Полный текст статьи
реклама
Окта-гуанидин морфолино восстанавливает экспрессию дистрофина в сердечной и скелетных мышцах у mdx мышей. Bo Wu,1 Yongfu Li,2 Paul A Morcos,2 Timothy J Doran,1 Peijuan Lu,1 and Qi Long Lu1 1Department of Neurology, McColl-Lockwood Laboratory for Muscular Dystrophy Laboratory, Neuromuscular/ALS Center, Carolinas Medical Center, Charlotte, North Carolina, USA 2Gene Tools, LLC, Philomath, Oregon, USA *Author for correspondence: Email: [email protected] Received September 3, 2008; Accepted February 5, 2009. This article has been cited by other articles in PMC. Введение Терапия антисмысловыми олигонуклеатидами (AO) недавно разработана и имеет большой потенциал для лечения заболеваний начиная от вирусных инфекций до раковых образований. Успешное применение терапии позволило расширить область ее применения, и данный метод применили для лечения миодистрофии Дюшена. Этот метод использует определенную последовательность для AON предназначенную для пропуска экзона, для того чтобы исправить рамку считывания видоизмененной мРНК дистрофина, и представляет беспрецедентную перспективу генной терапии по двум главным причинам. Во-первых, ген состоит из 79 экзонов- 2.3 миллиона пар оснований. Форма мышечного дистрофина содержит 3 685 аминокислот (427 kd) и может быть разделена на четыре структурных области: NH3 окончание, стержень, область богатую цистеином, и СООН- окончание. Что более важно, стержень, кажется, не важен для функций дистрофина. Например, удаление экзонов от 17 до 49 было связано с только умеренным клиническим фенотипом. Точно так же, искусственно построенный микродистрофин с удалением экзонов 18 - 58 остается в значительной степени функциональным. Во-вторых, значительная доля мутаций происходят в этой некритической области гена. Таким образом функции белка могут быть сохранены несмотря на пропуск видоизмененного экзона или экзонов, необходимых для восстановления открытой рамки считывания. Считается, что терапия AON была бы в состоянии исправить почти все типы мутаций в стержне, преобразовывая > 60% МДД к почти нормальным фенотипам или более умеренному фенотипу МДБ. Ободрительно, что дистрофин- положительные волокна найдены во многих мышцах при МДД у людей и у моделей животных. Эти так называемые реверантные волокна, кажется, продукт спонтанно измененного сплайсинга, при котором происходит пропуск видоизмененного экзона или экзонов, которые разрушают рамку считывания эндогенного гена, присутствие этих реверантных волокон может обеспечить толерантность к дистрофину, синтезированному при лечении AON. Потенциал AO-установленного пропуска экзона для лечения МДД, был первоначально продемонстрирован в системах клеточных культур и у mdx мышей. Позже, восстановление экспрессии дистрофина такой терапией было продемонстрировано у пациентов с МДД при внутримышечных инъекциях 2'O метилфосфоротиоата (2OMePS) в Нидерландах. Однако, пропуск экзона и экспрессия дистрофина являются очень переменными, и терапевтическое количество дистрофина было достигнуто только в некоторых скелетных мышцах посредством системной поставки. Кроме того, эффективная экспрессия дистрофина не была достигнута в сердечной мышце. Это могло уменьшить лечебное действие терапии антисмысловыми олигонуклеатидами при МДД, поскольку болезнь затрагивает все мышцы тела, и смерть обычно наступает вследствие отказа дыхательных и сердечных мышц. Один подход для улучшения эффективности пропуска экзона должен увеличить эффективность поставки препарата, путем применения пептидов улучшаюших доставку препарата в клетку. 