Тиреотропный гормон (TSH)

1
TSH, HUMAN GmbH
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2006/451 от 11.04.2006 года
Тиреотропный гормон (TSH)
Иммуноферментный тест для количественного определения тиреотропного гормона в сыворотке крови
человека
REF Номер по каталогу: 54030
Набор рассчитан на 96 определений
IVD
НАЗНАЧЕНИЕ
Тиреотропный гормон (ТТГ, тиреотропин, Thyroid Stimulating Hormone, TSH) представляет собой
гликопротеин с молекулярным весом около 28000 дальтон, синтезируемый передней долей гипофиза. ТТГ
считается наиболее чувствительным индикатором из используемых при диагностике первичного и
вторичного (гипофизарного) гипотиреоза. Повышение концентрации ТТГ в сыворотке служит ранним и
чувствительным признаком снижения запасов тиреоидных гормонов и, в совокупности с пониженным Т4,
является диагностическим признаком первичного гипотиреоза. Рост ТТГ демонстрирует классический
пример обратной связи между гипофизом и щитовидной железой. Кроме того, определение ТТГ позволяет
дифференцировать вторичный и третичный гипотиреоз от первичного. При вторичной и третичной форме
заболевания уровень Т4 обычно пониженный, а ТТГ – либо пониженный, либо в норме.
ПРИНЦИП МЕТОДА
ТТГ иммуноферментный тест фирмы HUMAN основан на классическом «сэндвич» методе ИФА. Являясь
тестом 2-го поколения, в нем использованы высокоспецифичные моноклональные антитела к ТТГ,
адсорбированные на лунках микропланшета. На первой стадии инкубации образцы сыворотки,
калибраторы или контроли, а также конъюгат (меченые пероксидазой антитела к ТТГ) смешивают в лунках,
при этом образуется структура типа «сэндвич», связанная с поверхностью лунок за счет взаимодействия с
иммобилизованными антителами. После инкубации не связавшийся конъюгат удаляется промывкой.
Добавление в лунки субстрата (стадия 2) приводит к образованию окрашенного продукта, который меняет
цвет с синего на желтый при добавлении стоп-реагента, вносимого для остановки реакции. Интенсивность
окраски измеряется фотометрически и пропорциональна концентрации ТТГ в образце. Оптическая
плотность калибраторов и образцов измеряется при помощи специальных фотометров для
микропланшетов или автоматических анализаторов (например, приборы линии HUMAREADER или ELISYS
производства фирмы HUMAN). Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной
кривой, построенной по калибраторам, входящим в состав набора.
МАТЕРИАЛЫ, РЕАГЕНТЫ И ИХ СОСТАВ
MIC
Стрипы 8-луночные (в рамке-держателе)
Стрипы, разделяемые на отдельные лунки, покрытые моноклональными мышиными
антителами к ТТГ, в упаковке с влагопоглотителем
12 шт.
CAL Калибраторы A - F (цветная кодировка крышек и этикеток: А - белый, В - желтый,
6×2,0 мл
CON Конъюгат (белая крышка)
1×13 мл
С - зеленый, D - красный, Е - синий, F - черный)
Готовые к использованию; на основе человеческой сыворотки, содержащие ТТГ в
концентрациях:
0 (А), 0,5 (В), 3,0 (С), 6,0 (D), 15,0 (Е) и 30,0 (F) мМЕ/л
Готовый к использованию, красного цвета, содержащий антитела козы к ТТГ, меченые
пероксидазой хрена; pH 6,25±0,1
WS Промывочный раствор (белая крышка)
1×50 мл
SUB Субстратный реагент (черная крышка)
1×13 мл
Концентрат Трис-буфера, 10 ммоль/л; содержит хлорид натрия (8 г/л); pH 7,2±0,2
Готовый к использованию, бесцветный или слегка голубоватый, содержащий
3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (1,2 ммоль/л)
и перекись водорода (≤6,0 ммоль/л); pH 3,6±0,25
STOP Стоп-реагент (красная крышка)
Серная кислота 0,5 моль/л
Клейкая пленка для стрипов
1×15 мл
2 шт.
• Общее содержание консервантов в реагентах < 0,1%.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Не пипетируйте реагенты ртом, не курите, не принимайте пищи во время исследования. Избегайте контакта
с кожей и слизистыми. Обращайтесь с образцами пациентов и калибраторами CAL как с материалами,
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, е-mail: [email protected]
2
TSH, HUMAN GmbH
_____________________________________________________________________________________________________
несущими инфекционную опасность. Проверка калибраторов CAL (на уровне доноров), входящих в состав
набора, на наличие антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, а также HВsAg, дала отрицательный результат.
В соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (GLP) пользуйтесь защитной одеждой и
одноразовыми перчатками.
После исследования все материалы, контактировавшие с образцами пациентов или калибраторами CAL ,
должны быть инактивированы официально регламентированными методами (автоклавированием в течение
1 часа при температуре 121 °С, замачиванием в 5% растворе гипохлорита натрия в течение 1 часа или
обработкой в соответствии с инструкцией каким-либо иным лабораторным дезинфектантом).
