Слайд 1 - Объединенный институт ядерных исследований

ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ
ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И МЕТИЛИРУЮЩИХ
АГЕНТОВ НА СЕТЧАТКЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VIVO
В.А.Тронов, Ю.В. Виноградова, М.Ю. Логинова, И.Г. Панова, В.А. Поплинская
М.А. Островский
В.А.Тронов, Ю.В. Виноградова, М.Ю. Логинова, И.Г. Панова,
В.А. Поплинская М.А. Островский
Институт химической физики РАН им. Н.Н.Семенова, Москва,
Институт биохимической физики РАН им. Н.М.Эмануэля, Москва,
Объединенный Институт ядерных исследований, Дубна,
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва
Схема и микрофотография сетчатки мышей
Схема из сайта http://webvision.med.utah.edu/sretina.html#overview
Срез сетчатки из: Логинова и соавт. 2008
пигментный эпителий
колбочки и палочки
наружный ядерный слой
наружный плексиформ
внутренний ядерный слой
внутренний плексиформ
ганглиозные клетки
Пигментный зпителий содержит зпителиальные клетки
Колбочки+палочки+наружный ядерный слой – фоторецепторные клетки
Наружный плексиформ – синаптическая область, содержит горизонтальные
клетки, связывающие фоторецепторы
Внутренний ядерный слой содержит биполярные клетки траслирующие
сигнал от фоторецепторов к ганглиозным клеткам
Внутренний плексиформ – синаптическая область, содержит амакриновые
клетки, связывающие между собой ганглиозные клетки
Аксоны ганглиозных клеток формируют зрительный нерв
Все клетки сетчатки – терминально дифференцированные,
постмитотические клетки, неспособные к регенерации
РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ СЕТЧАТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Rats + X-rays 2-20 Gy
RPE
PhotoR
Segments
ONL
mit swelling cell death
Memrane
Cell
damage
death
>5Gy, 180d >20 Gy, 30d 2Gy, >1h
>10 Gy, 30d
Ref
[1]
[2]
PhotoR
Segments
ONL
cell
hypertrophy
prolifer into
inner retina
disorgan.+
reduction
cell loss
ONL-absence
6 mths
8 mths
4 mths
6 mths
Segments
ONL
Rats + diabetes + X-rays 15 Gy
RPE
RPE
Ref
[3]
Протонная терапия меланом глаза человека:
кумулятивная доза фракционированного облучения, вызывающая
патоморфологические
изменения
сетчатки
у
человека,
индивидуально варьирует от 54 до 75 Гр, при этом ретинопатия
обнаруживается спустя несколько месяцев после радиационного
воздействия .
высокая радиоустойчивость+
неспособность к саморегенерации
подавление механизма гибели – апоптоза
Для делящихся клеток убедительно показана связь между
повреждением генома и последующей гибелью клеток. Детально
изучены пути трансляции первичного сигнала от повреждения до
активации апоптоза. Для постмитотических клеток эта связь
практически не исследована.
Более того, постмитотические клетки, каковыми являются клетки
сетчатки, на протяжение всей жизни активно используют небольшую
часть своего генома, рассматривая остальную больщую часть как
неинформативный балласт. В связи с этим репаративная активность
этих клеток на сегодня мало изучена.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИАЦИОННОЙ
ПОВРЕЖДЕННОСТИ ГЕНОМА КЛЕТОК СЕТЧАТКИ, ЕГО РЕПАРАЦИИ И
СВЯЗИ ЭТИХ ПРОЦЕССОВ С ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ ЭФФЕКТОМ
РАДИАЦИИ И ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ
1. ДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЙ НА СЕТЧАТКУ МЫШЕЙ
МИКРОФОТОГРАФИИ СРЕЗОВ СЕТЧАТКИ МЫШЕЙ, ОБЛУЧЕННЫХ ПРОТОНАМИ В
ДОЗЕ 14 Гр (А) И СРЕДНЯЯ +/-SD ТОЛЩИНА ЯДЕРНОГО СЛОЯ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ (В)
А
Ядерный слой
фоторецепторов
В
Control
24 h
7d
ВЕСТЕРН-АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ Р53 И АТМ В СЕТЧАТКЕ МЫШЕЙ,
ПОДВЕРГНУТЫХ ГАММА- И ПРОТОННОМУ ИЗЛУЧЕНИЮ
ГАММА, 14 Гр
p53
0
14
3
14
6
14
12
14 Доза, Гр
24 Время, ч
ПРОТОНЫ, 14 Гр
АТМ
Время, ч
• Динамика экспрессии белков р53 и АТМ совпадает с
динамикой репарации одно- и двунитевых разрывов ДНК в
сетчатке после облучения животных
• В ответ на возникшие разрывы ДНК в сетчатке
экспрессируются белки р53 и АТМ, которые способствуют
репарации ДНК, но не апоптозу клеток сетчатки.