1 Последний раз, мы и другие группы показали высокие уровни экспрессии дистрофина и в скелетных и в сердечных мышцах при применении олигонуклеатидов, меченных специально предназначенным богатым аргинином пептидом. Однако, длительные повторные применения пептидов, требуемых для того, чтобы доставлять АОN, повышают риск иммунной реакции. Гуанидиновая головка богатых аргинином пептидов ответственна за эффективную поставку морфолиновых олигонуклеатидов, и группа из 8-10 гуанидиновых головок показывают самый выраженный эффект усиления поставки. Здесь, мы сообщаем об использовании непептидного дендримерного октагуанидина с морфолиновым олигомером, созданным для мышей для пропуска экзона 23 (E23) ) [Vivo-MorpholinoE23 (Vivo-ME23)].. Мы продемонстрировали, что поставка значительно улучшила эффективность ME23-вызванного пропуска E23 у mdx мышей, модели МДД. Внутривенное введение (IV) 6 мг/кг - VivoME23 привело к достижению функциональных уровней дистрофина в скелетных мышцах, эквивалентных достигнутому при использовании 300 мг/кг неизмененного ME23. Повторные инъекции Vivo-ME23, восстановление экспрессии дистрофина во всех скелетных мышцах и частичной экспрессии в сердечной мышце, не привели к иммунным реакциям. Это вместе со снижением патологии мышц указывает на возможность использования Vivo-MorpholinoE23, как терапия для большинства пациентов с МДД. Эффективная экспрессия дистрофина была также продемонстрирована в гладких мышцах кровеносных сосудов всего тела. Результаты Внутримышечная инъекция Vivo-ME23 индуцировала экспрессию дистрофина в> 90% мышечных волокон mdx мышей, что указывает на точечную мутацию в E23 гена дистрофина, за исключением нескольких реверантных волокон или кардиомиоцитов. Наши предыдущие исследования показали, что морфолиновый олигомер E23 ( ME23), предназначаясь для граничной последовательности E23 (последние семь оснований) и интрона 23 (первые 18 оснований) у мыши в гене дистрофина смог вызвать пропуск E23 и экспрессию дистрофина в мускулах mdx мышей. Однако, восстановление функционального количества дистрофина в мускулах требует повторенных инъекций большого количества ME23. Кроме того, индукция синтеза дистрофина была очень переменна в пределах скелетных мышц и была едва обнаружимыма в сердечной мышце. Мы подозреваем, что низкая эффективность эффектов АО происходит прежде всего из-за плохого проникновения морфолино в клетки, строго ограничивая количество AO получающий доступ к внутриклеточным структурам. Чтобы исследовать, может ли поставка морфолино улучшить эффекты АО, мы сначала сравнили окта-гуанидин конъюгированный ME23 (виво-ME23) (рисунок 1a) к неизмененному ME23, введенному внутримышечно, или один или с амфифильным пептидом. Все формы ME23 вызвали экспрессию дистрофина в передней большеберцовой мышце (ПБМ) взрослой (4-5 недель) mdx мыши (рисунок 1b). Число дистрофин-положительных волокон было 61.80 ± 1.66 % и 95.80 ± 1.16 % при инъекциях 2 и 10 мкг виво-ME23, соответственно, значительно выше чем при инъекциях неизмененного ME23 (40.60 ± 0.93 % и 63.20 ± 1.16 %) и ME23 + endoporter (48.80 ± 1.59 % и 71.80 ± 2.67 %) (каждая группа n = 6, t-тест, P <0.05) (рисунок 1c). Отмечено, что экспрессия дистрофина была более однородна в мускулах получавших вивоME23 в обеих дозировках, тогда как группы дистрофин-отрицательных волокон часто смешивались с дистрофинположительными волокнами в мускулах, которые лечились другими формами ME23, особенно в более низкой дозировке (рисунок 1b). Более высокая эффективность виво-ME23 была также продемонстрированный вестерн блот анализом (рисунок 1d). Не наблюдалось увеличенное местное повреждение мышц или множественные ядра (данные не показаны). Эти результаты предлагают, чтобы виво-морфолинос улучшили эффекты АО без местной токсичности. Рисунок 1 Эффективное восстановление экспрессии дистрофина в брюшных мышцах и диафрагме внутрибрюшинной инъекцией виво-ME23 Затем, мы исследовали виво-ME23 при системном пропуске экзона у mdx мышей при внутрибрюшинной (ВБИ) инъекцией, поскольку этот способ поставки, как сообщали, эффективно вызвал пропуск экзона всюду в тканях тела. Мышам проводили единственную инъекцию 6 мг/кг или 30 мг/кг виво-ME23, и пропуск экзона и индукция дистрофина были исследованы 2 недели спустя. Дистрофин был обнаружен иммуногистохимией в> 40 % волокон и в брюшных мускулах и в диафрагме после лечения 6 мг/кг виво-ME23, особенно в волокнах мускула в слоях около брюшинной поверхности живота. Однако, дистрофин был обнаружен в <5 % волокон во всех других скелетных мускулах и не обнаружен в сердечной мышце (Рисунок 2a, c). То же