекс (антитромбпны
Ш и II — кофакторы клеточных и плазменных гликозаминогликанов (GAG), тромбомодулина). Конформационная стабильность
комплекса возрастает при участии низкомолекулярных гепаринов,
что делает эти препараты гепарина антикоагулянтом выбора при
лечении.
Особое место в ограничении активации каскада гемокоагуляции занимает система протеина С (PC), действующего совместно с
протеином S (PS) и тромбомодулином (ТМ) сосудистой стенки.
Активированный минимальными дозами тромбина PC (АРС) пред-
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
239
отвращает чрезмерную активацию плазменных FVa и FVIIIa. Резистентность к протеину С, обозначаемая как АРС-резистентность,
связана чаще всего с мутацией гена FV, что приводит к развитию
тромбозов и тромбоэмболии.
Кроме того, в ограничении активации гемостаза и нейтрализации образовавшегося тромбина участвуют 6 антитромбинов (AT),
обозначаемых римскими цифрами:
• AT I — фибрин;
• AT II — кофактор дерматан-сульфата, 2-й кофактор гепарина;
• AT III — 1-й кофактор гепарансульфата и других гликозаминогликанов;
• AT IV — патологический ингибитор тромбина при коллагенозах;
• AT V — в комплексе с AT IV при патологии соединительной
ткани;
• AT VI — продукты деградации (фрагменты) фибриногена и
фибрина (ПДФ), патологический ингибитор, обладающий
антитромбнновым и антитромбоцитарным действием, в зависимости от величины фрагмента.
Фибринолитические компоненты системы гемостаза. В здоровом организме активация коагуляционного каскада, тромбшюгенеза и непрерывное образование микроколичеств фибрина приводят к активации фибринолиза.
Плазминогеп (ПГ) — плазменный ^-глобулин с молекулярной
массой 90 000 Д, синтез которого осуществляется в печени, костном мозге и почках. Период полужизни ПГ в плазме составляет
2,24 суток. Данный компонент имеет большое сродство к фибрину
и под влиянием тканевых активаторов фибрннолиза превращается
в плазмин — протеолитический фермент, который лизирует (расщепляет) фибрин, активирует контактную фазу каскада гемокоагуляции (калликреин-кининовую систему, фактор Хагемана), создавая порочный круг активации свертывания крови и фибринолиза. Этот процесс лежит в основе синдрома диссеминированного
внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром), развития
коагулопатии потребления и фибринолитических кровотечений.
В результате фибринолиза в циркулирующей крови появляются
продукты (фрагменты) деградации фибриногена и фибрина.
Одновременно активный тромбин, являясь сериновой протеазой, расщепляет фибриноген и также образует фрагменты. Каждый фрагмент имеет иммунологическую специфичность, и его наличие может быть выявлено лабораторными тестами. В табл. 7
приведен перечень известных фрагментов, которые определяются
http://www.bestmedbook.com/
210
Часть 1. Теоретическая гематология
иммунологическими методами с помощью специфических антисывороток.
Обнаружение в крови больных фрагментов фибриногена и фибрина, образовавшихся при их расщеплении тромбином и плазмином, позволяет диагностировать ДВС и определить стадию ДВСсиндрома и степень активности фибринолиза еще до появления
клинических признаков.
Таблица 7
Моноклональные антитела к специфическим антигенам
фибриногена и фибрина и к их фрагментам
Реакция
с натнвным
фибриногеном
Тип иммуноглобулина
Фибрин(оген) Аа-цепь (Аа 559-539)
Да
IgGI,k
Фибрин(оген) Аа-цепь (Аа 24-^76)
»
»
Антигенная специфичность
Нет
»
Фибриноген: фибрин I: Вр-цепь (Вр 1-42)
Да
IgG2a. k
Фибрин II; Фибрин 11 Р цепь ((Вр 1-42)
Нет
IgGl.k
Фибрин(оген) у-цепь ф92-406)
»
»
Фибриноген D/фибрин D-димер только
))
»
>)
»
Фибрин(оген) у-цепь (у-15-35)
»
»
Фнбрин(оген) у-цепь (у-95-265)
»
»
Да
»
Фибринопептид A (FPA, Аа 1-16) только
Фибрин(оген) у-цепь (Аа)
Фибрин(оген) Аа-цепь (Аа)
Особая значимость в диагностике ДВС-синдрома придается
выявлению Д-Димера. Переход п.тазминогена в плазмин происходит под влиянием активаторов плазминогена, таких как тканевой
активатор плазминогена (t-PA) и урокиназный активатор плазминогена (и-РА).
Кроме того, активация фибринолиза происходит через контактную фазу (фактор XII) и через иммунную систему (комплемент).
К физиологическим ингибиторам фибринолиза относятся антиактиваторы (ингибитор активатора п.тазминогена — PAI), ингибиторы плазмина (а2-антиплазмин, а-2-макроглобулин, cd-антитрипсин и комплекс антитромбин -гепарин).
Помимо специфических активаторов плазминогена фибринолизис вызывается протеазами поджелудочной железы (трипсин,
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
241
хемотрипсин), эластазой, лизосомальными ферментами, ферментами из микроорганизмов и грибов (стрептаза, бриназа, охраза,
триаза и т. д.). При выделении в кровь больших количеств этих
ферментов или при постоянном их поступлении через активацию
контактной фазы коагуляции, калликреин-юшиновой и иммунной системы активируется тромбиногенез, что при недостаточности эндогенных антикоагулянтов и ингибиторов фибринолиза приводит к ДВС. Коагулопатия потребления — нарушение в системе
гемостаза, связанное с образованием микросгустков в сосудистом
русле при генерализованной ДВС, в результате чего возникает дефицит полноценных плазменных прокоагулянтов (снижение количества тромбоцитов, фибриногена и протромбина). При этом
нарушается полимеризация фибрина, полноценный сгусток не образуется.
Сосудистая стенка. Свертывание крови инициируется при повреждениях сосудистой стенки и дисфункциях эндотелия, вызываемых бактериальными токсинами, вирусной инфекцией, цитокинами (TNF, ИЛ-1 и другие), свободными радикалами, иммунными комплексами, острой гииертензией, никотином или другими
токсическими продуктами. Нарушается хрупкий гемостатический
баланс, меняется фенотип эндотелиальных клеток из тромборезистентного в прокоагулянтпое, воспалительное и вазоконстрикторпое состояние. Из телец Вейбела-Пэлейда эндотелия высвобождается 3-селектин и фактор Виллебранда, который связывает коллаген субэндотелия и рецептор тромбоцитов гликопротеин lb, a
затем через повышение внутриклеточного кальция и фактора Виллебранда происходит активация других поверхностных тромбоцитарных гликопротеидов ПЬ/Ша — рецепторов фибриногена и
плазменного фактора Виллебранда. Эти механизмы способствуют
сохранению целостности и функции эндотелия. Постоянное сохранение жидкой циркулирующей крови в сосудистом русле и образование тромба в месте повреждения эндотелия — двойная функция системы гемостаза, которая обеспечивается участием сосудов
в продукции как прокоагуляитных, так и антикоагулянтных субстанций.
Прокоагулянтные свойства сосудов связаны с синтезом:
• фактора Виллебранда (vWF) — кофактора адгезии тромбоцитов — пластинок (platelet), и антигемофилыгого фактора
(FVIII);
• тканевого фактора (TF) — активация коагуляции крови;
• ингибитора активатора плазминогена (PAI-1) — ингибирование фибринолиза.
242
Часть 1. Теоретическая гематология
Антикоагулянтные свойства сосудов обусловлены синтезом:
• простациклинов — ингибиторов адгезии и агрегации тромбоцитов;
• тромбомодулина (ТМ) — кофактора эндогенных антикоагулянтов, и протеина С;
• тканевого активатора плазминогена (t-PA);
• гепарансульфата и других гликозаминогликанов (GAG) —
кофакторов антитромбинов III и II (AT III, AT II), участвующих в нейтрализации тромбина и других сериновых протеаз
ферментативного каскада гемокоагуляции.
В нормальном функционировании системы гемостаза принимают участие практически все клеточные элементы крови и эндотелий. Одна из основных особенностей процесса свертывания локализация его на поверхности поврежденного эндотелия и активированных клеток крови. Эта особенность обусловлена связыванием ферментов (факторов Vila, IXa и Ха) с отрицательно заряженной поверхностью клеток и взаимодействием факторов Vila и
Ха с рецепторами клеток. Установлено, что две сериновые протеиназы и тромбин, а также антикоагулянт протеин С и его кофактор
протеин S имеют рецепторы на мембране клеток. Активация этих
рецепторов приводит к инициации свертывания вследствие образования ферментов и стимуляции синтеза, секреции и экспонирования на мембране клеток новых рецепторов и адгезивных молекул. Как видно из табл. 8, взаимодействие активированных протенназ с клетками в кровеносном русле происходит через тканевой
фактор и другие лиганды.
Установлено, что тромбин и Ха-фактор увеличивают прокоагулянтные свойства эритроцитов, уменьшают их осмотическую и кислотную резистентность и выход из них субстанций, ускоряющих
свертывание крови. Тромбин и Ха-фактор индуцируют функциональную активность иммунокомпетентных клеток, стимулируют
фагоцитарную активность макрофагов и уменьшают их миграционную способность. Усиливая специфическую активность макрофагов, тромбин вызывает секрецию тканевого фактора и активатора плазминогена.
Тромбоциты, или кровяные пластинки platelet (PL) — оба термина приняты в международной номенклатуре. Наибольшее значение в образовании тромба из всех клеток крови имеют кровяные
пластинки.
Основные физиологические функции тромбоцитов: участие в
гемостазе (остановке кровотечения), первичном гемостазе, тромбообразовании и тромболизисе, участие в поддержании целостно-
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
243
Таблица 8
Рецепторы сери новых протеаз и их лиганды в сосудистой системе
(по: Струкова С, М., 2002)
Протеиназа
Рецептор
ФУНКЦИЯ
Фактор
VII/VIIa
Тканевой фактор
(ТФ) (эндотелий, моноциты)
Инициирование свертывания крови
(активация FX-FXa). активация клеток
Фактор Ха
EPR-1 (эндотелий и
др.)
Генерация тромбина, независимая от
FVa. активация клеток
Фактор Ха
МАС-1 (моноциты)
Генерация FXa
Фактор Ха
PAR-2 (эндотелий и
лр.)
PAR-1/-3/-4 (тромбоциты, эндотелий и
лр.)
Активация клеток
Тромбин
Тромбомодулин (эндотелий )
Активация системы протеина С, ингибирование тромбина, активация
TAFI (ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином)
Тромбин
GPIb/X/V
Ускорение свертывания крови на
тромбоцитах, кофактор PAR-1 (протеиназой активируемого рецептора)
Протеин
С/АРС
Протеин S
EPCR (эндотелий)
Кооперация с ТМ (тромбомодулином). ингибироваиие воспаления
Рецептор тирозинкиназ (TYROZ). сосудистые клетки, аннексии
II
Активация клеток
Тромбин
То же
сти эндотелия, в депонировании и транспорте биологически активных веществ.
Эти клетки содержат аналогичные плазме прокоагулянты и сократительный белок (тромбостенин). Активируясь, они изменяют
форму, осуществляют «динамическую» функцию: адгезию (прилипание) друг к другу н к соединительной ткани поврежденной
сосудистой стенки. Затем кровяные пластинки образуют агрегаты
и первичную гемостатическую пробку. Активированные кровяные
пластинки выделяют гранулы (релиз-реакция), содержащие прокоагулянты (тромбопластиновый — 3-й тромбоцитарный фактор и
антигепариновый — 4-й тромбоцитарный фактор, (3-тромбог.тобулин), серотонин, адениновые нуклеотиды и т. д. Тромбоцитарные
мембранные фосфолипиды играют роль матрицы, па которой
активируются плазменные факторы свертывания, фибриноген превращается в фибрин и образуется тромб. Тромбоцитарное звено
гемостаза вносит важнейший вклад в осуществление физиологи-
244
Часть 1. Теоретическая гематология
ческой функции всей системы гемостаза, поэтому с нарушениями
в этом звене системы связана тяжелейшая патология, проявляющаяся в виде геморрагических диатезов и тромбозов.
Клинические манифестации могут быть связаны с изменением
количества тромбоцитов и нарушением динамической или выделительной функции. Тромбоцитопения — это уменьшение количества тромбоцитов (ниже 150 х 109/л), тромбоцитоз или тромбоцитемия — увеличение их количества (выше 350 х 109/л).
Причиной кровоточивости и тромбозов нередко может быть приобретенная тромбоцитопатия — нарушение функциональной активности тромбоцитов, которая может быть измененной при нормальном содержании, а также при сниженном и повышенном их числе.
Тромбоцитарные нарушения могут быть наследственными, связанными с недостатком синтеза различных тромбоцитарных субстанций, гранул хранения или с генетическими дефектами мембранных гликопротеинов. Нарушения тромбоцитарного звена могут быть связаны с дефектами кроветворения. Приобретенные
нарушения тромбоцитарного звена чаще всего являются результатом их активации и истощения при латентно протекающем или
остром синдроме ДВС, спровоцированным инфекционными и вирусными заболеваниями.
Большое значение в осуществлении процессов свертывания крови и поддержания ее в жидком состоянии имеет тканевой фактор
(ТФ) гемостаза, признанный провоцирующим фактором его внутрисосудистой активации. ТФ является трансмембранным гликопротеином, который служит клеточным рецептором и кофактором
для плазменного F Vila, который инициирует коагуляционный
ферментативный каскад, приводя к образованию тромбина и фибрина. Тканевой фактор — член семейства рецепторов цитокинов
II класса, может продуцироваться появившимися циркулирующими моноцитами, стимулированными специфическими факторами
воспаления. Для своей оптимальной функции тканевой фактор
интегрирует с анионными фосфолипидами клеточной мембраны.
Гранулоциты повышают липопротеин-зависимую экспрессию ТФ
в моноцитах.
Экспонирование тканевого фактора на клетках — ключевой
момент свертывания и тромбообразования. Показано, что внешний путь свертывания, запускаемый тканевым фактором, является основным в процессах внутрисосудистого свертывания крови
и тромбообразования, включающего 2 основные фазы (рис. 20):
1-я — триггерная (фаза инициации); 2-я — фаза распространения
(каскад).
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
ТКАНЕВЫЙ
ФАКТОР
Ха
1 TEPI
245
\ia
Рис. 20.
Этот принцип положен в основу новой трактовки механизма
аутоактивации ферментативного каскада свертывания крови. Стимулом для активации внешнего пути свертывания крови служит
экспонирование ТФ на поверхности клеток — рецептора фактора
VII/VIIa, 1% которого находится в кровотоке в активном состоянии, но в конфирмации не способен контактировать с плазменными факторами и активировать их. Комплекс ТФ/VIIa активирует
клетки, вызывая повышение внутриклеточного кальция и фосфорилирование активируемых митогеном протеинкиназ (МАР-киназ), приводя в конечном счете к адгезии клеток и миграции.
246
Часть 1. Теоретическая гематология
Комплекс ТФ/FVIIa активирует FIX, FIXa и FV, FVIII, и процесс переходит в фазу распространения. При этом происходит образование тенназы (комплекса FIXa — FVIIIa), которая активирует комплекс FX/FV на мембранных фосфолипидах (ФЛ) пластинок, что приводит к образованию протромбиназы (комплекса FXa/
FVa), расщепляющей протромбин с образованием тромбина.
Показано, что FXa, взаимодействуя с рецепторами на эндотелии и моноцитах, может стимулировать образование тромбина механизмами, независимыми от ТФ. Активация моноцитов приводит к экспонированию на их поверхности адгезивных белков, а
также FIXa и Ха, что стимулирует появление следов тромбина,
достаточных для активации интегринов аМ|32 (называемых также Мас-1 или CDllb/CD18), принадлежащих к семейству р2-интегринов, которые связывают (наряду с другими белками) FXa.
Катепсин G, освобождающийся из активированных лейкоцитов,
вызывает ограниченный протеолиз FX, мобилизованного на мембранах, превращая его в активную форму, способную преобразовывать протромбин в тромбин. В отличпе от FXa тромбин участвует в
регуляции процессов, направленных как на ускорение свертывания, так и на его торможение (Кудряшов Б. А., 1975).
Тромбин, иммобилизованный на тромбом одул пне, теряет способность свертывать фибриноген и активировать плазменные и
клеточные прокоагулянты, он приобретает новые функции. Так,
тромбин активирует протеины С и S-эндогенные антикоагулянты,
ограничивающие активацию FV и FVIII, и блокирует фибринолиз,
так как активирует ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином TAFI (карбоксипептидаза), тем самым лишая модифицированный фибрин способности связываться с плазминогеном.
Тромбин, взаимодействуя со специфическими рецепторами, стимулирует клетки, участвующие в процессах воспаления и репарации тканей, в том числе моноциты, Т-лимфоциты, клетки эндотелия, гладкомышечные, фибробласты, тучные и нервные клетки.
Активируя семейство протеиназой активируемых рецепторов
(PAR), тромбин стимулирует ряд механизмов передачи сигнала,
конечным результатом которых может быть активация факторов
транскрипции, регулирующих экспрессию тканевого фактора, адгезивных белков, факторов роста, цитокинов и других лигандов,
вовлекаемых в сопряженные процессы воспаления, миграции и
пролиферации клеток.
При очень низких концентрациях тромбин может быть регулятором воспаления, так как блокирует адгезию моноцитов к эндотелию, агрегацию тромбоцитов, освобождая оксид азота из клеток.
Глава 11. Современное представление о системе гемостаза
247
Рецепторы семейства PAR осуществляют связь между протеолитическими системами, участвующими в воспалении, свертывании и фибринолизе.
Коагуляционное и антикоагулянтное звенья гемостаза, действующие через сосудистый эндотелий и тромбоциты, конкурируют
друг с другом за контроль образования тромба. Фибринолитические и антифибринолитические компоненты в нормальных условиях также уравновешивают свое действие. Сосудистый эндотелий и тромбоциты в этих процессах играют важнейшую роль. Непрерывное внутрисосудистое свертывание (НВС) контролируется
нервно-гуморальными физиологическими механизмами (Зубаиров Д. М. А., 1978). Патологическая диссеминация свертывания
крови — ДВС-синдром — развивается в условиях декомпенсации
приспособительных механизмов при длительном или многократном действии провоцирующих активацию гемостаза патологических воздействий и только при наличии дефекта гуморально-рефлекторной регуляции системы гемостаза на фоне наследственной
или приобретенной тромбофилии.
Тромбофилия — термин, определяющий наследственную или
приобретенную склонность к активации гемостаза: тромбозам,
тромбоэмболиям и ДВС. Причиной наследственной тромбофилии
являются генетические дефекты, определяющие синтез патологических молекул факторов свертывания крови (мутации генов протромбина, V фактора Лейден, полиморфизм в генах фибриногена,
тромбоцитарных гликопротеинов, фактора VII, ингибитора активатора плазминогена (PAI), метилтетрафолатредуктазы, ответственной за гипергомоцистеинемию).
Приобретенная тромбофилия возникает на фоне аутоиммунных заболеваний и первичного или вторичного антифосфолипидного синдрома (АФЛС), при котором выработка и накопление аутоантифосфолипидных антител (АФЛА) приводит к диспротеинемиям и нарушению взаимодействия плазменных белков и
мембранных фосфолипидов. Мишенью АФЛА являются тромбоциты и эндотелиальные клетки, поэтому на таком фоне могут развиваться тромбозы и геморрагии. Приобретенная тромбофилия
развивается также на фоне хронических заболеваний печени и почек, которые способствуют нарушению синтеза эндогенных антикоагулянтов (АТШ, эндогенных GAG) и факторов свертывания
крови (фибриногена, протромбина и др.). Наличие тромбофилин
требует постоянного клшшко-лабораторного наблюдения за пациентом, особенно в тех случаях, когда эпизоды тромбозов или геморрагического диатеза уже были у него в анамнезе.
2 48
Часть 1. Теоретическая гематология
Для диагностики нарушений гемостаза в настоящее время используются скрининговые клоттинговые (коагуляционные) тесты:
• протромбиновый индекс;
• активированное парциальное тромбопластиновое время
АПТВ;
• фибриноген;
• эуглобулиновый тест;
• рептилазное (ядовое) время — выявление ингибитора;
• время кровотечения (длительность);
• активность FVIII, FIX;
• активность и антиген фактора Виллебранда;
• активность отдельных прокоагулянтов (факторов свертывания крови), факторов противосвертывающей системы и фибринолиза.
Содержание антигенов факторов системы гемостаза определяется иммунологическими методами.
Маркеры активации гемостаза (маркеры тромбинемии):
• фрагменты протромбина F1+2;
• тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ);
• фибрин-мономер;
• фибринопептид A (FPA);
• антигепариновый фактор кровяных пластинок (Pf4);
• (3-тромбоглобулин пластинок (J3-TG);
• Д-Димер и другие ПДФ.
Таким образом, более чем столетний путь накопления знаний
по проблемам, связанным с физиологией и патологией гемостаза,
позволил уточнить патогенез тромбозов и кровотечений и разработать методы достаточно точной диагностики нарушений в различных звеньях этой системы. Своевременная диагностика и коррекция нарушений гемостаза позволяет избежать локальных нарушений микроциркуляции крови и профилактировать почечную и
сердечную недостаточность, улучшать качество жизни онкогематологических больных.
Литература
Балуда В. П., Балуда М. В., Деяние И. И., Тлепшуков И. К. Физиология системы
гемостаза. Москва, 1995. 243 с.
Баркамн 3. С. Геморрагические заболевания и синдромы. М.: Медицина, 1988.
Бокарев И. Н., Щегютинин Б. М., Ена Я. М. Внутрисосудистое свертывание
крови. Киев: Здоровье, 1989.
Гаврилов О. К. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. М.: Медицина, 1981.285 с.
Часть 2
КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ
Глава 12
АНЕМИИ
Анемия (дословный перевод — бескровие), или малокровие, —
это заболевания и патологические состояния, сопровождающиеся
снижением уровня гемоглобина и (или) эритроцитов в единице
объема крови и, соответственно, снижением гематокрита, отражающего общий объем форменных элементов в крови.
В настоящее время единой общепринятой классификации обширной группы анемических состояний не существует. Анемии
делят на группы в зависимости от ряда признаков. Так, этиологически их подразделяют на врожденные анемии, обусловленные
внутриэритроцитарными факторами (аномалии мембраны, ферментопатии, гемоглобинопатии), и анемии, обусловленные внеэритроцитарными факторами — обычно приобретенные.
По степени тяжести выделяют тяжелую (уровень гемоглобина
75 г/л и ниже), умеренную или среднюю (80-100 г/л) и легкую
(100-110 г/л)анемии.
По эритроцитарным параметрам анемии различают по:
1) размерам эритроцитов — микроцитарные (средний диаметр
эритроцитов — СДЭ — менее 6,7 мкм; средний объем эритроци3
тов — СрОбЭ (MCV) — менее 80 мкм ), нормоцитарные (СДЭ —
3
7-8 мкм; СрОбЭ — 80 -100 мкм ) и макроцитарные (СДЭ — более
7,7 мкм; СрОбЭ - более 95- 100 мкм3);
2) степени насыщения гемоглобином — гипохромные (с цветовым показателем — ЦП — менее 0,85 и средней концентрацией
гемоглобина в эритроцитах — СКГЭ (МСНС) — ниже 30 г/дл),
Глава 12. Анемии
251
нормохромные (ЦП — 0,9-1,1: СКГЭ — 30-38 г/дл) и гиперхромные (ЦП — выше 1,1; СКГЭ — более 38 г/дл).
Число ретикулоцитов как показатель продукции молодых эритроцитов является чувствительным тестом для определения сохранности и адекватности реакции костного мозга на снижение уровня
гемоглобина и эритроцитов в крови. С учетом этого показателя
анемии могут быть разделены на гипорегенераторные (при уровне
ретикулоцитов менее 1 — 1,2% при наличии анемии), связанные с
нарушением продукции эритроцитов в костном мозге, а также нормо- или гиперрегенераторные (уровень ретикулоцитов повышен
умеренно или значительно — до 20-30% и более). Повышение числа ретикулоцитов указывает на то, что малокровие, скорее всего,
обусловлено гемолизом (то есть повышенным разрушением эритроцитов) или кровотечением.
Основной и наиболее часто используемой классификацией является патогенетическая — по ведущему механизму развития. В упрощенном варианте по М. П. Кончаловскому (1939) данная классификация выглядит следующим образом.
1. Постгеморрагические анемии — острые и хронические.
2. Анемии, являющиеся результатом нарушения кровообразования, — мегалобластные, железодефицитные, апластическая
и др.
3. Гемолитические анемии.
По патогенетическому механизму возможен следующий вариант группировки анемий, обусловленных (Абдулкадыров К. М. и
др., 1999):
1) преимущественно нарушением синтеза гемоглобина;
2) снижением продукции эритроцитов в костном мозге;
3) повышенным разрушением эритроцитов и (или) эритрокариоцитов в костном мозге.
П. А. Воробьев (2001) предложил несколько иной вариант классификации анемий.
1. Железодефицитные.
2. Сидероахрестические — дефицит гемсинтетазы (связанные с
нарушением синтеза гема).
3. Мегалобластные (связанные с нарушением синтеза ДНК).
4. Атрансферринемия (обусловленная нарушением транспорта
железа).
5. Гемолитические.
6. Связанные с костномозговой недостаточностью.
7. Связанные с нарушением регуляции эритропоэза (повышение уровня ингибиторов эритропоэза).
252
Часть 2. Клиническая гематология
В то же время международная классификация болезней ВОЗ
(МКБ-10) предусматривает основные рубрики, касающиеся анемий, с соответствующим кодом отдельных нозологических форм,
которые приведены ниже.
1. D50-D53 — анемии, связанные с питанием:
D50 — железодефицитная;
D51 — витамин Вр-дефицитная;
D52 — фолиеводефицитная;
D53 — другие анемии, связанные с питанием.
2. D55-D59 — гемолитические анемии:
D55 — связанные с ферментативными нарушениями;
D56 — талассемия;
D57 — серповидно-клеточная;
D58 — другие наследственные гемолитические анемии;
D59 — острые (приобретенные) гемолитические.
3. D60-D64 — апластическая и другие анемии:
D60 — приобретенная красноклеточная аплазия (эритробластопения);
D61 — другие апластические анемии;
D62 — острая постгеморрагическая анемия;
D63 — анемия хронических заболеваний;
D64 - другие анемии (МКБ-10, ВОЗ, 1992).
В разделах справочника, посвященных отдельным формам анемий, приведены классификации, которые наиболее широко применяют в клинической практике.
Железодефицитная анемия
Железодефицитная анемия (ЖДА) — патологические состояния, в основе которых лежит дефицит железа в организме, сопровождающиеся нарушением синтеза железосодержащего пигмента
гема в молекуле гемоглобина и, как следствие этого, развитием
анемии.
ВОЗ железодефицитная анемия признана одной из важных социальных проблем с учетом широкого распространения данной
патологии, в том числе среди женщин детородного возраста и детей, а также того, что социальные факторы (уровень жизни, образования, здравоохранения) влияют на частоту заболеваемости.
Распространенность. Железодефицитная анемия является широко распространенным патологическим состоянием и составляет
более 80% среди всех анемий. Наиболее часто заболевание встречается в развивающихся странах, а в различных группах населения
Глава 12. Анемии
253
высокая предрасположенность к дефициту железа и железодефицитной анемии отмечена у детей первых лет жизни, подростков и
женщин детородного возраста (Соболева М. К., 1990; Вуд М.,
БаннП.,2001).
По данным различных авторов, ЖДА в среднем страдает 510% населения планеты. Кроме того, латентный дефицит железа
выявляется у 12-15% и более обследованных, а среди женщин
репродуктивного возраста — у 50% (Шевченко Н. Г., 1997; Александрова В. А. и др.. 2002); в отдельных группах населения этот
показатель значительно выше. Так, в 1990-х гг. в Дагестане почти
90% рожениц имели признаки ЖДА. Среди детей от многоплодной беременности и детей с ростом, опережающим обычные нормы, ЖДА на первом году жизни выявляется более чем в 60% случаев (Соболева М. К., 1990). Латентный дефицит железа в нашей
стране может быть выявлен более чем у половины всех детей в
возрасте до 3 лет и примерно у 1/3-1/4 детей более старшего
возраста (Александрова В. А. и др., 2002; Малова Н. Е. и др.,
2002). Даже в экономически благополучных странах, несмотря на
развитую систему здравоохранения, железодефицитные состояния у детей в возрасте до 3 лет остаются серьезной проблемой
(Kazal L. А., 2002).
Классификация. Единой общей классификации ЖДА нет, но
обычно выделяют следующие варианты:
1) хроническая постгеморрагическая железодефицитная анемия (составляет основную часть ЖДА);
2) ювенильная анемия (связана с дисбалансом обмена железа
на фоне интенсивного роста и началом менструального периода у
девочек);
3) по степени тяжести (в зависимости от уровня гемоглобина) — тяжелая анемия (при уровне Hb менее 75 г/л), средняя (Hb
80-100 г/л) и умеренная (Hb 100-110 г/л);
4) по стадиям — прелатентный дефицит железа, стадия латентного дефицита железа и собственно ЖДА
Этиология. Основная причина развития ЖДА — дисбаланс между потребностями и поступлением железа в организм.
В организме взрослого человека содержится около 4 г железа,
из которых:
60-70%'находится в составе гема молекулы гемоглобина — гемоглобиновый (эритроцитарный) фонд;
20-25% — депо железа — резервный фонд в виде ферритина и
гемосидерина;
5-10% — в составе миоглобина;
25-1
Ч а с т ь 2. К л и н и ч е с к а я г е м а т о л о г и я
около 1% — в составе внутриклеточных ферментов (цитохромы,
каталаза и других) и неферментных железосодержащих биокатализаторов;
до 0,1% — в плазме крови.
Основное депо железа находится в печени, костном мозге, селезенке и мышцах. Потери железа происходят с желчью, потом — со
слущивающимся эпителием и менструальными кровопотерями.
В обычных условиях потребности организма в железе удовлетворяются преимущественно за счет внутренних запасов железа (поступление железа из разрушенных эритроцитов, из депо и пр.) и
поступлений с пищей. У здоровых лиц суточная потеря железа в
полной мере компенсируется пищевым железом, всасывающимся
в виде двухвалентного железа (гемовое железо или трансформированное из трехвалентного в желудке под действием соляной кислоты ) в двенадцатиперстной кишке и проксимальных отделах тощей
кишки.
Железо в форме гема, содержащееся в мясе, лучше всасывается,
чем негемовое железо, за счет специфических гемсвязывающих
участков в кишечнике. Из железа гема всасывается 20-30%, из
негемового железа (из молочных продуктов, яиц и всей растительной пищи) — около 5%, а степень всасывания железа из материнского молока составляет в среднем около 50%. Нормальному усвоению железа препятствует геликобактерная инфекция. Кроме того,
некоторые вещества, содержащиеся в растительной и молочной
пище, и таннины в чае и кофе препятствуют всасыванию железа.
Абсорбцию соединений железа также ухудшают фосфаты. Витамин С, лимонная и янтарная кислоты, сорбит, метионин, цистеин,
микроэлементы (медь), напротив, противодействуют этим ингибиторным эффектам (Идельсон Л. И., 1987; Циммерман Я. С, Бабушкина Г. Д., 1997; Вуд М„ Бани П., 2001; Крылов А. А., 2002).
Всосавшееся железо в соединении с транспортным белком трансферрином переносится к органам и тканям, где оно поглощается
эритроидными клетками костного мозга и захватывается тканевыми макрофагами, откладывается внутриклеточно в виде ферритина и, частично, гемосидерина и расходуется но мере необходимости. В итоге около 80% сывороточного пула железа расходуется на
синтез гемоглобина, начинающийся уже на стадии эритробластов.
После высвобождения и депонирования железа трансферрин связывается со специфическим трансферриновым рецептором (TfR)
на клеточной мембране. Часть трансферриновых рецепторов находится в сыворотке крови и может быть определена соответствующими методами. При низком внутриклеточном уровне железа син-
Глава 12. Анемии
255
тез TfR усиливается, а синтез ферритина, напротив, подавляется
(Шевченко Н. Г.. 1997; Шиффман Ф. Д., 2000; Kongo Y. et al,
2002).
При повышенном расходе железа в организме (хронические
кровопотери, интенсивный рост) и при нарушенном поступлении
(в результате несбалансированного питания и (или) нарушенного
всасывании), особенно при сочетании этих факторов, создаются
условия для развития ЖДА. Причиной повышенных трат железа
чаще всего являются хронические кровопотери (меноррагии, кровопотери из ЖКТ при геморрое, язвенной болезни, опухолях, дивертикулезе и другие; гематурия различного генеза и гемоглобинурия). Наиболее частыми являются кровопотери из желудочнокишечного тракта (ЖКТ) у мужчин и женщин в менопаузе или у
женщин при менструациях в пременопаузальном периоде. Такие
малые хронические кровопотери, как 1-2 мл, в конце концов приводят к дефициту железа из-за его невысокого поступления при
большинстве диет (Идельсон Л. И., 1987; Вуд М., Банн П., 2001).
К повышенной потребности в железе ведут быстрый рост в детском и подростковом возрасте и интенсивные физические нагрузки, а также беременность, при которой для поддержания баланса
дополнительная потребность в железе составляет 0,7-0,9 г и более,
роды и лактация. Потери менструирующих женщин эквивалентны
дополнительным 0,5-1 мг/день, а беременным женщинам требуется 4 -6 мг/день железа для самой матери и плода и для возмещения
потери крови при родах (Идельсон Л. И.. 1987; Шиффман Ф. Д.,
2000 и др.).
Активное донорство или частое взятие крови из вены у длительно болеющих и многократно обследующихся пациентов может быть причиной дефицита железа.
Пациенты с почечной патологией и хронической почечной недостаточностью, в программу терапии которых входит гемодиализ, предрасположены к дефициту железа, так как потеря крови в
процессе диализа и наклонность к повышенной кровоточивости
сопутствуют уремии. К потере железа с мочой приводит также
внутрисосудистый гемолиз, обусловленный протезами сердечных
клапанов или пароксизмальной ночной гемоглобинурией, что может определяться по наличию в ней гемосидерина.
Возможно появление ЖДА у больных с анемиями, связанными
с. нарушением образования эритропоэтина (при почечной, эндокринной и других патологиях) в период лечения его препаратами.
Это связано с тем, что увеличение гематокрита в ходе терапии
требует массивного поступления железа из пула хранения к эри-
256
Часть 2. Клиническая гематология
троидным предшественникам. Если пул хранения истощен, это приведет к дефициту железа и задержке восстановления гемопоэза.
Предрасполагающими к развитию ЖДА факторами, связанными с нарушением всасывания железа, могут быть хронические энтеропатии, резекции участка тонкой кишки и желудка, целиакия.
Формированию ЖДА способствует неполноценное питание с преобладанием мучных и молочных продуктов, а также имеет определенное значение и сниженное содержание микроэлементов (меди,
марганца, кобальта) в воде и пище. Существуют данные, что гипоэлементозы часто сочетаются со скрытым дефицитом железа.
К группам риска развития ЖДА относятся:
а) люди с хроническими кровопотерями, в том числе женщины
с гиперменореей (менструациями продолжительностью свыше
5 дней, особенно при появлении первых менструаций до 15 лет);
б) доноры (отмечается прямая зависимость от числа кроводач);
в) женщины с повторными беременностями (4 и более), родами
(3 и более), длительной лактацией (свыше года);
г) дети от матерей с анемией, из многодетных семей и недоношенные;
д) люди, длительно находящиеся на молочно-растительной диете;
е) люди с высоким ростом, большой массой тела.
Повышен риск развития дефицита железа у детей, живущих в
неблагоприятных социально-экономических условиях, вскармливавшихся коровьим молоком в первые 6 месяцев без дополнительного назначения препаратов железа или с низким весом при рождении (Соболева М. К.,1990; Вуд \1„ Банн П., 2001).
В то же время данные молекулярно-генетических исследований
последних лет показали возможное участие генетических механизмов в предрасположенности к развитию к ЖДА. Так, отмечено
достоверное повышение частоты встречаемости мутантной формы
гена цитохрома Р-4501А1 у больных ЖДА, на основании чего выдвинуто предположение о возможности определения молекулярногенетических маркеров повышенного риска ЖДА (Сафаунова Г. Ш.,
2002). Имеются данные о зависимости частоты выявления ЖДА
у женщин молодого возраста от полиморфизма гена GPIa-807 С/Т
(Carlsson L. E. et al., 2002).
Патогенез. Развитие дефицита железа в организме закономерно проходит несколько стадий: прелатентный дефицит железа, стадию латентного дефицита железа и собственно ЖДА. При этом в
первую очередь снижается количество железа, депонированного в
органах и тканях, затем уменьшается количество транспортного
Глава 12. Анемии
257
железа, несколько позже — железа гемсодержащих ферментов и
затем железа, необходимого для синтеза гемоглобина. Таким образом, анемии предшествует длительный период истощения депо
железа и латентного дефицита железа без клинических проявлений.
Поскольку железо является структурным компонентом гемоглобина и миоглобина, а также ряда ферментов, кофактором ряда
энзимных процессов, включая синтез коллагена, при развитии железодефицитного состояния в организме происходят соответствующие изменения. Нарушение синтеза гемоглобина приводит к развитию гипохромной анемии, миоглобина — к миастении. А следствием снижения активности железосодержащих ферментов
является изменение клеточного метаболизма и дистрофические
изменения органов и тканей с превалированием процессов катаболизма коллагена. С последними из указанных изменений в настоящее время связывают формирование и прогрессирование атрофических процессов в слизистой желудка, усугубляющих дисбаланс
в потребности и поступлении железа, в то время как ранее атрофичеекпй гастрит рассматривался как один из основных этиологических факторов (Дворецкий Л. И., 1999).
Дефицит железа приводит к нарушению функции иммунокомпетентных клеток и к снижению иммунологической резистентноети. При этом уменьшается содержание Т-лимфоцитов и снижается
реакция блаеттрансформации лимфоцитов в ответ на митогены, а
также нарушаются процессы перекисного окисления липидов
(Циммерман Я. С, Бабушкина Г. Д., 1997; Александрова В. А. и др.,
2002).
Страдает и центральная нервная система (ЦНС), поскольку в
условиях дефицита железа не только имеет место гипоксия за счет
анемии, но и снижается катаболизм катехоламинов с повышением
их концентрации в тканях ЦНС.
Клиническая картина. Поскольку анемия развивается медленно, то у многих больных она бессимптомна. Клиническая картина
заболевания складывается из неспецифических проявлений общеанемического синдрома (слабость, вялость, бледность кожных покровов, тахикардия и одышка при физической нагрузке и т. д.) и
проявлений тканевого дефицита железа — так называемого сидеропенического синдрома. Последний включает в себя следующие
симптомы:
а) изменения ногтей (слоение, исчерченность, ломкость, «корявость» и «койлонихии» — ногти ложкообразной формы);
б) затруднение глотания сухой пищи;
9 Гематология. Нов. справочник
258
Часть 2. Клиническая гематология
в)извращение обоняния;
г) извращение вкуса (pica chlorotica);
д) сглаженность сосочков языка;
е) «заеды» в углах рта (ангулярный стоматит).
Последние три симптома наиболее показательны для ЖДА, и
выраженность их зависит от уровня гемоглобина (Дворецкий Л. И.,
1999). Кроме того, обычно отмечаются сухость кожи, повышенная
ломкость ногтей и волос. У некоторых больных заметно проявление ангулярного стоматита в виде трещинок в уголках рта, глоссита, сопровождающегося жжением языка. Дефицит железа способствует разрушению эмали зубов и множественному кариесу.
У детей может наблюдаться задержка физического и умственного развития, снижение памяти, быстрая утомляемость и, как следствие, снижение способности к обучению.
Больные часто жалуются на выраженную общую слабость, не
соответствующую степени анемии, и мышечную слабость, что
объясняется нарушением синтеза миоглобина. Синдром мышечной гипотонии выявляется почти у 80% детей с ЖДА (Малова Н. Е.
и др., 2002). С миастенией и слабостью сфинктеров может быть
связано иногда наблюдающееся у девочек и женщин недержание
.мочи при кашле или смехе. Слабостью глоточных мышц и дистрофическими изменениями слизистой оболочки обусловлена сидеропеническая дисфагия с затруднением глотания сухой и твердой
пищи. При осмотре пациентов с ЖДА нередко обращает на себя
внимание алебастровый или зеленоватый оттенок кожных покровов, в связи с чем одно из первых названий ЖДА — «хлороз», а
также голубоватый оттенок склер («симптом голубых склер»), как
отражение дистрофических изменений роговицы с нарушением
гидроксилирования пролина и лизина в условиях дефицита железа (Кассирский И. А., Алексеев Г. А., 1962; Идельсон Л. И., 1987;
Александрова В. А. и др., 2002).
Извращение аппетита проявляется в желании есть крахмал (амилофагия), лед (пагофагия), известку, землю и глину (геофагия),
сырое тесто и т. д. Может появляться пристрастие к неприятным
запахам: бензина, лака, ацетона, нафталина и др.
Следует отметить, что проявления тканевого дефицита железа
обычно значительно опережают развитие анемии.
Имеющаяся у больного ЖДА отягощает течение ряда заболеваний и, в первую очередь, сердечно-сосудистых, причем нередко
имеет место кардиоанемический синдром с развитием миокардиодистрофии. Угнетение иммунного статуса приводит к повышению
заболеваемости различными инфекциями, включая респираторно-
Глава 12. Анемии
259
вирусные и кишечные, а также формированию очагов хронической
инфекции. В фертильном периоде железодефицитные состояния
отягощают течение беременности и родов, увеличивают частоту
преждевременных родов, ведут к повышению частоты послеродовых осложнений, оказывают влияние на здоровье детей. По некоторым данным, новорожденные дети у матерей с ЖДА имеют меньшую массу тела (Крылов А. А., 2002). Наличие ЖДА приводит к
нарушению физического и интеллектуального развития детей и
подростков, способствует формированию иммунодефицита и эндокринных нарушений. Так, у девушек-подростков повышается
частота патологии щитовидной железы, нарушений менструального цикла. У детей ЖДА может сопровождаться проявлениями
периферической нейропатии, патогенез которой не вполне ясен
(KabakusN.etal.,2002).
Диагностика. Диагноз основывается на характерных жалобах и
клинической картине заболевания с выявлением признаков сидеропенического синдрома-и лабораторных показателях.
Для ЖДА характерно наличие гипохромной микроцитарной
анемии. Цветовой и другие показатели насыщения эритроцитов
гемоглобином (среднее содержание гемоглобина в эритроците —
МСН — норма 80-94 фл; средняя концентрация гемоглобина в
эритроците — МСНС — норма 27-31 пг) снижены. При глубокой
анемии отмечается выраженный анизоцитоз и пойкилоцитоз эритроцитов, могут появляться единичные мишеневидные клетки. Количество ретикулоцитов обычно в норме, так как регенераторная
способность эритроидного ростка костного мозга сохранена. Транзиторный ретикулоцитоз может наблюдаться при выраженной кровопотере или приеме препаратов железа незадолго до проведения
анализов.
При оценке мазка крови обращает на себя внимание бледность
эритроцитов, встречаются эритроциты в виде колец с широким
просветлением в центре (анулоциты). При специальной окраске
на гранулы железа отмечается снижение числа железосодержащих
эритроцитов — сидероцитов. Важную информацию может дать
оценка эритроцитарных параметров. При ЖДА уменьшены средний диаметр и средний объем эритроцитов. Средний корпускулярный объем - MCV (как и среднее содержание гемоглобина в эритроците — МСН) имеет отношение к среднему (или общему) объему эритроцитов и должен интерпретироваться с учетом показателя
распределения эритроцитов по степени анизоцитоза (разброс размеров эритроцитов относительно среднего значения — RDW), являющимся отражением гомогенности популяции красных клеток
260
Часть 2. Клиническая гематология
крови по размеру. В норме среднее значение RDW составляет около 14-15%. При дефиците железа этот показатель повышен, а в
мазках крови отмечается анизоцитоз эритроцитов. У отдельных
больных возможна умеренная лейкопения и может отмечаться
тромбоцитопения (чаще у детей) или тромбоцитоз (по некоторым данным, у 30% детей и более чем у половины взрослых пациентов), особенно на фоне кровопотерь (Идельсон Л. И., 1987;
Кузнецова Ю. В. и др., 2000; Гусева С. А. и др., 2001; Вуд М,
Бани П., 2001).
В костном мозге у больных ЖДА, как правило, отмечаются
эритроидная гиперплазия (компенсаторное усиление эритропоэза) и пониженное количество железосодержащих клеток: сидероцитов и сидеробластов (нормальное содержание последних составляет 10-20%). Именно специфическая окраска препаратов костного мозга на содержание железа может быть прямым достоверным
показателем железодефицитного состояния. Однако из-за сложности и высокой стоимости исследования обычно ограничиваются
более доступными непрямыми показателями.
Для достоверной диагностики ЖДА необходимо исследование
показателей обмена железа и оценка депо железа. В качестве показателей транспортного фонда железа определяются содержание железа в сыворотке крови (сывороточное железо), общая железосвязывающая способность крови (ОЖСС) и латентная железосвязывающая способность (ЛЖСС). При типичной ЖДА уровень
сывороточного железа (в норме в пределах 9-30 мкмоль/л) и насыщение трансферрина снижены. ОЖСС, показывающая, какое
количество железа может связаться белками в 1 л сыворотки (нормальные колебания 45-60 мкмоль/л) и отражающая степень «нехватки» железа в сыворотке, увеличена. ЛЖСС определяется как
разность между показателем ОЖСС и сывороточным железом и в
случаях ЖДА бывает значительно повышена по сравнению с нормой, составляющей 30-75 мкмоль/л. О концентрации трансферрина в сыворотке судят чаще по показателю ОЖСС, так как методы достоверного определения самого трансферрина (метод радиальной иммунодиффузии, лазерной нефелометрии) более сложны.
Соотношение железа сыворотки и ОЖСС (в %) является показателем насыщения трансферрина железом (в норме 16-50%). Однако указанные показатели не всегда достаточно чувствительны. Они
могут быть нормальными даже тогда, когда предполагается истощение запасов железа, что определяется по уровню сывороточного
ферритина (15-150 мкг/л). В то же время уровень железа сыворотки и ЖСС могут снижаться не только при гипосидерозе, но и при
Глава 12. Анемии
261
различных инфекционных и воспалительных процессах, онкопатологии и заболеваниях печени. Недостоверными будут и анализы, произведенные в ближайшие дни после окончания приема железосодержащих препаратов.
Для ЖД А характерным является достоверное повышение уровня растворимых трансферриновых рецепторов в сыворотке крови
(s-TfR). Трансферриновые рецепторы представлены на эритроидных предшественниках и попадают в сыворотку в повышенных
количествах при неадекватном поступлении железа. Однако, поскольку уровень s-TfR бывает повышенным также при ряде опухолевых заболеваний, диагноз ЖДА не может основываться только
на нем (Вуд М., Банн П., 2001; Bierner J. et. al., 2002).
Для оценки запасов железа обычно используют непрямые методы: определение коэффициента насыщения трансферрина (Кнас)
и содержания ферритина в плазме крови. Кнас (в %) является
расчетным показателем, определяемым по соотношению содержания железа в плазме и концентрации трансферрина. В норме он
составляет около 20-30%, при ЖДА снижается. Причем в случаях
снижения уровня сывороточного железа и ЖСС, не связанных с
дефицитом железа, соотношение остается в пределах 20% и выше,
что имеет дифференциально-диагностическое значение.
Уровень ферритина — важный показатель запасов железа, поскольку именно ферритин является основной формой депонирования железа и синтезируется в печени в соответствии с содержанием железа в организме, причем его определенная доля находится
в плазме. При отсутствии других патологических факторов концентрация данного белка в сыворотке крови прямо коррелирует с
количеством депонированного в организме железа. Уровень ферритина определяется в сыворотке радиоиммунологическим или
иммуноферментным методом. Низкий сывороточный ферритин
при нормальном гемоглобине указывает на истощение запасов.
Считается, что о дефиците железа говорит концентрация ферритина менее 12 нг/мл. Если имеется анемия при нормальном или увеличенном уровне ферритина, следует начать поиск других причин
ее возникновения. Однако этот показатель не является абсолютно
достоверным и специфичным, так как уровень ферритина может
снижаться также при наличии гипотиреоза и дефиците витамина
С и, напротив, повышен при заболеваниях печени, инфекционновоспалительных процессах, злокачественных новообразованиях и
других состояниях, при которых ферритин выступает как острофазовый белок (Шевченко Н. Г., 1997; Шиффман Ф. Д., 2000;
Frewin R., 1997).
262
Часть 2. Клиническая гематология
Кроме того, запасы железа могут быть оценены с помощью десфералового теста путем определения содержания железа в моче
после введения больному комплексом десферрамина (десферала). При ЖДА содержание железа в моче снижено.
В «стандартный набор» минимальных необходимых исследований для диагностики, как правило, входят клинические анализы
крови, определение сывороточного железа и уровня ферритина.
Из ранних же скрининговых тестов, позволяющих распознать железодефицитное состояние еще до развития анемии, предлагается
определение эритроцитарного протопорфирина IX и контроль индекса анизоцитоза — RDW (Идельсон Л. И., 1987; Шевченко Н. Г.,
1997; Hagar W. et al., 2002; Kazal L. A., 2002).
Определенным этапам развития дефицита железа в организме
соответствуют следующие лабораторные показатели (Александрова В. А. и др., 2002).
1. Прелатентный дефицит железа — снижение уровня сывороточного ферритина ниже 12 мкг/л (при определении радиоиммунным методом); в десфераловом тесте уменьшение выделения железа с мочой менее 0,4-0,2 мг; уменьшение количества сидеробластов
в стернальном пунктате до 15% и менее.
2. Латентный дефицит железа (с появлением клинических признаков сидеропении) — сывороточное железо менее 14 мкмоль/л;
ОЖСС и ЛЖСС превышают нормальные показатели; снижение
коэффициента насыщения трансферрина.
3. Железодефицитная анемия — появление гипохромной анемии.
Важным моментом на этапе диагностики является установление причин ЖДА, активное выявление источников скрытой кровопотери. Для этого используется широкий арсенал методов исследования. Важное место, в частности, принадлежит, эндоскопическим методам. Так, по данным отдельных авторов, при проведении
эндоскопических исследований у пациентов с клинико-гематологическими признаками ЖДА серьезные заболевания желудочнокишечного тракта выявляются более чем в 60% случаев (Ioannou G. N. et al., 2002). У большинства больных источник кровопотери располагается в верхних отделах ЖКТ (часто это язвенная
болезнь), а у 20-30% имеется такой источник кровопотери, как
полип, опухоль или ангиодисплазия. У больных в возрасте 50 лет и
старше должна рассматриваться возможность колоноскошш, даже
если обнаружен источник кровопотери в верхних отделах ЖКТ.
так как возможно сочетание кровотечения из верхних и нижних
отделов. Могут возникать сложности при кровопотерях в закры-
Глава 12. Анемии
263
тые полости (гломические опухоли и др.). и в таких случаях в
диагностике помогает компьютерная томография. Для уточнения
источника кровопотери и ее объема могут быть применены радиологические методы с мечеными эритроцитами, при подозрении на
легочное кровотечение — исследования мокроты и промывных вод
бронхов для выявления макрофагов, содержащих гемосидерин.
Дифференциальная диагностика. Известно, что всякая железодефицитная анемия пшохромная, но не всякая шпохромная анемия — железодефицитная. Поэтому дифференциальный диагноз в
первую очередь проводят с другими гипохромными анемиями, к
которым, в частности, относятся сидероахрестические («железоненасыщенные» ) анемии (с нарушением синтеза гема в результате
угнетения активности ферментов, включающие железо в состав
гема), В эту группу входят наследственные сидероахрестические и
приобретенные (медикаментозные) анемии, а также анемия при
свинцовой интоксикации. Данная группа анемий принципиально
отличается от ЖДА тем. что при них в организме имеется не недостаток, а избыток железа, который можно определить соответствующими тестами. При просмотре мазка крови в случае свинцового
отравления базофильная пунктация в эрнтроцитах выглядит более грубой, тогда как при ЖДА отмечается более нежная зернистость. В этом случае скрининговым тестом может служить и определение свободного эритроцитарного протопорфирина (норма 2,79,0 мкмоль/л), уровень которого обычно повышен при ЖДА и,
напротив, при свинцовой интоксикации — с нарушенным порфириновым обменом. (Идельсон Л. И., 1987: Гусева С. А. и др., 2001:
ВудМ.. Бани П., 2001).
К гипохромным анемиям относится талассемия — наследственная гемолитическая анемия с нарушением синтеза гемоглобина.
В дифференциальной диагностике при талассемии имеют значение семейный анамнез, наличие признаков гемолиза и определение фракций гемоглобина. Кроме того, в случаях выявления микроцитоза при анемии умеренной степени тяжести очень важно
определить показатель RDW - повышенного при ЖДА и нормального при талассемии, где имеется более гомогенная популяция эритроцитов.
Может возникнуть необходимость в дифференциальной диагностике с так называемой анемией хронических заболеваний
(АХЗ) — железоперераспределителыюй анемией со сложным патогенетическим механизмом, при которой, так же как при ЖДА,
гипохромная анемия сочетается с невысоким уровенем ретикулоцитов. При АХЗ. так же как и при других вышеуказанных состоя-
264
Часть 2. Клиническая гематология
ниях (талассемии, сидеробластной анемии), сывороточный ферритин в норме или повышен. Однако если уровень сывороточного
ферритина на нижней границе нормы, может быть сложно отличить анемию при хронических заболеваниях от дефицита железа.
Более того, у некоторых больных сочетаются эти два состояния.
Ранним дифференциально-диагностическим критерием в отношении ЖДА и АХЗ считается показатель соотношения концентрации растворимых трансфсрриновых рецепторов сыворотки и уровня ферритина (Kongo Y. et al., 2002). Уровень рецепторов сывороточного трансферрина нормален в случаях анемии при хронических
заболеваниях. Одновременное определение уровня TfR сыворотки
и ферритина обеспечивает очень высокую чувствительность и специфичность при выявлении истощения запасов железа и в перспективе может заменить такие общепринятые в настоящее время
показатели обмена железа, как определяемые отдельно сывороточное железо, трансферрин и ферритин (Вуд М, Багга П., 2001).
Нельзя также забывать о вероятности полидефицитных анемий, особенно у лиц старшего и пожилого возраста, нередко зависящих от ряда географических и социально-демографических факторов. Высока вероятность сочетанного характера анемии при заболеваниях или резекции тонкой кишки (Шевченко Н. Г.. 1997;
Крылов А. А., 2002). Нормальный MCV при высоком RDW указывает па возможность смешанной этиологии анемии, в частности,
сочетание железо- и В1?-фолиеводефицита (Кузнецова Ю. В. и др.,
2000; Вуд М., Банн П.. 2001).
Лечение. В первую очередь, лечение ЖДА должно быть направлено на устранение причины заболевания, лечение «фоновых»
болезней. Одновременно проводят коррекцию дефицита железа
соответствующими медикаментозными препаратами.
Диета с повышенным содержанием пищевого железа и аскорбиновой кислоты и ограничением продуктов, снижающих его усвоение (молочные продукты), имеет значение только в проведении
профилактических мероприятий и при латентном дефиците железа. В случае уже развившейся ЖДА, что отражает истощение депо
железа, полноценная коррекция дефицита железа пищей практически невозможна.
Основные принципы медикаментозной терапии ЖДА;
1) выбор наиболее эффективного препарата;
2) выбор максимальной индивидуально переносимой дозы;
3) расчет необходимой курсовой дозы.
Так как полноценная коррекция дефицита железа в организме
больных ЖДА требует длительного (в течение нескольких меся-
Глава 12. Анемии
265
цев) активного лечения, то применяемые лекарственные препараты должны быть достаточно эффективны, удобны в применении и
иметь минимум побочных эффектов.
В настоящее время имеется большой выбор средств пероральной терапии. Современные железосодержащие препараты, использующиеся в лечении ЖДА, делятся на две группы: препараты на
основе солей железа и гидроксид-полимальтозного комплекса.
Многие годы основными в терапии железодефицитных состояний были ионные железосодержащие полисахаридные препараты,
а также монокомпонентные и комбинированные соединения солей
железа, которые успешно и широко используются и в настоящее
время. Всасывание железа из данных препаратов происходит преимущественно в двухвалентной форме посредством механизма пассивной диффузии, соответственно суточная и курсовая доза, а также эффективность отдельных средств этой группы определяется
содержанием Fe2* («элементарного железа») с учетом того, что в
конечном итоге всасывается лишь 10-15% поступающего в организм железа (Захарова И. Н. и др., 2003). Спектр железосодержащих препаратов для перорального применения достаточно широк,
однако не все они достаточно эффективны, может отмечаться плохая переносимость отдельных лекарственных форм. Как правило,
применяют лекарственные формы, содержащие двухвалентное железо в виде солей: сульфата (ферроградумет, тардиферон, сорбифер, актиферрин), глюконата (тотема), фумарата (ви-фер) и др.
Степень дефицита железа в организме и, соответственно, общей
дозы железосодержащих препаратов, необходимых для коррекции
анемии и восполнения запасов железа, можно рассчитать по следующей формуле:
Железо (вмг) = (НЬ в норме - НЬ больного) х
х масса тела (в кг)х2,21 + 1000.
В настоящее время расчет курсовой дозы для перорального приема не считается обязательным, и препараты обычно назначаются
в стандартных терапевтических дозах. Эффективная суточная доза
элементарного железа должна быть такой, чтобы всосавшаяся
часть обеспечивала суточную потребность и оптимальный среднесуточный рост гемоглобина. Для взрослых такая доза составляет
4-5 мг/кг массы тела или 100-400 мг Fe2^. В пределах этого диапазона суточная доза для каждого конкретного пациента определяется индивидуальной переносимостью. Средняя эффективная суточная доза двухвалентного железа для детей - до 6 мг/кг (Pediatrics
at a Glance, 1998; Вуд М., Банн П., 2001; Крылов А. А., 2002). Для
266
Часть 2. Клиническая гематология
лучшего усвоения пероральные препараты солей железа назначаются за час до приема пищи или не ранее чем через 2 часа посте
него, поскольку в просвете кишечника солевые препараты взаимодействуют с компонентами пищи и другими лекарственными препаратами.
Побочные эффекты при использовании препаратов солей железа обычно проявляются в виде тяжести и болей в эпигастрии, тошноты, расстройства стула и бывают связаны с количеством элементарного (двухвалентного) железа, содержащегося в данном средстве. Также могут появиться металлический привкус во рту,
головокружение, аллергические реакции, потемнеть зубная эмаль
и десна. Следует учитывать и возможность передозировки железосодержащих препаратов, а также риск развития гемосидероза.
У некоторых больных выраженность дисфункции ЖКТ служит
причиной отмены препарата или отказа больных от лечения. Если
эти симптомы появились, дозу рекомендуется уменьшить до 12 таблеток в день и принимать препарат во время еды. При плохой
переносимости препаратов железа возможно применение лекарств
(покрытых оболочкой) пролонгированного действия (сорбифердурулес) для одно-двухкратного приема в сутки. Однако такие
препараты всасываются хуже.
Большинство предлагаемых средств комплексные — с дополнительным содержанием фолиевой кислоты, комплекса витаминов и
микроэлементов в целях повышения эффективности терапии. Так,
аскорбиновая кислота, входящая в состав многих комбинированных препаратов (ферроплекс, тардиферон), обладает восстанавливающими свойствами и переводит двухвалентное железо в трехвалентное, повышая его резорбцию. Ряд препаратов, наряду с солями
железа, также включает фолиевую кислоту. Применение таких
средств, в частности, у беременных целесообразно для профилактики и лечения сочетапного дефицита железа и фолиевОй кислоты.
В последние годы наряду с солями железа в лечении ЖДА активно стали использовать неионпые препараты трехвалентного
железа в виде гидроксидполимальтозного комплекса (феррум-лек),
максимально приближенного к структуре естественных соединений железа с ферритином. При использовании средств этой группы всасывание железа является активным процессом, причем эффективность препаратов сопоставима с солями железа, но частота
развития побочных эффектов достоверно снижается и практически отсутствует опасность передозировки. Прием пищи не уменьшает абсорбцию железа из полимальтозного комплекса. Кроме того,
неионная структура комплекса делает его более стабильным и пред-
Глава 12. Анемии
26/
отвращает свободную диффузию ионов железа в организме и образование свободных радикалов (Александрова В. А. и др.. 2002; Захарова И. Н. и др., 2003).
Существуют специальные, как правило, жидкие лекарственные
формы препаратов железа для детей: сироп феррум-лек, сироп актиферрин (сульфат железа в комплексе с D-, L-серином, уменьшающим риск развития побочных реакций). Причем сиропы можно
смешивать с фруктовыми и овощными соками и искусственными
питательными смесями (Казакова Л. М., 1998).
Парентеральные препараты показаны только при невозможности использования энтеральных препаратов железа из-за мальабсорбции, тяжелой непереносимости пероральных форм и при декомненсированном дисбактериозе. Существенных преимуществ в
темпах прироста гемоглобина препараты для парентерального применения не имеют и могут вызывать серьезные побочные эффекты, такие как анафилаксия, лихорадка, гипотензия, крапивница
или боли в грудной клетке, животе или спине, наблюдающиеся
примерно в 10% случаев. В связи с этим при использовании парентеральных препаратов внутривенно рекомендуется вводить
пробную дозу в виде инфузии длительностью 4-6 часов (Вуд М.,
Банн П., 2001; Александрова В. А. и др., 2002). При парентеральном введении расчет числа ампул для введения необходимой суточной дозы железа проводят по соответствующим формулам.
1. Расчет дозы феррум-лек:
Количество ампул = масса тела больного х
х(100-0,6 х уровень гемоглобина в г/л).
2. Расчет общей дозы парентеральных препаратов (в мл) для
детей:
Общая доза (в мл) = масса ребенка в кг х
х (78-0,25 х уровень гемоглобина в г/л)/
содержание железа в 1 мл препарата.
Число инъекций на курс терапии и длительность лечения определяют с учетом суточных доз элементарного железа в разных возрастных группах: детям первого года жизни — до 25 мг/сут, от 1 до
3 лет — 24-40 мг/сут и старше 3 лет — 40-50 мг/сут (РЛС —
Энциклопедия лекарств, 2000; Александрова В. А. и др., 2002).
В терапии ЖДА выделяют два этапа: этап нормализации уровня гемоглобина (занимает в среднем 1,5-2 месяца) и этап восстановления резервных фондов железа. Так что в целом продолжи-
268
Часть 2. Клиническая гематология
телыюсть лечения ЖДА составляет 4-6 месяцев. При этом на первом этапе даются максимальные дозы железосодержащих препаратов, на втором — переходят на поддерживающие дозы. Суточная
доза железосодержащих препаратов при достижении уровня гемоглобина НО г/л может быть снижена, и дальнейшая терапия
продолжается умеренными дозами.
Обычно первый положительный симптом в ходе терапии у больных ЖДА — уменьшение мышечной слабости. Повышение гемоглобина может быть постепенным или скачкообразным и чаще
бывает заметно на 3-4-й неделе терапии. Начиная с 3-4-го дня у
большинства больных наблюдается повышение уровня ретикулоцитов, достигая максимума к 10-12-му дню, хотя значительный
ретикулоцитоз отмечается редко. При оценке результатов лечения
в первую очередь обращают внимание на такие показатели, как
достижение нормального уровня гемоглобина, а в ходе терапии —
на прирост гемоглобина более 1 г/л в сутки. Оценку состояния
тканевого и резервного фонда целесообразно проводить, ориентируясь на уровень ферритина в сыворотке крови: повышение концентрации сывороточного ферритина более 50 нг/мл является показателем адекватности проведенной терапии (Шиффман Ф. Д.,
2000; Вуд М, Банн П., 2001; Крылов А. А., 2002; Захарова И Н. и
др., 2003).
Больным с комбинированным дефицитом наряду с препаратами железа одновременно проводится терапия витамином В,., и (или)
фолиевой кислотой. Причем беременным женщинам с ЖДА рекомендуется дополнительно назначать фолаты, независимо от сывороточного уровня последних, поскольку, как показали рандомизированные исследования, эффективность такого лечения для беременных значительно выше (Juares-Vazquez J. et al., 2002).
Прогноз благоприятный. Терапия может быть неэффективна
при:
а) продолжающихся потерях железа в организме, когда кровопотеря превышает способность к повышенному всасыванию железа при дополнительном назначении железосодержащего препарата;
б) повышенном потреблении продуктов, снижающих всасывание железа;
в) наличии воспалительных и злокачественных заболеваний или
неверно установленном диагнозе ЖДА (Соболева М. К., 1990;
Frewin R., 1997).
Таким образом, при правильной диагностике и адекватной терапии заболевание полностью излечимо.
Глава 12. Анемии
269
Профилактика. Первичная профилактика ЖДА заключается
в выявлении лиц из группы риска с латентным дефицитом железа и проведении соответствующих профилактических мероприятий: диета с повышенным содержанием железа и прием препаратов
железа.
Важность проведения профилактических мероприятий и соответствующей терапии уже на стадии латентного дефицита железа
обусловлена как широкой распространенностью заболевания, так
и социальной значимостью проблемы, поскольку железодефицитные состояния приводят к снижению работоспособности и ухудшению качества жизни у взрослых, развитию осложнений во время беременности и родов у женщин, задержке развития и роста,
снижению интеллекта и нарушению поведения у детей и подростков.
Должно быть оценено поступление железа с пищей, и если оно
неадекватно, следует пересмотреть рацион или обеспечить профилактический прием железосодержащих препаратов. Особенное значение в рационе имеют продукты, являющиеся источниками оптимально всасывающегося гемового железа. Предпочтительны нежирные сорта говядины и свинины и телятина. Наряду с этим
рекомендуется употреблять фрукты и соки, содержащие ряд витаминов и кислот (аскорбиновой,глутаминовой,янтарной и др.) и
улучшающие усвоение организмом железа. Также необходимыми
источниками микроэлементов для профилактики железодефицитных состояний могут служить морепродукты (Соболева М. К.,
1990).
В целях активного выявления ЖДА гемоглобин или гематокрит должны контролироваться в следующие периоды: младенчество (возраст между 6 и 9 месяцами), поздний детский возраст
(между 5 и 12 годами), подростковый и юношеский возраст (между 14 и 20 годами). В ряде стран Европы и в США разработаны
программы по профилактике ЖДА, в частности, для детей первых
лет жизни, предусматривающие ряд профилактических мероприятий в зависимости от возраста ребенка, особенностей вскармливания (грудное, смешанное, искусственное), данных скрининговых
тестов и наличия группы риска (Kazal L. А., 2002).
Профилактику ЖДА у детей следует начинать еще в антенатальном периоде. Всем беременным женщинам, особенно во второй половине беременности, показана поддерживающая терапия
препаратами железа. Считается, что адекватное поступление данного элемента на протяжении беременности обеспечивается 30 мг
элементарного железа (150 мг сульфата железа или 250 мг глюко-
270
Часть 2. Клиническая гематология
пата). В постнатальном периоде детям от многоплодной беременности, а также с большой массой тела при рождении рекомендуется в возрасте 3-6 месяцев проводить профилактичесие курсы железосодержащих препаратов в дозе 2-3 мг/кг элементарного железа в сутки (Вуд М., Банн П., 2001: Александрова В. А. и др., 2002).
Причем для недоношенных детей с целью полного восполнения
запасов железа в организме рекомендуемая длительность профилактической терапии может доходить до 2 лет (Захарова И. Н. и
др., 2003).
Для профилактики рецидивов ЖДА необходимо устранение,
по возможности, этиологических факторов, полноценное, достаточно продолжительное для восполнения запасов железа в организме лечение железосодержащими препаратами, диспансерное
наблюдение за пациентами. При невозможности полного устранения причины ЖДА проводят профилактические курсы препаратов железа: дозы солей железа составляют 30-60 мг элементарного
железа в сутки.
Анемия хронических заболеваний
Анемией при хронических заболеваниях (анемия хронических
заболеваний — АХЗ) или хронического воспаления (АХВ) называют малокровие, сопровождающее хронические инфекции, воспалительные заболевания и неопластические процессы, для которых
характерно снижение продукции эритроцитов в костном мозге при
адекватных запасах железа в депо.
Распространенность. АХЗ по распространенности занимает
второе место после ЖДА среди всех форм анемий (Луговская С. А..
1997). В группе лиц пожилого возраста доля АХЗ достигает 3050% (Дворецкий Л. И., 1999).
Имеются данные о том, что среди больных системными заболеваниями соединительной ткани анемия встречается почти у половины пациентов, причем преобладает АХВ (Мазуров В. И., 2001).
При хронических заболеваниях почек анемия с уровнем гемоглобина менее 100 г/л регистрируется более чем у 25% больных
(Kammerer J. et al., 2002).
Этиопатогенез. При данной патологии нарушается использование железа организмом с пониженным выходом железа из макрофагов. Характерными изменениями при этом заболевании является наличие железа в ретикулоэндотелиальной системе костного
мозга (РЭС), но не в эритроидных предшественниках. Обычно
ЛХЗ встречается при активном ревматоидном артрите, остеомие-
Глава 12. Анемии
271
лите, туберкулезе легких, подостром бактериальном эндокардите,
хронических почечных инфекциях, опухолевых заболеваниях и лр.
Однако часто определить причину анемии, длительное время не
удается.
Анемия хронических заболеваний относится к анемиям со смешанным патогенезом, и в развитии заболевания играют роль следующие нарушения:
1) гипорегенераторное состояние костного мозга с понижением чувствительности эритроидных предшественников к эритропоэтину;
2) нарушение цитокиновой регуляции обмена железа и эритропоэза - повышение образования ИЛ-1, ФНОа, ИЛ-6 и ИНФ;
3) нарушение обмена железа элементами раздраженной ретикулоэндотелиальной системы, в том числе выхода железа из макрофагов;
4) повышенное потребление железа неэритроидными клетками;
5) дефицит эритропоэтина за счет нарушения его продукции и
присутствия в крови неспецифического ингибитора активности
эритропоэтина;
6) ДВС-синдром, сопровождающийся внутрисосудистым гемолизом и кровопотерями;
7) действие лекарственных препаратов на обмен железа.
Кроме того, возможен истинный дефицит железа и гемолиз эритроцитов. Длительность жизни эритроцитов при АХЗ снижена на
20-30%, замедлена скорость созревания эритроцитов (Соболева М. К., 1994; Луговская С. А., 1997; Воробьев П. А., 2001; Црschitz D. А., 1990; Шиффман Ф. Д., 2000).
Иногда Отдельно выделяют такой вариант АХЗ, как анемия при
хронической почечной недостаточности, основным патогенетическим механизмом которой является угнетение эритропоэза токсическими веществами и, как дополнительный фактор, кровопотери
с развитием дефицита железа при проведении повторных сеансов
гемодиализа. Причем в этом случае часто имеется прямая зависимость глубины анемии от степени нарушения функции почек и
концентрации креатинина в сыворотке крови (Kammerer J. et al.,
2002).
Клиническая картина. В клинической картине преобладают
симптомы основного заболевания. Анемия, как правило, умеренно выражена с уровнем гемоглобина 70-110 г/л (Lipschitz D. А.,
1990; Гусева С. А., 2001). При значительном снижении гемоглобина имеют место проявления анемического синдрома, гипоксии
тканей.
272
Часть 2. Клиническая гематология
Диагностика. На начальных этапах болезни анемия обычно носит нормохромный характер; средний диаметр и средний объем
эритроцитов остаются в норме. По мере прогрессирования заболевания эритроциты становятся гипохромными, меньшего размера,
то есть анемия приобретает характер гипохромиой микроцитарной, а это требует проведения дифференциальной диагностики с
ЖДА. В пользу АХЗ свидетельствует повышенный уровень железа и ферритина в сыворотке и нормальный индекс анизоцитоза —
RDW (разброс размеров эритроцитов относительно среднего значения), свидетельствующий о гомогенности популяции эритроцитов. При этом для АХЗ характерно опережающее снижение средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (МСНС) в сравнении с показателем среднего объема эритроцитов (MCV), в то время
как для ЖДА свойственна обратная картина и типично повышение RDW (Кузнецова Ю. В. и др., 1996).
Уровень ретикулоцитов в норме или несколько снижен. Осмотическая стойкость эритроцитов, как правило, существенно не изменяется. Часто отмечается повышенная СОЭ.
В миелограмме больных существенных изменений не отмечается. Характерным для АХЗ является наличие адекватных или повышенных запасов железа в клетках РЭС при сниженном его количестве в эритроидных предшественниках, то есть количество
сидеробластов в костном мозге уменьшено.
Нередко наблюдаются диспротеинемия, повышение в плазме
С-реактивного белка, гаптоглобина, церулоплазмина и (^-компонента комплемента. Содержание сывороточного эритропоэтина может
быть умеренно повышено (Гусева С. А., 2001; Мазуров В. И., 2001).
У больных с АХЗ наблюдается пониженный уровень общей
железосвязывающей способности (ОЖСС). Уровень ферритина в
норме или повышен, что отражает наличие нормальных или даже
повышенных запасов железа в РЭС, с одной стороны, и реактивное
изменение концентрации ферритина в плазме как острофазового
белка, с другой стороны (Шиффман Ф. Д., 2000). Снижение в сыворотке уровня феррнтина или увеличение сывороточных трансферриновых рецепторов указывает на сочетание истощения запасов железа и воспаления.
Лечение. Положительные результаты лечения анемии могут
быть достигнуты при успешной терапии основного заболевания.
При ряде заболеваний (ревматоидный артрит и др.) положительный терапевтический эффект дает применение глюкокортикоидов
(ГК) за счет снижения образования воспалительных цитокинов, а
также андрогенов (Вуд М., Банн П., 2001; Гусева С. А., 2001).
Глава 12. Анемии
2'73
Терапия препаратами железа обычно бесполезна и даже противопоказана, учитывая риск развития гемосидероза внутренних органов.
Для коррекции анемии у больных с низким уровнем эндогенного эритропоэтина (Эпо) успешно применяют препараты рекомбинантного Эпо (Эритростим, Эпрекс — препараты рекомбинантного эпоэтина-альфа; Рекормон — препарат бета-эритропоэтина; Эпомакс — эпоэтин-омега и др.) в относительно больших дозах —
100-150 МЕ/кг. К этой категории больных в первую очередь относятся пациенты с анемией при почечной недостаточности, при ряде
злокачественных опухолей, множественной миеломе, ВИЧ-инфекции и ревматоидном артрите (Lipschitz D. А., 1990; Шпффмаи Ф. Д.,
2000). В случаях тяжелой анемии и при наличии выраженного
гипоксического синдрома показаны трансфузии эритрошпарной
массы.
Мегалобластные анемии
В ^дефицитная анемия
Вр-дефицитная анемия (В р -ДА) входит в группу мегалобластных анемий, связанных с нарушением синтеза ДНК и РНК; развивается в условиях дефицита витамина Вр (кобаламина) в организме и характеризуется мегалобластическим типом кроветворения.