. Повреждение и репарация ssДНК (светлые квадраты) и dsДНК (черные квадраты)
в сетчатке мышей после облучения животных гамма и протонами в дозе 14 Гр
40
dsDNA-comets
ssDNA-comets
DNA damage, mt
DNA damage, mt
40
30
20
10
dsDNA-comets
ssDNA-comets
30
20
10
0
0
0
5
10
Time, h
15
20
0
5
10
Time, hr
15
20
Микрофотографии срезов сетчатки, демонстрирующие морфологические изменения
сетчатки и толщины сетчатого (1) и ядерного (2) слоев фоторецепторов
после локального облучения протонами в дозе 25 ГР
1
2
К
4 дн
6 дн
*
*
Процент
25
**
**
20
2
15
10
2
1
1
5
0
2
1
4 дн
К
*
6 дн
25 Гр
p>0,05, ** p<0,01
ЭКСПРЕССИЯ ПРО-АПОПТОТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ В СЕТЧАТКЕ МЫШЕЙ В ОТВЕТ НА
ОБЛУЧЕНИЕ ПРОТОНАМИ В ДОЗЕ 25 ГР
1 – контроль, 2 – сетчатка 24 ч после облучения протонами в дозе 25 Гр
2
Экспрессия белков на клетку
1
p<0,0001
200
160
120
80
2
p<0,01
p<0,0001
40
0
1
P53
2
1
1
FasR
2
Casp3
ДИНАМИКА РЕПАРАЦИИ SS-ДНК В СЕТЧАТКЕ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ
ПРОТОНАМИ В ДОЗАХ 14 ГР И 25 ГР
ssДНК-повреждение, mt
14 Гр
25 Гр
120
100
80
60
40
20
0
0
20
60 80 100 120 140 160
Время после облучения, ч
RESUME 1
γ-/p-ИЗЛУЧЕНИЯ
ДОЗА 14 Гр
1 Начальная генотоксичность
14
2 Полная репарация ДНК (t≥10 ч)
3 +экспрессия белков-сенсоров
повреждений ДНК р53, АТМ (t≤14 ч)
4 Нормализация экспрессии р53, АТМ
(t=24 ч)
5 Отсутствие цитотоксического
эффекта (t≤7 дн)
ДОЗА 25 Гр
1 25
Начальная генотоксичнолсть
2 Неполная репарация ДНК (t≥24 ч)
3 +экспрессия белка-сенсора р53
4 Сохранение экспрессии р53,
+экспрессия про-апоптотических
белков FasR, Casp-3
5 Цитотоксический эффект
(Апоптоз?)
1 Связь между повреждением ДНК и цитотоксическим эффектом через долгоживущие
нерепарированные повреждения ДНК (ОР, ДР)
2 Цитотоксический сигналинг от повреждений ДНК ассоциирован с про-апоптотическими
белками р53 и FasR
3 Если и существует порог цитотоксического эффекта излучений, то он определяется
эффективностью репаративной системы.
2. ДЕЙСТВИЕ МНМ НА СЕТЧАТКУ МЫШЕЙ
ДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СЕТЧАТКЕ У МЫШЕЙ В ОТВЕТ НА ОДНОКРАТНОЕ В/Б ВВЕДЕНИЕ
МЕТИНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ (МНМ)
Контроль
3 дня
7 дней
110
100
90
80
70
16
12
8
4
0
Деструкция ф/р слоя сетчатки
контроль
7 дн после МНМ
Снижение толщины ф/р слоя (черные колонки)и
увеличение числа апоптотических ядер (серые колонки)
в ф/р слое сетчатки
Фрагментированные и пикнотические ядра в
фоторецепторном слое сетчатки
АПОПТОТИЧЕСКИЙ ОТВЕТ СЕТЧАТКИ МЫШЕЙ НА ВВЕДЕНИЕ МНМ
ЭКСПРЕССИЯ ПРО-АПОПТОТИЧЕСКИХ
БЕЛКОВ СЕТЧАТКИ В ОТВЕТ НА МНМ.
