Нейроспецифические функции гена sbr (nxf1) у Drosophila

Отчет ассистента кафедры генетики и селекции Пугачевой Ольги Марковны за
2007-2008 учебный год.
Нейроспецифические функции гена sbr (nxf1) у Drosophila melanogaster.
Введение. Цель настоящего исследования состоит в изучении роли продуктов гена sbr
(Dm nxf1) в развитии и функционировании нервной ткани и сенсорных органов у
дрозофилы. Актуальность данного исследования определяется тем, что ген Dm nxf1
является крайне эволюционно консервативным и жизненно важным и имеет ортологов у
разных групп организмов, включая человека. Мутации именно таких генов определяет
тяжелые
наследственные
заболевания
у
человека.
Известны
нейропатологии,
обусловленные мутациями в генах, принадлежащих семейству NXF (Nuclear eXport
Factor), отвечающих за экспорт матричных РНК (мРНК) из ядра в цитоплазму.
Мы предполагаем, что ядерный экспорт мРНК - не единственная функция данных белков.
Наличие нескольких транскриптов, соответствующих генам nxf1 и выявленных не только у
дрозофилы, но и у человека (Herold et al., 2001; Sasaki et al., 2005; Ivankova et al., in press),
подтверждает возможное существование дополнительных функций названного гена.
Определение нейроспецифичных функций гена sbr (Dm nxf1) будет проводиться с
использованием
специфичных
современных
антител,
методов
РНК-РНК
иммунной
гибридизаций,
окраски
целого
тканей
спектра
с
помощью
молекулярно-
генетических методов (RT-PCR, клонирование, in vitro транскрипция, экспрессия белка в
бактериальных клетках и др.).
Цели и актуальность исследования. На сегодняшний день известно, что ряд
нейропатологических
определенных
заболеваний
эволюционно
человека
консервативных
опосредован
генов.
нарушением
Исследования
функций
молекулярной
этиологии и способов лечения таких заболеваний обычно проводится с использованием
различных модельных животных. Перспективным направлением является использование
хорошо изученного модельного объекта генетики – плодовой мушки Drosophila
melanogaster. С использованием дрозофилы уже созданы генетические модели таких
заболеваний, как болезни Паркинсона и Альцгеймера (Bilen and Bonini, 2005). Актуален
также поиск различных мутаций, ответственных за наследственные нейропатологические
синдромы. Так, сцепленная с полом умственная отсталость у человека обусловлена
мутацией в гене NXF5, продукт которого принадлежит к семейству белков NXF (Nuclear
eXport Factor), отвечающих за экспорт матричных РНК (мРНК) из ядра в цитоплазму. Ген
NXF5 (паралог гена NXF1 (Tap) человека) является членом кластера генов NXF,
расположенных в Х хромосоме. Оказалось, что у пациентов мужского пола, страдающих
синдромной формой умственной отсталости, отсутствует продукт гена
NXF5.
Предполагают, что этот ген может быть вовлечен в процесс развития нервной ткани,
обеспечивая метаболизм мРНК в нейронах (Jun et al., 2001). Интересно, что, несмотря на
высокую гомологию с геном Tap/NXF1 (продукт его обнаружен в основном в ядре),
продукту гена NXF5 не свойственна преимущественно ядерная локализация, он был
обнаружен в цитоплазме тел нейронов и нейритов гипокампа. При этом белок NXF5
способен связываться как с мРНК, так и с белком р15/NXT, необходимым для транспорта
мРНК (Jun et al., 2001). Таким образом, белки семейства NXF способны не только к
ядерному экспорту, но и к цитоплазматическому транспорту мРНК, что имеет особое
значение для нервных клеток, содержащих длинные отростки.