Мегалобластоз относится к патологическим процессам, характеризующимся задержкой созревания я/iep гемопоэтических клеток-предшественников при продолжающемся развитии и нормальной гемоглобинизации цитоплазмы. Результатом такой ядерно-цитоплазматической диссоциации является продукция клеток
больших размеров, чем нормальных. •
Первые подробные описания Вр-ДА под названием пернициозной (гибельной) анемии сделаны в 1855 г. Т. Аддисоном (Addison Т.), затем в 1870-1980-е гг. А. Бирмером (Biermer А.). Однако патогенез заболевания был окончательно выяснен только в 2030-е годы XX столетия благодаря работам Дж. Майнота (Minot G. R.) и В. Мерфи (Murphy W. Р.), В. Б. Касли (Castle W. В.) и
других исследователей.
Распространенность. В Северной Европе Вр-ДА встречается у
0,1% всего населения, а среди пожилых лиц частота встречаемости
увеличивается до 1%. По данным широкомасштабных исследований последних лет, до 20% пожилых лиц в Соединенных Штатах
имеют различной степени выраженности дефицит кобаламина, вероятно, из-за сниженного всасывания (так называемой пищевой
кобаламиновой малабсорбщш) (Вуд М., Банн П., 2001). Заболева-
274
Часть 2. Клиническая гематология
емость пернициозной анемией (вариант'В,,-ДА) среди лиц старше
40 лет на 100 тысяч составляет 25 человек в год (Шиффман Ф. Д.,
2000).
Этиология. Этиология заболевания может быть экзогенной
(алиментарной) и эндогенной.
Алиментарная недостаточность редко встречается среди лиц, в
рацион которых входит пища животного происхождения, так как
В г, имеется во всех видах животной пищи и содержится в мышцах,
паренхиматозных тканях, а дневные потребности в кобаламине
невелики (около 1 мкг). При этом в организме имеются определенные запасы В р , так что дефицит накапливается за годы, как правило, среди пациентов с нарушенным всасыванием и у строгих вегетарианцев.
Пищевой витамин В р , иногда называемый внешним фактором,
попадает в желудок в комплексе с белками, которые отщепляются
под действием пепсина, а кобаламин образует комплекс со специфическими белками желудочного секрета, в первую очередь транскобаламином I. В дальнейшем указанный комплекс переносится в дистальную часть двенадцатиперстной кишки к внутреннему фактору (ВФ) пли фактору Касла — белку, который секретируется париетальными клетками желудка. Вновь образованный
комплекс ВФ-кобаламин абсорбируется в дистальном отделе подвздошной кишки при участии мембраносвязывающих рецепторов.
В сыворотке крови кобаламин связывается с транспортным белком транскобаламином II и целенаправленно переносится в органы и ткани (Шиффман Ф. Д., 2000; Воробьев П. А., 2001). Нарушение в любом из указанных звеньев может стать причиной дефицита витамина В12 в организме.
Эндогенные причины дефицита витамина В ]2 включают резекцию тонкого кишечника, тотальную гастрэктомию, частичную гастрэктомию и создание тощекишечных или других кишечных обходных путей. Недостаточность поджелудочной железы и чрезмерное
развитие микрофлоры тонкого кишечника, разрушающей витамин,
также могут быть причиной малабсорбции кобаламина. В частности, В|7-ДА сопровождает синдром Золлингера-Эллисона, при котором имеется сочетание гиперпаратиреоза, множественных язв
желудка и двенадцатиперстной кишки и множественных аденом
островкового аппарата поджелудочной железы со сниженной активностью протеолитических ферментов, участвующих во всасывании кобаламина. К эндогенной Вр-ДА относят анемию Аддисона-Бирмера, обусловленную атрофией слизистой фундального отдела желудка с прекращением секреции внутреннего фактора Касла
Глава 12. Анемии
275
и нарушением всасывания В р . Редко встречается врожденное отсутствие Вр-связывающих компонентов (синдром ИммерслундаГрасбека) или нарушения структуры их молекул (Абдулкадыров К. М. и др., 1999; Шиффман Ф. Д., 2000).
Определенная часть больных с тяжелым дефицитом кобаламина страдает аутоиммунным заболеванием — периициозноп анемией. Термин предложен А. Бирмером в 1872 г.. когда патогенез
данного вида анемии был еще неясен и к этой категории относили всех больных Вр-ДА. В настоящее время под пернициозной
анемией подразумевают нарушение аутоиммунной природы, характеризующееся нарушением секреции ВФ слизистой желудка.
У больных с пернициозной анемией имеется желудочная ахлоргидрия и атрофия париетальных клеток желудка, которые продуцируют внутренний'фактор. необходимый для нормального всасывания витамина В р . При обследовании более чем у 90% больных определяются антитела к париетальным клеткам желудка,
относящиеся к классу иммуноглобулинов G, однако они не являются специфичными только для першщиозной анемии. Более показательно выявление антител к ВФ, которые могут быть обнаружены примерно у 60% больных (Шиффман Ф. Д., 2000). Не исключается вероятность генетической предрасположенности к
развитию пернициозной анемии с наследованием, по всей вероятности, по аутосомно-рецессивному типу (Гусева С. А. и др.,
2001). Иногда это аутоиммунное заболевание сочетается с другими заболеваниями аутоиммунной природы, особенно касающимися щитовидной железы (тиреоидит Хашимото и др.), и с витилиго. Пернициозную анемию обычно выявляют у лиц среднего
или пожилого возраста, но возможно ее развитие и у молодых
больных (Вуд М., Банн П., 2001 и др.).
Таким образом, к основным причинам развития В]7-ДА относятся:
1) гастрэктомия, резекция тонкой кишки;
2) атрофический гастрит с отсутствием внутреннего фактора и
нарушением всасывания В,,,;
3) рак фундального отдела желудка;
4) энтериты с нарушением всасывания;
5) гельминтозы (инвазия широким лентецом) и чрезмерное развитие микрофлоры кишечника (в условиях множественного дивертикулеза и др.), при которых имеет место конкурентное потребление витамина паразитами или микрофлорой;
6) недостаточное поступление В12 с пищей — строгое вегетарианство.
276
•
Часть 2. Клиническая гематология
Патогенез. В организме человека кобаламин участвует в двух
основных процессах: метаболизме нуклеиновых кислот и синтезе
и регенерации миелина. Одновременно витамин В12 участвует в
обмене жирных кислот и нейтрализации токсичной метилмалоновой кислоты. Соответственно в условиях дефицита кобаламина
(витамина В р ) эти процессы нарушаются в большей или меньшей
степени.
Замедление синтеза ДНК ведет к остановке митозов на более
ранних фазах (в S фазе при частичной репликации ДНК), нарушению синхронности созревания клетки и гемоглобинообразования.
В результате ядросодержащие клетки костного мозга приобретают
вид мегалобластов с характерными признаками анаплазии. Мегалобласты частично разрушаются в костном мозге, частично переходят в мегалоциты и выходят в циркуляцию.
Поскольку В р -ДА обусловлена нарушениями в синтезе ДНК,
большинство клеток костного мозга страдает в той или иной степени. Также могут наблюдаться мегалобластные изменения со стороны других быстро делящихся клеток, таких как поверхностный
эпителий языка и оболочка желудочно-кишечного тракта.
При тяжелой мегалобластной анемии созревающие эритроидные клетки разрушаются в костном мозге до выхода в циркуляцию. Это интрамедуллярное разрушение эритроидных клеток увеличивает сывороточный уровень непрямого билирубина и лактатдегидрогеназы.
Кобаламин выполняет роль кофактора двух важных внутриклеточных ферментов — метионинсинтетазы в цитоплазме и в
митохондриях катализирует переход метилмалонил-КоА (метилмалонил коэнзим А) в сукцинил-КоА (сукцинил-коэнзим А). В первой реакции метилтетрагидрофолат превращается в тетрагидрофолат, необходимый для работы ряда ферментов синтеза ДНК.
В ходе этой же реакции сульфгидрилсодержащая аминокислота
гомоцистеин превращается в метионин. Следовательно, дефицит
кобаламина приводит к повышению уровня общего сывороточного гомоцистеина. Кобаламин также необходим для реакции, в которой потенциально токсичный метилмалонил-КоА переходит в
легко метаболизирующийся сукцинил-КоА. Когда кобаламиновый
кофактор снижен, избыток метилмалонил-КоА гидролизируется в
метилмалоновую кислоту, которая может быть определена и в плазме, и в моче. Увеличение содержания метилмалоновой кислоты
имеется у 99% больных с клинически значимыми проявлениями
дефицита кобаламина, такими как мегалобластная анемия (Шиффман Ф. Д., 2000; Вуд М., Банн П., 2001). Нервной системе для
Глава 12. Анемии
277
нормального роста и функционирования требуется кобаламин в
достаточном количестве. У лиц с его дефицитом может развиться
демиелинизирующее нарушение, захватывающее головной мозг,
задние столбы спинного мозга и иногда периферические нервы.
Причем неврологическая симптоматика может опережать развитие анемии.
Клиническая картина. Заболевание развивается постепенно, и
часто пациенты обращаются за медицинской помощью уже при
значительном снижении уровня гемоглобина. Клиническая картина болезни определяется нарушениями со стороны желудочно-клшечного тракта (ЖКТ), а также кроветворной и нервной системы
(Кассирский И. А., Алексеев Г. А., 1970). Больные предъявляют
жалобы на диспепсические явления, нарастающую слабость, повышенную утомляемость, головокружения и другие проявления,
связанные с прогрессирующей анемией. У ряда больных теряются
вкусовые ощущения, появляется отвращение к мясной и другим
видам пищи. На различных этапах заболевания могут появляться
боли и жжение в языке, особенно при употреблении кислых продуктов, и при осмотре нередко определяется характерный для
В12-ДА глоссит. Первоначально определяются участки воспаления
по краям и на кончике языка, затем процесс распространяется на
весь язык и другие слизистые ротовой полости. Язык может приобретать вид «малинового». Позднее сосочки языка атрофируются, и он приобретает вид «лакированного языка».
Одновременно пациенты нередко отмечают нарушения сна, парестезии в виде «ползанья мурашек», онемения дистальных отделов конечностей, чувства «ватных ног», иногда возникают боли
корешкового характера. Неврологические нарушения при В12-ДА
известны под названием фуникулярного миелоза. Наиболее частыми симптомами являются болезненные парестезии и атактическая походка. В патологический процесс могут вовлекаться глазные
нервы и вегетативная нервная система. Иногда у больного имеются нервно-психические нарушения в виде депрессии, эмоциональной лабильности, нарушений памяти или органического психоза.
При отсутствии адекватной терапии и прогрессировании патологического процесса у больных могут наблюдаться тяжелые трофические расстройства, парезы и параличи нижних конечностей, нарушение функции тазовых органов, возможны психические нарушения с появлением бреда, галлюцинаций и эпилептических
приступов (Кассирский И. А., Алексеев Г. А., 1970). Причем могут
иметь место значительные расхождения между тяжестью неврологических проявлений и мегалобластной анемией. Так, у 25% боль-
2/8
Часть 2. Клиническая гематология
ных с дефицитом кобаламина имеют место главным образом неврологические нарушения при нормальных или почти нормальных гематологических показателях (Вуд М., Банн П., 2001).
Для внешнего вида больных В12-ДА характерны бледность кожи
с лимонно-желтым оттенком, субиктеричность склер, лицо часто
одутловато. Возможно появление диффузной или локальной гиперпигментации кожи. Нередко определяется увеличенная безболезненная печень мягкой консистенции. Реже может быть выявлена умеренная спленомегалия.
При физикальном обследовании могут быть определены нарушения вибрационной и проприоцептивной чувствительности.
Классификация. В12-ДА, как и другие виды анемий, подразделяется на группы в зависимости от степени тяжести и этиологического фактора.
Ниже представлены основные варианты В|7-ДА.
I. Экзогенная ВГ,-ДА.
I. Алиментарная В)2-ДА.
II. Эндогенная ВГ,-ДА.
1. В12-ДА, обусловленная резекцией желудка, тонкого кишечника.
2. Вр-ДА, обусловленная энтеритами с нарушением всасывания, глистной инвазией.
3. Анемия Аддисона-Бирмера, обусловленная атрофией слизистой фундального отдела желудка.
4. Пернициозная анемия — аутоиммунная атрофия париетальных клеток.
5. Врожденное отсутствие или структурные и функциональные
аномалии Вг,-связывающих компонентов (синдром Иммерслунда-Грасбека, наследственный дефицит транскобаламинаПидр.).
Диагностика. Сбор анамнеза и обследование должны быть ориентированы как на обнаружение признаков самой В,,-ДА, так и на
выявление вероятной причины заболевания.
При опросе пациента с предполагаемой В,,-ДА особое внимание обращается на режим питания больного, наличие патологии
ЖКТ, неврологических и аутоиммунных' нарушений. Из данных
объективного обследования в пользу мегалобластной анемии свидетельствуют такие признаки, как сочетание бледности и желтушности кожных покровов и видимых слизистых, глоссит, неврологические признаки и симптомы дефицита кобаламина.
Основное значение в диагностике ВГ,-ДА принадлежит морфологическим исследованиям крови и костного мозга. В анализах
Глава 12. Анемии
279
крови обращает на себя внимание нормо- или гиперхромный характер анемии и наличие макроцитоза. Средний диаметр и средний объем эритроцитов увеличен (СД - 8,5 мкм и выше, СрОЭ
или MCV — 100 фл или выше). Эритроциты, диаметр которых
превышает 11-12 мкм, обозначают как мегалоциты. Высокий МС\*
при нормальном индексе анизоцитоза (RDW) указывает на гомогенный макроцитоз, вероятной причиной которого является мегалоб.таетная анемия. Для макро- и мегалоцитов характерна гиперхромия — повышенная насыщенность гемоглобином в цитоплазме
клеток. Отмечаются анизо-, пойкилоцитоз и базофильная зернистость эритроцитов за счет наличия элементов РНК. Во многих
эритроцитах обнаруживаются остатки ядра в виде телец Жолли и
колец Кебота. Характерен низкий уровень ретикулоцитов, возможны умеренная лейко- и тромбоцитопения. Тромбоциты нередко
увеличены в размерах и имеют необычную форму. Как правило,
выявляется гиперсегментация полиморфноядерных гранулоцитов
(наличие 5 и более ядерных долей), что является отражением нарушения синтеза ДНК во всех клеточных рядах.
Для подтверждения мегалобластоидного типа кроветворения
показано исследование пунктата костного мозга. В костном мозге
при В,.,-ДА отмечается.эритроидная гиперплазия с мегалобластической реакцией. Клетки эритроидного ряда увеличены в размерах, вследствие нарушения синхронности в созревании ядро выглядит менее зрелым, чем цитоплазма. Имеет место картина так
называемого «синего костного мозга». В мегалобластах структура
ядер более нежная, чем в соответствующих клетках эритроидного
ряда при нормоблаетическом кроветворении. Эритроидные клетки крупные, с повышенным содержанием гемоглобина. Выявляются гигантские формы предшественников гранулоцитов, а зрелые
гранулоциты часто полисегментированы. Количество мегакариоцитов в норме, но иногда при тяжелой ВГ)-ДА и при наличии мегалобластоидных изменений ядер клеток оно снижено.
Как результат интрамедуллярного гемолиза эритроцитов и сниженной продолжительности жизни циркулирующих эритроцитов
за счет непрямой фракции у больных отмечается гипербилирубинемия и повышается уровень ЛДГ в сыворотке крови. Уровень
сывороточного железа в норме или несколько повышен.
Имеются методы определения концентрации Вр в сыворотке
крови, что служит отражением запасов кобаламина в организме.
Однако существует мнение, что только существенно сниженный
сывороточный уровень является указанием на клинически значимый дефицит витамина В , а очень высокий уровень исключает
280
Часть 2. Клиническая гематология
его. В ситуации, при которой обследуется больной с умеренной
мегалобластной анемией и уровнем сывороточного кобаламина на
нижней границе нормы, необходима комплексная оценка клинических и лабораторных данных, так как уровень витаминов в сыворотке не всегда точно отражает внутриклеточные биохимические
процессы. В сомлительных случаях клиницист может назначить
терапию соответствующим витамином и внимательно следить за
клиническим эффектом и динамикой анализов крови или же продолжить исследования определением метилмалоновой кислоты и
общего гомоцистеииа. Уровень метилмалоновой кислоты в сыворотке повышен при дефиците В12. В то же время уровень данной
кислоты в плазме бывает повышен также при редко встречающихся врожденных нарушениях метаболизма кобаламина и при почечной недостаточности, хотя в последнем случае повышение обычно
умеренное (менее 500-1000 нмоль/л). Если почечная патология
исключена, то повышение метилмалоновой кислоты является диагностическим признаком тканевого дефицита кобаламина (Шиффман Ф. Д., 2000; Вуд М, Банн П., 2001).
Общий гомоцистеин при повышенном его уровне может свидетельствовать в пользу В | Г ДА, но не относится к скрининговым
тестам, так как может быть повышен не только при дефиците кобаламина или фолата, но также при почечной недостаточности и
реже — при врожденных нарушениях обмена веществ (Вуд М.,
Банн П., 2001).
Для постановки диагноза пернициозной анемии проводится тест
Шиллинга, в котором измеряется всасывание принятого внутрь
радиоактивного кристаллического кобаламина. Обычно проводится
двойной тест, в котором также определяется повышение показателя при добавлении внутреннего фактора. Модификации теста, называемого пищевым кобаламиновым тестом Шиллинга, не нашли
широкого клинического признания. Сам тест Шиллинга в настоящее время проводится нечасто из-за наличия других методов диагностики, включая определение аутоантител к париетальным клеткам и ВФ (Шиффман Ф. Д., 2000; Вуд М„ Банн П., 2001).
Дифференциальная диагностика. Проводится с другими видами анемий. С учетом эритроцитарных параметров основные сложности возникают в отличии Вр-ДА от других макроцитарных анемий, поскольку увеличенный размер эритроцитов может быть не
результатом мегалобластического кроветворения, а следствием других причин, не связанных с синтезом ДНК. Дефицит витамина В12
следует отличать от таких заболеваний, как апластическая анемия,
рефрактерная анемия пли миелодиспластический синдром (МДС).
Глава 12. Анемии
281
Макроцитарную анемию с панцитопенией могут вызывать как гипо-, так и гипертиреоидизм, а также алкоголизм, хронические заболевания печени. Причиной макроцитоза также могут стать хронические заболевания почек и курение. Большое число ретикулоцитов может повышать показатель MCV. поскольку ретикулоциты
являются крупными клетками. Иммунные гемолитические анемии по эритроцитарным параметрам обычно характеризуются как
макроцитарные анемии с гетерогенной популяцией эритроцитов
(Кузнецова Ю. В. и др., 1996). Вследствие этого гемолитическая
анемия иногда ошибочно принимается за мегалобластную. В таких
случаях наряду с выявлением признаков гемолиза необходимо проведение пробы Кумбеа для выявления аутоантител к эритроцитам.
Прием лекарственных препаратов, в частности, цитостатического
ряда, ингибирующих синтез ДНК, может привести к мегалобластозу (Шиффман Ф. Д., 2000; Вуд М., Банн П., 2001).
Иногда гиперклеточный костный мозг с морфологически измененными клетками-предшественниками эритроидного ряда при
мегалобластной анемии ошибочно принимается за острый лейкоз.
В сложных случаях цитологическое исследование аспирата костного мозга позволяет отличить выраженные мегалобластные изменения от острого лейкоза и мегалобластоидного кроветворения
(напоминающего мегалобластное, но не являющегося таковым) при
миелодиспластическом синдроме или анемии при хронической
почечной недостаточности (Кассирский И. А., Алексеев Г. А., 1970;
Абдулкадыров К. М. и др., 1999; Воробьев П. А., 2001).
Дифференциальный диагноз между такими близкими формами
анемий, как В|2-ДА и фолиеводефицитная анемия, проводится с
учетом анамнеза, выявляющего характерные этиологические факторы, наличия неврологических нарушений, не свойственных дефициту фолатов, и по специальным тестам (определение концентрации витаминов, тест Шиллинга).
Лечение. Терапия больных В12-ДА направлена на устранение
причины заболевания, коррекцию имеющихся анемических и неврологических проявлений и восполнение депо цианкобаламина в
организме.
Лечение больных Вр-ДА проводится витамином В19 (цианкобаламином, оксикобаламином) в виде внутримышечных или внутривенных инъекций. Обычной начальной суточной дозой препарата
при тяжелой анемии является доза в 500-1000 мкг, хотя некоторыми авторами высказывается мнение о том, что одномоментное введение 1000 мкг и более кобаламина нецелесообразно, поскольку в
таких концентрациях препарат в полной мере не связывается бел-
282
Часть 2. Клиническая гематология
ками крови (Воробьев П. А., 2001). При повышении уровня гемоглобина доза может быть снижена до 200-400 мкг в сутки. В случаях, сопровождающихся проявлениями фуникулярного миелоза,
используются большие дозы цианкобаламина более длительное
время. Показателем адекватности и эффективности терапии служит ретикулоцитарный криз, под которым понимают значительное повышение уровня ретикулоцитов на 3-5-й день терапии витамином В г , с .максимальным подъемом на 4- 10-й день. В ходе лечения показан контроль уровня калия в крови, поскольку возможно
развитие гипокалиемии (Гусева С. А. и др.. 2001).
В отдельных случаях при подозрении на Вр-ДА и сложности
установления точного диагноза (например, у больных, уже получавших кобаламин незадолго до обследования) под контролем уровня ретикулоцитов крови проводится терапия ex juvantibus. Появление ретикулоцитарного криза будет свидетельством верного диагноза.
При определении длительности курса терапии необходимо иметь
в виду, что целью лечения является не только нормализация клинико-гематологических показателей, но и восполнение запасов витамина В| ,в организме, которые составляют в среднем 2-5 мг. Учитывается и способность препаратов задерживаться в организме.
Так, из общей дозы введенного цианкобаламина усваивается около
30%, а оксикобаламина, который обладает способностью лучше
связываться с белками плазмы. — 70-80% (Воробьев П. А., 2001).
Соответственно средний курс терапии цианкобаламином обычно
продолжается 4-6 недель, оксикобаламшюм — 2-3 недели. В последующем проводится поддерживающая терапия, интенсивность
и длительность которой (от нескольких месяцев до нескольких
лет) зависит от этиологии и исходной тяжести анемии.
Режимы введения цианкобаламина при проведении поддерживающей терапии могут быть различны: недельные курсы с ежедневным введением 200-500 мкг препарата каждые 3 месяца (или
оксикобаламина но 20С мкг 1 раз в полгода), однократное введение
дозы в 200-500 мкг один раз в неделю или 1000 мкг 1 раз в месяц
(Воробьев П. А., 2001; Гусева С. А. и др., 2001; Pediatrics at a glance,
1998).
Стандартной терапией является назначение Вр только парентерально, поскольку почти все случаи дефицита обусловлены
нарушением всасывания. Однако может быть эффективен и пероральный прием, предусматривающий повышенные дозы (1 мг
ежедневно) цианкобаламина для пероралыюго приема. Обычные
поливитаминные драже содержат не более 6 мкг кобаламина и
Глава 12. Анемии
283
неэффективны для лечения и профилактики В]9-ДА, особенно при
синдроме мальабсорбции.
Проведение гемотрансфузий с заместительной целью показано
лишь на короткий период и только тем больным, у которых имеет
место крайне тяжелая степень анемии с риском развития анемической комы.
Необходимо обратить внимание на то, что при вероятности сочетания В,,-ДА и фолиеводефицитной анемии, а также при невозможности проведения дифференциальной диагностики между этими двумя состояниями верной тактикой терапии будет назначение
цианкобаламина с последующим добавлением фолиевой кислоты.
В противном случае, если больного с В|2-ДА лечат фолиевой кислотой, то гематологические изменения могут частично нормализоваться, однако неврологические нарушения будут прогрессировать,
поскольку дефицит кобаламина не был возмещен.
При сочетании дефицита витамина В 12 и дефицита железа терапия проводится сочетанием препаратов витамина и железосодержащих препаратов в соответствующих дозировках. Причем назначение последних может быть рекомендовано и больным без клинических признаков ЖДА в случае тяжелой В)2-ДА в период
активизации кроветворения на фоне терапии кобаламином.
Причиной мегалобластной анемии, не регрессирующей при специфической витаминотерапии, не является дефицит витаминов.
В этом случае требуется уточнение диагноза.
Прогноз. До выяснения патогенеза Вр-ДА и введения в практику лечения препаратами кобаламина заболевание характеризовалось плохим прогнозом, вплоть до летального исхода, особенно
при пернициозной анемии. В настоящее время прогноз благоприятный. Большинство больных излечиваются. В случаях, когда причину заболевания полностью устранить невозможно (тотальная и
субтотальная гастрэктомия и другие), пациенты нуждаются в регулярной, часто пожизненной поддерживающей терапии, что обеспечит им отсутствие анемии и хорошее качество жизни.
Профилактика. Профилактические мероприятия заключаются
в обеспечении адекватного поступления витамина В 12 с пищей и
компенсации дефицита витаминными препаратами, своевременном выявлении и лечении заболеваний и патологических состояний, способствующих развитию дефицита кобаламина. Пациенты
после обширных хирургических вмешательств на ЖКТ, нарушающих всасывание В | 7 , нуждаются в длительном (многолетнем, часто
пожизненном) введении кобаламина парентерально для профилактики развития В]7-ДА.
284
Часть 2. Клиническая гематология
Проведение профилактических мероприятий важно, в частности, и ПОТОМУ, что сопровождающая В12-ДА гипегомоцистеинемия
считается одним из предрасполагающих моментов для развития и
прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний (Вуд М.,
Банн П., 2001), а у беременных повышенный уровень гомоцистеина является одной из причин привычных выкидышей и рождения
детей с врожденной патологией.
Фолиеводефицитная анемия
Фолиеводефицитная анемия (ФДА) — это один из видов мегалобластных анемий, обусловленный дефицитом фолатов в организме.
Этиология. Данной формой анемии чаще болеют люди молодого и среднего возраста. Дефицит фолатов нередко является результатом недостаточного содержания в пище фолиевой кислоты. Основными источниками фолиевой кислоты являются субпродукты,
зеленые листовые овощи, фрукты. Быстро растущим детям, беременным женщинам, а также больным с гемолитической анемией
требуется больше фолата, и у них может развиться дефицит даже
при адекватной диете. Заболевания верхних отделов желудочнокишечного тракта, глютеновая энтеропатия и болезнь Крона могут
приводить к нарушению всасывания фолата и его дефициту.
Имеется ряд лекарственных препаратов, которые, вмешиваясь
в метаболизм фолатов, приводят к мегалобластной анемии. К таким препаратам, в частности, относятся метатрексат, карбамазепин, дифенилгидрантоин, триамтерен, триметоприм и пириметамин. Злоупотребление алкоголем нередко приводит к мегалобластной анемии, поскольку алкоголь нарушает метаболизм фолатов, а
достаточное количество фолатов с пищей хронические алкоголики
получают редко (Гусева С. А. и др., 2001; Вуд М., Банн П., 2001).
Таким образом, к основным причинам развития ФДА относятся:
1) алиментарная недостаточность (недостаток свежих овощей,
фруктов);
2) энтериты с нарушением всасывания;
3) прием медикаментов, нарушающих всасывание и угнетающих синтез фолиевой кислоты (противосудорожные препараты,
оральные контрацептивы, барбитураты, метатрексат и др.);
4) хроническая алкогольная интоксикация;
5) повышенная потребность в фолиевой кислоте (беременность,
гемодиализ, неоплазмы, гемолиз, эксфолиативный дерматит).
Патогенез. Резервный пул фолиевой кислоты в организме сравнительно мал, и если снижено поступление или повышен расход
Глава 12. Анемии
285
кислоты, это ведет к развитию ее дефицита в течение нескольких
недель. Дефицит кобаламина и фолатов приводит к идентичным
гематологическим изменениям в виде мегалобластной анемии. Оба
витамина являются кофакторами фермента метионинсинтетазы,
так что дефицит фолатов, так же как и дефицит кобаламина, приводит к повышению уровня сывороточного гомоцистеина (Вуд М.,
Бани П., 2001; Гусева С. А. и др., 2001). Как и при В17-ДА, происходит пнтрамедуллярное разрушение эритроидных клеток, в результате чего может увеличиваться уровень непрямого билирубина
сыворотки.
Клиническая картина. Заболевание развивается постепенно.
Клиническая картина ФДА аналогична В)7-ДА, за исключением
неврологических нарушений.
Диагностика. Диагноз фолиеводефицитной анемии ставят на
основании характерных изменений в гемо- и миелограмме при соответствующей клинической картине заболевания.
Для уточнения диагноза и дифференцировки ФДА и В,.,-ДА
целесообразно определить уровень сывороточных и эритроцитарных фолатов. Однако уровень сывороточных фолатов изменяется
в широких пределах и может временно нормализоваться при поступлении с пищей, а потому не всегда точно отражает степень их
дефицита в организме. Более достоверным показателем запасов
фолатов является уровень фолатов эритроцитов (Вуд М., Банн П.,
2001). Однако как стандартное исследование определение фолатов
в эритроцитах не утвердилось в клинической практике из-за сложности и недостаточной информативности.
Дифференциальная диагностика ФДА основывается на тех же
принципах, что и В|2-ДА. В то же время необходимо иметь в виду,
что нередко встречаются сочетанные анемии, особенно у беременных.
Для разграничения В]2-ДА и ФДА необходимо выявление характерных этиологических факторов, определение признаков фуникулярного миелоза, свойственного В12-ДА. Большинство биохимических показателей в данном случае малоинформативно, кроме
непосредственного определения концентрации кобаламина и фолатов в крови больного. Так, повышение уровня метилмалоновой
кислоты и общего гомоцистеина имеется как при дефиците кобаламина, так и при дефиците фолатов. Однако повышенный за счет
дефицита кобаламина уровень- гомоцистеина не изменяется под
действием лечения фолиевой кислотой, И наоборот. Поэтому повторные исследования в ходе специфической терапии иногда дают
возможность различить эти два заболевания (Вуд М., Банн П.,
286
Часть 2. Клиническая гематология
2001). То же касается и развития ретикулоцитарного криза при
проведении пробной терапии В | 7 или фолиевой кислотой.
Вероятна также сочетанная недостаточность дефицита фолатов
и железа, для которой характерна нормоцитарная анемия с гетерогенной популяцией эритроцитов (Кузнецов Ю. В. и др., 1996). В таком случае показано исследование показателей обмена железа и
уровня фолиевой кислоты.
Лечение. У большинства больных фолиеводефицитная анемия
может быть излечена назначением пероралыю 1 мг фолиевой кислоты в день. Однако терапевтическая суточная доза фолиевой кислоты у больных с нарушенным всасыванием при патологии ЖКТ
составляет 5-15 мг в сутки. Длительность лечения составляет, как
правило, около месяца. Терапия проводится под контролем показателей гемограммы (уровень гемоглобина и эритроцитов, эритроцитарные параметры, появление ретикулоцитарного криза) до
нормализации показателей красной крови. При невозможности
полного устранения факторов, способствующих развитию дефицита фолатов, в дальнейшем проводятся профилактические курсы
терапии.
Прогноз. Благоприятный при адекватном лечении анемии и
устранении причины заболевания.
Профилактика. Профилактические мероприятия включают в
себя наблюдение за лицами из групп риска, коррекцию диеты и
назначение профилактических доз фолиевой кислоты при заболеваниях и состояниях, способствующих развитию ФДА.
Женщинам, находящимся в детородном возрасте и планирующим забеременеть, рекомендуется увеличить потребление фолатов с пищей, тем более что такие меры позволяют уменьшить примерно на 50% распространенность патологии, связанной с дефектами нервной трубки у эмбриона (Вуд М., Банн П., 2001). Для
беременных женщин рекомендуемая доза фолиевой кислоты составляет 1 мг в день (Гусева С. А. и др., 2001). Многие исследователи считают особенно важным назначение препарата фолиевой кислоты всем беременным женщинам с признаками дефицита железа,
' независимо от наличия или отсутствия признаков дефицита фолиевой кислоты в организме, включая сывороточный уровень фолатов (Juares-Vazquez J., Bonizzoni E., Scotti A., 2002). Профилактическое назначение фолиевой кислоты в дозе 1 мг в день рекомендуется также новорожденным с весом менее 1500 г и пациентам с
врожденной или длительно существующей гемолитической анемией (Pediatrics at a glance, 1998). Следует, однако, отметить, что
положение об эффективности профилактического применения
Глава 12. Анемии
'
287
фолиевой кислоты не всегда доказательно и у некоторых категорий пациентов из групп риска (в частности, у больных, находящихся на хроническом гемодиализе), по всей вероятности, не
оправдано.
Мембранопатии
К мембранопатням относят группу гемолитических анемий, как
правило, наследственных, обусловленных дефектами цитоскелета
эритроцитов, что сопровождается изменением их формы.
Данная группа анемий характеризуется внесосудистым (внутриклеточным) гемолизом, при котором эритроциты измененной
формы разрушаются преимущественно макрофагами селезенки.
За поддержание нормальной дисковидной двояковогнутой формы красных клеток крови, как известно, ответственны различные
протеины, располагающиеся на их субмембранной поверхности.
К таким белкам относятся спектрин и анкирип («якорный» белок,
фиксирующий белковую сеть цитоскелета на липидиом матриксе
мембраны), составляющие основу молекулярной структуры цитоскелета, и добавочные белки полосы 4.1 и 4.9, белок полосы 5.
(актин), белок полосы 4.2 и аддуцин, обеспечивающие спектринактиновое взаимодействие (Сторожок С. А. и др., 1997). В зависимости от внешнего вида эритроцитов, определяемого характером аномалии, выделяют:
. 1) сфероцитоз со сферической формой клеток;
2) эллиптоцитоз (овалоцитоз) с эритроцитами в форме эллипса;
3) пиропойкилоцитоз, характеризующийся наличием в крови
большого количества сфероцитов и овалоцитов, с выраженным
анизо- и пойкилоцитозом;
4) стоматоцитоз с выявлением в мазках крови эритроцитов, имеющих характерное просветление в виде поперечной щели (стомы);
5) акантоцитоз с наличием своеобразных выпячиваний мембраны эритроцитов.
Наиболее часто встречающейся формой патологии является наследственный сфероцитоз, реже встречается овалоцитоз, и относительно редки остальные виды мембранопатии и связанные с ними
виды анемий.
Наследственная сфероцитарная анемия
(шыедственный сфероцитоз)
Наследственный сфероцитоз (НС) — группа патологических
состояний, характеризующихся гемолитической анемией, сплело-
288
Часть 2. Клиническая гематология
мегалией и наличием эритроцитов сферической формы в периферической крови.
Кроме названия «наследственный сфероцитоз» или «микросфероцитоз», что менее точно, так как объем эритроцитов обычно
в норме, данная нозология обозначается также как болезнь Минковского-Шоффара (по фамилиям авторов, подробно описавших
данную патологию в начале 1900-х гг.) или как-врожденная гемолитическая анемия.
Этиопатогенез. Заболевание врожденного, обычно наследственного характера. Обусловлено мутациями в генах, кодирующими
мембранные белки цитоскелета эритроцитов. Наследуется, как правило, аутосомно-доминантно, однако не исключается и аутосомнорецессивное наследование. Считается, что для первого типа наследования более характерна анемия легкой и средней степени тяжести, в то время как при рецессивном типе чаще встречается
клинически тяжелая форма (Шиффман Ф. Д., 2000). Тип аномалии в цитоскелетных белках эритроцитов может быть различным:
чаще встречаются аномалии спектрина и анкирина, реже отмечаются аномалии сегмента 3. и протеина 4.1 или 4.2.
При наследственном сфероцитозе имеется дефицит спектрина
почти у всех больных и степень дефицита прямо коррелирует с
тяжестью гемолиза. Кроме того, аномальные молекулы спектрина более чувствительны к иротеолизу с разрывом пептидных связей в местах локализации дефектов в полипептидных цепях. У одних больных имеется первичный дефект спектрина, в то время
как у других выявляется дефект таких мембранных протеинов,
как анкирин или белок полосы 3., которые прикрепляют снектрин к мембране. Липидная структура мембраны при этом дестабилизируется, ведя к изменению площади поверхности и сфероцитарной форме эритроцитов, теряется способность эритроцитов
к деформации, нарушается работа Na+/K4-насоса мембраны. В измененных эритроцитах может быть выявлено пониженное содержание солей калия, АТФ, ряда ферментов и другие биохимические нарушения. Такие ригидные клетки задерживаются и разрушаются в селезенке (Сторожок С. А. и др., 1997; Вуд М., Банн П.,
2001 и др.).
Показано, что сфероцитарную форму основная масса эритроцитов с аномалиями мембранных белков приобретает при прохождении через селезенку, причем при прохождении клеток через синусы селезенки может нарушаться целостность мембраны эритроцита (Гусева С. А. и др., 2001). Преждевременная (не по мере
старения) сферуляция эритроцитов в периферической крови ведет
Глава 12. Анемии
•
289
к укорочению продолжительности жизни эритроцитов и их разрушению макрофагами селезенки. Длительность жизни эритроцитов
укорачивается до 12-14 дней, что требует компенсаторного усиления работы эритроидного ростка костного мозга (Шиффман Ф. Д.,
2000; Гусева С. А. и др. 2001).
Клиническая картина. Первые признаки заболевания могут отмечаться как в детском, так и в зрелом возрасте. Иногда болезнь
протекает скрыто и является случайной находкой, в том числе и
у лиц пожилого возраста. Основным проявлением наследственной
сфероцитарноп анемии является умеренно выраженная желтушная окраска кожи и видимых слизистых оболочек, нередко без
клинически значимых проявлений анемии и интоксикации. К данной категории больных относится известное выражение о том, что
они «более желтушны, чем больны». Отсутствие анемии длительное время у ряда больных объясняется компенсаторным повышением продукции эритропдных клеток в костном мозге. Такое компенсированное течение заболевания может наблюдаться у 25% больных (Гусева С. А. и др., 2001). Желтушная окраска кожи и склер
нередко проявляется под воздействием таких провоцирующих факторов, как переохлаждение, беременность, повышенные физические нагрузки или эмоциональный стресс. Усиление гемолиза обычно наблюдается на фоне инфекционных заболеваний. У пациентов
молодого возраста может отмечаться умеренное отставание в физическом развитии. В дальнейшем в клинической картине заболевания на первый план может выходить симптоматика, связанная с
образованием пигментных камней и присоединением желчнокаменной болезни. Последняя выявляется примерно у половины пациентов (Гусева С. А. и др., 2001). По мере снижения компенсаторных возможностей кроветворения и развития анемии у больных
появляются соответствующие жалобы и проявления анемического
синдрома.
При осмотре больных, наряду с различной степени выраженности бледностью и иктеричностью кожных покрдвов и слизистых,
определяется спленомегалия. Селезенка чаще плотная, безболезненная. Одновременно может выявляться и гепатомегалия, болезненность в проекции желчного пузыря.
Очень редко встречается осложнение НС в виде трофических
язв голеней. Могут отмечаться цитоскелетные аномалии (высоко
стоящее «готическое» небо, «башенный» череп, укорочение мизинцев, полидактилия, изменение расположения зубов), нередко
сопровождающие наследственную сфероцитарную анемию. Наличие указанных аномалий у больных НС связывают как с вероятны10 Гематология. Нов. справочник
290
Часть 2. Клиническая гематология
ми хромосомными аномалиями, так и с компенсаторным расширением плацдарма кроветворения в условиях хронического гемолиза
в период роста костей.
Таким образом, кроме анемии заболевание может проявлять себя следующими симптомами и осложнениями:
1) задержка роста и развития;
2) сниженная толерантность к нагрузкам;
3) холелитиаз;
4) гемолитические кризы;
5) аиластические кризы.
Гемолитические кризы при НС у разных больных встречаются с
различной частотой: у некоторых пациентов могут не наблюдаться
на протяжении всей жизни, у других же появляются неоднократно
каждый год. Такие кризы зачастую провоцируются инфекцией и
сопровождаются слабостью, лихорадкой, желтухой, нередко — рвотой и болями в животе, что напоминает картину инфекционного
гепатита или других инфекционно-воспалительных заболеваний,
и в этом случае требуется проведение дифференциально-диагностических исследований.
У больных с хронической гемолитической анемией может развиться апластический криз, причину которого связывают с дефицитом микроэлементов и витаминов. В данном случае при цптопении в крови в костном мозге может сохраняться повышенное
число эритроидных предшественников, в том числе с мегалобластическими признаками. Однако апластические кризы могут провоцироваться и парвовирусной инфекцией. При этом парвовирус
приводит к глубокому истощению эритроидных предшественников в костном мозге с появлением гигантских пронормобластов
(Вуд М., Банн П., 2000). Данное осложнение, свойственное различным формам хронических гемолитических анемий при НС, встречается нечасто.
Диагностика. Диагноз сфероцитарной анемии основывается на
наличии у пациента характерных морфологических изменений
эритроцитов.
Из лабораторных /данных обращает на себя внимание наличие
микроцитоза по мазку крови с отсутствием центрального просвета
в эритроцитах. Средний диаметр эритроцитов, как правило, составляет 5,8-6,4 мкм при норме 7,2-7,5 мкм. При этом средний
объем эритроцитов (MCV) соответствует норме, а толщина клеток
увеличена до 2,5-3 мкм (в норме 1,9-2,1 мкм). Соотношение между диам тром и толщиной эритроцитов («индекс сферичности»),
в норме составляющее 3,4-3,9, при НС значительно снижается,
Глава 12. Анемии
291
причем количество сфероцитов при НС различается у отдельных
больных: от относительно небольшой доли у одних до абсолютного большинства эритроцитов сферической формы у других. Выраженность признаков гемолиза в значительной степени зависит
от общего количества микросфероцитов в циркуляции (ИдельсонИ.Л. и др., 1975).
Показатели насыщения эритроцитов гемоглобином (ЦП, МСН,
МСНС) и уровень сывороточного железа обычно в норме, за исключением тех случаев, когда на фоне длительно существующего
гемолиза в организме развивается железодефицитное состояние.
Показатель МСНС у части больных может быть повышен.
Количество лейкоцитов и тромбоцитов обычно в пределах нормы. Появление нейтрофильного лейкоцитоза возможно в период
гемолитического криза. В случаях апластических кризов отмечается резкое снижение уровня гемоглобина и эритроцитов, ретикулоцитопения.
В костном мозге выявляется компенсаторное усиление'эритропоэза в виде эритроидной реакции нормобластического типа с повышенным содержанием базофнльных, полихроматофильных, оксифильных эритрокариоцитов (нормобластов). Как и при других
гемолитических анемиях, изменяется соотношение лейко : эритро
(общего числа клеток лейкоцитарного и эритроидного рядов).
В норме данное соотношение составляет в среднем 3:1, при с фероцитарной же анемии оно может увеличиться до 1 : 1 и более. 3 некоторых случаях, особенно после гемолитических кризов, в миелограмме отмечается появление небольшого количества мегалобластов, по-видимому, как отражение повышенного расхода фолиевой кислоты в период криза.
Отмечаются признаки гемолиза, такие как увеличение уровня
ретикулоцитов, повышение содержания билирубина различной
степени выраженности за счет непрямой фракции и повышение
уровня уробилина в моче. Осмотическая резистентность эритроцитов у большинства больных снижена: при норме 4,6-4,8 г/л —
для начального гемолиза и 3,2-3,3 г/л — для полного гемолиза у
больных НС показатели могут быть увеличены до 5-6 и 3,8-4 г/л
соответственно. Гемолиз начинается при концентрации солей, близкой к физиологическому раствору. Более показательно у данной
группы больных определение осмотической резистентности после
суточной инкубации эритроцитов и исследование кислотных эритрограмм с определением скорости распада эритроцитов при рН
3,0, отражающие повышенную хрупкость эритроцитов (Идельсон И. Л. и др., 1975).
292
Часть 2. Клиническая гематология
При исследовании белков мембраны эритроцитов по специальным методикам электрофореза в полиакриламидном геле можно
идентифицировать дефекты отдельных мембранных белков (Сторожок С. А. и др., 1997).
Дифференциальный диагноз проводится с желтухами другой
этиологии (инфекционным гепатитом, обструктйвной желтухой,
синдромом Жильбера и другими), иммунной гемолитической
анемией, спленомегалиями другой этиологии. При дифференциальной диагностике наряду с выявлением морфологически измененных эритроцитов, отрицательной пробой Кумбса и другими
лабораторными данными немаловажное значение могут иметь тщательно собранный семейный анамнез и обследование родственников больного для выявления у них признаков НС.
Лечение. При клинически компенсированном состоянии больного, отсутствии значимого гемолиза и анемии терапия обычно
ограничивается симптоматическими средствами, в том числе направленными на профилактику развития желчнокаменной болезни (желчегонные, фитотерапия и рациональная диета).
При тяжелом гемолизе с выраженной анемией и при апластических кризах с низким уровнем гемоглобина производятся трансфузии эритроцитарной массы.
Как и при других формах гемолитических анемий, у больных
НС нередко развивается дефицит фолатов, в связи с чем в лечении
этой категории больных используется фолиевая кислота.
Одним из основных методов терапии у больных сфероцитарной
анемией является спленэктомия. Оперативное лечение считается
показанным больным с наличием клинических проявлений гемолитической анемии средней и тяжелой степени или ее осложнений,
в том числе при наличии желчнокаменной болезни, особенно у лиц
молодого возраста. Детям младшего возраста спленэктомия производится редко из-за высокого риска тяжелых постспленэктомических инфекционных осложнений. Многие авторы рекомендуют при
подготовке к операции проведение больным иммунизации поливалентной вакциной против пневмококков, Haemofilus influenzae и менингококков за несколько недель до спленэктомии (Вуд М., Банн П.,
2000; Гусева С. А. и др., 2001). В результате удаления селезенки
прекращается или значительно уменьшается гемолиз эритроцитов и
увеличивается продолжительность их жизни, причем этот эффект
наиболее выражен у пациентов с дефектом спектрина и анкирина
(Reliene R. et al., 2002). Проведение спленэктомии целесообразно
сочетать с холецистэктомией, особенно у пациентов с признаками
холестаза и проявлениями желчнокаменной болезни.
Глава 12. Анемии
293
Наследственный эллиптоцитоз
Наследственный эллиптоцитоз (НЭ) — заболевание, характеризующееся наличием в крови эритроцитов овальной формы.
Этиопатогенез. Заболевание с аутосомно-доминантным типом
наследования, хотя у небольшой части больных возможен и рецессивный тип. При наследственном эллиптоцитозе (НЭ) в патологический процесс вовлекаются горизонтальные взаимодействия между спектрин-спектрином и спектрин-протеином полосы 4.1. Подобный дефект ослабляет цитоскелет, снижает стабильность
мембраны, нарушает деформируемость эритроцитов. Как следствие
молекулярных дефектов может наблюдаться дефицит гликофорина С. Эритроциты приобретают форму эллипса после выхода из
костного мозга. Как и сфероциты при наследственном сфероцитозе, эллиптоциты разрушаются селезенкой (Шиффман Ф. Д., 2000;
Вуд М., Банн П., 2001; Гусева С. А. и др., 2001).
В этой группе выделяют так называемый южно-азиатский или
маланезийский овалоцитоз с наличием большого числа стоматоцитов (эритроциты с неокрашенным участком, ограниченным изогнутыми линиями в форме рта в центре), а также наследственный
сферотический эллиптоцитоз с проявлениями, сходными как с наследственным сфероцитозом, так и НЭ.
Клиническая картина. У большинства пациентов с наследственным эллиптоцитозом симптоматика отсутствует или отмечается
умеренная анемия и спленомегалия. Гемолитическая анемия может наблюдаться у новорожденных с НЭ. У взрослых транзиторный гемолиз обычно провоцируется инфекцией, беременностью
или другими факторами. Более тяжелое течение заболевания, которое чаще наблюдается у гомозигот с дефицитом белка 4.1 или
изменением структуры и функции р-спектрина, характеризуется
изменением костей скелета, гемолитической анемией, изъязвлением кожи голеней.
Диагностика. Наследственный эллиптоцитоз диагностируется
по мазку периферической крови и при наличии сходных изменений эритроцитов у членов семьи. У больных НЭ содержание
эллиптоцитов в крови обычно колеблется от 25 до 75% (Идельсон И. Л. и др., 1975). При более тяжелом течении заболевания в
мазках крови определяются выраженный пойкилоцитоз, фрагментированные эритроциты. Осмотическая резистентность эритроцитов нормальна или умеренно снижена.
Дифференциальный диагноз проводится с другими гемолитическими анемиями. В частности, описаны случаи (Идельсон Л. II.
294
Часть 2. Клиническая гематология
и др., 1975) подозрения на серповидно-клеточную анемию у больных НЭ при резко измененной, удлиненной и изогнутой форме
эритроцитов.
Лечение. С учетом бессимптомного или малосимптомного течения заболевания, у большей части больных лечение часто ограничивается симптоматическими средствами. Для пациентов с наиболее тяжелыми формами эллиптоцитоза выбирают спленэктомию.
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия
(болезнь Маркиафавы-Микели)
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) — заболевание, обусловленное приобретенным клональным расстройством
гемопоэтических стволовых клеток и характеризующееся нестабильностью клеточных мембран клеток клона с повышенной их
чувствительностью к комплементу, основным проявлением которого является хронический внутрисосудистый гемолиз с гемоглобинурией и развитием анемии.
Этиопатогенез. Причиной возникновения патологического клона является мутация в PIG-A гене (Glycosylphosphatidylinositolglycan complementation group А), располагающемся на Х-хромосоме.
Это ведет к неспособности клеток продуцировать гликозилфосфатидилинозитольный якорь, общий для ряда протеинов на мембране клеток (CD59, CD58, CD14 и других), способных подавлять
активность поздних компонентов комплемента. В итоге снижения
экспрессии комплементинактивирующих протеинов увеличивается чувствительность клеток к комплементу. Таким образом, эритроциты, лейкоциты и тромбоциты больных с ПНГ обладают аномально повышенной чувствительностью к комплементу нормальной активности. Мутации в Х-связанном гене, который кодирует
фермент, необходимый на первом этапе биосинтеза гликозилфосфатидилинозитольных якорей, дает преимущество выживаемости
патологическому клону за счет того, что клетки становятся устойчивы к апоптотической гибели (Вуд М., Банн П., 2001). Многими
исследователями отмечено наличие различных по иммунофенотипическим характеристикам клеток эритроидной линии у больных
ПНГ с выделением двух-трех типов клеток, а также расхождения в
частоте встречаемости клеток ПНГ-фенотипа (то есть с нарушенной экспрессией GPI-связанных протеинов) среди эритроидных и
гранулоцитарных клеток у одного и того же больного. Такие закономерности, выявленные у больных ПНГ, позволяют предполагать
наличие у них более одного клона с характерными для данного
Глава 12. Анемии
295
заболевания особенностями (Pakdeesuwan К. et al., 2000). Это предположение подтверждается и данными исследований характера
мутаций в PIG-А гене, которые могут быть представлены в различных вариантах и сочетаниях, вследствие чего часто сосуществуют
несколько патологических клонов (Pavlu J. et al., 1998).
Эритроциты у больных ПНГ в зависимости от их чувствительности к комплементу делятся на три типа: с нормальной реакцией
на комплемент (тип I), с умеренно повышенной чувствительностью (тип II) и эритроциты, наиболее подверженные гемолизу с
чувствительностью, в десятки раз превышающей чувствительность
нормальных клеток (тип III). У абсолютного большинства больных имеется смешанный тип клеток с наличием эритроцитов типа I
и II (Pakdeesuwan К. et al., 2000). Гемолиз эритроцитов при ПНГ
происходит внутри сосудов, где свободный гемоглобин связывается белком сыворотки — гаптоглобином и бета-глобулином гемопексином, данный комплекс в дальнейшем разрушается в рстикулоэндотелиальной системе. Гемолиз при ПНГ обычно столь значителен, что в конце концов связывающая способность гаптоглобина и гемопексина исчерпывается, образуется метгемальбумин.
Высвобождаемое вследствие массивного внутрисосудистого распада эритроцитов большое количество гемоглобина и железа не
может быть полностью захвачено клетками ретикулоэндотелиальной системы, и это проявляется гемоглобинурией и гемосидеринурией.
Нейтрофилы больных ПНГ также обладают повышенной чувствительностью к литическому действию комплемента, однако
средняя продолжительность их жизни существенно не снижается.
Нарушена преимущественно функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов со снижением способности к фагоцитозу,
хемотаксису, бактерицидное™. Дефицит GPI-связанных протеинов при ПНГ более выражен на миелоидных клетках и значительно менее значим у лимфоидных, но имеются определенные нарушения и в отношении функции лимфоцитов. Так, выявляется снижение уровня иммуноглобулина G, нарушение процессов апоптоза,
реакции гиперчувствительности замедленного типа и ряд других
функциональных нарушений (Bessler M. et a!.. 2002). Все это ведет
к повышенной подверженности пациентов к различным инфекционно-воспалительным заболеваниям. Нередко наблюдаемая при
ПНГ нейтропения в большей степени бывает связана с гипоплазией костного мозга. Тем более что при данном заболевании в определенной части случаев встречаются пшопластические варианты с
пониженной функциональной активностью костного мозга и тен-
29G
Часть 2. Клиническая гематология
денцией к панцитопенни. В последние десятилетия выделяют даже
отдельный вариант ПНГ, так называемый синдром апластическая
анемия/пароксизмальная ночная гемоглобинурия (АА/ПНГ). По
всей видимости, между этими двумя заболеваниями существуют
определенные патогенетические связи (не вполне понятные на сегодняшний день) (Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, 1995;
Tichelli A. et al., 1988; Shresenmeier H. et al., 1995).
Тромбоциты при болезни Маркиафавы-Микели характеризуются повышенной чувствительностью к активации под воздействием комплемента и индукторов агрегации, что ведет к повышенной
частоте тромбоэмболпческих осложнений при данном заболевании (Шиффман Ф. Д., 2000).
Клиническая картина. Заболевание выявляется преимущественно у людей молодого возраста и обычно протекает в виде
гемолитических кризов, которые могут провоцироваться повышенной физической нагрузкой, инфекциями, вакцинациями, приемом
некоторых препаратов (аскорбиновой кислоты, иногда — препаратов железа и гепарина) и т. д. Основными проявлениями болезни
являются слабость, острые приступы болей в поясничной области
как следствие внутрисосудистого гемолиза, боли в животе и головные боли. У больных, как правило, отмечается сочетание бледности и желтушностп кожи. При длительном течении заболевания
у большинства пациентов определяется умеренная гепато- и спленомегалия.
Особенностью данной патологии является то, что гемоглобинурия с потемнением мочи (иногда до черного цвета) наблюдается
преимущественно в ночное время и утром. В течение дня последующие порции мочи становятся все более светлыми.
У больных ПНГ могут возникать тромбоз печеночных вен или
нижней полой вены (синдром Бадда-Киари), нарушение микроциркуляции в брыжеечных сосудах и портальной системе.
Возможны проявления кровоточивости, связанные с тромбоцитопенией, и (или) варикозные кровотечения из измененных вен
пищевода и др.
Нередко отмечается нарушение функции ночек, особенно в период гемоглобинурических кризов.
У некоторых больных бывает рекуррентная бактериальная инфекция, и 10% смертей связывают с инфекциями (Вуд М., Банн П.,
2001).
Могут встречаться длительные спонтанные ремиссии.
Диагностика. Пароксизмальную ночную гемоглобинурию следует заподозрить у больных с необъяснимым гемолизом в анамне-
Глава 12. Анемии
297
зе, наклонностью к цитопении и костномозговой гипоплазии и тромботическими эпизодами.
Число ретикулоцитов обычно повышено, и по мазкам периферической крови эритроциты морфологически не отличаются от
нормы. Вследствие гемолиза часто в крови присутствуют нормобласты, отмечается полихроматофилия. Осмотическая резистентное i ь эритроцитов не изменена. В результате значительных потерь
железа с мочой у больных ПНГ высока вероятность развития дефицита железа, и тогда эритроциты приобретают вид, характерный для ЖДА, — гипохромных с наклонностью к микроцитозу.
Число лейкоцитов и тромбоцитов часто снижено. Может наблюдаться и ианцптонения различной степени выраженности. Однако, в отличие от апластической анемии, наряду с цитопенией
обычно возникает ретикулоцитоз.
В костном мозге выявляется эритроидная гиперплазия. Нередко определяются гипоплазия костного мозга, сниженное содержание сидероцитов и сидеробластов.
В сыворотке крови повышено количество билирубина, свободного гемоглобина и метгемоглобина. Присутствую! признаки внутрисосудистого гемолиза, то есть снижение или отсутствие гаптоглобина (норма — гемоглобинсвязывающая способность 2002000 мкг/'л), повышение ЛДГ, повышенный уровень свободного
гемоглобина и железа в моче. Низкие уровни гаптоглобина постоянно наблюдаются при внутрисосудистом гемолизе, но также
бывают в случаях внесосудистого гемолиза, особенно хронического. Поскольку гаптоглобин является и острофазовым реагентом, то наиболее информативно его резкое снижение или отсутствие. В анализах мочи могут определяться гематурия и нротепнурия. Постоянными признаками, имеющими диагностическое значение, являются гемосидеринурия и выявление кровяного детрита
в моче.
Исследование больного на наличие признаков ПНГ-фенотипа
включает в себя пробы на повышенную чувствительность клеточных мембран к комплементу (проба Хема, сахарозный тест) и исследования методом проточной цитометрии с моноклональными
антителами к GPI-якорным протеинам.
Эритроциты при ПНГ гораздо более чувствительны к гемолизу
после активации нормального комплемента в сыворотке, чем нормальные клетки. Активация комплемента может быть получена
при слабом подкислении сыворотки (тест или проба Хема с кислотным гемолизом при рН 6,4) или при уменьшении ионной силы
сыворотки за счет использования сахарозы для поддержания ак-
298
Часть 2. Клиническая гематология
тивности комплемента (сахарозный тест на гемолиз или тест Хартмана). Второй тест более чувствителен и менее специфичен, чем
тест Хема. Источником комплемента в указанных тестах служит
сыворотка донора, к которой добавляют эритроциты больного.
Ранним и достоверным признаком ПНГ-фснотипа является
экспрессия GPI-связанных протеинов: экспрессию CD 14 и CD48
определяют на моноцитах, CD16 и CD66b — на гранулоцитах, CD48
и CD52 г- на лимфоцитах, CD55 и CD59 — на эритроцитах, CD55,
CD58 и CD59 — на тромбоцитах (Shubert J. et al, 1991; Shresenmeier H. et al., 1995). Пониженная их экспрессия свидетельствует в
пользу болезни Маркиафавы-Микели.
Дифференциальный диагноз проводят с другими видами гемолитических анемий, а при цитопеническом варианте ПНГ — с апластической анемией.
Лечение. При ПНГ единственным радикальным средством терапии может быть трансплантация костного мозга (ТКМ), при проведении которой для профилактики реакции «трансплантат против
хозяина» (РТПХ) используется циклоспорин А, в остальном лечение сводится к предотвращению осложнений заболевания.
В период гемолитических кризов проводится инфузионная дезинтоксикационная терапия. В связи с массивным гемолизом и развитием глубокой анемии при ограниченных компенсаторных возможностях у значительной части больных нередко возникает
необходимость в проведении заместительной гемокомпонентной
терапии. При этом используются трансфузионные среды, не содержащие плазму с комплементом: отмытые или размороженные
эритроциты.
Иногда бывает эффективно применение кортикостероидов в дозах 20-40 мг в сутки, андрогенов-оксиметолон в дозе 10-50 мг в сутки или других аналогичных препаратов, особенно при костномозговой гипоплазии (Воробьев П. А., 2001; Гусева С. А. и др., 2001).
Должны активно лечиться тромботические осложнения, многим больным постоянно необходимы антикоагулянты. Причем в
данном случае предпочтение, по возможности, отдается антикоагулянтам непрямого действия, поскольку они не вызывают активации комплемента (Гусева С. А. и др., 200-1). При явных признаках
железодефицитного состояния необходимы соответствующая коррекция диеты и прием железосодержащих препаратов с индивидуальным подбором медикаментов, учитывая их переносимость пациентом.
Предпринимались попытки лечения больных, страдающих ПНГ,
антитимоцитарным глобулином (АТГ). При этом отмечалось умень-
Глава 12. Анемии
299
шение числа гранулоцитов с ПНГ-фенотипом, снижение трансфузионной зависимости и снижение активности гемолиза. Положительный эффект АТГ связывают, в частности, с его комплементактивирующей активностью, за счет чего происходит элиминация
клеток патологического клона (Ebenbichler С. F. et al., 1996). Однако эффект обычно неполный и нестойкий.
Имеются сведения, указывающие на положительный опыт применения циклоспорина-А в дозах 5-10 мг/кг в день как средства
самостоятельной терапии у больных ПНГ. При этом отмечается
определенная положительная динамика в виде отсутствия ранее
наблюдавшихся гемолитических кризов и уменьшения потребности в трансфузиях отмытых эритроцитов, но с сохранением вялотекущего гемолиза и умеренной анемии. Механизм положительного
действия этого препарата при данной патологии остается неясным,
и нет единого мнения о целесообразности его применения у больных ПНГ. Возможно, имеет место блокирование циклоспорином
программы апоптоза в клетках кроветворной системы. Более эффективно использование и АТГ, и циклоспорина при АА/ПНГсиндроме. У больных этой категории под влиянием циклоспорина
в большинстве случаев улучшаются гематологические параметры,
снижается трансфузионная зависимость, повышается доля нейтрофилов с нормальной экспрессией GPI-связанных протеинов
(van Kamp H. et al., 1995; Ebenbichler С. F. et al., 1996).
Прогноз зависит от характера течения заболевания: частоты и
тяжести гемолитических кризов, наличия осложнений. Возможна
трансформация заболевания в острый лейкоз или миелодиспластический синдром. Средняя медиана выживаемости — около 10 лет
(Гусева С. А. и др., 2001). Большая часть больных погибает от
тромботических нарушений необычной локализации, таких как
мезентериальные вены, печеночные вены и венозные синусы мозга. Реже больные погибают от осложнений геморрагического и инфекционного характера.
Профилактика. Профилактики заболевания не существует, и
профилактические мероприятия заключаются в предупреждении
тяжелых осложнений заболевания. В первую очередь необходимо
проведение профилактики тромботических осложнений у больных ПНГ при хирургических вмешательствах, во время беременности и родов.
Ферментопатии
К ферментопатиям (энзимопатиям) относится разновидность
гемолитических анемий, как правило, наследственных, обуслов-
300
Часть 2. Клиническая гематология
ленных количественными и (или) качественными нарушениями
со стороны ферментных систем эритроцитов, что сопровождается
повышенной чувствительностью эритроцитов к оксидативному
стрессу, изменению энергетического обмена в клетке и другим неблагоприятным воздействиям.
В зависимости от того, аномалия какого фермента играет ключевую роль в развитии заболевания, выделяют три основные формы энзимопатий (Токарев Ю. Н. и др., 1983):
1-я — с патологией ферментов, относящихся к пентозофосфатному пути и системе глутатиона, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, пируваткиназы,
глютатион пероксидазы, глютатион S-трасферазы и др.;
2-я — с патологией ферментов, относящихся к пути ЭмбденаМсйергофа, характеризующаяся дефицитом гексакиназы, фосфофруктокиназы, триозофосфатизомеразы и др.;
3-я — с патологией ферментов, относящихся к метаболизму нуклеотидов, характеризующаяся дефицитом пиримидин 5-нуклеотидазы, АТФ-азы и др.
Наследственные нарушения обмена в большинстве случаев
обусловлены недостаточной активностью ферментов, участвующих в обмене глюкозы. Основное клиническое значение принадлежит дефициту глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, реже встречается анемия при дефиците пируваткиназы и других формах ферментопатий.
Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (ДГ-6-ФД) является наиболее распространенной наследственной аномалией метаболизма в эритроцитах, ведущей к сокращению длительности жизни
клеток.
Распространенность. Существуют данные, что дефицит Г-6-ФД
во всем мире имеется примерно у 400 млн человек (Fiorelly G. et al.,
2000). ДГ-6-ФД встречается в основном в тропических и субтропических странах «малярийного пояса», поскольку он представляет собой генетический полиморфизм, дающий преимущества в выживаемости при тропической малярии. Данная патология распространена среди афроамериканцев (у 6-30% населения), народностей
Дагестана (5-11%) и закавказских популяций, в частности, жителей Азербайджана (среди мужчин-гетерозигот доходит до 37,3%)
(Токарев Ю. Н. и др., 1983; Вуд М., Банн П., 2001). Широкомасштабные исследования но выявлению лиц с ДГ-6-ФД в арабских
странах показали, что частота встречаемости данной энзимопатий
Глава 12. Анемии
301
среди населения различных этнических групп колеблется от 1%
(на территории Египта) до 11,6% (в Иране) (Usanga E. A. et.al.,
2000). В различных группах населения Саудовской Аравии — колеблется от 4 до 13% (Gandapur A. S. et al., 2002).
В силу особенностей наследования, сцепленного с Х-хромосомой, патология более распространена среди мужской части населения. Так. при обследовании одной из популяций мужского пола в
Нигерии ДГ-6-ФД выявили у 23,9%, тогда как среди лиц женского
пола распространенность дефицита составила 4,6% (Ademowo О. G..
Falusi A. G.. 2002). При скрининговых исследованиях на ДГ-6-ФД
у новорожденных в Таиланде среди детей с положительными результатами доля мальчиков составила 11,1%, девочек — 5,6%
(Sanpavat S. et al., 2001). В Северном Китае ДГ-6-ФД обнаруживается примерно у 3% мужчин (Аи W. Y. et al., 2002).
ЭТИОЛОГИЯ. Наследование, сцепленное с полом; страдают преимущественно мужчины и гомозиготные женщины. Редко встречаются спорадические варианты.
В последнее десятилетие активно изучали особенности молекулярно-генетических изменений при ДГ-6-ФД, и к настоящему времени выявлено свыше 100 вариантов мутаций, приводящих к дефициту фермента (Hundsdoerfer P. et al., 2002). Частота встречаемости отдельных молекулярных дефектов различна в разных
регионах и отдельных этнических группах (Токарев Ю. Н. и др.,
1983: Ademowo О. G. et al., 2002; Ainoon О. et al., 2003).
Патогенез. При ДГ-6-ФД нарушения касаются начального этапа пентозно-фосфатного пути гликолиза, так называемого гексозомонофосфатного шунта, необходимого для сохранения и регенерации восстановленного глютатиона, предохраняющего гемоглобин
и другие протеины от окислительного повреждения. В случае дефицита Г-6-ФД в клетках образуется избыток перекиси водорода
и свободных радикалов, что ведет к денатурации внутриклеточного белка, изменению формы и структуры эритроцитарной мембраны и гемолизу эритроцитов. Гемолиз может провоцироваться многими лекарственными препаратами с высокой оксидантнои активностью в отношении эритроцитов. Классическим примером
являются антималярийные препараты — хинин, нримахин, хинакрин, использование которых у пациентов с данной патологией приводит к быстрому снижению гемоглобина и гематокрита и повышению числа ретикулоцитов. Другие лекарственные средства, вызывающие значительный гемолиз у больных с ДГ-6-ФД, включают
в себя сульфаирепараты, нитрофураны, препараты налидиксиновой кислоты, ряд противотуберкулезных препаратов (ПАСК, туба-
302
Часть 2. Клиническая гематология
зид), парацетамол (в больших дозах), метиленовый синий (применяемый как антидот при острых метгемоглобинемиях), доксирубицин и др.
Различают два типа заболевания:
1) африканский (более легкая форма А) — с умеренным снижением ферментативной активности;
2) средиземноморский (более тяжелая форма В) — наблюдается у жителей Азии и Средиземноморья.
Одной из наиболее тяжелых форм заболевания является фавизм (разновидность средиземноморского типа ДГ-6-ФД), для которого характерно развитие острого гемолиза после употребления
некоторых сортов бобовых. Встречается преимущественно в местах распространения бобовых культур: на побережье Средиземного и Черного морей, в Ираке, Иране, Китае и Америке.
При более легкой форме заболевания гемолиз, индуцированный препаратами оксидантного действия, как правило, дозозависим, поскольку только наиболее старые эритроциты гемолизируются данной дозой. Чем старте эритроцит, тем закономерно меньше в нем ДГ-6-ФД, и, таким образом, клетки более уязвимы. По
мере увеличения дозы препарата оксидантного действия гемолизируется значительно большая доля молодых эритроцитов с более
выраженной активностью ДГ-6-ФД, и таким образом гемолиз в
этом случае самоограничен. Феномен самоограничения гемолиза с
прекращением внутрисосудистого разрушения эритроцитов между 7-м и 12-м днем от момента действия гемолитического агента
наиболее ярко проявляется у женщин-гетерозигот и у лиц с африканским типом ДГ-6-ФД (Идельсон Л. И. и др., 1975: Токарев Ю. Н. и др., 1983; May J. et al.. 2000; Вуд М., Банн П., 2001).
Необходимо отметить, что нарушения при описываемой патологии касаются не только эритроидных клеток. В частности, отмечено, что дефицит фермента имеет место также и в печеночных
клетках, что приводит к более тяжелому течению сопутствующих
заболеваний печени (Gotsman A., Muszcat M., 2001). Кроме того,
поскольку ДГ-6-ФД участвует в метаболизме холестерина, при дефиците фермента отмечается снижение синтеза холестеролэстераз
(Batetta В. et al., 2002).
Выявлены сниженная способность лимфоидных клеток у больных с дефицитом ДГ-6-ФД отвечать на митогенную стимуляцию и
снижение способности моноцитов продуцировать интерлейкин-10
(Batetta В. etal., 2002; LieseA. M.etal.,2002). Этими нарушениями,
по-видимому, объясняются подтвержденная работами последних
лет статистически достоверная большая по сравнению со здоровы-
Глава 12. Анемии
303
ми лицами подверженность больных с ДГ-6-ФД ряду инфекционных заболеваний и более плохой прогноз при некоторых опухолевых болезнях (Cheng A. J. et al, 2001; Tabarra К. F. et al, 2001).
Иногда встречается сочетанная патология ферментов эритроцитов и гемоглобина: ДГ-6-ФД и а- или р-талассемпи, ДГ-6-ФД и
серповидно-клеточной анемии (Tagarelli A. et al., 2000; Hundsdoerfer
P. et al., 2002), возможно также сочетание ДГ-6-ФД и синдрома
Жпльбера (Kaplan M, 2001).
Клиническая картина. Заболевание может протекать в скрытой
форме, в виде гемолитических кризов, развивающихся в ответ на
провоцирующие факторы, или проявляться симптомами хронической несфероцитарной гемолитической анемии. Исследования, проведенные в Саудовской Аравии, показали, что среди лиц с ДГ-6-ФД
анемия определялась у 61%, в том числе анемия тяжелой степени — у 8% (Gandapur A. S. et al., 2002). Считается, что манифестные формы анемии, обусловленной ДГ-6-ФД, наблюдаются преимущественно при выраженном дефиците фермента, когда его уровень в эритроцитах снижен до 10-15% от нормы (Pediatrics at a
glance, 1998). Имеет значение и конкретный характер мутаций в
области гена ДГ-6-ФД, определяющий степень устойчивости эритроцитов к окислительному стрессу (Ермакова Т. А., Цветаева Н. В.,
2003; Fiorelly G. et al., 2000).
Первым проявлением заболевания может быть желтуха новорожденных. Отмечается, что частота развития желтухи у новорожденных с признаками ДГ-6-ФД составляет около 80% (Ainoon О.
et al., 2003), а в эндемичных районах 20% и более всех гипербилирубинемий новорожденных обусловлены именно ДГ-6-ФД (Sanpavat S.
et al., 2001). При этом вероятность развития такого тяжелого осложнения, как билирубиновая энцефалопатия (ядерная желтуха), у детей с дефицитом фермента достаточно высока. Этому проявлению
заболевания уделяется особое внимание из-за важности своевременной диагностики, которая бывает непростой, так как у родителей
дефицит Г-6-ФД нередко протекает в скрытой форме.
Наиболее распространенными являются эпизодические формы
гемолиза, при которых гемолитическая анемия, как правило, связана с приемом лекарств и инфекцией. Гемолиз, обусловленный
действием лекарственных препаратов, обычно проявляется через
2-4 дня после их приема. При более редком средиземноморском
варианте дефицита Г-6-ФД наблюдается хронический персистнрующий гемолиз, который иногда может переходить в тяжелый и
даже фатальный. Особенно характерны эпизоды острого тяжелого
гемолиза для фавизма, когда гемолитический криз начинается че-
304
Часть 2. Клиническая гематология
рез несколько часов или 1-2 суток после приема бобов в пищу
(Идельсон Л. И. и др., 1975; Токарев Ю. Н. и др., 1983; Вуд М.,
Банн П., 2001). Нередко при этом страдает функция почек, в период кризов определяется гемоглобинурия.
Течение болезни в виде хронической гемолитической анемии с
постоянно присутствующими умеренными признаками гемолиза
является относительно редким — до 2% среди больных с ДГ-б-ФД
(Токарев Ю. Н. и др., 1983). При этом, как правило, наблюдается
небольшое увеличение размеров печени и селезенки. На фоне длительно существующего гемолиза отмечается повышенная частота
встречаемости желчнокаменной болезни.
Как было отмечено выше, нарушение функции моноцитарномакрофагальных клеток приводит к тому, что у пациентов с выраженным дефицитом Г-6-ФД чаще встречаются и тяжелее протекают различные инфекциошю-воспалительные заболевания. В частности, частота развития сепсиса после тяжелых травматических
повреждений может превышать у больных ДГ-б-ФД частоту аналогичных осложнений у обычных пациентов более чем на 40%.
При этом длительность течения инфекционно-воспалительного
процесса почти в 3 раза дольше (Spolarics Z. et al., 2001).
В анализах крови выявляются анемия и ретикулоцитоз различной степени выраженности. Встречаются тельца Гейнца — внутриклеточные прецепитаты, которые образуются при окислении гемоглобина и могут выявляться специальной окраской. Удаление
части эритроцита с наличием телец Гейнца селезенкой ведет к появлению «обкусанных» клеток или форм с полостями и просветлениями, называемых «блистерными» (blister) формами. Могут
определяться сфероциты. Осмотическая резистентность эритроцитов чаще остается нормальной.
В костном мозге больных определяется картина, характерная
для большинства гемолитических анемий, — реактивная гиперплазия эритроидного ростка, при которой доля эритроидных клеток
может доходить до 50-70% от общего числа миелокариоцитов (Токарев Ю. Н. и др., 1985).
В крови на фоне гемолиза повышается уровень конъюгированного билирубина, однако его уровень редко достигает очень высоких
показателей. Характерными признаками для острого внутрисосудистого гемолиза являются гипергемоглобинемия и гемоглобинурия.
Диагностика. Поводом для обследования на дефицит Г-6-ФД в
неонатальном периоде является неблагоприятный семейный анамнез или длительная желтуха новорожденных при отсутствии признаков микросфероцитоза, иммунного конфликта по групповым и
Глава 12. Анемии
305
резус-антигенам и отрицательная проба Кумбса. В случаях выявления заболевания у взрослых причиной обследования на ДГ-6-ФД
обычно бывают гемолитические кризы, спровоцированные приемом медикаментов или инфекцией. При проведении диагностики
необходимо обратить внимание на этническую принадлежность
пациента с признаками гемолитической анемии и выяснить семейный анамнез.
