Блокада сигналов миостатина доминантными негативными рецепторами улучшает приживаемость

Блокада сигналов миостатина доминантными негативными рецепторами улучшает приживаемость
миобластов при трансплантации mdx мышам.
Введение
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является тяжелым Х-хромосомным, рецессивным
заболеванием, поражающим 1 из 3500 новорожденных мальчиков. Оно возникает в результате
мутации в гене, кодирующем дистрофин, 427-KD белок, состоящий из 3685 аминокислот.
Дистрофин находится непосредственно под мембраной скелетных мышечных волокон и его
отсутствие у пациентов с МДД вызывает сарколеммную нестабильность, что приводит к частым
повреждениям мышечных волокон. В дистрофических мышцах регенерация постепенно
прекращается, и нормальный цикл вырождения-регенерации отклоняется в пользу дегенерации.
Это дефект ремонта мышцы в результате старения миобластов приводит к смерти в начале
третьего десятилетия. Доставка нормального гена дистрофина при трансплантации мышечных
клеток-предшественников (например, миобластов), полученных от здоровых доноров в результате
долгосрочного восстановления этого белка. Успех трансплантации миобластов, однако,
уменьшается при ограниченной регенерации мышц у MDX мышей и пациентов с МДД.
Миостатин (MSTN), член семейства трансформирующих факторов роста-β, является негативным
регулятором роста скелетных мышц. Драматический эффект MSTN на постнатальный рост
связан с его негативной регуляцией активации сателлитных клеток, пролиферацией и
самообновлением, и его ингибирование пролиферации и дифференцировке миобластов. MSTN
также вовлечен в процесс регенерации мышц, блокируя миграцию макрофагов и, таким образом,
воспалительный ответ, который происходит после мышечного повреждения. MSTN
первоначально секретируется в виде белка-предшественника, состоит из двух одинаковых 352
аминокислотных полипептидных цепей, удерживаемых вместе дисульфидной связью. Nконцевые сегменты 243 аминокислотных остатков этого димера называются MSTN пропептидом,
который оказывается MSTN биологически неактивным предшественником. Протеолитическое
расщепление этих сегментов генерирует зрелую форму MSTN, который обладает биологической
активностью только после его полного освобождения от пропептидов. После обработки
протеолитическими ферментами С-конца зрелого MSTN, 25-кДа белка, состоящего из двух
одинаковых 109 аминокислотных полипептидных цепей, скрепленных одной дисульфидной
связью, 13 связываются с одной из серин / треонин киназ типа II клеточной поверхности [активин
тип рецепторов IIB (ActRIIB)] в большей степени, чем ActRIIA чтобы активировать его
биологические функции, его связывание с ActRIIB приводит к фосфорилированию и активации
активин I рецептора, который в свою очередь инициирует внутриклеточный сигнальный каскад
фосфорилированием рецептор-регулируемых белков Smad2 и Smad3. После фосфорилирования
Smads образует гетеродимер с Со-Smad, Smad4. Этот комплекс перемещается в ядро, связывается
с ДНК, и, наконец, модулирует транскрипцию различных целевых генов внутри клетки. MSTN
блок стимулирует рост миобластов путем ингибирования экспрессии миогенных регуляторных
факторов, таких как MyoD и стимулируя экспрессию ингибиторов циклин-зависимых киназ, таких
как p21. Есть несколько MSTN ингибирующих стратегий в настоящее время в стадии
доклинических или клинических исследований. Одна из них заключается в блокаде передачи
сигналов MSTN, вызванная его взаимодействием с активин IIB-рецепторов. Исследования,
проведенное в нашей лаборатории, подтвердили эти результаты, а также отметили, что успех
нормальной трансплантации миобластов был улучшен у MDX мышей, несущих dnActRIIB. Это
исследование показало, что миобласты, полученные из этих трансгенных мышей, формируют
более обильные дистрофин-положительные волокна при трансплантации в MDX мышцах. Кроме
того, было показано, что пропептид MSTN ингибирует связывание MSTN, чтобы заблокировать
его тормозящее действие на рост мышц in vivo. Другие исследования исследовали еще один
потенциальный ингибитор MSTN
фоллистатин, который подавляет активность других
трансформирующих факторав роста-β.
