Перевод Бойко Дениса Викторовича, Студента 6 курса Челябинской Медицинской Академии апрель 2004 21 January 2003Annals of Internal Medicine Volume 138 Number 2 XinglongZheng; Arnel M. Pallera; Lawrence T. Goodnough; J. Evan Sadler, MD and Morey A. Blinder Remission of Chronic ThromboticThrombocytopenic Purpura after Treatment with Cyclophosphamideand Rituximab Ремиссия при хронической тромботической тромбоцитопенической пурпуре после терапии циклофосфаном и ритуксимабом Предпосылки Тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП) у взрослых обычно обусловлена наличием аутоантител, ингибирующих фермент ADAMTS13. Плазмаферез у таких больных часто бываетэффективен, но не ликвидирует причину #8211; аутоиммунный процесс. Цель исследования Показать эффективность интенсивной иммуносупрессивной терапии прирефрактерной ТТП. Объект исследования История болезни. Место проведения исследования Университетский медицинский центр. Пациент 42-летняя женщина с хроническойрецидивирующей ТТП. Терапия Иммуносупрессияс применением ритуксимаба и циклофосфана Расчеты Изучение активности ADAMTS13 и его ингибиторов, а также гематологических показателей при ТТП. Результаты В течение 19 месяцев у больной рецидивировала тромботическаямикроангиопатия, несмотря на процедуры плазмафереза, спленэктомию, терапию винкристином,преднизолоном и циклоспорином. Активность ADAMTS13 была низкой. Лабораторные тесты определяли антитела класса IgG, которые ингибировали металлопротеазный домен рекомбинантногоADAMTS13. После лечения ритуксимабом и циклофосфаномнаступила ремиссия, уровень ADAMTS13 нормализовался, антитела-ингибиторы не определялись. Больная не нуждалась в лечении в течение 13 месяцев. Заключение Интенсивная иммуносупрессивная терапия может привести к стойкой клинической ремиссии у больных с рефрактерной аутоиммунной ТТП. Большинство взрослых больных с идиопатической тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП) имеют антитела, ингибирующие протеазу, расщепляющую фактор Виллебранда в плазме крови (1-3). Недавно этот фермент был получен рекомбинантно и отнесен к семейству металлопротеазADAMTS. Он был названADAMTS13 (4-8). Плазмаферез увеличивал выживаемость у больных с ТТП с цифр менее 10% до 75% (9). Однако плазмаферез не ликвидирует причину #8211; аутоиммунный процесс, и до 1/3 больных дают рецидив после первоначально успешного лечения (10). Отрывочные данные свидетельствуют о том, что иммуносупрессивная терапия иногда может быть эффективной, но этот подход не изучен системно у больных с дефицитом ADAMTS13. Мы приводим историю болезни женщины с хронической рецидивирующей ТТП, у которой не определялась активность ADAMTS13, а уровни ингибиторов ADAMTS13 были повышенными. Терапия ритуксимабом и циулофосфаном привела к исчезновению антител к ADAMTS13, нормализации активности ADAMTS13 и ремиссии тромботическоймикроангиопатии. История болезни 42-летняя женщина была госпитализирована в мае 1999 года с атаксией, дезориентацией и летаргией. До этого времени она была здорова, в анамнезе имела 3 неосложненныебеременности и 3 родов без предшествующих симптомов аутоиммунного заболевания. Компьютерная томография обнаружила множественные инфаркты головного мозга. Количество тромбоцитов составляло 60*10*9/л, гемоглобин 96 г/л, уровень фибриногена был нормальным. ЛДГ сыворотки крови #8211; 1157 Ед/л. Больная получала внутривенный иммуноглобулин, но эффекта не отмечалось. Она была переведена в нашу клинику в июне 1999 года (день 1 на Рисунке 1). Гематокрит при поступлении составлял 0,231, тромбоцитов было 24*10*9/л, гаптоглобин 0,09 г/л (норма #8211; 0,27-2,2 г/л), креатинин сыворотки крови 141 мкмоль/л (1,6 мг/дл) (норма #8211; 50-127 мкмоль/л