Окончательно диагноз устанавливают на основании определения уровня ДГ-6-ФД в крови больных. У некоторых пациентов
непосредственно после гемолитического криза уровень фермента
может быть нормальным за счет неизмененной ферментативной
активности оставшихся в циркуляции эритроидных клеток, что
необходимо учитывать при проведении исследований. Активность
ДГ-6-ФД может быть определена спектрофотометрическнмн методами.
Объективным и достоверным лабораторным методом диагностики ДГ-6-ФД является скрининговое определение дефицита Г-6-ФД
методом флюоресцентных пятен (Вуд М., Банн П., 2000). При проведении скрининга на дефицит Г-6-ФД у новорожденных рекомендуется исследование пуповинной крови с применением мнкрометгемоглобинредуктазного теста (Sanpavat S. et al., 2001). Для
определения молекулярно-генетических особенностей применяются методики с использованием полимеразной цепной реакции.
Лечение. Терапия симптоматическая. Рекомендуется отмена
провоцирующих гемолиз лекарств..Проводится инфузионная терапия в сочетании с адекватной дегидратацией, особенно при гемолитических кризах. При развитии почечной недостаточности и анурии показан гемодиализ.
Как и при других формах хронических гемолитических анемий,
показан прием фолиевой кислоты, расход которой в организме
больных повышен. В случае развития дефицита железа назначают
железосодержащие препараты.
При критическом снижении уровня гемоглобина проводят
трансфузии эритроцитарной массы. Обменные трансфузии крови
проводят новорожденным с клиническими проявлениями заболевания. В более легких случаях желтухи новорожденных, обусловленной ДГ-6-ФД, может проводиться фототерапия, снижающая
концентрацию билирубина в крови. Для профилактики развития
желтухи и билирубиновой энцефалопатии у новорожденных детей
в последние годы рекомендуют применять ингибиторы оксигеназной активности, такие как Sn-мезопорфирины (Kappas A. et al.,
2001; Kaplan M, Hammerman С, 2002).
306
Часть 2. Клиническая гематология
В случаях тяжелого течения заболевания с наличием осложнений может быть произведена спленэктомия.
В последние годы разрабатывают подходы к генноинженерной
терапии с использованием векторных технологий при ДГ-6-ФД,
однако эти работы находятся еще на стадии экспериментов (Rovira A. et al, 2000).
Прогноз. Прогноз зависит от варианта и степени тяжести заболевания, наличия осложнений, в том числе сохранности функции
почек и возможности избегать контакта с провоцирующими факторами. При фавизме смертность составляет около 8% (Гусева С. А. и
др., 2001). Имеются данные о том, что тяжесть течения заболевания может зависеть от HLA-фенотнпа (Busson M. et al., 2002).
Профилактика. Основные профилактические мероприятия при
ДГ-6-ФД заключаются в максимально раннем выявлении патологаи
и предотвращении развития гемолиза, то есть сводятся к ограждению
страдающего данной патологией от провоцирующих факторов.
Для раннего выявления ферментонатий необходимы тщательный сбор семейного анамнеза, проведение медико-генетического
консультирования при планировании семьи и скрининговых исследований у новорожденных из групп риска.
У пациентов с выявленным ДГ-6-ФД ограничивается применение лекарственных препаратов оксидантного действия. Для страдающих сахарным диабетом особенно важно своевременное применение антидиабетических препаратов. Беременным женщинам
н кормящим матерям следует помнить о способности ряда химических веществ, в частности медикаментов, попадать к плоду через
плаценту или к грудному ребенку — через материнское молоко.
Дефицит пируваткиназы
Пируваткиназа, как и ДГ-6-ФД, является одним из ключевых
ферментов эритроцитов, дефицит которого может приводить к развитию наследственной несфероцитарной гемолитической анемии.
Распространенность. Дефицит пируваткиназы (ДПК) составляет до 95% случаев гемолитических анемий, обусловленных нарушениями процессов гликолиза (Гусева С. А. и др., 2001). Страдают этой патологией преимущественно жители североевропейского
региона, а также итальянцы, африканцы, сирийцы и японцы (ИдельсонЛ. И. и др., 1975).
Патогенез. Пируваткиназа является одним из основных эритроцитарных гликолитических ферментов, участвующих в образовании аденозинтрифосфата (АТФ), необходимого, в свою очередь,
для поддержания формы и деформируемости эритроцитов. Непо-
Глава 12. Анемии
307
средственный механизм гемолиза связывают, в частности, с нарушением контролируемого АТФ калий-натриевого насоса с потерей
инов К+ в эритроцитах и ретикулоцитах. Так же, как и при ДГ-6-ФД,
в случае дефицита пируваткиназы при оксидативном стрессе и других неблагоприятных воздействиях эритроциты с повышенной чувствительностью к комплексам, повреждающим мембранные протеины, подвергаются гемолизу.
Клиническая картина. Пируваткиназный дефицит выявляется
почти всегда у детей, и гемолиз умеренной степени тяжести наблюдается с самого рождения. Тяжесть течения заболевания зависит от характера мутации, определяющей степень нарушения термостабильности н активности фермента (Valentini G. et al., 2002).
Гемолитические кризы у больных с ДПК возникают спонтанно
или провоцируются инфекцией. У значительной части людей с
дефицитом пируваткиназы заболевание может протекать практически бессимптомно. У ряда пациентов наблюдается хронический
внутриклеточный гемолиз с умеренной гепато- или спленомегалией, постоянной билирубинемией за счет пеконыогированного билирубина и уробилинурией.
Картина крови может быть сходной с картиной при ДГ-6-ФД.
В мазках периферической крови часто выявляются эхиноциты (напоминающие по форме шишку или морского ежа), сфероциты, акантоциты (листовидные, шпорообразные клетки) и дегидратированные эритроциты (ксероциты). В костном мозге выявляется выраженная гиперплазия эритроидных элементов, часто с признаками
неэффективного эритропоэза и эритрофагоцитоза.
Диагностика. Диагноз ставится при проведении исследований
ферментной активности в гемолизате эритроцитов больного и родственников, причем степень активности фермента далеко не всегда
коррелирует с тяжестью гемолиза (Идельсон Л. И. и др., 1975;
Токарев Ю. Н. и др., 1985). Возможно исследование молекулярных
перестроек в мутантном гене (Valentini G. el al., 2002).
Лечение. Принципы терапии те же, что и в отношении ДГ-6-ФД.
У больных с отставанием в развитии, хронической трансфузионной зависимостью и тяжелой анемией иногда используют спленэктомию.
Гемоглобинопатии (гемоглобинозы)
В группу гемоглобинопатии (гемоглобинозов) входят патологические состояния, обусловленные нарушением нормальной
структуры гемоглобина, что является частой причиной гемолиза
эритроцитов с развитием гемолитической анемии.
308
Часть 2. Клиническая гематология
Синтез гемоглобина начинается с этапа предшественников эритропоэза — эритропоэтинчувствительных клеток. Гемоглобин представляет собой гетеродимерный тетрамер, состоящий из четырех
молекул содержащего железо гема и белковой части, включающей
в себя две пары гемоглобиновых цепей. Гемоглобиновые цепи в
норме у взрослого человека представлены в основном в двух вариантах: а- и (3-цепей. В небольшом количестве синтезируются у- и
5-цепи. При этом две цепи, входящие в молекулу гемоглобина,
являются а-цепями. а другая пара — цепями другого типа. В раннем послеродовом периоде у детей, так же как у плода, синтезируется в основном гемоглобин F (HbF), состоящий из пар а- и у-цепей. В дальнейшем по мере взросления ребенка в эритроцитах
начинает преобладать гемоглобин А (НЬА), представленный а- и
(3-цепями. У взрослых НЬА составляет 95-98% и 2-2,5% приходится на НЬА2, содержащий две а- и две 5-цепи. Для сохранения
растворимости тетрамеров гемоглобина необходимо сбалансированное соотношение различных гемоглобиновых цепей. Недостаточное образование одной из них и избыточное образование других, а также структурные изменения глобиновых цепей при гемоглобинопатиях приводят к нарушению физико-химических
свойств гемоглобина, преципитации его в эритроците и повреждению клетки (Токарев Ю. Н. и др., 1983; Шиффман Ф. Д., 2000).
Гемолитические анемии, обусловленные гемоглобинопатиями,
встречаются чаще всего в средиземноморских странах и других
регионах, эндемичных для малярии, поскольку эритроциты, содержащие патологический гемоглобин, малярийным плазмодием практически не поражаются. Такая особенность приводит к тому, что
лица с патологией гемоглобина более устойчивы к тропической
малярии и, по всей видимости, имеют преимущество в выживаемости в зоне малярийного пояса.
Выделяют следующие варианты гемоглобинопатии:
1) серповидно-клеточная анемия;
2) талассемия;
3) гемолитические анемии, обусловленные нестабильными гемоглобинами (гемоглобины Bristol, Zurich, Волга и др.).
Наиболее часто встречаются два первых варианта. Нередки и
сочетанные формы талассемии и серповидно-клеточной анемии.
Серповидно-клеточная анемия
Серповидно-клеточная анемия (СКА), или серповидно-клеточная болезнь — аутосомно-наследуемое заболевание, вызываемое
аномальной структурой (З-глобина и гомозиготным носительством
Глава 12. Анемии
309
гемоглобина S (HbS), обладающего пониженной растворимостью
и способностью к полимеризации.
Первые описания заболевания относятся к началу XX в. К середине столетия была выяснена причина заболевания — наличие
аномального типа гемоглобина.
Распространенность. Данный вид гемоглобинопатии распространен в странах Средиземноморского бассейна, среди народов
Средней Азии, Центральной Индии, Азербайджана, Грузии, Дагестана, чернокожих жителей Америки и Африки. В отдельных районах тропической Африки частота носительства HbS достигает
40% (Идельсон Л. И. и др., 1975).
Этиология. Причиной заболевания являются точечные мутации в гене (3-цепи гемоглобина, в результате чего синтезируется
HbS, в котором глутаминовая кислота в 6-м положении замещена
валином.
Патогенез. При СКА содержание HbS у различных пациентов
колеблется в довольно широких пределах — от 23 до 98% (Наque А. К. et al, 2002). При этом основную роль в патогенезе заболевания играет полимеризация деоксигенированного HbS с образованием паракристаллического геля, что приводит к деформации
эритроцитов и гемолизу. Одновременно в серповидных клетках
наблюдается сниженная эффективность К+/Ыа*-насоса, накопление ионов кальция. Изменение ионных потоков вызывает потерю
воды клеткой и ускоряет процессы полимеризации (Токарев Ю. А.
и др., 1983).
При гетерозиготной форме патология проявляется только в условиях заметного снижения парциального давления кислорода.
У гомозигот заболевание протекает в виде тяжелой гемолитической анемии. Средняя продолжительность жизни эритроцитов у
больных, гомозиготных по HbS, — 17 дней (Шиффман Ф. Д., 2000).
Деформированные эритроциты при этом виде гемоглобинопатии принимают своеобразную форму серпа или полумесяца. Такие
серповидные эритроциты повышают вязкость крови, взаимодействуют с эндотелием сосудов, тромбоцитами, коагуляционными
белками, вызывая нарушения микроциркуляции и гипоксию в органах и тканях, включая и костный мозг. В тяжелых случаях имеют
место вазокклюзионные кризы с выраженной ишемией и болевыми приступами. В результате нарушения микроциркуляции, очаговых инфарктов в ряде органов постепенно развивается фиброз.
Так, фиброзные изменения мелких артерий, артериол и венул в легочной ткани и самих легких по данным аутопсии выявляются
у 95% больных СКА (Haque А. К. et al., 2002). В конечном итоге
31.0
Часть 2. Клиническая гематология
у значительной части больных с клинически манифестной СКА за
счет некрозов и фиброза селезенки появляется функциональная
аспления с повышенной чувствительностью к инфекциям.
Клиническая картина. Серповидно-клеточная анемия широко
варьирует по тяжести течения в зависимости от варианта гемоглобинопатии. У гетерозиготных пациентов с преобладанием в эритроцитах НЬА над HbS течение бывает асимптомным при общем
уровне гемоглобина, близком к норме. Встречаются промежуточные формы с умеренно выраженной симптоматикой хронической
гемолитической анемии, уровнем гемоглобина в пределах 100—
120 г/л и редкими, так называемыми серповидно-клеточными кризами. У пациентов с тяжелым течением и значительным преобладанием HbS обычно СКА протекает с выраженной симптоматикой
и уровнем гемоглобина около 60-90 г/л, с частыми, тяжелыми
кризами.
Заболевание редко проявляется в неонатальном периоде, поскольку в это время в эритроцитах высоко содержание фетального
гемоглобина. Первые признаки болезни часто определяются начиная с 3 -4-го месяца жизни в виде бледности и легкой желтушности
кожных покровов и слизистых оболочек. Могут определяться небольшая спленомегалия, лимфоаденопатия.
При СКА средней и тяжелой степени у детей нередко наблюдается задержка физического развития, отмечаются нарушения строения скелета за счет нарушений кроветворения и гиперплазии эритроидного ростка. Рентгенологически определяется расширение
диплопических пространств в костях черепа со структурой в виде
«солнечных лучей», «щетки». Под воздействием факторов, изменяющих парциальное давление кислорода (полеты на самолете,
подъем в горы, повышенная физическая нагрузка и другие), или
реже — спонтанно — у больных появляются гемолитические кризы
с гемоглобинурией. Однако в структуре кризов гемолитические
кризы составляют менее 30% (Токарев Ю. А. и др., 1983; Воробьев П. А., 2001).
Примерно у 10-20% больных наблюдаются тромбоваскулярные изменения в виде трофических язв, асептических некрозов
головок плечевых и бедренных костей, инфарктов внутренних органов и абдоминальных кризов из-за тромбоза капилляров брыжейки. У 50% мужчин, страдающихСКА, возникает рецидивирующий приапизм. Остро возникающие нарушения микроциркуляции сопровождаютеявыраженным болевым синдромом, отеками и
повышением температуры. Выделяют острый грудной синдром с
болями в грудной клетке, одышкой, гипоксемией, лихорадкой и
Глава 12. Анемии
311
инфильтратами в легких (по данным рентгенографии) и острые
неврологические нарушения (примерно у 1/4 больных) с транзиторными ишемическими приступами, геморрагическими и тромботическими инсультами и др. Тромботические инсульты, как результат закупорки крупных сосудов, наиболее свойственны детям
и при отсутствии терапии в 70% случаев рецидивируют в течение
3 лет (Шиффман Ф. Д., 2000). Цереброваскулярные осложнения одна из основных причин летальности у больных СКА (Sumoza A.
et al., 2002). Вазокклюзионные кризы могут провоцироваться инфекцией, переохлаждением, физической нагрузкой или эмоциональным стрессом. Кризы, захватывающие жизненно важные органы, могут сопровождаться серьезными осложнениями и даже приводить к летальным исходам.
Вазокклюзионные кризы часто сочетаются с гемолитическими,
но могут и не совпадать во времени.
Больные СКА жалуются на боли в трубчатых костях, кистях и
стопах, которые обусловлены нарушениями микроциркуляции и
очагами асептического некроза. В то же время у данной категории
больных высока вероятность остеомиелита, что необходимо учитывать при проведении диагностики.
Возможно развитие секвестрационных и апластических кризов.
Последние обычно возникают на фоне инфекций, особенно при
инфицировании парвовирусом В19, вирусом Эпштейна -Барра,
пневмококком и др. При этом у больных появляются резкая слабость, лихорадка, снижение уровня гемоглобина, эритроцитов и
ретикулоцитов без признаков гемолиза. В основе развития апластического криза лежит резкое угнетение эритропоэза в костном
мозге. Длительность такого состояния — обычно около 10 дней.
Секвестрационные кризы чаще всего наблюдаются у детей и обусловлены массивным разрушением патологических эритроцитов в
селезеночных синусах, сопровождаются сходной клинической картиной (Токарев Ю. А. и др., 1983).
Хронический гемолиз и повторные эпизоды сосудистой окклюзии постепенно приводят к прогрессирующей дисфункции большинства органов. Легочная гипертензия, признаки которой могут
быть определены у значительной части страдающих СКА, протекает с соответствующими клиническими проявлениями, развитием дыхательной недостаточности и является одной из основных
причин гибели больных. На фоне анемии и гемодилюции наблюдается хроническая перегрузка сердца. Кардиомегалия отмечается
более чем у 90% больных, а по данным эхокардиографии у 50%
выявляются признаки трикуспидальной регургитащш (Haque А. К.
312
Часть 2. Клиническая гематология
el al., 2002), причем степень увеличения отделов сердца (особенно
левого желудочка) пропорциональна степени анемии (Batra A. S.
el al., 2002). Для пациентов с СКА характерно раннее развитие
почечных дисфункций с нарушением концентрационной способности почек, проявляющееся гипостенурией, ацидозом, гиперкалиемией и гематурией. Часто отмечается нарушение функции печени, желчнокаменная болезнь и ретинопатии.
В связи с функциональной аспленией больным СКА, особенно
в детском возрасте, свойственны инфекционные осложнения, в
том числе пневмококковый сепсис.
Для картины крови при СКА характерны нормо- или гигюхромная анемия, ретикулоцитоз, анизопойкилоцитоз, полихроматофилия, наличие телец Жолли (остатков ядер в эритроците), присутствие в малке мишеневидных и серповидных эритроцитов. Число
серповидных эритроцитов неодинаково у разных боольных. Нередко наблюдается реактивный лейкоцитоз со сдвигом формулы
влево. При этом СОЭ чаще всего остается нормальной за счет того,
что серповидные эритроциты медленнее образуют «монетные столбики».
Как отражение гемолиза в крови больных СКА бывает повышен уровень непрямого билирубина. Количество свободного гемоглобина в плазме повышено, а гаптоглобина — снижено.
В костном мозге наблюдается гиперплазия, преимущественно
за счет эритроидного ростка.
Диагностика. Диагноз СКА, как и других гемоглобинопатии,
ставится на основании выявления аномального гемоглобина с
использованием методов электрофореза lib (в ацетилцеллюлозе, полиакриламидном геле и др.) и выявления молекулярно-генетических аномалий с использованием полимеразной цепной
реакции.
Как ориентировочные пробы, а также для дифференцпровки
HbS от других аномальных гемоглобинов могут использоваться
пробы на серповидность (с созданием условий локальной гипоксии при наложении жгута на основание пальца перед взятием крови и др.) и растворимость.
Лечение. Терапия СКА многие годы была преимущественно
симптоматической с назначением больным желчегонных средств,
антибиотиков, анальгетиков, фолиевой кислоты, лечебного плазмафереза при выраженном гемолизе, проведения поливакцинации,
лечения ДВС-синдрома и др. Эти средства активно используются
и в настоящем. В то же время активно стали использоваться новые
возможности терапии.
Глава 12. Анемии
313
В детском возрасте при тяжелых формах заболевания проводятся трансплантации стволовых кроветворных клеток от родственников и неродственных доноров (Vichinsky E., 2002).
Одним из основные средств терапии СКА на сегодняшний день
является гидроксимочевина в дозах от 15 до 30-40 мг/кг/сут. Как
было показано в рандомизированных исследованиях, применение
этого препарата снижает частоту и тяжесть болевых приступов за
счет способности гидроксимочевины повышать уровень фетального гемоглобина (HbF), не подвергающегося полимеризации (Kinпеу Т., 1999; Sumoza A. et al., 2002). Препарат хорошо переносится
больными н позволяет поддерживать уровень HbF в пределах 15%
даже у самых тяжелых больных. Такими же свойствами обладают
5-азацитидгш, цитарабин и масляная кислота, которые пытаются
использовать в терапии тяжелых форм заболевания.
Перспективным лечебным средством при СКА считается окись
азота (NO), обладающая вазодилятационными свойствами, регулирующая эндотелиальную адгезию и снижающая тяжесть ишемически-реперфузионного повреждения при СКА. Однако, учитывая сложность практического применения самой окиси, предлагается использовать перорально L-аргинин, индуцирующий
продукцию NO в организме (Vichinsky E., 2002).
Для коррекции анемии используют трансфузии эритромассы.
Учитывая наличие трансфузионной зависимости у значительной
части больных и высокий риск аллоиммунизации при частых гемотрансфузиях, оптимальными трансфузионными средами являются эритроцитарная масса, обедненная лейкоцитами, и эритроциты от фенотинированных доноров с максимальной совместимостью по антигенной структуре с эритроцитами больного. При этом
гематокрит поддерживается на уровне до 30%, чтобы не ухудшать
микроциркуляцию при повышении вязкости крови. Для купирования острого грудного синдрома с гипоксемией, тяжелого приапизма, лечения мозговых инсультов, костномозговых некрозов
проводятся обменные трансфузии крови. В этом случае основная
цель трансфузий — уменьшить долю HbS до 35% и менее. При
признаках перегрузки железом в результате многократных гемотрансфузий (критерий — уровень ферритина свыше 2500 нг/мл)
проводят терапию дефероксамином (десфералом).
Поскольку регулярные трансфузии эритроцитарной массы сопряжены не только с риском перегрузки железом, но и инфицирования и аллоиммунизации, для коррекции анемии и гипоксии тканей пытаются использовать другие средства. В частности, имеются
сообщения об успешном применении растворов полимеризирован-
Часть 2. Клиническая гематология
314
ного гемоглобина в сочетании с эритропоэтином для купирования
болевого криза за счет быстрой доставки кислорода к тканям и
повышения уровня гемоглобина (Raff J. P. et al., 2002).
При необходимости хирургического лечения больных с СКА
им проводится инфузионно-трансфузионная подготовка для коррекции уровня гемоглобина и гематокрита,"а при повышенном риске
бактериального инфицирования — профилактическая антибиотикотерапия.
Прогноз. Прогноз зависит от тяжести течения заболевания,
возможностей предупреждения и своевременного адекватного лечения осложнений. Для гомозиготных пациентов с тяжелым течением заболевания средняя продолжительность жизни при проведении соответствующей терапии составляет около 40 лет (Воробьев П. А., 2001). Для гетерозиготных больных прогноз в целом
благоприятный.
Профилактика. Профилактика заболевания заключается в проведении генетического обследования при планировании семьи,
выявлении патологии у лиц из групп риска, предупреждении ситуаций, ведущих к снижению парциального давления в крови, и профилактическом лечении страдающих СКА для поддержания уровня HbS на относительно безопасном уровне. Следует помнить о
повышенном риске тяжелых осложнений при беременности, как
для матери, так и для плода. Возможна пренатальная диагностика
СКА. Для женщин детородного возраста, страдающих СКА, важен
подбор методов контрацепции, исключающих повышенный риск
тромбоваскулярных осложнений. Больные должны быть привиты
поливалентной пневмококковой вакциной и проходить регулярную вакцинацию против гриппа и других распространенных инфекций.
Талассемия
Талассемию относят к количественным гемоглобинопатиям (Токарев Ю. Н. и др., 1983).
Понятие талассемии объединяет гетерогенную группу генетически обусловленных заболеваний, характеризующихся нарушением синтеза гемоглобина в результате уменьшения или отсутствия одной или нескольких глобшговых цепей.
Глобин синтезируется в эритропдных клетках, при этом гены
глобинов на каждой стадии развития экспресеируются коордшшрованно. Сбалансированный синтез глобиновых цепей необходим
для сохранения растворимости конечных тетрамеров, поскольку
тетрамеры, состоящие из одинаковых цепей гемоглобина, практи-
Глава 12. Анемии
315
чески нерастворимы (Шиффман Ф. Д., 2000). При талассемии же
происходит нарушение скорости синтеза отдельных цепей с образованием аномального, труднорастворимого гемоглобина.
Различают следующие основные виды талассемии:
1) а-талассемию с нарушением синтеза а-глобиновых цепей;
2) р-талассемию (малая талассемия при гетерозиготном варианте и большая талассемия или болезнь Кули — при гомозиготном)
с нарушением синтеза р-глобшювых цепей.
Наряду с этим можно выделить еще ряд талассемических синдромов, а также смешанные варианты.
Распространенность. Данная патология наиболее часто встречается среди лиц, проживающих в странах средиземноморского
побережья, что отражено в названии заболевания (от греческого
«таласса» — море), выходцев из Юго-Восточной Азии, Ближнего и
Среднего Востока, Азербайджана, Армении, Грузии, Таждикистана, Узбекистана и среди афро-американцев. На территории Российской Федерации талассемия отмечается в Дагестане, Поволжье, среди татар и башкир. Распространение талассемии в эндемичных по малярии регионах обусловлена, по всей видимости,
относительной устойчивостью эритроцитов гетерозиготных по талассемии лиц к возбудителю малярии.
Этиология. Талассемия характеризуется широкой генетической
гетерогенностью. Наследование при (3-талассемии аутосомнокодоминантное. Мутации (более 100 разновидностей) происходят в
локусе (3-глобина на хромосоме 11. При а-талассемии возможно
несколько типов наследования, так как синтез ос-цепей глобина
кодируется двумя парами генов на хромосоме 16. При этом гомозиготность по обеим парам генов несовместима с жизнью (водянка
плода), а утрата или дисфункция одного гена существенного клинического значения не имеет. Более чем у 80% больных ос-талассемией происходит потеря одного или более из 4-х генов, в остальных — гены сохранены, но функционально неактивны (Шиффман Ф. Д., 2000).
Патогенез. Патология обусловлена нарушением скорости синтеза отдельных цепей глобина. В случае (3-талассемии отмечается
наследственное угнетение синтеза (3-цепей, входящих в состав гемоглобина A (HbA), вследствие чего продукция HbA снижается, у
гомозигот с анемией Кули значительно, а гемоглобин представлен
преимущественно фетальным гемоглобином (HbF) и гемоглобином А2 (HbA2). Выявлена связь аллельного полиморфизма с различной частотой (3-талассемических мутаций (Kukreti R. et al,
2002).
316
Часть
2.
Клиническая
гематология
При а-талассемии в случае дисфункции 3 из 4 кодирующих
генов повышается содержание гемоглобина Н (HbH), представляющего собой |34-тетрамеры, образующиеся при избытке (З-цепей, при этом снижено до полного отсутствия содержание HbF и
НЬА2. В остальных случаях содержание последних не отличается
от нормы.
Аномальные или избыточные молекулы гемоглобина образуют
прецепитирующие тетрамеры внутри эритроцитов, что ведет к повреждению клетки и ее преждевременной элиминации клетками
ретикулозндотелиальной системы. Разрушаются эритроидные
клетки и интрамедуллярно. В результате имеет место укорочение
длительности жизни эритроцитов с развитием анемии. В качестве
компенсаторной реакции при тяжелых формах талассемии происходит и?1тенсивная эритроидная гиперплазия со значительным расширением зон кровообразования, появлением экстрамедуллярных
очагов кроветворения.
В результате нарушения синтеза гемоглобина — основного железосодержащего белка организма — и потери гемов при преципитации в организме больных талассемией возникает нарушение обмена железа и его накопление в эритроидных клетках, а но мере
развития заболевания — и в других органах и тканях. Развивающийся при этом гемохроматоз играет важную роль в патогенезе
заболевания, влияет на качество жизни больных и прогноз заболевания.
Клиническая картина. Талассемия может характеризоваться
разнообразной клинической картиной — от бессимптомного течения до тяжелой большой талассемии, от легкой анемии на фоне
интеркуррентных заболеваний до ранней трансфузионной зависимости.
Малая (гетерозиготная) (J-талассемия и ос-талассемия часто протекают бессимптомно и характеризуются как носительство талассемии.
Прогрессирующая анемия развивается начиная с первых месяцев жизни при тяжелых формах, а при легких — в более поздние
сроки. Отмечается бледность кожных покровов и слизистых с землисто-желтушным оттенком. Проявления заболевания обусловлены расширением плацдарма кроветворения, наличием очагов экстрамедуллярного гемопоэза, прогрессированием гемохроматоза с
гепато-, спленомегалией и гиперпигментацией кожи, костными изменениями (преимущественно в костях черепа). Спленомегалия,
часто весьма значительная, является обязательным признаком большой формы (З-талассемии. Желчнокаменная болезнь (ЖКБ) как
Глава 12. Анемии
317
следствие хронического гемолиза встречается при талассемии существенно реже, чем при СКА или наследственном сфероцитозе.
При адекватной трансфузионной терапии ЖКБ определяется менее чем у 2% больных большой талассемией (Krishna К. К. et al..
2002).
Для тяжелых форм талассемии (большой талассемии. тяжелых
форм а-талассемии) характерны гиперпигментация кожи, хроническое изъязвление голеней, а также задержка роста и развития.
Клинически значимым вариантам талассемии свойствен ряд
тяжелых осложнений и сопутствующих заболеваний. Так, у данной категории больных повышен риск сердечно-сосудистых заболеваний, что связывают как с перегрузкой организма железом, так
и с функциональными нарушениями со стороны клеток сосудистого эндотелия (Cheung Y. F. et al., 2002). В результате у значительной части больных отмечается нарушение сократительной способности миокарда, гипертрофия левого желудочка, нарушения
провидимости вплоть до полной блокады и различные аритмии.
Среди детей с большой талассемией частой патологией (определямой более чем у 30% детей) являются диффузные изменения в
ткани легких с нарушением функции органа (Li A. M. et al., 2002).
Развитие гемохроматоза в органах эндокринной системы может
приводить к диабету, адреналовой недостаточности и другим нарушениям. Немалую роль в клинической картине заболевания играют также явления гиперспленизма и снижение иммунитета.
Степень анемии различна. При большой талассемии уровень
гемоглобина может снижаться до 30 г/л и ниже. Эритроциты гипохромные, микроцитарные. Уровень ретикулоцитов повышен. При
талассемии характерной особенностью эритроцитов является однородный микроцитоз в отличие от железодефицита, и, соответственно, индекс анизоцитоза (RDW) обычно в норме. Однако наличие повышенного числа ретикулоцитов и мегалобластические
черты гемоиоэза при вторичной недостаточности фолиевой кислоты могут приводить к значительному анизоцитозу, маскируя этот
признак. Нередко выявляются базофильная пунктация эритроцитов и мишеневидные клетки, ядросодержащие эритроциты. Мишеневидные эритроциты могут присутствовать в значительном количестве. Однако мишеневидность эритроцитов не является патогномоничным для талассемии признаком, поскольку в небольшом
количестве эритроцитов подобные изменения могут наблюдаться
у больных с железодефицитной анемией и анемией при свинцовой
интоксикации. Число лейкоцитов и тромбоцитов нормальное или
несколько повышено.
318
Часть 2. Клиническая гематология
В костном мозге — выраженная эритроидная гиперплазия, наличие эритробластов с базофильной пунктацией и увеличено число сидеробластов. Часто наблюдается несоответствие степени раздражения эритроидного ростка костного мозга при наличии выраженной анемии с умеренным ретикулоцитозом, что отражает
неэффективность эритропоэза. Длительно существующая гемолитическая анемия повышает потребности в фолиевой кислоте, и при
ее недостатке кроветворение может приобретать мегалобластический тип.
Содержание железа в сыворотке и в депо (оцениваемое по уровню ферритина, количеству сидеробластов в костном мозге и десфераловому тесту) повышено при сниженном цветовом показателе и
других параметрах, отражающих степень насыщения эритроцитов
гемоглобином.
Диагностика. При проведении диагностики следует обратить
внимание на этническую принадлежность пациента, характерные
клинические признаки заболевания и особенности морфологии
эритроцитов.
Легче всего диагностируется развернутая картина большой (3-талассемии. При отсутствии терапии у больных появляются та.тассемичеекпе лица (с выступающей лобной частью) и гепатоспленомегалия, что обусловлено экстрамедуллярными очагами гемопоэза. Рентгенологически выявляется утолщение губчатого слоя свода
черепа и поперечная исчерченность в области наружной пластинки лобной и теменной кости («игольчатый периостоз»). Обращают
на себя внимание изменения в мазках крови, где определяются
микроцитоз, анизоцитоз, пойкилоцитоз, мишеневидные клетки в
большом количестве, базофильная пунктация и ядросодержащие
эритроциты.
Окончательный диагноз ставят на основании определения преобладающего типа гемоглобина или характера молекулярно-генетических изменений.
Основные методы лабораторной диагностики талассемии:
а) биохимические — определение недостаточно синтезируемой
цепи Hb и количества НЬА хроматографическими и электрофоретическими методами;
б) молекулярно-биологические — определение мутации, типа
наследования.
При постановке диагноза (З-талассемии обычно достаточно биохимических анализов, в то время как основой диагностики а-талассемии являются молекулярно-биологические методы (Вуд М.,
Банн П., 2001; Znou Y. Q. et al, 2002).
Глава 12. Анемии
319
Обычно показательны электрофорез гемоглобина и количественное определение НЬА2 и Hb-F, хотя результаты этих анализов могут быть и в норме при а-варианте.
При большой талассемии (гомозиготном варианте (3-талассемии) количество гемоглобина А2 обычно на нормальном уровне, а
количество Hb-F повышено до 90%. При малой (гетерозиготной)
талассемии повышен уровень НЬ-А2. В случаях а-талассемии с
делецией 3 из 4 а-глобиновых генов (так называемой болезни HbH)
при электрофорезе гемоглобина определяется HbH.
Дифференциальный диагноз чаще всего приходится проводить
с железодефицитной анемией (ЖДА), поскольку картина крови
при талассемии с гипохромными эритроцитами и наклонностью к
микроцитозу может быть похожа на железодефицитное состояние.
Основные различия в данном случае касаются показателей обмена
железа и содержания железа в депо: сниженного при ЖДА и повышенного при талассемии. На основании биохимических и молекулярно-биологических исследований проводят дифференциальную
диагностику между различными вариантами талассемии.
Лечение. При гетерозиготной (3- и а-талассемиях часто не требуется активных лечебных мероприятий и терапия сводится к применению симптоматических средств — фолиевой кислоты и желчегонных средств.
При тяжелых формах заболевания, в первую очередь при большой (3-талассемии, трансплантация гемопоэтических стволовых
клеток, осуществленная в раннем возрасте, может привести к выздоровлению (Cheng С. N. et al, 2002).
Гемотрансфузии (переливания эритроцитарной массы) проводят обычно при уровне гемоглобина менее 80 г/ли по потребности
до достижения уровня 90-100 г/л. Важно проводить больным талассемией адекватную трансфузионную терапию, особенно в детском возрасте, что позволяет избежать возникновения массивных
очагов экстрамедуллярного гемопоэза и костных деформаций. Детям обычно для коррекции анемии проводится программа интенсивных трансфузий с переходом на поддерживающую терапию,
предусматривающую переливание эритроцитарной массы в дозе
около 20 мл/кг массы тела каждые 3-4 недели. При проведении
повторных гемотрансфузии дополнительно назначают хелаторную
терапию десфералом для профилактики перегрузки железом. Курсовую десфераловую терапию проводят при уровне ферритина более 150-200 мкг/л (Токарев Ю. II. и др., 1983; Вуд М., Банн П.,
2001). Для мониторинга состояния обмена железа при талассемии
предлагается также использовать определение уровня хитотрио-
320
Часть 2. Клиническая гематология
зидазы в плазме крови (нормальный уровень 0,37 + 0,04 мЕ/мл),
поскольку данный показатель также отражает состояние перегрузки макрофагов железом (Altarescu G. et al., 2002). Основным препаратом является десферал, применяемый в виде внутривенных и
внутримышечных инъекций. В настоящее время разрабатываются
пероральные препараты для длительной хелаторной терапии при
синдромах перегрузки железом. Причем отмечено, что в плане профилактики накопления железа в ткани миокарда такой препарат
для перорального приема, как деферипрон, оказывается более эффективным, чем инъекционный деферроксамин (Anderson L.J. et al.,
2002; Buritton R. S., 2002).
Прогноз. Прогноз зависит от тяжести заболевания и степени
нарушения синтеза глобпновых цепей.
При большой талассемии средняя продолжительность жизни
составляет около 20 лет (Воробьев П. А.. 2001). Среди причин
летальности — тяжелые инфекционные осложнения и кардиальный гемохроматоз с тяжелыми нарушениями ритма. Имеются
данные о том, что при (3-талассемии, когда у большинства больных имеется трансфузионная зависимость, качество и длительность жизни пациентов во многом зависят от своевременной и
полноценной терапии десферамином в целях профилактики осложнений, связанных с перегрузкой железом (Buritton R. S. et al.,
2002).
Большинство больных а-талассемией благополучно живет без
потребности в гемотрансфузиях или спленэктомии.
Профилактика. В целях профилактики рождения детей с тяжелыми формами заболевания проводится генетическое консультирование. В настоящее время возможна антенатальная диагностика
большинства талассемических мутаций, в том числе с использованием неинвазивных методов (Chiu R. W. et al., 2002).
Пациентам с установленным диагнозом талассемии важно провести своевременную терапию и профилактические курсы десферала для сведения к минимуму возможных осложнений у пациентов, получающих повторные гемотрансфузии.
Иммунные гемолитические анемии
Иммунные гемолитические анемии (ИГА) — группа приобретенных гемолитических анемий, обусловленных иммунообусловленной преждевременной деструкцией эритроцитов и сопровождающихся, как правило, появлением в крови больного антител против эритроцитов.
Глава 12. Анемии
321
Все иммунные гемолитические анемии могут быть разделены
на: аутоиммунные, аллоиммунные, к которым относятся гемолитическая анемия новорожденных, и посттрансфузионные, связанные с появлением аутоантител в результате повторных гемотрансфузий, беременностей, несовместимости крови матери и плода или
донора и реципиента по системе АВО, резус-фактору или другим
антигенам. Вторая группа иммунных гемолитических анемий является предметом изучения преимущественно в акушерстве и педиатрии, а также трансфузиологии.
Аутоиммунная гемолитическая анемия
Распространенность. Частота встречаемости аутоиммунной
гемолитической анемии (АИГА), по данным различных авторов,
составляет в среднем один случай на 75-100 тысяч человек (Идельсон Л. И. и др., 1975; Buchman G. R. et al., 1976). Чаще всего заболевание наблюдается у женщин среднего возраста, хотя может встречаться и во всех возрастных группах.
Классификация. Группу аутоиммунных гемолитических анемий классифицируют, в первую очередь, по серологическому признаку, то есть по характеру вырабатываемых аутоантител. Так, различают анемии:
1) с неполными тепловыми агглютининами;
2) с тепловыми гемолизинами;
3) с полными Холодовыми агглютининами;
4) с Холодовыми двухфазными гемолизинами.
Среди АИГА с Холодовыми антителами иногда выделяют и
пароксизмальную холодовую гемоглобинурию — синдром Доната-Ландштейнера (Идельсон Л. И. и др., 1975; Воробьев П. А.,
2001).
Абсолютное большинство случаев АИГА приходится на анемию с неполными тепловыми антителами.
Наряду с этим выделяют острую и хроническую формы аутоиммунной гемолитической анемии.
Аутоиммунная гемолитическая анемия может являться самостоятельным заболеванием, чаще всего в виде идиопатической
АИГА, а может являться вторичной — симптоматической, сопровождающей целый ряд заболеваний и патологических состояний.
Встречается АИГА при системных заболеваниях соединительной ткани, патологии щитовидной железы и печени, синдроме Эванса (нарушение иммунной регуляции с иммунной тромбоцито-лейкопенией, анемией и другими аномалиями), лимфопролиферативных заболеваниях (хроническом лимфолейкозе, лимфомах) и
11 Гематология. Нов. справочник
322
Часть 2. Клиническая гематология
других неопластических процессах. Известна ВИЧ-ассоциированная ЛИГА.
Выделяют также группу иммунных гемолитических анемий, при
которых антитела вырабатываются против эритроцитов с измененной под воздействием лекарственных средств или инфекций
антигенной структурой. Так, известны вторичные АИГА вследствие
микоплазменных и пневмококковых инфекций, а также инфекций,
вызываемых вирусом Эпштейна-Барра. Описаны случаи АИГА
после применения антибиотиков пенициллинового ряда (Идельсон Л. И. и др., 1975; Buchman G. R. et al., 1976). Предлагают группу
лекарственных и обусловленных инфекцией анемий выделять в отдельный вариант гетероиммунных анемий (Воробьев П. А., 2001).
Патогенез. В основе патогенеза заболевания лежит иммунообусловленный гемолиз как результат «осаждения» аутоантител
на поверхности эритроцитов и последующей деструкции «антителсвязанных» клеток в ретикулоэндотелиальной системе (РЭС),
в основном в селезенке. Непосредственная причина выработки аутоантител обычно неизвестна.
Аутоантитела чаще всего относятся к иммуноглобулинам класса G (IgG), которые максимально активны обычно при температуре 37 °С и носят название тепловых антител. При наличии антител
данного типа секвестрация эритроцитов происходит в основном в
селезенке. Реже вырабатываются иммуноглобулины М (IgM) —
обычно холодовые аутоатитела, гемолитический эффект которых
опосредован через систему комплемента, а максимум активности
наблюдается при температуре 4-18 "С. В этом случае антитела активируют комплемент преимущественно в конечностях, где температура тела минимальная, а эритроциты элиминируются в основном в печени, а не в селезенке. Кроме того, может иметь место
прямой лизис клеток с клиническими проявлениями внутрисосудистого гемолиза. Изредка IgA также ассоциируется с аутоиммунной гемолитической анемией. Примерно 30-40% больных с аутоиммунным гемолизом имеют на эритроцитах только IgG (Вуд М.,
БаннП., 2001).
При АИГА с тепловыми антителами около половины случаев
являются идиопатическими. Распознаваемые случаи включают в
себя коллагенозы, лимфопролиферативные заболевания и реакции на медикаменты, среди которых особенно выделяются: метилдопа, новокаинамид, нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), хинидин, хинин, пенициллины и цефалоспорипы.
Иммунный гемолиз холодового типа часто ассоциирован с перенесенной инфекцией.
Глава 12. Анемии
323
Пароксизмальная холодовая гемоглобинурия (синдром Доната-Ландштейнера), как правило, наблюдается после перенесенных вирусных инфекций и в поздних стадиях сифилиса. При этом
вырабатываются антитела класса lgG, реактивные как в холодной
среде, так и при температуре тела, способные активировать комплемент (Шиффман Ф. Д., 2000).
Возможно сочетание АИГА с другими аутоиммунными заболеваниями и состояниями или их последовательное появление у одного и того же больного (Morgensztern D. et al., 2002).
Клиническая картина. В большинстве случаев для аутоиммунных гемолитических анемий характерно острое начало. У больных
отмечаются потемнение мочи, иктеричность кожи и склер, лихорадка, боли в животе, умеренная гепатоспленомегалия. По данным
различных авторов, увеличение селезенки регистрируется примерно у 40-80% больных, печени — у 20-50% (Идельсон Л. И. и др.,
1975; Шиффман Ф. Д., 2000; Гусева С, В. и др., 2001).
Имеются некоторые особенности в клинических проявлениях
заболевания в зависимости от серологического варианта. Так, гемолизиновые формы нередко сопровождаются гемоглобинурией и
другими признаками острого внутрисосудистого гемолиза. АИГА
с Холодовыми агглютининами проявляется обычно в виде хронической гемолитической анемии и нередко протекает с признаками
внутрисосудистого гемолиза и почечной недостаточности. При этом
наблюдаются акроцианоз, боли в конечностях, синдром Рейно и
другие проявления нарушений периферического кровообращения
под воздействием пониженных температур. Для постинфекционных АИГА с Холодовыми агглютининами характерным является
самоограничение процесса с внезапным прекращением гемолиза.
При синдроме Доната-Ландштейнера наблюдается обычно острый транзиторный внутрисосудистый гемолиз, сопровождающийся болями в спине, животе и HOF-ax, тошнотой и головной болью,
потемнением мочи.
Анемия при АИГА с колебаниями гемоглобина обычно в пределах 30-90 г/л носит нормохромный характер. В крови наблюдается полихромазия, пойкилоцитоз эритроцитов, часто обнаруживаются ядросодержащиеэритроидные клетки (нормобласты). Могут
встречаться сфероциты, которые образуются в результате действия
макрофагов селезенки на эритроцитарную мембрану с фиксированными антителами. Характерен различной степени выраженности ретикулоцитоз, хотя иногда после гемолитического криза уровень ретикулоцитов снижен. Иногда гемолиз настолько выражен,
что агг.тютинаты эритроцитов наблюдаются в мазках крови и за-
http://www.bestmedbook.com/
324
Часть 2. Клиническая гематология
труднено определение уровня эритроцитов в крови, а иногда и
групповой принадлежности крови пациента. Такой феномен (панагглютинация) чаще наблюдается при наличии Холодовых антител. В то же время АИ ГА с Холодовыми антителами редко приводит к тяжелой форме анемии — тепловой аутоиммунной гемолитической.
Осмотическая резистентность эритроцитов в большинстве случаев снижена.
Возможен лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы влево и тромбоцитоз. Иногда, напротив, наблюдается умеренное снижение числа лейкоцитов и тромбоцитов.
В костном мозге отмечается эритроидная гиперплазия, при
которой, по имеющимся данным, содержание эритрокариоцитов
превышает 25%. У некоторых больных АИГА отмечается мегалобластный тип кроветворения, что связывают в основном с относительным дефицитом фолиевой кислоты. В случаях, когда гемолитическая анемия является симптоматической, в миелограмме могут также наблюдаться изменения, свойственные основному заболеванию.
На фоне гемолиза содержание билирубина обычно повышено
преимущественно за счет непрямого. Также увеличивается уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) сыворотки. Уровень сывороточного железа в норме или повышен, гаптоглобина — в норме или
снижен. Повышенный распад гемоглобина приводит к поступлению дополнительного билирубина в кишечник и увеличивает экскрецию уробилиногена с мочой и калом.
У больных с синдромом Доната-Ландштейнера, напротив, в
плазме повышается количество прямого билирубина и свободного
гемоглобина, снижается уровень гаптоглобина.
Диагностика. Диагноз ставится на основании выявления клинико-лабораторных признаков гемолиза и результатов антиглобулинового теста — пробы Кумбса, которая известна в двух вариантах:
1-й — прямая проба, определяющая антитела или компоненты
комплемента (при использовании комплемент-специфической сыворотки) на поверхности эритроцитов;
2-й — непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба) с
использованием сыворотки больного и эритроцитов определенного антигенного типа, определяющий «несвязанные» свободно циркулирующие в сыворотке антитела и широко применяемый при
обследовании лиц, ранее получавших гемотрансфузии, и многорожавших женщин.
Глава 12. Анемии
325
Для диагностики аутоиммунной гемолитической анемии преимущественно используют прямую пробу Кумбса. Однако аутоиммунная гемолитическая анемия может быть у некоторых больных
и при наличии отрицательного прямого антиглобулинового теста.
Стандартные реактивы не могут определять менее чем 100-500 молекул антител на клетке, в то время как количество даже меньше
100 молекул на мембране эритроцита может повреждать клетку, вызывая ее гемолиз. Кроме того, реактивы определяют IgG и СЗ-компонент комплемента, в то время как IgA-антитела не определяются
(Вуд М., Банн П., 2001). При гемолизиновой форме АИГА проба
Кумбса нередко отрицательна. При холодовой иммунной гемолитической анемии прямой тест Кумбса определяет преимущественно наличие комплемента (C3d) на поверхности эритроидных клеток, поскольку IgM легко отщепляется от мембраны клеток в процессе циркуляции. Непрямой тест Кумбса дает положительные
результаты при АИГА примерно у 80% больных (Идельсон Л. И. и
др., 1975; Шиффман Ф. Д., 2000)'
Дифференциальная диагностика проводится с другими формами гемолитических анемий, в том числе вторичных, болезнью
Жильбера.
Иногда возникает необходимость дифференциальной диагностики АИГА и Вг;-фолиеводефицитных анемий. Эритроцитарная
лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и тест на непрямой билирубин являются индикаторами гемолиза. Однако оба показателя могут быть
повышены при мегалобластных анемиях из-за гемолиза в пределах
костного мозга (неэффективный эритропоэз). В этом случае правильной диагностике помогает исследование костномозгового кроветворения.
Лечение. Терапия АИГА направлена на снижение секвестрации
клеток в селезенке и кровяном русле, а также продукции аутоантител.
Глюкокортикоиды (ГК) обладают способностью угнетать активность макрофагов и снижать образование антител. В связи с
этим ГК, включая преднизолон в дозах 2-10 мг/кг массы тела в
сутки, являются первой линией терапии у больных АИГА. При
нормализации уровня гемоглобина может начинаться постепенное
снижение дозы преднизолона. У больных с IgG, обусловленной
АИГА, эффективность высоких доз ГК составляет более 80-90%,
ниже результативность при IgM-обусловленной анемии. Примерно у половины пациентов наблюдаются рецидивы.
В терапии используется также внутривенный иммуноглобулин
в дозах около 1 мг/кг в день, обычно в сочетании с ГК. При отсут-
326
Часть 2. Клиническая гематология
ствии эффекта от консервативной терапии возможно проведение
спленэктомии, эффективность которой при АИГА составляет около 50-70% (Шиффман Ф. Д., 2000; Вуд М., Банн П.. 2001). Исключением являются больные с вторичной АИГА, у которых спленэктомия обычно безуспешна и чревата тяжелыми осложнениями
(Akpek G. et al., 1999).
При неэффективности обычной терапии используются препараты иммуносупрессивного действия: азатиаприн, цитостатики
(винкаалкалоиды, циклофосфамид, хлорамбуцил), циклоспорин А
(Schwartz R. S. et al., 2000; Моуо V. М. et al.. 2002).
Стероиды, спленэктомия и иммуносупрессия в случае АИГА с
Холодовыми антителами часто мало эффективны, и терапия в основном симптоматическая.
Иногда в лечении АИГА с успехом используют даназол (дозы
100-150 мг/м2) — андрогенный стероид с минимальным вирили- •
зирующим эффектом, ингибирующий функциональную активность
макрофагов. Но для получения стойких результатов необходима
длительная терапия, а препарат обладает рядом побочных действий,
включая диспептические расстройства, нарушение функции печени и другие.
В случаях тяжелой анемии могут быть необходимы трансфузии
эритроцитарной массы. При этом нередко проведение перекрестных проб перед трансфузиями затруднено, поскольку антитела
могут мешать точному определению имеющихся аллоантител, индуцированных предшествовавшими трансфузиями или беременностями. Эти сложности повышают риск гемолитических трансфузионных реакций, обусловленных аллоантителами. Кроме того,
аутоантитела могут уменьшать длительность жизни перелитых
эритроцитов. Поэтому трансфузии эритроцитов больным АИГА
проводят минимальными порциями, медленно. Для больных с холодовыми антителами показаны трансфузии эритроцитов с подогревом, что обеспечивает их достаточную выживаемость.
Как дополнительные методы терапии для снижения уровня антител в крови больного используют плазмаферез и плазмообмен.
Основой лечения симптоматических анемий является лечение базового заболевания (Идельсон Л. И. и др., 1975; Дворецкий Л. И., 2003; Gupta N. et al.. 2002).
Если гемолиз вторичный и обусловлен применением лекарственных средств, то обычно эффективна простая отмена препарата.
Прогноз. Аутоиммунная гемолитическая анемия может быть
тяжелой и угрожающей жизни. Причинами гибели больных бывают тромбозы, легочные эмболии, осложнения со стороны сердеч-
Глава 12. Анемии
327
но-сосудистой системы, инфаркты селезенки, развивающиеся
в период кризов. Тем не менее более 70% больных переживают
10-летний рубеж (Гусева С. А. и др., 2001). В случаях вторичной
АИГА с тепловыми аутоантителами прогноз связан с течением и
эффективностью лечения основного заболевания.
Апластическая анемия
Апластическая анемия (АА) — тяжелое заболевание кроветворной системы, которое характеризуется панцитопенией в периферической крови и гипоклсточным костным мозгом.
Как отдельная нозологическая форма заболевание впервые было
описано П. Эрлихом в конце XIX в. (Ehrlich P., 1889).
Распространенность. Заболевание редкое: частота АА — в среднем 2-3 случая на 1 млн населения в год. Существует зависимость
частоты встречаемости АА от местности. Так, чаще оно отмечается
на Дальнем Востоке, в Японии, на Таиланде. АА наблюдается во
всех возрастных группах, но часто отмечают два возрастных пика
заболеваемости — в 10-25 лет и в возрасте около 60 лет (Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, 1995; Gordon-Smith E. С, 1996).
Классификация. В настоящее время широко используют «критерии Camitta» разделения АА на отдельные группы в зависимости от тяжести заболевания и прогноза, разработанные к 1979 г.
Международной группой по изучению (Camitta В. М. et al, 1975).
Согласно этим критериям, выделяют следующие группы АА:
1) тяжелую (тАА) — определяется при наличии двух любых из
перечисленных критериев по данным периферической крови: гранулоцитов менее 0,5 х 109/л; тромбоцитов менее 20 х 109/л; ретикулоцитов менее 1% (с коррекцией по гематокриту); в сочетании с
аплазией костного мозга по данным трепанобиоптатов (клеточность костного мозга не более 30% от нормы);
2) сверхтяжелую (сверхТАА) — соответствует критериям тАА,
и при этом уровень гранулоцитов менее 0,2 х 109/л;
3) умеренной степени тяжести (нетяжелая апластическая анемия — нАА) — не попадающие в группу тАА.
Установление степени тяжести заболевания важно для выбора
адекватной терапии, определения показаний к трансплантации
стволовых кроветворных клеток (ТСКК) и определения неотложности проведения терапевтических мероприятий.
Также выделяют острую и хроническую формы заболевания и,
с учетом этиологии, варианты с известным этиологическим фактором (ггостгепатитные АА и др.) и идиопатическую АА.
328
Часть 2. Клиническая гематология
Отдельно рассматривают анемию Фанкони — врожденное генетически обусловленное заболевание с гиперчувствительностью к
ДНК:повреждающим воздействиям, прогрессирующим поражением костного мозга и повышенной склонностью к развитию опухолевых заболеваний.
Этиология. Причины, приводящие к развитию аплазии костного мозга, в большинстве случаев неизвестны — этиологический
фактор в половине случаев не выявляется (идиопатические формы), а в остальных — возникновение заболевания связывают с
различными химическими (антибиотики из группы левомицетина
и макролидов, сульфаниламидные препараты, нестероидные противовоспалительные средства, противотуберкулезные препараты,
бензол и его производные, нитроэмали, лаки, пестициды и др.) и
физическими факторами, инфекциями (аплазии, ассоциированные
с цитомегаловирусной, парвовирусной, герпетической инфекцией;
иостгепатитные АА) и беременностью (Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, 1995; Михайлова Е. А. и др., 1999).
Анемия Фанкони является аутосомно-рецессивным заболеванием. В настоящее время определено более семи ассоциированных
с заболеванием генов, продуцирующих белки, которые участвуют
в патогенезе заболевания (D'Andrea A. D., Grompe M., 2003; Tichkowitz M. D., Hodgson S. V., 2003).
Патогенез. Современная концепция патогенеза АА, разработанная в 70-е гг. XX в., остается актуальной до сегодняшнего дня и
предполагает связь между развитием аплазии кроветворения и:
а) дефектом стволовых клеток с нарушением их пролиферативной активности;
б) нарушением регуляции гемопоэза иммунокомпетентными
лимфоидными клетками;
в) повреждением стромы костного мозга, то есть гемопоэтического микроокружения.
Признается возможность сочетания различных механизмов патогенеза.
При применении современных цитогенетических и молекулярно-генетических исследований различного характера хромосомные
аномалии выявляются в гемоноэтических клетках, по данным различных исследователей, у 4-26% больных АА. Наиболее частые из
хромосомных аберраций - моносомия 7 и трисомия 8 (MichailovaN. et al., 1996; Takeshima M. et al., 1998; Bessho M. et al., 2003).
При этом нередко наблюдаемый «переход» АА в миелодиспластический синдром (МДС), по мнению многих исследователей, вероятно, является отражением существования неидентифнцирован-
Глава 12. Анемии
329
ного аномального клона или повышенной чувствительности дефектных стволовых клеток к генетически повреждающим факторам (Nissen С, Shurert J., 2002). Последнее закономерно и доказательно имеет место в случаях анемии Фапкони (АФ). При данной
форме апластической анемии выявлено, в частности, более быстрое укорочение теломераз в клетках крови, что, по-видимому, играет определенную роль в генетической нестабильности клеток (Li X.
et al., 2003). Кроме того, исследования последних лет показали, что
при АФ мутировавшие гены продуцируют белки, которые в свою
очередь взаимодействуют с протеинами, участвующими в репарации повреждений ДНК (BRCA1, ATM и NRS1) (D'Andrea A. D.,
Grompe М., 2003; Kulter D. I. et al., 2003). Нарушение процессов
репарации как результат таких взаимодействий, по-видимому, является одной из важных причин повышенной чувствительности
клеток к ДНК-повреждаюшим воздействиям и наклонности к развитию опухолевых заболеваний у данной категории больных.
Как один из механизмов повреждающего воздействия на кроветворение рассматривается, в частности, нарушение экспрессии нитроксидсинтетазы, выявляемое в мононуклеарных клетках костного мозга больных АА, что ведет к повышению концентрации оксида азота (Chung I. J. et al., 2003).
При исследовании костномозговых клеток больных АА выявляется целый ряд нарушений, в частности, снижение экспрессии
GATA-2 протеина — фактора транскрипции, действующего на ранних стадиях гемопоэза, что может приводить к нарушению процессов пролиферации костномозговых клеток (Вуд М., Банн П., 2000).
Продукция ростовых факторов при АА, как правило, не нарушена,
и уровень колониестимулирующих факторов в крови больных в
норме или даже повышен (Розанова О. Е. и др., 2002; Gu J. et al.,
2002). Этот факт часто рассматривается как показатель сниженной чувствительности гемопоэтических клеток к регуляторным
воздействиям. Колониеобразующая способность гемопоэтических
клеток, отражающая их функциональную активность, снижена у
большинства больных (Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С,
1995;YongN. S., 1996).
Несмотря на большое внимание, уделяемое проблеме патогенеза АА на протяжении последних десятилетий, остается еще немало
нерешенных вопросов, и полной ясности до сих нор не существует.
Остаются неясными такие проблемы, как определение первичного
звена патогенеза, взаимосвязь АА с такими заболеваниями, как
миелодиспластический синдром (МДС) и пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ). Тем более что углубленные исследо-
330
Часть 2. Клиническая гематология
вания с применением методов проточной цитометрии позволяют
выявить клетки с ПНГ-фенотипом у примерно 50% больных АА
(Shresenmeier H. et al., 1995). Существует обоснованное мнение о
патогенетической общности этих трех заболеваний (Pavlu J., Necas E., 1998: Nissen С, Shurert J., 2002).
Тем не менее, до сих пор считается, что иммунные механизмы в
той или иной степени задействованы во всех случаях заболевания.
Свидетельством активных иммунных процессов в костном мозге
больных АА являются повышение содержания зрелых и активированных Т-лимфоцитов клеток с фенотипом супрессоров-киллеров,
инверсия хелперно-супрессорпого соотношения, закономерно выявляемые у данной группы больных. Также отмечается увеличение
содержания продуцируемого активированными Т-лимфоцитами
интерферона (ИФ) и фактора некроза опухоли-альфа (ФНОа).
которые способны оказывать ингибирующее действие на гемопоэз.
При этом выявлена закономерная связь между уровнем цитокинов
и процессами апоптоза. Некоторые авторы также представили данные об увеличении продукции интерлейкина-2 (ИЛ-2), приводящем к экспансии Т-клеточных клонов (Абдулкадыров К. М, Бессмельцев С. С, 1995; Розанова О. Е. и др., 2002; Yong N. S., 1996;
Geissler К. et al., 2002).
По-видимому, существенную роль в развитии заболевания играет и усиленный неконтролируемый триггерный механизм Fas-зависимого апонтоза гемопоэтических клеток (Carella E, Falcao R.,
1997; Li X. et al., 2003).
Клиническая картина. Клинические проявления заболевания
обусловлены анемическим и геморрагическим синдромом.
Острое начало при АА наблюдается у 12-15% больных и сопровождается лихорадкой, некротической ангиной, выраженными
носовыми, десневыми, маточными кровотечениями, появлением
множественных геморрагии на коже и слизистых. Более чем у
80% больных заболевание развивается постепенно с нарастающими
проявлениями анемического и геморрагического синдрома. У части
больных (в среднем до 20%) даже с тАА при первичном обследовании видимых геморрагических проявлений не отмечается (Абдулкадыров К. М. и др., 1998).
Анемия Фанкони характеризуется своеобразной клинической
картиной, в которой, наряду с проявлениями аплазии костного
мозга и цитопении, имеют место также физические аномалии (низкорослость, отставание в развитии), «кофейные» пятна на коже.
В анализах крови выявляется панцитопения: различной степени выраженности анемия нормохромного характера, лейкопения с
Глава 12. Анемии
331
гранулоцитопенией и относительным лимфоцитозом, тромбоцитопеция — часто глубокая до выявления единичных кровяных пластинок в мазках крови. Количество ретикулоцитов снижено как
проявление гипорегенераторного характера анемии.
Аспират костного мозга, как правило, беден ядросодержащими элементами. Снижено суммарное процентное содержание клеточных элементов гранулопоэза как за счет молодых форм, так и
зрелых гранулоцитов. Часто отмечается высокое относительное
число лимфоцитов, иногда умеренно повышено количество плазматических клеток. Отмечается задержка созревания клеток эритроидного ростка костного мозга на стадии полихроматофильных
нормобластов (эритрокариоцитов). Активность эритропоэза, по
данным миелограммы, снижена, но у некоторых больных может
быть и несколько повышенной. Значительно снижено содержание
мегакариоцитов. Могут быть обнаружены жировые клетки в значительном количестве, элементы стромалыюго микроокружения.
В гистологических препаратах трепанобиоптатов подвздошной
кости больных АА выявляется аплазия костного мозга с замещением кроветворной ткани жировой. При умеренной тяжести заболевания на фоне жировой ткани могут встречаться отдельные участки сохраненного гемопоэза. Мегакариоциты попадаются редко или
отсутствуют. Могут обнаруживаться глыбки кровяного пигмента
и участки с кровоизлияниями.
Содержание железа в сыворотке крови нормально или повышено.
Диагностика. Диагноз АА ставится на основании выявления
характерных изменений в анализах крови и костном мозге с отсутствием диспластических изменений клеток и других признаков
клонального гемопоэза.
Основой диагностики является прижизненное гистологическое
исследование костного мозга.
При анемии Фанкони, наряду с морфологическим исследованием костного мозга, проводят тесты, подтверждающие хромосомную
нестабильность клеток после экспозиции с различными алкилирующими агентами. Часто применяемой пробой на повышенную ломкость хромосом является исследование кариотииа стимулированных фитогемагглютинином лимфоцитов крови после обработки
диепоксибутаном (Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, 1995;
Tichkowitz M. D., Hodgson S. V., 2003).
Дифференциальный диагноз проводят с гипопластическими
вариантами МДС и ПНГ; вторичными (симптоматическими) аплазиями, наблюдающимися при заболеваниях печени; ряде опухоле-
332
Часть 2. Клиническая гематология
вых заболеваний. Иногда под маской АА начинаются острый лейкоз, сублейкемический миелоз и другие заболевания системы крови. В сложных случаях целесообразно проведение повторных морфологических и дополнительных иммунологических, цитогенетических исследований.
Лечение. До сих пор терапия АА является во многом эмпирической и основана на историческом опыте использования различных средств терапии и результатах мультицентровых рандомизированных исследований.
Основное внимание при разработке вопросов терапии уделяется группе больных с тяжелой и сверхтяжелой АА, хотя и лечение
пациентов с АА умеренной степени тяжести также представляет
собой серьезную проблему, поскольку среди больных нАА велика
доля пациентов с трансфузионной зависимостью (до 60%), что
значительно осложняет жизнь больных и чревато рядом осложнений. Кроме того, возможно прогрессирование заболевания (самостоятельно или под влиянием неблагоприятных факторов) и переход в тАА.
Цель терапии — достижение полной ремиссии, критериями которой считаются: отсутствие клинических признаков болезни; нормализация гематокрита или уровень гемоглобина более 120 г/л у
мужчин и более 110 г/л у женщин; число лейкоцитов 4,0 х 109/л и
более или число гранулоцитов свыше 1,5 х 109/л и тромбоцитов от
100 х 109/л и выше в сочетании с улучшением показателей миелограмм.
Под частичной ремиссией понимают такое улучшение состояния костномозгового кроветворения, которое позволяет больному
быть независимым от гемотрансфузий без риска тяжелых инфекционных осложнений, то есть при числе гранулоцитов в периферической крови более 0,5 х 109/л.
Методом выбора в терапии тАА у пациентов до 40 лет является
трансплантация костного мозга (ТКМ) предпочтительно от доноров — кровных родственников. Выживаемость больных с тяжелыми формами АА после трансплантации стволовых клеток — 6080% (Brodsky R. А., 1998; Bacigalupo A., Brand R. et al, 2000). Ограничивают применение ТКМ сложность самого метода, проблемы с
гистосовместимыми донорами-родственниками (HLA-совместимые и MLC-негативные доноры находятся не более чем у 15-25%
больных), а также особенности больных А А — относительно напряженный иммунитет, высокий риск отторжения трансплантата.
По данным многолетних наблюдений, частота развития острой и
хронической болезни «трансплантат против хозяина» составляет
Глава 12. Анемии
333
20% у больных АА в возрасте до 20 лет и свыше 40% — в возрасте
старше 40 лет (Deeg H. et al., 1998).
У больных тАА, которым по тем или иным причинам трансплантация стволовых кроветворных клеток невозможна, а также
для больных нАА методом выбора является иммуносупрессивная
терапия (ИС-терапия). Тем более что мультицентровыми рандомизированными исследованиями было'показано, что сравнимые с
ТКМ по эффективности результаты и с меньшим числом фатальных осложнений могут быть получены применением иммуносупрессивных средств (Bacigalupo A., Drand R. et al., 2000).
Средства и методы иммуносупрессивной терапии включают глюкокортикоидные гормоны (ГК), антилимфоцитарный (АЛГ) или
антитимоцитарный (АТГ) иммуноглобулин, циклоспорин-А (цА).
В определенной степени как средство ИС-терапии можно рассматривать такой метод терапии, как спленэктомию.
Основанием для использования ГК у больных АА является их
гемостимулирующий и иммунодепрессивный эффект, а также способность снижать проницаемость капилляров с уменьшением риска тяжелых геморрагических осложнений. Однако в настоящее время ГК применяются только на начальных стадиях при нАА или как
дополнительное средство терапии на определенных этапах лечения, поскольку сами по себе эти средства недостаточнао эффективны. В частности, при использовании больших доз метилпреднизолона (МП) может быть получено около 41% ремиссий при
нередком развитии ряда серьезных побочных эффектов, в том числе системных (Bacigalupo A., Bruno В. et al., 2000).
Многие годы одним из основных методов лечения больных АА
являлась спленэктомия. Эффект операции у больных АА обусловлен, в первую очередь, удалением органа, служащего «депо» иммунокомпетентных клеток, активно участвующего в продукции атлои аутоантител. Однако спленэктомия эффективна при наличии активных остаточных гемопоэтических очагов, то есть при нАА. В настоящее время в связи с появлением новых эффективных методов
терапии данного заболевания спленэктомия отошла на задний план
и применяется как дополнительный метод терапии, в частности, при
частичном восстановлении гемопоэза после ИС (Speck et al., 1996).
Иногда у больных АА применяют циклофосфамид как средство
ИС-терапии. Препарат достаточно эффективен, особенно в высоких дозах (до 45 мг/кг/день), в том числе и у больных с тяжелыми
формами АА, но ограничивает его применение токсичность, в ряде
случаев необратимая, и неспецифичность действия препарата (Федоровская Н. А., 1986; Brodsky et al., 1996; Tisdale J. F. et al., 2002).
334
Часть 2. Клиническая гематология
В настоящее время основными средствами в лечении данного
заболевания являются антилимфоцитарный глобулин (АЛГ) и циклоспорин-А (ЦсА). Оба препарата первоначально применялись при
трансплантации костного мозга для предупреждения и .течения
реакции «трансплантат против хозяина», в том числе и у больных
АА, а затем стали использоваться как самостоятельные средства
терапии.
Препараты антилимфоцитарного и антитимоцитарного иммуноглобулина (АЛГ или АТГ) получают путем иммунизации животных
лимфоцитами человека (тимоцитами плода человека). Использование АЛГ (АТГ) в терапии больных АА основано на том, что препарат
избирательно элиминирует Т-лимфоциты, осуществляющие ингибирующее влияние на гемопозз. Кроме того, препарат обладает не
только иммуносупрессивным, но и гемостимулирующим действием, влияет на продукцию цитокинов. Стандартными в лечении АА
являются большие дозы АЛГ в 15 -20-30 мг/кг веса больного. Препарат применяется в виде внутривенных инфузий при 4-8 инфузиях на курс терапии. Такие дозы необходимо применять для получения достаточного терапевтического эффекта у больных тАА и нАА
со значительным повышением уровня активированных лимфоцитов и супрессоров-к'иллеров в костном мозге. Так, для пациентов с
нАА при умеренной иммунологической активности супрессорных
клеток эффективным может быть применение и небольших доз препарата в 5 мг/кг при 8-10 введениях. При недостаточной эффективности или рецидивах заболевания через 3-6 месяцев возможно проведение повторных курсов АЛ Г-терапии (Шилова Е. Е, 1995; Speck В.
et al., 1996; Nissen c ' s h u r e r t J., 2002).
Первые сведения о положительных результатах использования
циклоспорина-А (ЦсА) как самостоятельного средства терапии при
АА стали появляться к середине 80-х гг. Последующие работы
подтвердили целесообразность применения цА в лечении больных
АА.
Наиболее часто данные схемы лечения сандиммуном (ЦсА) предусматривают назначение препарата в начальной дозе 8-10 мг/кг
массы тела-больного. При хорошей переносимости лечение в указанных дозах продолжается в течение 2-3 недель, затем переходят
на терапию поддерживающими дозами препарата в 3-5 мг/кг. По
достижении ремиссии начинается плановое снижение дозы из расчета 5% в неделю до полной отмены препарата. В ходе терапии
необходим контроль биохимических показателей с учетом возможного нефро- и гепатотоксического действия препарата.
Наиболее эффективной в лечении больных тАА считается сочетанная терапия ЦсА и АЛГ (АТГ). Комбинация ЦсА и АТГ пред-
Глава 12. Анемии
335
почтительна по числу ремиссий (по данным проспективных рандомизированных исследований, количество ремиссий возрастает
почти на 30% (Bacigalupo A., Drand В. et al, 2000)). их полноте,
уровню ранней смертности и выживаемости больных.
Обычно при проведении комбинированной терапии курс лечения начинается с внутривенных введений АТГ в дозах 10-15 мг/кг
веса больного в течение 5 дней, как правило, в сочетании с метилпреднизолоном (в начальной дозе около 2 мг/кг), затем по окончании введений АЛ Г подключается ЦсА.
Современные протоколы, наряду с комбинированной иммуносупрессивной терапией АТГ и ЦсА, включают в себя и использование гранулопитарного колониестимулирующего фактора (F-КСФ)
для увеличения числа лейкоцитов у больных с тАА. Комбинация
иммупосупрессивных средств с гранулоцитарными ростовыми факторами (филграстим, ленограстим, нейгюген и др.) в средних дозах
около 5 мг/кг в день не влияет непосредственно на полноту ремиссий и темпы восстановления костномозгового кроветворения, но
позволяет существенно снизить раннюю смертность при тАА и
особенно при сверхтяжелой АА. Некоторые опасения в отношении
применения КСФ вызывают только сообщения о возрастании частоты развития миелодиспластического синдрома (МДС) после их
длительного применения (Bacigalupo A., Bruno В. et al., 2000; Bessho M. et al., 2003).
В результате постоянного совершенствования иммуносупрессивной терапии эффективность ее за последние два десятилетия
значительно повысилась. Так, пятилетняя актуариальная выживаемость больных тАА за этот период выросла с 46 до 72-85%, а в
группе больных со сверх-тАА — с 51 до 73% (Speck В. et al., 1996;
Bacigalupo A., Drarid R., 2000). Эффект ИС-терапии отсроченный:
первые положительные сдвиги со стороны кроветворения наблюдаются через 1-3 месяца, а оценка окончательных результатов целесообразна не ранее чем через 4-6 месяцев (Абдулкадыров К. М.,
Бессмельцев С. С, 1995; Rosenfeld S. et al., 2003)."
Недостатками ИС-терапии являются сохранение остаточных
дефектов кроветворения в виде очагов гипоплазии костного мозга,
сниженной колониеобразующей способности клеток-предшественников и высокий риск развития рецидивов, наблюдающихся у 2050% больных с достигнутыми ремиссиями (Абдулкадыров К. М.,
Бессмельцев С. С, 1995; Шилова Е. Р. и др., 2002; Tisdale J. F. et al.,
2002).
Для повышения эффективности ИС-терапии больных АА ведутся постоянные исследования по совершенствованию программ
336
Часть 2. Клиническая гематология
лечения, комбинации различных иммуносупрессивных средств,
использованию новых препаратов, таких как микофенолат мофетила (селлсепт) и др. Делаются попытки использования в практике лечения больных АА фактора стволовых клеток (ФСК), интерлейкина-10, интерлейкина-11 (ИЛ-11) (Beissler К. et al, 2002).
При анемии Фанкони ИС-терапия неэффективна.
Андрогены в настоящее время редко используют в терапии АА,
хотя данные сравнительных исследований показали, что они способствуют повышению эффективности терапии у женщин с тАА
(Bacigalupo A. et al., 2000).
Как во время курсов ИС-терапии, так и независимо от них больные АА,-как правило, нуждаются и в проведении симптоматической терапии, направленной на коррекцию анемического и геморрагического синдромов, профилактику и лечение возможных инфекционных и иных осложнений.
Аллоиммунизация при повторных трансфузиях гемокомгюнентов у пациентов с АА возникает в 1,5-2 раза чаще и раньше, чем у
других категорий больных (Абдулкадыров К. М. и др., 1995). В связи с этим для коррекции анемии предпочтительно использование
таких трансфузионных. сред, как эритроцитарная масса, обедненная лейкоцитами (ЭМОЛТ), — размороженные эритроциты.
В связи с риском развития генерализованного гемосидероза у
больных с зависимостью от трансфузий эритроцитов, при проведении частых трансфузий больным показаны курсы терапии десфералом (по 500 мг внутривенно в течение 15-20 дней).
При наличии трансфузионной зависимости у части больных
АА с более низким уровнем сывороточного эритропозтина, более
высоким числом ретикулоцитов и рецепторов к сывороточному
трансферрину с положительным эффектом могут применяться препараты эритропоэтина (Matsuda A. et al., 2002).
Поскольку у больных АА возможны серьезные осложнения, связанные с тромбоцитопенией, особое значение придается адекватной гемостатической терапии, включающей в себя, в первую очередь, трансфузии тромбоконцентрата.
