В.В. Внуков, А.О. Кучеренко МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РФ
ГОУ ВПО «РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
В.В. Внуков, А.О. Кучеренко
МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
по общему курсу биохимии для студентов ОЗО
биолого-почвенного факультета, обучающихся
по специальности «Экология»
Ростов-на-Дону
2004
2
Печатается по решению кафедры биохимии и микробиологии биологопочвенного факультета Ростовского государственного университета.
Протокол № 7 от 6 февраля 2004 года
3
СОДЕРЖАНИЕ
Расширенная программа курса
4
Словарь основных терминов
10
Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
13
Занятие № 1. Качественные реакции на белки и аминокислоты
15
Занятие № 2. Изучение действия ферментов и их свойств
18
Занятие № 3. Выделение рибонуклеопротеидов и качественные
20
реакции на их компоненты
Рекомендуемая литература
23
4
РАСШИРЕННАЯ ПРОГРАММА КУРСА
Введение. Предмет биологической химии, основные исторические этапы развития биохимии. Задачи и положения биохимии в системе естественных наук. Роль биохимии в развитии экологии.
Химический состав организма. Элементарный химический состав
живых организмов и неживой природы. Макро-, микро, ультраэлементы.
Молекулярный состав клетки. Биомолекулы (биоорганические соединения,
биополимеры). Характеристика основных классов биомолекул, особенности
строения биомолекул. Процентное содержание белков, углеводов, липидов,
нуклеиновых кислот и других соединений в организме.
Водно-дисперсные системы организма. Вода как универсальная дисперсная среда организма. Содержание воды и ее распределение в живых системах. Физико-химические свойства воды, биологическая роль.
Белки, структура и свойства. Роль белков в построении живой материи и в процессах жизнедеятельности.
Структурная, сократительная, защитная, транспортная, каталитическая,
регуляторная, рецепторная, энергетическая функции белков. Роль белков в
иммунных реакциях организма.
Элементарный состав белков. Аминокислоты – структурные единицы
белков. Протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты. Классификация
аминокислот по свойствам их радикалов: неполярные (гидрофобные) аминокислоты, полярные (гидрофильные) аминокислоты, гидрофильные отрицательно заряженные и положительно заряженные. Заменимые, незаменимые,
полузаменимые аминокислоты. Физико-химические свойства аминокислот.
Кислотно-основные свойства аминокислот. Амфотерность. Изоэлектрическая
точка. Буферные свойства. Реакции на аминогруппу и карбоксильную группу. Реакции на отдельные аминокислоты.
Пептиды. Особенности строения и функции некоторых важнейших
природных пептидов (окситоцин, вазопрессин, адренокортикотропный гормон, инсулин, гастрин, глюкагон, глютатион и др.).
5
Белки – линейные полимеры аминокислот. Способ связи аминокислот в
белках. Доказательства универсальности пептидной связи в белках. Реакция
на пептидную связь.
Принципы структурной организации белков. Первичная структура белков – состав и последовательность расположения аминокислот в полипептидной цепи. Пептидная связь и ее свойства: копланарность, транс- и циспептидная связь, величины торсионных углов. Значение первичной структуры
для конформации белков и их функции. Молекулярные болезни.
Вторичная структура белков. Связи, стабилизирующие данную конформацию. Виды вторичной структуры белка (α-спираль, β-структура), параметры. Вклад отдельных аминокислот в образование вторичной структуры
белка. Суперспираль – структура фибриллярных белков. Особенности аминокислотного состава фибриллярных белков. Структура коллагена и фиброина шелка.
Третичная структура белков – способ пространственной укладки полипептидной цепи. Роль аминокислотных остатков в ее образовании. Нековалентные взаимодействия, определяющие структуру белковой молекулы. Вандерваальсовы взаимодействия: дисперсионные, индукционные, ориентационные. Электростатические связи радикалов аминокислот, гидрофобные
взаимодействия. Роль среды в образовании конформации белков. Структурный домен – единица свертывания полипептидной цепи. Третичная структура белков – относительное расположение доменов в пространстве. Принципы
самосборки белковых молекул.
Четвертичная структура белков. Дисульфидные связи в белках. Значение четвертичной структуры белков для их функции. Строение и функции
миоглобина и гемоглобина.
Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, кислотноосновные свойства белков. Заряд белковой молекулы, изоэлектрическая точка. Буферные свойства белков. Растворимость, коллоидные свойства, денатурация и оптические свойства белков.