или 0,6-1,4 мг/дл). Протромбиновоевремя и АПТВ было в норме. Результаты прямого и непрямого антиглобулиновоготеста #8211; отрицательные. В мазке периферической крови обнаруживались более 10 шистоцитов по всем полям зрения. Был выставлен диагноз ТТП и начато лечение плазмаферезом (1,5 объема в день) (см. верхний график Рисунка 1). Вначале количество тромбоцитов нормализовалось, но вновь упало до 34*10*9/л к 22 дню. Был добавлен преднизолон в дозе 1 мг/кг массы и аспирин 325 мг/сутки, но без четкого эффекта. После выполнения лапароскопической спленэктомии наблюдалось транзиторное повышения уровня тормбоцитовк 36 дню, но их количество вновь снизилось менее 100*10*9/л к 43 дню. 2 внутривенные дозы винкристина по 2 мг каждая привели к постепенному улучшению состояния. Количество процедур плазмаферезабыло уменьшено, и больная была выписана к 85 дню с нормальным количеством тромбоцитов. Плазмаферез отменили к 97 дню. На 105 день количество тромбоцитов составляло 43*10*9/л. Плазмаферез вновь возобновили и назначили 75 мг циклоспорина дважды в день. Количество тромбоцитов возросло, и процедуры плазмаферезапостепенно урежали в течение 3 недель. В течение следующих 4 месяцев показатели периферической крови были стабильными. Дневная доза преднизолона уменьшилась до 40 мг. На 248 день больная вновь была госпитализирована с количеством тромбоцитов 58*10*9/л и кортикальной слепотой. Процедуры плазмафереза привели к повышению количества тромбоцитов, но улучшения зрения не наблюдалось. Больнаябыла выписана через 12 дней и процедуры плазмаферезабыли постепенно отменены в течение 2 недель. В течение следующих 11 месяцев больная госпитализировалась 4 раза по поводу рецидивов ТТП и каждый раз была пролечена с использованием плазмафереза. Доза преднизолонаснизилась до 5 мг/сутки. На 572 день больная была госпитализирована с глухотой и тромбоцитопенией. Количество тромбоцитов быстро возросло после плазмафереза. Уровень креатинина сыворотки возрос до 221 мкмоль/л (2,5 мг/дл), в этой связи циклоспорин был отменен. Больная получила 2 дозы ритуксимаба внутривенно (375 мг/м*2 в неделю). Креатинин после этого снизился до 159 мкмоль/л (1,8 мг/дл), тромбоциты оставались выше 100*10*9/л, симптоматика была стабильной в течение 5 месяцев. На 740 день количество тромбоцитов упало до 69*10*9/л. Больная получила еще несколько сеансов плазмаферезав течение 16 дней с хорошим эффектом и была выписана. В течение последующих 4 месяцев она госпитализировалась дважды по поводу рецидивов ТТП и получала лечение плазмаферезом. Начиная с 849 дня больная получала 1 дозу внутривенного циклофосфана1 г/м*2 и 4 дозы внутривенного ритуксимаба 375 мг/м*2 еженедельно в течение 2 недель. Побочных эффектов от введения ритуксимаба не отмечалось. В течение последующих 10 недель у больной количество тромбоцитов, уровень ЛДГ, креатинина были нормальными, стабильным оставался гематокрит, в мазке крови определялись единичные шистоциты. Других симптомов ТТП не наблюдалось. Но неврологические дефекты (слепота и глухота) оставались стойкими. Проблема Многие взрослые больные с ТТП имеют аутоантитела, которые ингибируют протеазу (ADAMTS13), расщепляющую фактор Виллебранда в плазме. Предмет изучения 42-летняя женщина с хронической рецидивирующей ТТП, у которой рецидивы развивалисьнесмотря на терапию плазмаферезом, винкристином, преднизолоном, циклоспорином и выполненную спленэктомию. Активность ADAMTS13 у нее была низкой или не определялась вовсе. Определялись антитела класса IgG #8211; ингибиторы ADAMTS13. После иммуносупрессивной терапии ритуксимабоми циклофосфаном больная вышла в ремиссию, уровень ADAMTS13 нормализовался, а ингибиторы не определялись. Предостережение Интенсивная иммуносупрессивная терапия, обусловленная аутоиммунной причиной ТТП, должна быть изучена в проспективных исследованиях до своего широкого применения. Методы Было получено информированное согласие больной и ее семьи. ADAMTS13 определялся по указанной методике (11); однако реактив состоял из следующих компонентов: 10 мг/мл фактора Виллебранда в 5 ммоль/лтрис-соляной кислоты (рН 8,0), 1,5 моль/л мочевины и 1 ммоль/лфенилметансульфонилфторида (Sigma,St. Louis, Missouri).