самое количество неизмененного ME23, введенного внутриперитонеально, вызывало образование <5% дистрофин-положительных волокон и в брюшных мускулах и в диафрагме, и не было увеличения дистрофин-положительных волокон в любых других скелетных или сердечной мышце (данные не показаны). Эффективность индукции дистрофина была далее улучшена более высокой дозой, 30 мг/кг виво-ME23. Почти все волокна мускула были дистрофин- положительны и в диафрагме и в брюшных мускулах, включая более глубокие слои. Пропуск E23 в этих тканях было подтвержденный ОТ-ПЦР (рисунок 2f). Экспрессия дистрофина во всех других скелетных мышцах оставалась на низких уровнях - <15 % волокон являлись дистрофин- положительными. Снова, дистрофин-положительные кардиомиоциты не были обнаружены в сердечной мышце, за исключением некоторых изолированных реверантных кардиомиоцитов, которые были также замечены у нелеченных mdx мышей (иллюстрация 2, Дополнительный рисунок S1). Эти результаты предпологают, что интраперитонеальная инъекция обуславливает местные эффекты, но ограничивает системный эффект АО. Это было поддтверждено результатами повторных инъекций. Введение 15 мг/кг виво-ME23 через день в течение 20 дней вызвало экспрессию дистрофина во всех волокнах и диафрагмы и брюшных мускулов с интенсивностью окрашивания, подобного в нормальных мускулах контрольных мышей C57B/6 (Рисунок 2a, e). Однако, <30 % дистрофин-положительных волокон были замечены в других скелетных мышцах включая бицепс, ПБМ, икроножную, и квадрицепс, и изменения в уровнях экспрессии дистрофина между волокнами и мускулами были очевидны. Кроме того, в сердце экспрессия дистрофина была обнаружена в очень немногих кардиомиоцитах (<1 %), хотя слабое, неоднородное мембранное окрашивание присутствовало в маленькой порции клеток (рисунок 2e). Отмеченное неравенство в уровнях экспрессии дистрофина между диафрагмой, сердцем, и другими скелетными мускулами было также подтверждено ОТ-ПЦР и вестерн блот анализом (Иллюстрации 2f и 3e3e). Рисунок 2 Рисунок 3 Внутривенные инъекции виво-ME23 вызывают высокий уровень экспрессии дистрофина во всех скелетных мышцах. Мы исследовали системные эффекты виво-ME23 при внутривенных инъекциях. Исследование mdx мышей получивших единственную инъекцию 6 мг/кг виво-ME23 привело к обнаружению экспрессии дистрофина в> 50% волокон всех скелетных мускулов при иммуногистохимии спустя 2 недели после инъекции (Рисунок 3a, c; Дополнительная иллюстрация S1) со значительным сокращением уровней сывороточной креатинкиназы (рисунок 3f). Более важно что сильная экспрессия дистрофина была продемонстрирована в значительном числе кардиомиоцытов (до 300 кардиомиоцитов в поперечном сечении сердца) сопровождаемая слабым окрашиванием дистрофина в значительной доле остающейся сердечной мышце (рисунок 3c). Напротив, единственная внутривенная инъекция 300 мг/кг неизмененного ME23 произвела <50 % дистрофин-положительных волокон (Рисунок 3b, d; Рисунок S1 дополнения). Число кардиомиоцитов с сильной экспрессией дистрофина в сердце оставалось на уровнях, подобных наблюдаемым у невылеченных mdx мышей (<20 кардиомиоцитов в любом поперечном сечении сердца), и не было обнаружено даже слабой экспрессии в остающихся кардиомиоцитах. Значительно более высокая эффективность индукции дистрофина у получавших виво-ME23 чем неизмененный ME23 была подтверждена вестерн блот анализом (рисунок 3e). Повторенные внутривенные инъекции восстанавливают экспрессию дистрофина в почти всех волокнах скелетных мышц. Мы ввели 6 мг/кг виво-ME23 внутривенно пять раз с интервалом каждые две недели взрослым mdx мышам и исследовали мускулы спустя 2 недели после последней инъекции. Почти все волокна во всех скелетных мускулах, включая диафрагму, межреберные мускулы, трапецевидную, грудные, и поясничные мускулы показывали нормальные уровни экспресиии дистрофина при иммуногистохимии, с более слабой экспрессией, наблюдаемой только в маленькой порции волокон (<10 %) (рисунок 4a, Дополнительный рисунок S1). Что более важно, индукция дистрофина увеличилась значительно в сердечной мышце, в > 40 % кардиомиоцитов