Мыши, экспрессирующие повышенные уровни
фоллистатина в мышцах, имели резкое увеличение мышечной массы, ее гиперплазию и
гипертрофию. Наша исследовательская группа недавно продемонстрировала, что фоллистатин
улучшил успех трансплантации нормальных миобластов у MDX мышей. Потому что у людей, нет
доноров миобластов, которые несут dnActRIIB, мы стремились ввести этот ген лентивирусом в
клетки человека во время их экспансии в предтрансплантационной культуре, оценивали его
воздействия на формирование дистрофин-положительных волокон, тем самым улучшая успех
трансплантации миобластов.
Результаты
Постоянная экспрессия dnActRIIB.
Человеческие миобласты были заражены лентивирусом с dnActRIIB (Дополнительный Рис S1).
Эти клетки затем лизируют, и концентрацию белка в клеточных экстрактах определяли с
использованием набора ВСА анализа белка (Pierce, Rockford, IL). Образцы были разделены 10%
додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле, и проведен иммуноблоттинг с антителами
против ActRIIB. Вестерн-блот анализ показал экспрессию dnActRIIB в миобластах
инфицированных Ленти-CMV-dnActRIIB (рис. 1). Полосы усеченного рецептора (25 кд) были
более интенсивны, чем при нормальном диапазоне рецептора (100 кд).
Увеличение роста миобластов следующее за ингибированием сигнала MSTN.
MSTN является негативным регулятором распространения миобластов. Определение влияния
ингибирования сигнала MSTN в миобластах, несущих или не несущих dnActRIIB, было оценено с
помощью флуоресцентного анализа (CyQuant), что коррелирует с числом клеток. Ростовую среду
миобластов дополняли или не дополняли 500 нг / мл MSTN и меняли каждые 2 дня. Клеткам
давали пролиферировать в течение 4 дней и затем планшеты анализировали на общее количество
клеток. MSTN значительно снижает пролиферацию нормальных миобластов (выражающих
нормальный ActRIIB) по сравнению с необработанными нормальными миобластами (рис. 2).
Торможение дифференциации MSTN нормальных миобластов, но не dnActRIIB экспрессирующих
миобластов.
Миогенную дифференциацию человеческих миобластов оценивали через 3 дня после
переключения миобластов к дифференциации в среде, содержащей или не содержащей
рекомбинантный MSTN (500 нг / мл). Культуры фиксировали и окрашивали 4 ',6-диамидино-2фенилиндолом, чтобы визуализировать ядра, и рассматривали с антителами к MyHC (рис. 3а).
Лечение MSTN привело к значительному снижению размера и количества ActRIIB мышечных
трубок, но не имело никакого влияния на формирование dnActRIIB в мышечных трубках (рис. 3б,
в). Последующий анализ диаметров мышечных трубок показал, что лечение MSTN ингибирует
синтез нормальных миобластов примерно на 45% (рис. 3б) и уменьшает диаметр миотрубок на
87% (фиг. 3c). Однако этот ингибирующий эффект не наблюдался для dnActRIIB
экспрессирующих миобластов. Действительно, для этих миобластов индекс слияния и размер
мышечных трубок был повышен с или без MSTN в среде для дифференцировки, указывая, что
выражение dnActRIIB облегчает дифференциацию миобластов и диаметры миотрубок были
увеличены на 12-57% с MSTN в среде для дифференцировки.
Модуляция MSTN пути в dnActRIIB экспрессирующих миобластах.
Мы протестировали может ли эндогенный Smad2 регулировать экспрессию dnActRIIB. Лучший
способ контролировать Smad трансактивацию является трансфекция в пробирке Smad датчиков,
которые контролируют экспрессию гена-репортера, таких как зеленый флуоресцентный белок.
DnActRIIB снижает активность репортера Smad2 (рис. 4), наши результаты подтверждают
данные, представленные в другом исследовании.
Экспрессия MyoD мРНК в миобластах, несущих или нет dnActRIIB.