Образцы плазмы нагревались до 56 С в течение 30 минут, а затем серийно разводились фосфатным буфером. Разведенные образцы по 5 мл добавлялись к 5 мл нормальной человеческой плазмы и инкубировались при 37 С в течение 30 минут. Остаточная активность ADAMTS13 определялась так, как описано ранее. 1 образец ингибитора снижает активность ADAMTS13 в равном объеме нормальной плазмы на 50%. РекомбинантныйADAMTS13 (7), усеченный после металлопротеазногоучастка (остаток от 1 до 289 аминокислоты) был клонирован с помощью pcDNA3.1/V5-His TOPO (Invitrogen, Carlsbad,California), который был экспрессирован на клетках яичника китайского хомячка и очищен с помощью TALON металлическойафиннойсмолы (BD BiosciencesClontech, Palo Alto, California).ADAMTS13 иммунопреципитировали сIgG, адсорбированном из образцов плазмы на агарозупротеина А. Белки анализировались с использованием натрия додецилсульфат-полиакриламидногогелевого электрофореза и иммуноблотингас моноклональными анти-V5 антителами (Invitrogen). Результаты В самом начале заболевания у больной имелся абсолютный дефицит ADAMTS13 в плазме и определялись ингибиторы (Рисунок 1, нижний график). Терапия плазмаферезомв течение последующих 19 месяцев давала короткие периоды ремиссий, даже когда уровень ингибиторов ADAMTS13 был минимальным, а активность самого ADAMTS13 оставалась низкой. Ингибиторная активность была смоделирована с IgG, выделенном из плазмы больной. Этот иммуноглобулин иммунопреципитировалметаллопротеазный домен рекомбинантногоADAMTS13 (данные не представлены). Была начата терапия ритуксимабом, поскольку прогрессировала аутоиммунная ТТП. Ритуксимабприменялся в обычной дозе 375 мг/м*2 с 4-кратным введением этой дозы в неделю (12, 13). Больная получила укороченный курс из 2-х доз, после введения которых полностью исчезли ингибиторы ADAMTS13, нормализовалась активность ADAMTS13 и количество тромбоцитов. Первый из 3-х рецидивов наступил через 5 месяцев после окончания приема ритуксимаба. Перед 2-м курсом ритуксимаб+циклофосфан, активность ADAMTS13 составляла 33% от нормальной, а ингибиторы ADAMTS13 не определялись. Эти показатели были достигнуты благодаря ежедневномуплазмаферезув течение 9 дней, что могло частично скорректировать дефицит ADAMTS13. В последующем симптоматика ТТП купировалась, количество тромбоцитов и активность ADAMTS13 увеличились, а ингибиторы ADAMTS13 не определялись. Последний измеренный уровень ADAMTS13 составлял 17%, ингибиторы не определялись. Обсуждение Хотя идиопатическая ТТП обычно является аутоиммунным заболеванием (1-3), стандартная терапия не способна прервать аутоиммунный механизм. Плазмаферез может увеличить продолжительность жизни больных, т.