выявлен дистрофин, хотя значительное изменение сохранилось между областями (рисунок 4b, Дополнительный рисунок S1). Вестерн блот анализ показал> 50 % нормальных уровней дистрофина во всех скелетных мускулах и ~10 % в сердечной мышце (рисунок 4c). Как ожидалось с удалением единственного E23, дистрофин был подобен нормальному белку (рисунок 4c). Правильный пропуск предназначенного E23 был подтвержден ОТ-ПЦР (рисунок 4e). Экспрессия дистрофина была также восстановлена в гладких мускулах кровеносных сосудов в легких и кишечнике (рисунок 4f). Эти результаты предполагают, что виво-морфолино имеет высокий уровень. Рисунок 4 Повторное лечение виво-ME23 улучшает патологию мускула без очевидной токсичности Гистологически, многоядерные инфильтраты, наблюдался в любых мускулах Vivo-ME23-леченных mdx мышей. Лечение сокращало количество ухудшающихся волокон, идентифицированных иммунологически на присутствие иммуноглобулина (Ig) в пределах волокон, указывая на поврежденную (таким образом прохудившийся) мембрану (рисунок 5a). число волокон положительных-Ig колебалось от 10 до 31 у невылеченных mdx мышей в ПБМ, квадрицепсе, и бицепсе, тогда как только три или меньше волокон было после виво-ME23 лечения. В дополнение было обнаружено значительное сокращение уровней креатинкиназы сыворотки по сравнению с таковыми у невылеченных mdx мышей, хотя все еще немного выше чем нормальный диапазон (рисунок 3f). Процент центрально образованных ядро в волокнах был уменьшен в мышцах рассматриваемых мышей, но это не является статистически существенным по сравнению с контрольными mdx мышами (Дополнительный рисунок S2). Это предполагает, что существенные изменения в центрально образованных ядрах в волокне этих мускулов могут потребовать долгосрочного лечения или более высоких уровней экспрессии дистрофина. Однако, улучшение диафрагмы ясно наблюдалось. Смерти животных не произошли в течение 10 недель при повторных внутривенных инъекциях виво-ME23 и вес рассматриваемых мышей оставался подобным (Дополнительный рисунок S3). И печень и почки были нормальны при гистологическом анализе, без очевидного воспалительного инфильтрата, и уровни ферментов сыворотки оставались в пределах нормальных диапазонов (Рисунок 3f и 5b5b). Рисунок 5 Отсутствие иммунной реакции на виво-Morpholino Совокупный эффект экспрессии дистрофина после пяти системных инъекций почти через 3 месяца предполагает, что виво-морфолино не иммуногенен и разрешает повторенное введение. Это совместимо с результатом иммунологических исследований для Т лимфоцитов . CD3-положительные лимфоциты присутствовали спорадически в почти всех мускулах невылеченных mdx мышей, включая диафрагму, где дистрофия мускула было очевидна. Число CD3-позитивных-клеток редко наблюдалось во всех мускулах мышей получавших лечение (рисунок 5c). Мы также искали определенные гуморальные иммунные реакции в сыворотке у мышей после единственного и повторного применения виво-морфолино. Исследования с сывороткой леченных мышей и мышей контроля для обнаружения определенных антител были проведены. Только подобные второстепенные сигналы были обнаружены в сыворотке всех мышей включая C57Bl/6 и невылеченных mdx мышей (рисунок 5d). Обсуждение Использование AO, чтобы вызвать определенный пропуск экзона было среди самых важных методов терапии для МДД. В наших предыдущих исследованиях мы показали, что системная доставка 2OMePS AO mdx мышам смогла эффективно пропустить E23, с его мутацией, и таким образом выявить обнаружимое количество дистрофина во всех скелетных мускулах. Однако, 2OMePS, AON вызвал экспрессию дистрофина в количестве, которое рассматривают как не существенное терапевтически в любом мускуле после повторенных инъекций. Наше последующее исследование продемонстрировало, что та же самая последовательность, синтезируемая как олиго морфолино значительно увеличила эффективность пропуска экзона, когда поставлялась внутримышечно. Кроме того, повторные инъекции произвели терапевтические уровни экспрессии дистрофина во всех скелетных мускулах. Различие в эффективности между этими двумя этими препаратами