Прогноз. АА — тяжелое заболевание системы крови с высокой летальностью; без лечения при тяжелых формах погибает до
50% больных в первые 6 месяцев, а при своевременной терапии
выживаемость 1 год среди больных с тАА и свсрх-тАА составляет
60-80%, 2 года — 50-75%, а актуриальная 7-летняя выживаемость
для больных тАА составляет 55% (Rosenfeld S. et al., 2003).
Основными причинами смерти больных после ТКМ являются
отторжение трансплантата, острая и хроническая болезнь «транс-
Глава 12. Анемии
337
плантат против хозяина», а также инфекции. Наибольшая летальность наблюдается в течение первого года. Основные причины смерти больных, получавших ИС-терапию, — геморрагические
и инфекционные осложнения, прогрессирование аплазии при безуспешной терапии.
Прогноз заболевания в первую очередь зависит от глубины аплазии и тяжести заболевания, а также своевременности и активности проводимой терапии (Rosenfeld S. et al., 2003). Имеются дан-.
ные о том, что ИС-терапия менее эффективна у пациентов, у которых выявляются клетки с ПНГ-фенотигюм (Shresenmeier H. et al.,
1995). В определенной степени прогноз АА зависит от степени
иммунологических нарушений, хотя такая зависимость прослеживается не всегда (Шилова Е. Р., 1995; Sloand E. et al., 2002 и др.).
Выявляется зависимость тяжести течения АА и ответа на терапию
от генотипа больного. Так, ряд аллелей групп HLA-DR ассоциированы либо с положительным эффектом терапии, либо, напротив, с
отсутствием ответа на лечение (Kapustin S. I. et al, 2001; GordonSmith E. С, 1996; Saunthararajah Y. et al., 2002).
Поздние клональные осложнения, включающие трансформацию АА в ПНГ и МДС, встречаются, по данным различных авторов, с частотой от 5-7 до 20-60% (Speck В. et al., 1996; Bacigalupo A.,
Bruno В. et al., 2000; Bessho M. et al.. 2003).
При анемии Фанкони высок риск развития острого миелоидного лейкоза и различных солидных опухолей. Частота таких осложнений значительно выше у больных в возрасте старше 40 лет. По
данным проспективных исследований, анемия Фанкони сопровождается неопластическими заболеваниями у 23% больных, среди
которых у 60% наблюдаются гемобластозы и у 40% — негематологические опухоли (Kuker D. I. et al., 2003). Прогноз АФ также
неблагоприятен при прогрессировании костномозговой аплазии.
Парциальная красноклеточная аплазия
Парциальная красноклеточная аплазия (ПККА) — редкое гематологическое заболевание, характеризующееся нормохромной анемией и ретикулоцитопенией в сочетании с селективной аплазией
эритроидного ростка костного мозга.
Этиология. ПККА рассматривается как синдром или самостоятельное заболевание, которое может быть результатом спонтанных
мутаций или наследственных дефектов, а также возникать без видимых причин — идиопатическая форма, составляющая более
половины случаев ПККА. При остальных вариантах ПККА ас-
338
Часть 2. Клиническая гематология
социирована с заболеваниями тимуса (тимомами), Т-клеточными
лейкозами и лимфомами, острым вирусным гепатитом и другими
заболеваниями. Возможно возникновение лекарственно индуцированной ПККА. Имеются данные об этиологической роли возбудителей вирусного гепатита, паротита и особенно парвовируса В19
в развитии красноклеточной аплазии (Абдулкадыров К. М, Бессмельцев С. С, 1995; Кравченко С. К., 1998; Воробьев П. А., 2001:
KwongY. L.etal, 1996).
Выделяют также врожденную форму эритроидной аплазии —
анемию Дайемонда-Блэкфана — редкое заболевание, встречающееся в раннем детском возрасте.
Патогенез. Эритроидная аплазия развивается в результате подавления (прямого или косвенного — через эритропоэтин) созревания эритроцитов. В большей части случаев достоверно доказано,
что в основе заболевания лежат иммунологические механизмы.
Иммунная природа синдрома подтверждается выявлением специфических аутоантител к эритроидным предшественникам (Идельсон Л. И. и др., 1975; Тер-Григоров В. С. и др.,' 1980; Krantz S. В.,
Као V.. 1967). При этом у большинства больных определяется нормальный рост в культуре in vitro бурстобразующих единиц эритропоэза (Charles R. J. et al., 1996). У части же пациентов со сниженной колониеобразующей способностью бурстобразующих единиц
эритропоэза (БОЕ-Э) можно предположить наличие внутреннего
дефекта в эритроидных предшественниках.
Клиническая картина. В клинической картине заболевания ведущие симптомы обусловлены анемией и гипоксией тканей вследствие анемии.
Для синдрома Дайемонда-Блэкфана, наряду с проявлениями
анемии, характерны задержка роста и нарушение полового, созревания. Часто имеет, место умеренная гепатомегалия (Manglani M.
et al., 2003). Кроме того, вследствие развития ранней трансфузионной зависимости при неэффективном эритропоэзе у больных нередко наблюдаются перегрузка организма железом и связанные с
вторичным гемохроматозом осложнения. Данная форма ПККА
выявляется обычно на первом же году жизни, причем у 25% больных — уже в периоде новорожденное™ (Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, 1995).
В крови больных ПККА отмечаются нормохромная анемия, ретикулоцитопения. Количество лейкоцитов и тромбоцитов в норме.
В костном мозге наблюдается изолированный дефицит клеток
эритроидного ростка. У некоторых больных определяются признаки неэффективного эритропоэза с нарушением созревания эритро-
Глава 12. Анемии
339
идных клеток на стадии полихроматофильных нормобластов. Общая клеточность костного мозга обычно не изменена. Нередко может выявляться повышенное число железосодержащих клеток сидероцитов и сидеробластов.
Уровень сывороточного железа повышен.
Диагностика. Диагноз ставится па основании выявления гипорегенераторной анемии и изолированного дефицита клеток эритроидного ряда в костном мозге.
В сыворотке большинства больных иммунофлюоресцентным
методом и в питотоксическом тесте могут быть определены антитела к эритрокариоцитам (Тер-Григоров В. С. и др., 1980).
Нередко требуется углубленное обследование для выявления
заболеваний, с которыми может быть ассоциированиа ПККА. Описан ы случаи острого лейкоза и Т-клеточного хронического лимфолейкоза, которые на начальной стадии протекали под маской ПККА
(Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С, 1995; Воробьев 11. А.,
2001; Hansen R. M. et al, 1986). В сложных случаях для уточнения
диагноза используются методы проточной цитометрии, иммуногистохимии, кариологические и молекулярно-биологические исследования.
Лечение. В терапии больных ПККА используются глюкокортикоиды (ГК) (в средних и больших дозах), циклофосфамид, антилимфоцитарный глобулин (АЛГ), циклоспорин-А (ЦсА) и другие
препараты иммунодепрессивного действия.
* Из ГК чаще всего используется преднизолон и метилпреднизолон (метипред) в дозах от 3-5 мг/кг до мегадоз в 10/ мг/кг. Обычно
курс иммуносупрессивной терапии при назначении умеренных доз
препаратов продолжается около 4-8 недель. Первым критерием эффективности терапии служит увеличение числа ретикулоцитов.
С 80-х гг. XX в. в лечении ПККА используется цпклоспорин-А
(ЦсА). Эффективность ЦсА при ПККА связывают с такими ме- ханизмами действия препарата, как снижение пролиферации Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, поскольку данные субпопуляции
способны ингибировать рост колониеобразующих эритроидных
клеток. Отмечено, что ЦсА наиболее эффективен при идиопатнческой форме ПККА. причем он может давать хорошие результаты
при резистентности к другим видам терапии. Минимальная эффективная доза для достижения полной ремиссии — 4,5 мг/кг
в день. При лечении больных с идиопатической ПККА полные
ремиссии могут быть получены у 40% пациентов и частичные у 17%, в то время как при анемии Дайемонда-Блекфана ремиссии
наблюдаются у 20% больных. Минимальный период от начала при-
340
Часть 2. Клиническая гематология
ема до повышения числа ретикулоцитов — 14 дней. Однако высока доля рецидивов при отмене препарата — более чем у 60% больных (Кравченко С. К., 1998; Totterman Т. Н. et al, 1989; Charles R. J.
et al., 1996).
В целом лечение иммунодепрессивными препаратами приводит к ремиссиям примерно у 50-60% больных ПККА.
Попытки лечения больных ПККА внутривенным гамма-глобулином, даназолом оказались безуспешными (Kwong Y. L. et al.,
1996). Назначение иммуноглобулина для внутривенного введения
оказывает положительный эффект в тех случаях, когда аплазия
обусловлена инфицированием парвовирусом.
Как дополнительный метод терапии может использоваться лечебный плазмаферез, эффект от которого у больных ПККА обычно положительный, хотя и нестойкий (Yong N. S. et al., 1983).
Терапия врожденной формы ПККА обычно симптоматическая,
включающая заместительную гемотрансфузионную терапию, терапию хелаторами железа (дефероксамином), умеренными дозами ГК.
В лечении больных ПККА применяется также трансплантация
костного мозга, в том числе с использованием немиелоаблативных
режимов (Rabusin M. et al., 2000).
Прогноз. Средняя продолжительность жизни больных с приобретенной ПККА — около 14 лет. Возможны спонтанные ремиссии
заболевания у 15-20% больных (Гусева С. А. и др., 2001; Шиффман Ф. Д., 2000). В редких случаях происходит трансформация
ПККА в острый лейкоз. Имеются данные о том, что эффективность лечения зависит от сохранности колониеобразующей способности бурстобразующих единиц эритропоэза (БОЕ-Э), определяемой в культуре (Charles R. J. et al., 1996). У лиц с относительной
сохранностью колониеобразующей способности эритроидных предшественников результаты иммуносупрессивной терапии лучше.
Литература
Абдулкадыров К. М. Клинико-морфологическое изучение больных апластическими и гипопластическими анемиями до и после комплексной терапии: Дис.
канд. мед. наук. — Л., 1966.
Абдулкадыров К. М., Бессмелъцев С. С. Апластическая анемия. — СПб.: Наука;
Изд-во KN, 1995. - 232 с.
Абдулкадыров К. М., Попова Т. И., Шилова Е. Р. и др. Лечение больных апластической анемией в амбулаторных условиях (пособие для врачей). — СПб., 1998.
Абдулкадыров К. М., Попова Т. И., Шилова Б. Р. Тактика гемокомпонентной
терапии у больных апластической анемией // Актуальные вопросы службы
крови и трансфузиологии. — СПб., 1995. — С. 364-365.
Глава 13
ИДИОПАТИЧЕСКАЯ ТРОМБОЦИТОПЕНИЧЕСКАЯ
ПУРПУРА
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП) (болезнь Верльгофа, первичная иммунная тромбоцитопеническая пурпура) — это заболевание, которое обычно развивается в результате
иммунного конфликта, направленного на антигены либо тромбоцитов, либо мегакариоцитов, которое характеризуется снижением
количества тромбоцитов (< 150 х 109/л) при отсутствии иных отклонений при подсчете форменных элементов крови и геморрагическим синдромом.
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура наблюдается
в различных возрастных группах, однако чаще болеют дети и молодые люди. ИТП взрослых встречается в любом возрасте, но обычно у лиц 20-40 лет. У мальчиков и девочек это заболевание выявляется с одинаковой частотой. Среди взрослых чаще болеют женщины. Соотношение больных женщин и мужчин колеблется в
пределах 4 : 3, 3 : 1; на 100 тысяч населения приходится 4,5 лиц
мужского иола и 7,5 лиц женского пола. Распространенность ИТП
среди детей и взрослых колеблется от 1 до 13% на 100 тысяч человек, а ежегодный прирост ИТП, по данным J. N. George и соавторов (1995), составляет 10-125 больных (детей и взрослых) на 1 млн
населения.
Симптомы ИТП известны еще со времен Гиппократа, однако
только в 1735 г. Верльгоф выделил ее в отдельную нозологическую
единицу и описал как «болезнь пятнистых геморрагии» у молодых
женщин.
Этиология и патогенез. Этиология заболевания точно не установлена. У детей развитие ИТП обычно наблюдается после перенесенного инфекционного заболевания, особенно вирусного (грипп,
корь, краснуха, ветряная оспа, ВИЧ и др.), вакцинации, персистен-
350
Часть 2. Клиническая гематология
ции вирусов (вирус Эпштейна-Барра — ВЭБ, цитомегаловирусная инфекция - CMV) и парвовируса В19. При выяснении причин, приведших к развитию ИТП у взрослых, следует учитывать
те же факторы, то есть в первую очередь предшествующие инфекционные процессы. Некоторые лекарственные препараты могут
вызывать развитие иммунной тромбоцитопении: хинидин, соли
золота, антибиотики, налидиксовая кислота, триметоприм, парацетамол, салициловая кислота, различные нестероидные противовоспалительные средства, каптоприл, морфин, гепарин и другие
лекарственные препараты. В последние годы получены убедительные данные о роли Helicobacterpylory инфекции в развитии идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (Michel M. et al., 2002).
По результатам исследования К. Kohda и соавторов (2002), при
ликвидации данной инфекции у 63,2% больных отмечено существенное увеличение уровня тромбоцитов и, наоборот, существенное снижение IgG.
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура — приобретенное заболевание. В развитии ИТП определенную роль играет наследственная предрасположенность: передаваемая по аутосомнодоминантному типу качественная неполноценность тромбоцитов.
Для ИТП характерна повышенная деструкция тромбоцитов вследствие образования антител к их мембранным антигенам, обусловленного аномальным ответом на антигены (Kato A., 2003). Иммунологическая деструкция тромбоцитов может быть связана с воздействием лекарственных препаратов и с поеттрансфузионной
аллоиммунизацией, наблюдается при аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваниях, описана при синдроме антифосфолипидных антител и гестационной тромбоцитопении (Moccia E,
1999; Watanabe M. et al., 2002).
В тех случаях, когда количество антитромбоцитарных антител
очень велико или когда антитела направлены против антигена мегакариоцитов, отсутствующего на поверхности тромбоцитов, возможно нарушение производства мегакариоцитов. В большинстве
случаев ИТП количество тромбоцитов, образующихся в единицу
времени, не уменьшается, а увеличивается в 2-6 раз, что связано с
увеличением количества тромбопоэтинов в ответ на низкое количество тромбоцитов в периферической крови. Количество деятельных мегакариоцитов не уменьшено, а увеличено. Большое количество молодых мегакариоцитов, быстрое отщепление тромбоцитов
от мегакариоцитов и быстрый их выход в циркуляцию создают
визуально ошибочное впечатление, что мегакариоциты при ИТП
недеятельны (Баркаган 3. С, 1988).
Глава t3. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура
351
В основе патологического процесса при ИТП лежит срыв иммунологической толерантности к собственному антигену. Страдает
функция иммунокомпетентной системы организма, что характеризуется уменьшением содержания Т-лимфоцитов в крови, снижением бласттрансформации с фитогемагглютинином, увеличением количества В-лимфоцитов и нулевых клеток. Как известно,
антитела вырабатываются В-лимфоцитами, а Т-лимфоциты осуществляют функцию помощников, без которых невозможен ответ
В-клеток на антиген. Антитромбоцитарные аутоантитела находятся под контролем Т-хелперов и цитокинов. Доказано участие в
выработке иммунологической толерантности Т-супрессоров, блокирующих включение В-лимфоцитов в процесс антителообразования. Значительное понижение Т-лимфоцитов и выпадение их регулирующего влияния обусловливает повышенный и бесконтрольный В-клеточный иммунный ответ, с чем связан рост уровня
иммуноглобулинов в сыворотке крови больных с ИТП. При дефиците Т-супрессоров В-лимфоциты могут реагировать на различные антигены, в том числе похожие на собственные антигены, что
приводит к запуску аутоиммунного процесса (Абдулкадыров К. М.,
Бессмельцев С. С, 1990; Semple J. W., 2003). Показана важная роль
в механизме развития ИТП CD4 + Т-клеток, реагирующих с гликопротеином ПЬ/Ша, а также роль Т-клеточных рецепторов (альфа- и бета-цепи) в развитии аутоиммунного синдрома при ИТП
(Hedlund-Treutiger I. et al., 1998; Semple J. W., 2003). Селезенка при
ИТП играет «очистительную» роль, удаляя из циркуляции тромбоциты, содержащие на своей поверхности аутоантитела.
Классификация. По течению выделяют острые (продолжающиеся от 3 до 6 месяцев) и хронические формы ИТП (Гаврилов О. К.
и др., 1987; Цымбал И. Н., 2000; Dmoszynska A., 1993). Последние
подразделяются на варианты:
а) с редкими рецидивами;
б) с частыми рецидивами;
в) непрерывно рецидивирующее течение.
По периоду болезни выделяют обострение (криз), клиническую ремиссию (отсутствие каких-либо проявлений геморрагического синдрома при сохраняющейся тромбоцитопении) и клиникогематологическую ремиссии.
Клиническая картина и дифференциальная диагностика. Острая форма ИТП встречается, главным образом, у детей (80-90%).
У ребенка, чаще после инфекционного заболевания или вакцинации, причем, как правило, через 3 недели внезапно снижается количество тромбоцитов и развивается геморрагический синдром по
352
Часть 2. Клиническая гематология
микроциркуляторному типу. Геморрагический синдром обычно
представлен кожными геморрагиями (петехии, пурпура, экхимозы), кровоизлияниями в слизистые оболочки, кровотечениями из
слизистых (носовые, десневые, из лунки удаленного зуба, маточные, реже — мелена, гематурия). При физикальном обследовании
больного, кроме геморрагического синдрома, другие синдромы поражения (интоксикация, лимфоаденопатия и гепатоспленомегалия) не выявляются. Однако у некоторых больных увеличены печень и селезенка. В случае значительного снижения числа тромбоцитов возрастает риск профузных кровотечений с развитием тяжелой
постгеморрагической анемии, представляющей угрозу для жизни
больного. Основная причина смерти, хотя и достаточно редкая (менее 1 % при ИТП), — внутричерепные кровоизлияния. Факторы риска
последнего следующие: крайняя степень выраженности кожного геморрагического синдрома с локализацией петехий на vuiax, слизистой полости рта, кровоизлияния в склеру, кровотечения из слизистых носа при количестве тромбоцитов менее 20 х 109/л.
У детей старше 10 лет и взрослых чаще бывает хроническая
форма ИТП. Причем идиопатическая форма болезни развивается
зачастую без явной связи с каким-либо предшествующим заболеванием, хотя при тщательном сборе анамнеза нередко удается выявить провоцирующие факторы, например перенесенное острое
респираторное вирусное заболевание, ангину, длительное использование в лечебных целях медикаментозных средств, продолжительный контакт с химическими факторами (краски, нитроэмали
и пестициды) и т. д. Главным клиническим симптомом болезни
являются геморрагии, обусловленные тромбоцитопенией. Выраженность геморрагического синдрома весьма различна — от единичных синяков и небольших петехий до массивных кровотечений
из внутренних органов и кровоизлияний в жизненно важные органы и центры. Наблюдают гематурию (почечные лоханки, мочевой
пузырь, уретра), кровотечения из желудочно-кишечного тракта
(кровавая рвота, мелена) и кровоизлияния в головной мозг, в сетчатку. Геморрагии на коже в виде петехий и экхимозов часто локализуются на передней поверхности туловища и конечностей. Они
могут появляться на местах инъекций. На слизистой ротовой полости нередко возникают геморрагические везикулиты и буллы.
Кровоизлияния на лице, в конъюнктиве, на губах считаются серьезным симптомом, свидетельствующим о возможности кровоизлияний в головной мозг. Рецидивирующие десневые и носовые
кровотечения часто носят профузный характер. Нередко единственным симптомом болезни являются меноррапш, появляющиеся в
Глава 13. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура
353
начале периода полового созревания. Кровотечения при удалении
зубов возникают не всегда, начинаются сразу после вмешательства
и продолжаются несколько часов и дне]'!. Но после остановки они,
как правило, не возобновляются.
Увеличение размеров селезенки не характерно для хронической ИТП, хотя иногда при ультразвуковом исследовании удается
выявить умеренную спленомехалию. Каких-либо специфических
изменении в селезенке при ИТП не возникает. При морфологическом исследовании обнаруживается гиперплазия лимфоидной ткани, выражающаяся в расширении зародышевых центров фолликулов, появлении широкой перифолликулярной зоны из молодых
лимфоидных элементов. Размеры печени при ИТП также обычно
не изменены.
При исследовании периферической крови выявляется снижение количества тромбоцитов (всегда < 150 х 109/л, нередко вплоть
до нуля). В тех случаях, когда содержание тромбоцитов превышает
50 х 109/л, геморрагический диатез наблюдается редко. Обнаруживаются морфологические изменения в тромбоцитах: увеличение их размеров, иногда значительное, появление малозернистых
«голубых» клеток. Могут выявляться и малые формы пластинок,
отмечается их пойкилоцитоз и уменьшается количество отростчатых форм, регистрируемых при фазово-контрастном исследовании (Баркаган 3. С, 1988). Подтверждением диагноза должно служить обнаружение в крови больных антитромбоцитарных тромбоцитоассоциированных (TpA-IgG) или сывороточных антител по
данным иммунологического исследования. Для этих целей используется метод тромбоагглютинации (позволяет выявить полные антитела, вызывающие агглютинацию при смешивании сыворотки
больного с тромбоцитами донора), прямая и непрямая проба Кумбса, тест Штеффена (основан на определении антиглобулина), метод Диксона-Россе (наиболее информативный метод, который
выявляет антитела, расположенные на поверхности тромбоцитов).
Для выявления сывороточных антител используют метод иммуноферментного анализа.
Содержание эритроцитов и гемоглобина может быть нормальным. Если развивается анемия, то она в большинстве случаев является железодефицитной (в результате кровопотерь). У некоторых
больных анемия, как и тромбоцитопения, иммунного генеза с положительной пробой Кумбса. Морфология эритроцитов зависит
от наличия у больного анемии и ее характера. При исследовании
реологических параметров эритроцитов отмечается снижение их
агрегацпонной активности, уменьшение деформируемости эрит12 Гематология. Нов. справочник
354
Часть 2. Клиническая гематология
роцитов с одновременным повышением их собственной вязкости.
Низкая способность эритроцитов к агрегации и нарушение их эластических свойств при ИТП усугубляет патологию гемостаза и
может служить пусковым фактором развития ДВС-синдрома (Бессмельцев С. С, 1988).
Содержание лейкоцитов у большинства больных нормальное
или несколько увеличено. Лейкопения наблюдается при сочетанном поражении двух или трех ростков кроветворения.
Время кровотечения у больных с ИТП удлинено, ретракция
кровяного сгустка снижена. Наряду с этим, у преобладающего большинства больных (до 60%) наблюдаются изменения в фазах свертывания крови. По результатам коагулологического обследования
у больных регистрируется гипокоагуляция, которая по данным биохимической коагулограммы проявляется удлинением времени рекальцификации плазмы и тромбинового времени, снижением толерантности плазмы к гепарину. Снижается активность V, VII и
XIII факторов свертывания крови, протромбинового комплекса;
у отдельных пациентов обнаруживаются фибриногеноиения, подавление фибринолитической активности крови, а в сыворотке крови — продукты деградации фибриногена и фибрина. Данные громбо.эластограммы и кривой электрокоагулографа подтверждают нарушения в I и II фазах свертывания крови (Цепа Л. С. и др., 1986;
Бессмельцев С. С, и др., 1988, 1991).
В миелограмме при ИТП изменений не отмечается; выявляется
нормальное или повышенное количество мегакариоцитов, что доказывает тромболитический характер тромбоцитопении. Однако
при обострении болезни изредка может наблюдаться временное
снижение количества мегакариоцитов, причем вплоть до полного
их исчезновения. Мегакариоцитопения отражает более высокий
уровень поражения и указывает на тяжелое течение болезни. Часто обнаруживаются увеличенные мегакариоциты, преобладают
молодые формы. В случае рецидивирующих кровотечений в костном мозге может обнаруживаться раздражение красного ростка.
При гистологическом исследовании костного мозга у больных
ИТП регистрируется нормальное соотношение между жиром и
кроветворной тканью. У большинства больных отмечается увеличение количества мегакариоцитов, и лишь изредка в периоды обострения болезни или при особо тяжелом течении оно снижено
(наличие антимегакариоцитарных антител).
Дифференциальный диагноз. Диагностика ИТП нередко вызывает рудности, так как аналогичный симитомокомилекс может
быть проявлением других заболеваний.
Глава 13. Идиопатическаятромбоцитопеническая пурпура
355
Для ИТП характерны следующие критерии:
1) изолированная тромболитическая тромбоцитопения (тромбоцитов < 150 х 109/л) при отсутствии иных отклонений при подсчете форменных элементов крови;
2) отсутствие клинических и лабораторных признаков болезни
у кровных родственников;
3) нормальное или повышенное число мегакариоцитов в костном мозге;
4) отсутствие морфологических и лабораторных признаков, характерных для наследственных форм тромбоцитопений;
5) отсутствие у пациентов клинических проявлений других заболеваний или факторов, способных вызвать тромбоцитопению
(например, системная красная волчанка, ВИЧ-инфекция, острый
лейкоз, миелодиспластйческий синдром, а-гамма-глобулинемия,
лечение некоторыми лекарственными препаратами);
6) обнаружение антитромбоцитарных TpA-lgG или сывороточных антител;
7) эффект кортикостероидной терапии.
Дифференциальный диагноз ИТП проводится с целым рядом
заболеваний, сопровождающихся тромбоцитопенией: апластической анемией, пароксизмальной ночной гемоглобинурией (болезнь
Маркиафавы -Микели), острым лейкозом и другими злокачественными заболеваниями системы крови (например, лимфопротаферативные заболевания), витамин Вр и железодефицитным1 анемиями, миелодиспластическим синдромом, гемолитико-уремпческим синдромом, синдромом Вискотта -Олдрича, TAR-синдромом.
тромботической тромбоцитопенической пурпурой, синдромом Казабаха-Меррита, аномалией Мэя-Хегглина, Бернара-Сулье, синдромом Фишера-Эванса, ВИЧ-инфекцией, вирусными инфекциями (CMV, ВЭБ, парвовирус В19), гипоплазией мегакариоцитов
(под воздействием лекарств, алкоголя), конституциональными и
циклическими тромбопениями, некоторыми наследственными семейными тромбопениями, злокачественными опухолями с метастазами, системной красной волчанкой, хроническим гепатитом.
Клинико-гематологическая картина при ИТП имеет некоторое
сходство с симптоматикой апластической анемии (АА). В первую
очередь это геморрагический синдром, обусловленный тромбоцнтопенией. В результате длительных и частых кровопотерь у больных ИТП может развиваться анемия. Но следует помнить, что
анемия у больных АА носит нормохромный и нормоцитарный характер, между тем, возникшая вследствие кровотечений анемия
при ИТП — гипохромный. С течением времени у некоторых боль-
356
Часть 2. Клиническая гематология
ных ИТП возникает гипоплазия или даже полная аплазия костного мозга, которая может сохраняться долгое время, по сути представляя собой клинику АА. Однако для АА характерна пангемоцитопения (эритро-, тромбо-, лейкопения с нейтропенией и относительным лимфоцитозом), выраженная ретикулоцитопения. В миелограмме больных АА выявляется резкое уменьшение количества
миелокариоцитов, повышение содержания лимфоцитов, абсолютное снижение клеток нейтрофильного ряда, нередко сужение эритропоэза, существенное уменьшение, вплоть до полного отсутствия
мегакариоцитов (Бессмельцев С. С, 1997).
Определенные трудности могут возникнуть при дифференциальной диагностике ИТП и пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ), которая проявляется анемией, склонностью к лейкопении и тромбоцитопении. В костном мозге таких больных в
результате соматической мутации образуются тромбоциты, эритроциты и лейкоциты с неполноценной мембраной, которые легко
разрушаются в периферической крови под влиянием комплемента. Несмотря на тромбоцитопению, иногда выраженную при этой
болезни, кровоточивость наблюдается редко, более характерен гиперкоагуляционный синдром, тромбоз и эмболия сосудов различных органов. Отмечается преимущественно внутрисосудистый гемолиз, который периодически усиливается, поэтому у больных повышается уровень свободного гемоглобина плазмы. В отличие от
ИТП, ведущим симптомом ПНГ также является гемосидеринурия
(Абдулкадыров К. М, Бессмельцев С. С, 1995).
Гипорегенерация кроветворной ткани, наблюдаемая иногда при
железодефицитной анемии (ЖДА), проявляется ретикулоцитопенией, склонностью к лейкопении и даже тромбоцитопении. Решающее значение в диагностике ЖДА имеют показатели обмена железа, а при исследовании костномозгового аспирата — отсутствие
свойственных ИТП изменений мегакариоцитарного аппарата. Важное значение при диагностике ЖДА и ИТП имеет тщательно собранный анамнез заболевания. Тромбоцитопения в сочетании с
макроцитарной гиперхромной анемией наблюдается при дефиците витамина В12 или фолиевой кислоты в результате нарушения
деления всех клеток костного мозга, что связано с нарушением
образования ДНК. Но тромбоцитопения при этом чаще всего выражена нерезко, и, за исключением редких случаев, кровоточивости у таких больных нет. При мегалобластных анемиях в мазках
крови выявляют макроовалоцитоз, анизоцитоз и пойкилоцитоз
эритроцитов, типичными являются изменения гранулоцитов — гигантские палочкоядерные и гиперсегментированные нейтрофилы.
Глава 13. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура
357
Определяющее дифференциально-диагностическое значение имеет исследование костного мозга, который у таких больных обычно
гиперпластичен; обнаруживается множество мегалобластов, характерной чертой которых являются большие размеры и тонкий сетеподобный ядерный хроматин (Гаврилов О. К. и др., 1987).
При установлении диагноза ИТП необходимо иметь в виду миелодиспластический синдром (МДС), который, как и ИТП, нередко протекает с тромбоцитопенией. Причем обнаруживаются различные дефекты в кровяных пластинках: гигантские формы, клетки с атипичными гранулами, гипогрануляцией, изменение функции
тромбоцитов, нарушение их адгезии и агрегации. Но, в отличие от
ИТП, при МДС во всех клеточных линиях костного мозга выявляются морфологические и функциональные нарушения. Ведущее
место среди них занимают качественные и количественные изменения в эритроидном ростке кроветворения в виде явлений анизои пойкилоцитоза эритроцитов, макроцитоза, наличия мишеневидных эритроцитов, шизоцитов, нормобластов и мегалобластов. Обнаружение в лейкоцитарной формуле или миелограмме бластных
клеток является весомым аргументом в пользу миелодиспластического синдрома. Кроме того, у преобладающего большинства
больных обнаруживаются хромосомные нарушения (Абдулкадыров К. М., 1988).
Нередко острый лейкоз дебютирует глубокой тромбоцитопенией с геморрагическим синдромом. В таких ситуациях главными опорными пунктами дифференциального диагноза должны
быть результаты морфологического исследования костного мозга.
У больных острым лейкозом выявляется увеличение количества
бластных клеток, никогда не наблюдаемое при ИТП.
Необходимо исключить у больного и другие злокачественные
заболевания системы крови, в частности лимфопролиферативные
заболевания. Так, при синдроме Фишера-Эванса, который иногда
встречается при неходжкинских лимфомах, хроническом лимфолейкозе наблюдается аутоиммунная тромбоцитопения в сочетании
с аутоиммунной гемолитической анемией. В этих случаях необходимо обследование больного, включающее стернальную пункцию,
трепанобиопсию костного мозга, биопсию лимфатического узла.
Одним из этапов диагностики ИТП является ее дифференциация с группой наследственных тромбоцитопений. Существенную
роль в диагностике наследственных форм тромбоцитопенической
пурпуры играет морфологический анатиз тромбоцитов, определение их величины, структуры, функциональных свойств, а также
наличие других лабораторных и клинических проявлений наслед-
358
Часть 2. Клиническая гематология
ственной патологии, присущих некоторым формам тромбоцитопатии, протекающей с тромбоцитопеническим синдромом.
Тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП) впервые была описана Е. Moschcowitz (E. Мошкович) в 1925 г. Заболевание, в отличие от ИТП, характеризуется лихорадкой, неиммунной гемолитической анемией, тромбоцитопенией разной степени выраженности с геморрагическим синдромом (петехии,
синяки, носовые и желудочно-кишечные кровотечения, кровоизлияния в сетчатку и др.) и образованием множественных тромбов
в микроциркуляторном русле многих органов, неврологической
симптоматикой (дезориентация, атаксия, заторможенность речи,
гемипарезы и гемиплегии. тремор, диплопия, судороги и т. д.), нарушением функции почек (белок, эритроциты и цилиндры в моче).
Кроме того, больных беспокоят боли в суставах, нередко выявляется увеличение печени и селезенки (Баркаган 3. С, 1988). Гемолитико-уремический синдром (синдром Гассера) встречается
преимущественно у детей раннего возраста и характеризуется геморрагическим синдромом с тромбоцитопенией и признаками
ДВС-синдрома, гемолитической анемией и тяжелым нарушением
функции почек. Тромбоцитопения нередко сопровождает наследственные или врожденные дефекты структуры и функции тромбоцитов, чаще связанные с неполноценностью ферментов и (или)
оболочек клетки. К таковым относится макроцитарная тромбоцитодистрофия Бернара-Сулье, характеризующаяся кровоточивостью микроциркуляторного типа. Признаками этого заболевания
являются гигантские формы тромбоцитов, что, в первую очередь, и
определяет выраженность геморрагического синдрома. Продолжительность жизни тромбоцитов укорочена при сохранной их продукции, поэтому развивается умеренная тромбоцитопения (редко
ниже 100 х 109/л). Наблюдаются также отклонения в активности
фактора 3, отсутствие в цитоплазматической оболочке мегакариоцитов и тромбоцитов гликопротеида, взаимодействующего с фактором Виллебранда, VIII, V, XII факторами свертывания крови,
нарушение ультраструктуры мембраны. При наследственном, сцепленном с Х-хромосомой синдроме Вискотта-Олдрича тромбоцитопения, напротив, сочетается с микроформами тромбоцитов, нарушена реакция освобождения и агрегационная способность кровяных пластинок. Количество мегакариоцитов нормально или
повышено. Из других признаков болезни можно назвать экзему,
дефицит IgM и IgA, неполноценность малых форм Т-лимфоцитов,
атипичные плазматические клетки, экстрамедуллярный гематопоэз, главным образом, в лимфатических узлах и селезенке (Sho-
Глава 13. Идиопатическаятромбоцитопеническая пурпура
359
ver D. G. et a]., 1981). Аномалия Мея-Хеглина — редко встречающееся аутосомно-доминантно наследуемое заболевание, которое
характеризуется гигантскими тромбоцитами с эксцентричным расположением в них грануломера и нарушением дегрануляции. Тромбоцитопения обусловлена недостаточной продукцией тромбоцитов в костном мозге, а не укорочением их жизни и ускоренной
убылью из кровотока. У 30% больных развивается тромбоцитопения, однако число тромбоцитов чаще всего снижено до 40 х 109/л.
Геморрагический синдром при аномалии Мея-Хеглина в большинстве случаев выражен слабо.
Уменьшение числа тромбоцитов сопровождает довольно редкое заболевание — гигантскую кавернозную гемангиому Казабаха-Мерритта. Это заболевание проявляется кровоточивостью в
раннем детском возрасте (геморрагии в кожу, кровотечения из слизистых оболочек и др.) у детей с ангиомами кавернозного типа на
коже или во внутренних органах. Геморрагический синдром связан
с тромбоцитопенией и коагуляционными нарушениями. Предполагается, что тромбоцитопения развивается в результате гибели
клеток внутри ангиомы. Диагностика нетрудна при выявлении ангиом на коже, но сложна при их локализации во внутренних органах, когда нередко больному ошибочно устанавливают диагноз
ИТП. Поэтому таким пациентам при подозрении на гемангиому
Казабаха-Мерритта необходимо эндоскопическое и ангиографическое исследование.
Тяжелая тромбоцитопения описана при TAR-синдроме (тромбоцитопатия и тромбоцитопения с отсутствием лучевой кости —
thrombocytopenia/pathia absent radii), который принадлежит к группе врожденной патологии мегакариоцитарно-тромбоцитарного аппарата (амегакариоцитарная тромбоцитопения), сочетается с билатеральной аплазией лучевых костей, иногда и с другими скелетными нарушениями (деформацией позвоночника, дисплазией
тазобедренных суставов и т. д.), почечными или сердечными аномалиями (врожденными пороками сердца, пролабированием митрального клапана). Встречается редко у новорожденных (Yuhan I.
etal, 1980;ZahaviJ.etal., 1981).
Особую группу составляют тромбоцитопешш потребления, наблюдающиеся при тромбозах и диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови (ДВС-синдроме). Необходимо помнить
и о том. что ИТП (особенно у детей) могут вызвать вирусы ветряной оспы, кори, краснухи, CMV, ВЭБ и парвовирус В19.
Следует отметить, что диагностика как приобретенных, так и
наследственных тромбопитопсний может оказаться сложной, осо-
360
Часть 2. Клиническая гематология
бенно если требуется уточнить дефекты тромбоцитов и если тромбоцитопения остается единственным проявлением другого процесса. Во всех случаях ИТП следует исключить симптоматические
формы, связанные с системной красной волчанкой, хроническим
агрессивным гепатитом или другими заболеваниями, в патогенезе которых определенное значение принадлежит иммунным
сдвигам. Динамическое наблюдение за больным, тщательное обследование с привлечением всего комплекса лабораторных и инструментальных методов исследования, а также повторное исследование кроветворения позволяют конкретизировать характер
заболевания.
Лечение. При лечении аутоиммунных тромбоцитопений любого генеза традиционным является применение кортикостероидных
гормонов, внутривенных иммуноглобулинов, спленэктомии и цитостатическихиммунодепрессаитов.
Для большинства детей с острой формой ИТП существует благоприятный прогноз и возможность полного выздоровления без
какой-либо терапии, поэтому за ними необходимо вести постоянное наблюдение. Выздоровление обычно наступает в течение 46 месяцев с момента установления диагноза. Однако если у больных во время наблюдения возникает опасность возникновения
тяжелых кровотечений (внутричерепного кровоизлияния или кровотечения из слизистых с развитием тяжелой постгеморрагической анемии), угрожающих их жизни, то терапия показана немедленно. Если кожный геморрагический синдром не нарастает, то
терапия кортикостероидами не показана. Как правило, в такой ситуации геморрагии на коже исчезают в течение 7-10 дней, количество тромбоцитов нормализуется позже (индивидуально у каждого больного). Длительность тромбоцитопений определяется временем циркуляции в крови антитромбоцитарных антител — от 36 недель до 3-6 месяцев. Тромбоцитопения при отсутствии геморрагического синдрома лечения не требует. При нарастании кожного геморрагического синдрома в процессе наблюдения за больным
и (или) при возникновении кровотечения показана иммуносупрессивная терапия глюкокортикостероидами (ГК). Кортикостероиды уменьшают фагоцитоз сенсибилизированных антителами
тромбоцитов: нейтрализуют механизмы, вызывающие угнетение
тромбопоэза; уменьшают проницаемость и повреждения эндотелия;
оказывают иммуносупрессивноедействие. Из ГК чаще применяется преднизолон, начальная доза которого составляет в среднем
60 мг/м2 (2 мг/кг в сутки) в течение 3 недель, что соответствует
периоду полураспада антитромбоцитарных антител. При достиже-
Глава 13. Идиопатическая тромбоцитопсническая пурпура
361
нии полной клинико-гематологической ремиссии доза предннзолона уменьшается по 5-10 мг каждые 3 дня до полной отмены.
Снижение количества тромбоцитов на фоне уменьшения дозы ГК
не является показанием к возврату прежней дозы. При наличии у
больного тяжелых и опасных для жизни кровотечений начальная
доза ГК может быть увеличена до 3-5 мг/кг в сутки на 3-5 дней
до купирования геморрагического синдрома с переходом затем на
дозу 2 мг/кг в сутки. Наряду с преднизолоном может применяться
метилпреднизолон (или дексаметазон в адекватной дозе) в виде
пульс-терапии (30 мг/кг в сутки, а при тяжелом состоянии больного — до 50 мг/кг от 3 до 7 дней) до купирования геморрагического синдрома и повышения тромбоцитов (> 20 х 109/л) (Buchanan G. R., Holtkamp С. А., 1984; Hoyle С. et al., 1986; Albayrak D.
et al., 1994).
Спонтанное выздоровление у взрослых с хронической ИТП отмечается крайне редко. Больные с уровнем тромбоцитов более
20 х 109/л не подлежат госпитализации, если отсутствует симптоматика или имеются лишь минимальные проявлении пурпуры. При
уровне тромбоцитов > 50 х 109/л и даже 30-50 х 109 при отсутствии геморрагического синдрома показаний для терапии нет. Однако при уровне тромбоцитов 20-30 х 109/л и < 50 х 109/л и геморрагическом синдроме (или выявлении факторов риска возникновения таких кровотечений, как гипертензия, язвенная болезнь
желудка или активный образ жизни) больные нуждаются в лечении. Пациенты подлежат госпитализации при количестве тромбоцитов < 20 х 10э/л и геморрагическом синдроме (George J. N. et al.,
1996; Garvey В., 1998). У взрослых пациентов с хронической ИТП
глюкокортикоиды также считаются стандартным методом лечения и используются в качестве инициальной терапии при умеренной и тяжелой тромбоцитопении с геморрагическими проявлениями (с 1950 г.). ГК показаны взрослым больным с ИТП при
количестве тромбоцитов < 30 х 109/л (в том числе при отсутствии
клинических проявлений), с минимальной пурпурой, а также при
выраженном геморрагическом синдроме (George J. N. et al., 1996).
Начинают лечение обычно с назначения преднизолона в дозе 11,5 мг/кг (в среднем 60-90 мг в сутки) (Mazzucconi M. G. et al.,
1985). В тяжелых случаях эта доза может оказаться недостаточной,
тогда через 5-7 дней ее повышают в 2-3 раза. Длительность лечения ГК обычно не превышает 3-4 недель.
Критерии ответа при лечении больных с ИТП:
1) полный гематологический ответ (полная ремиссия) — увеличение количества тромбоцитов > 150 х 109/л;
362
Часть 2. Клиническая гематология
2) частичный гематологический ответ (частичная ремиссия):
А— увеличение количества тромбоцитов до 50 х 109/л и более;
Б - увеличение количества тромбоцитов до 30-50 х 109/л у больных с уровнем тромбоцитов до начала терапии < 20 х 109/л;
3) отсутствие ответа — увеличение количества тромбоцитов менее чем на 15 х 109/л при сохранении геморрагического синдрома.
Эффект терапии обычно проявляется в течение первых дней
лечения. Вначале прекращается геморрагический синдром, а затем
начинается рост числа тромбоцитов. Лечение продолжается до получения полного эффекта. Затем начинается этап снижения дозы
и постепенной, медленной отмены кортикостероидов. В ряде случаев один такой курс может привести к окончательному излечению. Однако чаще после отмены гормонов или даже при попытке
снижения дозы наступает рецидив, требующий возврата к исходным высоким дозам препарата. Примерно у 10% больных эффект
кортикостероидной терапии вообще отсутствует или оказывается
неполным: кровоточивость прекращается, тромбоцитопения остается. Больным, резистентным к обычным дозам ГК, можно провести короткий интенсивный курс терапии преднизолоном (100 мг и
более в сутки) или использовать пульс-терапию метилпреднизолон (Godeau В. et a]., 1995).
В последние годы все большее применение при лечении ИТП
находят внутривенные иммуноглобулины (IgG), которые угнетают образование антител. Чаще их используют у больных, резистентных к ГК или другим методам лечения, хотя применяют и в качестве метода первичной терапии. Внутривенные иммуноглобулины
вызывают более быстрое повышение уровня тромбоцитов, чем ГК.
Назначение внутривенных иммуноглобулинов показано первичным больным с уровнем тромбоцитов < 30 х 109/л и больным, у
которых наблюдаются тяжелые, угрожающие жизни кровотечения. Не показаны больным с количеством тромбоцитов в пределах
!)
30-100 х 10 /л при отсутствии геморрагических проявлений или
при минимальной пурпуре. Внутривенные иммуноглобулины назначаются также в качестве первичной терапии больным при количестве тромбоцитов < 20 х 109/л при отсутствии геморрагических проявлений или при минимальной пурпуре или выявлении
факторов риска развития кровотечений (гипертензии, пептических язв, активном образе жизни) (George J. N. et al., 1996). Назначаются внутривенные иммуноглобулины по 0,4 г/кг/день в течение 5 дней. Некоторые исследователи предлагают назначать их
в дозе 1 г/кг/день однократно или в течение 2 последовательных
дней (BusselJ. В. et al., 1990). Подъем уровня тромбоцитов бывает
Глава 13. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура
363
быстрым. У больных с хронической формой ИТП применение внутривенных иммуноглобулинов приводит к увеличению количества
тромбоцитов на 75%, а у половины из них — к полной нормализации. Однако достигнутый ответ является кратковременным, и
через 3-4 недели после окончания курса лечения уровень тромбоцитов возвращается к исходному. В. Godeau с соавторами (2002)
опубликовали результаты по сопоставлению эффективности внутривенных иммуноглобулинов и высоких доз метилпреднизолона
с или без преднизолона. Рандомизировано были выделены две
группы взрослых больных с тяжелой формой ИТП (тромбоцитов
< 20 х 109/л), которые получали либо внутривенные иммуноглобулины, либо высокие дозы метилпреднизолона в течение 3 дней, а
затем каждая из этих групп была разделена еще на 2 подгруппы и с
4-го по 21-й день в одной из них назначен преднизолон внутрь, а в
другой — плацебо. У 18 (32%) из 56 больных, получавших внутривенные иммуноглобулины, и только у 14 (23%) из 60 — метилпреднизолон, количество тромбоцитов превысило 50 х 109/л (р = 0,02).
При назначении в дальнейшем преднизолона больным, получившим внутривенные иммуноглобулины, количество тромбоцитов
более 50 х 109/л сохранялось 18,5 дней, а получавших метилпреднизолон — 17,5 дней. Авторы приходят к заключению, что более
эффективно применение внутривенных иммуноглобулинов в сочетании с преднизолоном, чем метилпреднизолона с преднизолоном.
Из других перспективных препаратов, которые в последние годы
начинают активно использовать в терапии ИТП, следует отметить
анти-Ш1(О)-иммуноглобулины — aHTn-Rh(D). Анти-D представляет собой гамма (IgG) фракцию, содержащую высокую концентрацию антител к Rh0(D) антигену эритроцитов. Клинические исследования последних 10 лет показали, что применение внутривенного анти-D является эффективным методом лечения Rh+ и
неспленэктомизированных больных с ИТП (Scaradavou A. et al.,
1998). После назначения aiiTH-Rh(D) в течение 2-3 недель примерно у половины Rh+ больных (у которых не удалена селезенка)
наблюдается транзиторное повышение количества тромбоцитов
(эффективность у больных с удаленной селезенкой значительно
ниже) (Rodeghiero F. et al., 1992). Неясным пока остается и механизм его действия. Установлено, что уже через 3 часа после введения aHTH-Rh(D) у больных отмечается существенное, но транзиторное увеличение уровня про- и антивоспалительных цитокинов/
хемокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, GM-CSF, TNF-альфа). J. W. Semple и соавторы (2002) назначали aHTH-Rh(D) детям с хронической ИТП
364
Часть 2. Клиническая гематология
по 25 или 50 мкг/кг, a S. G. Sandier (2001) — по 50-75 мкг/кг.
A. Sagripanti с соавторами (1998) рекомендуют применять 9001500 мкг aHTn-Rh(D) IgG 3 дня каждый месяц в течение 2 или
3 последовательных месяцев. Однако окончательная методика применения aHTH-Rh(D) пока не разработана.
По результатам исследований V. Blanchete и М. Сагсао (1998), в
экстренных ситуациях предпочтительным представляется применение высоких доз внутривенных иммуноглобулинов G, а не
aHTH-Rh(D), так как они более быстро вызывают увеличение содержания тромбоцитов. Однако для поддерживающей терапии у
Rh+пациентов следует использовать aHTH-Rh(D), при этом его
эффективность сопоставима с таковой внутривенных иммуноглобулинов, но он более удобен при применении, а стоимость его
меньше.
В комплексной терапии больных ИТП используют также антитимический (АТГ) и антилимфоцитарный (АЛГ) иммуноглобулины. Эти препараты оказывают стимулирующее влияние на Тклеточное звено иммунитета, что способствует нормализации иммунного ответа организма больного (Абдулкадыров К. М, Бессмельцев С. С, 1990). При анализе результатов лечения больных
этой группы установлено, что после курса комплексной терапии,
включающей АТГ/АЛГ, у большинства больных наблюдалось
увеличение уровня тромбоцитов (> 50 х 10"/л) и купирование геморрагического синдрома. АЛГ назначается внутривенно капельно через день в дозе 1,5-2,0 мг/кг/сут; курс лечения состоит из 67 инфузий. По результатам наших исследований (1990,1991), применение АЛГ у 15 (75%) из 20 больных хронической ИТП привело
к развитию ремиссии заболевания (у. 3 больных — полной ремиссии, у остальных.— частичной), длительность которой составила
5-10 месяцев. Правда, следует отметить, что у 5 (25%) после 45 инфузий АЛГ, наоборот, наблюдалось усиление геморрагического синдрома, что связано с ухудшением реологических свойств
эритроцитов и гемокоагуляционными расстройствами по типу
ДВС-синдрома (Бессмельцев С. С. и др., 1988, 1991). Для предотвращения или уменьшения гемореологических нарушений, удаления продуктов распада лимфоцитов, антитромбоцитарных антител и циркулирующих иммунных комплексов, уровень которых в
крови больных нарастает при АЛГ-терапии, показано использование лечебного плазмафереза. Каждому больному, в случае выявления у него на фоне АЛГ-терапии нарастающих реологических и
гемокоагуляционных сдвигов, проводятся 3-5 сеансов лечебного
плазмафереза с изъятием в целом 1500-5500 мл плазмы.
Глава 13. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура
365
При неполном и нестабильном эффекте лечения больных с ИТП
(обычно через 3-4 месяца от начала терапии) возникают показания к спленэктомии. Спленэктомия проводится не ранее чем через
1 год после установления диагноза. Принятый возраст для спленэктомии — 5 лет и старше, что связано с созреванием иммунной
системы к этому возрасту. Спленэктомия является наиболее эффективным методом долгосрочного лечения, особенно в случаях,
когда разрушение тромбоцитов с радиоактивной меткой происходит преимущественно в селезенке. Показаниями к плановой спленэктомии служат частые обострения с кровотечениями из слизистых при количестве тромбоцитов менее 30 х 109/л. При некупирующемся кровотечении или угрозе кровоизлияния в ЦНС целесообразна спленэктомия по жизненным показаниям. Во время
операции должны быть удалены все добавочные селезенки, в противном случае тромбоцитопения будет сохраняться. Более чем у
50-75% больных с аутоиммунной тромбоцитопенией спленэктомия приводит к стойкой полной ремиссии или даже практическому выздоровлению. Это касается в первую очередь больных, у которых кортикостероидные гормоны оказывают хороший, но нестойкий эффект. Эффект спленэктомии лучше в тех случаях, когда
нормализация тромбоцитов наступает от небольшой дозы преднизолона. Спленэктомию обычно производят на фоне ГК, причем за
4-5 дней до операции дозу преднизолона повышают, с тем чтобы
уровень тромбоцитов стал по возможности нормальным или субнормальным. За 1-2 дня до операции, независимо от того, удалось
или не удалось нормализовать уровень тромбоцитов, дозу преднизолона удваивают. Это обеспечивает улучшение гемостаза во время и после оперативного вмешательства. Учитывая более быстрое
выведение из организма преднизолона, применяемого для парентерального введения, внутривенно следует вводить дозу преднизолона, в 3 раза большую, чем рассчитанная для внутреннего приема.
Внутримышечные инъекции больным с ИТП делать не следует.
С 3-го дня после спленэктомии дозу преднизолона быстро снижают и к 5-6-му дню послеоперационного периода доводят до исходной, а затем в зависимости от эффекта операции начинают медленное снижение дозы и постепенную отмену глюкокортикоидных
гормонов. В случае уменьшения количества тромбоцитов на фоне
снижения дозы преднизолона темп снижения замедляют. Даже при
неэффективной спленэктомии более чем у половины больных синдром кровоточивости исчезает, хотя уровень тромбоцитов и остается низким. У некоторых из них наблюдается отсроченный эффект операции — медленное повышение уровня тромбоцитов в
366
Часть 2. Клиническая гематология
последующие 5-6 месяцев. Нередко после удаления селезенки проявляется терапевтическое действие ранее неэффективных кортикостероидов, причем удается долго вести больных на прерывистых
курсах сравнительно малых доз гормонов (Фанштейн Ф. Э. и др.,
1987; Гаврилов О. К. и др., 1987; Баркаган 3. С, 1988; Цымбал И. Н..
2000; Davis P. W. et al., 1991). В тех случаях, когда проведение
спленэктомии по каким-либо причинам противопоказано, некоторые авторы предлагают применять облучение селезенки (Саиlier M. Т. et al., 1995) ИЛИ частичную эмболизацию сосудов селезенки (Shaw J. Н. Е, Clark M. А., 1989).
Наибольшие трудности в терапевтическом плане представляют собой больные ИТП после неэффективной спленэктомии, у
которых возврат к гормональной терапии оказывается безрезультатным или дает временный и нестойкий эффект даже при применении высоких доз гормонов. Этим больным показана терапия цптостатическими иммунодепрессантами в сочетании с кортикостероидными гормонами. В качестве иммунодепрессантов применяют
следучощие препараты: имуран (азатиоприн) из расчета 50 мг/м2
вдень, продолжительность курса до 3-5 месяцев; циклофосфан
(циклофосфамид) по 200-400 мг в день, на курс около 6-8 г; винкристин по 1-2 мг/м2 1 раз в неделю, продолжительность курса
1,5-2 месяца. По сообщению J. Pizzuto и R. Ambriz (1984), при
использовании азатиоприна у 20% больных наблюдалась нормализация содержания тромбоцитов, которое сохранялось от нескольких месяцев до года без лечения. При применении циклофосфамида у 60-80% больных отмечалось увеличение уровня тромбоцитов
и у 20-40% их содержание оставалось нормальным в течение 23 лет. Винка-алкалоиды (винкристин, винбластин) вызывают транзиторное повышение уровня тромбоцитов в течение 1 -3 недель у
60% больных с ИТП. Но достигнутый эффект лишь у 10% больных
сохраняется в течение 3 месяцев (Facon Т. et al., 1994).
Однако следует подчеркнуть, что применение иммунодепрессантов до спленэктомии нерационально, так как такое лечение ухудшает условия для последующей операции, без которой редко удается обойтись. Кроме того, у молодых пациентов и детей лечение
цитостатическими препаратами чревато мутагенным эффектом и
бесплодием. Поэтому использование цитостатических препаратов — это скорее терапия «отчаяния» в случае неэффективной
спленэктомии.
Имеются сообщения об успешном лечении больных с ИТП даназолом (Flores A. et al., 1990; Edelmann D. Z. et al., 1990). Положительный ответ на лечение даназолом регистрируется у 10-80% боль-
Глава 13. Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура
367
ных с ИТП. Даназол представляет собой синтетический андроген,
который является производным этинилтестостерона. Препарат обладает иммуномодулирующим эффектом, вызывает стимуляцию
мегакариоцитарного ростка. Даназол, в отличие от других андрогенов, дает минимальный вирилизирующий эффект, поэтому нашел широкое применение в терапии аутоиммунных заболеваний.
Е. К. Донюш и соавторы (2001) назначали даназол в дозе по 1020 мг/кг/сут (не более 800 мг/сут), разделенной на 2 приема (утром и вечером) в течение 3 месяцев и более. По результатам исследования авторов, терапия даназолом позволила достичь частичного гематологического ответа у 57,1% больных хронической ИТП, в
том числе у 16,7%, не ответивших на кортикостероидную терапию.
Средняя скорость гематологического ответа на терапию даназолом составила 3,4 недели.
При непрерывно рецидивирующем течении хронической ИТП
до и (или) после спленэктомии в настоящее время обсуждается
использование модуляторов иммунного ответа (особенно у часто
болеющих) — препаратов интерферона (интрон А, лейкинферон,
у-интерферон), циклоспорина A (Dubbeld P. et al., 1994). Имеются
отдельные сообщения о применении колхицина, 2-хлородеоксиаденозина, полихимиотерапии, протеин А-иммуноадсорбции, лечебного плазмообмена (Marder V. J. et al., 1981; Strother S. V. et al.,
1984; Balint J. P. et al., 1991; Figueroa M. et al., 1993). J. Delgado и
соавторы (2002) у 4 больных с рефрактерной иммунной тромбоци2
топенической пурпурой применяли ритуксимаб по 375 мг/м 1 раз
в неделю (курс — четыре введения). Однако только у одного пациента была достигнута полная клинико-гематологическая ремиссия. На сегодняшний день достоверные данные об эффективности
указанных выше препаратов или доказательств, на основе которых
можно было бы разработать рекомендации, отсутствуют.
Имеются также сообщения о применении у больных с хронической формой ИТП трансплантации (аллогенной, аутологичной)
костного мозга или периферических стволовых клеток. R. D. Huhn
и соавторы (2003) привели результаты аутологичной трансплантации периферических стволовых клеток, очищенных от лимфоцитов. В исследование было включено 14 больных хронической ИТП,
многократно леченных ранее (кортикостероиды, спленэктомия,
внутривенные иммуноглобулины). У 6 больных была достигнута
полная ремиссия (содержание тромбоцитов > 100 х 109/л), продолжительность которой составляла 42 месяца. Еще у 2 пациентов
была получена частичная ремиссия. Авторы считают, что аутологичная трансплантация периферических стволовых клеток явля-
368
Часть
2.
Клиническая
гематология
ется перспективным методом лечения больных хронической ИТП.
Однако для выработки рекомендаций по применению данного метода при ИТП необходимо проведение крупных контролируемых
исследований.
Симптоматическое .течение геморрагического синдрома при
тромбоцитопении включает местные и общие гемостатические средства. Рационально применение е-ЛКК, адроксона, аскорбиновой
кислоты и других средств. Местно, особенно при носовых кровотечениях, широко используют гемостатическую губку, окисленную
целлюлозу, адроксон, местную криотерапию и е-АКК.
Показания к переливанию эритроцитов должны быть строго
ограничены (глубокая острая анемия), причем во избежание повторной иммунизации больного лейкоцитарным и тромбоцитарным детритом переливают только отмытые эритроциты, доза которых подобрана индивидуально. Вопрос о необходимости переливания тромбоцитов при иммунных тромбоцитопениях спорен.
По мнению многих исследователей (Баркаган 3. С, 1988; Цымбал И. Н., 2000), при всех разновидностях аутоиммунных тромбоцитопении вливание тромбоцитов не показано из-за сенсибилизации и резкого повышения образования антитромбоцитарных антител, так как оно грозит усугублением тромбоцитолиза. Следует к
тому же иметь в виду, что у больных с ИТП зачастую отмечается
рефрактерность к тромбоцитам, определяемая отсутствием существенного увеличения их количества в ответ на перелитую дозу.
Антитела, выявляемые у пациентов с ИТП, вызывают развитие
иммунной рефрактерное™ и обладают алло- или аутореактивностью. Переливание тромбоцитов следует рекомендовать лишь в тех
случаях, когда возникшее кровотечение угрожает жизни или функции органов у больного с ИТП. Хороший результат может дать
введение тромбоцитов, подобранных по HLA-системе и полученных путем тромбоцитафереза. Профилактическое переливание
тромбоцитов перед спленэктомией также обычно не показано
(Warkentin Т. Е., Kelton J. G., 1995).
Прогноз. Прогноз относительно жизни большей частью благоприятный. У преобладающего большинства детей (80-90%) ИТП
заканчивается спонтанным выздоровлением в результате терапии
или без нее. Выздоровление наступает, как правило, в течение 6 месяцев, поскольку антитромбоцитарные антитела могут циркулировать в крови до 3-6 месяцев. Больные хронической ИТП нуждаются в постоянном наблюдении. Профузные кровотечения при
тяжелой форме могут представлять смертельную опасность. Больному хронической ИТП должны быть даны подробные рекоменда-
Глава 13. Идиопатическая тромбоцнтопеническая пурпура
369
ции о необходимости контролировать гемограмму при развитии
инфекционных заболеваний или геморрагических проявлений, избегать острых алкогольных интоксикаций, приема препаратов, влияющих на тромбоциты (аспирин, нестероидные противовоспалительные препараты и др.), а также профилактических прививок в
острой фазе заболевания, брать с собой в поездки кортикостероиды н принимать по 1 мг/кг в течение нескольких дней при развитии геморрагического синдрома (при гормоночувствительной пурпуре).
Литература
Абдулкадыров К. М. Вопросы патогенеза, диагностики и лечения так называемой
«гемопоэтической дисплазии» /'/' Гематол. и трансфузиол. 1988. № 4. С. 6-9.
Абдулкадыров К. М., Бессмельцев С. С. Иммунологические и реологические параллели при лечении антилимфоцитарным глобулином больных аутоиммунной тромбоцнтопенической пурпурой // Клин. мел. 1990. № 6. С. 49-53.
Абдулкадыров К. М., Бессмелъцев С. С. Апластическая анемия. — М.: Наука:
СПб.: KN, 1995. - 232 с.
Барками 3. С. Геморрагические заболевания и синдромы. — 2-е изд., перераб. и
доп. — М.: Медицина, 1988. — 528 с.
Бессмельцев С. С. Роль эритроцитов в изменениях реологических и коагуляционных свойств крови при некоторых гематологических заболеваниях: Дне. канд.
мед. наук. - Л„ 1988.-229 с.
Бессмельцев С. С, Федорова З.Д., Абдулкадыров К. М. Реологические и гемокоагуляционные нарушения у больных аутоиммунной тромбоцитопенической
пурпурой, получавших антилимфоцитарный глобулин, и их коррекция гепарином // Гематол. и трансфузиол. 1991. № 9. С. 26- 30.
Бессмельцев С. С. Диагностика и дифференциальная диагностика апластической анемии // Клип. мед. 1997. № 9. С. 20-25.
Гаврилов О. К., Файнштейн Ф. Э., Турбина Н. С. Депрессии кроветворения. — М.:
Медицина, 1987. — 256 с.
Донюш Е. К., Быкова Л. П., Хаспекова С. Г. и др. Использование даназола в
лечении детей с хронической аутоиммунной тромбоцитопенической пурпурой,
резистентных к кортикостероидной терапии //' Гематол. и трансфузиол. 2001.
№ 1.С. 24-27.
Цепа Л. С, Сандулова Ю. Ф., Отставнова Е. И. Экстренная сплензктомия у
больных тромбоцитопенической пурпурой // Гематол. и трансфузиол. 1986.
№ 10. С. 629-630.
Цымбал И. Н. Иди<
чащпп врач. 2000. № 2.
Albayrak D., Islek I., Kalayci А. С, Guises N. Acute immune thrombocytopenic
purpura: A comparative study of very high oral doses of methylprednisolone and
intravenously administered immune globulin //'J. Pediatr. 1994. Vol. 125. P. 1004—
1008.
Balint J. P., Snyder H. W., Cochran S. K., Jones F. R. Longterm response of immune
thrombocytopenia to extracorporeal immunoadsorption // Lancet. 1991. Vol. 337.
P. 1106-1109.
Глава 14
ГЕМОФИЛИЯ
Гемофилия — наследственное заболевание, которое передается
как рецессивный признак, сцепленный с Х-хромосомой. обусловленное дефицитом или молекулярными аномалиями факторов свертывания крови VIII/IX и характеризующееся тяжелыми массивными кровотечениями различной локализации.
Гемофилия как наследственное заболевание было описано еще
в Талмуде в V в. н. э., однако современное знание и научное исследование гемофилии ведет отсчет с конца XX в. В 1903 г. американский врач Отто описал это заболевание как врожденное, которое
поражает только мужчин, но передаваемое здоровыми женщинами
и сопровождающееся массивными кровотечениями. Отто указал,
что при данном заболевании определяется удлинение времени свертывания крови и отмечается склонность к кровоточивости, которая возникает в раннем детстве, причем самый типичный симптом
кровоточивости — кровоизлияния в суставы. В Германии первоначально этой болезни дали название «геморрафилия», чтобы обозначить ее характерную черту — «любовь к кровоточивости»; затем название укоротили до гемофилии. Ранее считали, что гемофилия — это однородное заболевание, но в конце 40-х гг. XX в. Pavlovsky
из Аргентины обнаружил, что дефект свертывания крови одного
больного гемофилией можно нормализовать инфузией крови от
другого человека, страдающего этой болезнью. Аналогичные исследования, проведенные в 50-х гг., показали, что имеются, по меньшей мере, две формы гемофилии. Одна из них — классическая,
названная гемофилией А, вызвана отсутствием или недостатком
фактора VIII, известного также как антигемофильный фактор
(АГФ), или антигемофильный глобулин (АГГ). Другая форма, получившая название гемофилия В, обусловлена недостаточностью
374
Часть 2. Клиническая гематология
фактора IX. известного также как антигемофильный фактор В,
или фактор Кристмасса. Гемофилии А и В сходны по наследованию и клинически неотличимы.
Биохимические свойства факторов VIII и IX. В последние годы сделаны эпохальные биохимические открытия в области гемофилии, которые помогают понять эту болезнь, ее диагностику и
лечение.
В настоящее время доказано, что фактор VIII, дефицитный при
гемофилии А, и высокомолекулярный фактор Виллебранда (фВ),
который отсутствует при болезни Виллебранда, представляют собой два отличных друг от друга белка, которые в кровотоке находятся в виде нековалентно связанных комплексов. Концентрация
ф\ТП в плазме составляет всего лишь 150 шу'мл, тогда как фВ
присутствует в избытке — 5-10 мкг/мл. Таким образом, фВ является белком-носителем, который необходим для адекватной секреции фУШ; он также защищает лабильный фУШ от протеолитического разрушения. ФУШ связан с фВ, поэтому при повреждении сосудов он в достаточных концентрациях сосредоточивается у
обнаженного субэндотелия.
В 1984 г. две научные группы в США выделили ген, ответственный за синтез фУШ, и определили его структуру (Gitschier J.
et al., 1984; Toole et al., 1984). Этот ген расположен на длинном
плече Х-хромосомы, его длина составляет 186 тысяч пар нуклеотидов, содержит 26 экзонов и 25 интронов и является одним из
самых больших из известных генов человека. Структуру фУШ
составляют три А домена, один богатый углеводами домен В и
два С домена. Домены А и С имеют аминокислотную последовательность такую же, как у фУ, домены А имеют гомологию, идентичную церулоплазмину, белку, содержащему медь (Toole et al.,
1984). Считают, что фУШ синтезируется синусоидными клетками печени, хотя существуют мнения об участии других эндотелиальных клеток и даже гепатоцитов (Zelechowska et al., 1985;
Hellman I. et al., 1989).
Фактор VIII играет ключевую роль в процессе свертывания
крови в качестве кофактора 1Ха и тем самым ускоряет активацию
фХ. Вначале фУШ активируется путем расщепления тромбином
тяжелых и легких цепей в местах расположения остатков Arg372 и
Argl689 соответственно. Для полной активности фУШ требуется
А2 домен (44 кД) (Pittman D. et al., 1992).
Фактор IX синтезируется в печени и представляет собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 56 000, его концентрация в плазме составляет 3-5 мкг/мл, и для его синте-
Глава 14. Гемофилия
375
за необходим витамин К. Ген ф1Х расположен на длинном плече
Х-хромосомы. Определена структура гена: содержит 8 экзонов и
7 нитронов, его длина составляет 34 тысяч нар нуклеотидов. Установлена аминокислотная последовательность фактора IX (415 аминокислот). Аминоконцевая часть фактора IX называется GIa-доменом — и содержит 12 остатков гамма-карбоксиглютаминовой
кислоты. Другая необычная аминокислота — бета-гидроксиаспарагиновая — находится в EGF-домене. Два других важных фрагмента в ф1Х — это домен активации и каталитический. В плазме
ф1Х находится в виде неактивного зимогена. Ферментная форма —
ф1Ха — возникает в результате расщепления двух пептидных связей и высвобождения пептида активации. Фактор IX может быть
активирован через внутренний путь под действием фактора Х1а
или внешним путем под действием фактора Vila в присутствии
тканевого фактора. Затем вместе с фактором Villa и фосфолипидом фактор IXa в присутствии ионов кальция образует ферментный комплекс — геназу. Данный комплекс превращает неактивную
форму фактора X в активную Ха. Внешний и внутренний пути
замыкаются на факторе X и далее протекают одинаковым образом
и обозначаются как общий путь свертывания крови. .
Наследование гемофилии. Гены, ответственные за синтез факторов VIII и IX, расположены на Х-хромосоме и, как отмечалось
выше, наследуются как рецессивный признак. По правилам наследования заболевания, сцепленного с Х-хромосомой, все дочери
больного гемофилией являются облигатными носительницами патологического гена, а все его сыновья — здоровыми. У носительниц в 25% случаев имеется риск рождения больного мальчика и в
25% — девочки-передатчицы (если принять всех возможно рожденных детей за 100%).
Для женщин — членов семьи, где есть гемофилии, жизненно
важно знать, являются ли они носителями заболевания. Вероятность носительства у конкретной женщины может быть определена с помощью анализа родословной, определения активности
фУШ/1Х и антигена фУШ/1Х. Последние показатели определяются для выявления значительного превышения количества над
активностью (Casper С, 2000).
В последнее время стала доступной методика идентификации
носителя с помощью изучения генов факторов VIII/IX. расположенных на Х-хромосоме (ДНК-анализ или анализ генома). Специфическая мутация, вызывающая гемофилию, теперь может быть
выявлена прямо в гене больного или носителя. Альтернативным
образом вызывающий гемофилию ген может быть обнаружен пу-
376
Часть 2. Клиническая гематология
тем распознавания местоположения нормальных маркеров в гене
или прилегающей хромосоме. Для определения носительства используют реакцию полиморфизма фрагментов ограниченной длины (RFLP).
Однако когда в семье впервые появляется гемофилия (спорадический случай), то возникает вопрос, где же произошла мутация.
Она может возникнуть на .тюбом этапе развития или передаться от
далекого предка, a RFLP в этом случае может дать неточный результат. Для таких анализов необходимо иметь ДНК от лица, заведомо имеющего дефектный ген, и ДНК от нескольких других членов семьи.
Пренатальная диагностика с помощью анализа ДНК проводится путем биопсии ворсинок хориона при сроке беременности 8 недель или пробы амниотической жидкости в более поздний срок.
Это наиболее актуально в случае, когда мутантный ген в этой семье
уже идентифицирован. Если анализ ДНК невозможен, то на 1820-й неделе беременности делают попытку аспирации крови плода. Проведение такой серьезной инвазивной процедуры рекомендуется только в тех случаях, когда женщина собирается на основании результата обследования принять решение о прерывании
беременности.
Эпидемиология. По данным ВОЗ, гемофилия А встречается в
одном случае на 10 тысяч мужского населения, гемофилия В 1 случай на 50 тысяч. В Швеции гемофилия А встречается с частотой 2 случая на 10 тысяч мужского населения, гемофилия В —
1,3 на 50 тысяч (Lethagen S., 2002). По данным РосНИИГиТ,
в Санкт-Петербурге гемофилия А регистрируется в 1,2 случаях
на 10 тысяч мужского населения, гемофилия В — 1,3 случая на
50 тысяч.
Диагностика гемофилии основывается на данных семейного
анамнеза, клинических проявлениях и результатах лабораторного
обследования. Нормальные показатели и изменения, характерные
для гемофилии А/В, приведены в табл. 9.
Тяжесть заболевания. По данным ВОЗ, при гемофилии А/В
имеются три степени тяжести заболевания — тяжелая, среднетяжелая и легкая, которые коррелируют с уровнем фактора VIII/IX
в плазме. Показатели фУШ/1Х при гемофилии различной тяжести приведены в табл. 10.
При легкой форме гемофилии самопроизвольных симптомов
кровоточивости нет. Тяжелые кровотечения возникают после серьезных травм или инвазивных процедур. При среднетяжелой форме гемофилии симптомы кровоточивости могут быть различной
377
Глава 14. Гемофилия
Таблица 9
Показатели коагулограммы а норме и при гемофилии А/В
Тесты
Время свертывания по:
Ли Уайту, мин
Нормальные
показатели
От 4 мин 55 с
до Нмин 55 с
5-12
Норма
180 360 х Ю>
Норма
Длительность кровотечения
по: Айви, мин
Число тромбоцитов
Показатели при
гемофилии Л/В
Удлинено
Активированное парциальное
тромбопластиновое время
(индекс)
0.8 1,1
Увеличен
Протромбиновый индекс. %
86 114
Норма
Фактор VIII, %
58-180
Снижен при гемофилии А.
норма при гемофилии В
Фактор IX. %
60 180
Снижен при гемофилии В.
норма при гемофилии А
Таблица 10
Показатели фактора VIII-IX
в зависимости от степени тяжести гемофилии, %
Тяжесть гемофилии А/В
Легкая форма гемофилии А
Уровень фактора
VIII
IX
5-25
58-180
1-4
<1
58-180
Легкая форма гемофилии В
58-180
5-25
Среднетяжелая форма гемофилии В
58-180
Тяжелая форма гемофилии В
58 180
1-4
<1
Среднетяжелая форма гемофилии А
Тяжелая форма гемофилии А
58- 180
степени интенсивности: при тяжелой степени болезни возникают
спонтанные кровотечения в различные ткани и органы.
В то же время у разных пациентов при одном и том же уровне
дефицитного фактора течение заболевания может отличаться. Поэтому при установлении степени тяжести, помимо уровня фактора, необходимо учитывать и ряд других моментов, таких как начало возникновения кровотечений у данного больного, количество
геморрагических проявлений в год, число госпитализаций и количество переливаний в год.
Клиническая картина. Наиболее характерными проявлениями
кровоточивости при гемофилии являются кровоизлияния в круп-
378
Часть 2. Клиническая гематология
ные суставы конечностей, глубокие подкожные, межмышечные и
внутримышечные гематомы, обильные и длительные кровотечения при травмах, кровотечения после инвазивных манипуляций.
Реже наблюдаются другие геморрагии, такие как забрюшинные
гематомы, кровоизлияния в органы брюшной полости, желудочно-кишечные кровотечения, гематурии и внутричерепные геморрагии.
Средний возраст, при котором диагностируется гемофилия, в тяжелых случаях составляет 9 месяцев, в умеренных — 22 месяца.
Легкие формы гемофилии диагностируются в более позднем возрасте, иногда только после удаления зубов или других инвазивных
манипуляций (Nilsson I. M., 1999).
При гемофилии отмечается отчетливая возрастная эволюция
симптомов заболевания. В наиболее тяжелых случаях при рождении у ребенка могут наблюдаться обширные кефалогематомы, кровотечения из пупочной ранки. Чаще всего первыми симптомами
заболевания являются кровотечения в связи с пункцией, инъекцией или хирургической операцией, а также из полости рта и кровоизлияния в мягкие ткани.