6
Классификация белков: по форме молекулы, составу, структуре и
функциям.
Характеристика классов сложных белков: нуклеопротеиды, липопротеиды, гликопротеиды, фосфопротеиды, хромопротеиды, металлопротеиды,
флавопротеиды.
Ферменты. Ферменты – биологические катализаторы. Белковая природа ферментов. Характеристика ферментов как белковых соединений: термолабильность, зависимость активности от рН среды, специфичность. Уровни специфичности ферментов: абсолютная, относительная, стереоспецифичность.
Общие закономерности строения ферментов. Понятие об активном и
аллостерическом центрах. Одно- и двухкомпонентные ферменты. Понятие о
коферменте, простетической группе, апоферменте и холоферменте. Природа
и функции коферментов ферментативных реакций.
Кинетика ферментативного катализа. Зависимость скорости реакции от
концентрации субстрата. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Константа Михаэлиса.
Механизм действия ферментов. Черты сходства и различий в действии
биокатализаторов (ферментов) и катализаторов неорганической природы.
Значение фермент-субстратного комплекса в обеспечении специфичности и
скорости ферментативной реакции. Энергетические преобразования в фермент-субстратном комплексе, обеспечивающие снижение энергии активации
катализируемой реакции. Механизм образования фермент-субстратного комплекса. Теория Фишера «ключ-замок», ее критика. Теория Кошланда – индуцированное взаимодействие фермента и субстрата, ее доказательство.
Номенклатура и классификация ферментов, основанная на типах катализируемых биохимических реакций. Характеристика классов ферментов:
оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, изомеразы, лиазы, лигазы (синтетазы). Систематические и тривиальные названия ферментов.
7
Регуляция активности ферментов – основа регуляции обмена веществ.
Влияние концентрации субстрата и фермента на активность ферментативных
процессов. Эффекторы (модуляторы) – регуляторы активности ферментов:
активаторы и ингибиторы активности. Понятие о конкурентных и неконкурентных ингибиторах. Аллостерическая регуляция активности ферментов.
Роль циклической АМФ и протеиназ в активировании ферментов.
Значение организации ферментных систем для регуляции активности.
Ферментные ансамбли и надферментативные комплексы.
Изоферменты как способ регуляции ферментативной активности. Характеристика функциональной роли изоферментов на примере лактатдегидрогеназы. Применение ферментов в медицине и народном хозяйстве.
Витамины. Общая характеристика. Роль витаминов в питании. Авитаминозы, гиповитаминозы и гипервитаминозы. Связь витаминов и ферментов.
Жирорастворимые витамины. Витамин А (ретинол), источники, участие в зрительной рецепции. Витамин Д (кальциферол), структура и роль в
кальциево-фосфатном обмене. Витамин Е (токоферол) – основной природный мембранный антиоксидант. Витамин К (нафтохинон), его участие в процессах свертывания крови. Витамин F – комплекс ненасыщенных жирных
кислот.
Водорастворимые витамины. Витамин В1 – тиамин, В2 – рибофлавин,
РР – никотиновая кислота (устаревшее название – В3), В5 – пантотеновая кислота, В6 – пиридоксаль, В12 – цианкобаламин и др. Строение, механизм действия, источники. Витамины группы Д – важнейшие коферменты клетки. Витамин
С
(аскорбиновая
кислота)
и
ее
роль
в
окислительно-
восстановительных реакциях, синтезе коллагена, гормонов, медиаторов.
Углеводы. Общая характеристика углеводов, строение, классификация, роль в живой природе.
Моносахариды: изомерия, конформация, оптическая активность, физико-химические свойства. Важнейшие представители: глицериновый альдегид, глюкоза, фруктоза, рибоза, дезоксирибоза, галактоза и др.
8
Олигосахариды. Строение, функции. Важнейшие дисахариды: лактоза,
сахароза, мальтоза.
Полисахариды. Структурные мономеры полисахаридов. Гомо- и гетерополисахариды. Сравнительная характеристика важнейших полисахаридов:
крахмала, гликогена, целлюлозы. Глюкозаминогликаны. Строение и функции
гиалуроновой кислоты, гепарина.
Нуклеиновые кислоты. Нуклеотиды – сложные структурные единицы
нуклеиновых кислот. Характеристика молекул, входящих в состав нуклеотидов. Пуриновые и пиримидиновые азотистые основания. Углеводы в составе
нуклеотидов.