Также
известно,
что
другой
высоко
консервативный
гомолог
NXF1
у
млекопитающих – белок NXF2 способен связываться с белком FMRP, отсутствие которого
у человека приводит к синдрому ломкой Х-хромосомы, сопровождающемуся умственной
отсталостью и макроорхидизмом в числе прочих симптомов. Белок FMRP способен
специфически связываться с определенными мРНК, обеспечивая их транспорт не только
из ядра в цитоплазму, но и по постсинаптическим дендритам нейронов, где выступает в
качестве регулятора трансляции (Lai et al, 2006).
Ортологом гена Tap (NXF1) человека является и ген small bristles - sbr (Dm nxf1) у
Drosophila melanogaster. Показано, что основная функция этого гена также заключается в
транспорте мРНК из ядра в цитоплазму (Wilkie et al., 2001). Исследователями нашей
группы было впервые показано, что ген sbr у D. melanogaster проявляет специфичность в
экспрессии на уровне транскрипции в зависимости от типа ткани и стадии эмбриогенеза; в
числе прочих был выявлен транскрипт, специфичный для нервной ткани (Ivankova et al.,
in press). Длинный транскрипт – 5,1 т.н., выявленный методом нозерн-блот гибридизаций,
впервые в развитии появляется у эмбрионов на 10-18 часу развития и в нервных ганглиях
личинок в небольшом количестве по сравнению с конститутивным – 3,5 т.н., тогда как в
тканях головы взрослых насекомых является мажорным. Нейроспецифичность длинного
транскрипта предполагается на основании тканеспецифичности его экспрессии (Ivankova
et al., in press), и том факте, что именно у эмбрионов дрозофилы 10-18-ти часового
возраста происходит основной этап дифференциации нейробластов (Kearney et al., 2004).
Мы предполагаем, что длинный транскрипт гена sbr играет важную роль в
формировании и работе нейросенсорной системы дрозофилы. Эти предположения также
основаны и на результатах исследования проявлений различных мутаций в гене sbr. Нами
были выявлены доминантные эффекты различных мутантных аллелей гена sbr.
Характерной особенностью этих мутаций является широкий спектр плейотропных
эффектов с такими аллель-специфичными проявлениями, как нарушения морфологии и
числа макрохет (сенсорных органов дрозофилы) и морфологии глазных фасеток.
Например, мутация sbr1 в гомозиготе и в компаунде с летальными аллелями гена sbr
вызывает нарушения морфологии и числа макрохет, морфологии глазных фасеток,
нарушение общей структуры сложного глаза дрозофилы, вплоть до его отсутствия. При
этом частоты аномалий глазных фасеток достигали 80-92% (Маркова, 2002).
Более того, одним из проявлений мутантного термочувствительного аллеля sbr10
является вызванное действием теплового шока (ТШ) нарушение долговременной памяти
(Никитина и др., 2003). Авторы исследования полагают, что нарушение памяти у данного
мутанта возможно не только за счет функциональных дефектов, но и за счет структурных
изменений. Было показано, что ТШ на стадии личинки первого возраста (формирование
грибовидных телец мозга) индуцировал дефекты памяти, аналогичные таковым при
тепловой обработке взрослых самцов (Никитина и др., 2003). Известно, что в процессы
формирования долговременной памяти включены так называемые долгоживущие мРНК
(Si et al., 2003), возможно, что продукт гена sbr может участвовать не только в
локализации таких мРНК, но и в регуляции их экспрессии, осуществляющейся на уровне
трансляции.
Таким образом, цель настоящего исследования состоит в изучении роли продуктов
гена sbr в развитии и функционировании нервной ткани и сенсорных органов у
дрозофилы. Актуальность данного исследования определяется тем, что ген Dm nxf1
является крайне эволюционно консервативным и жизненно важным и имеет ортологов у
разных организмов, включая человека. Мутации именно таких генов определяет тяжелые
наследственные заболевания у человека.
Наиболее изученной функцией белков NXF1, в том числе Dm NXF1, является ядерноцитоплазматический транспорт большинства, а возможно и всех мРНК (Wilkie, 2001).