Наиболее значимыми в плане инвалидизации и нарушения качества жизни являются кровоизлияния в суставы. Впервые они
появляются, когда ребенок учится ходить. Чаще всего страдают
коленные, голеностопные и локтевые, реже — плечевые и тазобедренные суставы. Позвоночник и лучезапястные суставы поражаются редко, обычно в результате травм. Острые кровоизлияния в
суставы (гематрозы), как правило, возникают без видимой травмы:
сустав становится ригидным, распухшим, горячим, болезненным и
согнутым; движениям препятствуют тугоподвижность и боль.
Отдельные эпизоды кровоизлияний в суставы сравнительно безвредны, и как только кровь реабсорбируется, а отек спадает, восстанавливаются нормальная подвижность и функция суставов,
рентгенологических изменений практически не отмечается. После
неоднократных кровоизлияний суставная капсула становится утолщенной и меняет свой цвет под действием гемосидерина. Капсула
в дальнейшем все больше воспаляется. Более поздние стадии артропатии характеризуются выраженным фиброзом суставной капсулы и окружающей мягкой ткани с очень ограниченной подвижностью сустава. Хрящ сустава дегенерирует и разрушается после
повторных кровоизлияний под действием агрессивных активных
протеолитических ферментов и коллагеназ, его прочность уменьшается, поверхность поражается, а после перерождения он разрушается. Субхондральная кость становится остеопорозной, разре-
Глава 14. Гемофилия
3/9
женной из-за резорбции кости и склерозированной вследствие оссификации. В субхондральной кости могут образовываться кисты,
наполненные студенистым веществом. Клинически функция сустава нарушается, сгибание и разгибание конечности становятся
ограниченными, сустав деформируется, расширяется и принимает
неправильное положение при распрямлении конечности — происходит атрофия окружающей мускулатуры. В случаях тяжелой артропатии могут быть утрата подвижности, анкилоз. Хроническая
гемофилическая артропатия может быть болезненной, однако сравнительно часто суставы с выраженной хронической гемофилической артропатией бывают безболезненны. В случае отсутствия адекватной заместительной терапии больные становятся глубокими
инвалидами, вынуждены пользоваться костылями и часто прикованы к инвалидным коляскам.
Наиболее частыми причинами желудочно-кишечного кровотечения у больных гемофилией являются язвенная болезнь желудка,
двенадцатиперстной кишки, варикозно расширенные вены пищевода, геморроидальные узлы, возникновение которых может провоцировать прием нестероидных противовоспалительных препаратов. Однако встречаются и спонтанные желудочно-кишечные
кровотечения. При первом эпизоде кровотечения больного необходимо обследовать для выявления причины данной геморрагии.
Серьезную терапевтическую проблему при гемофилии создают
обильные и упорные почечные кровотечения, которые наблюдаются у 14-30% больных (Casper С, 2000). Они могут возникать как
спонтанно, так и в связи с травмами поясничной области, сопутствующим пиелонефритом, а также приемом аспирина, нестероидных противовоспалительных препаратов. Гематурия часто сопровождается дизурическими явлениями и приступами почечной колики, обусловленной образованием в мочевыводящих путях
сгустков крови, которые могут обтурировать тубулярные канальцы и даже мочеточник, что способно привести к временному гидронефрозу. Общепризнано, что гемофилические почечные кровотечения намного труднее поддаются терапии, чем геморрагии многих других локализаций. Для достижения адекватного гемостаза
больным с гематуриями рекомендуется вводить концентраты дефицитных факторов два раза в сутки, а также соблюдать постельный режим вплоть до остановки кровотечения (Casper С, 2000).
Лечение основано на проведении заместительной терапии с
целью введения дефицитных факторов. В настоящее время для
купирования геморрагических проявлений у данной категории пациентов используют следующие компоненты и препараты крови.
380
Часть 2. Клиническая гематология
I. Свежезамороженная плазма (СЗП) содержит все факторы
свертывания крови, в том числе фактор VIII и фактор Виллебранда. Содержание факторов свертывания крови, кроме ф\^Ш, составляет 0,6-1 ME на 1 мл плазмы, ф\ т Ш — 0,25-0,5 ME на 1 мл.
Последний фактор является лабильным и быстро разрушается.
Возможно применение СЗП при лечении гемофилии А и В, но с
незначительным клиническим эффектом. При переливании необходимо учитывать групповую принадлежность. Хранится при температуре -40 °Q в течение 3 месяцев. Перед применением необходимо размораживать при температуре 37 °С.
П. Криопреципитат. В 1959 году Pool и Robinson показали,
что фактор VIII можно криопреципитировать, осаждая его из свежезамороженной плазмы при центрифугировании на холоду. Препарат выпускается в замороженном и сухом виде, содержит факторы VIII, Виллебранда и XIII, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулин А и G. Содержание фактора VIII в криопреципитате не
стандартизовано, но согласно ГОСТ РФ в одной дозе должно содержаться не менее 100 ME антигемофильного глобулина, что является спорным, и даже в материалах Всемирной федерации гемофилии указано, что его содержание в криопреципитате не стандартизовано и зависит от многих составляющих. Применяется для
лечения больных с гемофилией А. Использовать криопреципитат
у больных гемофилией В не рекомендуется, так как в нем нет фактора IX и он не будет оказывать клинического эффекта.
Хранится замороженный криопреципитат при температуре -40 °С
в течение 3 месяцев, перед применением необходимо размораживать при температуре 37 °С. Сухой криопреципитат хранится при
температуре 4-8 °С в течение года, перед применением растворяют физиологическим раствором, тем количеством, которое указано на флаконе. Ниже приводим формулы расчета доз криопреципитата.
1. Из приказа №713 МЗ РСФСР от 7 июля 1980 г.:
X = YxZ/100,
где X — необходимое количество флаконов криопреципитата; Y —
масса больного в кг; Z — необходимое содержание фЛ/Ш в крови
больного; 100 — минимальное содержание ф\'П1 в единице активности в одной дозе криопреципитата.
2. Формула Рутберг и Андреева (1972 г.):
Y = масса больного в кг х Х/1,3,
где Y — доза криопреципитата в ед.; X — заданный уровень фактора VIII (%); 1,3 — каждая единица введенного фактора VIII повышает его концентрацию в плазме на 1,3 + 0,6%.
Глава 14. Гемофилия
381
Вышеперечисленные препараты имеют ряд существенных недостатков: во-первых, низкую активность факторов свертывания
крови VTII и IX, кроме того, препараты не стандартизованы и не
подвергаются надежному процессу вирусной инактивации, поэтому передают большое число вирусных агентов.
III. Концентраты фактора VIII появились в конце 60-х гг.,
для их приготовления используют пул плазмы, состоящий из порций, заготовленных от большого количества доноров (у некоторых
коммерческих производителей максимум составляет 60 тысяч).
Фактор может быть отделен методом первоначальной криопреципитации, а затем очищен с помощью осаждающих агентов или хроматографии. Для выражения чистоты концентратов фактора VIII
применяется термин специфическая активность — число международных единиц фактора VIII прокозгулянта на мг белка. Все
концентраты можно классифицировать по специфической активности на следующие группы.
1. Концентраты промежуточной степени очистки — содержание фактора 1-5 ME на 1 мг общего белка Агемофил А
(ГНЦРАМН).
2. Концентраты высокой степени очистки — содержание фактора 50-250 ME на 1 мг общего белка; к ним относятся Иммунат
(Бакстер, США), Октанат (Октафарма, Швейцария), Коэйт ДВИ
(Байер, США).
3. Концентраты сверхвысокой чистоты — получены в основном
посредством иммуносорбционной хроматографии и содержат более 2000 ME фактора на 1 мг общего белка; к ним относятся Рекомбинат (Бакстер, США), Когенат (Байер, США)
А. Концентраты фактора VIIIс высоким содержанием фактора
Виллебранда. В настоящее время выпускаюся два коммерческих
препарата с высоким содержанием фактора Виллебранда: Наетаte-P/Humate-P — лиофилизированный, вирусинактивирован пастеризацией (Авентис-Беринг, Германия), и А1. phanate — высокоочищенный, двойная вирусинактивация (Альфа, США).
5. Свиной концентрат фактора VIII. Высокоочищенный и осажденный полиэтиленгликолем свиной фактор VIII (Хиате-С); используется в лечении пациентов с ингибитором к человеческому
фактору.
6. Неплазматические препараты (рекомбинантные). Факторы
свертывания могут также продуцироваться культурой клеток, что
позволяет избежать вирусной контаминации. В клетки яичника
хомяка с помощью генной технологии внедряют геном, синтезирующий фактор свертывания. Полученные посредством генной ин-
http://www.bestmedbook.com/
382
Часть 2. Клиническая гематология
женерии препараты имеют специфическую активность более
1000 ME на 1 мг общего белка.
В Гематологическом научном центре Российской академии медицинских наук разработан отечественный концентрат фактора
VIII — Агемофил А — промежуточной степени очистки, вирусинактивирован тепловым способом.
Необходимо подчеркнуть, что период полураспада для фактора
VIII варьирует от 8 до 20 часов и не изменяется от чистоты и
вирусной инактивации препаратов. Известно, что период полураспада введенного фактора у детей короче, чем у взрослых, также он
укорачивается при проведении оперативных вмешательств и массивных травмах.
Важно подчеркнуть, что степень чистоты не может быть выражена в виде специфической активности ни в случае рекомбинантных препаратов, ни в случае концентратов, очищенных моноклональными антителами, потому что они стабилизируются альбумином. Самый лучший способ оценить чистоту препарата — это
измерить содержание в нем белковых примесей. При этом рекомбинантный фактор не содержит ни фибриногена, ни фибронектина, хотя в нем присутствуют микроколичества IgA и IgG. Очищенные моноклональными антителами концентраты фактора VIII содержат лишь микроколичества этих белков. В остальных препаратах
присутствуют значительные количества фибриногена, фибронектина. IgA и IgG.
IV. Препараты фактора IX получают из плазмы человека.
Существуют следующие препараты, содержащие фактор IX: протромбинового комплекса (ППК), собственно концентрат фактора
IX и антиингибиторный протромбиновый комплекс (АИПК) или
активированные препараты протромбинового комплекса (АППК).
1. ППК содержат факторы II, IX и X, а также различное (иногда
незначительное) количество фактора VII, вирусинактивированы
либо тепловым, либо химическим (сольвент-детергент) методами.
ППК стабильны при комнатной температуре. Главным недостатком препаратов является их тромбогенность. Возможно возникновение тромбоза глубоких вен, легочной эмболии и ДВС-синдрома
после применения ППК при проведении хирургических операций,
массивных травмах, у больных с серьезными дисфункциями печени, а также у новорожденных, у которых также имеется недостаточность функции печени. Один или несколько активированных
факторов могут избирательно запускать процесс коагуляции.
В 1974 году Международный комитет тромбоза и гемостаза рекомендовал добавлять 5-10 ед. гепарина к каждому миллилитру ППК,
Глава 14. Гемофилия
383
во избежание риска тромбообра:ювания, а в 1991 году эти рекомендации были вновь подтверждены. Показаниями к их применению
являются гемофилия В, ингибиторная форма гемофилии А, дефицит фактора II, VII и X. Прн "ингибиторной форме гемофилии А
ППК используются без гепарина и запускается процесс свертывания крови но внешнему пути, но каким образом это происходит,
остается предметом дискуссии.
2. Концентраты фактора IX — препараты высокой степени очистки, получены из плазмы человека и не содержат протромбин и
факторы X, VII, а также они не вызывают тромбозов. Вирусинактивированы либо тепловыми процедурами, либо химическим
(сольвент-детерген) методом. В настоящее время рекомендованы
две ступени вирусинактивации - тепловая и ультрафильтрация.
Показания к применению - гемофилия В.
3. Рекомбинантный концентрат фактора IX стабилизирован
сахарами. Показания к применению - гемофилия В.
4. Активированные препараты протромбинового комплекса
(АППК). На сегодняшний день на рынке присутствуют два препарата: Фейба (Бакстер-Иммунно, США) и Аутоплекс (НАВИ,
США). Оба препарата содержат факторы II, VII, IX и X, не обладают тромбогенностью. Вирусинактивированы тепловыми процедурами. Показаниями к применению является ингибиторная форма
гемофилии А. При этом каждый препарат имеет уникальную систему запуска системы гемостаза по внешнему пути, но существенной разницы в клиническом эффекте не выявлено.
В ГНЦ РАМН разработан, прошел клинические испытания и
зарегистрирован отечественный концентрат фактора IX — Агемофил В. Препарат содержит все факторы протромбинового комплекса, вирусинактивирован тепловым методом. Показаниями к применению являются гемофилия В и ингибиторная форма гемофилии А.
Фирма Ново-Нордиск (Дания) выпускает рекомбинантный препарат Ново Сэвен® (Vila). Фактор Vila действует только в месте
поражения, поскольку активирует фактор X в Ха, только образовав комплекс с тканевым фактором. Препарат практически не обладает тромбогенным эффектом. Показаниями к применению являются ингибиторные формы гемофилии А и В. Клинический эффект после применения Ново Сэвен® наступает в короткие сроки
от момента введения.
Для успешного осуществления всех видов терапии больных гемофилией необходимо иметь достаточное количество концентратов факторов свертывания.
384
Часть 2. Клиническая гематология
Теоретический расчет потребности больных гемофилией в концентратах факторов свертывания крови, которые являются единственным и адекватным средством при лечении гемофилии, производится на основании методических рекомендаций МЗ РФ и по
общепринятым формулам, согласованных с Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Ниже приводим данные формулы
расчета.
В методических рекомендациях МЗ РФ «Сбалансированное
планирование различных видов донорства в учреждениях службы
крови» (Л., 1990) дана формула расчета потребности в зависимости от количества населения страны, региона, города, административного района и составляет 8,5 тысяч доз криопреципитата на
1 млн жителей.
Минимальное количество необходимого для лечения концентратов ф\ТН/1Х, выраженное в международных единицах (ME), но
данным ВОЗ, составляет 12,5-20 тысяч ME на каждого больного в
год. Так как данная цифра соответствует лишь минимально возможной потребности, для более точного подсчета существует норматив среднего количества препарата, который соответствует 3060 тысячам ME из расчета на одного больного в год.
При осуществлении лечения «по требованию» — by demand —
это количество достигает 60-120 тысяч ME на одного больного
в год.
При осуществлении все более распространяющегося в мире профилактического лечения гемофилии потребность в антигемофильных препаратах увеличивается в 12 раз по отношению к нормативу
средней потребности и может составить 210-270 тысяч ME на
одного больного в год.
Следующая методика подсчета потребности заключается в применении норматива, ориентированного на общее население страны, региона, города, административного района. Средний показатель составляет 2 ME фактора VIII на каждого жителя в год.
Например, в Португалии обеспеченность на одного жителя концентратами фактора колеблется от 1,5 ME антигемофильного глобулина (АГГ), а в Швеции — до 3,8 ME АГГ.
Профилактическое лечение назначают больным с тяжелой формой гемофилии А/В вне зависимости от наличия геморрагических
проявлений но схеме (I. M. Nilsson):
1) при гемофилии А — но 25-40 ME фактора VIII на кг массы
3 раза в неделю;
2) при гемофилии В — по 25-40 ME на кг массы фактора IX
3 раза в неделю.
Глава 14. Гемофилия
385
Терапию по требованию назначают больным сразу же после
момента травмы или при первых симптомах геморрагического проявления. Применяют минимальную дозу 25 ME фактора VIII/IX
на кг массы тела однократно.
Купирование острых геморрагических проявлений. Необходимо подчеркнуть, что выбор дозы, а также кратность введения
препаратов зависят от вида гемофилии, массивности кровотечения или хирургического вмешательства, минимально необходимого гемостатического уровня и периода полураспада дефицитных
факторов. В табл. 11 представлены принципы остановки кровотечений у больных гемофилией.
Таблица 11
Принципы купирования кровотечений
у больных гемофилией А и В
Вид коагулопати и/кровотечения
Компоненты и пре- Период полу- Доза и частопараты крови
распада, ч
та инфузий
Необходимый
гемостатический уровень, %
Гемофилия А
Концентраты фУШ
(преципитат)
8-12
15-30 ME
через 8-12 ч
15-30
Массивные
кровотечения
Тоже
6-8
50 ME через
6-8 ч
100-80-60
Операции
То же
4-6
50 ME через
4-6-8ч
100-80
Умеренные/
спонтанные
Концентраты ф1Х,
ППК (комплекс
ф/И. VII, ГХ, X),
АППК, СЗП
15-30
15-30 ME
через 24 ч
15-30
Массивные
кровотечения
Концентраты ф!Х,
ППК, АППК, СЗП
12-15-30
20-40 ME
через 12 ч
100-80-60
То же
12-15-30
80 ME через
6-8-12ч
100-80
Умеренные/
спонтанные
Гемофилия В
Операции
При лечении больных гемофилией, кроме специфических препаратов, используют следующие медикаментозные средства: десмопрессин (ДДАВП), антифибринолитические препараты, противовоспалительные и анальгетики.
Десмопрессин применяется внутривенно, подкожно или интраназально, он показан для купирования геморрагических проявлений и удаления зубов у больных с легкой формой гемофилии А.
Стандартная доза ДД ВАП при внутривенном введении составляет
13 Гематология. Нов. справочник
386
Часть 2. Клиническая гематология
0,3 мкг/кг, препарат разводят в 50 мл физиологического раствора и
вводят в течение 30 минут. Стандартная доза при подкожном введении составляет 0,3 мкг/кг массы тела, но препарат не разводят в
физиологическом растворе. Максимальный эффект после внутривенного введения препарата наступает через 45-60 минут, уровень
фУШ увеличивается в 2-3 раза. Введение препарата в данной дозировке можно повторять через 12-24 часа, но после 3-4 инъекций
наступает быстрое снижение лечебного эффекта, так как происходит истощение депо факторов в эндотелиальных клетках. Повторные курсы введения можно возобновить через 7-10 дней. Следует
учитывать, что у пациентов, которым проводились повторные курсы ДДАВП, его надо вводить через более короткие интервалы,
хотя это может привести к симптоматической гипонатриемии.
В Российской Федерации зарегистрирован препарат ДДАВП
для подкожного введения итальянской фирмы «Кедрион» - Эмосинт, который выпускают в ампулах по 1,0 мл (20 мкг ДДАВП
в ампуле).
Для купирования легких кровотечений применяют производные аминокапроновой и транексамовой кислот — антифибринолитики.
Аминокапроновую кислоту выпускают во флаконах в виде 5%
раствора по 100 мл. Назначают перорально из расчета 0,1 г/кг
массы тела через 4 часа. Применяют для купирования легких носовых, десневых кровотечений. Противопоказан при гематуриях (может вызвать закрытие сгустками тубулярных канальцев почек) и в
сочетании с препаратами протромбинового комплекса из-за увеличения риска развития тромбоза.
Производные транексамовой кислоты выпускают в виде таблеток (0,25 и 0,5 мг/л), сиропа (50 мг/мл) и раствора для инъекций
(250 мг/5 мл, 250 мг/2,5 мл, 500 мг/10 мл и 1000 мг/10 мл). Показания к применению: носовые и десневые кровотечения, удаление
зубов. Дозировка: перорально — 20-25 мг/кг массы тела 3-4 раза в
день, внутривенно — 10 мг/кг 3-4 раза в день.
Кортикостероды (преднизолон) применяют с целью уменьшения воспалительного процесса перорально и внутривенно как противоаллергическое средство. Преднизолон выпускают в таблетках
по 0,005 г (упаковка — 20 или 100 шт.) и в ампулах по 1 мл (30 мг) и
используют перорально по 15-20 мг/кг массы в течение недели,
внутривенно — 30-60 мг одномоментно.
Нестероидные противовоспалительные (ибупрофен, индометацин) средства применяют осторожно, так как они могут провоцировать кровотечение и удлиняют время кровотечения.
Глава 14. Гемофилия
387
Проблема снятия болевого синдрома у больных гемофилией
стоит остро, поэтому применяют различные анальгетики. Наркотические средства используют крайне редко во избежание развития наркомании и только для снятия сильного болевого синдрома.
Аспирин и аспиринсодержащие препараты противопоказаны,
так как они необратимо ингибируют циклооксигеназу тромбоцитов и могут спровоцировать кровотечение.
При хроническом болевом синдроме обычно используют панадол и трамал. Одна таблетка панадола содержит 500 мг парацетамола и 65 мг кофеина, назначают пероралыга по 2 таблетки на
прием, повторный прием не ранее чем через 4 часа (но не более
8 таблеток в течение 24 часов). Трамал выпускают в ампулах по
1 мл (50 мг трамадола гидрохлорида) — в 1 упаковке по 5 штук, в
капсулах по 50 мг — в 1 упаковке 20 штук. Назначают пероралыю
по 1-2 таблетки на прием (не более 4 табл'еток в сутки). Обычно
применяют не более 1-2 суток. Внутривенно — 50-100 мг одномоментно. Следует учитывать, что при длительном применении трамала к нему возможно привыкание.
Осложнения после заместительной терапии. Применение компонентов и препаратов крови приводит к возникновению большого числа осложнений, самыми значительными из которых являются перенос гемотрансмиссивных агентов и развитие ингибиторов к
дефицитным факторам.
Больные гемофилией, получающие продукты крови, приготовленные из больших донорских пулов, подвержены риску передачи
целого ряда инфекционных заболеваний, главным образом гепатиты В и С (Lethagen S., 2002). Описаны также случаи гепатита А
среди больных гемофилией (Mannucci P. M., 1992). Высока вероятность заражения пациентов вирусом СПИДа. Не исключена возможность передачи через препараты крови прионов (Hunter N..
J
2002). В настоящее время все доноры проходят обязательное o6
следование на эти инфекции. Для препаратов крови предусматриваются две ступени вирусинактивации: для концентратов фУШ —
химическая и тепловая, ф1Х — тепловая и нанофильтрация.
Еще одним осложнением при гемофилии является развитие антител (ингибиторов), направленных против факторов VIII/IX.
Образование ингибиторов доказано у 8-30% больных с тяжелой
формой гемофилии А и у 2,5-16% с тяжелой формой гемофилии В
(Oldenburg J., 2003). Антитела (аллоантитсла) относятся к иммуноглобулинам igG, большей частью к IgG4 и IgGl подкласса с
тяжелыми цепями и класса с легкими цепями. Титр ингибитора
измеряется в Бетезда единицах (BU). 1 BU равна количеству инги-
388
Часть 2. Клиническая гематология
битора, которое инактивирует 50% добавленного фактора VIII после 2 часов инкубации при температуре 37 °С. Титр антител может
заметно варьировать от случая к случаю и даже в небольшой промежуток времени у одного и того же больного. Через 8-10 дней
после введения любого препарата плазмы или концентрата наблюдается значительное повышение титра антител, однако через 4-8
месяцев он возвращается к исходному уровню. Те пациенты, у которых происходит выраженное повышение титра антител, считаются «высокореагирующими», те, у кого оно незначительно, — «низкореагирующими».
Большинство пациентов с ингибиторами — «высокореагирующие», имеют титр более 10 BU. Как правило, ингибиторы появляются в раннем возрасте и обычно уже после нескольких инфузий
ф\ТП/1Х. Более часто ингибиторы возникают при тяжелых формах гемофилии. Серьезные дефекты гена (инверсии, стоп-мутаций
и разрежения), вызывая полное отсутствие белка фУШ, являются
мутациями высокого риска и в образовании ингибитора. Другие
генетические дефекты (мелкие разрежения, отсутствие или сращивание генов) приводят к снижению функции фактора и имеют
меньший риск развития ингибитора. Гены иммунного ответа, например, класса МНС (Основной Комплекс Тканевой Совместимости) являются другим параметром, влияющим на риск развития
ингибитора. Отмечен высокий риск развития ингибитора у афроамериканцев. Так как мутация самого гена, обусловливающего гемофилию А, одинакова у всех наций, этническую разницу в риске
развития можно связать с генетической вариацией в генах иммунного ответа, то есть МНС.
Пациенты с высоким титром антител до сих пор лишены возможности получать полноцепное лечение, так как нет способов
нормализовать этот дефект. Важно проводить тест на выявление
ингибитора один-два раза в год, а также перед любым видом хирургического вмешательства и удалением зубов. Лечение больных
гемофилией с наличием ингибиторов имеет двойную цель: 1) остановить тяжелые случаи острых кровотечений или подготовить больного к необходимой операции; 2) вызвать иммунную толерантность или, по меньшей мере, перевести больного из состояния высокого ответа в состояние низкого путем выведения антител.
Рекомендации по диспансеризации больных. Все больные гемофилией должны находиться на учете у гематолога. Больные с
легкой формой заболевания подлежат обследованию не менее одного раза в год. Следует давать рекомендации по вакцинации против гепатита А и В. Заместительную терапию проводить высоко-
Глава 14. Гемофилия
389
активными, дважды вирусинактивироваиными концентратами
cpVIII/IX. При острых кровотечениях лечение начинать как можно раньше (благоприятный период не позднее 3 часов от момента
травмы). Заместительную терапию следует проводить в адекватных количествах до полной остановки кровотечения. Пациентам
противопоказан прием аспирина, производных ацетилсалициловой кислоты и нестероидных противовоспалительных препаратов.
Противопоказаны контактные виды спорта, такие как хоккей, футбол, баскетбол и бокс; показано плавание в бассейне.
Поскольку гемофилия является врожденным геморрагическим
заболеванием, для которого характерны особые проблемы в плане
диагноза, дорогостоящего лечения и побочных эффектов заместительной терапии, а также психосоциальные проблемы, то оказание
медицинской помощи при этом заболевании требует особых мер.
Лечение гемофилии должно быть сосредоточено в специализированных центрах. В настоящее время в Российской Федерации их
всего четыре — Москва, Санкт-Петербург, Вятка и Барнаул. Необходимо отказаться при лечении больных гемофилией от криопреципитата и свежезамороженной плазмы, как от вируснеинактивированных препаратов. Национальная служба крови должна полностью обеспечивать эту тяжелую группу больных современными
безопасными гемостатическими препаратами — дефицитными факторами.
Литература
Casper С. Key issues in hemophilia treatment: products and care Trombosis and
Hemostasis. 2000. Vol. 87. P. 34-41.
GgitschierJ., Wood W. I., Goralka Т. М. et al. Characterization of human factor VIII
gene // Nature. 1984. Vol. 63. P. 312-326.
Hellman I., SvtdsrodB., SandbergH. et al. Secretion of coagulant factor VIII activity
and antigen by in vitro cultivated rat liver sinusoidal, endothelial. Cells // Br. J.
Haematol. 1989. Vol. 73. P. 348-355.
Hunter N., Foster]., Chong A. et al. Transmission of prion by blood transfusion //
J. General. Virol. 2002. Vol. 83. P. 2897-2905.
Lethagen S. Hemostasis and bleeding disorders. Sweden, 2002.82 p.
Mannucci P. M., SchimpfK., Abe T. et al. Low risk of viral, infection after administration
of vapor-heated factor VIII concentrate // Transfusion. 1992. Vol. 32. P. 134-138.
Oldenburg]. Environmental and genetic factors influencing inhibitor development.
7th Novo Nordisk Symposium on Hemostasis Management // 2003. Abstracts. P. 45.
Pittman D., Millenson M.. Marquette K. et al. A2 domain of human recombinantderived F VIII is required for procoagulant activity but not for trombin cleavage //
Blood. 1992. Vol. 79. P. 389-397.
Глава 15
БОЛЕЗНЬ ВИЛЛЕБРАНДА*
Болезнь Виллебранда — наследственное заболевание, передающееся аутосомно-доминантным или аутосомно-рецессивным путем, обусловленное различными количественными и качественными дефектами синтеза фактора Виллебранда и характеризующееся
симптомами повышенной кровоточивости.
В 1926 г. в Хельсинки профессор Эрик фон Виллебранд (von
Е. A. Willebrand, 1926) опубликовал свою первую работу о наследственной форме повышенной кровоточивости, которую он наблюдал у нескольких членов семьи на одном из островов Аландского
архипелага. Симптомы повышенной кровоточивости были выявлены у пятилетней девочки и ее родственников. Из геморрагических проявлений у них преобладали носовые, десневые, луночные
кровотечения, меноррагии, повышенная кровоточивость из мелких ранок. Кровоизлияния в суставы наблюдались сравнительно
редко. В 1981 г. D. Nyman и сотрудники провели повторное обследование этой семьи и сделали заключение, что родственники с
умеренными проявлениями кровоточивости страдали заболеванием, которое мы в настоящее время называем болезнью Виллебранда, тип 1 — больные с тяжелыми кровотечениями были гомозиготами и имели тип 3 болезни Виллебранда.
Распространенность. Болезнь Виллебранда — наиболее широко распространенное заболевание среди геморрагических диатезов. Большинство исследований в различных популяциях определяют распространенность заболевания как 1-2%, т. е. 100 человек
на 1 млн населения (Werner E. J. et al, 1993; Lethagen S., 2002).
Распространенность типа 1 болезни Виллебранда составляет 6080%, типа 2 - 7-30%, типа 3 - 5-20% (Lethagen S., 2002).
* Глава подготовлена при участии О. Э. Залепухиной.
Глава 15. Болезнь Виллебранда
391
Распространенность типа 3 на 1 млн населения в Италии — 0,55
(Mannucci P. M. et al. 1984), в Северной Америке — 1,38 (Weiss H. J.
et al., 1982), в Швеции - 3,12 (Mannucci P. M., 1984) и в Израиле 3,2 (Berliner S. A. et al., 1986). Значительно более высокая распространенность типа 3 болезни Виллебранда отмечается в странах с большим количеством родственных браков. По Санкт-Петербургу распространенность типа 3 составляет 0.85 (по данным РосНИИГиТ).
Патогенез. За последние 75 лет патофизиология болезни Виллебранда была сравнительно хорошо изучена. В настоящее время
известно, что заболевание обусловлено различными количественными и качественными дефектами синтеза фактора Виллебранда
(фВ), который выполняет в системе гемостаза две основные функции: инициирует адгезию тромбоцитов к поврежденной стенке сосуда и стабилизирует циркулирующий фактор свертывания VIII
за счет комплексообразования с ним.
Фактор Виллебранда — биосинтез и структура. Установлено,
что ген, контролирующий синтез фВ, расположен на коротком плече
12-й хромосомы ( Kuwano A. et al., 1996). Соответствующая информационная РНК состоит из 85-90 тысяч нуклеотидов и кодирует полипептидную цепь из 2813 аминокислотных остатков, которая представляет собой белок-предшественник фВ, пре-про-фВ,
подвергающийся в эндоплазматическом ретикулуме первоначальной гликолизации и димеризации. Затем отщепляется сигнальный
пептид из 22 аминокислотных остатков, с образованием про-фВ.
Последующие гликолизация, сульфатация и мультимеризация фВ
происходят в аппарате Гольджи. Прополипептид, состоящий из
741-го аминокислотного остатка, также известный как антиген II
фВ, отщепляется от аминокониа полипептидной цепи, способствуя
мультимеризации, с образованием зрелой молекулы, которая содержит 2050 аминокислотных остатка.
Фактор Виллебранда синтезируется в клетках сосудистого эндотелия и в мегакариоиитах (Mayadas Т. N. et al., 1991). Белок,
синтезируемый эндотелиальными клетками, хранится в так называемых тельцах Weible-Palade (Visher U. M. et al., 1994) и высвобождается в плазму и субэндотелий. Из эндотелия происходит 7585% всего циркулирующего фВ, из мегакариоцитов — 15-25% и
хранится в ос-гранулах циркулирующих тромбоцитов.
Роль фактора Виллебранда в гемостазе. Фактор Виллебранда в
нормальном гемостазе выполняет две основные функции: является кофактором адгезии тромбоцитов к поврежденной стенке сосуда и их агрегации и служит белком-носителем для прокоагулянта — фУШ. Особенно важна роль фВ для адгезии и агрегации
392
Часть 2. Клиническая гематология
тромбоцитов при повреждении мелких артерий и артериол. В результате связывания фВ с рецептором тромбоцитов гликопротеином Ib (GPIb) происходят их активация и агрегация. В реакциях
сосудисто-тромбоцитарного взаимодействия участвует фВ, находящийся в плазме, а также высвобождающийся из эндотелия и секретируемый тромбоцитами (Папаян Л. П., Петрищев Н. Н.. 1999).
Тромбоцитарный рецептор GPIIb/IIIa, который открывается после
активации тромбоцитов, играет важную роль в последующих тромбоцитарных реакциях. GPIIb/IIIa имеет сайт для связывания с тетрапептидом адгезивных протеинов: фибриногена, фибронектина, фВ
(Savage В. et al., 1996). Локальное высвобождение фВ из эндотелиальных клеток и тромбоцитов может создавать высокую концентрацию протеина, состоящего главным образом из больших мультимеров, которые имеют наибольшее сродство к GPIIb/IIIa. Тромбоцитарный фВ, высвобождающийся из активированных кровяных
пластинок, играет большое значение в их агрегации.
Фактор Виллебранда является белком-носителем фУШ в плазме и защищает этот очень лабильный протеин от расщепления. Он
не только стабилизирует фУШ в циркуляции, но, по-видимому,
способствует увеличению его секреции (Kaufman R. J. et al., 1988).
Вероятно, этим можно объяснить вторичное повышение фУШ после инфузий концентратов фВ больным с тяжелой формой болезни
Виллебранда тип 3.
Классификация. В зависимости от характера нарушений фактора Виллебранда выделяют три основных типа заболевания.
Тип 1 — частичный количественный дефицит фактора Виллебранда.
Тип 2 — качественные изменения структуры и функции фактора Виллебранда (существует около 20 подтипов, важнейшие из
них - 2А, 2В, 2М и 2N).
Тип 3 — полное отсутствие фактора Виллебранда.
Каждой из этих категорий соответствуют определенные патофизиологические механизмы, которые в значительной степени коррелируют с клиническими особенностями и терапевтическими
требованиями (Sadler J. E., 1994).
Тип 1 болезни Виллебранда характеризуется частичным количественным дефицитом фВ, снижением его плазменного уровня
менее чем на 50%, нормальной структурой и функцией протеина.
Это наиболее часто-встречающаяся форма заболевания, составляет 75-80% случаев (Lethagen S., 2002), имеет аутосомно-доминантный тип наследования. В рамках типа 1 выделяют 3 подтипа болезни в зависимости от количества и функциональной активности
Глава 15. Болезнь Виллебранда
393
тромбоцитарного фВ. Тип 1 — «platelet normal» — нормальное содержание и функциональная активность тромбоцитарного фВ. Тип
1 - «platelet low» - снижено содержание фВ в тромбоцитах, их
функциональная активность не нарушена. Тин 1 - «platelet
discordant» — нормальный уровень тромбоцитарного фВ, но его
функциональная активность снижена (Federici А. В., 1998).
Представляет определенные трудности диагностика заболевания у пациентов с легким течением болезни Виллебранда тин 1 и
дифференциальная диагностика между больными данным типом
и здоровыми лицами с низким уровнем фВ, так как пределы нормальных колебаний фактора довольно широки. Диагноз заболевания при типе 1 облегчается наличием выраженных симптомов кровоточивости, низким содержанием качественно не измененного фВ
и доказанным наследственным характером заболевания.
Тип 2 болезни Виллебранда встречается значительно реже, на
его долю приходится от 7 до 25% случаев (Lethagen S., 2002). В пределах данного типа выделяют несколько подтипов (2А, 2В, 2М и
•2N), которые характеризуются определенными нарушениями.
Тип 2А болезни Виллебранда характеризуется отсутствием гемостатически активных больших мультимеров фВ в плазме и в
тромбоцитах, вследствие чего нарушается процесс адгезии тромбоцитов при повреждении мелких артерий и артериол, кофактором которой является фВ (Ruggeri Z. M. et al, 1980). Возможны
доминантный и рецессивный типы наследования этой формы заболевания. Доминантный вариант наследования типа 2А — наиболее часто встречающаяся форма (Holmberg L. et al., 1992). Известны, по меньшей мере, 24 мутации и 1 делеция, определяющие тип
2А. Существуют два механизма мутаций фВ, вызывающих тип 2А
болезни Виллебранда. Один класс мутаций обусловлен нарушением внутриклеточного транспорта, сборки, хранения и секреции
больших мультимеров в плазме и тромбоцитах. Вторая группа не
нарушает сборку или секрецию больших мультимеров, но значительно повышает их чувствительность к протеолизу в плазме. Обе
группы мутаций, вызывающих тип 2А Виллебранда, приводят к
отсутствию больших мультимеров фВ.
Тип 2В обусловлен мутациями в домене А1 фВ, который содержит сайт связывания фВ с гликопротеином Ib тромбоцитов. Характеризуется повышенной аффинностью мутантных форм фВ к
тромбоцитарному рецептору GPIb. Очевидно, это является причиной связывания больших мультимеров фВ с тромбоцитами in vivo,
что ведет к снижению количества и тех, и других. Высокомолекулярных мультимеров в плазме обычно нет, их можно обнаружить
394
Часть 2. Клиническая гематология
лишь в тромбоцитах и эндотелиальных клетках. Оставшиеся в плазме мультимеры не обладают полноценным гемостатическим эффектом, поэтому пациенты страдают повышенной кровоточивостью. Данный тин наследуется как доминантный признак. При нем
может наблюдаться транзиторная тромб.оцитопения, усиливающаяся при оперативных вмешательствах, беременности и лечении
деаргенин-девазопрессшгом ( ДД АВП).
Тип 2М обусловлен мутацией, которая локализуется внутри домена А1 и нарушает связь фВ с тромбоцитарным гликопротеином
Ib. Мультимерная структура протеина не нарушена.
Тип 2Nсвое название получил от провинции Нормандия (Франция), где был выявлен один из случаев заболевания (Mazurier С. et
al, 1990). Данный вариант характеризуется нормальными уровнем и
мультимерной структурой фактора Виллебранда, но низкой активностью ф\'Ш в нлазме, ниже 25%. Заболевание часто протекает под
видом легкой формы гемофилии А, но наследуется как аутосомнодоминантный признак и, в отличие от гемофилии, им страдают лица
обоего пола. Низкий уровень ф\'Ш вызван укорочением его периода
полураспада в плазме, так как нарушена связь фУШ с фВ. Распространенность типа 2N точно неизвестна, так как некоторые случаи
заболевания диагностируются как легкая форма гемофилии А.
Тип 3 болезни Виллебранда обусловлен нарушением биосинтеза фВ и характеризуется практически полным его отсутствием в
плазме и тромбоцитах. Он наследуется по аутосомно-рецессивному пути и проявляется только у гомозигот с одинаковыми мутантными аллелями или двойных (смешанных) гетерозигот с двумя
различными мутантными аллелями. Среди всех случаев болезни
Виллебранда на долю типа 3 приходится 5-20% (Lethagen S., 2002).
Больные имеют одинаковые (гомозиготы) или различные.(гетерозиготы) повреждения обоих аллелей. Уровень фУШ обычно ниже
10%, редко ниже 1%, при этом возможны спонтанные гемартрозы и
кровоизлияния в мягкие ткани. Родственники больных, являющиеся гетерозиготами, могут иметь нормальный или умеренно сниженный уровень фВ. В большинстве случаев у гетерозигот нет
клинической симптоматики, но у отдельных лиц возможны незначительные проявления кровоточивости. Патофизиология типа 3
принципиально не отличается от патофизиологии типа 1, так как
оба они относятся к формам с количественным дефицитом фВ.
Однако тип 3 выделен в отдельную категорию, так как симптомы
заболевания очень тяжелы, и применяемая больным терапия существенно отличается от таковой при типе 1. У 7,5-9,5% больных
типом 3 могут появляться аллоантитела к фВ.
Глава 15. Болезнь Виллебранда
395
Клиническая картина. Носовые кровотечения, меноррагии, кровотечения из слизистых полости рта, легкое образование синяков,
кровотечения после удаления зубов и послеоперационные считаются самыми частыми симптомами болезни Виллебранда. Желудочно-кишечные кровотечения встречаются относительно редко и
могут быть связаны с ангиодисплазией. Более половины пациентов в слаборазвитых странах имеют гемартрозы и гематомы, подобно больным гемофилией (Sadler J. E. et al., 2000). Проявления
кровоточивости обычно варьируют от легкой до средней степени
тяжести, но иногда бывают опасными для жизни, особенно у больных с типом 3 и у некоторых с типом 2 болезни Виллебранда.
Симптомы и тяжесть течения могут быть различными у разных
членов одной и той же семьи и меняются в разное время у одних и
тех же людей. Следует подчеркнуть, что часть вышеперечисленных симптомов встречается у значительного количества гематологически здоровых людей: носовые кровотечения — 5-39%, десневые — 7-51%, легкое образование синяков — 12-24%, кровотечение после удаления зубов — 1-13%, кровотечение после тонзилоэктомии - 6 - 2 3 % , меноррагии - 23-44% (Sadler J. E., 2000).
Аутосомный тип наследования предполагает одинаковую частоту генной трансмиссии у пациентов обоего пола, но физиологические состояния женского организма, такие как менструации, беременность, роды, способствуют более частому проявлению симптомов повышенной кровоточивости среди женщин. По данным
различных исследований, примерно 60% пациентов с болезнью
Виллебранда — женщины (Paper R., 2000). Около 65% женщин с
болезнью Виллебранда страдают меноррагиями; кровопотеря составляет свыше 80 мл за менструальный цикл. Женщины с меноррагиями в контрольной группе составляют 9-14% (Kadir R. А.
et al., 1998).
Роды у женщин с болезнью Виллебранда связаны со значительной кровопотерей. У большинства больных, исключая пациенток с
типом 3, уровни факторов VIII и Виллебранда в течение беременности повышаются, достигая нормальных показателей, и риск геморрагии в родах невысокий. В послеродовом периоде концентрации данных факторов максимально снижаются в течение нескольких дней (5-7), у некоторых — до 3 недель, и риск массивных
кровотечений возрастает на 20-25%. Поэтому пациенткам с болезнью Виллебранда рекомендуется наблюдаться у врача в течение
3 недель после родов. Следует учитывать, что тромбоцитопения в
период беременности может встречаться при типе 2В болезни Виллебранда.
396
Часть 2. Клиническая гематология
Диагностика базируется на изучении семейного анамнеза, клинических проявлений, результатов лабораторных исследований и
молекулярно-генетических аспектов.
Лабораторная диагностика болезни Виллебранда включает следующие тесты: длительность кровотечения по Айви (в РосНИИГиТ
используется модификация Шитиковой) — норма 5-12 мин (3 мин
16 с), активность фактора VIII — коагуляционная активность фУШ
в плазме — норма — 58-180%, антигена фВ (плазменный антиген
фВ) — норма — 55-165%, ристоцетин кофакторная активность
(функциональная активность фВ в плазме — 54-153%, плазма пациента и смесь нормальных тромбоцитов), РИПА — ристоцетининдуцированная активность тромбоцитов (функциональная активность фВ, связанная с тромбоцитами больного), мультимерный
анализ. Последний необходимо проводить только после установления диагноза болезни Виллебранда.
Типичные нарушения показателей коагулограммы, характерные для основных типов и подтипов болезни Виллебранда, приведены в табл. 12.
При обследовании больных необходимо учитывать, что очень
многие негенетические факторы: физическая нагрузка, стресс, инфекции, уровень гормонов (тиреоидные гормоны, эстрогены) —
повышают уровни фВ, поэтому при пограничных показателях необходимо повторять обсдедования для выявления легких форм
заболевания. Также известно, что уровень фУШ и фВ в плазме
людей с группой крови 0 значительно ниже, чем с группами А и В
(Souto J. С. et al, 2000; O'Donnel J. et al, 2001). Это необходимо
учитывать при постановке диагноза больным с пограничными показателями фУШ и фВ.
Лечение. При лечении болезни Виллебранда используют медикаментозные препараты и/или препараты крови, которые содержат фактор Виллебранда.
В качестве медикаментозных препаратов используют синтетический аналог вазопрессина — десмопрессин (ДДАВП), антифибринолитики — производные аминокапроновой и транексамовой
кислот и пероральные контрацептивы.
При проведении заместительной терапии применяют следующие компоненты и препараты крови: свежезамороженную плазму,
криопреципитат и концентраты фактора VIII, с высоким содержанием фВ.
Десмопрессин применяется внутривенно, подкожно или интраназально. Показан для купирования геморрагических проявлений
и проведения оперативных вмешательств пациентам с типом 1 и
397
Глава 15. Болезнь Виллебранда
Таблица 12
Типичные изменения показателей коагулограммы,
характерные для различных вариантов
болезни Виллебранда и гемофилии А
Тип,
полтин
1
Активное 1ь
ф\'Ш:С
Снижен
2А
То же
2В
»
2М
2N
3
Гемофилия
А
Ристонетин
Ри^тоцетинАнтиген
фВ-фактора кофакторная индуцированVII
активность ная активация
(v\VK:Ag)
(>WF:Rcof)
тромбоцитов
РИПА
Снижен
Снижена
Снижена
или норма
Все ра змеры присутствуют
Отсутствуют
большие и
средние
формы
Отсутствуют
большие
формы
Значительно
снижена
Снижена
Норма
или
снижен
То же
Повышена
Снижен
или
норма
Значительно
снижен
Снижен
Значительно
снижена
Снижена
или норма
Все размеры присутствуют
Норма
Норма
Норма
Все размеры присутствуют
То же
Отсутствует
Отсутствует
Значительно снижена
Норма
Норма
Норма
Полностью отсутствует
фВ
Все размеры присутствуют
»
То же
Мультимер- ДополнеН|.HI анализ
ния
—
Может
быть
тромбоцитопения
—
Семейный
анамнез —
страдают
лица
обоего
пола
—
Страдают
только
мужчины
подтипами 2А, 2N и 2М. У больных с типом 3 и подтипом 2В
препарат не эффективен, с подтипом 2А эффективен в 50% случаев. Стандартная доза ДДВАП при внутривенном введении состав-
398
Часть 2. Клиническая гематология
ляет 0,3 мкг/кг. Препарат вводится в 50 мл физиологического раствора в течение 30 минут.
Неразведенный препарат вводят подкожно. Максимальный эффект после внутривенного введения препарата наступает через 4560 минут, период полураспада фВ — от 18 до 30 часов, при проведении оперативных вмешательств он укорачивается и составляет
12 часов. Введение препарата в данной дозировке можно повторять через 12-24 часа, но после 3-4 инъекций наступает быстрое
снижение лечебного эффекта, так как происходит истощение депо
фВ в эндотелиальных клетках. Повторные курсы введения можно
повторять через 7-10 дней. Следует учитывать, что у пациентов,
которым проводились повторные курсы ДДАВП, надо вводить через более короткие интервалы, что может привести к симптоматической гипонатриемии. Стандартная доза при подкожном введении составляет 0,3 мкг/кг массы тела. Показания к применению те
же, что и для внутривенного введения.
Существуют формы ДДАВП для интраназального применения
в виде спрея, концентрация ДДАВП — 1,5 мг/м.т. Используют у
тех же групп пациентов, что и для внутривенного введения. Показаниями к применению препарата являются: домашнее лечение
при легких эпизодах кровоточивости, после легких травм и при
меноррагиях. Обычно применяемая доза — один спрей в каждый
носовой ход у пациентов с весом менее 50 кг и по два спрея — с
весом более 50 кг.
В Российской Федерации зарегистрирован препарат ДДАВП
для подкожного введения итальянской фирмы «Кедрион» — Эмосинт, который выпускают в ампулах по 1,0 мл (20 мкг ДДАВП в
ампуле).
Для купирования легких кровотечений применяются производные аминокапроновой и транексамовой кислот — антифибринолитики.
Аминокапроновая кислота выпускается во флаконах в виде 5%
раствора по 100 мл. Назначают перорально из расчета 0.1 г/кг
массы тела через 4 часа. Применяют для купирования легких кровотечений — носовых, десневых и меноррапш.
Производные транексамовой кислоты выпускают в виде таблеток по 0,25 и 0,5 мг/мл, сиропа — 50 мг/мл и раствора для инъекций (250 мг/5 мл, 250 мг/2,5 мл, 500 мг/10 мл, 1000 мг/10 мл).
Показания к применению: носовые кровотечения, меноррапш, удаление зубов, оперативные вмешательства. Дозировка: перорально
20-25 мг/кг массы тела 3-4 раза в день, внутривенно — 10 мг/кг 34 раза в день.
Глава 15. Болезнь Виллебранда
399
Пероральные контрацептивы необходимо использовать при купировании меноррагий, по стандартным схемам, применяемым в
гинекологии.
Препараты крови используют у пациентов с болезнью Виллебранда, у которых ДДАВП был неэффективен.
Свежезамороженную плазму применяют из расчета 5-15 мл/кг
массы тела через каждые 12 часов до остановки кровотечения.
Криопреципитат также содержит фВ, его применяют для купирования геморрагических проявлений в дозировке 10-25 ME антигемофильного глобулина на кг массы тела, при оперативных вмешательствах до 40-50 ME на кг массы тела через каждые 12 часов
до остановки кровотечения.
Необходимо подчеркнуть, что свежезамороженная плазма и
криопреципитат не подвергаются вирусинактивации и могут передавать гемотрансмиссивные агенты.
В Российской Федерации зарегистрированы следующие концентраты фактора VIII с высоким содержанием фВ: Коэт ДВИ
(Байер, США), Иммунат (Бакстер Хиланд Иммуно, США), Октанат (Октафарма, Швейцария), Эмоклот Д И (Кедрион, Италия) во
флаконах по 250, 500, 1000 ME фактора VIII.
Для купирования геморрагических проявлений их применяют
в дозировке 10-25 ME на кг массы тела через каждые 12-24 часа;
при оперативных вмешательствах — до 40-50 ME на кг массы тела
через 12-24 часа.
Рекомбинантный Vila (коммерческое название Ново Сэвен*)
выпускается во флаконах по 1,2, 2,4 и 4,8 мг. Применяется у пациентов с болезнью Виллебранда с упорными кровотечениями и
аллоантителами к фВ. Средняя разовая доза 90 мкг/кг массы
тела, вводить через каждые 2-3 часа до полной остановки кровотечения.
Рекомендации по диспансеризации больных. При выявлении
заболевания необходимо проводить сбор семейного анамнеза и обследование ближайших родственников. Все пациенты с болезнью
Виллебранда должны находиться на учете у гематолога. Больные с
клиническими проявлениями подлежат обследованию не менее
одного раза в год, без клинических проявлений — по показаниям,
при обострении геморрагических проявлений. Следует давать рекомендации по вакцинации против гепатита А и В. Пациентам
противопоказан прием аспирина, производных ацетилсалициловой кислоты и нестероидных противовоспалительных препаратов.
Противопоказаны также контактные виды спорта, такие как хоккей, футбол, баскетбол и бокс.
400
Часть 2. Клиническая гематология
Болезнь Виллебранда является наиболее распространенным геморрагическим заболеванием, с которым приходится встречаться
гематологам в повседневной практике. Многообразие симптоматики, сложности в интерпретации лабораторных данных ведут к
определенным трудностям в постановке диагноза у этих пациентов. В настоящее время в федеральных центрах отработан алгоритм обследования пациентов с болезнью Внллебранда, включающий современные методы обследования и лечения.
Литература
Петрищев Н. Н. Гемостаз // Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. — СПб., 1999.
Berliner S. A., Seligsohn U., Zivelin A. et al. A relatively high frequency of severe
(type 3) von Willebrand disease in Israel // Br. J. Haematol. 1986. Vol. 62. P. 535543.
Felerici A. B. Diagnosis of von Willebrand disease // Haemophilia. 1998. Vol. 4.
P. 654-660.
Holmberg I... Nibson I. M. Von Willcbrand's disease // Eur. J. Haematol. 1992.
Vol.48. P. 127-141.
Kadir R.A., Lee С E, Sabin С A. et al Women with of von Willebrand's disease and
factor IX deficiency// Brit. J. Obset. Gynaecol. 1998. Vol. 105. P. 314-321.
Kaufman R.J., Wasley L. C, Darner A. J. Synthesis, processing and secretion of
recombinant human factor VIII expressed in mammalian cells // J. Biol. Chem.
1988. Vol. 84. P. 676-679.
Kuwano A., MorimotoJ., Nagai T. et al. Precise chromosomal locations of the genes
for dentatorubralpallidolnysion atrophy (DRPI.A), von' Willebrand factor (F8 vWF)
and parathyroid hormone-like hormone (PTHLH) in human chromosome 12 p by
delection mapping // Human. Jenet. 1996. Vol. 97. P. 95-98.
Lelhagen S. Hemostasis and bleeding disorders // Sweden, 2002. 82 p.
Mannucti P. M., Bloom A. L., Lazrien M.J. Atherosclerosis and von Willebrand factor.
Prevalence of severe von Willebrand's disease in western Europe and Israel // Br. J.
Haematol. 1984. Vol. 57. P. 163-169.
Mazuiier C, DiemlJ.Jorieux S. et al. A new von Willebrand factor (vWF) detect in
a patient with factor VIII (F VIII) deficiency but with normal levels and multimeric
patterns of both plasma platelet vWF characterization of abnormal vWF/FVIII //
Blood. 1990. Vol. 75. P. 20-26.
Mayadas T. N., Wagner D. D. Von Willebrand factor biosynthasis and processing //
Annals. New York: Academy of Science. 1991. Vol. 614. P. 153-166.
Nyman D., Ericson A. W., Bhmback M. et al. Recent investigation of the first bleeder
family in Aland (Finland) described by von Willebrand // Thromb. Haemost. 1981.
Vol. 45. P. 73-76.
O'DonnelJ., La/fan M. A. The relationship between ABO histo-blood group, factor
VIII and von Willebrand factor//Transfusion Medicine. 2001. Vol. 11. P. 343-351.
Ruggeri Z. M.. Zimmerman T. S. Variant von' Willebrand disease. Characterization of
two subtypes by analysis of multimeric composition of factor Vlll/von Willebrand
factor in plasma and platelets //J. Clinical Investigation. 1980. Vol. 65. P. 1318-1325.
Sadler J. E., Mannucii P. M., Bemtorp E. et al. Impact, diagnosis and treatment of von
Willebrand disease//Thromb. Haemost. 2000. Vol. 84. P. 160-174.
Глава 16
ОСТРЫЕ ЛЕЙКОЗЫ
Острые .[сикозы — гетерогенная группа клональных опухолевых заболеваний кроветворной ткани, прежде всего характеризующаяся неконтролируемой пролиферацией, нарушением дифференцировки и накоплением в костном мозге и периферической
крови незрелых гемопоэтических клеток. Эти злокачественные
(бластные) клетки постепенно замещают и ингибируют рост и созревание нормальных гемопоэтических предшественников и благодаря способности к миграции инфильтрируют различные органы и ткани. Остаточная способность данных клеток к дифференцировке лежит в основе фенотипической классификации заболевания.
Историческая справка, основные понятия и термины. Представления об остром лейкозе как нозологической форме складывались в течение более чем 100 лет. Впервые термин лейкемии был
предложен Р. Вирховым в 1856 г. для обозначения патологии, характеризующейся гепатоспленомегалией и изменением цвета и консистенции крови. Термин острая лейкемия предложен В. Эбштейном в 1889 г. В 1900 г. впервые охарактеризован миелобласт, что
послужило морфологической основой диагностики заболевания и
последующей верификации основных его форм. С этого же времени началась морфологическая детализация различных форм острого лейкоза, которая продолжалась семь десятилетий. В 1976 г.
франко-американо-британская рабочая группа разработала
ФАБ-классификацию острого лейкоза. В основе классификации
лежали морфологические и цитохимические характеристики клеток костного мозга и периферической крови. Несовершенство классификации требовало поиска новых подходов к классифицированию форм заболевания. В 1981, 1985 и 1987 гг. в классификацию
Глава 16. Острые лейкозы
403
вносили дополнения. Были уточнены критерии классифицирования острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ), диагностики острого мегакариобластного лейкоза и острого миелобластного лейкоза
без созревания.
Позднее по мере совершенствования иммунологических и цитогенетических методов исследования, накопления клинических
данных была разработана иммунологическая классификация и
MIC-классификации острых лейкозов, основанная на морфологических, иммунологических и цитогенстическнх критериях. Была
выделена подгруппа бифенотипичных острых лейкозов.
В 1997 г. рабочая группа специалистов ВОЗ разработала новую
классификацию, которая выделила формы острых лейкозов, отличающиеся определенным прогнозом, но и она до сих пор не
вмещает в себя все многообразие форм заболевания.
Если четверть века назад большинство больных острыми лейкозами погибало в течение первых месяцев заболевания без достижения ремиссии, то в настоящее время от 10 до 80% больных (в
зависимости от возраста, формы заболевания, группы риска) могут рассчитывать на длительную выживаемость и выздоровление.
В связи с этим важное клиническое значение имеет определение
стадии заболевания и формулировка основных понятий, используемых для оценки эффективности лечения и выбора тактики терапии. Первично-активная стадия острого лейкоза — промежуток
времени между первыми клиническими проявлениями заболевания, установлением диагноза и достижением первой полной ремиссии. Эта стадия характеризуется увеличением числа бластных
клеток в миелограмме > 20%, наличием, как правило, бластных клеток в периферической крови, клиническими проявлениями болезни, связанными с замещением патологическим клоном нормальных ростков кроветворения, инфильтрацией опухолевыми клетками внутренних органов и опухолевой интоксикацией. К полной
клинико-гематологической ремиссии относят состояния, когда количество бластных клеток в миелограмме становится меньше 5% и
отсутствуют внекостномозговые лейкемические очаги поражения.
При этом в периферической крови не должно быть бластных клеток, количество тромбоцитов составляет > 100 х 109/л, лейкоци9
9
тов — > 2,5 х 10 /л, гранулоцитов — > 1,0 х 10 /л, уровень гемоглобина — > 100 г/л. Как правило, в начале полной клинико-гематологической ремиссии в организме больного остается большое
количество резидуальных (остаточных) лейкозных клеток (10 s 1010), которые не выявляются обычными морфологическими методами исследования, но могут быть идентифицированы с помощью
404
Часть 2. Клиническая гематология
молекулярно-генетических и иммунологических методов. В связи
с этим в настоящее время можно выделить стадию минимальной
остаточной (резидуальной) болезни острого лейкоза. Постремиссионная терапия острых лейкозов по сути дела направлена на полную элиминацию остаточных лейкозных клеток, т. е. на лечение
минимальной резидуальной болезни. Определение количества резидуальных клеток после этапов индукции и консолидации ремиссии используется в настоящее время в качестве прогностических
критериев. При невозможности выявления лейкозных клеток с
помощью цитогенетических и молекулярно-генетических методов
исследования говорят о полной цитогенетической или молекуляр-'
но-генетической ремиссии заболевания. При ее сохранении в течение 5 лет можно условно говорить о гематологическом выздоровлении от острого лейкоза, так как через 5-7 лет после достижения
ремиссии рецидивы заболевания бывают крайне редкими. Если в
результате проведения стандартных курсов химиотерапии индукции ремиссии полная клинико-гематологическая ремиссия не достигается, то говорят о сохраняющейся первично-активной стадии
заболевания и первичной химиорезистентности лейкозных клеток. В отношении острых лейкозов, в силу быстрой прогрессии
заболевания, понятия «стабилизации опухолевого роста», «частичной ремиссии» или «частичного ответа» в настоящее время практически не используют. При увеличении у больного острым лейкозом с ремиссией заболевания в костном мозге по данным миелограммы количества бластных клеток более 5% можно думать о
начинающемся рецидиве. С уверенностью говорить о рецидиве заболевания можно в тех случаях, когда количество бластных клеток
в костном мозге составляет более 20%, имеет место неоднократное
обнаружение бластов в периферической крови, выявление внекостномозговых лейкемических очагов (поражение кожи, лимфоузлов,
центральной нервной системы). Таким образом, рецидив заболевания может быть костномозговым и внекостномозговым. Если рецидив заболевания возникает после первой ремиссии, говорят о
первом рецидиве заболевания, если после второй ремиссии — о
втором рецидиве и т. д. Иногда у больного острым лейкозом число
ремиссий и рецидивов заболевания исчисляют тремя и даже пятью.
При неэффективности многочисленных курсов химиотерапии, схем
второй и третьей линий терапии, при развитии полиорганной недостаточности и неуклонной прогрессии опухолевого роста иногда
можно выделить терминальную стадию острого лейкоза, подразумевая невозможность достижения ремиссии с помощью существующего на сегодняшний день арсенала методов лечения.
Глава 16. Острые лейкозы
405
Для оценки эффективности того или иного метода лечения острого лейкоза на этапе индукции ремиссии используются показатели частоты достижения полной ремиссии, резистентности и ранней смерти. На последующих этапах лечения методом KaplanMeier определяют общую, бессобытийную и безрецидивную
выживаемость, а также частоту и вероятность развития рецидива
заболевания за определенный отрезок времени (например, за 3, 5,
10 и 30 лет). При расчете общей выживаемости оценивают общее
число больных, которым начато лечение, а фактом выбытия считается смерть больного. При расчете бессобытийной выживаемости
учитывают больных, которым полностью проведен курс индукции
ремиссии и достигнута ремиссия заболевания, а фактом выбытия
считается рецидив или смерть больного от любой причины. При
расчете безрецидивной выживаемости учитывают больных, достигших ремиссии, а фактом выбытия считается только рецидив.
Таким образом, общая выживаемость отражает эффективность лечения на всех этапах терапии, без учета достижения ремиссии,
безрецидивная выживаемость — в большей степени на постремиссионном этапе. Учитывая, что не все больные острым лейкозом
достигают ремиссии, а часть пациентов даже без ее полного достижения при адекватной терапии поддержки могут рассчитывать на
довольно длительную выживаемость, оценка эффективности лечения должна проводиться комплексно, с использованием всех перечисленных выше критериев.
Распространенность. Острый лейкоз — довольно редкое заболевание и составляет лишь 2-3% злокачественных опухолей человека.
Заболеваемость острыми лейкозами в среднем составляет 3-5 случаев на 100 тысяч населения. В 75% случаев заболевание диагностируется у взрослых, в 25% — у детей. Среднее соотношение миелоидных и лимфоидных острых лейкозов составляет 6 : 1. У взрослых
пациентов в возрасте старше 40 лет 80% составляют миелоидные,
у детей — 80-90% — лимфоидные формы острых лейкозов. Медиана возраста больных острыми нелимфобластными лейкозами — 6065 лет, острыми лимфобластными лейкозами — 10 лет.
Этиопатогенез. Острый лейкоз является следствием повреждения-мутации в генетическом материале клоногенной кроветворной клетки. В результате этого на молекулярном уровне происходят события, приводящие к нарушению контроля за клеточным
циклом, изменению процесса транскрипции и продукции ряда ключевых белков-регуляторов. Хотя патогенез острых лейкозов во многом расшифрован, этиология заболевания окончательно не установлена. В большинстве случаев конкретная причина возникнове-
406
Часть 2. Клиническая гематология
пия острого лейкоза остается неизвестной. В качестве основных в
настоящее время рассматриваются несколько этиологических факторов.
1. Генетическая предрасположенность и хромосомная нестабильность. Имеется ряд сообщений о множественных случаях возникновения острых нелимфобластных и острых лимфобластных лейкозов в одной семье. Вероятность возникновения острого лейкоза
у ближайших родственников выше, чем в общей популяции. Установлено, что нестабильность хромосомного аппарата, имеющая
место при ряде врожденных заболеваний, сопровождается повышенным риском развития острых лейкозов. К таким заболеваниям
можно отнести врожденный агранулоцитоз, цслиакию, анемию
Фанкони, синдром Дауна, синдром Вискотта-Олдрича, Клайнефельтера, нейрофиброматоз Реклингхаузена и некоторые другие.
2. Вирусы. Роль вирусов в развитии лейкозов доказана в отношении птиц и некоторых животных: в частности, приматов, коров.
Причем в качестве этиологических факторов рассматриваются
РНК-ретровирусы и ДНК-вирусы. Прямое доказательство происхождения острого лейкоза у взрослых доказано лишь для Т-клеточного лейкоза или лимфомы, встречающегося у населения Японии и жителей Карибского бассейна, вызываемых HTLV-1 (human
T-leukemia virus-1). Из ДНК-вирусов лишь вирус Эпштейна-Барра участвует в онкогенезе лимфомы Беркита и В-клеточного ОЛЛ
и В-клеточных лимфом, ассоциированных с приобретенным иммунодефицитом.
Доказанная возможность вмешательства в геном человека с помощью ретро- и аденовирусов, продемонстрированная с помощью
методов генотерапии, также указывает на возможность непосредственного участия вирусов в онко- и лейкозогенезе.
3. Ионизирующая радиация. Роль малых доз радиации в лейкозогенезе не установлена. Однако показано увеличение риска развития острого лейкоза при взрыве атомной бомбы. В настоящее
время установлено, что высокодозная луч-евая терапия онкологических больных в 5-10% случаев вызывает вторичные опухолевые
заболевания, в том числе острые лейкозы. При комбинированной
лучевой и химиотерапии риск развития вторичных острых лейкозов составляет 10%.
4. Химиотерапия. В качестве серьезного этиологического фактора лейкозов в настоящее время рассматривают высокодозную
химиотерапию, обладающую, как известно, мутагенным эффектом.
К сильным мутагенам относятся следующие препараты: мустарген, прокарбазин, хлорбутин, циклофосфан. ломустин, тенипозид
Глава 16. Острые лейкозы
407
и этопозид. Например, еженедельное использование в прежних
программах лечения ОЛЛ у детей этопозида приводило к развитию вторичных ОМЛ в 13% случаях. Частота развития вторичных
лейкозов у взрослых через 2-10 лет после достижения ремиссии
достигает 5-15%.
5. Курение. Считается, что существует дозозависимая связь между курением и развитием острых миелоидных лейкозов у пожилых
пациентов.
6. Некоторые химические вещества. Бензол при длительном хроническом воздействии на организм может оказывать лейкемогенный эффект.
Перечисленные факторы в конечном итоге приводят к таким
изменениям генома клетки, которые сопровождаются нарушением
функции протоонкогенов, супрессией генов и белков сунрессоров,
образованием онкогенов, что приводит к злокачественной трансформации и преимущественной пролиферации определенного клона гемопоэтических клеток. На более поздних стадиях лейкозогенеза формируются вторичные опухолевые клоны.
Нарушение регуляции клеточного деления и созревания, связанное с изменением функции протоонкогенов при лейкозах, может происходить на нескольких уровнях.
1. Межклеточное взаимодействие.
2. Взаимодействие клеточных рецепторов с лигандами (сигнальными молекулами).
3. Передача сигнала от клеточных рецепторов к эффекторным
ферментным системам и циклинам.
4. Регуляция транскрипции.
5. Регуляция клеточного цикла и супрессия опухолевого роста.
6. Регуляция програмированной смерти клетки, то есть апоптоза (Сергеев А. Г. и др., 2000).
Хромосомные нарушения выявляются у 70-80% больных острыми лейкозами; у 20% — точечные изменения генома, приводящие к изменению процессов транскрипции.
Некоторые генетические аномалии, приводящие к нарушению
регуляции деления и дифференцировки клетки при острых лейкозах, представлены в табл. 13.
Повреждения генома лейкозных клеток в основном представляют собой реаранжировку (перестройку) протоонкогенов, а также делении или точечные мутации протоонкогенов и генов-супрессоров. Возможна также амплификация, т. е. множественное
копирование протоонкогенов, что чаще имеет место при солидных
опухолях.
408
Часть 2. Клиническая гематология
Таблица 13
Генетические аномалии, приводящие к нарушению
регуляции деления и диффереицировки клетки
при острых лейкозах
Уровень
регуляции
Аберрация
Аберран гнын ген
Межклеточное взаимодействие
Передача
сигнала от
клеточных
рецепторов
к эффекторным ферментным
системам
t(5;14)(q31;q32)
IL-3
t(9;22)(q34;qll)
c-ABL
LCK
Нарушение
регуляции
транскрипции
t(4;ll)(q21;q23)
t(9;ll)( P 22;q23)
t(8;21)(q22;q22)
t(12;21)(P13;q22)
t(l:7)(p34;q34)
Тип лейкоза
Отсутствует
В-ОЛЛ
BCR
В-ОЛЛ.
TCRP
онлл
Т-ОЛЛ
inv(16)(pl3;q22),
t(16;16)
t(ll;14)(pl3;qll)
t(ll;14)(pl5;qll)
t(15;17)(q22;qll)
t(12;21)(pl3;q22)
t(l;19)(q23;pl3)
del(lp32)
t(8;14)(q24;qll)
Регуляция
клеточного
цикла и супрессия
опухолевого роста
Ген-паршер
Точечные мутации/делеции
17pll
Точечные мутации/делеции
9р21
AF4
AF9
ЕТО
ETV6
MYH11
ОНЛЛ-М4Э0
LMO2
LM01
PML
ETV6
Е2А
TAL-1
c-MYC
TCRa/5
Т-ОЛЛ
RARa
CBFA2
РВХ1
SIL
Отсутствует
ОНЛЛ-МЗ
ОЛЛ (у детей)
рге-В-ОЛЛ
Т-ОЛЛ
Т-ОЛЛ
53
Отсутствует
ОЛЛ, ОНЛЛ
CDKN2
Отсутствует
ОЛЛ
MLL
CBFA2
CBFB
Р
рге-В-ОЛЛ
ОНЛЛ-М5
ОНЛЛ-М2
ОЛЛ у детей
Выделяют два основных механизма нарушения функции протоонкогенов в лейкозных клетках.
1. Генетические перестройки, сопровождающиеся структурными изменениями протоонкогена с формированием гибридных (химерных) генов. В результате таких аберраций происходят качественные изменения белков, приобретающих онкогенную активность.
Глава 16. Острые лейкозы
409
2. Генетические перестройки, сопровождающиеся переносом
протоонкогена в область генов иммуноглобулина (Ig) или В-клеточных рецепторов (BCR) и генов рецепторов Т-лимфоцитов
(TCR). Данные аберрации, характерные для зрелых В- и Т-линейных ОЛЛ, ведут к состыковке кодирующих последовательностей
протоонкогена и сильных промоторов генов TCR или Ig, что приводит к количественным изменениям в экспрессии протоонкогенов.
Наиболее расшифрованы генетические механизмы лейкозогенеза, связанные с изменением функции основного связующего фактора — Core binding factor (CBF). CBF — гетеродимерный транскрипционный фактор, который был первым идентифицирован как
транскрипционный активатор основного фактора роста вируса
мышиной лейкемии Малони (Moloney). Он играет ключевую роль
в транскрипционной активации генов, ответственных за синтез
интерлейкина 3, миелопероксидазы, гранулоцитарно-моноцитарного колонестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), М-КСФ рецептора, Т-клеточного рецептора-фактора роста. Оба гетеродимерных
компонента CBF — CBF ot(AMLl) и CBF P вовлечены в хромосомные транслокации, ассоциированные с лейкемией.
AMLl(CBFa)/ETO - химерный ген при t(8;21)(q22;q22) ОМЛ.
Одно из наиболее частых цитогенетических нарушений при ОМЛ —
t(8;21) — встречается в среднем у 15% взрослых больных. Следствие транслокации — слияние AMLl(CBFa) гена, расположенного на 21 хромосоме, с ЕТО геном на 8 хромосоме. Механизм трансформации AMLl(CBFa)/ETO не совсем понятен, но данный слитный (химерный) ген имеет ингибиторную активность в отношении
транскрипционной активации, вызываемой AML1. AMLl(CBFa)/
ЕТО протеин ингибирует способность AML1 гена регулировать
нормальное созревание и развитие гемопоэтических клеток. Это
подтверждено на линии мышей, гетерозиготной по AMLl(CBFa)/
ЕТО. В культуральных исследованиях показана роль этого протеина в поддержании фенотипических особенностей линии лейкемических клеток с t(8;21). Наличие транслокации t(8;21) определяет морфологическую форму ОМЛ, обычно М2 вариант по FABклассификации и ассоциируется с хорошим ответом на XT, высокой
частотой ПР и высокой безрецидивной выживаемостью. Химерный транскрипт может выявляться у больных в течение 10 лет и
более после достижения полной морфологической и цитогенетической ремиссиии, даже после аллогенной ТКМ.
Результатом хромосомных нарушений inv(16)(pl3;q22) и
t(16;16)(p!3;q22) является сцепление CBFp на 16q22 с геном
410
Часть 2. Клиническая гематология
тяжелой цепи гладкомышечного миозина (SMMHC) на 16р13. Белок химерного гена также является ингибитором функции AML1
гена. Аналогичный эффект оказывает также химерный сцепленный ген CBF(3/MYH 11.
Таким образом, оба компонента транскрипционного фактора
CBF (а и (3) играют ключевую роль в развитии приблизительно
30% острых нелимфобластных лейкозов, а также В-линейных ОЛЛ
детского возраста с TEL-AML1 химерным геном.
К сожалению, до сих пор успехи в теоретическом понимании
природы острых лейкозов незначительно повлияли на результаты
их лечения и возможность избирательного воздействия на патогенетический механизм развития заболевания. Только при остром
промиелоцнтарном лейкозе выявление химерного гена PML/RARa,
являющегося следствием транслокации t( 15; 17)(q22;ql 1.2), позволило внедрить в практику лечения использование препаратов трансретиноевой кислоты, что существенно изменило прогноз при данной форме острого лейкоза.
В результате транслокации PML ген, являющийся регулятором
роста и созревания клеток и расположенный на 15-й хромосоме,
переносится на длинное плечо 17-й хромосомы в регион, где находится ген а-рецептора ретиноевой кислоты RARa, который относится к семейству рецепторных генов, являющихся транскрипционными факторами, регулирующими в присутствии определенных
лигандов активацию или супрессию необходимых генов. Одним из
лигандов гена RARa является ретиноевая кислота.
Продуктом химерного гена PML/RARa служит патологический белок, накапливающийся в избыточном количестве в цитоплазме и ядре миелоидных клеток и блокирующий дифференцировку клеток на уровне промиелоцита. Этот блок может быть снят
в условиях высоких концентраций ретиноевой кислоты.
Клиническая картина. Клиническая симптоматика острых лейкозов обычно неспецифична, вариабельна и связана с уменьшением продукции нормальных гемопоэтических клеток и поражением
лейкозными клетками других органов. При острых лейкозах известны следующие основные синдромы: связанные с поражением и
нарушением функции каких-либо внутренних органов, интоксикации, анемический, геморрагический, а также различные инфекции.
Слабость, потливость, субфебрилитет, познабливание больные
обычно объясняют вирусными респираторными инфекциями. Боли
в костях или суставах могут встречаться у 25-79% больных; повышение температуры без явных признаков инфекции — у 50-70%;
Глава 16. Острые лейкозы
411
снижение массы тела — у 20-66%. Геморрагические высыпания в
виде петехий и экхимозов на коже и повышенная кровоточивость
встречаются у половины пациентов и имеют место, как правило, на
фоне снижения числа тромбоцитов в крови меньше 50 х 109/л. Наиболее опасны и выражены геморрагические осложнения у больных
острым промиелоцитарным лейкозом, что обусловлено высокой
частотой развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания.