до конца не доступно пониманию. Однако, AOвызванная экспрессия дистрофина была самой заметной в миопатических областях мускула, предполагая, что AO обеих структур может войти в волокно мускула, главным образом, через частично поврежденную (прохудившуюся) мембрану. Поставка этих двух неизмененных препаратов, поэтому, вероятно пассивная, а не процесс активного транспорта. Одно из существенных различий между этими двумя составами - то, что 2OMePS AON, как естественные олигонуклеатиды, отрицательно заряженный, тогда как олиго морфолино - нейтрален. Поэтому может быть отталкивание между одноименными зарядами 2OMePS AON и молекулы в клеточной мембране, что препятствует эффективной поставке AO в клетки. Нейтральный морфолино, однако, будет иметь намного меньше препятствий для контакта с поверхностью клеток и может таким образом войти в волокна мускула более эффективно, особенно с прохудившейся мембраной. Это, однако, вероятно объясняет только частичное различие в эффекте АО между этими двумя составами. Зависимость от повреждения мускула за эффективную поставку нейтрального морфолино имеет преимущество ограничения количества AO входяших в непредназначенные клетки, таким образом уменьшая возможные побочные эффекты. Однако, это ограничение представляет потенциальный барьер для эффективного лечения МДД. Экспрессия дистрофина, вызванная неизмененным морфолино, была очень переменной во всех скелетных мускулах, где асинхронные циклы дегенерации и регенерации приводят к волокнам с разными уровнями мембранной проходимости. Значительные числа волокон остаются дистрофин- отрицательными даже после семи последовательный внутривенных инъекций морфолино 2 мг (за взрослую мышь, equivent к массе тела на ~80 мг/кг). Этих моделей предсказали, что в волокнах мускула, спасенные ранее морфолино-вызванным пропуском экзона, возможно, повторно начнутся дистрофические процессы прежде, чем они могли снова быть защищены дальнейшим входом АО. Такое требование для возвращающихся циклов регенерации и дегенерации в рассматриваемых мускулах строго ограничило бы ценность терапии АО для лечения МДД. Здесь мы демонстрируем, что димерный октагуанидин может значительно улучшить эффективность поставку морфолино, с последовательной индукцией экспрессии дистрофина во всех волокнах скелетных мышц. Таким образом, восстановление и поддержание экспрессии дистрофина могут быть достигнуты и в гистологически нормальных и в поврежденных мускулах регулярной инъекцией виво-морфолино. Производство дистрофина в сердечной мышце становится все более и более важным для качества и продолжительности жизни пациентов, поскольку улучшенный уход за больным уменьшает их смертность от других причин. Однако, пропуск экзона в сердечной мышце все еще менее эффективен чем в скелетных мышцах по причинам, которые еще не поняты. Гуанидиновые группы в виво-морфолино химически подобны активным компонентам аргинина, и полиаргинин коньюгированных олигонуклеатидовpo предложили войти в целевые клетки протеогликан-установленным эндоцитозом. Поэтому, может быть возможно, что различия между этими двумя типами зависят от количества и распределения протеогликана на поверхности клеток, что опирается на различие в эффективности пропуска экзона. Другие факторы, такие как различия в кровообращении волокон мускула остаются не до конца исследованными. Однако, наше открытие, что виво-морфолино в состоянии произвести значительное количество дистрофина в сердечной мышце, дает надежды на достижение восстановления сердечной функции терапией АО. Главный барьер для общего успешного применения лечения АО - трудности в достижении эффективной поставки таких составов в целевые ткани in vivo. Улучшенноя поставка была достигнута с использованием проникающих через клетку пептидов. Более значительно, что очень эффективное восстановление экспрессии дистрофина и в скелетных и в сердечных мускулах у mdx мышей было достигнуто морфолино со специально предназначенными богатыми аргинином пептидами Однако, использование пептидов повышает риск потенциальной иммунной реакцией, предотвращая возможность