У млекопитающих масса скелетных мышц зависит от количества мышечных волокон,... три аспекта, как полагают, ... Антагонисты миостатина усиливают восстановление мышц во время саркопении
advertisement
Антагонисты миостатина усиливают восстановление мышц во время саркопении У млекопитающих масса скелетных мышц зависит от количества мышечных волокон, их типа и размера. Все три аспекта, как полагают, изменяются под влиянием различных условий, в том числе старения, которое может привести к атрофии отдельных мышечных волокон, потери волокна, и переключение между типами волокна. Важным компонентом размера мышечных волокон является участие клеток-сателлитов, популяции миогенных клеток-предшественников, связанных с мышечными волокнами. Спутниковое клетки расположены между базальной пластинки и сарколеммой и существуют преимущественно в фазу митотического покоя. Эти клетки, как полагают, в значительной степени ответственны за регенерацию мышц, порождая миобласты, тем самым позволяя дополнительным ядрам сливаются с существующими волокнами или формируя новые мышечные волокна. Для прогрессирования этого процесса сателлитным клеткам необходимо выйти из состояния покоя и начать миогенез. Очевидно, что число клеток-сателлитов повлияет на степень восстановления мышц . Одним из факторов, которые, как полагают, может серьезно повлиять на поведение спутниковых клеток является старение. Спутниковые клетки, выделенные у старых животных показали значительное отставание при входе в клеточный цикл, снижение пролиферации и потенциал а дифференцировки, и повышенную склонность к аппаптозу. Кроме того, различные исследования показывают, что с возрастом мышцы ограничены в своих способностях содействовать активации спутниковых клеток. Использование трансплантации поперечных мышц продемонстрировало,, что бедная регенерация, связанна с возрастом животных, и является функцией возрастных нарушений. Кроме того, есть предположения, что недостаточная регуляция No- сигнального пути несет прямую ответственность за нарушение активации спутниковых клеток с возрастом. Совсем недавно, эксперименты показали, что системные факторы, от молодых мышей восстановливали активация сигнального пути, а также способствовали распространению и регенеративной способности сателлитных клеток. Кроме того, негативные регуляторы, такие как миостатин, могут подавлять активность спутниковых клеток. Миостатин является трансформирующим фактором роста, и действует как мощный ингибитор роста мышцы. Это выражается как в пре-, так натально развивающихся миотомах и после рождения во взрослых скелетных мышцах, тем самым предполагая, что миостатин играет постоянную роль в миогенезе. Действительно, у животных с отсутствием миостатина наблюдается значительно больше мышечной массы в результате гиперплазии мышц и их гипертрофии. Исследования показывают, что миостатин влияет на миогенез C2C12 культур миобластов через регуляции клеточного цикла и миогенных факторов. Кроме того, миостатин ингибирует активацию спутниковых клеток у мышей, и это будет иметь серьезные последствия в контексте возрастной атрофии мышц и регенерации. Интересно, что увеличение миостатина было связано с атрофией мышц во время разгрузки у мышей, атрофии мышц при инфекции вирусом иммунодефицита человека , и кахексии при индуцированном системном введении миостатина Хотя точная роль миостатина в возрастной регуляции мышечной массы остается неясной, его длительное отсутствие в дородовом этапе, как показано на мышах, продемонстрировало саркопению. Скорей всего , антагонист миостатина будет иметь значительный терапевтический потенциал при саркопении и нарушении регенерации мышц, которое наблюдается у старых животных. В самом деле, по нашим данным, краткосрочная блокада функции миостатина с помощью введения усеченного белока значительно повышает регенерацию мышц у пожилых мышей. Эта регенерация произошла в процессе восстановления миогенной и воспалительной реакции у старых мышей, что привело к увеличению спутниковой активности клеток и макрофагов и расширения миграции миобластов. Результаты Производство антагониста MSTN-ANT1 Ранее мы показали, что длительное отсутствие миостатина уменьшает саркопения у миостатина-нулевых mice. Мы избрали для проверки конкретные молекулы, усеченную версию миостатина, которая может подавлять синтез миостатина и, возможно, имеет терапевтические возможности для лечения саркопении. Миостатин протеолитически перерабатывается , что