Инфекции диагностируются только у 10-20% больных и могут
быть бактериальными, грибковыми, вирусными, системными и локализованными. Сочетание инфекционных осложнений с выраженным гиперлейкоцитозом (встречается у 50% больных), лейкопенией (встречается примерно у 30% больных с острым промиелоцитарным лейкозом), нейтропенией, тромбоцитопенией и анемией
может навести на мысль о гематологическом заболевании. Нормохромная анемия составляет 50-80% случаев и проявляется бледностью кожных покровов, утомляемостью. При выраженной анемии могут появиться сердечно-сосудистые расстройства, особенно
у пожилых больных. Гепатоспленомегалия при остром нелимфобластном лейкозе встречается в 50% случаев, а при острых лимфобластных лейкозах — у 75% пациентов. Увеличение периферических лимфоузлов при острых лимфобластных лейкозах отмечается
в 75% случаев и значительно реже при острых нелимфобластных
лейкозах. При'отсутствии увеличенных периферических лимфоузлов с помощью инструментальных методов исследования (УЗИ,
рентгенография легких, компьютерная томография) может быть
обнаружено изолированное увеличение внутрибрюшных и внутригрудных лимфоузлов.
Специфическое поражение кожи, проявляющееся в виде уплотнений, узелков, пятнистой сыпи, встречается в 10% случаев и характерно для миеломоно- или монобластных лейкозов, хотя могут
встречаться и при других формах заболевания. Гингивиты, гиперплазия слизистой рта и желудочно-кишечного тракта за счет специфической инфильтрации часто наблюдаются при острых монобластных лейкозах.
Специфическое поражение центральной нервной системы при
остром нелимфобластном лейкозе встречается в 5% случаев, преимущественно при монобластном лейкозе (3-22%), 15-20% — при
остром лимфобластном лейкозе, 25% — при миеломонобластном
лейкозе с повышенным количеством эозинофилов и инверсией 16-й
хромосомы. Нейролейкоз у половины больных клинически не проявляется и выявляется только при морфологическом исследова-
412
Часть 2. Клиническая гематология
нии осадка ликвора, компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии. У половины больных могут наблюдаться симптомы, обусловленные повышенным внутричерепным давлением:
головная боль, тошнота, рвота, сонливость, а также поражением 3,
4, 6 и 7-й пары черепных нервов.
Метаболические и электролитные нарушения характерны для
острого лейкоза. Гиперурикемия и гиперуринемия встречаются у
большинства больных, что создает риск поражения почек с отложением в них уратных кристалов. При УЗИ у 10% больных отмечается увеличение размеров почек, что связывают со специфической инфильтрацией их паренхимы. Гиперкалиемия может проявляться на фоне повышенного клеточного распада. Чаще при острых
лейкозах, особенно при миеломоно- и монобластных лейкозах, обнаруживается гипокалиемия, что связывают со специфическим
поражением клеток почечных канальцев лизоцимом и мурамидазой. Довольно часто наблюдается гиперкальциемия, причина которой неизвестна. У большинства больных ОЛЛ с гиперлейкоцитозом и у части больных с ОНЛЛ-М7 имеет место увеличение лактатдегидрогеназы.
При остром лимфобластном лейкозе у мальчиков в 10-25% случаев наблюдается специфическое поражение яичек, проявляющееся их увеличением, отеком, болезненностью.
Респираторные расстройства у больных острым лейкозом могут быть обусловлены лейкостазом в легочных капиллярах на фоне
гиперлейкоцитоза, кровоизлияниями в паренхиму легких, микротромбоэмболиями, инфекционными осложнениями. Немотивированная одышка, гипоксемия, гиперкапния могут быть первыми проявлениями заболевания.
Диагностика и классификация. Учитывая неспецифичность
клинических проявлений острого лейкоза, диагностика заболевания основана на поэтапном применении комплекса лабораторноинструментальных исследований. Первый этап — установление
самого факта наличия у больного острого лейкоза с помощью цитологического исследования мазков крови и костного мозга. При
обнаружении в мазках костного мозга более 20% бластных клеток
можно думать об остром лейкозе. Второй этап — разделение острых лейкозов на две группы: острые нелимфобластные и острые
лимфобластные лейкозы. С этой целью, кроме цитологического,
осуществляется цитохимическое и иммунологическое исследование образцов костного мозга. Третий этап — подразделение острых
лейкозов на формы, характеризующиеся определенным прогнозом
и особенностями терапии. Для этого, наряду с вышеперечисленны-
Глава 16. Острые лейкозы
413
Таблица 14
Методы исследований при острых лейкозах
Группы методов
исследования
Морфологические
Цитохимические
Иммунологические
(изучение клеточных
маркеров)
Цитогснетические
Молекулярногенетические
Методы
Световая микроскопия мазков крови и костного
мозга
Гистологическое исследование костного мозга
Трансмиссионная электронная микроскопия
Световая микроскопия
Ультраструктурная цитохимия
Проточная цитометрия
Флюоресцентная микроскопия
Иммуноцитохимия с фиксацией клеток на стекле
Иммуногистохимическое исследование костного
мозга
Метод бондирования хромосом
ДНК гибридизация (ДНК зондовая гибридизация по Southern blotting, флюоресцентная in situ
гибридизация (FISH))
ПЦР
Секвенирование (определение последовательности реаранжировки генов иммуноглобулина и
рецептора Т-лимфоцитов, исследование точечных мутаций и микроделеций в генах)
Дополнительные
Определение лактатдегидрогеназы в сыворотке
крови
Определение Р-гликопротеина, экспрессии гена
множественной лекарственной резиетентности
MDR1
Инструментальные
Рентгенологический
Ультразвуковой
Ядерно-магнитно-резонансная томография
ми методами исследования, используют дитогенетические, молекулярно-генетические, иммуногистохимические и некоторые другие. Комплекс методов, используемых в процессе диагностики острых лейкозов, представлен в табл. 14.
Световая микроскопия мазков крови и костного мозга, отпечатков гистологических препаратов костного мозга остается наиболее
употребимым методом диагностики острого лейкоза. Уже на этом
этапе диагностики опытный морфолог с помощью анализа мазков
крови или костного мозга с большой вероятностью может идентифицировать острый лимфобластный и острый миелобластный лейкозы, так как лимфобласты и миелобласты имеют свои цитологи-
Часть 2. Клиническая гематология
414
ческие характеристики (табл. 15). Цитохимические исследования
мазков костного мозга позволяют идентифицировать острый лимфобластный лейкоз и М1 -Мб варианты острых нелимфобластных
лейкозов (табл. 16).
Таблица 15
Цитологические характеристики бластных клеток
при острых миелобластных и острых лимфобластных лейкозах
Характеристики
Острые лейкозы
мие.юб.тастные
лимфобластные
Крупные, популяция одно- От мелких до средних, пообразна
пуляция вариабельна
o.iacioti
Размеры клеток
Хроматин ядра
Нежный, тонкосетчатый, с
равномерной окраской и
калибром
Более грубый
Количество
нуклеол
1 4. часто явно видимые
Отсутствуют или 1 2. неясные, расплывчатые
Цитоплазма
Умеренно выраженная,
часто с гранулами
От практически полного
отсутствия до умеренной,
гранулы практически всегда
отсутствуют
Палочки Ауэра
Встречаются в 60-70% случаев
Отсутствуют
Миелодиспластические изменения
Часто присутствуют
Отсутствуют
Таблица 16
Морфологическая FAB-классификация
острых нелимфобластных лейкозов
Вариант ОНЛЛ
Морфологические критерии
(по данным миелограмчы)
МО — острый миелобластный лейкоз
с минимальной
дифференцировкой
>30% миелобластов без гранул
Палочки Ауэра ( )
Ml — острый миелобластный лейкоз
без созревания
>30% миелобластов с отсутствием
или скудными гранулами. <10%
созревающих гранулоцитарных
клеток. Палочки Ауэра (±)
М2 — острый миелобластный лейкоз
с созреванием
>30% миелобластов с гранулами,
>10% промиелоцитов или созревающих гранулоцитарных клеток. <20% моноцитов. Палочки
Ауэра (+)
Цитохимические
характеристики
МПО,
ХАЭ
нэ
Суд. В
-
+
•+
++
+
-
415
Глава 16. Острые лейкозы
Продолжение таблицы 16
Вариант ОНЛЛ
Морфологические критерии
(по данным мнело! раммы)
МЗ — острый промиелоцитарный
лейкоз
>30% миелобластов и промиелоцитов, <10% созревающих гранулоцитарных клеток. Палочки
Ауэра (++)
М4 — острый миеломоноцитарный
лейкоз
>30% миелобластов, монобластов, промиелоцитов, >20% моноцитарных клеток. Палочки
Ауэра (±)
М5а — острый монобластный лейкоз
без дифференцировки
>80% крупных монобластов с
выраженной цитоплазмой. Палочки Ауэра (-)
М5в — острый монобластный лейкоз
с дифференцировкой
>80% моноцитарных клеток с
преобладанием промоноцитов и
моноцитов. Палочки Ауэра (±)
Мб — острая эритролейкемия
Миелобласты >30% от неэритроидных клеток. Эритроидные
предшественники с мегалобластами >50%. Палочки Ауэра (+)
М7 — острый мегакариобластный
лейкоз
Бласты с «лимфоидной» морфологией и отшнуровкой цитоплазмы, мегакариобласты >30%,
диспластические мегакариоциты. Палочки Ауэра (-)
Ци f охимические
характеристики
МПО,
ХАЭ
нэ
Суд. В
+++
+++
++
++
++
±
+++
+
+++
-
Примечание. МПО — миелопероксидаза. Суд. В — Судан черный, ХАЭ — хлорацетатэстераза. НЭ — неспецифическая ^стераза.
Картина периферической крови у больных острым лейкозом
вариабельна. В дебюте заболевания в периферической крови могут
наблюдаться снижение уровня гемоглобина и числа эритроцитов,
тромбоцитопения (редко тромбоцитоз), лейкопения или гиперлейкоцитоз, нейтропения, сдвиг лейкоцитарной формулы до промиелоцитов или бластов.
Трансмиссионную электронную микроскопию в настоящее время практически не используют, но в ряде случаев она позволяет
идентифицировать ранние В- и Т-формы острых лейкозов, а также
гипогранулярную форму острого промиелоцитарного лейкоза.
Гистологические методы исследования имеют принципиальное
значение при так называемом «сухом» костном мозге, когда получить пунктат и оценить морфологию костного мозга не удается.
416
Часть 2. Клиническая гематология
Такая ситуация встречается в 5-10% случаев. В этом случае проводится цитологическое исследование отпечатка трепаната костного
мозга, а гистологический и иммуногистохимический анализ позволяет с определенной точностью установить диагноз острого лейкоза.
Следует отметить, что иногда гистологическая картина может
быть смазана, что требует проведения дифференциального диагноза с бластным кризом хронического миелолейкоза, лимфобластной лимфомой и миелодиспластическим синдромом. Гистологический метод позволяет также установить или подтвердить предположение о мегакариобластном лейкозе, который характеризуется
миелофиброзом, увеличением ретикулиновых волокон и увеличением бластных клеток на фоне повышенного числа зрелых или
атипичных мегакариоцитов. Особенно точен для диагностики М7
варианта ОНЛЛ метод иммуногистохимии.
Ультраструктурная цитохимия позволяет определять на ранних
стадиях дифференцировки бластных клеток миелопероксидазу в
миелобластах и мегакариобластах и диагностировать МО и М7 варианты ОНЛЛ. Использование этого метода доказало, что в 80%
случаев при острых недифференцированных лейкозах бластаые
клетки содержат гранулы миелопероксидазы, и это позволяет отнести их к миелоидным формам.
Иммунофенотииирование бластных клеток, особенно при использовании проточного цитометра, позволяет быстро (в течение
1 часа) подтвердить диагноз острого лейкоза, осуществить подразделение клеток на лимфобласты и миелобласты, идентифицировать МО, Мб и М7 варианты ОНЛЛ, верифицировать формы ОЛЛ,
диагностировать бифенотипичный острый лейкоз. Одновременное использование 3 или 4 красящих меток дает возможность выявлять экспрессию на бластной клетке определенной комбинации
кластеров дифференцировки (CD), что в последующем помогает
отслеживать эти клетки для диагностики резидуальной болезни.
Цитогенетические методы исследования являются необходимыми для подтверждения основных форм острых лейкозов и определения прогноза и полноты ремиссии. Хромосомные нарушения
диагностируются у 80% больных ОЛ.
Молекулярно-биологические методы в клинической практике
используют для выявления некоторых типов транслокаций, не выявляемых методом бондирования хромосом, идентификации ключевых генов, вовлеченных в патогенез острого лейкоза, а также
рассматривают как основные методы верификации полного выздоровления и контроля за течением резидуальной болезни.
Глава 16. Острые лейкозы
417
Определение лактатдегидрогеназы, Р-гликопротеина и гена множественной лекарственной резистентное™ (MDR1 гена) у больных острыми лейкозами в настоящее время проводят для выделения группы высокого риска.
ФАБ-классифпкация остается основной для верификации острых нслимфобластных лейкозов (ОНЛЛ).
При остром миелобластном лейкозе с минимальной дифференцировкой (МО) — миелобласты не содержат гранул, палочек Ауэра
и не имеют отчетливых морфологических и цитохимических характеристик, позволяющих их идентифицировать. Мнелопероксидаза выявляется только методами ультрацитохимии или с помощью моноклональных антител. Критерием для диагностики данной формы является обнаружение в менее чем 3% бластов МПО.
Суд. В пли в более чем 20% клеток обнаружение экспрессии миелоидных маркеров (CD13, CD14*, CD33*) без экспрессии лимфоидных маркеров. В настоящее время установлено, что небольшое
число бластов может нести лимфоидные маркеры (TdT*). Специфические для этой формы ОНЛЛ цитогенетичеекие изменения
отсутствуют, но часто имеют место комплексные поломки, изменения 5-й или 7-й хромосомы, трисомия 8-й или 13-й хромосомы.
ОНЛЛ-М0 чаще встречается у пожилых (медиана возраста —
60 лет) и при вторичных формах ОНЛЛ. Миелобласты часто экспрессируют CD34'.
Острый миелобластный лейкоз без созревания (Ml) характеризуется резким снижением созревающих форм клеток гранулоцитарного ряда (<10% промиелоцитов и более зрелых гранулоцитов) и увеличением миелобластов (>90%). ОНЛЛ-М1 встречается
в 10-20% случаев ОНЛЛ, чаще у взрослых, чем у детей (медиана
возраста — 45-50 дет). Данную форму ОНЛЛ необходимо прежде
всего отдифференцировать от ОЛЛ-1_2, М5а, М7 и острого базофилыгого лейкоза. Не менее 3% бластов должны быть МПО + и
Суд. В^ и в более чем 20% клеток экспрессия миелоидных маркеров (CD13 T , C D i r , CD33*).
Острый миелобластный лейкоз с созреванием (М2) составляет
30-45% от всех ОНЛЛ. Бласты морфологически и цитохимически
типично мислоидные. Часто имеет место эозинофилия. В 35-40%
случаев встречается типичная трапелокация t(8;21)(q22;q22), характеризующаяся благоприятным прогнозом как у взрослых, так и
у детей. При иммунофенотииировании, наряду с миелоидными
маркерами, часто имеет место экспрессия CD56* и реже — CD19*.
При наличии экспрессии CD34^, как правило, возникает коэкспресспяСП56 и CD19 .
14 Гематология. Нои. справочник
418
Часть 2. Клиническая гематология
Острый промиелоцитарный лейкоз (МЗ) составляет 5-10% от
всех ОНЛЛ и встречается чаще у молодых. Медиана возраста больных МЗ вариантом ОНЛЛ составляет 30-38 лет, хотя иногда заболевание встречается в возрасте моложе 10 и старше 50 лет. Гипергранулярная форма острого нромиелоцитарного лейкоза диагностируется уже при световой микроскопии мазков костного мозга.
Диагноз подтверждается цитохимическим исследованием. При
ОНЛЛ-МЗ в 95% случаев встречается характерная транслокация
t( 15; 17) . При ее обнаружении диагноз острого промиелоцитарного лейкоза не должен вызывать сомнений. Цитогенетическое исследование помогает диагностировать заболевание при микро- или
гипогранулярной форме ОНЛЛ-МЗ.
При M3v (гипогранулярной форме промиелоцитарного лейкоза), встречающейся в 20% случаев, отсутствуют гипергранулярные
промиелоциты и бластные клетки могут быть без гранул, диагноз
обязательно должен подтверждаться цитогенетическими и молекулярно-генетическими методами исследования. При гипогранулярной форме острого промиелоцитарного лейкоза, наряду с миелоидными маркерами, лейкозные клетки часто зкспрессируют CD2*
и никогда не экспрессируют HLA-DR.
Острый миеломоноцитарный лейкоз (М4) составляет 5-10% от
всех ОНЛЛ. Медиана возраста больных — 40-45 лет. Морфологические и цитохимические критерии, как правило, позволяют верифицировать данную форму острого лейкоза. При иммунофенотипировании, наряду с миелоидными маркерами, часто встречается экспрессия CD2' и HLA-DR'. Характерных цитогенетических форм
нет. Только при М4 с эозинофилией характерны инверсии и. транслокации с вовлечением 16-й хромосомы. При М4 с эозинофилией
выраженность цитохимической реакции на НЭ (+) или (±).
Острые монобластные лейкозы (М5а и М5в) составляют 210% от всех ОНЛЛ. Больные острым монобластным лейкозом без
дифференцировки (М5а) чаще молодого возраста. Количество всех
больных с ОНЛЛ-М5а моложе 25 лет составляет 75%. Острый
монобластный лейкоз с дифференцировкой (М5в) встречается с
одинаковой частотой в любом возрасте. При М5 вариантах ОНЛЛ
диагностическое значение имеет полное подавление неспецифической эстеразы фторидом натрия. Монобласты могут быть идентифицированы иммунофенотипически: антителами к лизоциму и
:
KP 1(CD68 ).
Острая эритролейкемия (Мб) встречается менее чем в 5% случаев СЧЛЛ, и чаще у лиц старше 50 лет. Для диагноза обычно
достаточно морфологических критериев.
Глава 16. Острые лейкозы
419
Острый мегакариобластный лейкоз (М7) составляет 5-10% от
всех ОНЛЛ. Морфологически бластные клетки выглядят как
ОНЛЛ-М1 или ОЛЛ-Ь2. При Мб и М7 вариантах ОНЛЛ иногда
может проявляться слабо выраженная положительная (±) реакция
на НЭ, при М7 варианте — ± реакция на ХАЭ, что в обоих случаях
не имеет диагностической ценности. При Мб (реже М7) варианте
ОНЛЛ бывает положительной PAS реакция, и это позволяет в ряде
случаев видеть палочки Ауэра в эритроидных предшественниках.
М7 вариант ОНЛЛ диагностируется методом иммунофенотипирования, который позволяет выявлять тромбоцитарные кластеры
дифференцировки (CD41, C D 4 2 B , CD61) на бластных клетках.
ФАБ-классифнкацию ОЛЛ (табл. 17) в клинической практике
в настоящее время практически не используют в связи с отсутствием ее прогностической значимости. Прогностическую значимость имеют линейность и степень дифференцировки лимфобластов, то есть их иммунофенотипическая особенность (табл. 18).
Таблица 17
ФАБ-классификация острых лимфобластных лейкозов
Морфологические
признаки
L1
1.2
Размер клетки
Маленький
Клетки крупные.
reieporeHHbie
Клетки крупные,
гомогенные
Количество цитоплазмы
Скудное
Среднее или выраженное
Среднее или вь оаженное
Нуклеолы
Незаметные
Заметные, бросаюшиеся в глаза
Имеются, могут
быть хорошо заметными
Цитоплазматические вакуоли
Вариабельные
Вариабельные
Заметные, бросающиеся в глаза
Таблица 18
Иммунофенотипическая классификация
острых лимфобластных лейкозов
Вариант ОЛЛ
Ранний пре-В
Common-ОЛЛ
Пре-В
Характерные маркеры
+
+
CD10 CD 19 . clg slg . cCD79cr. cCD22
CD 10+ . CD19+ . clg slg
В
CD 10+ . CD19+ . clg+ .slg
CD10 + . C D 19 \ clg slg 4
Пре-Т
CD7\ cCD3+
Т
+
+
CD1*. CD3 . CD4+ CD7 . CD8+
Примечание, с - цитоплазматический, s — поверхностный, мембранный.
120
Часть 2. Клиническая гематология
Для диагностики В-линейного ОЛЛ на бластной клетке необходимо выявить по крайней мере 2 В-антигена — CD79a, CD19,
CD22; для Т-линейного ОЛЛ - CD3, TdT. TdT антиген экспрессирован на всех лимфобластах за исключением В-ОЛЛ. Ранний преВ вариант ОЛЛ в литературе иногда называют про-В, пре-пре-В,
«пи11»-вариант ОЛЛ.
В группе Т-линейных ОЛЛ некоторые авторы (EGIL group Европейская группа по изучению лейкозов) выделяют четыре
подгруппы: про-Т или Т I (CD7\ cCD3*), пре-Т или Т II (CD2 4
или CD5* или CD8*), кортикальные Т-ОЛЛ или Т III (CDla + ),
зрелые Т-ОЛЛ или Т IV (sCD3 T ) В с разделением на два варианта: TCR а/Р или у/8. Иммунофенотгшические характеристики различных форм острых нелимфобластных лейкозов представлены в
табл. 19.
Таблица 19
Иммунофенотипические характеристики властных клеток
при различных формах острых нелимфобластных лейкозов
по ФАБ-классификации (по: R. W. Me. Kenna, 2000)
CD
МО
Ml
М2
CD13
CD33
HLA-DR
CD64
CD 14
CD36
CD71
CD41
CD61
Гликофорин А
МРО*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
±
+
+
+
+
+
+
±
мз
М4
М5
Мб
+
+
+
+
+
+
±
±
±
+
+
+
+
+
+
+
М7
+
±
+
+
+
+
+
+
±
+
±
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
±
+
Примечание. При МО и Ml возможна экспрессия некоторых лимфоидных маркеров.
1
CD7", TdT ; при М2 и М2 с базофилией - CD 19: при МЗ и М4 с эозинофилией CD2;
при М4и М 5 — CD4.
* МРО — миелопероксидаза.
В том случае, когда бластные клетки несут маркеры как миелоидных так и лимфоидных клеток, можно говорить о бифенотипичном остром лейкозе. Критерии диагностики бифенотипичных лейкозов представлены в табл. 20.
Бифенотипичный острый лейкоз диагностируется при экспрессии более чем на 2 балла миелоидных и лимфоидных маркеров.
Глава 16. Острые лейкозы
т
Таблица 20
Иммунофенотипические критерии диагностики
бифенотипичных острых лейкозов
Коэффициент
2
1
0.5
В-линейпыс
маркеры
Миелоидные
маркеры
Т-линейные
маркеры
МРО
CD19+. CD10\
CD20+
CD3(c/s), TCRa/p + .
TCRy/5+
C D 2 \ CD5 + . CD8+.
CD4 +
CD117(c-kit)\CD13 + ,
CD3.V. sCD65 +
TdT + . CD24*
TdT+. C D 7 + . C D l a +
CD14\CD15 + . CD64*
C D 7 9 a \ clg*,
cCD22 +
С 1997 г. получила распространение ВОЗ-классификация острых лейкозов, которая построена на выделении подгрупп заболевания на основе их клоналыгого происхождения и прогностической значимости. Данная классификация предусматривает постановку диагноза острого лейкоза при обнаружении не менее 20%
бластов в крови или костном мозге. Подгруппа острых миелоидных лейкозов с характерными цитогенетическими нарушениями
составляет примерно 30% всех ОМЛ. Как правило, эти острые
лейкозы не являются вторичными и ассоциированы с характерной
морфологией костного мозга и хорошим прогнозом. Транслокации
Hq23 встречаются при М4 и М5 вариантах ОНЛЛ, и прогноз заболевания в связи с этим может быть вариабельным. Острые миелоидные лейкозы с мультилинейной дисплазией могут быть de
novo и вторичными, связанными с предшествующим миелодиспластическим синдромом или проводимым ранее лечением цитостатическими препаратами, или лучевой нагрузкой. Данная группа ОМЛ характеризуется плохим прогнозом даже при наличии
прогностически благоприятных цитогенетических вариантов.
В группе не категоризованн'ых ОМЛ первые 8 вариантов соответствуют М0-М7 вариантам ОНЛЛ по ФАБ-классификации. В эту
группу ОМЛ также включены острый базофильный лейкоз, острый панмиелоз с миелофиброзом и миелоидная саркома. Острый
базофильный лейкоз соответствует по ФАБ-классификации Ml,
М2, М4 вариантам и характеризуется базофильными включениями в цитоплазму миелобластов, определенными цитогенетическими нарушениями и плохим прогнозом. Острый панмиелоз с миелофиброзом составляет 1-2% всех ОНЛЛ и объединяет в одну
группу острый миелофиброз, злокачественный миелосклероз и миелодисплазию с миелофиброзом. Саркоматозная пролиферация миелобластов может быть охарактеризована как миелоидная саркома.
Прогноз при данной форме плохой.
422
Часть 2. Клиническая гематология
Классификация ВОЗ острых миелоидных лейкозов
ОМЛ с характерными цитогенетическими транслокациями
ОМЛ с t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO).
Острый промиелоцитарный лейкоз (ОМЛ с t( 15;17)(q22;ql2),
(PML/RARa) и вариантный.
ОМЛ с патологической костномозговой эозинофилией
(inv(16)(pl3q22)iont(16;16)(pl3;q22). CBFb/MYXl IX).
ОМЛ с 1 Iq23 (MLL) дефектами.
ОМЛ с мультилинейной дисплазией
С предшествующим миелодиспластическим синдромом или
миелодисплазией с миелопролиферацией.
Без предшествующего миелодиспластического синдрома, но с
диспластическими изменениями 150% клеток в двух и более
миелоидных линиях.
Вторичные ОМЛ и миелодиспластический синдром, связанные с проводимым ранее лечением:
— алкилирующими препаратами или облучением;
— ингибиторами топоизомеразы II (могут быть лимфоидными);
— другими препаратами.
ОМЛ, никак более не категоризованные
ОМЛ с минимальной дифференцировкой.
ОМЛ без созревания.
ОМЛ с созреванием.
Острый миеломоноцитарный лейкоз.
Острый монобластный/моноцитарный лейкоз.
Острый эритроидный лейкоз (эритроидно/миелоидный и чистая эритролейкемия*).
Острый мегакариобластный лейкоз.
Острый базофильный лейкоз.
Острый панмиелоз с миелофиброзом.
Миелоидная саркома.
Классификация ВОЗ острых лимфобластных лейкозов
Острые лимфобластные лейкозы из предшественников В-клеток (цитогенетические подгруппы)
t(9;22)(q34;qll).
t(v;ll)(v;q23).
* Вариант ОМЛ «чистая эритролейкемия» в качестве критерия диагноза
предусматривает обнаружение в костном мозге >80% эритроидных предшественников по отношению ко всем костномозговым клеткам вне зависимости от количества миелобластов.
423
Глава 16. Острые лейкозы
t(l;19)(q23;pl3).
t(12:21)(q23;pl3).
Острый лимфобластный лейкоз из предшественников Т-клеток.
Острый лейкоз Беркитта.
ВОЗ-классификация острых лимфобластных лейкозов предусматривает выделение трех основных групп: острый лимфобластный лейкоз из предшественников В-клеток, острый лимфобластный лейкоз из предшественников Т-клеток и острый лейкоз/лимфома Беркита. Третий вариант ОЛЛ требует проведения специфического лечения, и прогноз определяется ранним использованием
больших доз метотрексата. Выделение подгрупп ОЛЛ в зависимости от сдепени зрелости и иммунофенотипических характеристик
лимфобластов данная классификация не предусматривает. В группе В-линейных ОЛЛ выделяются четыре формы с характерными
цитогенетическими изменениями.
Безусловно, представленные выше классификации острых лейкозов не отражают многообразие их патогенетических форм. Если
в качестве основы классифицирования использовать их клональное происхождение, то количество форм заболевания будет огромным. Наиболее часто встречающиеся хромосомные нарушения,
которые лежат в основе острых лейкозов и соответствуют их определенным формам, представлены в табл. 21.
Таблица 21
Хромосомные нарушения при острых лейкозах
Хромосомные
нарушения
Вовлеченные
гены
—
Соответствие форме
острого лейкоза
-5, -7, del(5q), del (7q).+11 ,+ 13
ОНЛЛ МО
t(9;22)(q34;qll)
ABL; BCR
t(l:ll)(p32;q23)
AFlp;MLL
—
ОНЛЛ Ml
- 5. -7, del(5q),del (7q),+8
+ 11
MLL
t(9;22)(q34;qll)
ABL; BCR
TEL. MNI
t(12;22)(pl3;qll)
t(l;7)(plO;qlO)
—
t(8:21)(q22:q22)
AML1/ETO
ОНЛЛ М2
del7(q)
—
t(9;22)(q34;qll)
ABL, BCR
+ 11
MLL
t(ll;17)(q23;q25)
MLL. AF17
t(7:ll)(P15:pl5)
HOXA9,NUP98
t(7;ll)(pl3;ql3)
424
Часть 2. Клиническая гематология
Продолжение таблицы 21
Хромосомные
нарушения
t(l;7)(plO;qlO)
t(16;21)(pll;q22)
+4
t(6;9)(P23;q34)
t(15;17)(q24;q21)
t(15;17)(q22;ql2)
t(ll;17)(q23;q2l-q25)
t(5;17)(q35;ql2)
11q23. +8. +21
t(6;9)(p23;q34)
t(l;ll)(q21;p23)
t(ll;16)(q23;pl3)
I(ll;17)(q23;q25)
t(ll;19)(q23;pl3)
t(12;22)(pl3;qll)
t(6;ll)(q27;q23)
t(l;3)(p36;q31)
inv(16)(pl3;q22).
t(16;16)(pl3;q22),+22
t(6;9)(P23;q34)
Вовлеченные
гены
—
Соответствие форме
острого лейкоза
ОНЛЛ М2
—
DEK, CAN
PML, RARA
—
PLZF. RARA
NPM.RARA
MLL
DEK, CAN
AFIq, MLL
MLL. СВР
MLL, AF17
MLL, ENL. ELL
TEL. MNI
AF6, MLL
—
MYH11 CBFB
—
DEC, CAN
ОНЛЛ-М2 с базофилией
ОНЛЛ-МЗ, -M3v
0НЛЛ-М4
0НЛЛ-М4 с эозинофилией
0НЛЛ-М4 с базофилией
MLL
AFIq, MLL
AFIO. MLL
MLL. СВР
MLL. AF17
MLL, ENL. ELL
—
AF6, MLL
0НЛЛ-М5
t(9:ll)(p22;q23)
AF9, MLL
0НЛЛ-М5а
t(8;16)(pll;pl3)
MOZ. СВР
0НЛЛ-М5 с фагоцитозом
эритроцитов
ОНЛЛ-М6
t/del(ll)(q23),+8
t(l;ll)(q21;p23)
t(lO;l1)(p1l-l5:ql3-23)
t(ll;16)(q23;pl3)
t(ll;17)(q23:q25)
t(ll;19)(q23;p!3)
t(8;16)(pll;pl3)
t(6;ll)(q27:q23)
-7.del7,-5,del5.+9, del(20)(qll)
t(3;3)/inv(3)(q21;q26)
t(3;5)(q25;q34)
трисомия 21
t(12;22)(pl3;qll)
t(l;22)( P 13;ql3)
—
EVI1, ribophorin
MLF1.NPM
—
TEL, MNI
—
0НЛЛ-М7
ОНЛЛ-М0-М7
t(16;22)(pll;q22)
t(3;21)(q26:q22)
FUS. ERG
EVI1.MDS1 или
EAP. AML1
t(8;14)(q24;q32)
t(2;8)(pl2;q24)
t(8;22)(q24;qll)
t(9;22)(q34;qll)
MYC. IGH
IGK, MYC
IGL, MYC
ABL, BCR
В-ОЛЛ
t(l;19)(q23;pl3)
PBX1.E2A
пре-В-ОЛЛ
Глава 16. Острые лейкозы
125
Продолжение таблицы 21
Хромосомные
нарушения
t(17:19)(q22:pl3)
t(4;ll)(q21;q23)
t(9;22)(q34;qll)
t/dic(9;12)(q34;pl3)
t(4;ll)(q21;q23)
гипердиплоидия
Uq23
der(19), t(l;19)(q23;pl3)
6q-. 9pt(9;22)(q34;qll).
гипердиплоидия
t/dic(9;12)(q34;pl3)
t(12:21)(pl3;q22)
t(ll;l9)(q23:q22)
t(5:14)(q31:q32)
t(l;14)(p32-34;qll)
t(8;14)(q24;qll),
t(10;14)(q24;q!l)
t(ll;14)(pl3;qll)
6q-.9p14qll,14q23
t(7;19)(q32-6;pl3)
t(7;ll)(pl3;q32-6)
t(7;10)(q32-6;q24)
del(lp32)
t(l;7)(p32;q32-6)
t(l;7)(q34;q32-6)
t(7;9)(q32-6;q32)
t(7;9)(q32-6;q34)
t(ll;19)(q23;pl3)
t/del(llq23)
Вовлеченные
гены
HLF. E2A
MLL. AF4
ABL. BCR
ETV6. ABL
MLL. AF4
Соответствие форме
острого лейкоза
прс-В-ОЛЛ
пре-пре-В-ОЛЛ
—
MLL
PBX1,E2A
common-ОЛЛ
MYB
ABL, BCR
ETV6.ABL .
TEL. AML1
В-линейные ОЛЛ
MLL, ENL или MLL.
ELL
IL3. IgH
TAL1.TCRD
MYC, TCRD
HOX11.TCRD
RBTN1,TCR
Т-ОЛЛ
MYB
TCR-CAIG-VH
TCR. LYLI
TTG.TCRB
TCRB, HOX11
TALI
TALI, TCRB
LCK, TCRB
TCRB, TAL2
TCRB, TAN1
MLL. ENL, ELL
MLL
пре-Т-ОЛЛ
Т-линейные ОЛЛ
Бифснотипичные
острые лейкозы
Примечание. ОНЛЛ — острые нелимфобластные лейкозы; МО М7 — варианты
острых нелимфобластных лейкозов по ФАБ-классификации; ОЛЛ
острые лимфобластные лейк озы.
Диагностика минимальной резидуальной болезни. Минимальной резидуальной (остаточной) болезнью принято называть популяцию лейкозных клеток, которая на фоне установленной полной
клинико-гематологической ремиссии (количество бластных клеток в миелограмме составляет менее 5%) может быть определена
только с помощью специальных методов исследования. Отслеживание резидуальной болезни возможно только при -идентификации лейкозного клона, то есть выявлении особых фенотипических
426
Часть 2. Клиническая гематология
и генотипических характеристик леикозных клеток, которые позволяют отличить их от нормальных гемопоэтических клеток-предшественниц. Основные методы, позволяющие идентифицировать
лейкозные клетки, представлены в табл. 22. Выявление остаточных леикозных клеток на различных этапах постремиссионного
лечения является принципиальным для определения риска рецидива заболевания и корректировки лечебной тактики.
,
Таблица 22
Методы диагностики резидуальной болезни
при острых лейкозах
Возможность
выявления
резидуа.тьных
клеток, %
Чувствительность
метода
Цитогенстическое исследование (метод бондирования)
40-60
10:
FISH (флюоресцентная in situ
гибридизация)
25-35
10 2 10 -'
Определение плоидности
хромосом
5-25
10
Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) на выявление
транслокаций
10-30
10 4 -10<-
Выявление экспрессии генов
иммуноглобулинов (Ig) и
Т-клеточных рецепторов
(TCR) с помощью иммуноблотинга (Southern blotting)
>90
10-
40-60
10 3 -10 о
ПЦР на выявление генов IgH
>90
10 ' - 1 0 '•'
Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии
35
10 4
30-50
10-
10-20
10 --10 3
<5
10-
Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) на выявление
транслокаций и TALI делеций
25 35
10 4 -10 "
Выявление экспрессии генов
иммуноглобулинов (Ig) и
Т-клеточных рецепторов
(TCR) с помощью иммуноблотинга (Southern blotting)
90-95
10-
Форма острого
лейкоза
Метод
диагностики
В-линейные
ОЛЛ
ПЦР на выявление генов
TCRy и TCR5
Т-линейные Цитогенетическое исследование (метод бондирования)
ОЛЛ
FISH (флюоресцентная in situ
гибридизация)
Определение плоидности
хромосом
:
127
Глава 1 б. Острые лейкозы
Продолжение таб. шцы 22
Форма острого
.(ей ко за
Метол
диагностики
Т-линейные ПЦР на выявление генов
TCRy и TCR8
ОЛЛ
ПЦР на выявление генов IgH
онлл
Возможность
выявления
резидуальных
клеток. %
Чувствительность
метода
40- 60
10 -МО
>90
s
Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии
90-95
10 М О 6
10 4
Цитогенетическое исследование (метол бонлирования)
50-60
10-
FISH (флюоресцентная in situ
i ибридизация)
40-60
10 М О
Метод полимеразной цепной
реакции (ПЦР) на выявление
транслокаций
20-30
10 -^ 10 6
Иммунофенотипирование метолом проточной цитометрии
35
10->
;
Наиболее быстрый и простой способ определения резидуальной болезни — метод проточной цитометрии. В основе метода лежит выявление клеток с комбинацией клеточных маркеров, которые были экспрессированы на лейкозных клетках. В ряде случаев — это необычная комбинация и выраженность экспрессии
антигенов, в других — выявление аберрантной экспрессии антигенов, не характерных для клеточной линии дифференцировки. Наибольшую ценность метод проточной цитометрии имеет при Т-линейных ОЛЛ, так как возможность его применения составляет 90%.
Для диагностики минимальной резидуальной болезни наиболее
информативны следующие иммунофенотипические комбинации
клеточных маркеров: для Т-линейных ОЛЛ — TdT/цитоплазматический CD3; В-линейных ОЛЛ - TdT-CD10 (или CD19-CD34)/
CD13, TdT-CD10 (или CD19-CD34)/CD33, TdT-CD10 (или CD19CD34)/CDw65, TdT-CD10 (или CD19-CD34)/CD21, TdT-CDlO
(или CD19-CD34)/CD56, TdT/цитоплазматический u/CD34;
ОНЛЛ - CD34/CD56, CDw65/CD34/TdT.
Наиболее чувствительным при острых лейкозах в диагностике
резидуальной болезни является метод полимеразной цепной реакции. Количественное определение остаточных лейкозных клеток
после проведения терапии индукции ремиссии, консолидации ремиссии и ранней интенсификации — основа выработки стратегии
и тактики лечения больных острым лейкозом. Невозможность выявления с помощью молекулярно-биологических методов иссле-
428
Часть 2. Клиническая гематология
дования лейкозных клеток является основным критерием прекращения лечения и установления факта выздоровления больного от
лейкоза.
Лечение. Успехи химиотерапии (XT), достигнутые в последние
годы, позволяют добиваться полной ремиссии (ПР) у страдающих
острыми лейкозами. Так, ПР у больных острыми нелимфобластными лейкозами составляет 50-85%, а острыми лимфобластными
лейкозами — 70-93%. Однако у 60-80% больных, достигших ПР,
развивается рецидив заболевания, что обусловлено сохранением
резистентного к проводимой XT лейкозного клона и развитием
вторичной резистентности бластных клеток к цитостатическому
воздействию. У 30-50% больных ОН Л Л и 7-32% ОЛЛ достичь
ПР не удается. У 4-18% пациентов имеется резистентность бластных клеток к химеопрепаратам. У 4-30% пациентов токсические
осложнения XT и осложнения, связанные с лейкозным процессом,
вызывают раннюю смерть (PC). Поэтому совершенствование терапии ОЛ в последнее время связывают с интенсификацией XT на
этапе ИНДУКЦИИ ремиссии и постремиссионного лечения, направленной на преодоление первичной резистентности бластных клеток и профилактику развития вторичной, а также с улучшением
терапии поддержки, обеспечивающей снижение показателя ранней смерти. В настоящее время установлена прямая зависимость
между количеством резидуальных лейкозных клеток в костном
мозге после достижения гематологической ремиссии и последующим развитием рецидива. При применении высокодозной химиотерапии и трансплантации стволовых клеток (ТСК) количество
резидуальных бластных клеток в организме может снижаться до
уровня <10\ что обеспечивает возможность последующего иммунного контроля над лейкозным процессом. В связи с этим в последнее время активно изучают возможности применения иммунотерапии на этапе лечения резидуальной бо'лезни.
Интенсификация XT лимитирована риском развития необратимой миелотоксичности. В связи с этим в настоящее время в лечении острых лейкозов активно используют трансплантацию аутологичных или аллогенных гемопоэтических клеток костного мозга
и периферической крови, которые позволяют использовать летальные и сублетальные дозы химио-, лучевой терапии без развития
необратимой миелотоксичности. При выполнении аллогенной
трансплантации стволовых клеток возможна также реакция —
трансплантат против лейкоза, оказывающая дополнительное иммунологическое воздействие на лейкозные клетки. Применение в
процессе проведения высокодозной химиотерапии ростовых фак-
Глава 16. Острые лейкозы
429
торов (нейпоген, граноцит, лейкомакс) позволяет сократить период постцитостатического агранулоцитоза и за счет этого уменьшить частоту инфекционных осложнений. Принципиальное значение для эффективного лечения ОЛ имеет программное лечение,
то есть проведение поэтапной полихимиотерапии с соблюдением
доз и интервалов введения химиопрепаратов. Причем лечение ОЛ
должно включать следующие этапы: индукция ремиссии, консолидация ремиссии, терапии в ремиссии, включающая раннюю и позднюю интенсификацию лечения.
Химиотерапия острых нелимфобластных лейкозов. Основой лечения ОНЛЛ на этапе индукции и консолидации ремиссии
является комбинация цитозин-арабинозида (цитозара) и антрациклиновых антибиотиков. В настоящее время эмпирическим путем на основе крупных рандомизированных клинических исследований установлены оптимальные дозы и режимы введения этих
препаратов. Так, Cancer and Leukemia Group В (CALGB) в 80-х гг.
установила, что 3-дневное введение даунорубицина более эффективно, чем 2-дневное, а 7-дневный курс химиотерапии цитозаром
более эффективен, чем 5-дневный, то есть программа «7 + 3>> более
эффективна, чем «5 + 2». Многочисленные рандомизированные и
нерандомизированные исследования в последующем показали, что
оптимальные разовые дозы цитарабина составляют 100-200 мг/м2,
а 2-кратное болюсное введение через 12 часов данной дозы по эффективности не уступает постоянному 24-часовому режиму введения. В отношении антрациклиновых антибиотиков сложилось мнение, что доза даунорубицина (рубомицина) у больных моложе
60 лет 45 мг/м2 более эффективна, чем 30 мг/м2. При остром про2
миелоцитарном лейкозе доза даунорубицина 60 мг/м эффектив2
нее, чем 45 мг/м .
Эффективность различных схем химиотерапии больных ОНЛЛ
представлена в табл. 23. По данным разных авторов, применение
стандартной программы «7 + 3» с использованием даунорубицина
позволяет достигать ПР в 58-72% случаев. Добавление к стандартной программе «7 + 3» этопозида (вепезида), замена рубомицина
или доксорубицина препаратами второй линии терапии — митоксантроном или идарубицином, не увеличивает значимо .процент
больных, достигших ремиссии. Некоторая закономерность в увеличении эффективности лечения отмечается при наращивании разовых и курсовых доз цитозара и а?1трациклиновых антибиотиков,
что имеет место при применении программ ТАД-9, «10 + 3»,
ЦРОМП. Это подтверждают данные и о меньшей эффективности
XT больных ОНЛЛ при уменьшении рекомендуемых в програм-
Часть 2. Клиническая гематология
430
мах доз цитостатических препаратов. Редукция доз химиопрепаратов на 30% снижает возможность достижения ПР на 30-50%. То
есть щадящий режим химиотерапии, обусловленный чаще всего
желанием врача снизить токсичность лечения и частоту осложнений на фоне тяжелого соматического статуса больного, приводит к
снижению эффективности терапии и становится щадящим прежде
всего для лейкозного процесса. В то же время чрезмерная интенсификация лечения на этапе индукции ремисии не сопровождается
увеличением частоты ПР, но увеличивает токсичность лечения.
Так, применение больших доз цитарабина (HidARC) в комбинации с антрациклиновыми антибиотиками приводило к достижению ПР только у 55% больных ОНЛЛ (Weick J. H. et al, 1996).
Таблица 23
Эффективность различных схем химиотерапии
на этапе индукции ремиссии
острыми нелимфобластными лейкозами
7 + 3 (цитозар 100 мг/м2 х
2 раза в/ в. 1-7-й день: рубомицин 45 мг/м2, в/в, 1 3-й
день)
62
10
16
Ранняя
смерть,
%
12
7 + 3 + 7 (цитозар 100 мг/м:
х 2 раза в/в, 1-7-й день: доксорубицин 60 мг/м2, в/в. 1
3-й день этопозид 70 мг/м:,
в/в. 1-7-й день)
64
8
12
16
DAT (цитозар 100 мг/м- х
2 раза в/в. 1 7-й день: даунорубицин 45 мг/м2, в/в. 1
3-й день; 6-тиогуанин 100 мг
х 2 раза. 1-7-й день)
83
ADE (цитозар 100 мг/м2 х
2 раза в/в. 1 10-й день: даунорубицин 50 мг/м2. в/в, 13-й день: этопозид 70 мг/м2.
в/в. 1-5-й день)
85
7 + 3 с идарубицином(цитозар 200 мг/м2, в/в. 1-7-й
день; идарубицин 12 мг/м2.
в/в. 1-3-й день)
71
15
14
7 + 3 с митоксантроном(цитозар 200 мг/м2, в/в, 1-7-й
день: митоксантрон
12 мг/м2. в/в, 1-3-й день)
78
10
12
Программа
Полная
ремиссия.
Частичная Резистентность
ремиссия. к химиотерапии.
131
Глава 16. Острые лейкозы
Продолжение таблицы 23
Программа
Полная
ремиссия,
%
Частичная Резистентность
ремиссия, к химиотерапии,
%
%
24
Ранняя
смерть,
%
8 + 5 + 5 (цитозар 100 мг/м2,
в/в. 1-8-й день; митоксантрон 10 мг/м2, в/в, 4-8-й
день; этопозид 100 мг/м2,
в/в. 4—8-й день)
58
ТАД-9 (6-тиогуанин
100 мг/м2 х 2 раза. 3-9-й
день; цитозар 100 мг/м2, в/в,
круглосуточно, 1- 2-й день;
цитозар 100 мг/м2 х 2 раза
в/в. 3-9-й день; даунорубицин 60 мг/м2. в/в, 3-5-й
день)
74
16
10
10 + 3 (цитозар 200 мг/м2,
в/в, 1-10-й день; доксорубомицин 60 мг/м2. в/в.
1-3-й день)
80
8
12
ЦРОМ (цитозар 170 мг/м2.
в/в, 1-14-й день; рубомицин
30 мг/м2, в/в, 1,2,5,6,9. 10,
13, 14-й день; винкристин
0.5 мг, в/в, 1-4-й день;
6-меркптопурин 75 мг/м2.
1-14-й день)
81
9
10
HidAC (цитозар 2000 мг/м2
х 2 раза в/в, 1-6-й день;
даунорубицин 45 мг/м2, в/в,
7-9-й день)
55
HidAC (цитозар 3000 мг/м2
х 2 раза в/в, 1.3.5. 7-й день;
даунорубицин 45 мг/м2, в/в,
1—3-й день; этопозид
45 мг/м2, в/в. 1-7-й день)
71
18
16
Большой разброс данных об эффективности различных программ химиотерапии связан с неоднородностью ОНЛЛ и недостаточной представительностью сформированных групп. В связи с
этим особый интерес представляют данные наиболее крупных рандомизированных исследований, представленные в табл. 24.
Использование различных современных программ XT позволяет достигнуть ПР в среднем у 66-85% больных ОНЛЛ.
Исследования EORTC/GIMEMA AML8 и EORTC/GIMEMA
AML10 показали, что добавление на этапе индукции ремиссии к
432
Часть 2. Клиническая гематология
Таблица 24
Рандомизированные исследования
эффективности лечения больных
острыми нелимфобластными лейкозами
Группа
исследователей
(источник)
Выживаемость без лейкоза
(LFS) более 4 лет
Частота
в зависимости or ностполных
ЧССI BO
ремиссионного
лечения
больных, ремиссий,
(ХТ±АутоТСК/АллоТСК),
%
чел.
%
Kom-
Годы
EORTC/GIMEMA
AML8 (Zittoun R. A.
etal., 1995)
EORTC/GIMEMA
A ML 10(SuciuS.
etal., 2001)
1986 1991
941
66
33/46
1993-1999
2038
71
41/51
GOELAM
(Harousseau et al.,
1997)
1993-1997
517
71
38/44
MRCAML10 (Burnett A. K... etal..
2002)
1988-1996
1966
83
42/50
Кооперированная
группа —SWOG,
CALGB. ECOG
(Cassileth P. A. et al..
1999)
1990-1995
740
70
35/43
M R C A M L 12
(Wheatley K. etal..
2002)
1995-2002
3459
85
комбинации цитарабина с антрациклиновыми антибиотиками этопозида несколько увеличивает частоту достижения ремиссии (соответственно 66 и 71%), не влияет на показатели безрецидивной
выживаемости в случае применения на постремиссионном этапе
высокодозной химиотерапии и аутологичной ТСК, но сопровождается тенденцией к увеличению безрецидивной выживаемости в
случае выполнения аллогенной ТСК (соответственно 46 и 51,4%).
Исследование EORTC/GIMEMA AML8 впервые убедительно показало, что использование трансплантации стволовых клеток
(ТСК), как атлогенной, так и аутологичной, достоверно увеличивает показатели общей и безрецидивной выживаемости у больных
ОНЛЛ по сравнению с группой больных, получивших интенсифи2
кацию большими дозами цитарабина (16 г/м ) в комбинации с
амсакрином. Так, 4-летняя общая выживаемость больных ОНЛЛ,
Глава 16. Острые лейкозы
133
получивших XT, аутологичпую ТСК и аллогенную ТСК, составляла
соответственно 46, 56 и 59%, а безрецидивная выживаемость — 30,
48 и 46%. Дальнейшие исследования этой группы (EORTC/
GIMEMA AML10) убедительно показали преимущество аллогенной ТСК по сравнению с аутологичной ТСК. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в исследованных группах составляла соответственно 51,4 и 41,2%. Особенно значимо аллогенная ТСК влияла на выживаемость группы больных ОНЛЛ с плохим прогнозом.
Безрецидивная выживаемость больных после аутологичной и аллогенной ТСК характеризовалась соответственно 19 и 43,2%.
Кооперированная группа (SWOG, CALGB, ECOG) показала,
что замена даунорубицина на идарубицин в программе индукции
ремиссии не приводит к увеличению частоты ПР. Даже в группе
относительно молодых пациентов (16-55 лет) частота ПР составила 70%. Данное исследование продемонстрировало недостаточную
эффективность использования средних доз цитарабина на этапе
консолидации ремисии и больших доз цитарабина (36 г/м-/курс)
на этапе ранней интенсификации для профилактики рецидивов
заболевания. Рецидив заболевания развился у 61% больных после
указанной химиотерапии, у 48% — после аутологичной ТСК и
29% — после аллогенной ТСК. Вместе с тем авторами отмечено,
что смерть, связанная с проведением аллогенной ТСК (25%), была
достоверно выше, чем с аутологичной ТСК (14%) или высокодозной XT (3%). Исследование продемонстрировало принципиальное преимущество ТСК перед химиотерапией в лечении резидуальной болезни при ОНЛЛ. Вместе с тем было показано, что в
настоящее время на высоком уровне находится сопроводительная
терапия при проведении высокодозной XT и недостаточно разработана сопроводительная при проведении аллогенной или аутологичной ТСК.
Таким образом, очевидно, что итог терапии ОЛ зависит не только от противоопухолевого эффекта цитостатических препаратов,
но и в значительной степени от успешной профилактики и лечения
осложнений, вызванных лейкозным процессом и противоопухолевой терапией. Существенную роль в комплексе терапии поддержки играет инфузионная терапия (ИТ). Проведение XT на фоне
сбалансированной ИТ, которая включает проведение умеренно
форсированного диуреза глюкозо-солевыми растворами из расчета 2,5 л/м2/сутки под контролем электролитов и КЩС крови, адекватную своевременную гемокопонентную терапию, полное парентеральное питание в период постцитостатического агранулоцитоза с одновременной стерилизацией кишечника неадсорбируемыми
434
Часть 2. Клиническая гематология
антибиотиками и профилактика вирусных, бактериальных и грибковых инфекций позволяет осуществить полную программу XT
без редукции доз у 91% больных ОНЛЛ. При отсутствии адекватной терапии поддержки полноценную XT удается провести только
у 70% больных ОНЛЛ. Это сопровождается снижением частоты
достижения ПР, показателей общей и безрецидивной выживаемости и увеличением показателя PC с 3-12 до 16-25%. Следовательно, инфузионная терапия, как часть терапии поддержки, является
обязательным компонентом лечения больных ОНЛЛ.
В процессе проведения терапии индукции и на последующих
этапах лечения больным с М4Э вариантом ОНЛЛ (острым миеломонобластным лейкозом с патологической эозинофилией) и больным с монобластным лейкозом проводится профилактика нейролейкоза. В каждый курс XT обязательно включают эндолюмбальное введение метотрексата — 15 мг, цитозара — 20 мг/м 2 и
дексаметазона — 4 мг.
При достижении ПР после курсов индукции ремиссии проводят курсы консолидации ремиссии. До сих пор отсутствует единое
мнение о том, какой интенсивности должно быть лечение на этом
этапе. Ряд исследователей считают необходимым объединять этапы консолидации и ранней интенсификации и сразу после достижения ПР проводить высокодозную терапию с использованием
средних и больших доз цитарабина. Проведение после одного-двух
индукционных курсов «7 + 3» двух курсов консолидации ремиссии «5 + 2» не обеспечивает достаточной элиминации лейкозного
клона. При этом у 70-90% больных развивается рецидив заболевания. Использование в качестве консолидирующих курсов программ
XT, обеспечивших достижение ПР (например, «7 + 3»), или высокодозной XT, включающей большие дозы цитозара в комбинации с
митоксантроном (например, программа «НАМ»), более эффективно, но сопровождается высокой токсичностью лечения, прежде всего миелотоксичностыо, и риском развития летальных осложнений.
Попытки использовать индукционную программу «7 + 3» на этапе
консолидации и дальнейшего постремиссионного лечения не сопровождаются достоверным увеличением показателей общей и безрецидивной выживаемости.
Большинство исследователей в настоящее время склоняются к
тому, что на этапе консолидации необходимо либо увеличивать но
сравнению с индукционным курсом дозы цитозин-арабинозида,
либо вводить в программу новые цитостатические препараты. Основные программы, используемые на этапе консолидации ремиссии, представлены в табл. 25.
Глава 16. Острые лейкозы
Таблица 25
Программы химиотерапии больных
острыми нелимфобластными лейкозами
на этапе консолидации ремиссии
Программа лечения,
препарат
Способ
введения •
ДЧна,
мг/м2
Дни
введении
НАМ:
цитозин-арабшюзид
митоксантрон
В/в
В/в
3000 х 2
10
1 3-й
3-5-й
5 + 2 + 5:
цитозин-арабинозид
руоомицин
этопозит
В/в
В/в
В/в
100x2
45
75
1-5-й
1-2-й
1-5-й
HidARA-C:
цитозин-арабинозид
В/в
3000 х 2
1.3.5.7-й
В/в
В/в
В/в
100
200
100
1-5-й
1-5-й
3-9-й
В/в
В/в
1000 х 2
45
1 5-й
1-3-й
MidAC:
Митоксантрон
цитозин-арабинозид
В/в
В/в
10
1000x2
1 5-й
1-3-й
HidARA-C + идарубицин:
цитозин-арабинозид
идарубицин
В/в
В/в
2000 х 2
8
1,3.5.7-й
2. 4-й
В/в
В/в
100 х 2
45
100
1-7-й
1-3-й
1 7-й
МАСЕ:
амсакрин
цитозин-арабинозид
этопозит
5 + 3:
цитозин-арабинозид
даунорубицин
DAT:
цитозин-арабинозид
даунорубицин
6-тиогуанин
Примечание. Р. о.
P.O.
per os: i
внутривенно.
Если планировать в дальнейшем этап ранней интенсификации
лечения, то оптимальным является использование на этапе консолидации ремиссии двух программ «5 + 2 + 5».
Программа хорошо переносится больными (PC = 0), но в 100%
случаев вызывает отсроченный агранулоцитоз и тромбоцитопению.
После достижения клинико-гематологической ремиссии заболевания и проведения курсов консолидации ремиссии наступает
второй этап — лечение резидуалыюй болезни ОНЛЛ. При этом
используют два компонента лечения: проведение ежемесячных курсов поддержания ремиссии по ротирующей схеме и курсов ранней
http://www.bestmedbook.com/
436
Часть 2. Клиническая гематология
и поздней интенсификации лечения. При планировании проведения аллогенпой родственной HLA-совместимой ТСК курсы консолидации ремиссии и интенсификации лечения можно не проводить и сразу после достижения ремиссии выполнять трансплантацию (Tallman M. S. et al, 2000). При планировании аутологичной
ТСК обязательным компонентом лечения является проведение
курсов консолидации и ранней интенсификации лечения для максимальной очистки трансплантата in vivo (Suciu S. et al.. 2001).
При проведении терапии ОНЛЛ без этапа ТСК желательно выполнение всех этапов лечения: индукция и консолидация ремиссии, ранняя и поздняя интенсификация и длительная терапия
поддержания ремиссии. Хотя в настоящее время последний компонент лечения многие авторы не используют и предлагают программы лечения, предусматривающие прекращение терапии ОНЛЛ
после проведения 4-8 курсов химиотерапии (Wheat ley К. et al.,
2002).
Проведение ранней интенсификации лечения (в первые 3-6 месяцев ПР) большими дозами цитозара с последующей терапией
поддержания ремиссии в течение 1-2 лет увеличивает эффективность лечения и обеспечивает пятилетнюю безрецидивную выживаемость больных ОНЛЛ на уровне 30-40%. Рецидив заболевания
при этом развивается в среднем у 60% больных. Для проведения
ранней интенсификации лечения могут быть рекомендованы следующие программы XT.
1. Цитозар 1 г/.м2, в/в через 12 ч. 1-5-й дни; митоксантрон
12 мг/м2, в/в, 1-3-й дни.
2. Цитозар 0,5 г/м2, в/в, в виде непрерывной инфузии, 1-4-й
дни; вепезид 100 мг/м2, в/в, 1-4-й дни.
2
2
3. Цнтозар 1 г/м , через 12 ч, 1-5-й дни; митоксантрон 12 мг/м ,
2
в/в, 1-3-й дни; вепезид 200 мг/м , в/в, 6-8-й дни.
4. Цитозар 1 г/м2, в/в каждые 12 ч, 1-4 дни; рубомицин 60 мг/м2,
в/в, 4-й или 5-й день.
5. Цитозар 1 г/ м2, в/в, каждые 12 ч, 1-5-й дни; идарубицин
12 мг/м2, в/в, 1-3-й дни.
Кроме того, могут быть использованы программы химиотерапии, применяемые на этапе консолидации ремиссии с использованием больших и средних доз цитозин-арабинозида (см. табл. 25).
Проведение поздней интенсификации лечения ОНЛЛ (через
9-12 месяцев после достижения ПР) с помощью больших доз цитозара увеличивает эффективность лечения и позволяет обеспечить 5-летнюю безрецидивную выживаемость на уровне 40-50%,
при этом рецидив заболевания развивается только у 40% больных.
Глава 16. Острые лейкозы
437
Проведение этапа поздней интенсификации лечения позволяет ограничиться длительностью проведения терапии поддержания ремиссии в один год. Для проведения поздней интенсификации лечения может использоваться одна из приведенных схем, включающих большие и средние дозы цитозара. В группе больных ОНЛЛ
старше 50 лет рекомендуется не использовать разовые дозы цитозара выше 1 г/м2, в то же время у лиц моложе 40 лет разовые дозы
цитарабина могут быть увеличены до 2-3 г/м2.
Таким образом, проведение каждого последующего этана интенсификации приводит к снижению риска рецидива заболевания.
Это позволяет рекомендовать ранний и поздний этапы интенсификации лечения ОНЛЛ в ремиссии.
При проведении терапии поддержания ремиссии с помощью
5-дневных курсов XT, основанных на комбинации цитозара с одним из цитостатических препаратов, по ротирующей схеме без этапов интенсификации лечения показатель общей 5-летней безрецидивной выживаемости больных ОНЛЛ не превышает 10%. То есть
у 90% больных стандартная терапия поддержания ремиссии не
предотвращает развитие рецидива заболевания, что связано с резистентностью резидуальных лейкозных клеток к стандартным
дозам цптостатическнх препаратов. В дополнение к этапам интенсификации лечения, особенно в группе пожилых пациентов (старше 50 лет), у которых программы химиотерапии не предусматривали применение больших доз цитозара, может быть показано проведение иммунотерапии интерлейкином 2 или ос-интерфероном, а
также выполнение родственной аллогенной трансплантации с использованием немиелоаблативных режимов кондиционирования.
Примерная схема стандартной терапии поддержания ремиссии
ОНЛЛ состоит в последовательном применении 5-дневных программ XT каждые 4 недели.
1. Цитозар 100 мг/м2, в/в каждые 12 ч, 1-5-й дни; рубомицин
2
40 мг/м , в/в, 1-2-й дни.
2. Цитозар 100 мг/м2, в/в каждые 12 ч, 1 -5-й дни; 6-меркаптопурин 100 мг/м2, 1-5-й дни.
3. Цитозар 100 мг/м2, в/в каждые 12 ч, 1-5-й дни; 6-тиогуанин
100 мг/м2, 1-5-й дни.
2
4. Цитозар 100 мг/м , в/в каждые 12 ч, 1-5-й дни; циклофосфан
2
1000 мг/м , в/в, 1-й день.
5. Цитозар 100 мг/м2, в/в каждые 12 ч, 1-5-й дни; белустин
2
75 мг/м , 1-й день.
2
6. Цитозар 100 мг/м , в/в каждые 12 ч, 1-5-й дни; винкристин
2 мгв/в, 1-й день.
438
Часть 2. Клиническая гематология
Таким образом, совершенствование лечения больных ОНЛЛ
в настоящее время возможно за счет усиления стандартной комбинации цитозин-арабинозид + антрациклиновые антибиотики дополнительными химиопрепаратами на этане индукции ремиссии,
интенсификация постремиссионной химиотерапии у лиц моложе
50 лет за счет раннего применения больших и средних доз цитозин-арабинозида и активное использование трансплантации гемопоэтичеекпх стволовых клеток.
Ниже представлены основные протоколы лечения ОНЛЛ.
Протокол CALGB(CIUA)
Индукция ремиссии: 7 + 3(1 курс).
Консолидация ремиссии: большие дозы цитозара (4 курса).
Терапия поддержания ремиссии — 5 + 2 (4 курса).
Протокол TAD/HAM {Германия)
Индукция ремиссии: TAD (1 курс), НАМ (1 курс), начало на
21-й день после TAD.
Консолидация ремиссии: TAD (1 курс), SHAM (1 курс: в случае
проведения курсов поддержания ремиссии может быть исключен).
Терапия поддержания ремиссии: 5 + 2. 5 -+- циклофосфамид, 5 +
6-МП (3 года).
Протокол MRC10AML {Великобритания)
Индукция ремиссии: ADE (2 курса) или DAT (2 курса).
Консолидация ремиссии: МАСЕ (1 курс), MidAC (1 курс).
Терапия поддержания ремиссии: не проводится.
Протокол ALSG {Австралия)
1-й вариант
Индукция ремиссии: 7 + 3 + 7(1-2 курса).
Консолидация ремиссии: 5 + 2 + 5 (2 курса).
Терапия поддержания ремиссии: 5 + 6-тиогуанин (в течение
2 лет).
2-й вариант
Индукция ремиссии: Hid АС 3 + 7(1-2 курса).
Консолидация ремиссии: 5 + 2 + 5 (2 курса).
Терапия поддержания ремиссии: 5 + 6-тиогуанин (в течение
2 лет).
Протокол ГНЦ РАМН (01/99) (Россия)
1-й вариант
Индукция ремиссии: 7 + 3 ( 1 - 2 курса: доза даунорубишша 60 мг/м2/сутки).
Глава 16. Острые лейкозы
439
Консолидация ремиссии: DidAC (2 курса).
Терапия поддержания ремиссии не проводится.
2-й вариант
Индукция ремиссии: 7 + 3 ( 1 - 2 курса; доза даунорубицина 60 мг/м2/сутки).
Консолидация ремиссии: 7 + 3(1-2 курса).
Терапия поддержания ремиссии: 7 + 3(1 год).
Протокол ГНЦ РАМН (01/01) (Россия)
1-й вариант
Индукция ремиссии: 7 + 3 + 5 (2 курса; введение этопозида
в дозе 120 мт/м2 на 17-21-й день от начала программы).
Консолидация ремиссии: 7 + 3 + 5(2 курса).
Терапия поддержания ремиссии: 7 + 3 с 6-тпогуанином в течение года П Р.
Протокол РосНИИГиТМЗРФ (Россия)
1-й вариант
Индукция ремиссии: ЦРОМ (1 курс).
Консолидация ремиссии: 5 + 2 + 5 (2 курса).
Ранняя интенсификация: 5 + 3 (средние дозы цитозара + митоксантрон/идарубицин).
Терапия поддержания ремиссии: по ротирующей схеме в течение года ПР*.
Поздняя интенсификация: 5 + 3 (средние дозы цитозара + идарубицин/митоксантрон).
2-й вариант
Индукция ремиссии: 7 + 3 с идарубицином (1-2 курса).
Консолидация ремиссии: 5 + 2 + 5 (2 курса).
Ранняя интенсификация: 5 + 3 (средние дозы цитозара + митоксантрон/идарубици н ).
Терапия поддержания ремиссии: но ротирующей схеме в течение года ПР*.
Поздняя интенсификация: 5 + 3 (средние дозы цитозара + идарубицин/митоксантрон).
Отдельного рассмотрения требует терапия больных острым промиелоцитарным лейкозом (МЗ варианта по ФАБ-классификации).
* При наличии HLA-совместимого родственного донора после этапа ранней
интенсификации выполняется аллогенная трансплантация стволовых клеток.
При отсутствии донора и отсутствии противопоказаний через 6 месяцев терапии в ремиссии выполняется аутологичная трансплантация стволовых клеток.
В этом случае дальнейшее лечение не проводится.
440
Часть 2. Клиническая гематология
До недавнего времени 30-40% больных острым промиелоцитарным лейкозом погибало в процессе проведения индукционной
химиотерапии, причем преимущественно от геморрагических
осложнений. Внедрение в программу лечения гепаринотерапии,
активной заместительной терапии свежезамороженной плазмой позволило несколько уменьшить летальность, но частота достижения ремиссии при использовании программы «1 + 3» оставалась
на уровне 44-70%. Оптимальной разовой дозой рубомицина при
проведении индукционной терапии считалась доза 60 мг/м2. Программа лечения выглядела следующим образом: индукция ремиссии проводилась с помощью 1—3 программ «7 + 3» с применением
рубомицина в дозе 60 мг/м2, консолидация ремиссии проводилась
2 курсами данной программы с использованием рубомицина в дозе
45 мг/м2. В дальнейшем терапия поддержания ремиссии проводилась по ротирующей схеме, но без использования антрациклиновых антибиотиков, так как суммарная доза рубомицина после индукции и консолидации превышала 600 мг/м2. В случае достижения ПР безрецидивная 5-летняя выживаемость больных острым
промиелоцитарным лейкозом не превышала в среднем 30%.
Внедрение в терапию данной категории больных производных
транеретиноевой кислоты (АТРА) в корне изменило ситуацию. Проведение индукционного курса «7 + 3» в комбинации с АТРА в дозе
45 мг/м2 позволило достигать ПР у 85-95% больных острым промиелоцитарным лейкозом и добиться 3-5-летней безрецидивной
выживаемости на уровне 63-80%. В России используется препарат АТРА-Весаноид. Методика применения АТРА зависит от исходного лейкоцитоза у больного. Если на момент начала терапии
количество лейкоцитов менее 5 х 10''/л, то терапию сначала проводят только препаратом АТРА, а затем присоединяют химиотера9
пию. В случае исходного количества лейкоцитов > 5,0 х 10 /л параллельно с АТРА проводят программу «7 + 3». После достижения
ремиссии применяют 2 курса консолидации ремиссии, а затем в
течение 2 лет проводится терапия 6-меркаптопурин + метотрексат
(как при острых лимфобластных лейкозах) с курсами АТРА (45 мг/
2
м /сутки), которые длятся в течение 15 дней каждые 3 месяца.
Следует отметить и экономическую целесообразность использования препаратов АТРА в терапии острых промиелоцитарных лейкозов. На фоне терапии АТРА в период индукции ремиссии в среднем в 3 раза уменьшается расход компонентов крови и в 1,5 раза —
антибактериальных препаратов.
Одним из способов лечения резидуальной болезни при ОНЛЛ
является проведение иммунотерапии препаратами: а.,-интсрферо-
Глава 16. Острые лейкозы
441
на (роферон, интрон А, реаферон и пр.), индукторами интерферонов (циклоферон и др.), препаратами интерлейкина 2 (пролейкин
и ронколейкин). Проведение иммунотерапии показано больным
ОНЛЛ (достигшим гематологической ремисии, но не достигшим
цитогенетической ремиссии) при наличии относительной резистентности резидуального лейкозного клона к химиотерапии, после
аутологичной ТСК без очистки костного мозга и с факторами риска рецидива заболевания.
При наличии резистентности к проводимой терапии индукции
ремиссии или развитии рецидива заболевания наиболее эффективны программы XT, основанные на применении больших доз
цитозара и таких препаратов, как митоксантрон, идарубицин и флударабин. Применение данных программ позволяет достигнуть ПР
у 30-40% больных с резистентными формами ОНЛЛ. Учитывая
высокий риск раннего рецидива заболевания у этой категории больных наиболее перспективным является выполнение аллогенной
ТСК. Особенно обнадеживающим методом лечения можно считать использование аллогенных стволовых клеток после немиелоаблативных (иммуносупрессивных) режимов кондиционирования
с последующей терапией донорскими лимфоцитами.
К новым технологиям лечения резистентных форм ОНЛЛ следует отнести клиническое применение моноклональных антител.
Так, применение антител к CD45* лейкоцитам, нагруженных радиоактивным йодом, в программах подготовки к аллогенной ТСК
позволяет добиваться ПР у 30% химорезистентных больных острым лейкозом (Mathews D. С. et al., 2000).
Химиотерапия больных острыми лимфобластными лейкозами. Химиотерапия больных ОЛЛ основана на поэтапном проведении курсов индукции, консолидации ремиссии, терапии поддержания ремиссии, интенсификации лечения. При наличии факторов риска рецидива больным может быть показана трансплантация
стволовых гемопоэтических клеток.
Интенсивная полихимиотерапия на этапе индукции ремиссии
позволяет в настоящее время достигать полной ремиссии у 7591% взрослых и у 85-100% детей. В табл. 26 представлены результаты наиболее крупных рандомизированных исследований но оценке эффективности лечения больных ОЛЛ взрослого возраста.
Анализ эффективности лечения больных ОЛЛ показал, что в
течение последних 10 лет частота достижения ПР у больных ОЛЛ
существенно не увеличилась и составляет в среднем 82%, причем
от 28 до 39% больных в настоящее время могут рассчитывать на
длительную безрецидивную выживаемость.
Часть 2. Клиническая гематология
442
Таблица 26
Рандомизированные исследования
эффективности лечения больных
острыми лимфобластными лейкозами
Группа исследователей
(источник)
Год
Количество Частота полбольных, ных ремиссий,
чел.
%
Выживаемость
без лейкоза
(LFS) (период
наблюдения), %
GMALL 84 (Hoelzer D. et
al., 1993)
1993
562
75
39 (7-летний)
FGTALL (Thiebaut A. ct
al., 2000)
1993
581
76
30 (10-летний)
MRC-UKALL XA (Durrant I. J. et al., 1997)
CALGB (Larson R. A.
etal., 1998)
MRC/ECOG(RoweJ. M.
et al.. 1999)
1997
618
82
28 (5-летний)
1998
198
85
36 (4-летний)
1999
920
89
Нет данных
MDACC (Kantarjian H. M.
et al.. 2000)
2000
204
91
38 (5-летний)
GMALL 93 (Gokbuget N.
etal., 2001)
2001
1163
83
Нет данных
GIMEMA 88 (Annino L.
etal., 2002)
2002
794
82
29 (9-летний)
Основой химиотерапии на этапе индукции ремиссии больных
острыми лимфобластными лейкозами остается комбинация винкристина, преднизолона, антрациклиновых антибиотиков, L-acnaрагиназы и циклофосфамида в виде различных схем-«пролонг»
или «блоков» (Савченко В. Г. и др., 1997; Bassan R. et al., 1992;
Durrani I. J. et al., 1997). Некоторые протоколы лечения включают
цитозин-арабинозид, 6-меркаптопурин, этопозид и его аналоги, а
также метотрексат. Оптимальная комбинация перечисленных цитостатических препаратов и их доз до сих пор не определена, поэтому для лечения ОЛЛ используют большое количество схем и
программ лечения. Большинство авторов индукцию ремиссии проводят без учета иммунофенотипа бластных клеток, используя унифицированные протоколы терапии. Германские исследователи
BFM пытаются проводить лечение с учетом иммунофенотипа лимфобластов и групп риска. В целом результаты лечения при этих
двух принципиальных подходах к терапии ОЛЛ схожи. Так, по
результатам рандомизированного итальянского исследования
GIMEMA ALL 0288, частота достижения полных ремиссий (ПР)
при использовании унифицированного протокола при В- и Т-ли-
Глава 16. Острые лейкозы
443
нейных ОЛЛ составила соответственно 83 и 85% (Amino L. et al..
2002). что соответствует результатам BFM-группы.
Ключевую роль в терапии ОЛЛ на этапе индукции ремиссии
имеет не сверхинтенсивное химиотерапевтическое воздействие, а
проведение пролонгированного .течения, то есть длительное воздействие на лейкозный клон комбинацией преднизолона, даунорубицина, винкристина, что убедительно продемонстрировали Hoelzer D.
и соавторы (1978). Короткие курсы химиотерапии («ВРП», «7 + 3»)
позволяют достигать ПР в среднем только у 50% больных ОЛЛ.
Минимальная длительность индукционного курса при ОЛЛ не должна быть менее 35 дней (Моисеев С. И. и др., 2001).
Одним из самых важных прогностических факторов у больных
ОЛЛ является наличие чувствительности лейкозного клона к глюкокортикоидам. Причем прогностическая значимость чувствительности к глюкокортикоидам сказывается как при оценке ответа на
их применение на этапе префазы, так и скорости снижения бластных клеток в крови и костном мозге на 5, 7 и 14-й день лечения
(Amino L. et al., 2002). В связи с этим все используемые в настоящее время схемы индукционного лечення включают глюкокортикоиды. Стандартными считаются дозы преднизолона 40-60 мг/м2/
сутки, но наиболее оптимальной дозой является 60 мг/м2/сутки.