Стоп-реагент STOP содержит серную кислоту, способную вызвать ожоги глаз, кожи и слизистых покровов.
При контакте с этим реагентом тщательно промойте пораженное место большим количеством проточной
воды, после чего обратитесь к врачу.
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Реагенты стабильны в течение срока годности, указанного на этикетках, в условиях хранения при
температуре 2-8 °С.
После вскрытия флаконов реагенты пригодны к использованию в течение 60 дней (см. также раздел
«ПРИМЕЧАНИЕ»).
Стрипы MIC (код TSH)
− Планшет, состоящий из 12 стрипов в рамке-держателе, запаян под вакуумом в пластиковый
металлизированный пакет с влагопоглотителем.
− Перед вскрытием упаковку с планшетом следует прогреть до комнатной температуры.
− Неиспользованные стрипы необходимо вернуть обратно в пакет с влагопоглотителем и плотно закрыть
герметизирующей застежкой. Стрипы, хранящиеся таким образом при температуре 2-8 °С, можно
использовать в течение всего срока годности (см. также раздел «ПРИМЕЧАНИЕ»).
− Не касайтесь пальцами дна лунок и их верхней кромки.
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ
Перед использованием дайте всем реагентам прогреться до комнатной температуры. (15-25 °С).
Неиспользуемые реагенты следует всегда хранить при температуре 2-8 °С.
Рабочий раствор промывочного буфера WASH
Для получения рабочего промывочного раствора разведите концентрат WS в соотношении 1+20 свежей
деионизированной водой, например, 50 мл WS+ 1000 мл воды = 1050 мл WASH
Промывочный раствор стабилен в течение 60 дней при 15-25 °С.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Сыворотки
Не используйте образцы с сильным гемолизом или липемией.
Образцы могут храниться до 5 дней при температуре 2-8 °С, или до 30 дней при температуре минус 20 °С.
Повторное замораживание образцов не допускается. После размораживания образцы необходимо
гомогенизировать. Видимые включения следует удалить центрифугированием или фильтрацией.
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Внимание! Точность полученных результатов зависит от строгого следования приведенной ниже процедуре
исследования.
Предварительные замечания
Р1: Не смешивайте реагенты из разных партий наборов. Не путайте крышки от флаконов, чтобы избежать
риска контаминации. Не пользуйтесь просроченными реагентами.
Р2: Не пользуйтесь реагентами, если они загрязнены, либо имеют запах или вид, отличный от обычного.
Р3: Аккуратно впишите номера калибраторов CAL, образцов и контролей в листок-формуляр, приложенный
к набору.
Р4: Подсчитайте количество лунок, необходимое для данного исследования. Выньте необходимое
количество стрипов MIC или отдельных лунок из упаковки и вставьте их в рамку-держатель.
Р5: Исследование калибраторов CAL, образцов и контролей должно проводиться в дубликатах. Вносить
образцы и контроли необходимо как можно ближе ко дну лунки.
Р6: Всегда вносите реагенты в лунки в одном и том же порядке, чтобы свести к минимуму разброс по
времени реакции между отдельными лунками. Это важно для воспроизводимости результатов. Общее
время пипетирования образцов не должно превышать 10 минут. В противном случае, калибраторы для
калибровочной кривой следует вносить в отведенные для них лунки после пипетирования первой половины
образцов. Если для анализа используется больше одного планшета, калибровочную кривую следует
выполнять на каждом планшете.
Р7: Любые воздушные пузырьки в лунках должны быть удалены до начала инкубации или измерения
оптической плотности.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, е-mail: [email protected]
3
TSH, HUMAN GmbH
_____________________________________________________________________________________________________
Р8: Добавление рабочего раствора субстрата SUB инициирует процесс развития окраски, который
прерывается при добавлении стоп-реагента STOP. Во время развития окраски инкубируйте планшет в
темноте.
Р9: После каждого пипетирования аккуратно покачайте планшет MIC в течение 20-30 сек для
перемешивания содержимого лунок, избегая разбрызгивания. При возможности используйте шейкер для
микропланшетов (например, встроенный шейкер планшетного фотометра HUMAREADER).
Методика промывки
Промывка лунок является исключительно важной стадией. Недостаточная промывка ведет к снижению
точности полученных результатов и завышению оптической плотности.
W1: Удалите жидкость из лунок и внесите в них рабочий раствор промывочного буфера WS. Через 30
секунд удалите жидкость из лунок и повторите промывку еще 4 раза.
W2: При использовании автоматического промывочного устройства заправьте его рабочим раствором
промывочного буфера WASH и промойте лунки 5 раз. Следите за тем, чтобы вошер целиком заполнял
лунки жидкостью и полностью удалял ее через каждые 30 секунд (остаток жидкости должен быть менее 15
мкл).
W3: После окончания промывки удалите остатки жидкости из лунок, постукивая перевернутым планшетом о
фильтровальную бумагу.
Схема проведения анализа
Перед использованием все реагенты и образцы должны быть комнатной температуры.
