идентификация расовой принадлежности изолятов

ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ.
Научно-технический бюллетень Всероссийского
научно-исследовательского института масличных
культур. Вып. 2 (151–152), 2012
_____________________________________________
_________________________________________________________________________________
ИДЕНТИФИКАЦИЯ РАСОВОЙ
ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ИЗОЛЯТОВ
PLASMOPARA HALSTEDII,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОРАЖЁННЫХ
РАСТЕНИЙ АМБРОЗИИ
ПОЛЫННОЛИСТНОЙ
М.В. Ивебор,
кандидат сельскохозяйственных наук
С.А. Рамазанова,
кандидат биологических наук
Т.С. Антонова,
доктор биологических наук
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, д. 17
тел.: (861)2758653, e-mail: [email protected]
Ключевые слова: подсолнечник, ложная
мучнистая роса, Plasmopara halstedii,
физиологические
расы,
амброзия
полыннолистная, Ambrosia artemisifolia,
молекулярные маркеры, ДНК, SNPs,
ПЦР.
УДК 633.72:632.11:581.1
Введение. Оомицет Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni вызывает
ложную мучнистую росу культурного
подсолнечника и ряда других представителей
семейства
Сложноцветных
(Asteraceae). Один из первых исследователей этого патогена M. Nishimura (1922)
полагал, что его появление можно ожидать почти на любом сложноцветном. На
основе специализации этого возбудителя
болезни, рядом исследователей неоднократно подвергалось ревизии его таксономическое положение, что подробно
описано в работе Н.С. Новотельновой
(1966). Зарубежные и отечественные
ученые проводили экспериментальные
работы по изучению специализации P.
halstedii, испытывая виды разных родов
семейства сложноцветных – Helianthus,
Girsium, Xanthium, Erigeron, Artemisia,
Ambrosia и других. Заболевали только
растения подсолнечника [1; 4; 5]. На этом
основании было высказано предположение об особой расе или форме
патогена, приспособившейся лишь к
подсолнечнику [5].
Фактически до 80-х годов ХХ века в
Европе не было отмечено случаев присутствия этого гриба в природе на других
видах, кроме культурного подсолнечника.
В 1984 г. были найдены растения
Xanthium strumarium L. с признаками
поражения оомицетом P. halstedii, который был изолирован и после тестирования оказался патогенным для подсолнечника [13].
В середине 90-х годов прошлого
столетия были обнаружены больные
ложной мучнистой росой растения амброзии полыннолистной (Ambrosia artemisiifolia L.) и астры ивовой (Aster salignus L.)
в Краснодарском крае [3]. Возбудители
оказались способны к заражению культурного подсолнечника.
Несколько растений A. artemisiifolia с
признаками поражения патогеном находили в 1998 г. в Венгрии. Была установлена принадлежность изолятов P. halstedii
к расе 730. Авторы предположили, что
виды амброзии не просто поддерживают
существование паразита в природе, но и
влияют на его вирулентность положительно и даже селективно. Микроскопические
исследования
выявили
сосуществование в одних и тех же тканях
листа P. halstedii и Albugo tragopogonis
(DC.) Gray. [14].
Пораженные растения A. artemisiifolia
выявляли и в Белгородской области. С
помощью заражения линий-дифференциаторов подсолнечника изоляты оомицета были идентифицированы как раса 310.
Цель наших исследований – выявить
пораженные ложной мучнистой росой
сорных растений семейства сложноцветных
в
Краснодарском
крае,
определить
патогенность для подсолнечника и расовую
принадлежность возбудителя.
Методы исследований. Лабораторные
исследования проводили в лаборатории
иммунитета и электрофореза ГНУ
ВНИИМК Россельхозакадемии. Объектами изучения служили изоляты P.
halstedii, собранные в 2011 г. при
обследовании полей подсолнечника в
районах Краснодарского края. Листья со
спороношением с пораженных растений
помещали в полиэтиленовый пакет с
этикеткой с указанием даты и места сбора
и хранили в морозильной камере при
температуре -80 оС.
Для идентификации рас использовали
стандартный тест-набор следующих линий-дифференциаторов подсолнечника:
триплет-группа 1 – HA-304 (D-1), RHA-265
(D-2), RHA-274 (D-3); триплет-группа 2 –
DM-2 (D-4), PM-17 (D-5), 803-1(D-6);
триплет-группа 3 – HAR-4 (D-7), HAR-5
(D-8), HA-335 (D-9).
Семянки подсолнечника проращивали
при температуре 25 °С в рулонах фильтровальной бумаги до размера корешка 1–
2 см. Для каждого изолята патогена
проростки всех девяти линий-дифференциаторов раскладывали рядами по 10
штук в пластмассовые растильни с
прокаленным речным песком. Покрывали
корни полосками влажной ваты и
фильтровальной бумаги. В отстоянную
водопроводную воду смывали зооспорангии с собранных в поле и замороженных
листьев. Полученной суспензией зооспорангиев поливали растильни из расчѐта
150 мл в каждую, при температуре 16 °С.