Ряд авторов предлагают для усиления системного противолейкозного эффекта, а также для большей санации центральной нервной
системы заменять в схемах лечения преднизолон на дексаметазон,
что позволяет достичь полной ремиссии у 67-91% больных ОЛЛ
(Савченко В. Г. и др., 2001; Kantarjan H. M. et al., 2000). Однако
включение в протокол лечения больших доз дексаметазона, даже
если он используется в прерывистом режиме, как в схеме «3 х 3»,
предложенной ГНЦ РАМН, сопровождается увеличением частоты
тяжелых инфекционных осложнений до 95%.
Антрациклиновые антибиотики являются необходимым компонентом терапии ОЛЛ на этапе индукции ремиссии и существенным фактором, влияющим на частоту ПР (Bassan R. et al., 1996).
Если ранее антрациклины в программах «ВРП» использовали в до2
2
зе 25-40 мг/м раз в неделю с курсовой дозой 75-120 мг/м , то в
последние годы имеется тенденция к увеличению разовых и курсовых доз препаратов этой группы до 40-60 и даже 80-90 мг/м2/
сутки, а также 180-270 мг/м2 на курс с возможностью достижения
ремиссии у 93% больных ОЛЛ (Todeshmi G. et al., 1998).
Роль включения в протоколы лечения ОЛЛ на этапе индукции
ремиссии циклофосфамида до сих пор окончательно не установлена. Традиционно считается, что при Т-линейных ОЛЛ включение
444
Часть 2. Клиническая гематология
в схемы лечения циклофосфамида и цитозин-арабинозида увеличивает частоту ремиссий (Hoelzer D. et al., 1990). Однако последнее рандомизированное исследование, проведенное GIMEMA ALL
0288. показало отсутствие влияния добавления в протокол индукционной терапии циклофосфамида на частоту достижения ремис1
сии и показатели обшей и безрецидивной выживаемости.
Уже около 20 лет обсуждается значение включения L-acnapaniназы в терапию индукции ремиссии ОЛЛ. Данный препарат при
незначительном влиянии на частоту достижения ремиссии достоверно увеличивает продолжительность ремиссии. Эффективность
применения L-аспарагиназы определяется фармакокннетикой препарата. Использование L-аспарагиназы, полученной из Е. coli, с периодом полувыведения 1,2 дня (- 28 часов) позволяет обеспечить
6-летнюю безрецидивную выживаемость у больных ОЛЛ детского
возраста на уровне 73,4%, в то время как использование L-аспарагиназы Erwinia с периодом полувыведения 0,6 дней
на уровне
59,8% (Duval M. et al., 2002).
До сих пор отсутствует единое мнение о значимости курсов
консолидации ремиссии, длительной XT поддержания ремиссии,
этапов ранней и поздней интенсификации лечения в постремиссионной терапии больных ОЛЛ. Часть рандомизированных исследований показали положительную роль курсов консолидации ремиссии в длительном сохранении ПР: при отсутствии этого этапа лечения 3-летняя безрецидивная выживаемость снижалась с 38 до
0% (Guyotat D. et al., 1990). В то же время кооперированные исследования GALGB и GIMEMA (Mandelli F. et al.. 1989: Ellison R. R.
et al., 1991) не подтвердили значения этого этапа лечения для выживаемости больных ОЛЛ. Попытки не использовать поддерживающую терапию после индукции и консолидации ремиссии приводят к достоверному снижению безрецидивной выживаемости
больных ОЛЛ (Cassileth P. A. et al., 1990; Cuttner J. et al., 1991).
При возможности отслеживания количества резидуальных лейкозных клеток после курсов индукции и консолидации ремиссии
необходимость проведения этапа ранней интенсификации лечения может решаться индивидуально, что позволит избежать избыточности химиотераневтического воздействия на этапе постремиссионного лечения и снизить риск развития вторичных неоплазий
у больных ОЛЛ. Группу высокого риска ОЛЛ, нуждающуюся в
проведении высокодозной химиотерапии, составляют пациенты,
у которых время достижения гематологической ремиссии превы!
шает 2-4 недели, число резидуальных клеток — более 10 - 10 ', а
после курса консолидации — более 10 ' (Hoelzer D., 2000).
Глава 16. Острые лейкозы
445
При схожем мнении многих авторов о целесообразности проведения длительной (от 2 до 5 лет) терапии поддержания ремиссии
вопрос о целесообразности интенсификации постремиссионного
лечения остается открытым. Одни авторы считают, что при проведении достаточно интенсивной терапии на этапах индукции и консолидации ремиссии не требуется интенсификация лечения на стадии поддерживающей терапии (Mandelli F. et al., 1989), другие рассматривают интенсификацию лечения на этапе консолидации
ремиссии пли проведения поддерживающей терапии обязательным условием эффективного лечения больных ОЛЛ (Cassileth P. А.
et al.,' 1990; Hoelzer D., 1991. 1993: Smedmyr В. et al., 1991).
Эффективность стандартной поддерживающей XT может зависеть от вариантов и факторов риска ОЛЛ. Пациенты со стандартным риском рецидива, пре-В-формой ОЛЛ, РгГ/Ьсг-аЫ-негативные имеют улучшение результатов длительной безрецидивной выживаемости при поддерживающей терапии 6-меркаптопурином и
метотрексатом. При Т-форме ОЛЛ вопрос о ценности проведения
поддерживающей терапии остается открытым. В других вариантах
ОЛЛ эффективность поддерживающей терапии крайне низкая
(Hoelzer D., 1993). Остается открытым вопрос о длительности проведения терапии поддержания ремиссии, которая, по данным различных авторов, должна продолжаться от 3 месяцев до 3 лет
(Hoelzer D., 1996).
Возможно, вопрос о длительности терапии поддержания ремиссии должен решаться с точки зрения иммунологического варианта
ОЛЛ. Например, по данным GMALL (германской группы по изучению ОЛЛ), при common-варианте и пре-В-варианте ОЛЛ возможность рецидива сохраняется в течение 5-7 лет после достижения полной клинико-гематологической ремиссии, причем преимущественно развивается костномозговой рецидив. При зрелоклеточном В-ОЛЛ рецидив развивается в первые 2 года ПР1, и
возможен как костномозговой рецидив, так и нейролейкоз. При
Т-линейных ОЛЛ (ранний-Т-ОЛЛ, пре-Т-ОЛЛ, зрелоклеточный
Т-ОЛЛ) рецидивы могут возникать в течение 3-4 лет после достижения ПР1, причем возможны как костномозговые, так и экстрамедуллярные рецидивы. При пре-пре-В-ОЛЛ рецидивы заболевания могут развиваться в течение 5 лет.
О необходимости проведения иммунофенотипирования бластных клеток у больных ОЛЛ на этапе диагностики заболевания с
целью установления группы риска свидетельствуют данные D. Hoelzer (2002) о длительности безрецидивной выживаемости в зависимости от иммунофенотипа бластных клеток. Так, при про-В-
446
Часть
2.
Клиническая
гематология
ОЛЛ длительной выживаемости без лейкоза удается добиться у 4050% больных ОЛЛ, при common и пре-В-ОЛЛ — у 30-40%, при Phпозмтивном ОЛЛ — у 10%, при зрелоклеточном В-ОЛЛ — у 4050%, при раннем Т-ОЛЛ - у 20-30%. при пре-Т-ОЛЛ - у 50-60%,
при зрелоклеточном Т-ОЛЛ — у 20-30%.
В настоящее время в мире проводят изучение десятков протоколов XT больных ОЛЛ, обеспечивающих преемственность терапии на этапах индукции ремиссии и постремиссионного лечения, а
также исследуют возможности дифференцированного подхода к
лечению больных с различными иммунологическими формами
ОЛЛ и разной степенью риска рецидива. Все исследователи в настоящее время сходятся в том, что зрелоклеточныи В-ОЛЛ нуждается в проведении специализированного лечения с ранним применением больших доз метотрексата. Даже сторонники унифицированных протоколов лечения больных ОЛЛ исключают эту группу
пациентов из исследований. Для практического использования
могут быть предложены несколько протоколов лечения больных
ОЛЛ, используемых в России и за рубежом. В качестве унифицированных протоколов лечения могут быть приведены протоколы,
разработанные американскими гематологами группы CALGB
(Larson L. et al., 1995), Гематологическим научным центром РАМН
(Савченко В. Г. и др., 2001,2002). Российским НИИ гематологии п.
трансфузиологии МЗРФ (Моисеев С. II. и др., 2001). Золотым
стандартом дифференцированных протоколов лечения являются
протоколы, разработанные группой BFM и усовершенствованные
группой GMALL (Hoelzer D. et al.. 1996, 1998, 2002; Ludwig W. D.
et al., 1998).
Использование CALGB протокола (табл. 27), основанного на
применении 5 основных препаратов, позволяет достигнуть ремиссии в среднем у 85% больных ОЛЛ в возрасте 16-80 лет; рефрактерны к терапии — 7% больных; показатель ранней смерти составляет 9%. У лиц моложе 30 лет частота достижения ПР1 достигла
94%. Протокол несколько более эффективен при Т-линейных ОЛЛ:
частота ПР1 составила 97%, в то время как при В-линейных ОЛЛ —
80%. Длительность общей выживаемости зависела от возраста больных. В группе больных моложе 30 лет общая 3-летняя выживаемость составляла 69%, 30-59 лет — 39%, старше 60 лет — 10%.
Таким образом, данный протокол лечения ОЛЛ наиболее эффективен у молодых пациентов с Т-линейной формой ОЛЛ.
Протокол, разработанный Гематологическим научным центром
РАМН, основанный на применении больших доз дексаметазона,
является унифицированным на этапе индукции ремиссии и диф-
447
Глава 16. Острые лейкозы
Таблица 27
CALGB-протокол лечения острых лимфобластных лейкозов
Этап лечения
и основные препараты
Индукция ремиссии
1-й курс:
циклофосфамид
даунорубицин(рубомицин)
винкристин
преднизолон
L-аспарагиназа
Способ
введения
Дни
введения
Доза
1200 мг/м2
(8ООмг/м2*)
В/в
45 мг/ м :
(30 мг/ м-*)
В/в
2 мг
Р. о., в/в 60 мг/ м 2
6000 ед/м2
П/к
В/в
1-й
1.2.3-й
1,8. 15.22-й
1-21-й (1-7-й*)
5.8. 11. 15. 18.
22-й
2-й курс:
циклофосфамид
6-меркаптопурин
цитозин-арабинозид
винкристин
L-аспарагиназа
метотрексат
В/в
P.O.
П/к
В/в
П/к
Э/л
1000 мг/м2
60 мг/м2
75 мг/м2
2 мг
6000 сд 1м15 мг
1-й
1-14-й
1-4.8-11-й
15.22-й
15. 18,22.25-й
1-й
Курс 3 (профилактика нейролейкоза
и поддерживающая терапия):
облучение головы
метотрексат
6-меркаптопурнн
метотрексат
—
Э/л
Р. о.
P.O.
24 Гр
15 мг
60 мг/м2
20 мг/м2
1-12-й
1,8. 15.22.29-й
1-70-й
36. 43. 50, 57.
64-й
доксорубицин (адриамицин)
винкристин
дексаметазон
циклофосфамид
6-тиогуанин
цитозин-арабинозид
В/в
В/в
Р. о.
В/в
P.O.
П/к
30 мг/ м2
2 мг
10 мг/м 2
1000 мг/м 2
60 мг/ м2
75 мг/ м 2
1. 8, 15-й
1,8, 15-й
1-14-й
29-й
29-42-й
29-32.36-39-й
Терапия поддержания ремиссии
(до 24 месяцев с момента диагноза и
начала лечения):
винкристин
В/в
2 мг
1-й день, каждые 4 недели
1-5-й дни, каждые 4 недели
1,8, 15,22-й
1 28-й
Курс 4-й (поздняя интенсификация):
2
преднизолон
P.O.
60 мг/ м
метотрексат
6-меркаптопурин
P.O.
P.O.
20 мг/ м2
60 мг/ м2
Примечание. * — модификация дозы у лиц старше 60 лет;
внутривенно; э/л — эндолюмбалыю; п/к
подкожно.
per os:
448
Часть 2. Клиническая гематология
ференцнрованным в зависимое™ от группы риска на этапе постремиссионного лечения (табл. 28).
К группе высокого риска многие авторы относят больных с Вклеточными ОЛЛ, у которых число лейкоцитов в дебюте заболевания составляет более 30 тысяч в 1 мкл. с пре-пре-В-ОЛЛ, Т-ОЛЛ —
более 100 тысяч в 1 мкл, а также с ранним Т-ОЛЛ; транслокациями
t(4; 11), t(9;22); транскриптом bcr-abl; множественными хромосомными аберрациями; достижением ремиссии заболевания более чем
за 4 недели и с остающимися увеличенными в размерах селезенкой, печенью и лимфоузлами.
Использование данного протокола позволяет получать ремиссии заболевания в среднем у 68,4% больных ОЛЛ, резистентность
к лечению имели 15,8% пациентов, показатель ранней смерти составляет 15,8% (Савченко В. Г. и др., 2001).
Таблица 28
Протокол лечения острых лимфобластных лейкозов (ГНЦ РАМН)
Этап лечения
и основные препараты
Пред фа за:
циклофосфамид
дексаметазон
Способ
введения
Дни
введения
В/в
В/в
300 мг/м2
10мг/м-
1-3-й
1-3-й
В/в
В/в
В/в
Э/л
Э/л
4. 10. 16-й
4. 10. 16-й
4. 10. 16-й
0.5. 10. 15.20-й
0,5, 10, 15,20-й
0.5, 10.15,20-й
Индукция ремиссии
1-я фаза (2 недели + перерыв):
рубомицин
винкристин
L-аспарагиназа
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
2-я фаза (3 недели):
циклофосфамид
L-аспарагиназа
цитарабин
6-меркаптопурин
Э/л
60 мг/м3
2 мг
15000 ед/м:
15 MI
30 мг
4 мг
В/в
В/в
В/в
Р. о.
1000 мг/м2
15000 ед/м100 мг/м2
60 мг/м-
1. 15-й
1. 8-й
4-6. 11-13-й
1-22-й
Консолидация ремиссии
через 2-3 недели
Группа стандартного риска
(чередование курсов 1-2-1-2,
10. 13. 16, 19-й недели)
1-й курс:
цитарабин
В/в
100 мг/м2
(2 раза в день)
1-3-й
449
Глава 16. Острые лейкозы
Продолжение таблицы 28
Этап лечения
и основные препараты
Способ
введения
Доза
Дни
введения
этопозид
дексаметазон
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
2-й курс:
циклофосфамид
метотрексат
дексаметазон
Группа высокого риска (чередование курсов 1—2—1. 10. 13, 19-й недели)
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
300 мг/м2
30 мг/м2
15 мг
30 мг
4 мг
1-й
1-3-й
1-й
1-й
1-й
В/в
В/в
В/в
300 мг/м2
300 мг/м2
30 мг/м2
1-3-й
1-й
1-3-й
В/в
В/в
В/в
1000 мг/м2
1500 мг/м2
30 мг/м2
1-й
2-й
1 -3-й
В/в
В/в
В/в
2000 мг/м2
30 мг/м2
30 мг/м2
1-й
2-й
1-3-й
В/в
В/в
В/в
1-й
1-й
1-5-й
1-й
1-й
3. 4-й
1-5-й
1-й курс:
метотрексат
ци клофосфамид
дексаметазон
2-й курс:
питарабнн
новантрон
дексаметазон
Поддерживающая терапия
(начинается с 22-й недели и продолжается до 2 лет с момента
окончания консолидации, проводится с помощью программ
СОАР и СОМР по ротирующей
схеме каждые 4—6 недель)
СОАР:
циклофосфамид
винкристин(онковин)
цитарабин (Ага-С)
преднизолон
СОМР:
циклофосфамид
винкристин
метотрексат
преднизолон
P.O.
400 мг/ м2
1.4 мг/ м2
60 мг/ м 2
(2 раза в день)
40 мг
В/в
В/в
В/в
P.O.
1000 мг/м 2
1.4 мг/ м 2
12,5 мг/м 2
100 мг
Профилактика нейролейкемии
в период терапии поддержки
(начиная с 22-й недели раз
в 3 месяца):
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
Э/л
Э/л
Э/л
15 мг .
30 мг
4 мг
Гематология. Поп. справочник
1 5-й
0,5. 10, 15.20-й
0.5, 10. 15.20-й
0.5. 10. 15.20-й
Часть 2. Клиническая гематология
450
Протокол лечения ОЛЛ, разработанный в 1991 т. в Российском
НИИ гематологии и трансфузиолопга МЗ РФ, на этапе индукции
предусматривает применение 5 препаратов и по сути является стандартной программой «BPn+L-аспарашназа пролонг», усиленной
большими разовыми и курсовыми дозами антрациклиновых антибиотиков (Моисеев С. И. и др., 2001). Первоначально использовались разовые дозы рубомицина — 45 мг/м2, а с 1997 г. для лиц
моложе 60 лет первые 3 введения рубомицина были увеличены до
60 мг/м2 (табл. 29). Проведение данного унифицированного протокола больным ОЛЛ в возрасте 15-62 лет (средний возраст 33 ±
3 года) позволяет достигнуть ПР у 91% больных. При этом показатель ранней смерти составлял 4,5%, резистентность к терапии —
4,5%. 10-летняя актуриальная безрецидивная выживаемость больных ОЛЛ составила 31%.
Таблица 29
Программа лечения острых лимфобластных лейкозов
Российского НИИ гематологии и трансфузиологии МЗ РФ
Этап лечения
и основные препараты
Индукция ремиссии
1-я ступень:
рубомицин
винкристин
преднизолон
метотрсксат
цитозар
преднизолон*
2-я ступень:
рубомицин
винкристин
преднизолон
L-аспарагиназа
метотрексат
цитозар
преднизолон
3-я ступень:
рубомицин
винкристин
преднизолон
циклофосфамид
метотрексат
цитозар
преднизолон
Способ
введения
Доза
Дни
введения
В/в
60 мг/м: для больных
моложе 60 лет. 45 мг/м2
— старше 60 лет
1-3-й
В/в
P.O.
Э/л
Э/л
Э/л
2 мг
60 мг/м2
15 мг
20 мг/м2
30 мг/м2
1.8-й
1-14-й
1-й
1-й
1-й
В/в
В/в
P.O.
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
45 мг/м2
2 мг
60 мг/ м2
6000 ед/м2
15мг
20 мг/м :
30 мг/м2
15-й
15.22-й
15-28-й
17-28-й
15-й
15-й
15-й
В/в
• В/в
P.O.
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
45 мг/ м 2
2 мг
60 мг/м1
1000 мг/м2
15 мг
20 мг/м2
30 мг/м2
29. 30-й
29-й
29-35-й
29-й
29-й
29-й
29-й
Глава 16. Острые лейкозы
451
Продолжение таблицы 29
Этап лечения
и основные препараты
Способ
введения
Доза
Дни
введения
В/в
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
30 мг/м2
100 мг/м2 х (2 раза в день)
70 мг/м2
15 мг
20 мг/м2
30 мг/м2
1-2-й
1 5-й
1-5-й
1-й
1-й
1-й
В/в
В/в
В/в
2 мг
30 мг/м2
6000 ед/м2
30 мг/м2
15 мг
20 мг/м2
30 мг/м2
1.8-й
1.8-й
1-5, 8-12-й
1-5.8-12-й
1-й
1-й
1-й
2 мг
1000 мг/м2
100 мг/м2
30 мг/м2
15 мг
20 мг/м2
30 мг/м2
1.8, 15-й
1.8. 15-й
1-15-й
1 4. 8 11-й
1.8. 15-й
1.8. 15-й
1.8, 15-й
100 мг/м2 (болюсом).
900 мг/м2 (в течение 24 ч)
12 мг/м2 (через 24 ч после
окончания введения метотрексага.2 раза с интервалом 6 ч)
15мг
20 мг/м2
30 мг/м2
1-й
Консолидация ремиссии
1-я ступень (через 3 недели):
доксорубицин
цитарабин
этопозид
метотрексат
цитозар
преднизолон
2-я ступень** (через 3 недели):
винкристин
доксорубицин
L-аспарагиназа
преднизолон
метотрексат
цитозар
преднизолон
3-я ступень (через 3 недели):
винкристин
циклофосфамид
6-мсркаптопурин
преднизолон
метотрексат
цитозар
преднизолон
P.O.
Э/л
Э/л
Э/л
В/в
В/в
P.O.
В/в
Э/л '
Э/л
Э/л
Ранняя интенсификация
(через 3 недели)
1-я ступень:
метотрексат
В/в
лейковорин
В/в
метотрексат
цитозар
преднизолон
Э/л
Э/л
2-я ступень
метотрексат
Э/л
-
В/в
лейковорин
В/в
метотрексат
цитозар
преднизолон
Э/л
Э/л
Э/л
100 мг/м2 (болюсом).
900 мг/м2 (в течение 24 ч)
.12 мг/м2 через 24 ч после
окончания введения метотрексата, 4 раза с интервалом 6 ч
15 мг
20 мг/м2
30 мг/м2
3-й
1-й
1-й
1-й
10-й
12-й
10-й
10-й
10-й
452
Часть 2. Клиническая гематология
Продолжение таблицы 29
Этап лечения
и основные препараты
Способ
введения
3-я ступень
мстотрексат
В/в
лейковорин
В/в
метотрексат
цитозар
преднизолон
Терапия поддержания реми>
сии***(начинается через
3 недели после курса ранней
интенсификации и проводится в группе стандартного риска в течение 1 года, высокого
риска — в течение 3 лет):
6-меркаптопурин или 6-тиогуанин (возможно их чередование после курсов реиндукции ремиссии, которые проводятся каждые 3 месяца)
метотрексат
Курсы реиндукции ремиссии
(каждые 3 месяца терапии
поддержания ремиссии по
ротирующей схеме)
СО АР:
циклофосфамид
винкристин(онковин)
цитарабин (Ага-С)
преднизолон
CHOP:
циклофосфамид
винкристин
рубомицин
преднизолон
POMP:
6-меркаптопурин
винкристин
метотрексат
преднизолон
Доза
Дни
введения
20-й
Э/л
Э/л
Э/л
100 мг/м2 (болюсом),
900 мг/м2 (в течение 24 ч)
12 мг/м2 через 24 ч после
окончания введения
метотрексата 6 раз
с интервалом 6 ч
15 мг
20 мг/м2
30 мг/м2
P.O.
75 мг/м2
2-7-й дни
каждой
недели
В/в
15 мг/м2
1-й день
каждой
недели
В/в
В/в
В/в
P.O.
50 мг/м2 х (3 раза в день)
1,4 мг/м2
50 мг/м2 х (3 раза в день)
60 мг
1-4-й
1-й
1 —4-й
1-5-й
В/в
В/в
В/в
P.O.
750 мг/м2
2 мг
45 мг/м2
60 мг/м2
1-й
1-й
1-й
1 5-й
P.O.
В/в
В/в
P.O.
500 мг/м2
2 мг
7,5 мг/м2
100 мг/м2
1-5-й
1-й
1 5-й
1-5-й
22-й
20-й
20-й
20-й
Глава 16. Острые лейкозы
453
Окончание таблицы 29
Этап лечения
и основные препараты
Способ
введения
Дни
введения
Доза
Профилактика нейролейкемин в период терапии
поддержания ремиссии:
1-й день каждого
курса реиндукции
ремиссии
метотрексат
Э/л
15 мг
цитозар
Э/л
20 мг/м2
преднизолон
Э/л
30 мг/м2
P.O.
30 мг/м2
1-5-й
цитозар
В/в
1 г/м2
1 5-й
митоксантрон
В/в
12 мг/м2
1-3-й
этопозид
В/в
200 мг/м2
6-8-й
В/в
0.5 г/м:/сутки (в виде
1-4-й
Поздняя нигснсификншя
лечении (через 6-9 месяцев после достижения ПР
вместо очередного курса
реиндукции ремисии)
Курс для больных моложе
60 лет:
преднизолон
Курс для больных старше
60 лет:
цитозар
непрерывной инфузии)
эгопозид
В/в
100 мг/м
2
1-4-й
Примечание. * При проведении профилактики нейролейкемии эндолюмбальным
введением триплета преднизолон может быть заменен дексаметазоном (4 мг) или
солюкортефом (50 мг/м:).
** При развитии побочных токсических эффектов (3—4 ст.) на введение L-acnapaгиназы при проведении индукционного курса вместо 2-го курса консолидации повторяют
1-й курс («5 + 2 + 5»),
*** Терапия поддержания ремиссии может быть начата уже на этапе проведения
консолидации ремиссии и в последующем в промежутках между курсами химиотерапии в
случае отсутствия выраженной лейкопении, нейтропении и тромбоцитопении (количество
лейкоцитов в крови > 2.0 х 10е'/л. гранулоцигов >1,0х 107л. тромбоцитов >100 х 107л).
В табл. 30-33 представлены дифференцированные протоколы
лечения больных ОЛЛ, разработанные германскими гематолагами
группы GMALL.
Раннее использование на этапе индукции ремиссии больших
доз метотрексата в комбинации с ифосфамидом, тешшозидом, цнтарабшгом и дексаметазоном вместо программы химиотерапии
ОЛЛ ALL 01/81, основанной прежде всего на комбинации винкристина, преднизолона и антрациклиновых антибиотиков, позволило увеличить частоту достижения ПР при зрелоклеточных В-ОЛЛ
Часть 2. Клиническая гематология
151
с 44 до 74%, общую пятилетнюю выживаемость — с 0 до 51%,
безрецидивную выживаемость — с 0 до 71 % (Hoelzer D. et al., 1996).
Причем проведение 6 курсов химиотерапии в последующем не требует проведения длительной терапии поддержания ремиссии.
Таблица 30
Протокол лечения зрелоклеточных
В-линейных острых лимфобластных лейкозов (BFM90)
Этап лечения
и основные препараты
Предфаза(1-я неделя):
циклофосфамид
преднизолон
Индукция ремиссии
Блок Л (2 . 8, 14-я недели):
винкристин
мстотрексат
ифосфамид
тенипозид
цитарабин
дексаметазон
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
Блок В (5, 11, 17-я недели):
винкристин
метотрексат
циклофосфамид
адриамицин (доксорубицин)
дексаметазон
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
Способ
введения
Дни
веления
В/в
В/в
200 мг/м2
60 мг/м:
1-5-й
1 5-й
В/в
В/в
2 мг
3000 мг/м- для
больных моложе
50 лет, 500 мг/м: —
старше 50 лет
800 мг/м100 мг/м2
150 мг/м:
1-й
1-й
В/в
В/в
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
В/в
В/в
В/в
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
10 м'г/м15 мг
40 мг
4 мг
2 мг
3000 мг/м2 для
больных моложе
50 лет, 500 мг/м : —
старше 50 лет
200 мг/м2
25 мг/м:
10 мг/м2
15 мг
40 мг
4 мг
1-5-й
4-5-й
4-5-й
1-5-й
1.5-й
1,5-й
1,5-й
1-й
1-й
1-5-й
4-5-й
1-5-й
1.5-й
1, 5-й
1,5-й
Лечение больных Т-линейных ОЛЛ по специализированному
протоколу GMAL 05/93 позволяет достигать ПР у 86% больных и
обеспечить 5-летнюю безрецидивную выживаемость у 53%. Про-
Глава 16. Острые лейкозы
455
токол индукции ремиссии основан на комбинации 8 химиопрепаратов (Hoelzer D. et al., 1998, 2002) и представлен в табл. 31.
Таблица 31
Протокол лечения Т-линейных
острых лимфобластных лейкозов GMAL 05/93
Этап лечения
и основные препараты
Индукции ремиссии
1-я фаза
(1—4-я недели лечения):
даунорубицин(рубомицин)
винкристин
преднизолон
L-аспарагиназа
метотрексат
2-я фаза
(5-8-я недели):
циклофосфамид
цитарабин
6-меркаптопурин
метотрексат
облучение средостения
облучение головы
Ранняя консолидация
ремиссии
1-й курс:
(13-я неделя)
цитарабин
митоксантрон
2-й курс:
(17-19-я недели)
метотрексат
L-аспарагиназа
6-меркаптопурин
Реиндукция ремиссии
(21-26-я недели)
1-я фаза:
преднизолон
винкристин
доксорубицин
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
2-я фаза:
циклофосфамид
цитарабин
6-тиогуанин
метотрексат
Способ
Доза
Дни введения
В/в
В/в
P.O.
В/в
Э/л
45 мг/м2
2 мг
60 мг/м2
5000 ед/м :
15 мг
1.8, 15.22-й
1,8. 15,22-й
1-28-й
15-28-й
1-й
В/в
В/в
P.O.
Э/л
650 мг/м2
75 мг/м2
60 мг/м2
15 мг
24 Гр
24 Гр
29, 43, 57-й
31-34,38-41,45-48-й
52-55-й
29-57-й
31,38,45.52-й
В/в
1—4-й
В/в
1000 мг/м2 х
2 раза
10 мг/м2
3-5-й
В/в
В/в
P.O.
1500 мг/м2
10000 ед/м2
25 мг/м2
1, 15-й
2, 16-й
1-5, 15-19-й
P.O.
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
3 х 20 мг/м2
2 мг
25 мг/м2
15 мг
40 мг
4 мг
1-28-й
1,8, 15.22-й
1,8, 15,22-й
1-й
1-й
1-й
В/в
П/к
P.O.
Э/л
1000 мг/м2
75 мг/м2
60 мг/м2
15 мг
29-й
31-34, 3 8 ^ 1 - й
29-42-й
29-й
введения
Часть 2. Клиническая гематология
456
Окончание таблицы 31
Этап лечения
и основные нрепаралм
Способ
введения
Доза
Дни введения
цитарабин
дексаметазон
Э/л
Э/л
40 мг
4 мг
29-й
29-й
Поздняя консолидация
ремиссии
1-я фаза
(33 и 45-я недели):
циклофосфамид
цитарабин
2-я фаза
(39 и 51-я недели):
тенипозид
цитарабин
В/в
В/в
1000 мг/м500 мг/м-
1-й
1-й
В/в
В/в
60 мг/м :
75 мг/м:
•1 5 - й
Профилактика нейролейкоза в период поздней консолидации
(33.39,45, 51-я недели):
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
Э/л
Э/л
Э/л
15 мг
40 мг
4 мг
1-й
1-й
1-й
Терапия поддержания
ремиссии
(до 31 месяца с момента
установления диагноза):
6-меркаптопурин
метотрексат
P.O.
P.O.
60 мг/м20 мг/м:
Ежедневно
Ежедневно
1-5-й
Для группы больных ОЛЛ высокого риска используется специализированный протокол, разработанный GMALL (табл. 32). К данной группе отнесены больные с ранним пре-В-ОЛЛ, Ph позитивные ОЛЛ, BCR-ABL-позитивные ОЛЛ, а также common вариант
ОЛЛ в случае гиперлейкопитоза >30 тысяч в 1 мкл и достижения
ПР более чем за 4 недели. Использование данного протокола для
лечения раннего пре-В-ОЛЛ позволяет достигать ПР у 73% больных и обеспечить 4-летнюю безрецидивную выживаемость на уровне 52% (Ludwig W. D. et al., 1998).
В группу стандартного риска для проведения специализированного лечения были отнесены больные ОЛЛ common-вариант, в
возрасте 15-35 лет, с количеством лейкоцитов менее 30 тысяч в
1 мкл, достижением ПР в течение 4 недель и без транслокации
t(9;22). Протокол позволяет достигать ПР у 81% больных с commonвариантом ОЛЛ без факторов риска и обеспечить длительную безрецидивную выживаемость у 30% пациентов (табл. 33).
Глава 16. Острые лейкозы
457
Таблица 32
Протокол лечения острых лимфобластных лейкозов
у больных группы высокого риска (GMAL 04/89)
Этап лечения
Способ
и основные препараты
введения
Индукция ремиссии
1-я фаза:
преднизолон
винкристин
даунорубицин(рубомицин)
L-аспарагиназа
метотрсксат
2-я фаза:
циклофосфамид
цитарабин
6-меркаптопурин
цетотрексат
облучение головы
Консолидация ремиссии
1-я фаза
1-й вариант (13-я неделя):
цитарабин
Доза
Дни введения
1-28-й
В/в
В/в
П/к
Э/л
20 мг/м2
(3 раза в день)
2 мг
45 мг/м2
5000 ед/м15 мг
В/в
П/к
650 мг/м2
75 мг/м2
P.O.
60 мг/м2
15 мг
24 Гр
Р. О.
Э/л
1.8. 15.22-й
1.8.15.22-й
15-28-й
1-й
29. 43, 57-й
31-34. 38-41,
4 5 ^ 8 , 52-55-й
29-57-й
31.38.45.52-й
митоксантрон
2-й вариант
(13. 15 и 17-я недели):
метотрексат
L-аспарагиназа
В/в
1000 мг/м2
(2 раза в день)
10 мг/м2
В/в
В/в
1500 мг/м2
10000 ед/м2
1-й
2-й
Реинлукция ремиссии
(21-26-я недели)
1-я фаза
преднизолон
P.O.
20 мг/м2
(3 раза в день)
2 мг
25 мг/м2
15 мг
40 мг
4 мг
1-28-й
1,8, 15. 22-й
1,8, 15,22-й
1-й
1-й
1-й
650 мг/м2
75 мг/м2
60 мг/м2
15 мг
40 мг
4 мг
29-й
31-34,38-41-й
29^2-й
29-й
29-й
29-й
винкристин
доксорубицин
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
2-я фаза
циклофосфамид
цитарабин
6-тиогуанин
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
В/в
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
В/в
П/к
P.O.
Э/л
Э/л
Э/л
1 -4-й
2-5-й
Часть 2. Клиническая гематология
458
Окончание таблицы 32
Этап лечения
и основные препараты
Способ
введения
Доза
Консолидация ремиссии
(2-я фаза)
(31 и 35-я недели):
тенипозид
цитарабин
В/в
В/в
60 мг/м2
75 мг/м2
Терапия поддержания ремиссии
(39-142-я недели):
6-меркаптопурин
метотрексат
P.O.
P.O.
60 мг/м2
20 мг/м2
Дни введения
1-5-й
1 - 5-й
Ежедневно
Ежедневно
Таблица 33
Протокол лечения острых лимфобластных лейкозов
у больных группы стандартного риска (GMAL 05/93)
Этап лечения
и основные препараты
Индукция ремиссии
1-я фаза:
преднизолон
винкристин
даунорубйцин (рубомицин)
L-аспарагиназа
метотрексат
2-я фаза:
циклофосфамид
цитарабин
6-меркаптопурин
метотрексат
облучение головы
Ранняя консолидация ремиссии
1-й курс (13-я неделя):
метотрексат
L-аспарагиназа
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
2-й курс (15-я неделя):
метотрексат
L-аспарагиназа
Способ
введения
Доза
Дни введения
P.O.
В/в
В/в
П/к
Э/л
60 мг/м2
2 мг
45 мг/м2
5000 ед/м2
15 мг
1-28-й
1.8, 15,22-й
1,8, 15.22-й
15-28-й
1-й
В/в
П/к
1000 мг/м 2 '
75 мг/м2
29. 43. 57-й
31-34, 38-* 1,
45-48, 52-55-й
P.O.
Э/л
60 мг/м2
15 мг
24 Гр
29-57-й
31.38.45.52-й
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
1500 мг/м2
10000 ед/м2
15 мг
40 мг
4 мг
1-й
2-й
1-й
1-й
1-й
В/в
В/в
1500 мг/м2
10000 ед/м2
1-й
2-й
Глава 16. Острые лейкозы
459
Окончание таблицы S3
Этап лечения
и основные препараты
3-й курс (17-я неделя):
тенипозид
цитарабин
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
Рсиндукция ремиссии
(21-26-я недели)
1-я фаза:
преднизолон
винкристин
доксорубицин
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
2-я фаза:
циклофосфамид
цитарабин
6-тиогуанин
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
Поздняя консолидация ремиссии
1-я фаза (33. 35. 45 и 47-я недели):
метотрексат
L-аспарагиназа
2-я фаза (39 и 51-я недели):
тенипозид
цитарабин
Профилактика нейролейкоза
в период поздней консолидации
(33, 39, 45 и 51-я недели):
метотрексат
цитарабин
дексаметазон
Терапия поддержания ремиссии
(до 31 месяца с момента установления диагноза):
6-меркаптопурин
метотрексат
Способ
введения
Доза
Дни введения
60 мг/м :
75 мг/м2
15 мг
40 мг
4 мг
1 5-й
1-5-й
1-й
1-й
1-й
1-28-й
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
20 мг/м2
(3 раза в день)
2 мг
25 мг/м2
15мг
40 мг
4 мг
1.8, 15.22-й
1,8. 15,22-й
1-й
1-й
1-й
В/в
П/к
P.O.
Э/л
Э/л
Э/л
1000 мг/м2
75 мг/м2
60 мг/м2
15 мг
40 мг
4 мг
29-й
31 34. 3 8 ^ 1 -й
29-42-й
29-й
29-й
29-й
В/в
В/в
1500 мг/м2
10000 ед/м2
1-й
2-й
В/в
В/в
60 мг/м2
75 мг/м2
• 1-5-й
Э/л
Э/л
Э/л
15 мг
40 мг
4 мг
1-й
1-й
1-й
P.O.
P.O.
60 мг/м2
20 мг/м2
Ежедневно
Ежедневно
В/в
В/в
Э/л
Э/л
Э/л
P.O.
1-5-й
Таким образом, дифференцированная химиотерапия в зависимости от иммунофенотипа бластных клеток и группы риска позво-
460
Часть 2. Клиническая гематология
ляет достигать ПР у 74-86% пациентов и обеспечить длительную
безрецидивную выживаемость у 30-71% больных ОЛЛ. Большая
вариабельность в результатах лечения больных ОЛЛ даже с учетом дифференцированного подхода к терапии указывает на необходимость дальнейшего совершенствования критериев разделения
больных на группы риска и оптимизации протоколов химиотерапии.
Лечение нейролейкоза всегда представляет собой сочетание интратекальных введений химиопрепаратов и облучение головы.
Люмбальные пункции с введением трех препаратов (метотрексат,
цитозар и дексаметазон) выполняют каждые 2-3 дня на фоне системной химиотерапии, начиная с дозировок, используемых в процессе профилактики нейролейкоза. При каждой очередной люмбальной пункции увеличивают дозу цитозара на 10 мг/м2 (но не
больше чем 100 мг) до момента достижения чистого (без примеси
бластных клеток и при нормальном цитозе) ликвора. После этого
производят еще 3 введения триплета (метотрексата, цитозара и
дексаметазона) в полных дозах с тем же интервалом введения,
затем частота введения препаратов снижается до 1 раза в неделю,
если позволяют показатели крови и отсутствуют тяжелые побочные реакции на интратекальную терапию. Затем (в случае отсутствия в прошлом облучения головы) в течение 2-3 недель проводят облучение головы в дозе 24 Гр. Облучение областей спинного
мозга делают только в случаях обнаружения солитарных очагов
методом ядерно-магнитного резонанса, только если подтверждена
полная гематологическая ремиссия. В ряде случаев нейролейкоз
протекает без обнаружения в ликворе бластных клеток. Это бывает при солитарном варианте нейролейкоза, когда имеется очаговое
поражение вещества головного мозга без вовлечения спинномозговых оболочек. В данной ситуации принципиальное значение имеет целенаправленное облучение очага, а также профилактическое
эндолюмбальное введение триплета с частотой 1 раз в неделю. После
проведения облучения головы профилактическое интратекальное
введение триплета (в профилактических дозах) проводят раз в 23 месяца в течение всего периода лечения.
Иммунотерапия резидуальной болезни при ОЛЛ носит вспомогательный характер и основывается на использовании препаратов ос-интерферона в комбинации со стандартной терапией поддержания ремиссии 6-меркаптопурином и метотрексатом. Следует отметить высокую миелотоксичность препаратов а-интерферона
у больных ОЛЛ. Поэтому дозы препарата подбирают индивидуально, чтобы поддерживать уровень лейкоцитов в крови более
Глава 16. Острые лейкозы
461
2,5 х 109/л, гранулоцитов — более 1,0 х 109/л, тромбоцитов — более
100,0 х 109/л. Обычно хорошо переносится больными доза а-интерферона 1 млн ед/м2 3 раза в неделю. Принципиальное значение для
улучшения показателей безрецидивной выживаемости имеет длительность иммунотерапии — не менее 6 месяцев.
При лечении резистентных форм ОЛЛ используют программы
химиотерапии, основанные на применении больших и средних доз
цитарабина, новых комбинаций химиопрепаратов, обладающих
взаимным потенцированием цитостатического эффекта. Как правило, подбор программы химиотерапии в данном случае производится эмпирическим путем с учетом предшествующей химиотерапии и соматического статуса пациента. Для терапии резистентных
форм ОНЛЛ могут быть рекомендованы программы РАМЕ, МОАД,
HiCOAP. В случае, если больной с резистентной формой ОЛЛ не
получал программы полихимиотерапии с большими дозами декса-метазона и не имеет признаков инфекции эффективной, может
быть использована программа «3 х 3» с заменой рубомицина на
идарубицин и исключением префазы.
Программа МОАД позволяет получать ПР у 60% больных ОЛЛ
и частичную ремиссию у 20%. Программа проводится в виде нескольких последовательных ступеней до получения клинического
эффекта. Для достижения ремиссии обычно необходимо 3-4 ступени. При развитии лейкопении или тромбоцитопении после 1-й
ступени XT последующая ступень проводится с применением
уменьшенных на 50% доз метотрексата и винкристина. При достижении ПР следующая ступень проводится с использованием тех
же дозировок препаратов в качестве закрепляющей терапии.
1-я ступень: метотрексат 100 мг/м2, в/в, 1-й день; винкристин
2
2 мг, в/в, 1-й день; L-аспарагиназа 5000 ед/м , в/в, 2-й день; декса2
метазон 6 мг/м , per os, 1-10-й день.
2-я ступень: метотрексат 150 мг/м2, в/в, 1-й день; винкристин
2 мг, в/в, 1-й день; L-аспарагиназа 5000 ед/м2, в/в, 2-й день; декса2
метазон 8 мг/м , per os, 1-10-й день.
3-я ступень: метотрексат 200 мг/м2, в/в, 1-й день; винкристин
2
2 мг, в/в, 1-й день; L-аспарагиназа 5000 ед/м , в/в, 2-й день; декса2
метазон 10 мг/м , per os, 1-10-й день.
4-я ступень: метотрексат 250 мг/м2, в/в, 1-й день; винкристин
2
2 мг, в/в, 1-й день; L-аспарагиназа 5000 ед/м , в/в, 2-й день; декса2
метазон 10 мг/м , per os, 1-10-й день.
Программа HiCOAP позволяет достигать ПР в среднем у 50%
больных ОЛЛ с резистентными формами заболевания. Более предпочтительно ее использование у больных с Т-линейными формами
462
Часть 2. Клиническая гематология
ОЛЛ. Программа хорошо переносится пациентами, вызывает, как
правило, отсроченную тромбоцитопению и может применяться у
соматически ослабленных пациентов.
Программа выглядит следующим образом.
1. Циклофосфамид 350 мг/м2/сутки, в/в, капельно в течение
24 ч. 1-7-й дни.
2. Винкристин 2 мг, в/в, 1-й лень.'
3. Цитарабин 100 мг/м2, в/в, 2 раза в сутки, 1-7-й дни.
4. Преднизолон 100 мг, per os, 1-7-й дни.
Следует отметить, что при хорошей переносимости данная программа вызывает в 100% случаев агранулоцитоз и глубокую тромбоцитопению, что необходимо учитывать при планировании ее проведения.
Программа РАМЕ основана на применении средних доз цитозара
и вызывает ПР у 50% больных ОЛЛ с резистентными формами
заболевания. Она может быть показана при очевидной резистентности к глюкокортикоидам. Следует отметить ее высокую токсичность.
Программа выглядит следующим образом.
1. Преднизолон 0,5 мг/кг, в/в, 1-5-й дни.
2. Цитозар 1 г/м2, в/в, 2 раза в день через 12 ч в виде 1-часовой
инфузии, 1-5-й дни.
3. Митоксантрон 12 мг/м2, в/в, 1-5-й дни.
4. Этопозид 200 мг/м2, в/в, 6-8-й дни.
Следует отметить, что продолжительность ремиссий у больных
с резистентными формами заболевания невелика и не превышает,
как правило, одного года. В связи с этим данная группа пациентов
должна рассматриваться в качестве кандидатов для неродственной HLA-совместимой или родственной частично совместимой по
системе HLA-аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Таким образом, современная химиотерапия позволяет не только достигать полной гематологической ремиссии при острых лейкозах, но и обеспечивать адекватное лечение резидуальной болезни, что является необходимым условием для полного избавления
от ранее фатального заболевания.
Прогноз. Эффективность .течения больных острыми лейкозами определяется многими факторами риска. При острых лимфобластных лейкозах основными из них являются:
1) возраст старше 35 лет, особенно старше 50 лет;
2) гиперлейкоцитоз (количество лейкоцитов >30 тысяч в 1 мк.т
при В-линейных ОЛЛ, и >100 тысяч в 1 мкл — при Т-линейных
ОЛЛ);
Глава 16. Острые лейкозы
463
3) достижение полной ремиссии в течение более чем 2 и, особенно, более чем 4 недель терапии индукции ремиссии;
4) ранние и зрелые Т-ОЛЛ и ранние В-формы ОЛЛ;
5) наличие хромосомных аберраций t(9;22) и t(4;ll).
Больных, имеющих эти показатели, относят к группе высокого
риска, не имеющих — стандартного.
Дополнительно к факторам риска относят наличие нейролейкоза, гепато- и спленомегалии, а также больших опухолевых масс
в средостении. В последние годы среди прогностических факторов
также выделяют количественное определение резидуальных лейкозных клеток после курсов индукции и консолидации ремиссии.
Так, прогностически неблагоприятным является количество резидуальных лейкозных клеток после курса индукции ремиссии
>10~ ! -10Л а после курса консолидации >10 '' (D. Hoelzer, 2002).
Основные факторы риска при острых нелимфобластных лейкозах:
1) пожилой возраст (более 50 и, особенно, более 60 лет);
2) плохой соматический статус;
3) гиперлейкоцитоз (>50 тысяч лейкоцитов в 1 мкл и, особенно,
>100 тысяч лейкоцитов в 1 мкл для большинства вариантов острого
нелимфобластного лейкоза; для МЗ варианта >10 тысяч в 1 мкл);
4) вторичный острый лейкоз;
5) экспрессия Р-гликопротеина и гена множественной лекарственной резистентности;
6) ФАБ-вариант заболевания (М5-М7);
7) скорость изменения количества бластных клеток в крови на
фоне химиотерапии;
8) цитогенетические нарушения (-5/del5, -7/del7, 3q-, t(9;22),
1 Iq23, (t 10;l 1), t(6;9), del(9q), вовлечение 20q, 21q,17p, 3 и наличие
комплексных нарушений).
•
Кроме того, прогностически неблагоприятным является отсутствие полной ремиссии после первого курса химиотерапии. Некоторые авторы к прогностически неблагоприятным относят МО вариант по ФАБ-классификации и количество лейкоцитов в крови
>25 тысяч в 1 мкл.
К группе стандартного риска относят М2, МЗ, М4э формы
ОНЛЛ, с благоприятными цитогенетическими нарушениями:
транслокации t(8;21), t( 15; 17), invlG. Следует отметить, что ОНЛЛ
с t(8;21) может считаться благоприятным при условии включения
в программы химиотерапии больших доз цитозара, а ОНЛЛ-МЗ
с t(15;17) при условии применения препаратов транеретиноевой
кислоты.
Глава 17
МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ
Миелодиспластический синдром (МДС) — это гетерогенная
группа приобретенных клональных заболеваний, развивающихся
из илюрипотентной стволовой клетки с вовлечением в патологический процесс клеток миело- и В-лимфопоэза или из мультипотентной стволовой клетки, не дифференцирующейся по лимфоидной линии. МДС характеризуется неэффективным кроветворением и риском трансформации в острый миелобластный лейкоз
(ОМЛ). Под неэффективным гемопоэзом подразумевается несоответствие между нормо- или гиперклеточным костным мозгом
(КМ), с одной стороны, и одно-, двух- или трехростковой цитопенией в периферической крови (ПК) — с другой. Вероятность прогрессирования МДС в ОМЛ зависит от целого ряда факторов и
может происходить в сроки от 5 месяцев до 6 лет. То есть течение
МДС варьирует от индолентных вариантов, со стабильно сохраняющимся в течение длительного времени уровнем бластов в КМ, до
быстро прогрессирующих форм. Это позволяет рассматривать МДС
как предлейкозное состояние, при котором опухолевый клон может и не трансформироваться в явный ОМЛ. Хотя в последнем
случае возможно, что больной не доживает до трансформации в
ОМЛ, а умирает от осложнений цитопении.
МДС может возникать как de novo, так называемый первичный МДС, или развиваться после применения мутагенных агентов (химио- и/или лучевая терапия) но поводу другого, обычно
опухолевого, заболевания. Второй вариант носит название вторичный МДС.
Распространенность. Средняя частота заболеваемости МДС
составляет 4,9 на 10 тысяч человек в год. Статистические данные
свидетельствуют об отсутствии тенденции к увеличению заболе-
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
469
ваемости МДС за последние 25 лет. Средний возраст больных составляет 75,4 года. Распределение МДС по возрастным группам
(%): среди лиц моложе 20 лет — 0,3, в группе 20-30 лет — 0,6, 3040 лет - 1,6,40-50 лет - 2,2, 50-60 лет - 8 , 5 , 60-70 лет - 25,9,7080 лет — 41,6, старше 80 лет — 18,7. У мужчин заболеваемость
встречается в 1,4 раза чаще, чем у женщин (преимущественное
увеличение заболеваемости МДС у мужчин в возрасте старше
80 лет). По отдельным вариантам МДС распределение следующее (%): рефрактерная анемия — 49,3, рефрактерная анемия с кольцевыми спдеробластами — 8,7, рефрактерная анемия с избытком
бластов — 26,5, рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации — 7,2 и хронический миеломоноцитарный лейкоз — 8,1.
В анамнезе больных МДС встречаются указания на курение —
29,0 %, семейную отягощенность опухолевыми заболеваниями —
18,6%, предшествующий контакт с канцерогенными веществами —
16,2%, предшествующее лечение цитостатическими препаратами по поводу другого онкологического заболевания — 6,4%
(Germing U., 2003; Bernasconi С, 2003).
Классификация. Становление концепции о МДС относится к
началу XX в., когда в 1907 г. A. Luzzato описал больного с клиническими признаками апластическои анемии и гиперплазией эритроидного ростка под термином «псевдоапластическая анемия». В 1937 г.
С. Shoads и W. Baker выделили группу больных анемией с морфологическими признаками дизэритропоэза и использовали термин
«рефрактерная анемия». Одновременно было сообщено о развитии острого лейкоза у больных анемией. Эти и другие данные послужили основанием для J. Hamilton-Paterson ввести в 1949 г. термин «предлейкозная анемия», который в целом отразил тенденцию отдельных форм рефрактерной анемии прогрессировать в ОЛ.
Предлагаемые в последующем термины подчеркивали обнаруженный риск развития ОЛ у больных с дисгемопоэзом в костномозговых клетках. И только в 1982 г. франко-американо-британской
(ФАБ) рабочей группой была предложена классификация МДС,
позволяющая по результатам исследования КМ и ПК разграничивать МДС от ОМЛ и выделять отдельные варианты МДС. Поэтому
верификация диагноза МДС основана прежде всего на выявлении
морфологических признаков дисгемопоэза и количестве бластов
в КМ. Принципиальным для диагностики МДС по ФАБ-классификации является обнаружение диспластических изменений, по
крайней мере, в клетках 2 из 3 гемопоэтических линий.
Дизэритропоэз - диспластическне изменения в клетках эритроидного ряда — включают is себя три основные группы изменений:
470
Часть 2. Клиническая гематология
клеточные аномалии с потерей индивидуальных признаков клетки, структурные деформации и стромальные нарушения. В ПК
определяются анизоцитоз, умеренный макроцитоз, пойкилоцитоз,
овалоциты, фрагментированные эритроциты в виде слезных капель, «мишеневидные» (таргетные) клетки, базофильнопунктированные эритроциты, тельца Жоли, нормобласты и мегалобластоидные элементы. В КМ: эритроидная гиперплазия, наличие мегалобластоидных элементов, многоядерность эритрокариоцитов,
ядерная фрагментация, межъядерные мостики, неправильные митотические фигуры, Шик-положительные эритро- и нормобласты,
кольцевидные сидеробласты. В норме агрегаты ферритина встречаются менее чем в 50% нормобластов, и их количество обычно не
превышает 4 гранул в клетке. Наличие 5 или более гранул рассматривается как патологический признак, а если они занимают более
трети ядра, то описываются под термином «кольцевой» сидеробласт. Отложение ферритина в митохондриях является результатом
сниженной активности аминолевулиновой кислоты и увеличенного захвата железа митохондриями и приводит к нарушению клеточного цикла, например вхождению клеток в S-фазу цикла. Кольцевые сидеробласты идентифицируются по окраске гранул железа
Prussan-blue, встречаются при различных гематологических состояниях и являются результатом неэффективного гемопоэза.
К признакам дизгранулоцитопоэза в ПК относят наличие нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов со сниженной или полным отсутствием зернистости, выявление гипосегментации с пикнозом ядер по типу аномалии Пельгера. В КМ обнаруживаются:
1) гранулоцитарная гиперплазия; 2) повышение бластных клеток
двух типов: тип 1 - е выраженной базофилией цитоплазмы и отсутствием в ней грануляции, наличием в ядре отчетливо контурирующихся нуклеол, тип II — более крупного размера, содержащие
в цитоплазме, по крайней мере, одну, но не более 5-6 гранул; 3) гипоили гипергрануляция первичных гранул и специфическая зернистость в цитоплазме всех стадий созревания; 4) наличие парамиелоидных клеток при отсутствии или снижении специфической зернистости в миелоцитах или метамиелоцитах, подобные клетки напоминают моноциты; 5) палочки Ауэра; 6) пельгероидность клеток;
7) базофилия цитоплазмы в зрелых элементах (тельца Деле); 8) наличие эозинофилов с круглым ядром и вариабельной зернистостью.
Со стороны мегакариоцитарного ростка в ПК выделены следующие диспластические признаки: наличие микромегакариоцитов
с моноплоидным ядром и гигантских тромбоцитов со скудным грануломером. В КМ обнаруживают микромегакариоциты с моно-
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
471
плоидным ядром и гигантские мегакариоциты с множеством раздельнолежащих маленьких круглых ядер.
Диспластические признаки клеток моноцитарной линии в ПК
включают: увеличение моноцитов с множеством долей (то есть как
бы гиперсегментация) и наличие азурофильной зернистости в цитоплазме. В КМ: 1) наличие монобластов и моноцитов, аналогичных в ПК; 2) гемофагоцитоз; 3) макрофаги, содержащие гранулы
железа.
Характерные диспластические изменения обнаруживают и в
гистологических препаратах КМ. Выявляют нарушение костномозговой топографии всех ростков гёмопоэза. Наиболее отчетливо
оно выражено в мегакариоцитарном ростке в виде скопления микромегакариоцитов, нарушения синусоидальной ориентации и паратрабекулярной локализации диспластических и пикнотичных
мегакариоцитов. Для миелоидного ростка характерным признаком является патологическая локализация незрелых клеток — ALIP
(abnormal localization of immature myeloid precursors), впервые описанная G. Tricot с соавторами в 1984 г. Этот феномен представляет
скопление миелобластов и промиелоцитов в центральной части
костномозговых лакун, в то время как обычно они локализуются
вдоль эндостальной мембраны. Скопление 5 или более клеток описывается как «агрегат», а 3-5 клеток — как «кластер». По мнению
G. Tricot, о патологической локализации клеток можно судить только в том случае, если по крайней мере три агрегата или кластера
присутствуют в каждой секции препарата. Со стороны эритропоэза выявляются участки с блоком созревания, располагающиеся как
в интра-, так и в паратрабекулярных областях. Картина повреждения микроокружения складывается из участков отека и экстравазации эритроцитов в результате повреждения синусоидов, васкулитов, фиброза, увеличения плазматических клеток, тучных клеток, лимфоцитов, макрофагов и нередко — гемофагоцитоза.
В некоторых случаях отмечают превалирование воспалительных
изменений с содержанием высокого процента плазматических и
тучных клеток, лимфоцитов, которое коррелирует с результатами
изучения костномозговых аспиратов.
Морфологические признаки дисплазии ростков кроветворения
являются определяющим фактором в совокупности признаков
МДС. Однако само по себе выявление дисплазии того или иного
ростка гёмопоэза еще не является основанием для диагностики
МДС, так как встречается и при других патологических состояниях. Так, различной степени проявления дизэритропоэза обнаруживаются в регенерирующем КМ, в том числе и после проведения
i /2
Часть 2. Клиническая гематология
цитостатической терапии, при недостаточности питания, миелопролиферативных заболеваниях и врожденной дизэритропоэтической анемии. Гипогранулярные нейтрофилы и клетки с пельгеровской аномалией встречаются при Ml, М2 и М4 вариантах de novo
О МЛ, нередко после цитостатической терапии. Дисплазия мегакариоцитов выявляется в ряде случаев ХМЛ. Миелодисплазия, как
морфологическая находка, еще не является синонимом МДС, а
обнаружение одноростковой дисплазии еще не служит критерием
диагностики первичного МДС. В типичных случаях после исключения состояний, сопровождающихся диспластическими изменениями: дефицит витамина В12 и фолиевой кислоты, хронический
алкоголизм, заболевания печени и почек, гиперспленизм, аутоиммунные заболевания, терапия цитостатическими препаратами,
СПИД, неопластические процессы, — диагностика первичного
МДС у больных с панцитопенией, которая ассоциирована с гиперили нормоклеточным КМ с характерными диспластическими изменениями в клетках всех ростков кроветворения, чаще всего не
вызывает затруднений. Клинически заподозрить МДС можно в
тех случаях, когда в ПК обнаруживают персистирующие в течение
4-6 месяцев изменения, не обусловленные вышеуказанными причинами и сохраняющиеся после лечения витаминами В12, В6 и фолиевой кислотой.
При отсутствии явных признаков, то есть при сниженной клеточности КМ, разрастании фиброзной ткани, минимальных морфологических признаках дисплазии, обнаруживаемых в одном или
двух ростках кроветворения, одноростковой цитопении, макроцитозе без анемии, нормальном кариотипе клеток КМ диагностика
МДС может быть затруднена. В таких случаях Т. Hamblin (1992)
рекомендовано использовать термин «Not quite MDS» или «Not
yet MDS», то есть «не вполне МДС» или «еще не МДС», и проводить динамическое наблюдение до окончательного формирования
явного диагноза.
В затруднительных случаях необходимо комплексное обследование: гистологические и культуральные исследования, изучение
кариотипа с использованием FISH-методики для обнаружения типичных изменений кариотипа, определение патологического клона по результатам изучения полиморфизма Х-хромосом у женщин.
Однако выявление клональности еще не является подтверждением МДС. Наиболее типичными для диагностики МДС являются
следующие диспластические проявления: 1) присутствие гипо- или
гипергранулированных нейтрофилов и вытекающий отсюда дефицит активности пероксидазы на всех стадиях созревания клеток
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
473
миелопоэза; 2) пельгероидность клеток нейтрофильного и эозинофильного характера; 3) наличие более 15% кольцевых сидеробластов; 4) PAS положительный материал в мегалобластоидных клетках эритроидного ряда; 5) микромегакариоциты с одним пикнотическим ядром и гигантские мегакариоциты с множественными
раздельными ядрами округлой формы.
В соответствии с ФАБ-классификацией выделяют пять вариантов МДС. различающихся по содержанию миелобластов в КМ и
ПК, числу костномозговых кольцевых сидеробластов и моноцитов
в крови: рефрактерная анемия, рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами, рефрактерная анемия с избытком бластов, рефрактерная анемня с избытком бластов в трансформации и хронический миеломоноцитарный лейкоз (табл. 34). Разграничительный уровень между МДС и О МЛ установлен в 30% бластов в КМ.
Таблица 34
ФАБ-классификация миелодиспластического синдрома
ФАБвариант
Бласты,
%
fc Кольцевые
сидеробласты,
%
Палочки
Ауэра
Моноциты,
1О'/л
ПК
КМ
РА
<1
<5
<15
<1000
РАКС
РАИ Б
РАИБ-Т
ХММЛ
<1
<5
>15
<1000
<5
5-20
21-30
0-20
<15
>5
<5
—
+
<1000
<15
<15
—
>1000
<1000
Рефрактерная анемия (РА). Ведущим признаком является
разной степени выраженности анемия с ретикулоцитопенией. Гранулоцитопения и (или) тромбоцитопения или не выявляются, или
незначительны. В КМ выявляют гиперплазию эритроидного ростка и эритробласты с признаками мегалобластоидного кроветворения. Количество миелобластов — менее 5%; кольцевые сидеробласты обнаруживаются редко, их количество составляет менее 15%
от всех клеток эритроидного ряда. Морфологических признаков
днсмегакариоцитопоэза может не быть, или выявляется повышенное содержание мегакариоцитов с признаками дисплазии. Признаки дисгранулоцитопоэза могут или обнаруживаться, или полностью отсутствовать. PAS-реакция в эритробластах в большинстве
случаев варьирует от слабо выраженной до полного отсутствия,
474
Часть 2. Клиническая гематология
однако может быть и гранулярного характера. В ПК могут выявляться агранулярные или гипогранулярные нейтрофилы, хотя и
необязательно.
Рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами
(РАКС). Практически те же самые признаки, что и при РА, но в
костномозговом пунктате содержание кольцевых сидеробластов
составляет более 15%, миелобластов — менее 5%. Положительная
PAS-реакция диффузного или гранулярного характера встречается в большинстве эритробластов, хотя может быть и отрицательной. Трансформация РАКС в ОЛ ввиду стабильности патологического клона наблюдается крайне редко. В случае прогрессирования
заболевания количество сидеробластов может достигать 80% клеток эритроидного ряда. Описаны две формы РАКС: 1-я — с морфологическими признаками дизэритропоэза, 2-я — с дополнительными признаками дизгранулоцитопоэза и (или) дизмегакариоцитопоэза. Риск лейкозной трансформации в этих группах составляет
1,9 и 48%, а 5-летняя выживаемость больных — 69 и 19% соответственно. Это позволяет предположить, что первая форма РАКС не
является клональным состоянием и, следовательно, не может рассматриваться в качестве истинного первичного МДС.
Рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ). В периферической крови иногда выявляются бласты, но обычно их количество составляет менее 5%, нередко — гипо- или агрануляция
гранулоцитов иногда с измененным хроматином или сегментацией
ядра. Тромбоцитопения умеренная. Обнаруживается дисплазия 2 или
более клеточных линий в КМ. Количество бластов с положительной реакцией на миелопероксидазу находится в диапазоне 5-20%
всех ядерных клеток. По сравнению с ОМЛ, бласты преимущественно меньшего размера, что, вероятно, отражает их низкий пролиферативный потенциал. PAS-реакция в эритробластах варьирует от слабо выраженной до хорошо гранулированной. Активность
реакций на кислую фосфатазу и специфическую эстеразу слабо
выраженная либо отсутствует. Сидеробласты встречаются редко,
и количество их варьирует от случая к случаю.
Рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации (РАИБ-Т). К этой форме относят варианты с количеством
бластов в КМ от 21 до 30% и (или) наличием бластов с палочками
Ауэра и (или) содержанием более 5% бластов в ПК. В тех случаях,
когда количество бластов в КМ достигает 30%, критерием разграничения этого варианта МДС от ОМЛ является обнаружение бластов III типа, содержащих 20 азурофильных гранул. Случаи с содержанием бластов в КМ от 5 до 20% при условии выявления
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
475
палочек Ауэра относят к РАИБ-Т ввиду высокого риска прогрессирования заболевания и низкой выживаемости больных этой группы.
Хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ). В ПК: количество бластов составляет не более 5%, абсолютное количество
моноцитов — не менее 1 х 109/л. В КМ: признаки трехростковой
дисплазии, степень выраженности которой варьирует от случая к
случаю. Моноцитарные клетки разной степени зрелости. Число
бластов может варьировать от 5 до 20% в результате повышенного
содержания молодых форм мопоцитарного ростка, а количество
миелобластов в этом случае обычно не превышает 10% костномозговых клеток. Эритробласты с чертами мегалобластоидного кроветворения. Нередко выявляется повышенное содержание эозинофилов и плазматических клеток. При проведении цитохимических
реакций в моноцитах обнаруживается интенсивная окраска на неспецифическую эстеразу, подавляемую NaF; активность реакций
на кислую фосфатазу и специфическую эстеразу варьирует от слабовыраженной до полного отсутствия; активность реакции на миелопероксидазу различная, но в большинстве случаев слабая или
полностью отсутствует. В эритробластах при проведении PAS-peакции выявляется слабоположительная окраска цитоплазмы.
ХММЛ включен ФАБ-классификацией в группу МДС, хотя имеет
признаки миелопролиферативного заболевания. В некоторых исследованиях предлагают деление ХММЛ на два варианта: пролиферативный и непролиферативный. Разграничительной чертой
9
между ними служит число лейкоцитов — 12 х 10 /л.
Одно из основных проявлений МДС — симптомы анемии, ассоциированные со слабостью, — встречаются у большинства больных (60-80%). Другие цитопении также могут приводить к клиническим проявлениям и включают в себя нейтропению (5060% больных) и дисфункцию нейтрофилов, которые увеличивают
частоту инфекционных осложнений, и тромбоцитопению — наиболее часто встречающуюся при продвинутых вариантах МДС и
ассоциирующуюся с кровотечением.
К недостаткам ФАБ-классификации следует отнести отсутствие
отдельных категорий для ряда морфологических вариантов, как,
например, для больных с мультилинейной дисплазией и числом
бластов в КМ менее 5%. Кроме того, это достаточно приблизительная оценка риска прогрессирования МДС ввиду использования
только морфологических критериев, широкого размаха костномозговых бластов для больных РАИБ (5-20%) и ХММЛ (1-20%)
и отсутствия биологических маркеров патологического процесса
(табл. 35). Так, если рассматривать время до прогрессирования
Часть 2. Клиническая гематология
476
заболевания, то 25% случаев РАИБ и 55% РАИБ-Т трансформируются в ОМЛ в течение первого года, а 35% РАИБ и 65% РАИБ-Т —
в течение второго года. Больные РАИБ с бластозом более 10%
имеют худший прогноз, чем с бластозом менее 10%. В противоположность этому, для больных РА частота трансформации составляет 5% за 1-й год, и ни один больной РАКС не имел лейкозной
трансформации в течение 2 лет.
Таблица 35
Вероятность трансформации в острый миелобластный лейкоз
и медиана выживаемости больных миелодиспластическим синдромом
Трансформация в ОМЛ,
%
Медиана выживаемости,
мес.
РА
12
50
РАКС
РАИБ
РАИБ-Т
ХММЛ
8
51
44
11
ФАБвариант
60
5
14
11
В 1997 г. международной рабочей группой была предложена
шкала (International Prognostic Scoring System; IPSS) для установления прогноза у больных МДС. Особенностями IPSS являются
привязанность к ФАБ-классификации и определение прогноза МДС
по совокупности клинических (число цитопений в ПК), морфологических (количество бластов в КМ) и биологических (кариотип)
маркеров. К цитопениям отнесены снижение абсолютного числа
нейтрофилов — менее 1,8 х 109/л, гемоглобина — менее 100 г/л и
9
тромбоцитов — менее 100 х 10 /л. Изменения кариотипа разбиты
на три прогностические группы: хорошего (нормальный кариотии,
только — Y, только — 20, только — 5), плохого (комплексный кариотип с > 3 поломками или изменениями 7-й хромосомы) и промежуточного (все остальные хромосомные аберрации) прогноза.
Каждому из трех прогностических критериев придано количественное значение, на основании суммарных значений которых выделены четыре прогностические группы риска МДС, различающиеся
по выживаемости больных и прогрессированию в ОМЛ (табл. 36 и
37): низкая, промежуточная 1, промежуточная 2 и высокая.
Использование биологических свойств клеток патологического
клона в совокупности с прогностически значимыми критериями
обусловливает неоспоримое преимущество IPSS в определении
477
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
Таблица 36
Международная шкала прогноза (IPSS) МДС
Баллы
Критерии
прогноза
0
0,5
Бласты, %
<5
5-10
1,0
—
Кариотип
Цитопении
Хороший
Промежуточный
Плохой
0/1
2/3
—
2,0
1,5
11-20
—
21-30
—
•
—
—
Таблица 37
Прогноз в группах риска больных миелодиспластическим
синдромом по международной шкале (IPSS)
Группа риска
Сумма
баллов
Медиана выживаемости,
лет
Эволюция в ОМЛ,
лег
0
5,7
9,4
Промежуточная 1
0.5-1.0
3.5
3,3
Промежуточная 2
1,5-2,0
1,2
0.4
1.1
0..2
Низкая
Высокая
>2,5
течения МДС и, соответственно, выборе лечебной тактики конкретного больного по сравнению с ФАБ-классификацией. Однако
IPSS обладает и рядом недостатков: привязанность к моменту проведения обследования больного, не учитываются иммунологические маркеры бластных клеток, обладающие высоким прогностическим потенциалом, и молекулярно-генетические повреждения,
лежащие в основе прогрессирования МДС. То есть на современном
этапе IPSS не соответствует накопленным данным о патобиологических механизмах развития МДС и требованиям к более точному
прогнозированию темпа прогрессирования растянутого во времени данного заболевания.
В 1999 г. ВОЗ была предложена новая классификация опухолей кроветворной и лимфоидной тканей, которая по ряду позиций
значительно отличается от FAB-классификации. Касательно МДС
было предложено реклассифидировать РАИБ-Т и ХММЛ. Это
было обусловлено предложением снизить разграничительный
уровень между МДС и ОМЛ с 30 до 20% и созданием новой категории — миелодиспластический синдром/миелопролиферативное
заболевание (МДС/МПЗ). В соответствии с этим РАИБ-Т полностью исключается из МДС, что объясняется высокой тенденци-
478
Часть 2. Клиническая гематология
ей больных РАИБ-Т к трансформации в О МЛ, а также идентичному ОМЛ прогнозу и лечению. В свою очередь ХММЛ, сочетающий
одновременно черты и миелопролиферативного, и миелодиспластического заболевания, вместе с ювенильным миеломоноцитарным лейкозом (юММЛ) и атипичным ХМЛ включен в группу
МДС/МПЗ. Наряду с сохраненными по критериям FAB-классификации такими вариантами, как РА, РАКС и РАИБ, были.рекомендованы два варианта РАИБ и новые единицы МДС. ВОЗ-классификация в зависимости от количества бластов в КМ выделяет
РАИБ 1 с 5-10% бластов и РАИБ 2 с 11-20%. Это отражает увеличение риска прогрессирования МДС у больных при увеличении
бластов в КМ выше 10%. Вновь предложенными вариантами МДС
являются рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией
(РЦМД), 5(]-синдром и неклассифицируемый МДС. РЦМД представляет ту часть больных МДС, у которых наряду с дисплазией в
двух и более ростках кроветворения имеются значительная нейтропения и тромбоцитопения с числом бластов в ПК и КМ менее 1 и
5% соответственно. Хромосомные изменения при РЦМД идентичны РАИБ, а риск лейкозной трансформации выше, чем у больных
МДС, не имеющих мультилинейной дисплазии. Больных рефрактерной макроцитарной анемией с овальными макроцитами и монолобулярными мегакариоцитами, у которых обнаруживается изолированная деления длинного плеча 5 хромосомы (ql2-13; q3133; ql2q23 и q23q32) при количестве бластов в КМ менее 5%.
объединяет 5q-cnHflpo\i. Впервые описанный в 1974 г. Van der Berghe
с соавторами Sq-синдром чаще встречается у женщин и имеет в
целом благоприятный прогноз. По ВОЗ-классификации МДС, не
укладывающийся ни в один из вариантов, определяется как неклассифицируемый.
Несмотря на ряд очевидных преимуществ ВОЗ-классификации и, прежде всего, такое принципиальное условие, как выделение отдельных вариантов по хромосомным аберрациям, существует целый ряд достаточно спорных вопросов, которые не позволяют
безоговорочно принять предлагаемую классификацию МДС. Вопервых, это касается РА и РАКС, условием верификации которых
является обнаружение персистирующей, но крайней мере, в течение 6 месяцев дисплазии только одного эритроидного ростка при
отсутствии других возможных причин ее возникновения. Тогда
как по критериям ФАБ-классификации диагностика МДС требует
обнаружения дисплазии по крайней мере в 2 ростках кроветворения. Во-вторых, создание таких неопределенных новых диагностических категорий, как РЦМД и неклассифицируемый МДС. не
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
479
имеющих биологического, клинического или генетического основания. И наконец, отсутствие сквозного, единого для всех вариантов МДС клинического и (или) прогностического критерия (-ев).
Что касается снижения разграничительного уровня между МДС и
ОМЛ до 20% бластов, то многими гематологами эта рекомендация
воспринимается как еще более проблематичная задача, чем ранее
существующая граница в 30% бластов. Так, несмотря на то, что
РАИБ-Т и de novo ОМЛ пожилых больных имеют практически
идентичные цитогенетические поломки, они различаются между
собой по клиническому течению, биологическим признакам и терапевтическому ответу на интенсивную XT. Возможно, сохранение РАИБ-Т как одного из вариантов МДС целесообразно и для
сравнения будущих лечебных достижений при ОМЛ/МДС с историческим контролем (Hellstrom-Lindberg E., 2000).
Классификация ВОЗ опухолевых заболеваний гемопоэтической и лимфоидной ткани: миелодиспластический синдром и МДС/
МПЗ
I. Миелодиспластический синдром.
1. Рефрактерная анемия:
а) с кольцевыми сидеробластами;
б) без кольцевых сидеробластов.
2. Рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией.
3. Рефрактерная анемия с избытком бластов.
4. Sq-синдром.
5. МДС неклассифицируемый.
II. МДС/МПЗ:
1. Хронический миеломоноцитарный лейкоз.
2. Атипичный хронический миелоидный лейкоз.
3. Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз.
Наряду с классическими вариантами МДС, характеризующимися сочетанием цитопении в ПК с нормальной или повышенной
клеточностью КМ, существует и ряд отдельных вариантов, не нашедших окончательного места ни в одной из существующих классификаций: МДС с пониженной клеточностью КМ и фиброзом, а
также вторичный МДС.
Гипоцеллюлярный МДС. У 5-15% больных МДС в возрасте 60 лет
или старше выявляется клеточность КМ менее 30 или 20%. Клинически этот вариант МДС трудно отличить от апластической анемии (АА). Предложены следующие критерии диагностики гипопластического варианта МДС: патологическая локализация незрелых клеток миелоидного ростка (ALIP); повышенное количество
незрелых клеток миелоидного ростка; выявление островков эрит-
480
Часть 2. Клиническая гематология
робластоидных клеток, микромегакариоцитов и мегакариобластов
с использованием моноклональных антител к CD41 и фактору VII.
