РНК интерференция
advertisement
РНК интерференция План: Введение 1 История открытия 2 Молекулярные механизмы o 2.1 Малые интерферирующие РНК o 2.2 МикроРНК o 2.3 Эффекторный комплекс RISC o 2.4 Подавление транскрипции o 2.5 Связь с редактированием РНК o 2.6 Различия между организмами o 2.7 Аналог РНК у прокариот 3 Биологические функции o 3.1 Иммунитет o 3.2 Подавление экспрессии генов o 3.3 Активация экспрессии генов 4 Эволюция 5 Прикладное применение o 5.1 Нокдаун генов o 5.2 Функциональная геномика o 5.3 Медицина o 5.4 Биотехнология Источники Введение Доставка коротких РНК, содержащих шпильки, с помощью вектора на основе лентивирусу и механизм РНК-интерференции в клетках млекопитающих РНК интерференция ( англ. RNA interference, RNAi ) - Система контроля активности генов эукариотических клеток, что осуществляется с помощью коротких (20-25 нуклеотидов) молекул рибонуклеиновой кислоты. Ключевыми молекулами в РНК есть короткие интерферирующие РНК ( англ. small interfering RNA, siRNA ) И микроРНК ( англ. microRNA ), Эти молекулы могут вступать во взаимодействие с комплементарными последовательностями в других молекулах РНК, например в матричных РНК и повышать или подавлять их активность. Одним распространенных и лучше изученных механизмов действия РНК является посттранскрипционная угнетение экспрессии генов путем разрушения или деаденилювання мРНК. РНК интерференция обнаружена в клетках большинства эукариот ( животных, растений, грибов). Она является важным механизмом защиты клетки от паразитирующих генов вирусов и транспозонов, также участвует в регуляции экспрессии собственных генов организма, в частности в процессе эмбриогенеза. Выборочный и мощный характер влияния РНК на экспрессию генов, позволяет использовать это явление как удобный инструмент биологических исследований, как в культурах клеток так и в живых организмах. Использование этого пути также является многообещающим для биотехнологии и медицины, в частности разработки и внедрению. Исторически РНК интерференция была известна под другими названиями, в частности косупресия и посттранскрипционная подавления экспрессии генов. Только после детального исследования этих процессов, которые сначала казались несвязанными, стало понятно, что все они являются примерами РНК интерференции. В 2006 году Эндрю Фаер и Крейг Мело получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за работу посвященную механизмам РНК интерференции в Caenorhabditis elegans [1], которую они опубликовали в 1998 году [2]. 1. История открытия Цветы Petunia hybrida, в клетках которой экспрессия генов, отвечающих за окраску снижена РНК интерференцией. Слева растение дикого типа; растения дело содержащих трансгены, экспрессия которых подавлена, как и экспрессия собственных генов организма, ответственные за окраску венчика [3] Открытию РНК интерференции предшествовало наблюдение угнетение экспрессии генов у растений под влиянием антисенс РНК [4]. Позже ученые в Нидерландах и США получили неожиданные результаты при введении трансгенов в растения петунии. Ричард Йоргенсен и сотрудники пытались модифицировать растения таким образом, чтобы их цветы имели более глубокий цвет. Для этого ученые ввели в клетки дополнительные копии гена фермента халконсинтазы, отвечающий за образование фиолетового пигмента. Однако, как выяснилось, увеличение копийность этого гена не привело к проявлению темного окраса венчика петунии, наоборот - растения образовывали меньше пигмента и цветы становились полностью или частично белыми. Эти результаты свидетельствовали о значительном снижении активности халконсинтазы, причем подавлялась работа как трансгены так и эндогенной копии гена этого фермента. Это явление у растений было названо косупресия [5]. Впоследствии аналогичный явление было открыто и у грибов Neurospora crassa [6]. Сначала аналогии между этими двумя случаями не было проведено, и в случае N.crassa такой эффект назывался другим термином - квелинг ( англ. Quelling ). Дальнейшие исследования показали, что косупресия у растений обусловлена посттраснкрипцийним угнетением экспрессии гена вследствие повышения уровня деградации мРКН [7]. Вскоре похож неожиданный эффект был описан при попытке повысить устойчивость растений к вирусных инфекций. К тому времени было известно, что растения, которые экспрессируют вирусные белки, имеют нечувствительны к инфицированию соответствующим вирусом. Неожиданностью стало то, что для получения такой устойчивости достаточно было ввести в геном растения короткие некодирующие последовательности вирусной РНК. Предполагалось, что вирусная РНК, создавалась в растительных клетках также подавляла репликацию вируса [8]. В обратном эксперименте короткие участки растительных генов вводились в геном вируса. В этом случае наблюдалось угнетение экспрессии соответствующего гена в растительной клетке после ее заражения модифицированным вирусом. Этот феномен получил название "вирусиндуцированное подавление экспрессии генов" ( англ. virus-induced gene silencing, VIGS ), А всю совокупность подобных явлений называли пост-транскрипционного угнетением экспрессии генов ( англ. post transcriptional gene silencing ) [9]. В 1998 году в журнале Nature была опубликована работа Эндрю Фаер и Крейга Мело, в которой они описывали попытку подавления экспрессии генов С.elegans с использованием методики антисенс РКН. Эти ученые показали, что ведение антисен или сенсРНК в клетки нематоды, мало как минимум в 10 раз слабее эффект на экспрессию гена, чем введение смеси антисес и сенсРНК, которые образовывали двухцепную РНК [2]. Таким образом было показано, что причиной возникновения пост-транскрипционного подавления генов является именно наличие в клетке двухцепочечной РНК. Результатом этих работ было создание самого термина РНК интерференция. Фаер и Мело получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2006 году ?