Выращивали зараженные проростки при
температуре 25 оС днем и 18 °С ночью
(16-часовой фотопериод) в течение 7–9
дней. Затем обильно поливали отстоявшейся водопроводной водой комнатной
температуры, понижали температуру
воздуха до 16–17 °С и создавали влажную
камеру
путем
накрытия
растилен
полиэтиленовой пленкой на ночь.
Определение рас вели по наличию
спороношения на первой паре настоящих
листьев.
Линии-дифференциаторы рас возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника выращены на полях ЦЭБ ГНУ
ВНИИМК Россельхозакадемии.
ДНК выделяли из соскобов конидиального спороношения P. halstedii и тканей
пораженных семядольных листьев подсолнечника с применением модифицированного СТАВ-метода [15]. Полимеразную цепную реакцию и рестрикцию
продуктов амплификации проводили по
методикам, описанным нами ранее [2].
Результаты и обсуждение. При
ежегодных с 2004 г. мониторинговых
наблюдениях популяции P. halstedii на
подсолнечнике в Краснодарском крае
обследовались и сорные представители
семейства сложноцветных. Сорное растение, амброзия полыннолистная, довольно
часто присутствует в посевах подсолнечника и на прилегающих территориях.
В 2011 г. было обнаружено шесть
растений этого вида с признаками
заболевания ложной мучнистой росой.
Возбудитель с каждого растения амброзии был апробирован на патогенность к
проросткам подсолнечника. Они инфицировались с проявлением всех типичных
симптомов заболевания (рис. 1).
С применением международного тестнабора линий-дифференциаторов подсолнечника была установлена принадлежность к расе 330 всех шесть изолятов P.
halstedii с растений амброзии. По данным
предыдущих исследований, эта раса –
наиболее распространѐнная в Краснодарском крае на подсолнечнике последние
семь лет.
А – спороношение P. halstedii на листе
амброзии (стрелки), В – его крупный план;
С – зооспорангии и часть спорангиеносца;
D – спороношение на проростках подсолнечника, зараженных изолятом с амброзии.
Рисунок 1 – Лист амброзии полыннолистной
(A. artemisiifolia), пораженный ложной
мучнистой росой (стрелки указывают на
спороношение P. halstedii).
При микроскопировании
спороношения с трех из шести найденных
растений амброзии, как и в исследованиях венгерских коллег [14], вместе с P.
halstedii был обнаружен A. tragopogonis –
возбудитель белой ржавчины подсолнечника и других сложноцветных. Однако
при инокуляции подсолнечника этой смесью оомицетов, симптомов заболевания,
вызываемого A. tragopogonis, не проявлялось; на инфицированных проростках
было спороношение только P. halstedii.
Был проведен SNP-анализ шести локусов ДНК пяти изолятов патогена,
собранных с амброзии. Все изученные
SNP-локусы имели те же аллели, что были
обнаружены с применением этой технологии у изолятов расы 330 P. halstedii с
подсолнечника (таблица, рис. 2).
Таблица
Аллельное состояние SNP-локусов ДНК
P. halstedii с разных хозяев
Хозяин
Раса
Pha6
Подсолнечник 330
2
-//330
2
-//330
2
Амброзия
330
2
-//330
2
-//330
2
-//330
2
-//330
2
* 2, 1 – аллели локусов
Pha54
Локус
Pha82 Pha56 Pha99
Pha74
1
1
1
2
2
2
2
1
2
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
1
1
2
2
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
Рисунок 2 – Электрофоретические
спектры продуктов рестрикции
фрагментов ДНК по локусу Pha54 у
изолятов P. halstedii: 1–6 – изоляты,
собранные с амброзии; 7 – изолят расы 330 с
подсолнечника; М – маркер молекулярного
веса; К – контроль (без обработки
рестриктазой).
У изолятов расы 330, выделенных с
подсолнечника, был выявлен внутрирасовый полиморфизм в локусе Pha56.
Аналогичный полиморфизм проявился в
этом локусе и у изолятов, собранных с
амброзии (рис. 3).
Рисунок 3 – Электрофоретические спектры
продуктов рестрикции фрагментов ДНК
по локусу Pha56 у изолятов P. halstedii:
1, 2, 8–11 – разные изоляты расы 330 с
подсолнечника; 3–7 – изоляты, собранные
с амброзии полыннолистной.