MyoD семья играет существенную роль в качестве центрального регулятора миогенеза. Myf5 и
MyoD выражаются в миобластах и мышечных трубках, и необходимы для миогенеза. Миогенин
имеет решающее значение для формирования мышечных трубочек и терминальных миогенных
событий дифференциации. Несколько исследований описывали, что миогенные клетки реагируют
на MSTN снижением экспрессии ключевых транскрипционных регуляторов развития мышц,
таких как MyoD, Pax3, Pax7, P21, объясняя свои ингибирующие эффекты при дифференцировке,
поэтому ингибирование MSTN должно привести к повышенной экспрессии этих регуляторов. ОТПЦР анализ MyoD семьи в миобластах, несущих или не dnActRIIB с или без MSTN в среде (рис.
5), показал, что MyoD, миогенин, Myf5 и MyHC мРНК были обнаружены в их ожидаемом размере
(рис. 5а). Выражение генов было увеличено в dnActRIIB экспрессирующих миобластах, по
сравнению с нормальными миобластами, в основном экспрессирубщих Myf5, Myogenin, и MyHC
(P <0,05). Тем не менее, в присутствии MSTN в среде, мы наблюдали ингибирование экспрессии
этих генов и MyoD в нормальных миобластах, но не в экспрессирующих dnActRIIB миобластах
(рис. 5б). Выражение миогенного фактора кажется выше в dnActRIIB экспрессирующих
миобластах с или без обработки MSTN.
Успех трансплантации в Rag / MDX человеческих миобластах, несущих dnActRIIB.
Для изучения влияния блокировки сигнала MSTN у дистрофических мышей на долгосрочной
успеха трансплантации нормальных человеческих миобластов, полмиллиона миобластов с или
без dnActRIIB были пересажены в каждую переднюю большеберцовую (ТА) мышцу Rag / MDX
мышей. Рисунок 6а показывает репрезентативные сечения пересаженных
мышц с миобластами (рис. 6а, левая сторона) и dnActRIIB-выражающие
миобласты (рис. 6а, правая сторона). Дисперсионный анализ выявил, что больше мышечных
волокон, выражающих человеческий дистрофин (105 ± 20), были обнаружены в мышечных
сечениях Rag / MDX мышей, которым пересаженны миобласты, несущие dnActRIIB. Только 62 ±
2 мышечных волокон были положительными для человеческого дистрофина в мышечных
поперечных сечениях MDX мышей с трансплантироваными нормальными миобластами (фиг.6В).
Таким образом, на 40% больше дистрофин-положительных волокон присутствовало после
трансплантации dnActRIIB экспрессирующих миобластов. Этот результат можно объяснить
снижением MSTN ингибирования миобластов, выражающих мутантный рецептор MSTN.
Обсуждение
MSTN является ключевым регулятором развития скелетных мышц и роста. Это исследование дало
несколько важных выводов, касающихся сигнализации MSTN и его вклад в успех трансплантации
миобластов. Таким образом, блокада сигнала MSTN при трансплантации человеческих
миобластов повысила количество мышечных волокон, выражающих человеческий дистрофина в
мышцах Rag / MDX мышей. Этот улучшенный успех трансплантации объясняется связыванием
эндогенного MSTN в усеченных рецепторов MSTN, которые были неэффективны. Кроме того,
белки dnActRIIB также сформировали димеры с нормальными белками ActRIIB, поэтому
формируются неактивные рецепторы. Мы предлагаем следующую модель (рис. 7), чтобы
проиллюстрировать эффект присутствия dnActRIIB в миобластах, в котором MSTN связывается с
рецептором dnActRIIB не вызывая передачу сигнала. Фосфорилирование домена GS от типа I
рецептора ингибируется в связи с отсутствием внутриклеточной киназы мутантного рецептора
типа II. Так, комплекс Smad не может быть активирован.