приводит к биологически активному зрелому миостатину, который охватывает аминокислоты 266-375. Этот 110-аминокислотный белок связывается с рецептором активин типа IIB в виде димера. Для того, чтобы противодействовать миостатину, мы подготовили усеченный с С конца на аминокислоты с 266 до 350, в качестве доминирующего отрицательного (миметического) белка. Это усечение назвали MSTN-ANT1,, показан на рисунке 1а.MSTN-ANT1 был экспрессирован гомогенности (рис. 1б). кишечной палочкой и очищен до Антагонист миостатина усиливает регенерацию мышц после травмы. Далее мы проверили пользу MSTN-ANT1 в модели у мышей. Обычно после травмы, есть изначальное увеличение веса раненых мышц вследствие отека, а затем снижение вызвано некрозом поврежденных мышечных волокон. Мышечная масса затем начинает возрастать снова, как происходит регенерация волокон. Полученные результаты свидетельствуют о тенденции, в которой потери мышечной массы была менее выраженной у MSTN-ANT1 обработанных мышц по сравнению с обработанными физиологическим раствором мышцами в дни 7 и 10 (рис. 2а).Наблюдаемая тенденция может быть связана с сокращением потери мышечной массы во время некроза или, наоборот, в связи с формированием новых волокон в результате антагонизма MSTN-ANT1 к миостатину. В подтверждение этого, анализ передней большеберцовой мышцы (TA) показал, что зарождающееся формирование мышечных волокон (районы регенерации) проходит раньше, и не было связанно с сокращением некротической области (неперерожденной области) в мышцах обработанных MSTN -ANT1 по сравнению с обработанными физиологическим раствором мышцами в дни 7 и 10 (рис. 2, б-е) (P <0,05). Измерение волокна может указывать на прогрессирование регенерации, происходящее в восстановленных мышцах. Поэтому мы были намерены оценить регенерацию волокна через 28 дней после травмы, и результаты показали, что регенерированных волокон из мышц MSTN-ANT1-мышей было значительно больше (рис. 3) (P <0,05). Кроме того, поскольку уровни коллагенных депозитов могут быть измерены в регенерирующих после травмы мышцах , окрашивание по Ван Гизону было проведено (рис. 3а, б). Снижение уровня коллагена было найдено в MSTN-ANT1 обработанных мышцах в дни 10 и 28 (P <0,05) (рис. 3). Экспрессия MyoD и Pax7 в регенерирующих мышцах изменяется при лечении антагонистом. Было установлено, что Pax7 и MyoD являются сильными маркерами миогенеза. В то время как уровень Pax7 может означать степень активации бассейна спутниковых клеток, а также их самообновление, MyoD может означать уровень миогенеза, происходящего в мышцах. Для исследования Pax7 и MyoD уровня белка в поврежденных мышцах, Вестерн-блот анализ был выполнен. Анализ контроля и MSTN-ANT1 обработанных мышц показал, что уровень Pax7 белка был выше у получавших MSTN-ANT1 (рис. 4, б) (P <0,05). Точно так же, MyoD уровни были выше у получавших MSTN-ANT1 лечение, чем получавшие физиологический раствор (рис. 4а и C) (P <0,05). Сопоставимые уровни MyoD были отмечены между группами на 28 день, однако, более высокий уровень Pax7 наблюдается в той же точке времени с группой, получавшей MSTN-ANT1. Как и в случае повреждения нотексином, хотя и в меньшей степени, с возрастом мышцы также отображают уровень текущего миогенеза за счет поддержания и восстановления мышц, связанного с процессом старения. Таким образом, Pax7 и MyoD также проанализированы в мышцах мышей, получавших в течение 6 недель инъекции с физиологическим раствором или MSTN-ANT1. Уровни белка, выделенного из икроножной мышцы при завершении исследования, значительно выше Pax7 и MyoD белков в MSTN-ANT1-обработанных мышцах мышей по сравнению с контрольной группой мышей (рис. 4d, Р и Н) (Р <0,05). Кроме того, белок, выделенный из активно растущих первичных миобластов, также отображается повышение уровня и Pax7 и MyoD (рис. 4e, г и я) после MSTN-ANT1 лечения. Спутниковая активация и пролиферация клеток и увеличение мышечной силы в ответ на MSTN-ANT1 лечение. Чтобы исследовать, как MSTN-ANT1 повлияет на спутниковую активацию клеток, изолированные одиночные волокна 1 - и 24-месячных мышей культивировали с или без MSTN-ANT1. Спутниковая активация клеток определяется путем иммуноцитохимии с использованием антител для ядерного антигена пролиферирующих клеток, маркера репликации ДНК (рис. 5а). Волокна, культивированные с MSTN-ANT1, последовательно демонстрируют высокий процент активированных клеток-сателлитов на волокно, чем волокна, культивированных с физиологическим раствором (рис. 5в, г) (P <0,05). Миостатин влияет на пролиферацию клеток. Таким образом, для изучения эффективности антагонистов в увеличении распространения миобластов у 1месячных мышей культивировали с или без MSTN-ANT1. Результаты показали, что культивирование с MSTN-ANT1 увеличило распространение миобластов на 15% (рис. 5е) (P <0,001).