Как уже было сказано выше, в Краснодарском крае P. halstedii обнаруживали
только на двух видах сложноцветных (A.
artemisiifolia и A. salignus), кроме культурного подсолнечника. Однако этот
патоген способен вызывать ложную
мучнистую росу не менее чем у 80 видов
из 35 родов семейства Asteraceae [6; 8; 9;
10; 11; 13]. Не у всех изолятов P.halstedii,
выделенных разными авторами из
растений этих видов, определялась способность заражать культурный подсолнечник. Тем не менее,
способность
поражать такое большое число видов
растений показывает широкие возможности адаптации паразита и выживания
его в неблагоприятных условиях среды. В
частности, наши данные показывают, что
раса 330 может сохраняться на амброзии
при возделывании устойчивого к ней
сортимента подсолнечника. Не исключена и возможность формирования у P.
halstedii рас различной вирулентности в
дикорастущих сорных резерватах.
Таким образом, изоляты P. halstedii,
выделенные с амброзии полыннолистной
в Краснодарском крае, идентичны расе
330 возбудителя ложной мучнистой росы
подсолнечника. Это свидетельствует о
том, что раса 330 P. halstedii может
сохраняться и возобновляться на амброзии при смене возделываемого сортимента подсолнечника с восприимчивого на
устойчивый к ней. Амброзия полыннолистная является естественным резерватом данной расы в крае. Выделенные
из амброзии вместе с P. halstedii изоляты
A. tragopogonis не были патогенными для
проростков подсолнечника в искусственных условиях.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ, грант 11-04-96501.
Список литературы
1. Новотельнова, Н.С. Ложная мучнистая роса подсолнечника / Н.С. Новотельнова. – М.-Л.: Наука, 1966. – 150 с.
2. Рамазанова, С.А. Дифференциация
изолятов возбудителя ложной мучнистой
росы подсолнечника на основе SNPмаркеров / С.А. Рамазанова, Т.С. Антонова, М.В. Ивебор // Масличные культуры:
Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. – 2011. –
Вып.1 (146–147). – С. 122–126.
3. Терешина, М.В. Биологическое
обоснование методов ранней диагностики
и приемов снижения вредоносности ложной мучнистой росы подсолнечника /
М.В. Терешина // Автореф. дис. канд.
биол. наук. – Краснодар, 1996. – 26 с.
4. Христова, Е. Маната по слънчогледа
– Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni
– в България и средства за борба с нея / Е.
Христова, Н. Митов // Болгарск. акад. отд.
с.-х. наук. – 1960. – № 3. – С. 381–397.
5. Ягодкина, В.П. Ложная мучнистая
роса подсолнечника в Краснодарском
крае / В.П. Ягодкина // Земледелие. –
1955. – № 7. – С. 95–97.
6. Dankers, H. First report of Plasmopara
halstedii on Perennial Black Eyed Susan in
North Florida / H. Dankers, J.W. Kimbrough, M.T. Momol // Online. Plant Health
Progress. – 2004. – doi:10.1094/PHP-20040119-01-HN.
7. Gulya, T.J. First report of crossinfectivity of Plasmopara halstedii from
marshelder to sunflower / T.J. Gulya // Plant
Dis. – 2002. – V. 86. – P. 919.
8. Gulya, T.J. Sunflower diseases / T.J.
Gulya, K.Y. Rashid, S.M. Masirevic // Sunflower technology and production. – USA,
1997. – V. 35. – P. 263–381.
9. Hall, G. Unusual or interesting records
of plant pathogenic oomycetes / G. Hall //
Plant Pathol. – 1989. – V. 38. – P. 604–611.
10. Kleber, A. First report of Plasmopara
halsiedii on Ageratum housionianum in Distrito Federal, Brazil / A. Kleber, J. Mottos,
L.A. Pio, B. Gouveia, J. lnacio, J.C. Dianese //
Fitopatol. Braz. – 2006. – V. 31. – P. 413.
11. Leppik, E.E. Origin and specialization
of Plasmopara halstedii complex on Compositae / E.E. Leppik // FAO Plant Protection Bulletin. – 1966. – V.14. – P. 72–76.
12. Nishimura, M. Studies in Plasmopara
halstedii / M. Nishimura // J. Coll. Agric. / Hokkaido Imp. Univ. – 1922. – V.11. – P. 185–216.
13. Viranyi, F. Population studies on
Plasmopara halstedii: host specificity and
fungicide tolerance / F. Viranyi, I. Wacgz //
15th International Sunflower Conference, Toulouse, France. – 2000. – V.2. – P. 155–160.
14. Walcz, I. Study on an Ambrosia isolate of Plasmopara halstedii / I. Walcz, K.
Bogar, F. Virani // Helia 23. – 2000. –
№. 33. – P. 19–24.
15. Zolan, M.E. Inheritance of DNA
methylation in Corpinus cinereous / M.E.
Zolan, P.J. Pukkila // Mol. Cell Biol. – 1986.
– V. 6. – №1. – Р. 195–200.