Из-за отсутствия ингибирования MSTN, мы предположили, что человеческие генетически
модифицированные миобласты выражали dnActRIIB, размножались и сливались
с
принимающими мышечными волокнами, таким образом производя больше мышечных волокон,
выражающих человеческий дистрофин. Наши результаты в пробирке подтвердили это
предположение, действительно MSTN, даже добавленный экзогенно, не имеет ингибирующего
действия на миобласты, несущие dnActRIIB и, таким образом, эти клетки имеют более широкое
распространение нормальных миобластов (экспрессирующие только ActRIIB). Эти
физиологические изменения включают изменения в экспрессии миогенного фактора. MSTN
уменьшает пролиферацию и дифференцировку миобластов, подавляя экспрессию MyoD
основных транскрипционных факторов, которые включают MyoD, Myogenin, Myf5 и миогенный
фактор-4. Это исследование показало, что экспрессия миогенина, Myf5 и MyHC мРНК
значительно выше в dnActRIIB экспрессирующих миобластах даже в присутствии экзогенного
MSTN. Взятые вместе, наши результаты показывают, что ингибирование сигнала MSTN усиливает
регенеративные способности мышц. В dnActRIIB экспрессирующих миобластах менее
восприимчивы к MSTN, что приводит к увеличению пролиферации и выражению MYF 5,
миогенина и MyHC. Многочисленные исследования изучили регуляцию экспрессии MSTN в ответ
на различные раздражители и при различных физиологических условиях, и регуляцию или
подавление экспрессии MSTN, которая была обнаружена во многих из этих исследований.
Очевидно, намного больше работы будет необходимо чтобы определить,
будет ли путь MSTN иметь положительные последствия для лечения
дистрофии. Тем не менее, наше исследование показывает, что генетическая модификация
человеческих миобластов
dnActRIIB увеличивает образование дистрофин-положительных
мышечных волокон в дистрофических скелетных мышцах, увеличивая синтез с принимающими
мышечными волокнами. Такой подход может повысить успех клеточной терапии для МДД, без
необходимости системного ингибирования MSTN у пациента. Таким образом, этот подход имеет
то преимущество, что он позволяет улучшить пролиферацию и слияние только привитых
миобластов, не приводя к мышечной гипертрофии мышц пациента, которая может быть за счет
пролиферативной способности собственных миобластов пациента.
Ссылки
1. Emery, AE (1993). Duchenne muscular dystrophy–Meryon's disease. Neuromuscul Disord 3:
263–266. | Article | PubMed | ChemPort |
2. Hoffman, EP, Brown, RH Jr and Kunkel, LM (1987). Dystrophin: the protein product of the
Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51: 919–928. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
3. Blau, HM, Webster, C and Pavlath, GK (1983). Defective myoblasts identified in Duchenne
muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci USA 80: 4856–4860. | Article | PubMed | ChemPort |
4. Bonilla, E, Samitt, CE, Miranda, AF, Hays, AP, Salviati, G, DiMauro, S et al. (1988). Duchenne
muscular dystrophy: deficiency of dystrophin at the muscle cell surface. Cell 54: 447–452. |
5. Skuk, D and Tremblay, JP (2000). Progress in myoblast transplantation: a potential treatment of
dystrophies. Microsc Res Tech 48: 213–222. | Article | PubMed | ChemPort |
6. Skuk, D and Tremblay, JP (2003). Myoblast transplantation: the current status of a potential
therapeutic tool for myopathies. J Muscle Res Cell Motil 24: 285–300.
7. McPherron, AC, Lawler, AM and Lee, SJ (1997). Regulation of skeletal muscle mass in mice by
a new TGF-β superfamily member. Nature 387: 83–90. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
8. Thomas, M, Langley, B, Berry, C, Sharma, M, Kirk, S, Bass, J et al. (2000). Myostatin, a
negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. J Biol Chem
275: 40235–40243. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
9. McCroskery, S, Thomas, M, Maxwell, L, Sharma, M and Kambadur, R (2003). Myostatin
negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J Cell Biol 162: 1135–1147.