В дополнение к культивированию изолированных волокон с MSTN-ANT1, спутниковая активация клеток была также исследована в волокнах изолированных от мышей, которым вводили физиологический раствор или MSTNANT1 в течение 6 недель. Волокна изолированые от MSTN-ANT1 мышей отображают значительно более высокий процент активированных спутниковых клеток в волокнах (рис. 5е) (P <0,05). Кроме того, чтобы проверить, может ли 6-недельное лечение увеличить мышечную силу, испытания силы мышц были проведены в начале и завершении периода лечения. Результаты показали, что MSTN-ANT1 значительно увеличило силу старых мышей на 12% (P <0,05) (рис. 5г).Антагонист изменяет миграцию макрофагов, и , как полагают, препятствует миграции макрофагов. Поэтому в поврежденные мышцы вводили физиологический раствор или MSTN-ANT1 и обследовали на наличие макрофагов, антиMac1 антитела были использованы для определения эффективности антагониста в усилении миграции макрофагов. Действительно, на 2-й день после травмы, мышцы, которые были обработаны MSTN-ANT1, показали больший процент Mac1-положительных ядер (рис. 6а-с) (P <0,05). На 3-й день, этот процент упал в MSTN-ANT1 обработанных мышцах ниже, чем в мышцах, в которые вводили физиологический раствор , и продолжал быть ниже в дни 7 и 10. Миобласты и миграция макрофагов изменяются с возрастом и при MSTN-ANT1 лечении. Миобласты и миграция макрофагов, как известно, изменяется под влиянием сигналов хемотаксиса. Для того чтобы выяснить влияние последствий воздействия миостатина и старения на миграцию миобластов и макрофагов, был выполнен ряд анализов хемотаксиса. Полученные результаты свидетельствуют, что миграция значительно отстает в изолированных от 24-месячных мышей по сравнению с 1-месячными мышами в присутствии 5% экстракта куриного эмбриона или 2% лошадиной сыворотки (рис. 7а) (P <0,05). Точно так же, миграция макрофагов изолированных от 24-месячныъ мышей была ниже по сравнению с 1месячными мышами, независимо от концентрации хемоаттрактанта (рис. 7б) (P <0,001).Эффективность MSTN-ANT1 в восстановлении миграции клеток в ответ лечение исследовали с помощью первичных миобластов, изолированных от 24-месячных мышей. Когда MSTN-ANT1 был добавлен, можно было восстановить миграцию клеток, препятствуя тормозящему действию миостатина (рис. 7) (P <0,05). Для того, чтобы проверить эффективность MSTN-ANT1 в усилении миграции клеток после длительного лечения в естественных условиях костного мозга, макрофаги были выделены у мышей, которым вводили в течение 6 недель физиологический раствор или MSTN-ANT1. На самом деле макрофагов MSTN-ANT1-обработанных мышей были способны мигрировать более эффективно (рис. 7б) (P <0,05). Дискуссия Многочисленные исследования показывают, что старение значительно влияет на миогенез из-за окружающей среды мышц или системных факторов. Недавно было показано, что длительное отсутствие миостатина снижает саркопению у миостатин-нулевых мышей. Однако, так как этим мышам не хватает миостатина в дородовой стадии, необходимо было провести дополнительные исследования, чтобы определить влияние краткосрочного ингибирования миостатина в пожилом возрасте. Предыдущее исследование показало, что увеличение мышечной массы и силы происходит после лечения ингибиторами миостатина. В этом исследовании мы показали, что краткосрочное введение антагониста миостатина восстанавливает регенеративную и миогенную мощность мышц. В соответствии с прошлыми исследованиями, которые показали, что отсутствие миостатина значительно улучшает регенерацию мышц и уменьшает фиброз, результаты, представленные здесь, предполагают, что блокада миостатина путем введения MSTN-ANT1 сразу после травмы может повторить этот же эффект. Вес мышц, гистология, большие регенерирующие области в дни 7 и 10, а также значительно больше отдельных участков волокна на 28-й день, все критерии регенерации наблюдались после MSTN-ANT1 лечения (рис. 2 и 3, в). Кроме того, MSTN-ANT1 обработанные мышцы отображают снижение уровня коллагена (рис. 3), тем самым предполагая, что миостатин участвует в процессах фиброза и образовании коллагена. Это