повторенного введения, которое важно для лечения. Чтобы уклониться от иммуногенности пептидов, мы исследуем использование половины дозы из синтетических белков и многократных неестественных цепей, каждой содержащий главные группы гуанидина, построенные на димерном ядре. Эта специальная химическая особенность устраняет использование богатых аргинином линейных пептидов, которые могут быть иммуногенны. Мы ожидаем, что синтетическая природа этой половины поставки вряд ли будет вызывать цитолитическую иммунную реакцию. Это поддержано фактом, что число лимфоцитов и другого мононуклеаров уменьшено в мускулах мышей, получавших лечение. Однако, мы знаем, что такие полимеры могут произвести гуморальный ответ, который ограничил бы эффекты, чтобы поддержать функциональные уровни дистрофина в мускулах. Эта перспектива не подтверждена нашими результатами, экспрессия дистрофина было сохранена и увеличена после повторенных инъекций виво-ME23 более чем 10 недель, и никаких антител не было обнаружено. В резюме наша демонстрация, что димерный окта-гуанидин как компонент поставки позволил эффективную поставку морфолино к мускулам во всем теле, включая сердечную мышцу, и то восстановление экспрессии дистрофина к функциональным уровням у mdx мышей, представляет значительный шаг вперед в нашем усилии преодолеть барьер эффективной системной поставки АО. Возможно, также важное открытие, что димерный октагуанидин морфолино является очень мощным для проникновения в ткани. Это было продемонстрировано эффектом на брюшные мышцы после интраперитонеальной инъекции. Клетки даже глубокх слоев далеко от брюшинной поверхности были эффективно изменены. Высокая степень модуляции РНК и проникновения в ткани вместе обеспечивает возможность использования виво-морфолино для многих тканей и сосудистых систем для лечения других болезней от рака до вирусных инфекций. Дополнительные материалы Рисунок S1. Процент дистрофин-позитивных волокон в мышцах mdx мышей (n = 6)леченных внутривенными инъекциями VivoME23 30мг/кг ME23 ; внутрибрюшинными инъекциями 6мг/кг Vivo-ME23; внутрибрюшинными инъекциями 30мг/кг Vivo-ME23; повторными внутрибрюшинными инъекциями 15мг/кг Vivo-ME23, 10 раз каждый день. 300мг/кг внутривенных инъекций; 6мг/кг Vivo-ME23 внутривенными инъекциями; повторными внутривенными инъекциями 6мг/кг Vivo-ME23 , 2 раза в неделю, всего 5 инъекций. Рисунок S2. Процент волокон с центрально расположенными ядрами.Vivo-ME23, образцы мышц mdx мышей (n=6) Рисунок S3. Изменение веса в течение эксперементального периода с введения первой инъекции 6 мг/кг Виво-морфолино E23 (День 0). Не было потери массы у mdx мышей получавших лечение. n=6. Ссылки Blow N. Small RNAs: delivering the future. Nature. 2007;450:1117–1120. [PubMed] Kumar P, Wu H, McBride JL, Jung KE, Kim MH, Davidson BL, et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 2007;448:39–43. [PubMed] Sherratt TG, Vulliamy T, Dubowitz V, Sewry CA, and Strong PN. Exon skipping and translation in patients with frameshift deletions in the dystrophin gene. Am J Hum Genet. 1993;53:1007–1015. [PMC free article] [PubMed] Dunckley MG, Manoharan M, Villiet P, Eperon IC, and Dickson G. Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet. 1998;7:1083–1090. [PubMed] Mann CJ, Honeyman K, Cheng AJ, Ly T, Lloyd F, Fletcher S, et al. Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:42–47. Lu QL, Mann CJ, Lou F, Bou-Gharios G, Morris GE, Xue SA, et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med. 2003;9:1009–1014. [PubMed] Dickson G, Hill V, and Graham IR. Screening for antisense modulation of dystrophin pre-mRNA splicing Neuromuscul Disord 2002. 12S67–S70.S70suppl. 1. [PubMed] Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson AA, den Dunnen JT, van Ommen GJ, and van Deutekom JC. Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy Neuromuscul Disord 2002. 12S71– S77.S77suppl. 1. [PubMed] England SB, Nicholson LV, Johnson MA, Forrest SM, Love DR, Zubrzycka-Gaarn EE, et al. Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin. Nature. 