10. Langley, B, Thomas, M, Bishop, A, Sharma, M, Gilmour, S and Kambadur, R (2002). Myostatin
inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression. J Biol Chem 277: 49831–
49840. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
11. McCroskery, S, Thomas, M, Platt, L, Hennebry, A, Nishimura, T, McLeay, L et al. (2005).
Improved muscle healing through enhanced regeneration and reduced fibrosis in myostatin-null
mice. J Cell Sci 118(Pt 15): 3531–3541. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
12. Jiang, MS, Liang, LF, Wang, S, Ratovitski, T, Holmstrom, J, Barker, C et al. (2004).
Characterization and identification of the inhibitory domain of GDF-8 propeptide. Biochem
Biophys Res Commun 315: 525–531. | Article | PubMed | ChemPort |
13. Lee, SJ (2004). Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol 20: 61–86.
14. Joulia-Ekaza, D and Cabello, G (2007). The myostatin gene: physiology and pharmacological
relevance. Curr Opin Pharmacol 7: 310–315. | Article | PubMed | ChemPort |
15. Kollias, HD and McDermott, JC (2008). Transforming growth factor-β and myostatin signaling
in skeletal muscle. J Appl Physiol 104: 579–587. | Article | PubMed | ChemPort |
16. Lee, SJ and McPherron, AC (2001). Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc
Natl Acad Sci USA 98: 9306–9311. | Article | PubMed | ChemPort |
17. Patel, K and Amthor, H (2005). The function of myostatin and strategies of myostatin blockadenew hope for therapies aimed at promoting growth of skeletal muscle. Neuromuscul Disord 15:
117–126. | Article | PubMed
18. Joulia-Ekaza, D, Dominique, JE, Cabello, G and Gérard, C (2006). Myostatin regulation of
muscle development: molecular basis, natural mutations, physiopathological aspects. Exp Cell
Res 312: 2401–2414. | Article | PubMed | ChemPort |
19. Wagner, KR (2005). Muscle regeneration through myostatin inhibition. Curr Opin Rheumatol 17:
720–724. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
20. Benabdallah, BF, Bouchentouf, M and Tremblay, JP (2005). Improved success of myoblast
transplantation in mdx mice by blocking the myostatin signal. Transplantation 79: 1696–1702.
21. Qiao, C, Li, J, Jiang, J, Zhu, X, Wang, B, Li, J et al. (2008). Myostatin propeptide gene delivery
by adeno-associated virus serotype 8 vectors enhances muscle growth and ameliorates dystrophic
phenotypes in mdx mice. Hum Gene Ther 19: 241–254. | Article | PubMed | ChemPort |
22. Gamer, LW, Wolfman, NM, Celeste, AJ, Hattersley, G, Hewick, R and Rosen, V (1999). A novel
BMP expressed in developing mouse limb, spinal cord, and tail bud is a potent mesoderm inducer
in Xenopus embryos. Dev Biol 208: 222–232. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
23. Benabdallah, BF, Bouchentouf, M, Rousseau, J, Bigey, P, Michaud, A, Chapdelaine, P et al.
(2008). Inhibiting myostatin with follistatin improves the success of myoblast transplantation in
dystrophic mice. Cell Transplant 17: 337–350. | Article | PubMed
24. Sartori, R, Milan, G, Patron, M, Mammucari, C, Blaauw, B, Abraham, R et al. (2009). Smad2 and
3 transcription factors control muscle mass in adulthood. Am J Physiol, Cell Physiol 296: C1248–
C1257. | Article | PubMed | ChemPort |
25. Perry, RL and Rudnick, MA (2000). Molecular mechanisms regulating myogenic determination
and differentiation. Front Biosci 5: D750–D767. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |
26. McFarlane, C, Hennebry, A, Thomas, M, Plummer, E, Ling, N, Sharma, M et al. (2008).
Myostatin signals through Pax7 to regulate satellite cell self-renewal. Exp Cell Res 314: 317–329.
27. Ríos, R, Carneiro, I, Arce, VM and Devesa, J (2001). Myostatin regulates cell survival during
C2C12 myogenesis. Biochem Biophys Res Commun 280: 561–566.
28. Amthor, H, Otto, A, Macharia, R, McKinnell, I and Patel, K (2006). Myostatin imposes
reversible quiescence on embryonic muscle precursors. Dev Dyn 235: 672–680.