подтверждается тем фактом, что во время миграции фибробластов миостатин может вести себя как хемоаттрактант фибробластов (данные не показаны). В совокупности, эти результаты показывают, что длительное отсутствие миостатина, как это наблюдалось у миостатин-нулевых мышей, не является необходимым для получения расширенной регенерации мышц и снижения фиброза. Скорее всего, краткосрочная блокада миостатина во время периода регенерации является достаточной для улучшения процесса регенерации. Во время восстановления мышц, MyoD выражается раньше и на более высоких уровнях в миостатина-нулевых мышцах по сравнению с диким типом мышц. Аналогичным образом, Вестерн-блот анализ регенерирующих мышц от мышей, получавших MSTN-ANT1, показал повышение уровней MyoD во время регенерации , тем самым предполагая, что увеличение миогенеза является прямым результатом блокады миостатина MSTN-ANT1 (рис. 4в). Кроме того, Pax7, который экспрессируется в спокойных и пролиферирующих клетках, был выше при MSTN-ANT1 лечении в течении испытательного периода, тем самым предлагая сравнительное увеличение числа спутниковых клетки, активации и / или самообновления (рис. 4б ). Эти более высокие Pax7 и MyoD уровни могут быть связаны с увеличением числа клеток-сателлитов и последующим миогенезом и увеличением спутникового обновления клеток. Следует отметить, что в то время как аналогичные уровни MyoD наблюдались в MSTNANT1регенерирующих мышцах на 28-й день, более высокий уровень Pax7 были замечены в MSTN-ANT1 обработанных мышцах, чем в группе контроля. Pax7 является маркером для самообновления спутниковых клеток, высокий уровень Pax7 указывает, что MSTN-ANT1 должен повышать это самообновление. Это в соответствии с ранее сделанными выводами, означает, что миостатин тормозит спутниковые клетки самостоятельно. Кроме того, MSTN-ANT 1введение мышам в возрасте 6 недель также привело к увеличению MyoD и Pax7 белка в икроножных мышцах и первичных миобластов (рис. 4f-я). Возраст мышц может повлиять на этот процесс из-за потери волокон и атрофии существующих волокон, следовательно, продолжение миогенеза на таком же уровне необходим для поддержания и восстановления мышц. Соответственно, MyoD экспрессия, как было показано, высокая у молодых животных, значительно уменьшается у взрослого, а затем снова растет с возрастом. Однако, несмотря на уровни MyoD и других миогенных регуляторных факторов, увеличение возраста мышц не восстанавливает миогенную способность мышц к уровню молодых мышц. Потому что миостатин, как известно, уменьшает экспрессию MyoD, можно было бы ожидать, что миостатин негативно регулирует этот возрастной миогенез. В самом деле, путем противодействия миостатину, мы смогли повысить уровень миогенеза, о чем свидетельствует увеличение уровня как MyoD и Pax7 белка. В поддержку этих результатов, повышение спутниковой активации клеток наблюдалось в 1 - и 24-месячных одиночных волокнах при культивировании в присутствии MSTN-ANT1 (рис. 5в, г). Кроме того, MSTN-ANT1 вводили в естественных условиях мышам в возрасте, он был в состоянии увеличить процент активированных клеток-сателлитов на волокно (рис. 5е). Это предполагает, что антагонизм миостатина через подкожные инъекции MSTN-ANT1 может предоставить средства для увеличения миогенеза, возможно, за счет увеличения числа спутниковых клеток . Если это действительно так, то, возможно, антагонизм миостатина у старых животных может способствовать преодолению тенденции к сокращению сателлитных клеток и / или их потенциалу активации, который, как сообщается, уменьшается с возрастом. Увеличение активации спутниковых клеток , как можно было бы ожидать, приведет к увеличению прочности. Как показано на рисунке 5 , после 6-недельного лечения MSTN-ANT1, сила мышц увеличилась у обработанных животных (P <0,05).