Два типа нуклеиновых кислот, основные понятия об особенностях их
структуры. Сравнительная характеристика ДНК и РНК по составу главных и
минорных азотистых оснований, строению углевода, молекулярной массе,
локализации в клетке и функциям.
Первичная структура ДНК. Связи, соединяющие нуклеотиды в ДНК.
Методы исследования первичной структуры ДНК. Вторичная структура
ДНК. Двойная спираль – структурная организация молекулы ДНК. Принцип
комплементарности пуриновых и пиримидиновых оснований и его реализация в структуре нуклеиновых кислот. Правила Чаргаффа. Данные рентгеноструктурного анализа о периодичности в структуре молекулы ДНК, шаг спирали, диаметр молекулы. Третичная структура ДНК. Способ плотной укладки
длинных цепей ДНК в очень ограниченном пространстве клетки у прокариотов и эукариотов. Гистоны и негистоновые белки. Характеристика гистонов,
их роль в организации третичной структуры ДНК. Состав хроматина.
Свойства ДНК. Величина молекулы, вязкость, поглощение в ультрафиолетовой области спектра, влияние температуры и рН на структуру ДНК.
Строение и свойства РНК. Типы РНК. Матричная (информационная)
РНК. Молекулярная масса, первичная структура. Транспортные РНК – тРНК.
Особенности нуклеотидного состава тРНК. Минорные основания. Вторичная
структура тРНК – тип клеверного листа. Третичная структура. Функциональ-
9
ные участки тРНК. Разнообразие тРНК в клетке. Рибосомальные РНК. Особенности структуры, свойства и функции.
Липиды. Общая характеристика липидов. Классификация липидов в
соответствии с их химическим строением. Функции липидов: энергетическая,
защитная, структурная, как предшественников биологически активных соединений – гормонов и витаминов.
Жирные кислоты – характерные структурные компоненты большинства липидов. Характеристика насыщенных и ненасыщенных жирных кислот,
конформация, физико-химические свойства. Заменимые и незаменимые жирные кислоты.
Триглицериды (триацилглицеролы). Строение, свойства, функции, локализация.
Фосфолипиды – основные компоненты биологических мембран.
Строение фосфолипидов и характеристика входящих в их состав компонентов. Свойства молекул фосфолипида. Конформация молекулы. Взаимодействие с водой. Строение мицелл. Структура и функции главных представителей
фосфолипидов – фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, кардиолипина.
Гликолипиды. Цереброзиды – сфинголипиды, содержащие остатки углеводов. Их строение и локализация в клетках. Ганглиозиды – наиболее
сложные представители сфинголипидов. Структура и функции ганглиозидов.
Локализация ганглиозидов в мембранах нервных и других клеток. Характерный структурный компонент гликолипидов – ацетилнейраминовая кислота.
Стероиды – неомыляемые липиды. Холестерин (холестерол), его эфиры
с жирными кислотами. Структура, свойства холестерола, его локализация в
клетке. Производные холестерина – витамины группы Д, стероидные гормоны (половые гормоны, кортикостероиды), желчные кислоты. Воска, терпены.
Общая характеристика обмена веществ и энергии. Понятие о метаболизме, катаболизме и анаболизме, метаболических циклах и центральных
метаболических путях. Анаэробное окисление глюкозы в клетке (гликолиз).
10
Аэробное окисление веществ в клетке. Образование ацетилКоА. Цикл трикарбоновых кислот. Цепь транспорта электронов в митохондриях. Механизм
окислительного фосфорилирования. Гипотеза Митчела.
Репликация ДНК. Транскрипция. Генетический код, его свойства. Биосинтез белка (трансляция). Стадии биосинтеза белка: образование аминоацил-тРНК, инициация, элонгация, терминация, постсинтетическая модификация.
СЛОВАРЬ ОСНОВНЫХ ТЕРМИНОВ
Активный центр – область молекулы фермента, которая взаимодействует с субстратом. Имеет 2 участка: адсорбционный для связывания с субстратом и каталитический для осуществления биохимической реакции.
Аланин – аминопропионовая кислота, нейтральная аминокислота. αаланин входит в состав белков. β-аланин входит в состав витамина пантотеновой кислоты, дипептидов – карнозина и ансерина.