Цитогенетические поломки, особенно 7-й хромосомы, способствуют правильной диагностике МДС. Прогрессировать и прогноз
соответствуют нормо- или гиперклеточному МДС.
МДС с фиброзом. Частота от 17 до 47% при всех вариантах
МДС. Клинические проявления включают панцитопению, минимальную органомегалию, гиперклеточный КМ со значительным
фиброзом и мультилинейную дисплазию. Бластоз — менее 20%.
Прогноз МДС с фиброзом неблагоприятный.
Вторичный МДС. Наиболее частое осложнение у больных с опухолями, леченными XT и (или) РТ. Более 90% больных с вторичным МДС имеют измененный кариотип. Установлена связь между
вторичным МДС, наведенным алкилирующими препаратами и делециями 5-й и (или) 7-й хромосом, а при лечении ингибиторами
топоизомеразы II — со сбалансированной транслокацией между
1 Iq23 и 21q22 хромосомами. У этих больных преимущественно
выявляются более продвинутые варианты МДС, мультилинейная
дисплазия и высокая резистентность к терапии, то есть прогноз в
целом неблагоприятный.
Этиопатогенез. В настоящее время возникновение МДС рассматривается как результат кумулятивного воздействия внешних
факторов на генетически предрасположенных лиц. Накопленные
данные позволяют предположить связь образования МДС с радиацией, курением, пестицидами, органическими химикатами и тяжелыми металлами. Под генетической предрасположенностью подразумевается комплекс факторов, включающий, с одной стороны,
естественный полиморфизм ДНК в генах, отвечающих за восстановление ДНК и метаболизм канцерогенов, и с другой — индивидуальные различия по уровню отдельных энзимов, вовлеченных в
активацию или детоксикацию канцерогенов. Так, обнаружено, что
уровень энзимов, вовлеченных в метаболизм бензола (например,
т
К аО(Р)Н-хиноноксидоредуктаза), значительным образом влияет на
риск возникновения МДС после контакта с бензолом, а активность
S-трансферазы, возможно, коррелирует с риском развития МДС у
лиц, контактирующих с индустриальными веществами.
Хотя пусковые механизмы, ответственные за инициацию МДС,
до сих пор неизвестны, предполагается взаимодействие генотоксических (мутации ядерных и митохондриальных ДНК) и негенотоксических (иммунные нарушения) механизмов лейкозогенеза. Существующая в настоящее время модель канцерогенных эффектов
может быть представлена на примере воздействия бензола, когда
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
481
его метаболиты изменяют структуру ДНК и генерируют свободные радикалы кислорода, которые в условиях дефектности детоксирующих систем оказывают мутагенное действие и индуцируют
апоптоз. Генотоксические эффекты бензола включают мутации RAS
онкогена и делеции, а также транслокации хромосом. К негенотоксическим действиям бензола относят активацию протеинкиназы
С, повышение зависимой от ГМ-КСФ пролиферации, иммунологическую дизрегуляцию.
Возникшие в результате инициации патологического клона мутации ряда специфических генов, таких как AML1, NF1, или ответственных за восстановление ДНК генов предрасполагают к возникновению вторичных изменений, которые в свою очередь характеризуются ступенчатообразным прибавлением и (или) потерей
хромосомных регионов — преимущественно Зр-, 3q-, 5q-, 7q-, 12p-,
-17, -18, 20ql 1-12, +8. Эти большие хромосомные изменения в обязательном порядке сопровождаются субмикроскопическими мутациями ДНК таких генов, как р53, FLT3 или RAS, метилированием
специфических генов-промоутеров и, в некоторых случаях, реципрокными транс локациями и инверсиями, уже ассоциированными
с О МЛ. То есть у больных МДС еще до приобретения характерных
цитогенетических аномалий уже существует клональная фаза болезни. Каждая же последующая стадия развития МДС сопровождается дальнейшими генетическими повреждениями. И следовательно, ассоциированные с МДС цитогенетические поломки, ранее считавшиеся «первичной» причиной заболевания, являются
«вторичными» изменениям в результате первичных повреждений
в клональной популяции гемопоэтической стволовой клетки.
На основании клинико-экспериментальных данных составлена
приблизительная модель специфического многоступенчатого процесса развития идиопатического МДС, в которой биологическая
природа заболевания объясняется совокупностью генетического
повреждения стволовой клетки с такими эпигенетическими механизмами, как аберрантная продукция цитокинов, нарушенная адгезия стволовых клеток и поврежденное гемопоэтическое микроокружение.
В этой модели выделяют четыре патофизиологические фазы.
В преМДСфазе процесс инициируется действием внешних факторов у генетически чувствительных лиц.
Ранняя фаза характеризуется иммунным ответом на повреждение кроветворных клеток. Существование аутоиммунного Т-клеточного ответа подтверждается выявлением Т-клеточного рецептора (TCR) Vb характера, который свидетельствует о персистенции
16 Гематологии. HOD. справочник
482
Часть 2. Клиническая гематология
Т-клеточной клональной популяции, и ассоциации МДС с Т-клеточным лейкозом из больших гранулярных лимфоцитов, развивающегося в результате олигоклональной или клональной экспансии Т-клеток. Как при анластической анемии, клональная Т-клеточная популяция вызывает аутоиммунную миелосупрессию,
приводящую к цитонении при МДС. Персистирующая аутоиммунная атака обусловливает хроническую избыточную продукцию
таких проапоптических цитокинов, как фактор некроза опухоли
альфа (ФНОа), интерлейкин-1бета (ИЛ-lp) и трансформирующий рост фактор бета (ТРФ-|3). Основным продуцентом ФНОа
являются мононуклеарные клетки патологического клона, а ИЛ-1(3
и ТРФ-(3 — стромальные клетки.
Увеличение уровня ФНОа в костномозговом микроокружении индуцирует на CD34 r костномозговых клетках избыточную
экспрессию FAS-антигена в результате активации каспаз (и, прежде всего, каспазы-3) и снижение Fap-1, что обусловливает избыточный апоптоз клеток КМ. Кроме того, высокая экспрессия ФНОа
способствует повышенной продукции свободных радикалов и окислительному повреждению CD34 костномозговых клеток с формированием характерной диспластической морфологии клеток.
Преобладание внутримедуллярного апоптоза над пролиферацией
клеток обусловливает неспособность КМ экспортировать достаточное количество клеток в ПК. Избыточному апоптозу также способствуют нарушенные адгезивные взаимоотношения между клоногенными гемопоэтическими стволовыми клетками и прилегающей костномозговой стромой или эндотелием. Дополнительным
фактором, поддерживающим неэффективный гемопоэз при МДС,
является и избыточный ангиогенез — результат продукции клональными клетками васкулярного эндотелиального ростового фактора (vessel endothelial grows factor, VEGF). Повышенная плотность сосудов может благоприятствовать прогрессии МДС путем
поддержки нерегулируемого клеточного роста. Нарушенная экспрессия онкопротеинов и, особенно, высокое соотношение проапоптических/антиапоптических онкопротеинов, например, Мус против bcl-2 или bax/bad против bcl-2/bcl-x и сверхэкспрессия р53
или низкая экспрессия bcl-2 также коррелируют с повышенным
апоптозом. Избыточный апоптоз является удобным объяснением
того, как клональная экспансия костномозговых клеток-предшественников может приводить к неэффективному гемопоэзу и костномозговой недостаточности. Причина избыточного апоптоза окончательн > не ясна, предполагается внутреннее повреждение ДНК
или измененный уровень ростовых факторов в клетке.
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
483
При прогрессировании МДС в позднюю стадию апоптические
сигналы (FAS, с-Мус) снижаются, а антиапоптические (bcl-2) —
усиливаются. Прогрессировать в продвинутые стадии МДС и
ОМЛ связано с инактивацией генов-супрессоров опухоли р15 шЫЬ
(гиперметилирование) и р53 (точечные мутации). В целом поздняя стадия МДС характеризуется снижением контроля за клеточным циклом и развитием МДС/ОМЛ (Hellstrom-Lindberg E.,
2000).
Описанная патофизиологическая модель развития МДС позволяет определить важнейшие точки для терапевтического пособия
и его характер. У больных с ранними вариантами МДС и низким
риском прогрессирования это аутоиммунные механизмы миелосупрессии и повышенный апоптоз костномозговых клеток, представляющие ведущий механизм неэффективного гемопоэза. В качестве принципиального условия интрамедуллярного апоптоза рассматривается избыточная продукция ингибиторных цитокинов и,
прежде всего, ФНОа, являющаяся отчасти результатом усиленного ангиогенеза. Во время прогрессирования МДС экспансия патологического клона ассоциирована со сниженным апоптозом гемопоэтических клеток.
Таким образом можно определить основные биоспецифические
агенты, влияющие на некоторые патогенетические стороны МДС.
Ростовые факторы, антиапоптические агенты, блокаторы икгибиторных цитокинов и антиангиогенезные препараты назначаются
преимущественно больным низкого риска, ингибиторы RAS и препараты триоксида арсения — преимущественно больным высокого
риска. При назначении цитостатических препаратов и трансплантации стволовых клеток возможна эрадикация клеток патологического клона.
Лечение. Основные виды терапевтических программ лечения
больных МДС можно разбить на три отдельные группы: поддерживающая, низкой и высокой интенсивности. Общей задачей всех
программ, независимо от ее интенсивности, является улучшение
качества жизни больных МДС. Терапия низкой интенсивности
обеспечивает повышение показателей периферической крови у
больных низкого риска. Целью высокоинтенсивной терапии является изменение естественного течения болезни путем снижения
риска трансформации в ОМЛ и улучшения результатов выживаемости больных высокого риска. При этом у большинства больных
МДС при достижении морфологической ремиссии после интенсивной XT не только восстанавливается поликлональный гемопоэз, но и выявляется цитогенетическая ремиссия.
484
Часть 2. Клиническая гематология
Поддерживающая терапия. Коррекция того или иного вида
цитопении обеспечивается прежде всего поддерживающей терапией компонентами крови: трансфузии эритроцитарной взвеси, истощенной от лейкоцитов, при анемии и тромбоконцентрата при тромбоцитопении. Одна лечебная доза эритроцитарной взвеси содержит 200 мг железа, то есть в случае, когда больной получает 2 дозы
эритроцитарной взвеси в месяц, ежегодный объем трансфузированного железа достигает 4-5 г. К простым способам мониторирования избытка железа относят подсчет числа трансфузированной
эритроцитарной взвеси и определение уровня сывороточного ферритина. Магнитно-ядерная томография является достаточно информативным неинвазивным способом определения уровня накопления железа в печени. При его избыточной аккумуляции в
организме больного, которую обычно обнаруживают после трансфузий более 40 единиц эритроцитарной взвеси, представляется
целесообразным проведение терапии хелаторами железа, планируемую с учетом варианта МДС, IPSS, числа трансфузированной
эритроцитарной взвеси, уровня ферритина и толерантности больного данного вида лечения (гематомы, дискомфорт от повторных
инфузий). Так, по рекомендациям Итальянского общества гематологов, взрослым больным МДС, получившим более 50 доз эритроцитарной взвеси и с предполагаемой продолжительностью жизни
более 6 месяцев, целесообразно подкожное введение десферриоксамина («Десферал», Novartis, Ciba-Geigy). Возможны как 12-часовая инфузия 2 г препарата, растворенного в 10 мл дистиллированной воды, так и болюсное его введение по 1 г 2 раза в день в
течение 5 дней в неделю. Регулярное применение хелаторов железа не только снижает концентрацию ферритина в крови больных
МДС, но и уменьшает степень цитопении в ПК и потребность в
заместительной терапии.
Терапия низкой интенсивности включает использование модификаторов биологического ответа или XT низкой интенсивности. Она часто осуществляется в амбулаторных условиях как дополнение к поддерживающей терапии. За исключением рекомбинантного эритропоэтина, для которого отработаны показания и
схемы терапии, остальные препараты рекомендуется использовать
в рамках клинических испытаний. Это обусловлено отсутствием
достаточного клинического материала, позволяющего установить
показания к назначению этих препаратов, их оптимальные дозы и
эффективность.
Для лечения анемии у больных МДС рекомбинантный эритропоэтин (рЭпо) (эпрекс, Cilag) рекомендуется вводить в дозе
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
485
150 МЕ/кг, подкожно, 3 раза в неделю. Частота гематологического
ответа составляет 20-30%, но на терапию рЭпо преимущественно
отвечают больные женского пола, с нормальным кариотипом, не
нуждающиеся в трансфузиях эритроцитарной взвеси, или с концентрацией эндогенного Эпо в сыворотке крови менее 100-200 МЕ/мл.
При достижении ответа доза препарата или частота его введения
может быть снижена до толерантной. Если ответа нет через 46 недель, то возможно увеличение дозы рЭпо до 300 МЕ/кг, подкожно. 3 раза в неделю или комбинированное применение рЭпо с
гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ)
(граноцит, Rhone-Poulcnc Rorer; нейпоген, Roche) или гранулоцитарным-макрофагальным колониестимулирующим фактором
(ГМ-КСФ) (лейкомакс, Novartis) в дозе 1 мкг/кг/день. Комбинация препаратов позволяет увеличить частоту ответа в 2 раза, то
есть довести до 40-60%. Условиями высокой вероятности ответа
на комбинированную терапию являются концентрация эндогенного Эпо менее 500 МЕ/мл и вариант с кольцевыми сидеробластами.
Независимо от вида лечения (моно- или комбинированная терапия) необходимо осуществлять мониторинг за насыщением железа, так как при слабой его утилизации на потребности эффективного эритропоэза, даже при условии адекватного запаса железа в организме больного, необходимо назначать препараты железа внутрь.
Эритроидный ответ наступает в среднем через 2-3 месяца от начала терапии. Если же за это время ответа нет, то лечение рассматривается как неэффективное и отменяется.
Хотя нейтропения и может быть показанием для назначения
Г-КСФ или ГМ-КСФ, это не сопровождается ни снижением частоты инфекционных осложнений, ни их более эффективным разрешением. Поэтому не рекомендуется длительное назначение
Г-КСФ для профилактики инфекций у больных МДС. Целесообразным может быть использование КСФ у больных с нейтропенией при часто рецидивирующих или антибиотикорезистентных инфекциях.
При лечении тромбоцитопении у больных МДС могут оказаться эффективными малые дозы ИЛ-11 (10 мкг/кг/день). У некоторых больных возможно повышение числа тромбоцитов и при применении даназола (данол, Sanofi-Winthrop; дановал, KRKA) внутрь
в дозе 600 мг/день.
• Желанием преодолеть блок фенотипической дифференцировки с индукцией созревания костномозговых клеток до нормально
функционирующих зрелых клеток обусловлено применение в ряде
случаев препаратов с дифференцирующим механизмом действия
486
Часть 2. Клиническая гематология
или их комбинации: ретиноевая кислота, витамин Dr интерфероны, ростовые факторы.
Иммуносупрессивная терапия больных МДС включает использование антитимоцитарного глобулина (АТГ) (атгам, Pharmacia &
Upjohn), или циклоспорина А (ЦсА) (сандиммун, сандиммун неорал, Novartis), или их комбинации.
Применение АТГ в дозе 40 мг/кг/день в течение 4 дней для
лечения больных РА, РАКС и РАИБ позволяет достичь независимости от трансфузий эритроцитарной взвеси у 33% больных с разными морфологическими вариантами и клеточностью КМ от пониженной до повышенной. Достигнутый результат сохраняется у
76% больных в течение 32 (20-58) месяцев. В случае ответа риск
прогрессирования в ОМЛ представляется минимальным. Установлены факторы благоприятного ответа на терапию АТГ — молодой
возраст больных, короткий период зависимости от трансфузий
эритроцитарной взвеси и экспрессия аллеля HLA DRB 1*15.
Циклоспорин А в дозе 1-5 мг/кг/день в 2 приема рекомендуется назначать в течение не менее 6 месяцев. Доза коррегируется в
соответствии с концентрацией препарата в сыворотке крови (не
выше 400 мкг/мл), уровнем артериального давления, функциональным состоянием печени и почек. При ответе доза препарата
снижается до поддерживающей и принимается больным до развития рецидива цитопении или прогрессирования МДС. В противном случае терапия признается неэффективной и отменяется. Отсутствие данных проспективных рандомизированных клинических исследований и значительный размах частоты положительного
ответа (от 30 до 80%) при использовании разных доз ЦсА являются причинами того, что в настоящее время нет единого алгоритма
его применения для лечения больных МДС. Хотя ЦсА и может
быть эффективным у больных с нормальной и повышенной клеточностью КМ и вариантами с избытком бластов, гематологического ответа чаще всего удается достичь у больных с гипоцелюллярным
КМ, бластозом в КМ менее 5%, экспрессией аллеля HLA DRB 1*15,
нормальным кариотипом, и если in vitro определяется ингибицияроста КОЕ-ГМ после инкубации костномозговых клеток с ЦсА.
Применение фосфорилированного органического тиола амифостина (этиол, USB Pharma; Schering-Plough) для лечения больных
МДС обусловлено его способностью подавлять апоптоз костномозговых клеток. Предполагается, что метаболиты амифостина,
обладающие антиоксидантной активностью, подавляют выделение
провоспалительных цитокинов и тем самым защищают клетку от
окислительного стресса при взаимодействии с цитокинами, в том
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
числе и ФНОа. Так, но данным A. List и соавторов, использовавших амифостин в дозе 100, 200 или 400 мг/м2/день внутривенно
3 раза в неделю для лечения 18 больных МДС с одноростковой или
более рефрактерной цитопенией, гематологический ответ был получен у 15 больных (83%), в том числе у 14/15 больных* на 50% или
более увеличилось абсолютное число нейтрофилов, тромбоциты
увеличились у 6/14 больных с тромбоцитопенией, и у 5/15 больных на 50% и более снизилась потребность в трансфузиях эритроцитарной взвеси. Несмотря на эти достаточно обнадеживающие
результаты, во многих случаях эффективность монотерапии амифостином ставится под сомнение. Представляется целесообразным включение амифостина в комбинацию с ростовыми факторами или химиотерапией.
Способность ксантинового деривата пентоксифиллина (пентилин, KRKA) взаимодействовать с липидами сигнального пути
ФНОа, ИЛ-1Р и ТРФ-(3 составляет основу антнцитокинового протокола PCD (пентоксифиллин, ципрофлоксацин, дексаметазон).
Циирофлоксацин включен в схему благодаря его способности
уменьшать разрушение пентоксифиллина в печени, а дексаметазон — из-за снижения продукции Ф Н О а в результате воздействия
на трансляцию мРНК ФНОа. Существуют сообщения, что комбинация пентоксифиллина 800 мг 3 раза в неделю с ципрофлоксацином 500 мг 2 раза в неделю и дексаметазоном 4 мг утром ежедневно в течение 4 недель с последующим переходом на поддерживающую дозу позволяет получить частичный гематологический
ответ у 76%, а в единичных случаях — и цитогенетическую ремиссию. Однако нередко улучшение показателей крови наступает только после начала приема дексаметазона. Эти результаты, а также
единичные сообщения не позволяют окончательно определить
место PCD в лечении больных МДС. Предполагалось, что применение растворимого рецептора ФНОа (энбрел, Wye'th) способно
достаточно эффективно блокировать функцию ФНОа и оказывать более выраженное гематологическое действие. Однако, хотя и
сообщается о достижении эритроидного ответа у 30% больных,
клинические данные в целом свидетельствуют об умеренном ответе на препарат.
Талидомид (таломид, Celgene) — иммуносупрессивный препарат, обладающий способностью переориентации Т-хелперных клеток с продукции ТЫ цитокинов на Th2 цитокины — подавляет
* Здесь и далее 14/15 — у 14 из 15 больных.
488
Часть 2. Клиническая гематология
продукцию ФНОа моноцитами. Кроме того, он снижает продукцию ФНОсс и подавляет ангиогенез. Таким образом, иммуносупрессивный, антицитокиновый и антиангиогенезный механизмы
действия талидомида способны улучшить функцию КМ у некоторых больных МДС. В разных исследованиях частота гематологического ответа колеблется от 19 до 56% больных МДС. Наилучшие
результаты при применении талидомида в максимально переносимой ежедневной дозе, составившей 400 мг в течение 12 недель,
получены у больных с небольшим числом бластов в КМ. При этом
не было выявлено какого-либо воздействия препарата на естественное течение заболевания. Однако многие больные отказывались от
приема талидомида из-за его непереносимости.
Перспективным направлением в лечении больных МДС считается применение гипометилирующих препаратов 5-азацитидина
(5-Аза, Pharmion) и децитабина (SuperGen). Так, в рандомизированном исследовании установлено снижение риска лейкозной
трансформации, улучшение выживаемости и качества жизни больных МДС, получавших лечение 5-Аза по 75 мг/м2, подкожно в
течение 7 дней каждые 28 дней, по сравнению с больными, находившимися на поддерживающей терапии. Гематологический ответ
достигнут у 60% больных, получавших 5-Аза, включая полный ответ у 7%, частичный — у 16% и улучшение у 37% больных, в то
время как на поддерживающей терапии отмечено только улучшение у 5%. Тем самым 5-Аза значительно превосходит поддерживающую терапию и представляет новый подход в лечении больных МДС.
В настоящее время продолжается активное изучение клинической эффективности препаратов, обладающих антиангиогенезным
действием (анти-VEGF) и подавляющих опухолевый рост. К последней группе относятся препараты с анти-ras активностью (ингибитор фарнезилтраисферазы — SCH66336, Schering-Plough;
RH5777, Janssen Pharmaceutical), триоксид арсения (трисенокс,
С П ) и моноклональные анти-СОЗЗ*антитела (Гемтузумаб озогамицин; милотарг, Wyeth-Ayerst). Однако уже первые результаты о
незначительном ответе на применение этих препаратов свидетельствуют о необходимости тщательного отбора больных на тот или
иной вид терапевтического пособия. Так, при применении больным РАИБ, РАИБ-Т или <le novo О МЛ в возрасте 65 лет и старше
милотарга в дозе 9 мг/м2 в 1-й и 8-й или в 1-й и 15-й дни без/или
в комбинации с интерлейкином-11 в дозе 15 мкг/кг/день в 1-й и
15-й дни полная ремиссия была достигнута у 8% больных, получавших монотерапию милотаргом, и у 36% — на комбинированной
терапии. При сравнении этих данных с результатами индукции
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
489
ремиссии цитозаром с идарубицоном частота полных ремиссии
была значительно выше при XT (48%). Вероятно, целесообразно
комбинированно применять препараты с разными точками терапевтического воздействия.
Лечение одним цитостатическим препаратом в малых дозах в
течение длительного или короткого промежутка времени (монотерапия малыми дозами) применяется прежде всего у больных
МДС с неблагоприятным прогнозом, которым из-за возраста и
(или) тяжелой сопутствующей патологии не показаны интенсивные миелосупрессивные программы XT. Хорошие результаты лечения ряда больных МДС цитарабином, вводимым длительно подкожно или внутривенно в дозе 10-20 мг/м2, указывали на его
способность оказывать дифференцирующее действие по аналогии
с результатами in vitro. Но большинство клинических работ эти
данные не подтвердили, а при анализе большого числа наблюдений у 88% больных отмечено развитие миелосупрессии, в том
числе с летальным исходом (15%). Частота полных и частичных
ремиссий при назначении малых доз цитарабина составляла 17 и
19% соответственно. Алкеран при назначении внутрь в ежедневной дозе 2 мг до развития миелосупрессии, ответа или прогрессирования заболевания позволяет достичь 40% общего ответа, в том
числе полной ремиссии — у 30% больных. Факторами благоприятного ответа являются пониженная клеточность КМ и благоприятные изменения кариотипа. Ответ у больных МДС высокого риска возможен и при назначении миелосупрессивных доз идарубицина внутрь.
Высокоинтенсивная терапия включает интенсивную индукционную XT пли трансплантацию гемопоэтических (костномозговых или периферической крови) стволовых клеток — ТГСК.
Однако при выборе высокоинтенсивного метода терапии больных МДС необходимо учитывать прогностический IPSS-вариант
и возраст больного. Это вызвано тем, что, хотя высокоинтенсивное
лечение и может коренным образом изменять естественное течение заболевания, оно все-таки сопряжено с достаточно ^высоким
риском осложнений и летальности в результате токсического действия терапии. Преимущественно это касается больных промежуточного 2 и высокого IPSS риска старшей возрастной группы, у
которых МДС отягощено не только сопутствующими заболеваниями, но и целым рядом биологических особенностей костномозговых клеток, таких как многоростковая дисплазия, изменения кариотипа комплексного характера или плохого прогноза и экспрессия
гена множественной лекарственной резистентности.
490
Часть 2. Клиническая гематология
В то же время для больных МДС моложе 60 лет с высоким IPSS
риском и хорошим общим статусом приоритетной служит аллогенная ТГСК от HLA-совместимого донора. При отсутствии совместимого донора наиболее приемлемой для них является интенсивная индукционная химиотерапия с применением в ряде случаев экспериментальных биологических агентов, 5-Аза или вновь
разрабатываемых клинических протоколов. Для больных группы
высокого риска, но старше 60 лет и с хорошим общим статусом
предпочтение должно быть отдано 5-Аза или высокоинтенсивному экспериментальному протоколу.
В целом ответы на стандартную XT у больных МДС или вторичным ОМЛ в результате трансформации МДС хуже, чем у пациентов de novo ОМЛ. Частота полных ремиссий у больных продвинутыми вариантами МДС колеблется от 15 до 64%. Этот разброс
объясняется не только выбором доз цитостатических препаратов в
том или ином клиническом исследовании, но и возрастным составом больных, а также биологическими свойствами клеток патологического МДС клона и гемопоэтического мпкроокружения.
Установлено, что возраст больного МДС старше 45-50 лет является прогностически неблагоприятным фактором ответа. Так, в
разных клинических исследованиях частота полных ремиссий и
медиана продолжительности ответа на стандартные и высокодозные курсы XT у больных МДС и de novo ОМЛ моложе 45 лет
практически не отличаются. В более старшем возрасте увеличивается частота обнаружения прогностически неблагоприятных хромосомных поломок и экспрессии гена множественной лекарственной резистентности. Поэтому вероятность достижения полной ремиссии повышается только в случае проведения интенсивной XT.
Однако выбор целесообразности применения XT той или иной
интенсивности у больных МДС старше 60 лет определяется целым
рядом факторов, и нередко более рациональным может оказаться
проведение экспериментальных программ лечения, например моноклональными антителами.
У больных МДС с хромосомными аберрациями частота достижения полных ремиссий и продолжительность безрецидивной выживаемости значительно хуже, чем у больных с нормальным кариотипом.
Другим отягощающим фактором, влияющим на результаты терапии больных МДС, является и более длительный период постцитбетатической миелосупрессии с высокой частотой ранней летальности. Несмотря на применение ростовых факторов (Г-КСФ,
ГМ-КСФ) для укорочения сроков постцитостатической нейтро-
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
491
пении, это в целом не привело к улучшению результатов терапии.
Так же как практически безрезультативными были и попытки применения ростовых факторов до начала и в ходе проведения XT с
целью увеличения пролиферативной активности бластных клеток
и повышения их чувствительности к цитостатичсским препаратам.
Высокий уровень экспрессии гена множественной лекарственной резистентности (ген MDR-1, multidrug resistance gene) также
значительно ухудшает результаты лечения больных и прогноз заболевания в целом при проведении стандартных режимов индукционной терапии. Так, при экспрессии р-гликопротеина частота полных
ремиссий у больных МДС составляла 14% против 69% у пациентов
без экспрессии р-гликопротеина. Несмотря на предполагаемую клиническую эффективность ряда модификаторов MDR, таких как хинин, ЦсА и его аналог PSC-833 (валеподар), только включение хинина в комбинацию с XT позволило существенным образом повысить частоту ПР и улучшить выживаемость MDR-позитивных
больных МДС по сравнению с теми, кто получал только XT. Предполагается комплексный механизм резистентности, что, вероятно,
обусловливает необходимость использования дополнительных модификаторов резистентности для улучшения результатов лечения.
Попытки преодоления резистентности при увеличении дозы
цитарабина или включении в программы XT ряда новых перспективных препаратов не принесли ожидаемых результатов. Так, при
2
применении цитарабина в дозе 1 -3 г/м каждые 12 часов в течение
6 дней частота ремиссий составила 13-47%, однако при этом отмечается высокая частота токсической смертности и короткая продолжительность ремиссии, даже несмотря на интенсивную постремиссионную терапию. При длительной внутривенной инфузии топотекана (ингибитор топоизомеразы-I) (гикамптин, SmithKline
Beecham) в дозе 2 мг/м2 в течение 5 дней каждые 4-6 недель полная ремиссия была достигнута у третьей части пролеченных больных продвинутыми формами МДС или ХММЛ. Но при этом у
20% больных развилась постцитостатическая миелосупрессия с
летальным исходом.
В клинической практике использованы разные комбинации цитозара с флударабином (флудара, Schering) (режимы FA): цитозар
2 г/м2, внутривенно в течение 2-4 часов, 1-5-й дни, и флударабин
30 мг/м2, внутривенно, 1-5-й дни без (FA) или с дополнительным
введением Г-КСФ 400 мкг/м2, внутривенно или подкожно — с 1-го
дня до восстановления гранулоцитов (FLAG). При усилении FLAG
терапии идарубицином (заведос, Pharmacia & Upjohn) время введения цитозара и флударабина снижается до 4 дней, Г-КСФ назна-
492
Часть 2. Клиническая гематология
чается в той же дозе с -1 по +8 дни и идарубицин вводится по
12 мг/м2, внутривенно во 2, 3 и 4-й дни программы (FLAG+Ida).
В режиме ТА цитозар 1-2 г/м2, внутривенно в течение 2-4 часов,
1-5-й дни, комбинируется с топотеканом 1,5 мг/м2; длительная
инфузия — 1-5-й дни. А при программе IA идарубицин (12 мг/м2,
в/в, 1-3-й дни) сочетается с длительным внутривенным введением цитозара 1,5 г/м2, 1-4-й дни. Однако сравнительный анализ
результатов лечения больных РАИБ, РАИБ-Т или de novo ОМЛ не
выявил существенного преимущества более современных режимов цитостатической терапии FA и ТА по сравнению с комбинацией цитозара и идарубицина. Так, при режимах FA, ТА и IA частота
полных ремиссий составила 55,59 и 77%, бессобытийная выживаемость в ремиссии была короткой — 40, 77 и 63 недели, и медиана
выживаемости больных — 30, 41 и 77 недель соответственно (Estey E., 2001). Это обусловливает актуальность разработки новых
более эффективных режимов XT.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток от аллогенных сиблннгов и совместимых неродственных доноров с предполагаемой максимальной эрадпкацией клеток патологического
клона в результате высокодозной XT и иммунной реакции «трансплантат против лейкоза» проводится больным моложе 60 лет с
хорошим общим статусом. По данным Fred Hutchinson Cancer
Research Center, Seattle (2002), при ТГСК от HLA-совместимых
доноров-сиблингов 3- 5-летняя безрецидивная выживаемость составляет 41%, летальность, связанная с трансплантацией, — 42%, а
частота рецидивов — 17%. Однако на результаты ТГСК непосредственное влияние оказывают несколько факторов, и прежде всего
IPSS статус. Так, если частота развития рецидивов составляет 4% у
больных низкого риска, у высокого — 27%; 3-летняя безрецидивная выживаемость у больных с промежуточным 1 риском составляет 60%, с промежуточным 2 - 36% и только 28% у больных
высокого IPSS риска. Принципиальное значение играют цитогенетические нарушения, отражающие в целом биологические особенности клеток патологического клона. У больных с цитогенетическими аберрациями хорошего прогноза в соответствии с IPSS безрецидивная выживаемость составляет 51%, с кариотипом
промежуточного риска — 40% и у больных с хромосомными поломками плохого прогноза — всего 6% (Nevill Т., 1998). Эффективность АллоТГСК снижается и по мере прогрессирования заболевания. Так, если безрецидивная выживаемость больных РА и РАКС
составляет 55%, то у больных РАИБ и РАИБ-Т — 28%. На поздних
стадиях увеличивается и частота рецидивов: она достигает 43% по
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
493
сравнению с 13% у больных ранними вариантами. Это еще раз
подтверждает принципиальное значение изменения биологических свойств клеток МДС клона по мере его прогрессирования.
Результаты аллогенной HLA-совместимой ТГСК от неродственных доноров значительно хуже, чем от HLA-совместнмых доноров-сиблингов. Это вызвано иммунологическим конфликтом между донором и реципиентом, хотя иммунная реакция трансплантат
против лейкоза в случае успешного преодоления всех осложнений
позволяет улучшить результаты длительной безрецпдивной выживаемости. Частота летального исхода в результате ТГСК от HLAсовместимых неродственных доноров достигает 54%, а 2-летняя
безрецидивная выживаемость — 29% при 14% рецидивов болезни
(Castro-Malaspina H., 2002). Лучшие показатели безрецидивной
выживаемости достигаются у больных с ранними стадиями МДС,
при высокой дозе трансплантируемых клеток, ЦМВ-серонегативности реципиента и коротком интервале от установления диагноза
до ТГСК. Благоприятным фактором является и проведение ТГСК
в последние годы, что отражает улучшение качества терапии поддержки. В то же время более старший возраст и донора, и реципиента, ЦМВ-серопозитивность реципиента и несовместимость по
HLA являются факторами риска высокой летальности больных от
трансплантаций. Условиями улучшениями результатов ТГСК служат индивидуальный подбор дозы бусульфана в режиме кондиционирования и использование в качестве источника стволовых клеток не КМ, а кровь.
Перспективное направление в ТГСК — проведение немиелоаблативных режимов кондиционирования (так называемая минитрансплантация) с уменьшением токсического действия химиопрепаратов, улучшением толерантности и увеличением возраста
больных МДС, которым может быть выполнена ТГСК.
Нередко после достижения ремиссии, как этап высокоинтенсивной консолидации, проводится аутологичная ТГСК. Это обусловлено возможностью сбора нормальных поликлональных стволовых клеток у больных МДС в период постцитостатической ремиссии. Использование Г-КСФ после интенсивной XT для
заготовки стволовых клеток из ПК позволяет не только получить
трансплантат, свободный от контаминации клональными клетками, но и уменьшить сроки его приживления. По данным ЕВМТ,
2-летняя безрецидивная выживаемость и общая выживаемость
больных МДС в первой полной ремиссии после АутоТКМ составляют 34 и 39% соответственно, а актуриальная частота рецидивирования — 64% (de Witte Т., 2000). К факторам благоприятного ответа
494
Часть 2. Клиническая гематология
относят возраст моложе 40 лет, так как в старшей возрастной группе
увеличивается риск рецидива заболевания — 59 и 72% соответственно. Однако, несмотря на низкую летальность больных от АутоТГСК,
высокая частота рецидивов в результате отсутствия реакции трансплантат против лейкоза позволяет рекомендовать этот вид ТГСК в
редких случаях в комбинации с последующим проведением поддерживающей терапии иммуномодулирующими препаратами.
Прогноз и выбор вида терапии. Благодаря принципиальному
прогностическому значению биологических и клинических факторов Национальным единым раковым сообществом США
(US National Comprehensive Cancer Network — NCCN, 1998) в
качестве практического руководства для лечения больных МДС
был предложен алгоритм, учитывающий IPSS прогностический
вариант, возраст и общий статус больного МДС, то есть риск
прогрессирования заболевания и индивидуальные особенности
больного (см. рис. 21).
• Низкий или
промежуточный 1
1
|
"И В;>:Г,0
г
Возраст>80 пет
I
Зозраст<60 лет
плохой общий
стзтус
хороший общий
(•тат ус
Ц__Общий ста-ус j —
•ТГСК
• Терагччя низкой интенс! ВНОСГИ
« ТГСК
• Иидук дир ремиссии по режимам
я ремиссии no i
" Индукция о ем и ееи vпо режимам рОМЛ с ТГСК в рем иссич
рОМЛ с ТГСК 8 ремисс; и
рОМ Л с Т С К \i р<>
миссии
• Те рэп'•Я НИЗШИ ИИТ гнейвнести
•Терапия низкой nHiencf внасти
• Поддерж зающая терапия
"Подде зживзющая ерапия
•Поддер киезюшая тера
•Подаержиаающая терзпия
•Терзпия низкой интенсивности
Рис. 21. Алгоритм лечения больных МДС, NCCN
(по: P. L. Greenberg et. al., 2002)
Так, разным видам терапии низкой интенсивности следует отдавать предпочтение в том случае, если у больного МДС устанавливается вариант низкого IPSS (низкий и промежуточный 1) риска. У больных МДС с высоким IPSS (промежуточный 2 и высокий) риском приоритетной должна быть высокоинтенсивная
терапия. Однако во всех случаях обязательно учитывается возраст
больного, его общий статус и пожелания.
Больные МДС разделяются на две возрастные группы — до и
после 60 лет, так как именно возраст больного часто играет ведущую
Глава 17. Миелодиспластические синдромы
495
роль в выборе некоторых видов высокоинтенсивной терапии и
прежде всего ТГСК.
Выбор вида лечения и времени его начала основываются на
результатах мониторинга за течением МДС. Биологическая стабильность МДС и клинический статус больного устанавливаются
по результатам динамического наблюдения в течение 4-6 недель.
В случае наличия признаков нестабильности болезни с высоким риском прогрессирования МДС, возможно, и в виде нарастания цитопении с повышением потребности в гемотрансфузиях,
более правильным будет установить группу прогноза и выбрать
интенсивность терапии по результатам последующих, повторных
исследований КМ. Если больной остается в группе низкого или
промежуточного 1 IPSS риска, то лечебные пособия, показанные
для больных этих групп, должны быть продолжены.
Если же больной прогрессирует в группу промежуточного 2
или высокого IPSS риска или если больной исходно имел один из
этих неблагоприятных IPSS вариантов, то лечение должно быть
высокоинтенсивным. Для больных с плохим общим статусом независимо от категории риска показаны только поддерживающая терапия или терапия низкой интенсивности. Такой подход должен
быть обусловлен тяжестью конкурирующего заболевания, которая
снижает толерантность больных к высокоинтенсивной терапии.
Литература
Alessandrino Е., Amadori 5., Cazzola M. et al. Myelodysplastic syndromes: recent
advances // Haematol. 2001. Vol. 86. P. 1124-1157.
Aul C, Bowen D., Yoshida Y. Pathogenesis, etiology and epidemiology of
myelodysplastic syndromes // Haematol. 1998. Vol. 83. P. 71—86.
Bennett J., Catovsky D.. Daniel M. et al. Proposals for the classification of the
myelodysplastic syndromes // Br. J. Haematol. 1982. Vol. 51. P. 189-199.
GreenbergP., Bishop M., DeegJ. et al. NCCN practice guidelines for myelodysplastic
syndromes // Oncol. 1998. Vol. 12. P. 53-80.
GreenbergP., Cox C, Le Beau M. M. et al. International scoring system for evaluation
prognosis in myelodysplastic syndromes // Blood. 1997. Vol. 89. P. 2079-2088.
Greenberg P., Young N., Gattermann N. Myelodysplastic syndromes // Am. Soc.
Hematol. 2002. P. 136.
Harris N., Jaffe £., Diebokl J. et al. WHO classification of neoplaslic diseases of the
hematopoietic and lymphoid tissues: report of the clinical advisory committee meeting //
J. Clin. Oncol. 1999. Vol. 17. P 3835-3849.
Hellstrom-Lindberg E., Willman С Barrett A., Saunthararajah Y. Achievements in
understanding and treatment of myelodysplastic syndromes // Am. Soc. Hematol.
2000. P. 110-132.
Rosenfeld С List A. A hypothesis for the pathogenesis of myellodysplastic syndromes:
implications for new therapies /,/ Leukemia. 2000. Vol. 14. P. 2-8.
Steensma D., Tefferi A. The myelodysplastic syndrome(s): a prospective and
highlighting current controversies // Leuk. Res. 2003. Vol. 27. P. 95-120.
Глава 18
ХРОНИЧЕСКИЙ МИЕЛОЛЕЙКОЗ
Хронический миелолейкоз (ХМЛ) — клональное заболевание,
при котором клеточный уровень поражения ассоциируется с плюрипотентной стволовой клеткой. Это первый вид лейкоза, у которого микроскопическое описание клеток было дано еще в 1839 г.
патологоанатомом Донне, а в 1951 г. В. Домешек включил ХМЛ
в группу миелопролиферативных заболеваний. ХМЛ занимает пятое место в структуре заболеваемости гемобластозами (8,9%) и
на 100 тысяч населения составляет 1,0-1,7 случая (Мерабишвили В. М., 1991; Doll R., 1970). В детском и юношеском возрасте
заболевание обнаруживается сравнительно редко, а среди всех
больных лейкозом ХМЛ составляет 6,45% (Алексеев Н. А., Воронцов И. М., 1988). Пик заболеваемости отмечается в 40-50-летнем
возрасте. Мужчины заболевают несколько чаще (53,9%), чем женщины (46, 1%) (Абдулкадыров К. М. и др., 1998).
Этиология и патогенез. В настоящее время наиболее доказанной и общепризнанной является опухолевая природа лейкозов, в
пользу чего свидетельствует наличие общих закономерностей, объединяющих лейкозы и опухоли. В частности, это нарушение способности клетки к дифференцировке, вплоть до полного ее торможения; морфологический и метаболический атипизм клеток; наличие общих факторов, способствующих развитию лейкозов и
опухолей; воспроизведение в эксперименте наряду с лейкозами
различных форм опухолей. Существует ряд факторов, способствующих развитию лейкозов: 1) хромосомные аномалии; 2) облучение; 3) токсические влияния вследствие загрязнения окружающей
среды, лекарственной терапии; 4) предшествующие заболевания
кроветворной системы (Ковалева Л. Г. и др., 1992; Воробьев А. И. и
др., 1994; Любарец Т. Ф„ 1995).
Глава 18. Хронический миелолейкоз
497
Хронический миелолейкоз — это первое заболевание системы
крови, при котором были выявлены специфические изменения хромосомы и обусловленная этим активация протоонкогенов. Обнаружение P. Nowell и D. Hunderford (1960) специфического хромосомного маркера — филадельфийской хромосомы (Ph') — безусловно, явилось одним из самых выдающихся открытий XX века в
области биологии и медицины, так как впервые была доказана
связь ХМЛ с определенными изменениями в ядре клетки. Авторы
установили, что при ХМЛ наблюдается постоянное хромосомное
нарушение — деления приблизительно половины длинного (q-)
плеча у одной из хромосом 21-22-й пары. В дальнейшем
Т. Caspersson et al. (1970) и]. Rowley (1973) показали, что Ph'-xpoмосома, как правило, образуется в результате транслокации большей части длинного плеча 22-й хромосомы на 9-ю хромосому. Одновременно небольшой участок длинного плеча 9-й хромосомы
перемещается на 22-ю хромосому, то есть имеет место взаимная
транслокация, обозначаемая как t(9;22). Но, так как участок 22-й
хромосомы, перемещающийся на 9-ю хромосому, значительно больше участка последней, то в результате описанной транслокации 9-я
хромосома увеличивается (9q+), а 22-я — уменьшается (22q ). Хромосома из 22-й пары с укороченным длинным плечом обозначается как Ph-хромосома и присутствует во всех клетках крови и костного мозга больных ХМЛ (в клетках гранулоцитарного и эритроидного ростков, в мегакариоцитах, В- и Т-лимфоцитах). Описанный
вид транслокации с участием упомянутых хромосом является стандартным и обнаруживается в 95-100% метафаз более чем у 90%
больных ХМЛ (Verma R. S., Marcera M. J., 1987; Kurzorck R. et al.,
1988). У 5-8% больных определяются вариационные транслокации или нестандартные перемещения, при которых происходит
обменная транслокация между 22-й и какой-либо другой, но не 9-й
хромосомой (например, 4, 12, 19 и 21-й). Иногда отмечается сложный тип транслокации с вовлечением в перестройку трех и более
хромосом.
Расшифровка молекулярных изменений, возникающих в результате t(9;22), позволила понять многие стороны патогенеза ХМЛ.
Было установлено, что человеческий клеточный протоонкоген
с-аЫ, гомолог онкогена вируса мышиного лейкоза Абельсона (V-abl)
локализован в дистальном отделе длинного плеча 9-й хромосомы."
Этот клеточный онкоген в составе фрагмента длинного плеча 9-й
хромосомы перемещается на длинное плечо хромосомы 22, в тот
участок, который в данной хромосоме является местом разрыва.
При этом с-аЫ своим проксимальным концом соединяется с дис-
498
Часть 2. Клиническая гематология
тальным концом укороченного плеча 22-й хромосомы, содержащим
большую часть M-BCR-гена (major breakpoint cluster region). Именно в районе этого гена происходит отрыв длинного плеча 22-й хромосомы. Иногда точка разрыва гена находится ближе к центромере
хромосомы, в районе m-BCR (minor breakpoint daster region). Еще
реже точка разрыва находится в m-BCR районе, расположенном
дальше от центромеры хромосомы, чем M-BCR. Продукцией гена
BCR/ABL в этих случаях является белок с молекулярной массой
230 Кд — p230BCR"ABL. Этот белок описан при хроническом нейтрофильном лейкозе и обычно характеризуется меньшим, чем при
ХМЛ, лейкоцитозом и количеством незрелых гранулоцитов в крови и костном мозге, а иногда — умеренной спленомегалией.
В результате таких перестроек происходит активация протоонкогенов, и в месте поломки образуется новый, не встречающийся в
норме химерный ген BCR/ABL. Разрыв гена BCR обычно происходит между экзонами 12 (обозначаемый Ь2) и 13 (ЬЗ) или 13 и 14.
Ген BCR/ABL кодирует химерный белок с молекулярной массой
210 кД — p210BCR"ABL. В зависимости от того, с каким экзоном гена
ВС R сливается ген ABL, кодируются 2 типа информационной (матричной) тРНК, на которой строятся 2 типа белка, отличающиеся
друг от друга по длине на 25 аминокислот. Образование гена BCR/
ABL приводит к изменениям функциональных свойств клеток.
Продуцируемый им белок p210 B C R A B L имеет значительно более выраженную тирозинкиназную активность, чем его нормальный прототип р145 А В | . Активация различных участков генов ABL и BCR
запускает цепь событий в клетках, что приводит к росту клеточной
пролиферации. Тирозин 177, локализованный в области BCR, фосфорилируется тирозинкиназой гена ABL, активность которой существенно возрастает при образовании гена BCR/ABL за счет серинтреонинпротеинкиназы, расположенной в области BCR. Фосфорилирование тирозина 177 приводит к активации ряда клеточных белков и, в конечном итоге, — глютатионсвязывающих
генов семейства RAS. Активация RAS в свою очередь активирует
гены семейства RAF, что благодаря ускорению фосфорилирования
обусловливает ускорение сигнала пролиферации, поступающего к
ядру клетки от RAF через систему митогенактивных протеинкиназ (МАРК-киназы). RAS-MAPK сигнальный путь является в клетке основным путем, передающим сигналы дифференцировки и пролиферации. Благодаря ускорению сигнала пролиферации не только
усиливается пролиферация, но и нарушается дифференцировка клеток-предшественников. Активация RAF и МАРК, кроме того, активирует гены MYC и FOS. Увеличение экспрессии MYC приводит к
Глава 18. Хронический миелолейкоз
499
независимости клеточной пролиферации от регулирующего влияния ростовых факторов, причем степень независимости коррелирует с выраженностью экспрессии BCR/ABL. Одновременно активируется локализованный в области гена BCR циклин-D-KOMnлекс, передающий разрешающий сигнал, необходимый для начала
перехода клетки из фазы G1 в фазу S (Волкова М. А., 2003; Pane F.
etal., 1999;WitteO.,2001).
Однако биологический эффект гена BCR/ABL сводится не только к увеличению митогениой активности клеток, но и к нарушению адгезии клеток к строме, ингибированию апоптоза, возникновению нестабильного генома клетки в связи со снижением функции гена ABL (Миллс К. И., 1993; Абдулкадыров К. М. и др., 1998;
Волкова М. А., 2001; Масега М. J. et al., 1994). С прогрессированием заболевания в крови больных появляются популяции клеток с
высоким уровнем пролиферации или субклоны с дополнительными изменениями кариотипа. Наиболее часто из геномных изменений встречаются: вторая Ph'-хромосома, изохромосома 17q и трисомия 8, менее часто — трисомия 19. Вторая Ph'-хромосома обычно
образуется в резу, плате дупликации исходной Ph'-хромосомы, что
определяется по отсутствию изменений в точке разрыва. В некоторых случаях вторая Ph'-хромосома может отличаться от исходной,
что приводит к одновременной экспрессии разных типов гибридной BCR/ABL mPHK или белка, например белка BCR/ABL (pl90),
который характерен только для Ph-положительных острых лейкозов. Властный криз часто сопровождается появлением изохромосомы 17q. В ее области расположен ген р53, что дает возможность
предполагать изменения данного гена в результате этой хромосомной аберрации. Действительно, перестройка гена р53 наблюдается
у 25-30% больных в фазе БК и не встречается при других типах
лейкозов человека. Показана также отчетливая корреляция между
гиперметилированием 5-области гена кальцитонина (хромосома
llq) и развитием бластного криза ХМЛ. У преобладающего большинства пациентов с бластным кризом обнаружено патологическое метилирование данного гена.
Доказательством происхождения ХМЛ из одного патологического клона стало обнаружение моноклонального типа экспрессии
изоэнзима глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназы в клетках костного
мозга. В качестве возможного причинного фактора, влияющего на
заболеваемость лейкозами, рассматривается воздействие облучения. По данным Научного комитета по действию атомной радиации,
минимальная доза, обладающая лейкозогенным эффектом, составляет 0,1-0,2 Гр. Связь возникновения лейкозов с ионизирующим
500
Часть 2. Клиническая гематология
излучением отчетливо прослежена на последствиях атомной бомбардировки городов Хиросимы и Нагасаки. Отмечено увеличение
частоты лейкозов после использования лучевой энергии в качестве терапевтических процедур. Например, при облучении позвоночника больных спондилезом в суммарной дозе 17,5 Гр частота
лейкозов возросла до 16-17 случаев на 100 тысяч облученных, а
при увеличении суммарной дозы до 22,5 Гр — в 5 раз.
Результаты эпидемиологических исследований указывают на
возможное лейкозогенное действие некоторых химических веществ,
а также лекарственных цитостатических препаратов. Наиболее отчетливо доказано увеличение риска заболевания лейкозами среди
людей, имеющих длительный профессиональный контакт с бензолом, летучими органическими растворителями (шоферы, работники обувной и кожевенной промышленности). Имеются сообщения
о возникновении лейкозов в связи с приемом фенилбутазона (бутадиона), хлорамфеникола (левомицетина), цитостатических препаратов, в частности, при использовании мелфалана, азотиаприна
и циклофосфана. Одной из возможных причин хронического миелолейкоза может быть употребление недостаточно очищенной воды,
так как водоемы загрязняются различными химическими соединениями, многие из которых опасны для здоровья человека. К числу
последних относятся канцерогенные вещества (ароматические амины, N-нитрозо-соединения, пестициды, гидразин и его производные), радиоактивные вещества, канцерогены природного происхождения (мышьякосодержащие соединения и соли цинка), одной
из особенностей которых является способность оказывать специфическое патогенное действие, попадая в организм в чрезвычайно
малых количествах.
В настоящее время существуют доказательства вирусного происхождения лейкозов. Для большинства экспериментальных гемобластозов птиц, грызунов и млекопитающих вирусная этиология лейкозов подтверждена выделением вируса и воспроизведением с его
помощью заболевания у здоровых особей. Развитие у животных
гемобластозов связано с активацией латентных вирусов как внешними, так и внутренними факторами. Получены убедительные доказательства тесной связи с вирусами лимфомы Беркитта и Т-клеточного лейкоза. Описаны вирусы Гросса, Граффи и Мазовенко,
вызывающие развитие хронического лимфолейкоза, неходжкинских злокачественных лимфом и острого лейкоза. В последние годы
получены данные о связи вируса иммунодефицита и лейкоза.
Классификация. Хронический миелолейкоз, согласно классификации-ВОЗ (Harris N. L. et al, 2000), является наиболее харак-
Глава 18. Хронический миелолейкоз
501
терным представителем миелопролиферативных болезней и обозначается как «хронический миелоидный лейкоз с филадельфийской хромосомой (Ph') (t(9;22)qq34;qll), BCR/ABL)"». В клиническом течении ХМЛ выделяют три фазы: хроническую, прогрессирующую (фазу акселерации) и бластный криз. При верификации
хронической фазы, как правило, затруднений нет. В то же время
нередки клинические ситуации, когда у больного с нерезко выраженными клинико-лабораторными признаками заболевания врач
испытывает значительные трудности. В таких случаях важным
представляется проведение цитогенетического и молекулярно-генетического исследования костного мозга, что помогает правильно
завершить диагностический процесс у подавляющего большинства
пациентов. Однако до того как определить кариотип клеток костного мозга и установить наличие химерного гена BCR/ABL, больному необходимо произвести пункцию грудины и трепанобиопсию костного мозга.
Убедительными клинико-гематологическими признаками, позволяющими с уверенностью верифицировать хроническую фазу
(ХФ), являются: 1) сочетанное или изолированное увеличение размеров селезенки и (или) печени; 2) содержание лейкоцитов в периферической крови > 80 х 1О''/л; 3) сдвиг в лейкоцитарной формуле
влево с общим количеством миелобластов и промиелоцитов более
4%; 4) общая клеточность костного мозга > 350 х 109/л; 5) общее
количество бластов и промиелоцитов в костном мозге > 8%; 6) содержание клеток нейтрофильного ряда с учетом бластных форм в
костном мозге > 85%; 7) общее количество клеток базофильного и
эозинофильного рядов в костном мозге > 6,5%; 8) содержание клеток эритроидного ряда в костном мозге < 5%; 9) активность щелочной фосфатазы нейтрофилов периферической крови не более 20%,
при коэффициенте не выше 0,25; 10) гиперплазия гемопоэтической ткани за счет клеток гранулоцитарного (часто в сочетании с
мегакариоцитарным) ростка в трепанобиоптате костного мозга (Абдулкадыров К. М. и др., 1998).
Диагностика прогрессирующей фазы (ПФ) в настоящее время облегчена наличием конкретных клинико-лабораторных критериев, которые обязательно включают тщательную оценку динамики лейкозного процесса клинического статуса больного, результаты анализа периферической крови и миелограммы. Согласно
классификации ВОЗ (Vardiman J. W. et al., 2002), верификация
прогрессирующей фазы хронического миелолейкоза основывается
на выявлении одного из следующих признаков: 1) содержание бластных клеток в периферической крови или костном мозге 10-19?<>;
502
Часть 2. Клиническая гематология
2) содержание базофилов в периферической крови не менее 20%;
3) персистирующая тромбоцитопения (< 100 х 109/л) или персистирующий тромбоцитоз (> 1000 х 1О''/л), не поддающиеся терапии; 4) нарастающая спленомегалия и рост числа лейкоцитов, не
отвечающие на лечение; 5) обнаружение дополнительных хромосомных аномалий.
Следует также иметь в виду обнаружение при гистологическом
исследовании костного мозга мегакариопитарных пролифератов
(крупные очаги и отдельные кластеры), ретикулиновый или ко.тагеновый фиброз и (или) тяжелую гранулоцитарную дисплазию.
Правда, эти признаки не могут считаться независимыми критериями ПФ.
Признаками властного криза ХМЛ считаются увеличение количества бластных клеток в периферической крови или костном
мозге до 20% и более, а также выявление экстрамедулярных бластных пролифератов и крупных скоплений из бластных клеток в
биоптатах костного мозга. Эффективность терапии больных ХМЛ
в фазе БК определяется вариантом криза и назначением соответствующим этому варианту лечения. Установление варианта БК невозможно без цитохимической характеристики бластных клеток.
Выделяют также два гистологических варианта ХМЛ — гранулоцитарный (ГВ) и гранулоцитарно-мегакариоцитарный (ГМВ)
(Абдулкадыров К. М. и др., 1993; Thiele J. et al., 1990). Для диагностики гистологических вариантов ХМЛ производят морфометрическую оценку гистологических структур костного мозга, обязательно учитывая при этом мегакариоцитарный коэффициент. Гистологическое исследование костного мозга имеет определяющее
значение в дифференциальной диагностике ХМЛ и хронического
идиопатического миелофиброза, поскольку гистологическая картина костного мозга при этих двух заболеваниях весьма сходна.
Всемирная организация здравоохранения выделяет атипичный
хронический миелоидный лейкоз (аХМЛ). Атипичный ХМЛ определяется как болезнь, поражающая преимущественно клетки нейтрофильного ряда и характеризующаяся отсутствием РЫ или транслокации BCR/ABL. Он имеет черты и дисплазии, и пролиферации
и часто протекает с мультилинейной дисплазией, а поэтому включен в категорию миелодиспластических/миелопролиферативных
болезней. Прогноз его значительно хуже, чем при Ph' + ХМЛ. Термин «аХМЛ» является субоптимальным, поскольку отражает как
хронический процесс болезни, так и его связь с Ph'" ХМЛ.
Клиническая картина и дифференциальная диагностика. Клиническая симптоматика ХМЛ весьма разнообразна. Характерным
Глава 18. Хронический миелолейкоз
503
признаком заболевания является увеличение размеров печени и
селезенки. Причем начальные признаки болезни нередко связаны
именно с увеличением размеров селезенки. Казалось бы. среди полного благополучия больной начинает ощущать боль или тяжесть в
левой половине живота, реже — в правой, иногда появляются боли
после еды или быстрой ходьбы. Нередко ХМЛ выявляется случайно при заполнении санаторно-курортной карты или обследовании
пациента по другому поводу. Внимание врача в подобных случаях
привлекает нейтрофильный лейкоцитоз, обнаруженный при анализе периферической крови-. Увеличение селезенки в этот период
физикальными методами удается выявить у 1/3 больных. Отсутствие спленомегалии может увести мысли врача от правильного
диагноза и наличие умеренного иейтрофильного лейкоцитоза расценить как признак какой-либо бактериальной инфекции. Поэтому в таких ситуациях показано использование инструментальных
методов исследования, в частности ультразвукового исследования
(УЗИ) брюшной полости. Этот метод позволяет выявить увеличение размеров печени и селезенки более чем у 90% больных ХМЛ
уже в ранней ХФ. Спленомегалия при ХМЛ объясняется несколькими факторами: 1) лейкозной инфильтрацией селезенки; 2) развитием миелофиброза параллельно с фиброзированием костного
мозга; 3) вторичным повреждением селезенки, связанным с токсическим гепатитом, цирротическим перерождением печени и портальной гипертензией. При значительной спленомегалии, особенно при высоком лейкоцитозе и тромбоцитозе, у больных ХМЛ
возможно возникновение инфарктов селезенки. Патогенез функциональных и структурных изменений печени при ХМЛ достаточно сложен. Однако в первую очередь он объясняется лейкозной
инфильтрацией органа, длительным применением цитостатических препаратов, обусловливающих развитие токсического гепатита. Определенное значение принадлежит трансфузионной терапии, что может быть причиной острых трансфузионных гепатитов,
а также повышает вероятность трансмиссии вирусов гепатита В
и С (Бессмельцев С. С, Абдулкадыров К. М., 1997).
Наиболее частыми симптомами со стороны сердечно-сосудистой системы у больных в ХФ являются жалобы на колющие или
ноющие боли в области сердца, иногда чувство тяжести, сердцебиение, «перебои» в работе сердца, одышку при физической нагрузке.
У больных в прогрессирующей фазе и, особенно, в фазе БК персчисленные симптомы встречаются чаще. Наблюдаются тахикардия,
склонность к снижению артериального давления, расширение границ относительной сердечной тупости, приглушение тонов сердца и
504
Часть 2. Клиническая гематология
появление систолическою шума у основания сердца. Частота болевого синдрома, выраженность тахикардии и гипотонии зачастую
находятся в прямой зависимости от тяжести анемического синдрома. Изменения на ЭКГ-ленте выражаются в нарушении ритма, проводимости, изменениях зубцов Т и Р, снижении вольтажа зубцов R.
При ЭхоЭКГ-исследовании выявляется расширение полостей сердца, снижение сократительной способности миокарда левого желудочка и утолщение стенки миокарда. ЭхоЭКГ-сдвиги нарастают соответственно фазе ХМЛ и более глубокими становятся у больных в
фазе БК. При проведении больным ХМЛ в фазе БК химиотерапии,
включающей кардиотоксические препараты, происходит стадийное
формирование цитостатической миокардиопатни с клиническими
проявлениями хронической сердечной недостаточности.
При ХМЛ наблюдается поражение органов дыхания (специфические и неспецифические поражения). Наиболее часто развиваются инфекционно-воспалительные процессы (острые пневмонии,
бронхиты и т. д.). Причиной таких осложнений является количественная и функциональная недостаточность фагоцитирующих и
иммунокомпетентных клеток, приводящая к нарушениям кооперативных взаимодействий между лимфоцитами и нейтрофилами.
В основном наблюдаются инфекционные осложнения бактериальной природы, хотя встречаются вирусные и грибковые инфекции.
Частота и выраженность инфекционно-восиалительных процессов зависят от фазы заболевания, массы опухоли, и нередко, такие
осложнения развиваются на фоне цитостатической терапии. Не исключается поражение легких специфическим процессом, при этом в
органах рентгенологически выявляются лейкозные инфильтраты,
которые зачастую принимаются за очаговое воспаление легких.
Иногда больные ХМЛ предъявляют жалобы на тошноту, рвоту,
понижение аппетита и похудание. При прогрессировании заболевания наблюдается кровоточивость из десен, а также носовые и
желудочно-кишечные кровотечения. При исследовании секреторной и кислотообразующей функции желудка на первых порах обнаруживается повышение секреции и кислотности желудочного
содержимого. При прогрессировании миелопролиферативного процесса у больных в фазе БК преобладает пшосекреторное и гипоацидное состояние вплоть до ахилии. Рентгенологическое исследование в первом случае выявляет гиперплазию складок слизистой
оболочки диффузного или очагового характера, а во втором —
гипоплазию и даже атрофию складок слизистой оболочки; тонус
желудка понижен. Диспепсические расстройства, наблюдаемые у
больных ХМЛ, могут быть обусловлены и функциональными
Глава 18. Хронический миелолейкоз
505
изменениями поджелудочной железы. Наряд\' с описанными изменениями, у больных ХМЛ иногда наблюдается возникновение
пролифератов бластных клеток в оболочках головного и спинного
мозга, веществе мозга, нервных стволах, а также ганглиях вегетативной нервной системы, что проявляется симптомами нейролейкоза, мучительными болями и развитием нарезов. Тестом, подтверждающим диагноз специфического поражения нервной системы,
является исследование спинномозговой жидкости. Во всех случаях нейролейкоза обнаруживаются внутричерепная гипертензия,
гиперцитоз, бластные клетки и повышение уровня белка. При
патогенетическом исследовании бластных клеток ликвора установлена их идентичность с кариотипом клеток костного мозга и
периферической крови. Вовлечение центральной нервной системы в опухолевый процесс чаще наблюдается у больных в фазе БК.
реже — в прогрессирующей фазе, но изредка — и в хронической
фазе. Поэтому больным с выраженным пролиферативным синдромом, находящимся в ХФ, показано осуществление диагностической люмбальной пункции (Абдулкадыров К. М. и др., 1998).
Ведущими признаками ХМЛ считаются нарушения кроветворения (Воробьев А. И., Бриллиант М. Д., 1985; Абдулкадыров К. М.
и др.; 1998; Волкова М. А., 2001). Самым показательным критерием роста опухолевых масс в организме больного является лейкоцитоз (табл. 38), который вначале может быть весьма умеренным
9
(20-50 х 10 /л), но по мере течения болезни, без адекватного лече9
ния, достигает огромных цифр (300-600 х 10 /л). Одновременно с
гиперлейкоцитозом у больных в ХФ заболевания наблюдаются
изменения лейкоцитарной формулы — увеличение числа гранулоцитов до 90% и более, появление их незрелых форм (миелоцитов,
метамиелоцитов, нередко — промиелоцитов и даже единичных бла. стных элементов). Отмечается повышение уровня базофилов, часто и эозинофилов (см. табл. 38). Следует подчеркнуть, что обнаружение повышенного количества базофилов и эозинофилов в периферической крови, так называемая «эозинофильно-базофильная
ассоциация», является специфическим маркером ХМЛ. Между тем
число лимфоцитов в крови закономерно уменьшается. Важными
вспомогательными критериями диагностики ХМЛ служат цитохимические показатели активности щелочной фосфатазы нейтрофилов, пероксидазы, содержания липидов и PAS-положительного
вещества в зрелых клетках нейтрофильного ряда периферической
крови и костного мозга. Характерным являются нормальные или
повышенные показатели содержания липидов, полисахаридов, а
также активности ггероксидазы.
Часть 2. Клиническая гематология
506
Активность щелочной фосфатазы нейтрофилов, как правило,
низкая и только в процессе развития бластного криза или присоединения инфекционных осложнений значительно повышается.
Содержание гемоглобина и число эритроцитов у больных в ХФ
долгое время остается нормальным, и лишь изредка, при очень
высоком уровне лейкоцитов, наблюдается умеренное снижение
концентрации гемоглобина и числа эритроцитов.
Таблица 38
Показатели периферической крови больных
хроническим миелолейкозом
Хроническая
фаза
(п = 200)
Показатель
Средние значения (М+т)
Прогрессирующая
Властный криз
фаза
(я = 60)
(я = 80)
Гемоглобин (г/л)
117,4 ±0.77
92.4 ± 1,0
Эритроциты (х10!:/л)
4.03 + 0,14
3.47 + 0.21
3.5 ±0.1
Цветовой показатель
0.S5 + 0.06
0.8 + 0,1
0.83 ± 0.07
СОЭ (мм/ч)
Лейкоциты (х 109/л)
9
100.4 + 2.01
21 ±0,33
27.1 ±0.58
34.23 ± 2,03
106.7 ±0.73
42.35+0.73
74.5 ± 6.3
411.1 ± 1.44
600.0 ± 2.8
227,6 ±27,9
Бласты (%)
1.61 ±0.09
10,4 + 0,36
45,4 ± 3.9
Промиелоциты (%)
2.71 +0,12
5.25 ±0.26
5.9 ± 0,8
Миелоциты
нейтрофильные (%)
13.3 ±0.03
7.9 ±0.31
6.4 ±0,9
Метамиелоциты
нейтрофильные (%)
16.6 + 0,29
8.16 + 0,32
5.4 ±0.6
Тромбоциты (х 10 /.т)
П/я нейтрофилы (%)
20,4 + 0.32
13.04 ±0.4
7,7+0,7
С/я нейтрофилы (%)
29.5 + 0.39
21.2 ± 0.5
11,1 ± 1,2
Миелоциты
эозинофильные (%)
Метамиелоциты
эозинофильные (%)
0.08 + 0,02
0,58 + 0,09
0.14 ±0.02
0.02 ±0,01
0.26 ± 0.06
0,17 ±0,02
Эозинофилы (%)
2,07 ±0.07
2.63 + 0.17
0.52 + 0.06
Миелоциты
базофильные (%)
Базофилы (%)
0,03 ±0.01
0,16 ±0,05
0,03 ±0,01
4.42 ±0.15
14.08 ±0.42
Лимфоциты Си)
6.57 + 0.18
10.4 ±0,36
Моноциты (%)
2.41 ±0,11
4.9 ± 0.25
3.8 ±0.4
11,2± 1.4
2.26 ±0.3
Плазматические
клетки (%)
0.02 ±0,01
0,16 ±0,05
0
Глава 18. Хронический миелолейкоз
ЛОТ
Однако у некоторых больных в этой фазе, наоборот, исходно
может выявляться эритроцитов с повышением содержания гемоглобина. Увеличивается скорость оседания эритроцитов (СОЭ),
которая в большинстве случаев превышает 20 мм/ч.
Число тромбоцитов у больных в ХФ может оставаться нормальным, однако у преобладающего количества пациентов (75%)
наблюдается их увеличение до 500-600 х 10()/л, а у отдельных — до
800 х 109/л. Для иллюстрации приводим пример клинического анализа крови больной ХМЛ в хронической фазе заболевания.
Пример анализа крови при ХМЛ в хронической фазе заболевания:
Эритроциты
(ХЮ'2/Л)
Гемоглобин
(г/л)
Цветовой
показатель
СОЭ
(мм/ч)
Лейкоциты
(х10«/л)
Тромбоциты
(х10«/л)
4.7
128
0,9
24
150
200
Лейкоцитарная формула (%):
ПроМие.томиелобласты
циты
0,5
8,5
Миело- МетамиеП/я
С/я
лоциты
циты
Эозинонейтро- ней гронейтронейтрофилы
филы
филы
ф ильные фильные
19.5
13,5
25,5
2Q.5
2
Базо- Лимфо- Монофилы циты
циты
3.5
2,5
4
При исследовании пунктата костного мозга у больных в ХФ
обращает на себя внимание повышение клеточности костного мозга, то есть увеличение количества миелокариоцитов, в основном за
счет незрелых форм гранулоцитов, миелоцитов и метамиелоцитов (табл. 39). Клеточность костного мозга в среднем составляет
539,4 ± 171,0 х 109/л, а у некоторых — превышает 1000 х109/л. Индекс созревания нейтрофилов увеличивается до 1,3-1,6 (при норме 0,6-0,8). Повышается количество промиелоцитов, миелоцитов,
метамиелоцитов, а лимфоцитов и моноцитов, наоборот, — снижается. Относительное количество клеток эритроидного ряда либо
снижено незначительно, либо соответствует нижней границе нормы, а абсолютное количество не отличается от показателей здоровых людей. Индекс созревания эритронормобластов составляет 0,81,0 (норма 0,7-0,9). Абсолютное количество мегакариоцитов у большинства больных превышает норму; встречаются гигантские
формы тромбоцитов, свободные ядра мегакариоцитов, то есть признаки, характерные для усиления тромбоцитопоэза.
Часть 2. Клиническая гематология
508
Таблица 39
Показатели миелограммы при хроническом миелолейкозе
Средние значения (М ± т)
Показатель,
(%)
Хроническая
фаза
(л = 200)
Прогрессирующая
фаза
(л = 80)
Властный
криз
(л = 60)
Ретикулярные клетки
0,04 ± 0,02
0
0
Миелобласты
2,47 + 0,11
11.6 ±0.62
61,2 ± 1,56
Промиелоциты
5,88 ±0,27
5,21 ±0.42
5.08 ±0,45
Миелоциты
нейтрофильные
23,16 ±0.54
11,05 ±0.61
5,3 ±0.46
Метамиелоциты
нейтрофильные
21,6 ±0.52
10,32 ±0.59
5,2 ±0,46
П/я нейтрофилы
17,35+0.46
9,8+0,57
4.9 ± 0.44
С/я нейтрофилы
14,58 + 0.43
11.75 ±0,63
5,45 ±0,47
Всего клеток
нейтрофильного ряда
85,54 ± 1.03
59.73 ± 1.41
25.93 + 2.3
Миелоциты
эозинофильные
0.97 ±0,11
1,08 ±0,19
0.37 ±0.12
Метамиелоциты
эозинофильные
0.45 ± 0.08
0.4 ±0.12
0,19 ±0,09
Эозинофилы
2.47 ±0.18
2,2 ±0.27
0.46 ±0.14
Всего клеток
эозинофилыюго ряда
3,99 ± 0.22
3.68 ±0.35
1,02 + 0.2
Миелоциты
базофильные
0,17 ±0,05
0,3 + 0,1
0.4 ±0.13
Базофилы
2,99 ±0,19
9,96 + 0,58
2.4 ±0,31
Всего клеток
базофильного ряда
Лимфоциты
2,46 + 0,18
10,26 ±0,59
2,8 ± 0,33
1,73 ±0,15
16,82 ±0,75
5,7 ± 1,07
Моноциты
1,06 ±0,12
2.53 ±0,29
0,64 ±0,16
0,19 ±0,09
Плазматические клетки
0,05 + 0,025
0.2 ± 0.08
Эритробласты
0,16 ±0,04
0,14 + 0,07
0
Нормобласты
базофильные
Нормобласты
полихроматофильные
0,59 ± 0,09
0,56 + 0,14
0.37 ±0.12
3.63 ±0,21
5,48 ±0,43
1.6 ±0,25
Нормобласты
оксифильные
0,33 ±0,06
0,6 ±0,14
0,55 ±0.15
Мегалобласты
0,12 ±0,04
0
0
Всего клеток
эритроидного ряда
4,83 ± 0.25
6.78 ±0.48
2,52 ±0,32
Мегакариоциты
0.15 + 0.04
0.6 ±0.14
0
Глава 18. Хронический миелолейкоз
509
В ХФ существенно меняется колониеобразующая способность
(КОС) клеток крови и костного мозга. Наблюдается резкое увеличение колониеобразующих единиц клеток-предшественников грануломоноцитопоэза (КОЕ ГМ), причем преимущественно за счет
зрелых субпопуляций (Абдулкадыров К. М. и др.. 1998). Отмечается увеличение не только КОС, но и кластерообразующей способности (КлОС) клеток предшественников грануломоноцитопоэза.
В целом у больных ХМЛ в хронической фазе КОС и КлОС клеток
костного мозга в 3-5 раз превышает соответствующие показатели
у здоровых.
Прогрессирующую фазу можно выделить у 70 80% больных
ХМЛ, которая, по существу, является началом бластной трансформации и продолжается 6-18 месяцев. Изменения в периферической крови отражают дальнейшее прогрессирование лейкозного процесса (см. табл. 38). В первую очередь обращает на себя внимание
нарастающая нормохромная анемия, хотя ее тяжелая степень наблюдается и после обильных или длительных кровотечений. Анемия характеризуется рефрактерностью и не отвечает на терапию
цитостатическими препаратами. Количество лейкоцитов подвергается значительным колебаниям — от сублейкемических до высоких лейкемических показателей. Характерным считается быстрое
удвоение числа лейкоцитов (менее чем за 5 дней) после прекращения химиотерапии. Наблюдается дальнейшее «омоложение» состава лейкоцитарной формулы. Содержание бластных клеток в
периферической крови составляет более 10%, одновременно повышается количество промиелоцитов. Повышается содержание «промежуточных» форм (миелоцитов, метамиелоцитов). Относительное и абсолютное содержание эозинофилов и базофилов увеличивается. Кроме зрелых форм этих клеток встречаются базофильные
миелоциты, эозииофильные миелоциты и метамиелоциты. Наряду
с изменениями в лейкоцитарной формуле обнаруживается повышение активности щелочной фосфатазы нейтрофилов. Количество
тромбоцитов у больных в этой фазе ХМЛ крайне вариабельно и
колеблется от 20 до 800 х 109/л, а у отдельных пациентов — превышает 1000 х 109/л. При тромбоцитопении у больных ХМЛ возможно сочетание множественных тромбозов и преходящих нарушений кровообращения, обусловленных блокированием микроциркуляции агрегатами клеток, с геморрагическими явлениями, то есть
развитие ДВС-синдрома с диссеминированной пластиночной агрегацией и частичной последующей дезагрегацией в зоне микроциркуляции. Чащ