Как отмечалось ранее, одним из основных компонентов процесса регенерации является воспалительная реакция. После травмы, макрофаги, а также миобласты мигрируют в место повреждения в ответ на сигналы воспалительных цитокинов и различных факторов роста. Подтверждающие результаты исследования с использованием миостатин-нулевых мышей, ускоренная миграция макрофагов наблюдалось после MSTN-ANT1 лечения (день 2, рис 6в), тем самым предполагая, что MSTN-ANT1 быстро и эффективно противодействует тормозящему действию миостатина . Аналогичные выводы показали анализы хемоатрактантов (рис. 7). Старение значительно негативно влияло как на первичные миобласты и миграцию макрофагов (рис. 7а, б). Это может быть обусловлено снижением склонности к хемотаксису 24-месячных миобластов и макрофагов в ответ на их соответствующие хемоаттрактанты, или за счет снижением экспрессии рецепторов. Интересно, что после 6 недель MSTN-ANT1 лечения, миграционная способность макрофагов была восстановлена (в неизвестном степени) у старых мышей (рис. 7б). В совокупности представленные здесь результаты показывают, что краткосрочные блокады миостатина и его функции через лечение антагонистом может эффективно увеличить восстановление мышц у пожилых мышей после травм и во время возрастной атрофии мышц. Последствия лечения антагонистом для здоровья человека являются обширными. Эффективность лечения антагонистом была продемонстрирована здесь, только четыре дозы антагониста в критический период восстановления после травмы было достаточно, чтобы значительно улучшить восстановление мышц. Поэтому мы полагаем, что антагонист миостатина является жизнеспособным вариантом лечения недостаточной регенерации мышц и саркопении у людей, восстанавливая миогенную и воспалительную реакцию и уменьшая фиброз. Материалы и методы Генерация MSTN-ANT1. Система кишечной палочки была использована для создания усеченного миостатина. Усиленную комплементарную ДНК из C-концевой области миостатина очищают, а затем вставляют в вектор рЕТ 16-B (Novagen, Madison, WI). В целях формирования MSTN-ANT1, комплементарная ДНК была усечена на 350 аминокислоты. Белок очищают с использованием никель-нитрилоуксусной кислоты (Ni-NTA) агарозы (Qiagen, Hilden, Германия) . Для того, чтобы проверить чистоту антагониста, он был отделен от NuPAGE в 412% Bis-Tris геле (Invitrogen, Carlsbad, CA), окрашивали кумасси синим, а затем обесцвечивали. Животные. Дикий тип мышей C57BL/10 был выведен на небольшой колонии животных. Все животные были обработаны в соответствии с руководящими принципами Ruakura животного комитета по этике (AgResearch, Гамильтон, Новая Зеландия). Введение MSTN-ANT1 и нотексина мышам. В 0 день 1-летних мышей анестезировали с 10% кетамином гидрохлоридом (100 мг / мл) / 5% Rompun (20 мг / мл) в 0,1 мл / 7 г веса тела. Небольшой разрез был сделан на левой TA, и нотексин (10 г / мл; Venom, Австралия) вводили в мышцы. На 1, 3, 5 и 7 группы получили лечение MSTN-ANT1 на 6 г / г веса тела подкожно, в то время как контрольная группа получала эквивалентный объем физиологического раствора. Мыши были подвергнуты эвтаназии в дни 1, 2, 3, 7, 10 и 28 (4-6 мышей в группе в день). Кроме того, мышам в возрасте 13-16 месяцев вводили подкожно три раза в неделю MSTN-ANT1 на 6 г / г веса тела, или эквивалентный объем физиологического раствора, в течение 6 недель (10 в группе). ТА и икроножные мышцы были собраны для одного выделения волокон и мышечных белков, соответственно, в то время как остальные мышцы задних конечностей были собраны для изоляции миобластов. Костный мозг был также собран для культур макрофагов, используемых для анализа хемотаксиса. Оценка регенерации мышечной массы и силы. TA мышцы были вскрыты, взвешанны и заморожены для выделения белка или срезов ткани . Срезы мышц окрашивали гематоксилином и эозином для визуализации и измерения неперерожденной и регенерирующей области. Для визуализации областей коллагена на 10 и 28 день после травмы, мышечные срезы окрашивали по Ван Гизону . Количество коллагена . Затем измеряют в пределах каждого среза в процентах от общей площади сечения. Срезы мышц в дни 2, 3, 7, и 10 были исследованы на Mac1. Двойное измерение мышечной силы проводится у мышей, которым вводили физиологический раствор или MSTN-ANT1, в течение 6 недель в начале исследования и при завершении (MK-380S, Муромати, Токио, Япония). Изоляция волокна и анализ активации спутниковых клеток. TA мышцы собраны у мышей были использованы для выделения отдельных волокон. Изолированные волокна затем культивировали в течение 24 или 48 часов при 37 ° C в 5% CO2. Кроме того, отдельные волокна были выделены из необработанных 1-месячных и 24-месячных мышей. Эти волокна культивировали с или без MSTN-ANT1 с 5 г / мл в течение 24, 48 или 72 часов при 37 ° С в 5% СО2. После того, как требуемое время культивирования прошло, волокна подверглись иммуноокрашиванию на ядерный антиген пролиферирующих клеток и с 4 ',6-диамидино-2-фенилиндол (см. дополнительные данные S1).