Аллостерические ферменты – регуляторные ферменты, обладающие
четвертичной структурой. Наряду с активным центром имеют аллостерические центры, к которым присоединяется активатор или ингибитор (например, фосфофруктокиназа).
Альдолазы – ферменты, относящиеся к классу лиаз, осуществляют разрыв С-С связей с образованием альдегидной группы.
Апофермент – белковая часть молекулы сложного фермента.
АТФазы – интегральные белки мембран. Выполняют транспортную
функцию. Используют энергию АТФ. Например, Н+-АТФаза, Na+, K+АТФаза, Ca2+-АТФаза.
Гем – металлопорфириновый комплекс, небелковая часть гемпротеидов (гемоглобина, миоглобина, каталазы, цитохромов, пероксидаз).
Гистоны – белки с повышенным содержанием основных аминокислот,
связаны с ядерной ДНК. Разделяются на 5 классов: Н1, Н2А, Н2В (богаты лизином), Н3 и Н4 (богаты аргинином).
11
Гликолипиды сложные липиды, содержащие углеводный компонент,
аминоспирт сфингозин и остаток жирной кислоты. К ним относятся цереброзиды, ганглиозиды и сульфолипиды.
Гликопротеиды – молекулярные комплексы углеводов и белков, соединенные
ковалентно.
Например,
иммуноглобулины,
церулоплазмин,
трансферрин, фибриноген, протромбин, рибонуклеаза, гонадотропины.
Глобулярные белки – белки с шарообразной формой молекулы, растворимы в воде. К ним относятся, например, все ферменты, альбумины, гистоны.
Дальтон – единица молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот, равная 1/12 массы атома углерода. 1 Да=1,661. 10-24 г.
Дегидрогеназы – ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз.
Субстрат, на который они действуют, является донором протона.
Денатурация – процесс разрушения пространственной структуры (нативной конформации) белков и нуклеиновых кислот с потерей ими физикохимических и биологических свойств. Вызывается денатурирующими агентами: физическими – температура, давление, ультразвук, ионизирующее излучение; химическими – кислоты, щелочи, органические растворители, детергенты, амиды, тяжелые металлы, алкалоиды.
Домен – сверхвторичный уровень пространственной структуры молекулы белка. Отдельные домены обладают функциональной активностью.
Изоферменты – группа ферментов, катализирующих одну реакцию в
разных условиях. Имеют четвертичную структуру. Например, изоферменты
лактатдегидрогеназы, гексокиназы, пируваткиназы.
Изоэлектрическая точка – значение рН, при котором суммарный заряд молекулы аминокислоты или белка равен нулю.
Ингибиторы – различные химические вещества, специфически снижающие активность фермента. По механизму действия различают конкурентные (сходные по структуре с субстратом, связываются с адсорбционным
участком активного центра фермента), неконкурентные (изменяют конфор-
12
мацию каталитического участка активного центра фермента), бесконкурентные (присоединяются к фермент-субстратному комплексу), аллостерические
(присоединяются к регуляторным центрам аллостерических ферментов, изменяя конформацию активного центра).
Карбоксилазы – ферменты класса лиаз, осуществляют присоединение
карбоксильной группы.
Киназы – ферменты класса трансфераз, осуществляют перенос остатка
фосфорной кислоты.
Коллаген – внеклеточный белок, образуемый клетками соединительной
ткани. Основное содержание аминокислот приходится на глицин, пролин и
гидроксипролин. Третичная структура представляет собой 3 спиральные αцепи – тропоколлаген. Четвертичная структура коллагена состоитиз тропоколлагеновых субъединиц.
Кофермент – небелковая часть сложных ферментов. В качестве коферментов выступают нуклеотиды, производные витаминов, тетрапиррольные соединения (гемы).
Мукополисахариды – гетерополисахариды, имеющие отрицательный
заряд. К ним относятся гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, кератансульфат, гепарин.
Незаменимые аминокислоты – аминокислоты, которые не образуются в организме и должны обязательно поступать с пищей. Для человека незаменимыми являются валин, лейцин, изолейцин, треонин, лизин, метионин,
фенилаланин, триптофан. Для детского организма дополнительно еще аргинин и гистидин.
Нуклеазы – ферменты класса гидролаз, расщепляющие фосфодиэфирные связи нуклеиновых кислот. Различают рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, эндонуклеазы (действующие только на внутренние фосфодиэфирные
связи полинуклеотида) и экзонуклеазы (отщепляющие нуклеотиды только с
конца полинуклеотидной цепи).