к. удаляет патологические антитела и увеличивает содержание фермента ADAMTS13. У многих больных заболевание имеет самоограничивающийся характер, что проявляется в уменьшении клиники после плазмафереза в течение 1 или нескольких недель. Однако примерно треть больных страдают от хроническогорецидивированияболезни (10). Таким образом, ТТП представляется как агрессивное аутоиммунное заболевание, при котором может быть эффективна терапия, направленная на уменьшение продукции антител В-лимфоцитами. При ТТП были испробованы многие режимы иммуносупрессивнойтерапии. Они давали хорошие, но неубедительные результаты. Кортикостероиды часто назначаются при проведении плазмафереза (14), но их эффективность не была оценена системно (9, 10). Отдельные случаи и небольшие по размеру исследования показали длительный положительный эффект от спленэктомии (15), описаны так же эффекты терапии циклоспорином (16), винкристином,циклофосфаном и азатиоприном(17, 18). Приведенные данные являются неубедительными, что диктует необходимость изучения рациональных режимов иммуносупрессии у больных с рецидивирующей или рефрактерной ТТП. Рисунок 1. Количество тромбоцитов (верхний график) и активность ADAMTS13 (нижний график) у больной ТТП в течение 2,5 лет наблюдения. Примечание: стрелочки показывают на спленэктомию и дозы винкристина. Черные столбцы обозначают лечение плазмаферезом; столбцы полной высоты, половинки и 1/3 высоты обозначают соответственно ежедневное лечение, лечение через день и лечение дважды в неделю. Пунктирная линия на верхнем графике указывает нижнюю границу нормы тромбоцитов (140*10*9/л). На нижнем графике сплошная линия указывает активность ADAMTS13, а пунктирная линия #8211; уровень ингибиторов ADAMTS13. NHP #8211; нормальная человеческая плазма. Ритуксимаб представляет собой препарат, содержащий химерное анти-CD20 моноклональное антитело, полученное для терапии неходжкинских лимфом. МолекулаCD20 экспрессируется на В-лимфоцитах. Ритуксимабявляется многообещающим препаратом для лечения аутоиммунных заболеваний, например, аутоиммунной гемолитической анемии (12) и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (13). Побочные эффекты, наблюдаемые при лечении ритускимабом лимфом, включали транзиторную артериальную гипотензию, лихорадку (после первой инфузии). Возможно, это связано с лизисом опухоли. Данные побочные эффекты не наблюдаются у больных с аутоиммунными заболеваниями, поскольку масса лимфоцитов-мишеней для ритуксимабаневелика (12, 13). Результаты лечения нашей больной ритуксимабом и циклофосфаном подтверждают аутоиммунную природу идиопатической ТТП и говорят о том, что интенсивнаяиммуносупрессия может быть методом выбора у больных, не отвечающих на плазмаферез. Пока данная работа была в процессе подготовки, были получены похожие результаты у 2 больных с рефрактерной ТТП при лечение только ритуксимабом(19). Последние исследования по теме описывают 2 больных с рефрактерной ТТП, пролеченных только ритуксимабом, хотя активность ADAMTS13 и его ингибиторы не изучались (20). Из-за демографических характеристик большинства больных, ритуксимаб мог быть предпочтительнее, чем другие иммуносупрессанты. 2/3 взрослых больных ТТП #8211; это женщины в возрасте около 40 лет (9, 14). Вообще большинство больных с рефрактерной ТТП женского пола, причем в детородном возрасте, и очень часто заболевание манифестирует в период беременности (14). У таких больных терапия ритуксимабомпозволяет избежать потенциального бесплодия и тератогенности,вызванными цитотоксической терапией. Таким образом, необходимы дальнейшие проспективные исследования для изучения иммуносупрессивной активности ритуксимабапри рефрактерной ТТП. Литература 1. Furlan M, Robles R, Galbusera M, Remuzzi G, Kyrle PA, Brenner B, et al.von Willebrand factor-cleaving protease in thrombotic thrombocytopenic purpuraand the hemolytic-uremic syndrome. N Engl J Med. 1998;339:1578-84. [PMID: 9828245] 2. Tsai HM, Lian EC. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease inacute thrombotic thrombocytopenic purpura. N EnglJ Med. 1998;339:1585-94.[PMID: 9828246] 3. Veyradier A, Obert B, Houllier A, Meyer D, Girma JP. Specific von Willebrandfactor-cleaving protease in thromboticmicroangiopathies: a study of 111cases. Blood.2001;98:1765-72. [PMID: 11535510] 4. Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human vonWillebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of themetalloproteinase family. Blood. 2001;98:1662-6. [PMID: 11535495] 5. Gerritsen HE, Robles R, LaЁmmle B, Furlan M. Partial amino acid sequenceof purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood. 2001;98:1654-61.[PMID: 11535494] 6. Levy GG, Nichols WC, Lian EC, ForoudT, McClintick JN, McGee BM, etal. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thromboticthrombocytopenic purpura. Nature. 2001;413:48894. [PMID: 11586351] 7. Zheng X, Chung D, Takayama TK, Majerus EM, Sadler JE, Fujikawa K.Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloproteaseinvolved in thromboticthrombocytopenic purpura. J BiolChem. 2001;276:41059-63. [PMID: 11557746] 8. Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T,NakagakiT, et al. A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted intothe blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease? J Biochem (Tokyo).2001;130:475-80. [PMID: 11574066] 9. Rock GA, Shumak KH, Buskard NA, Blanchette VS, Kelton JG, Nair RC,et al. Comparison of plasma exchange with plasma infusion in the treatment ofthrombotic thrombocytopenic purpura. Canadian Apheresis Study Group.N Engl J Med. 1991;325:393-7. [PMID: 2062330] 10. Bandarenko N, Brecher ME. United States ThromboticThrombocytopenicPurpuraApheresisStudy Group (US TTP ASG): multicenter survey and retrospectiveanalysis of current efficacy of therapeutic plasma exchange. J ClinApheresis.1998;13:133-41. [PMID: 9828024] 11. Gerritsen HE, Turecek PL, Schwarz HP, LaЁmmle B, FurlanM. Assay ofvon Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen bindingaffinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thromboticthrombocytopenic purpura (TTP). ThrombHaemost. 1999;82:1386-9. [PMID:10595623] 12. Quartier P, Brethon B, Philippet P, Landman-Parker J, Le Deist F, FischerA. Treatment of childhood autoimmune haemolyticanaemia with rituximab[Letter]. Lancet.2001;358:1511-3. [PMID: 11705566] 13. Stasi R, Pagano A, Stipa E, Amadori S. RituximabchimericantiCD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytopenicpurpura. Blood.2001;98:952-7. [PMID: 11493438] 14. Bell WR, Braine HG, Ness PM, Kickler TS. Improved survival in thromboticthrombocytopenic purpura-hemolyticuremic syndrome.Clinical experiencein 108 patients. N Engl J Med. 1991;325:398-403. [PMID: 2062331] 15. Crowther MA, Heddle N, Hayward CP, Warkentin T, Kelton JG. Splenectomydone during hematologic remission to prevent relapse in patients withthrombotic thrombocytopenic purpura. Ann Intern Med. 1996;125:294-6.[PMID: 8678392] 16. Pasquale D, Vidhya R, DaSilva K, Tsan MF, Lansing L, Chikkappa G.Chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura: role of therapy withcyclosporine. Am JHematol. 1998;57:57-61. [PMID: 9423818] 17. Ferrara F, Copia C, Annunziata M, Spasiano A, DiGrazia C, Palmieri S, etal. Vincristine as salvage treatment for refractory thrombotic thrombocytopenicpurpura. Ann Hematol. 1999;78:5213. [PMID: 10602896] 18. Allan DS, Kovacs MJ, Clark WF. Frequently relapsing thromboticthrombocytopenicpurpura treated with cytotoxic immunosuppressive therapy. Haematologica.2001;86:84450. [PMID: 11522541] 19. Gutterman LA, Kloster B, Tsai HM. Rituximab therapy for refractorythrombotic thrombocytopenic purpura. Blood Cells Mol Dis. 2002;28:385-91.[PMID: 12367582] 20. Chemnitz J, Draube A, Scheid C, Staib P, Schulz A, Diehl V, et al. Successfultreatment of severe thrombotic thrombocytopenic purpurawith themonoclonal antibody rituximab. Am J Hematol. 2002;71:105-8. [PMID:12353309]