Положительные ядра на ядерный антиген пролиферирующих клеток были подсчитаны в процентах от общего числа ядер для нормализации данных и исключить любые расхождения в длине волокна. Выделение первичных миобластов и перитонеальных макрофагов. Спутниковое клетки были изолированы из мышц задних конечностей мышцы в соответствии с протоколом. После 48 часов культивирования клетки были собраны для изоляции белка. Кроме того, первичные миобласты, выделенные у необработанных 1-месячных и 24-месячных мышей для анализа хемотаксиса. Для анализа пролиферации миобласты культивировали с или без MSTN-ANT1 10 г / мл в течение 96 часов. Пролиферация клеток была позже оценена с помощью фотометрического анализа. Макрофаги костного мозга были получены путем посева клеток костного мозга на 5 10 6 клеток/пластина в среде Игла, модифицированной (DMEM) + 10% эмбриональной телячьей сывороткой + 10% L929 кондиционированной среде (содержащей колониестимулирующий фактор-1) в течение 5 дней, чтобы побудить дифференциацию макрофагов. Перитонеальные макрофаги были получены путем промывания брюшной полости 1-месячных и 24-месячных необработанных мышей холодным фосфатно-солевом буфером. Миобласты и анализ макрофагального хемотаксиса. Анализы хемотаксиса проводили в двух экземплярах с использованием культуры клеток,содержащие полиэтилентерефталат 0,8 м (BD Biosciences, San Jose, CA) Для хемотаксиса макрофагов, DMEM + зимозан (Sigma, Сент-Луис, Миссури), активированная мышинная сыворотка используется в качестве хемоаттрактанта на 33, 22 и 11% (об / об). Для хемотаксиса миобластов, DMEM + 2% лошадиной сыворотки + 5% экстракт куриных эмбрионов (оптимальной), DMEM + 2% лошадиной сыворотки (субоптимальных) или DMEM + 5% экстракт куриных эмбрионов (субоптимальных) были использованы в качестве хемоаттрактантов. Эксперименты проводились с 2,5 или 5 г / мл рекомбинантного миостатина в присутствии или в отсутствии MSTN-ANT1 . Клетки инкубировали в течение 4 и 7 часов для макрофагов и миобластов, соответственно. Перенесенные клетки подсчитывали по четыре поля на мембране. Анализ белков. TA мышцы мышей гомогенизировали в 1 мл буфера для лизиса белков [0,05 М Трис, рН 7,5, 0,25 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, ингибитора протеазы (Roche, Annheim, Германия) и 0,1% NP40]. Реагента Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) был использован для оценки общего белка. Общий белок (10 г) был разделен на NuPAGE 4-12% Bis-Tris геле (Invitrogen) и перен на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad), прежде чем определены MyoD или Pax7 (см. дополнительные данные S1). Общий белок (15 г) был использован для вестерн блот анализа на MyoD и Pax7. Изображение и статистический анализ. Неперерожденные / регенерирующие области и отложение коллагена были проанализированы с помощью Olympus SZ-PT стереомикроскопа (Olympus, Токио, Япония), три прибора со связью с камерой (Dage MTI, Мичиган-Сити, IN) и Scion Image программного обеспечения (Scion, MD). Полученные изображения были затем оценены с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальный институт здоровья). Положительное окрашивание на Mac1 оценено под флуоресцентным освещением с использованием микроскопа Olympus BX50, SPOT-RT 4,01 камеры и программное обеспечение (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, MI) Все данные представлены в виде значений и стандартных ошибок. Дисперсионный анализ и тест Тьюки был использован для определения значимости (P <0,05), данные различия между группами. Ссылки REFERENCES Alnaqeeb, MA and Goldspink, G (1987). Changes in fibre type, number and diameter in developing and ageing skeletal muscle. J Anat 153: 31–45. | PubMed | ISI | ChemPort | Gutmann, E and Hanzlikova, V (1966). Motor unit in old age. Nature 209: 921–922. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Holloszy, JO, Chen, M, Cartee, GD and Young, JC (1991). Skeletal muscle atrophy in old rats: differential changes in the three fiber types. Mech Ageing Dev 60: 199–213. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Lexell, J, Taylor, CC and Sjostrom, M (1988). What is the cause of the ageing atrophy? Total number, size and proportion of different fiber types studied in whole vastus lateralis muscle from 15- to 83-year-old men. J Neurol Sci 84: 275–294. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Rowe, RW (1969). The effect of senility on skeletal muscles in the mouse. Exp Gerontol 4: 119–126. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Mauro, A (1961). Satellite cell of skeletal fibers. J Biophys Biochem Cytol 9: 493–498. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Schultz, E, Gibson, MC and Champion, T (1978). Satellite cells are mitotically quiescent in mature mouse muscle: an EM and radioautographic study. J Exp Zool 206: 451–456. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Partridge, TA (2002). Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther 9: 752–753. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Bischoff, R (1994). The satellite cell and muscle regeneration. In: Engel, AG and Franzini-Armstrong, C(eds). Myology: Basic and Clinical, McGraw-Hill, New York: pp. 97–112. Schultz, E and McCormick, KM (1994). Skeletal muscle satellite cells. Rev Physiol Biochem Pharmacol 123: 213–257. | PubMed | ISI | ChemPort | Johnson, SE and Allen, RE (1995). Activation of skeletal muscle satellite cells and the role of fibroblast growth factor receptors. Exp Cell Res 219: 449–453. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Lees, SJ, Rathbone, CR and Booth, FW (2006). Age-associated decrease in muscle precursor cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol 290: C609–C615. | PubMed | ISI | ChemPort | Schultz, E and Lipton, BH (1982). Skeletal muscle satellite cells: changes in proliferation potential as a function of age. Mech Ageing Dev 20: 377–383. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Jejurikar, SS, Henkelman, EA, Cederna, PS, Marcelo, CL, Urbanchek, MG and Kuzon, WM Jr. (2006). Aging increases the susceptibility of skeletal muscle derived satellite cells to apoptosis. Exp Gerontol 41: 828–836. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Krajnak, K, Waugh, S, Miller, R, Baker, B, Geronilla, K, Alway, SE et al. (2006). Proapoptotic factor Bax is increased in satellite cells in the tibialis anterior muscles of old rats. Muscle Nerve 34: 720–730. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Bockhold, KJ, Rosenblatt, JD and Partridge, TA (1998). Aging normal and dystrophic mouse muscle: analysis of myogenicity in cultures of living single fibers. Muscle Nerve 21: 173–183. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Conboy, IM, Conboy, MJ, Smythe, GM and Rando, TA (2003). Notch-mediated restoration of regenerative potential to aged muscle. Science 302: 1575–1577. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Decary, S, Mouly, V, Hamida, CB, Sautet, A, Barbet, JP and Butler-Browne, GS (1997). Replicative potential and telomere length in human skeletal muscle: implications for satellite cell-mediated gene therapy. Hum Gene Ther 8: 1429–1438. | PubMed | ISI | ChemPort | Carlson, BM and Faulkner, JA (1989). Muscle transplantation between young and old rats: age of host determines recovery. Am J Physiol 256: C1262–C1266. | PubMed | ISI | ChemPort | Conboy, IM, Conboy, MJ, Wagers, AJ, Girma, ER, Weissman, IL and Rando, TA (2005). Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. Nature 433: 760–764. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | McPherron, AC, Lawler, AM and Lee, SJ (1997). Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature 387: 83–90. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Langley, B, Thomas, M, Bishop, A, Sharma, M, Gilmour, S and Kambadur, R (2002). Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression. J Biol Chem 277: 49831–49840. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Thomas, M, Langley, B, Berry, C, Sharma, M, Kirk, S, Bass, J, et al (2000). Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. J Biol Chem 275: 40235–40243. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | McCroskery, S, Thomas, M, Maxwell, L, Sharma, M and Kambadur, R (2003). Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J Cell Biol 162: 1135–1147. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Carlson, CJ, Booth, FW and Gordon, SE (1999). Skeletal muscle myostatin mRNA expression is fiber-type specific and increases during hindlimb unloading. Am J Physiol 277: R601–R606. | PubMed | ISI | ChemPort | Gonzalez-Cadavid, NF, Taylor, WE, Yarasheski, K, Sinha-Hikim, I, Ma, K, Ezzat, S et al. (1998). Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14938–14943. | Article | PubMed | ChemPort | Zimmers, TA, Davies, MV, Koniaris, LG, Haynes, P, Esquela, AF, Tomkinson, KN et al. (2002). Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin. Science 296: 1486–1488. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Siriett, V, Platt, L, Salerno, MS, Ling, N, Kambadur, R and Sharma, M (2006). Prolonged absence of myostatin reduces sarcopenia. J Cell Physiol 209: 866–873. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Wagner, KR, Liu, X, Chang, X and Allen, RE (2005). Muscle regeneration in the prolonged absence of myostatin. Proc Natl Acad Sci USA 102: 2519–2524. | Article | PubMed | ChemPort | Lee, SJ and McPherron, AC (2001). Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA 98: 9306–9311. | Article | PubMed | ChemPort | McCroskery, S, Thomas, M, Platt, L, Hennebry, A, Nishimura, T, McLeay, L et al. (2005). Improved muscle healing through enhanced regeneration and reduced fibrosis in myostatin-null mice. J Cell Sci 118: 3531–3541. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Oustanina, S, Hause, G and Braun, T (2004). Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not their specification. EMBO J 23: 3430–3439. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Seale, P, Sabourin, LA, Girgis-Gabardo, A, Mansouri, A, Gruss, P and Rudnicki, MA (2000). Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell 102: 777–786. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Grounds, MD, Garrett, KL, Lai, MC, Wright, WE and Beilharz, MW (1992). Identification of skeletal muscle precursor cells in vivo by use of MyoD1 and myogenin probes. Cell Tissue Res 267: 99–104. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Bischoff, R (1997). Chemotaxis of skeletal muscle satellite cells. Dev Dyn 208: 505–515. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Jones, GE (2000). Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. J Leukoc Biol 68: 593–602. | PubMed | ISI | ChemPort | Welle, S, Bhatt, K and Thornton, CA (2000). High-abundance mRNAs in human muscle: comparison between young and old. J Appl Physiol 89: 297–304. | PubMed | ISI | ChemPort | Whittemore, LA, Song, K, Li, X, Aghajanian, J, Davies, M, Girgenrath, S et al. (2003). Inhibition of myostatin in adult mice increases skeletal muscle mass and strength. Biochem Biophys Res Commun 300: 965–971. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Zammit, PS, Golding, JP, Nagata, Y, Hudon, V, Partridge, TA and Beauchamp, JR (2004). Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal? J Cell Biol 166: 347–357. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Dedkov, EI, Kostrominova, TY, Borisov, AB and Carlson, BM (2003). MyoD and myogenin protein expression in skeletal muscles of senile rats. Cell Tissue Res 311: 401–416. | PubMed | ISI | ChemPort | Grounds, MD (1998). Age-associated changes in the response of skeletal muscle cells to exercise and regeneration. Ann NY Acad Sci 854: 78–91. | Article | PubMed | ChemPort | Welle, S (2002). Cellular and molecular basis of age-related sarcopenia. Can J Appl Physiol 27: 19–41. | PubMed | ISI | ChemPort | Shefer, G, Van de Mark, DP, Richardson, JB and Yablonka-Reuveni, Z (2006). Satellite-cell pool size does matter: defining the myogenic potency of aging skeletal muscle. Dev Biol 294: 50–66. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Sharma, M, Kambadur, R, Matthews, KG, Somers, WG, Devlin, GP, Conaglen, JV, et al. (1999). Myostatin, a transforming growth factor-beta superfamily member, is expressed in heart muscle and is upregulated in cardiomyocytes after infarct. J Cell Physiol 180: 1–9. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Rosenblatt, JD, Lunt, AI, Parry, DJ and Partridge, TA (1995). Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim 31: 773–779. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Partridge, TA (1997). Tissue culture of skeletal muscle. Methods Mol Biol 75: 131–144. | PubMed | ChemPort | Yablonka-Reuveni, Z, Rudnicki, MA, Rivera, AJ, Primig, M, Anderson, JE and Natanson, P (1999). The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Dev Biol 210: 440–455. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Oliver, MH, Harrison, NK, Bishop, JE, Cole, PJ and Laurent, GJ (1989). A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates: application for assessment of growth factors. J Cell Sci 92: 513–518. | PubMed | ISI | Suresh, A and Sodhi, A (1991). Production of interleukin-1 and tumor necrosis factor by bone marrow-derived macrophages: effect of cisplatin and lipopolysaccharide. Immunol Lett 30: 93–100. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