1 – интактные животные,
2 - спустя 24 ч после в/б введения МНМ в
дозе 70 мг/кг
АПОПТОТИЧЕСКАЯ ФРАГМЕНТАЦИЯ
DS-ДНК В СЕТЧАТКЕ В ОТВЕТ НА МНМ
16
2
12
2
8
4
2
2
0
1
P53
1
PARP
1
1
FasR Caspase-3
dsДНК-повреждения на клетку, mt
Intracellular protein levels
20
35
30
25
20
15
10
5
0
-10
0
10
20
30
40
Время, ч
50
60
70
80
Концентрационная зависимость эффекта МНМ говорит в пользу наличия
порога цитотоксического действия МНМ и индукции дегенерации сетчатки
контроль
МНМ 35 мг/кг
МНМ 70 мг/кг
7 дн после введения
Поврежденность ssДНК, mt
РЕПАРАЦИЯ ДНК В СЕТЧАТКЕ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ МЫШАМ МНМ
В ДОЗАХ 70 МГ/КГ (1) И 35 МГ/КГ (2)
100
80
60
40
1
20
10
2
0
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Время, ч
RESUME 2
МНМ ВНУТРИБРЮШИННО, ОДНОКРАТНО, 70 МГ/КГ
1
2
3
4
5
6
Цитотоксический эффект через t≥3 дн
Устойчивая (24 ч) +экспрессия сенсоров повреждений ДНК р53, PARP
+экспрессия про-апоптотических FasR, caspase-3
Апоптотическая фрагментация DS-ДНК
Наличие долгоживущих нерепарированных повреждений ДНК (≥30%)
Острая концентрационная зависимость цитотоксического эффекта
МНМ-индуцированная репарация
ssДНК в клетках сетчатки мышей
Гамма-/протон-индуцированная
репарация ssДНК в клетках сетчатки
мышей
1
100
80
60
40
2
1
20
10
2
0
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Время, ч
120
ssДНК-повреждение, mt
Поврежденность ssДНК, mt
1
2
100
80
25 Гр
60
40
20
14 Гр
0
0
10
20
Время после облучения, ч
ДЕГЕНЕРАЦИЯ СЕТЧАТКИ
60
RESUME
1. РЕЗУЛЬТАТЫ УКАЗЫВАЮТ НА СВЯЗЬ МЕЖДУ ГЕНО- И
ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ ЭФФЕКТАМИ В СЕТЧАТКЕ
2. ДЛЯ ПРОЯВЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА
НЕОБХОДИМО ПОВРЕЖДЕНИЕ ГЕНОМА ВЫШЕ ПОРОГОВОГО
УРОВНЯ
3. ВЕЛИЧИНА ПОРОГА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ
РЕПАРАЦИИ ДНК, КОЛИЧЕСТВОМ ДОЛГОЖИВУЩИХ
НЕРЕПАРИРОВАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ
• Покоящиеся терминально дифференцированные клетки содержат
активно транскрибируемые гены, составляющие небольшую часть
генома. Поддержание целостности этих генов осуществляет
механизм transcription coupled repair (TCR, вариант механизма NER).
Глобальная репарация генома в этих клетках подавлена.
• Считается, что для активации механизма гибели покоящихся
клеток, в т.ч. и сетчатки, НЕОБХОДИМО повреждение
транскрибируемой части генома. Повреждение этой части генома
поисходит только по достижении определенной, пороговой
плотности повреждений генома в целом.
• На величину порога может влиять активность репаративной
системы клетки
и, возможно, тип повреждений ДНК.…..
В связи с подавлением в дифференцированных клетках
механизма global genome NER, можно ожидать в них наличие basal
DNA damage, количество которых зависит от степени оксигенации
органа. Уровень этих повреждений может представлять
генотоксический порог активации цитотоксического эффекта в
ткани.
mt=8±4
Спонтанная поврежденность ДНК (разрывы,
АП-сайты) в разных органах мыши
ssДНК-кометы
mt=32±3
dsДНК-кометы
Орган
mt=32±3
Ceтчатка
mt=20±5
mt=20±5
Мозг
mt=8±4
Печень
mt=2±2
mt=2±2
Лимфоциты
ДНК-кометы из интактных клеток сетчатки и мозга мышей
ssДНК
dsДНК
сетчатка
“Eye tears”
“Dandelons”
мозг
Неспособность сетчатки к саморегенерации
сателлитные клетки как источник поддержания ткани:
• клетки RPE - питание, барьерная ф-ция
• глиальные/мюллеровские клетки – защита, регенерация…
• стресс вызывает активацию сателлитных клеток
ЦЕЛЬ: РЕАКЦИЯ САТЕЛЛИТНЫХ КЛЕТОК НА ГЕНОТОКС МНМ
Схема экперимента:
MNU
70 mg/kg, ip
t,h
0
BrUdR
50 mg/kg, ip
19
BrUdR
euthanasia
35 mg/kg, ip
44
68
BrUdR+ клетки сетчатки после введения МНМ
(реактивный глиозиз: гипертрофия, миграция, пролиферация )
ИНТАКТНАЯ СЕТЧАТКА
МНМ, 70 мг/кг, 72 ч
BrUdR-ДНК кометы из клеток сетчатки мышей
Интактные мыши
Мыши, обработанные МНМ