Стадия 1
Внесите в лунки:
CAL A – F; каждый в две лунки (дубликаты)
Образцы, контроли; каждый в две лунки (дубликаты)
Конъюгат CON во все лунки
Лунка [объем жидкости в мкл]
А1…D2
Калибраторы
50
-100
E2…
Образцы
-50
100
300
300
100
100
100
100
Перемешайте и закройте стрипы МIC клейкой пленкой
Инкубируйте 60 минут при 20-25 °С.
Промойте лунки 5 раз, как описано (см. W1 - W3).
Рабочий раствор промывочного буфера WASH
Стадия 2
Внесите в лунки:
Рабочий раствор субстрата SUB
Инкубируйте 15 минут при 20-25 °С в темноте (см. Р8).
Добавьте стоп-реагент STOP
Тщательно перемешайте.
После добавления стоп-реагента как можно быстрее (в течение не более чем 30 минут) измерьте
оптическую плотность при длине волны 450 нм, используя (по возможности) референтную длину волны
630-690 нм.
ВАЛИДАЦИЯ ТЕСТА
Результаты теста могут считаться достоверными, если выполняются следующие условия:
Максимальная оптическая плотность ОПmax (калибратор CAL F) > 1,2
Концентрация ТТГ при 80% ОПmax = 24,2 ± 4,6 мМЕ/л
Концентрация ТТГ при 50% ОПmax = 13,8 ± 3,3 мМЕ/л
Концентрация ТТГ при 20% ОПmax = 5,5 ± 3,0 мМЕ/л
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Для определения концентрации ТТГ в образце строится калибровочная кривая:
1. Постройте на миллиметровой бумаге калибровочный график, откладывая по оси абсцисс (X)
концентрации ТТГ калибраторов CAL (в мМЕ/л), а по оси ординат (Y) – соответствующие им дубликаты
значений оптической плотности. Дубликаты перед нанесением не усредняйте.
2. Проведите между точками на графике плавную линию.
3. Для определения неизвестной концентрации ТТГ (в мМЕ/л) в образце (S) отложите на оси Y среднее
для дубликата значение ОП450 и проведите горизонтальную прямую до пересечения с калибровочной
кривой. Вертикальная линия, проведенная из точки пересечения до оси X, укажет значение
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, е-mail: [email protected]
4
TSH, HUMAN GmbH
_____________________________________________________________________________________________________
концентрации ТТГ в образце. Дубликаты значений ОП450 для образцов с неизвестной концентрацией
можно предварительно усреднить.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Общая концентрация ТТГ в сыворотке зависит от множества факторов: функционирования щитовидной
железы и гипоталамуса, чувствительности гипофиза к тиреотропин-релизинг гормону (ТРГ). В связи с этим
одно только определение ТТГ не достаточно для оценки клинического статуса.
Повышение уровня ТТГ может быть вызвано приемом лекарственных препаратов, таких как домперидон,
амидазон, йод, фенобарбитал и фенитоин. Пониженные концентрации ТТГ отмечались при приеме
пропранолола, метимазола, допамина и D-тироксина. Генетические вариации ТТГ, а также распад его
исходной молекулы на фрагменты может влиять на связывающие характеристики антител и,
следовательно, на конечный результат анализа.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Результаты обследования эутиреоидной популяции:
нормальный диапазон концентраций ТТГ составляет 0,3 – 6,2 мМЕ/л
Каждая лаборатория должна самостоятельно определять нормальные диапазоны концентрации ТТГ с
учетом используемых в данной лаборатории оборудования, способа взятия крови и методики анализа.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ИФА набор ТТГ фирмы HUMAN, как тест 2-го поколения, имеет чувствительность лучше, чем 0,10 мМЕ/л, и
может использоваться, таким образом, для скрининга на гипертиреоз.
Данный тест стандартизован по 2-му Международному референтному препарату ВОЗ (WHO 2nd IRP for TSH
80/558).
Сведения об аналитических характеристиках ИФА теста ТТГ фирмы HUMAN можно найти в Отчете об
испытаниях, опубликованном в Интернете на сайтах:
http://www.human.de/data/gb/vr/el-tsh.pdf
или http://www.human-de.com/data/gb/vr/el-tsh.pdf
Примечание
Компоненты набора стабильны до окончания указанного срока годности даже после вскрытия их упаковки.
Тем не менее, контаминация реагента зависит от количества отборов реагентов. 60-дневный срок
использования реагентов установлен из соображения надежности получения результатов.
При работе с набором следует обеспечить постоянное соблюдение в лаборатории основных требований
GLP (надлежащей лабораторной практики).
Данные требования в т.ч. включают: необходимость плотно закрывать флаконы их собственными
крышками немедленно после отбора реагентов; отбирать только необходимое количество реагента,
если предполагается его соприкосновение с другими растворами, способными вызвать контаминацию,
например образцами пациентов; как можно быстрее возвращать исходные реагенты, если они не
используются, в стандартные условия хранения (2-8 °С).
Всегда должно проверяться соблюдение условий достоверности результатов теста.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
54030-TSH.doc
1/25/2010 10:21:00 AM
Оригинал EL-TSH
INF 5403H01 GB
12-2008-27
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, е-mail: [email protected]