Нуклеотиды – фосфорные эфиры нуклеозидов. Включают 3 компо-
13
нента: пуриновое (аденин, гуанин) или пиримидиновое (цитозин, Тимин,
урацил) основание, пентозу (рибозу, дезоксирибозу), остаток фосфорной кислоты.
Проферменты – неактивные предшественники, в виде которых синтезируются некоторые ферменты. В форме проферментов образуются протеолитические ферменты пищеварительного тракта, ферменты свертывания крови. Переход профермента в фермент заключается в разрыве нескольких пептидных связей в молекуле профермента, отщеплении пептида и формировании активного центра.
Субстрат – вещество, на которое действует фермент.
Фибриллярные белки – белки, по форме молекулы близкие к вытянутому эллипсу (кератин, эластин, коллаген). Практически не растворимы в воде и солевых растворах.
Фосфолипиды – сложные липиды, фосфатзамещенные эфиры органических спиртов (глицерина, сфингозина).
ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ
В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Общие сведения. Запрещается вход в лабораторию в верхних вещах.
Работа в биохимической лаборатории допускается только в специальном халате, так как вероятна возможность загрязнения, порчи одежды при попадании на нее едких реактивов.
Обращение со стеклом. Химическая посуда - в большинстве случаев
тонкостенная и хрупкая - поэтому при небрежном обращении с ней ее можно
разбить и порезаться. Посуду следует держать в руках осторожно, не сжимая
сильно пальцами. Химическую посуду нельзя резко ставить на стол. В случае
пореза стеклом нужно вначале осмотреть ранку и извлечь из нее осколки
стекла, если они есть, а затем обмыть пораненное место, смазать йодом и заклеить лейкопластырем или завязать бинтом.
Обращение с реактивами. Все концентрированные кислоты и щелочи
должны находиться в вытяжном шкафу. Наливать или насыпать реактивы
14
следует только над столом. Не следует оставлять открытыми банки с реактивами. Пролитые или рассыпанные реактивы нужно немедленно удалить со
стола, вытерев стол тряпкой и обмыв водой. Пролитые концентрированные
кислоты следует засыпать песком, а затем собрать песок дощечкой. Облитое
место необходимо обмыть раствором соды и вытереть тряпкой. При работе с
органическими растворителями (спирты, эфиры, ацетон, бензин, дихлорэтан
и др.) нельзя определять вещества по запаху, так как может произойти отравление их парами. Наполнение пипеток растворами органических растворителей, кислот, щелочей проводят только при помощи груши, так как при набирании этих веществ ртом они могут попасть в ротовую полость и вызвать
ожоги или даже отравление. В случае попадания на кожу концентрированных кислот облитое место нужно вначале обмыть большим количеством воды, а затем разбавленным раствором соды. При попадании растворов щелочей на кожу пораженное место нужно вначале обмыть разбавленным раствором кислоты, а затем водой.
Обращение с нагревательными приборами. На практических занятиях по биохимии часто приходится пользоваться спиртовками. Зажигать спиртовку нужно только спичкой. В пробирке можно нагревать только небольшие
количества вещества, жидкость должна занимать не более 1/3 объема пробирки. Пробирку при нагревании следует направлять в сторону от себя и рядом находящихся людей. Нельзя наклоняться над спиртовкой. Вначале пробирку с веществом следует слегка прогреть всю, а затем нагревать в нужном
месте, не вынимая из пламени спиртовки. Нельзя нагревать пробирку долго в
одной точке, так как теплопроводность стекла низкая, жидкость быстро закипит и выплеснется из пробирки. Нагревать пробирку нужно ниже уровня
жидкости в ней. После нагревания следует сразу погасить спиртовку, накрыв
пламя фарфоровым колпачком. Работа с водяной баней осуществляется только под тягой. При неосторожной работе могут быть ожоги нагретой стеклянной посудой. При ожогах на обожженное место нужно положить ватку, смоченную раствором марганцевокислого калия.
15
Занятие № 1. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ
И АМИНОКИСЛОТЫ
Техника безопасности. На занятии предусматривается работа с концентрированной азотной кислотой и работа со спиртовками.
Задачи занятия:
1. Доказать наличие пептидной связи в растворах белков.