Однако мы предполагаем, что ядерный экспорт мРНК - не единственная функция данных
белков. Наличие нескольких транскриптов, соответствующих генам nxf1 и выявленных не
только у дрозофилы, но и у человека (Herold et al., 2001; Sasaki et al., 2005; Ivankova et al.,
in press), подтверждает возможное существование дополнительных функций названного
гена. Показано для человека и мыши и предполагается для дрозофилы (Sasaki et al., 2005;
Li et al., 2006; Ivankova et al., in press), что тяжелый транскрипт, соответствующий генам
nxf1 появляется за счет того, что один из интронов - 10-11 у человека и мыши и 5-6 – у
дрозофилы не вырезается в процессе сплайсинга. Присутствие в соответствующих
интронах стоп-кодона приводит к тому, что длинному транскрипту соответствует
укороченная форма белка NXF1, содержащая только N-концевую половину белка (Li et al.,
2006), включающую в себя домен, отвечающий за связывание с мРНК, и не содержит С-
концевой части, функция которой заключается в обеспечении взаимодействия с
нуклеопоринами – белками ядерно-порового комплекса (Grant et al, 2002). Таким образом,
короткая изоформа белка NXF1 лишается возможности связывания с нуклеопоринами и
транспортировать мРНК из ядра в цитоплазму, но сохраняет свойства рецептора и может
взаимодействовать с различными мРНК и другими белками рибонуклеопротеинового
(РНП) комплекса.
Для гена Dm nxf1 экспериментально не доказано, что длинный транскрипт
содержит интрон 5-6, и неизвестно, существует ли короткая изоформа белка Dm NXF1,
соответствующая данному транскрипту.
Предположение о том, что длинный транскрипт является нейроспецифичным
(Ivankova et al., in press), а также фенотипические проявления мутантов гена sbr (Dm nxf1),
свидетельствующие о возможном участии гена sbr в формировании и функционировании
нервных клеток, и определили задачи настоящего исследования.
Важную информацию в определении функции гена дает определение локализации
его продукта(ов) в клетке и тканях. Мы располагаем полученными в нашей группе
антителами к С-терминальному фрагменту белка Dm NXF1. Использование данных
антител позволит ответить на вопрос о локализации конститутивного продукта гена Dm
nxf1 в клетке, включая нейросенсорные клетки.
Для выявления нейроспецифичных
функций продуктов гена sbr (nxf1) нами были поставлены следующие задачи,
соответствующие настоящему этапу работы:
1. Локализовать белок SBR в нервных тканях в разные периоды развития. Для этого
предполагается использовать метод иммунного окрашивания
целых органов –
нервных ганглиев и тонких срезов мозга имаго с помощью имеющихся в нашей
группе антител к С-концевой части белка SBR. На этом этапе работы необходимо
определить, каким образом распределен конститутивный белок в нервных
ганглиях личинок – связан ли с морфогенетическими образованиями, расположен
ли в районе дифференцированных клеток, имеет ли преимущественно ядерную
локализацию
или
цитоплазматическую
тоже,
локализуется
ли
только
в
нейробластах или и в материнских ганглиальных (стволовых клетках), зависит ли
локализация от стадии клеточного цикла (деление или интерфаза). Мы
предполагаем, что конститутивная форма белка SBR может выполнять не только
свою основную функцию – транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, но и участвовать
в таких процессах, как локализация мРНК в цитоплазме в составе нейрональных
гранул, транспорт мРНК по нервным отросткам, регуляция трансляции и/или
дифференциация нейросенсорных клеток.
С помощью имеющихся в нашей группе антител к С-концевой части белка SBR мы
показали, что в дифференцированных нейронах нервных ганглиев личинок первого
возраста
имеет
преимущественно
цитоплазматическую
локализацию,
причем
интенсивно окрашиваются отростки нервных клеток. Помимо скопления белка в
отростках, нами были обнаружены цитоплазматические крупные гранулы, содержащие
белок SBR (рис.1).
Рисунок 1. Иммунная окраска антителами к белку SBR. Район дифференциации
нейронов в области среднего мозга нервных ганглиев личинок третьего возраста.