1990;343:180–182. [PubMed] Sakamoto M, Yuasa K, Yoshimura M, Yokota T, Ikemoto T, Suzuki M, et al. Micro-dystrophin cDNA ameliorates dystrophic phenotypes when introduced into mdx mice as a transgene. Biochem Biophys Res Commun. 2002;293:1265–1272. [PubMed] Winnard AV, Klein CJ, Coovert DD, Prior T, Papp A, Snyder P, et al. Characterization of translational frame exception patients in Duchenne/Becker muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 1993;2:737–744. [PubMed] Mirabella M, Galluzzi G, Manfredi G, Bertini E, Ricci E, De Leo R, et al. Giant dystrophin deletion associated with congenital cataract and mild muscular dystrophy. Neurology. 1998;51:592–595. [PubMed] Lu QL, Morris GE, Wilton SD, Ly T, Artem'yeva OV, Strong P, et al. Massive idiosyncratic exon skipping corrects the nonsense mutation in dystrophic mouse muscle and produces functional revertant fibers by clonal expansion. J Cell Biol. 2000;148:985–996. [PMC free article] [PubMed] van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhuizen WS, Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, et al. Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med. 2007;357:2677–2686. [PubMed] Alter J, Lou F, Rabinowitz A, Yin H, Rosenfeld J, Wilton SD, et al. Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology. Nat Med. 2006;12:175–177. [PubMed] Eagle M, Bourke J, Bullock R, Gibson M, Mehta J, Giddings D, et al. Managing Duchenne muscular dystrophy—the additive effect of spinal surgery and home nocturnal ventilation in improving survival. Neuromuscul Disord. 2007;17:470–475. [PubMed] Wagner KR, Lechtzin N, and Judge DP. Current treatment of adult Duchenne muscular dystrophy. Biochim Biophys Acta. 2007;1772:229–237. [PubMed] Fletcher S, Honeyman K, Fall AM, Harding PL, Johnsen RD, Steinhaus JP, et al. Morpholino oligomer-mediated exon skipping averts the onset of dystrophic pathology in the mdx mouse. Mol Ther. 2007;15:587–1592. Wu B, Moulton HM, Iversen PL, Jiang J, Li J, Spurney CF, et al. Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modified morpholino oligomer. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:14814–14819. Yin H, Moulton HM, Seow Y, Boyd C, Boutilier J, Iverson P, et al. Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum Mol Genet. 2008;17:3909– 3918. [PubMed] Jearawiriyapaisarn N, Moulton HM, Buckley B, Roberts J, Sazani P, Fucharoen S, et al. Sustained dystrophin expression induced by peptide-conjugated morpholino oligomers in the muscles of mdx mice. Mol Ther. 2008;16:1624–1629. [PMC free article] [PubMed] Futaki S, Nakase I, Suzuki T, Youjun Z, and Sugiura Y. Translocation of branched-chain arginine peptides through cell membranes: flexibility in the spatial disposition of positive charges in membrane-permeable peptides. Biochemistry. 2002;41:7925–7930. [PubMed] Hoffman EP, Morgan JE, Watkins SC, and Partridge TA. Somatic reversion/suppression of the mouse mdx phenotype in vivo. J Neurol Sci. 1990;99:9–25. [PubMed] Sicinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS, Barnard EA, Darlison MG, and Barnard PJ. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 1989;244:1578–1580. [PubMed] Lu QL, Rabinowitz A, Chen YC, Yokota T, Yin H, Alter J, et al. Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102:198–203. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur J Biochem. 2003;270:1628– 1644. [PubMed] Summerton J, and Weller D. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997;7:187–195. [PubMed] Abes S, Moulton HM, Clair P, Prevot P, Youngblood DS, Wu RP, et al. Vectorization of morpholino oligomers by the (R-AhxR)4 peptide allows efficient splicing correction in the absence of endosomolytic agents. J Control Release. 2006;116:304– 313. [PubMed] Li YF, and Morcos PA. Design and synthesis of the dendritic molecular transporter that achieves efficient in vivo delivery of morpholino antisense oligo. Bioconjug Chem. 2008;19:1464–1470. [PubMed] Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org/ Оригинальная статья http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835139/?tool=pubmed