2. Провести качественные реакции на аминокислоты.
3. Определить наличие некоторых аминокислот в составе белков.
1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА БЕЛКИ
Биуретовая реакция – качественная реакция на пептидную связь.
Принцип метода. Реакция основана на образовании внутрикомплексного соединения ионов меди с двумя пептидными связями. В щелочной среде
раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в розово-фиолетовый цвет:
H2N−CH−CO−NH−CH−CO−NH−CH−CO−NH−CH−C=O + 2NaOH + Cu(OН)2
⎜
⎜
⎜
⎜ \
R2
R3
R4
OH
R1
⎯→
R2 O
⎮ ⎢⎢
...−NH−CH−C=N−CH−C−N−CH−C−...
⎢ ⎢
⎢ ⎢⎢
R1 O
R3 O
Cu
R4 O
R6 O
⎢ ⎢⎢
⎢ ⎢⎢
... −NH−CH−C−N−CH−C=N−CH−C−...
⎢ ⎢
R5 O
2−
⎯
∗ 2Na+
Реакция называется биуретовой, так как она характерна и для биурета, состоящего из 2 молекул мочевины (NH2-CO-NH-CO-NH2).
Ход работы. В 3 пробирки наливают по I мл растворов: овальбумина
(яичного белка), зеина (белка кукурузы) и желатина, добавляют 1 мл 10 % рра NаОН и 2 капли 1 % р-ра СиS04. После перемешивания при наличии пеп-
16
тидной связи в исследуемых растворах появляется фиолетовое окрашивание.
Результаты опыта вносят в таблицу, приведенную на стр. 13, отмечая в
соответствующей графе «+» или «−».
2. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АМИНОКИСЛОТЫ
2.1. КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА АРОМАТИЧЕСКИЕ
АМИНОКИСЛОТЫ
Принцип реакции. При нагревании с концентрированной азотной кислотой растворы белка дают желтое окрашивание при наличии в белках циклических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) вследствие образования нитропроизводных этих аминокислот:
OH
OH
O2N
NO2
+ 2HNO3 ⎯→
CH2
⎢
NН2-СН-СООН
тирозин
+ 2Н2О
CH2
⎢
NН2-СН-COOH
динитротирозин
Ход работы. В 4 пробирки наливают по I мл растворов: в 1-ю – ароматической аминокислоты, во 2-ю – овальбумина, в 3-ю – зеина, в 4-ю – желатина. Затем во все пробирки добавляют по 3-5 капель концентрированной
азотной кислоты. При этом во 2 и 3 пробирках появляется осадок свернувшегося белка. Содержимое всех пробирок нагревают до появления желтого окрашивания. Результаты опыта вносят в таблицу.
2.2. РЕАКЦИЯ ФОЛЯ НА ЦИСТЕИН
Принцип реакции. Растворы цистеина и белков, имеющих в своем составе цистеин, дают с нитропруссидом натрия пурпурное окрашивание.
Ход работы. В 4 пробирки наливают по I мл растворов: в 1-ю цистеина, в остальные 3 пробирки – овальбумина, зеина и желатина, добавляют 1 мл
насыщенного р-ра (NH4)2SO4 и 2-3 капли 5 % р-ра нитропруссида натрия. За-
17
тем раствор подщелачивают несколькими каплями 30 % раствора NаОН. Раствор приобретает пурпурный цвет. Результаты опыта вносят в таблицу.
2.3. РЕАКЦИЯ САКАГУЧИ НА АРГИНИН
Принцип реакции. Реакция обусловлена присутствием в молекуле
аминокислоты аргинина гуанидиновой группировки. В щелочном р-ре в присутствии гипохлорита натрия гуанидиновая группа аргинина окисляется.
Окисленный продукт, соединяясь с α-нафтолом, образует продукт конденсации розово-красного цвета:
ОН
2H2N− C−NH−(CH2)3− CH− COOH + 3 NaClO +
⎢⎢
⎢
NH
NH2
аргинин
2 O=
⎯→
2
α-нафтол
=N−C−NH−(CH2)3−CH−COOH + 3NaCl + 3H2O
⎢⎢
⎢
NH
NH2
нафтохинонимин
Ход работы. В одну пробирку наливают I мл раствора аргинина, в остальные 3 пробирки - по I мл растворов овальбумина, зеина и желатина, добавляют 1-2 капли 10 % р-ра NaOH, затем 1-2 капли спиртового раствора αнафтола. Перемешивают, приливают 1-2 капли гипохлорита натрия и вновь
перемешивают. Развивается розово-красное окрашивание.
