компьютерная микроскопия для детектирования homo-fret

КОМПЬЮТЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ
ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ HOMO-FRET
И.Г. Пальчикова, Е.С. Смирнов
ФГБУН Конструкторско-технологический институт научного приборостроения
СО РАН, 8(383)306 58 74, the-first-person@yandex.ru
Разработана и создана лазерная цитофотометрическая система, обоснован метод выбора установок цифровой камеры для захвата микроизображения, найдены алгоритмы
и создано программное обеспечение для обработки флуоресцентных микроизображений биологических препаратов для обнаружения HOMO-FRET.
Получение, сохранение, преобразование и обсчёт цифровых микроскопных изображений, пригодных для получения количественной информации об анизотропии поляризации флуоресценции, вызванной резонансным транспортом энергии между GFPмаркированными белками в живой клетке не возможна без использования компьютерных технологий. Создана лазерная цитофотометрическая система на базе биологического микроскопа, выработана процедура и тестовые объекты, в том числе биологические, для тестировании и калибровки цифровой камеры с повышенной дигитализацией
(14 бит) и системы в целом. Компьютерная Фельгеновская цитофотометрия применялась для отработки методики и определения характеристик системы. Получены экспериментальные результаты по изучению диминуции хроматина у двух видов циклопов с
погрешностью измерений, не превышающей погрешность наиболее точного оборудования, которое до сих пор использовалось в мировой практике (коэффициент вариации
2,6%).
Методами флуоресцентной и поляризационной микроскопии с компьютерными технологиями выявлено явление HOMO-FRET на образцах, подготовленных в ИМКБ СО
РАН. Биологические образцы: выращенные на покровном стекле клетки фибробластов
человека (линия 293Т) трансфецированные с помощью ДНК векторов pEGFP-C1 и
pEGFP3-C1, полученных от авторов работы [1], в которой впервые наблюдался гомоFRET между двумя молекулами GFP.
Выявлена значительная зависимость анизотропии (рис. 1) от расчетной области, выбранной в пределах изображения клетки, что указывает на возможность идентификации клеточной организации, лежащей на пределе разрешения микроскопа. Разработан
специальный алгоритм определения границ клетки с учетом дифракционных эффектов.
Полученные экспериментальные результаты близки к данным, опубликованным в [1].
а)
б)
в)
Рис. 1 – а), б) микрофотографии одного и того же препарата для взаимно перпендикулярных положений анализатора; в) визуализация результатов расчета анизотропии.
1. A. Squire et al./Journal of Structural Biology 147 (2004) 62 – 69.
80