29. Liu, D, Black, BL and Derynck, R (2001). TGF-β inhibits muscle differentiation through
functional repression of myogenic transcription factors by Smad3. Genes Dev 15: 2950–2966.
30. Carlson, CJ, Booth, FW and Gordon, SE (1999). Skeletal muscle myostatin mRNA expression is
fiber-type specific and increases during hindlimb unloading. Am J Physiol 277: R601–R606.
31. Gonzalez-Cadavid, NF, Taylor, WE, Yarasheski, K, Sinha-Hikim, I, Ma, K, Ezzat, S et al.
(1998). Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIVinfected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14938–14943.
32. Ji, S, Losinski, RL, Cornelius, SG, Frank, GR, Willis, GM, Gerrard, DE et al. (1998). Myostatin
expression in porcine tissues: tissue specificity and developmental and postnatal regulation. Am J
Physiol 275(4 Pt 2): R1265–R1273. | PubMed | ISI | ChemPort |
33. Sharma, M, Kambadur, R, Matthews, KG, Somers, WG, Devlin, GP, Conaglen, JV et al. (1999).
Myostatin, a transforming growth factor-β superfamily member, is expressed in heart muscle and
is upregulated in cardiomyocytes after infarct. J Cell Physiol 180: 1–9.
34. Lalani, R, Bhasin, S, Byhower, F, Tarnuzzer, R, Grant, M, Shen, R et al. (2000). Myostatin and
insulin-like growth factor-I and -II expression in the muscle of rats exposed to the microgravity
environment of the NeuroLab space shuttle flight. J Endocrinol 167: 417–428.
35. Mendler, L, Zádor, E, Ver Heyen, M, Dux, L and Wuytack, F (2000). Myostatin levels in
regenerating rat muscles and in myogenic cell cultures. J Muscle Res Cell Motil 21: 551–563.
36. Sakuma, K, Watanabe, K, Sano, M, Uramoto, I and Totsuka, T (2000). Differential adaptation of
growth and differentiation factor 8/myostatin, fibroblast growth factor 6 and leukemia inhibitory
factor in overloaded, regenerating and denervated rat muscles. Biochim Biophys Acta 1497: 77–
88. | Article | PubMed | ChemPort |
37. Wehling, M, Cai, B and Tidball, JG (2000). Modulation of myostatin expression during modified
muscle use. FASEB J 14: 103–110. | PubMed | ISI | ChemPort |
38. Kawada, S, Tachi, C and Ishii, N (2001). Content and localization of myostatin in mouse skeletal
muscles during aging, mechanical unloading and reloading. J Muscle Res Cell Motil 22: 627–
633. | Article | PubMed | ChemPort |
39. Lang, CH, Silvis, C, Nystrom, G and Frost, RA (2001). Regulation of myostatin by
glucocorticoids after thermal injury. FASEB J 15: 1807–1809. | PubMed | ChemPort |
40. Marcell, TJ, Harman, SM, Urban, RJ, Metz, DD, Rodgers, BD and Blackman, MR (2001).
Comparison of GH, IGF-I, and testosterone with mRNA of receptors and myostatin in skeletal
muscle in older men. Am J Physiol Endocrinol Metab 281: E1159–E1164. | PubMed | ChemPort |
41. Morine, KJ, Bish, LT, Pendrak, K, Sleeper, MM, Barton, ER and Sweeney, HL (2010). Systemic
myostatin inhibition via liver-targeted gene transfer in normal and dystrophic mice. PLoS ONE 5:
e9176. | Article | PubMed | ChemPort |
42. Naldini, L, Blömer, U, Gallay, P, Ory, D, Mulligan, R, Gage, FH et al. (1996). In vivo gene
delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272: 263–267.
43. Kinoshita, I, Roy, R, Dugré, FJ, Gravel, C, Roy, B, Goulet, M et al. (1996). Myoblast
transplantation in monkeys: control of immune response by FK506. J Neuropathol Exp Neurol
55: 687–697.
Переведено проектом МОЙМИО: http://www.mymio.org
Оригинал статьи: http://www.nature.com/mt/journal/v19/n1/full/mt2010171a.html