Оформление работы. Результаты опытов вносят в таблицу:
Р-ры белков
Овальбумин
Качеств. реакции
1. Биуретовая реакция
2. Ксантопротеиновая
реакция
3. Реакция Фоля
4. Реакция Сакагучи
Зеин
Желатин
18
Занятие № 2. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ И
ИХ СВОЙСТВ
Техника безопасности. На занятии предусматривается пользование
спиртовками. Быть внимательными при нагревании пробирок с реактивами.
Задачи занятия:
1. Изучить действие ферментов на примере амилазы.
2. Показать влияние тепловой денатурации на активность фермента.
3. Доказать, что ферменты обладают субстратной специфичностью.
4. Показать действие активаторов и ингибиторов на активность фермента на примере амилазы.
1. ДЕЙСТВИЕ АМИЛАЗЫ НА КРАХМАЛ
Принцип метода. При действии фермента амилазы на субстрат крахмал происходит разрыв ковалентных гликозидных связей в молекуле субстрата. Гидролиз крахмала проходит через стадии образования промежуточных продуктов: амилодекстринов (фиолетовая окраска с йодом), ахродекстринов (красно-бурая окраска с йодом), эритродекстринов (желто-бурая окраска с йодом), мальтодекстринов, изомальтозы. Конечными продуктами гидролиза являются дисахарид мальтоза или моносахарид глюкоза. Крахмал с
йодом дает черно-синее окрашивание. Отсутствие окраски указывает на образование конечных продуктов гидролиза.
Ход работы. В 6 пробирок наливают по 1 мл раствора крахмала, прибавляют 0,5 мл слюны во все пробирки (быстро) и хорошо перемешивают. В
1-ю пробирку сразу вносят каплю йода, в остальные пробирки йод добавляют
с интервалом 2-4 минуты (время зависит от активности амилазы слюны). В
пробирке, где йод не изменяет цвет, гидролиз считается законченным.
С этой пробиркой проводят качественную реакцию на глюкозу – реакцию Троммера, основанную на восстанавливающей способности глюкозы. К
содержимому пробирки прибавляют 2-3 капли 10 % р-ра NaOH и 3-4 капли 7
% р-ра CuSO4. Содержимое пробирки нагревают до кипения. В присутствии
глюкозы выпадает желтый осадок CuOH, который затем переходит в крас-
19
ный осадок Cu2О.
Оформление результатов. Результаты опыта представляют в виде
таблицы:
№ пробирки
1.
2.
…
6.
Время инкубации
Окраска с йодом
Продукты гидролиза
2. ТЕРМОЛАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ
Свойства большинства ферментов ингибироваться при кипячении является характерной особенностью, отличающей биологические катализаторы
от химических, и называется термолабильностью.
Принцип метода. Фермент сахараза катализирует реакцию гидролитического расщепления дисахарида сахарозы с образованием глюкозы и
фруктозы. Наличие конечного продукта реакции – глюкозы определяют с
помощью реакции Троммера.
Ход работы. В 2 пробирки наливают по 1 мл раствора сахаразы (вытяжки из дрожжей). В 1-й пробирке раствор кипятят в течение 2-х минут, во
2-й - оставляют без кипячения. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл сахарозы, перемешивают, оставляют при 37ºС. Через 10 минут с содержимым
пробирки проводят качественную реакцию на глюкозу – реакцию Троммера.
Полученные результаты объясняют и делают вывод о зависимости активности фермента от температуры.
3. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
Принцип метода. Каждый фермент действует только на определенный
субстрат (абсолютная специфичность) или на группу сходных по строению
субстратов (групповая специфичность). Амилаза расщепляет полисахарид
крахмал и не действует на дисахарид сахарозу. Фермент сахараза расщепляет
только сахарозу и не расщепляет крахмал.
20
Ход работы. В 2 пробирки наливают по 1 мл р-ра крахмала, а в 2 другие – по 1 мл р-ра сахарозы. Затем добавляют: в 1-ю и 3-ю – 0,5 мл слюны, во
2-ю и 4-ю – 0,5 мл вытяжки из дрожжей (фермент сахараза). Все пробирки
оставляют на 15 мин при t=37ºС. Затем с каждой пробиркой проводят реакцию Троммера.