отросток
тело
нейрона
гранулы
2. Получение специфичных антител к N-концевой части белка SBR для выявления
предполагаемого короткой изоформы белка. Для этого нами будет выделен
фрагмент ДНК, соответствующий 1-3 экзонам гена sbr методом RT-PCR с помощью
праймеров,
содержащих
необходимые
в
дальнейшем
сайты
рестрикции,
последовательности ATG и стоп-кодоны для правильной экспрессии. Полученная
таким образом последовательность будет клонирована в вектор экспрессии pET24b
(Novagen) для экспрессии белка в бактериальных клетках. Полученным белком
будут иммунизированы лабораторные мыши, а полученная антисыворотка будет
специфически очищена на колонках, содержащих белок SBR.
Для выполнения этой задачи нами были подобраны праймеры и проведены, выделение
геномной РНК из голов взрослых насекомых дикой линии Oregon R, реакции обратной
транскрипции со специфичными праймерами для получения кДНК фрагмента
соответствующего 1-3 экзонам гена sbr и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с этими
же праймерами (рис. 2)
Рисунок 2. Результаты ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к 1-3 экзонам.
1
2
3
1,2 дорожки – продукт ОТ-ПЦР, ожидаемая длина фрагмента 264 п.н.
3 дорожка – маркер молекулярного веса
Полученный в результате фрагмент был выделен из геля, очищен и в данный момент
секвенируется (определение нуклеотидной последовательности фрагмента), в качестве
контрольной процедуры, после чего фрагмент будет клонирован в вектор экспрессии для
получения pET24b (Novagen) для получения полипептида, соответствующего 1-3 экзонам
гена sbr , и в дальнейшем используемого для получения антител к N-концевой части белка.
Используя полученные результаты, нами поставлены следующие задачи:
1. Получение ответа на вопрос о преимущественной экспресси длинного транскрипта 5.1
т.н. в тканях головы взрослых особей D. melanogaster с помошью содержащего интрон
5-6 зонда. Данная задача будет решаться с использованием двух методов: Нозерн-блот
гибридизации выделенной РНК из разных тканей и органов D. melanogaster и
детекции тяжелого транскрипта в эмбриогенезе и мозге имаго методом РНК-РНК
гибридизации in situ на целых эмбрионах и тонких срезах мозга имаго дрозофилы. В
качестве зонда в обоих случаях предполагается использовать последовательность
интрона 5-6, полученную методом RT-PCR, а затем меченую дигоксигенином с
помощью тарнскрипции in vitro для получения рибонуклеиновой последовательности.
Мы ожидаем, что в результате нозерн-блот гибридизаций с помощью интронспецифичного зонда, мы обнаружим длинный, содержащий 5-6 интрон, транскрипт в
мозге имаго, на стадии 10-18-тичасовых эмбрионов и в нервных ганглиях личинок. В
качестве контроля будут использоваться другие ткани, например семенники и/или
яичники и эмбрионы более ранних стадий развития.
2. Определение специфичности в появлении короткой изоформы белка SBR
в
зависимости от типа ткани, органа и стадии развития D. melanogaster. Эту задачу
планируется решать с использованием метода Вестерн-блот гибридизации полученных
антител с разделенными путем гель-электрофореза белками, полученными из тканей
голов имаго, нервных ганглиев личинок и семенников (отрицательный контроль) D.
melanogaster.
Педагогическая нагрузка за 2007/2008 учебный год:
1. Курс для лекций для студентов 5 курса (магистратура) «Генетические механизмы
адаптаций»
2. Курс лекций для студентов 6 курса (магистратура) «Генетика клеточного ядра»
3. Семинарские занятия по курсу «Психогенетика» для студентов 3 курса факультета
психологии
4. Научное руководство у 2-х студентов 3 курса (бакалаврс
5. Кураторство научной работой 1 студента 3 курса
6. Рецензирование выпусных квалификационных работ и отчетов о летней практике.