Оформление результатов. Полученные результаты представляют в
виде таблицы:
№ пр.
Субстрат
Фермент
Реакция Троммера
Объяснение
1.
2.
3.
4.
4. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ
НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ
Активаторами и ингибиторами называются вещества, способные ускорять или тормозить активность ферментов.
Ход работы. В 3 пробирки наливают по 2 мл крахмала. В 1-ю вносят 3
капли 1 % р-ра NaCl, во 2-ю – 3 капли 1 % р-ра CuSO4, а 3-ю оставляют контрольной. В каждую пробирку добавляют 0,5 мл слюны и оставляют при
37ºС. Через 10 минут добавляют по 1 капле р-ра йода.
Различная окраска проб обусловлена степенью гидролиза крахмала.
Делают вывод о влиянии NaCl и CuSO4 на активность амилазы.
Занятие № 3. ВЫДЕЛЕНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ И
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ИХ КОМПОНЕНТЫ
Техника безопасности. На занятии предусматривается работа с концентрированными кислотами и работа с водяной баней.
Задачи занятия:
1. Провести гидролиз РНП (рибонуклеопротеидов) дрожжей.
21
2. Определить компоненты РНП с помощью качественных реакций.
Большая часть нуклеиновых кислот в клетках встречается в виде комплексов с основными белками. Такие комплексы называют нуклеопротеидами. Для изучения компонентов нуклеопротеидов используют растительный
объект – пекарские дрожжи, содержащие рибонуклеопротеиды (РНП). В результате кислотного гидролиза РНП распадаются на составляющие их компоненты: пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу, фосфорную кислоту, пептиды.
1. ПОЛУЧЕНИЕ ГИДРОЛИЗАТА ДРОЖЖЕЙ
Ход работы. В пробирку помещают 1 г свежих пекарских дрожжей,
наливают 8 мл 10 % р-ра Н2SO4. Пробирку закрывают пробкой, в которую
вставлен обратный холодильник (стеклянная трубка длиной 20-30 см), и ставят на водяную баню на 35 минут. Гидролизат после охлаждения отфильтровывают и используют для проведения качественных реакций.
2. МОЛИБДЕНОВАЯ ПРОБА НА ФОСФОРНУЮ КИСЛОТУ
Принцип реакции: При взаимодействии фосфорной кислоты с молибденовым реактивом (раствор молибдата аммония в азотной кислоте) выпадает желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония:
H3PO4 +12(NH4)2MoO4 +21HNO3 → (NH4)3PO4.12MoO3↓ +21NH4NO3 + 12H2О
Ход работы: К 1 мл гидролизата прибавляют 1 мл молибденового реактива и помещают на 10 минут на водяную баню. В присутствии фосфорной
кислоты появляется желтое окрашивание. При охлаждении выпадает желтый
кристаллический осадок комплексного соединения.
3. РЕАКЦИЯ ТРОММЕРА НА УГЛЕВОДНЫЙ КОМПОНЕНТ
Ход работы: К 0,5 мл гидролизата дрожжей добавляют 1 мл 30 % р-ра
NaOH и 3 капли 7 % р-ра CuSO4. Пробирку нагревают до кипения. Происходит окисление рибозы и выпадает желтый осадок CuOH или красный осадок
Cu2O в результате восстановления Cu2+ до Cu+.
22
4. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ПОЛИПЕПТИДЫ
Ход работы: К 0,5 мл гидролизата добавляют 1 мл 10 % раствора
NaOH и 0,5 мл 1% раствора CuS04. Наблюдают появление окраски.
Оформление работы. Результаты работы представляют в виде таблицы:
№
1.
2.
3.
4.
Название этапа
работы
Условия реакции (реактивы,
t°С, время, уравнение
реакции)
Наблюдаемые
эффекты
Вывод
23
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. ун-тов / А.А. Анисимов, А.Н. Леонтьева, И.Ф. Александрова и др. М.: Высш. школа, 1986.
– 551 с.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина,
1998. – 704 с.
3. Биохимия. Учебник для вузов / под ред. Е.С. Северина. М.: ГЭОТАРМЕД, 2003. – 784 с.
4. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / под ред. Е.С.
Северина, А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. – 448 с.
5. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. – Ростов-на-Дону: Феникс,
1999. – 544 с.