за открытие РНК интерференции - подавления экспрессии генов двухцепочечной РНК" [1]. 2. Молекулярные механизмы Белок Дайсер Giardia intestinalis, катализирующий разрезания двухцепной РНК с образованием малых интерферирующих РНК. Домен РНКазы окрашен зеленым, PAZ домен - желтым, домен платформы - красным, а связующее спираль - синим [10] РНК - это РНК -зависимое угнетение экспрессии генов, которое осуществляется благодаря эффекторные белковом РНК-индуцированном сайленсинг комплекса ( англ. RNA-induced silencing complex, RISC ) И инициируется короткими двухцепной РНК (длРНК), которые взаимодействуют с этим комплексом в цитоплазме клетки [1]. Существует два пути РНК: экзогенный и эндогенный. В случае экзогенного пути длРНК происходит из генома вируса или являются результатом лабораторных манипуляций. Такие длРНК в цитоплазме режутся на короткие фрагменты ферментом с активностью РНКазы ИИИ Дайсер ( англ. Dicer ). Эндогенные дволанцюгови РНК образуются в результате экспрессии собственных генов организма, например генов пре-микроРНК. Процессинг первичных транскриптов этих генов предусматривает образование характерных структур стебель-петля в ядре, которые позже транспортируются в цитоплазму и разрезаются ферментом Дайсер, в результате чего образуются микроРНК, которые могут взаимодействовать с RISC комплексом. Таким образом пути экзогенных и эндогенных длРНК сходятся на уровне RISC [11]. 2.1. Малые интерферирующие РНК Малые интерферирующие РНК ( англ. siRNA ) - Это дволанцюгови РНК длиной 21-25 нуклеотидов с двонуклеотиднимы выступлениями на 3'-концах. Каждая цепь имеет фосфатную группу на 5'-и гидроксильную на 3'-конце. Такая структура образуются в результате действия фермента Дайсер на долгие дволанцюгови РНК или РНК, содержащих шпильки [12]. После расщеплением Дайсер дволанцюгови siRNA попадают в каталитический RISC комплекс. В этом комплексе белок аргонавт ( англ. Argonaute ) Расплетает дуплекс РНК, в результате чего у RISC остается только один из двух цепей "направляющий". Направляющий цепь siRNA позволяет эффекторные комплекса найти специфическую мРНК-мишень, поскольку он комплементраний к определенной ее участки. Присоединение комплекса siRNA-RISC к мРНК приводит к деградации последней. В отличие от микроРНК малые интерферирующие РНК, как правило, гибридизуються единственным типом мРНК-мишени очень точно и приводят к ее ендонуклеотичного расщепления [13]. 2.2. МикроРНК Структура стебель-петля - вторичная структура пре-микроРНК с Brassica oleracea. МикроРНК ( англ. microRNA, miRNA ) - Молекулы РНК длиной 21-22 нуклеотиды эндогенного происхождения, участвующих в регуляции експерсии генов, в частности в процессе индивидуального развития организмов [14] [15]. Гены микроРНК транскрибируются с образованием длинных первичных транскриптов pri-miRNA ( англ. primordial miRNA ), Эти РНК процесуються в ядре, в результате чего они превращаются в pre-miRNA - структуры в виде стебель-петля длиной около 70 нуклеотидов. Комплекс процессинга pri-miRNA в pre-miRNA содержит фермент с активностью РНКазы ИИИ, который называют Drosha, и белок связывающий двухцепную РНК - Pasha. После процессинга pre-miRNA транспортируется из ядра в цитоплазму, где она становится субстратом для фермента Дайсер (в Drosophila melanogaster и ' С.elegans siRNA и miRNA процесуються различными изоформами фермента Дайсер [16]). Зрелая молекула микроРНК может связываться с ферментативными RISC комплексом [17]. Известен также путь процессинга микроРНК не зависящий от Дайсер. В этом случае pre-miRNA режется белком аргонавт 2 [18]. Принципиальная разница между siRNA и miRNA заключается в том, что в животных последовательность микроРНК не полностью комплементарная к последовательности мРНК -мишени, таким образом микроРНК могут ингибировать трансляцию с нескольких различных мРНК, содержащие похожие последовательности (у растений как miRNA так и siRNA обычно полностью комплементарные к РНК-мишени). МикроРНК присоединяются к 3'-UTR (3'-конечного участка, не транслируется) мРНК и вызывают удаление поли (А)-хвоста или угнетение трансляции другим путем [13]. 2.3. Эффекторный комплекс RISC "Слева Полноразмерный белок аргонавт из виду архей Pyrococcus furiosus. Справа: PIWI домен белка аргонавта в комплексе с в комплексе с двухцепной РНК. RISC ( англ. RNA-induced silencing complex , РНК-индуцированный сайленсинг комплекс) эффекторный белковый комплекс, обеспечивающий ендонуклеазне расщепление мРНК в процессе РНК интерференции. Каталитической частью RISC является эндонуклеазы семьи Argonaute (аргонавтов), которые расщепляют мРНК комплементарную к siRNA или микроРНК RISC комплекса [1]. Фрагменты, образующиеся в результате действия фермента Дайсер на двухцепную РНК, также двухцепной, и, теоретически, любой из двух цепей может входить в активный RISC комплекс. Однако с белком аргонавты связываются только один из этих цепей, который называется "направляющим" ( англ. guide strand ), И только он участвует в поиске мРНКмишени. Другая цепь - цепь-спутник ( англ. passenger strand, anti-guide strand ) Расщепляется в процессе активации RISC [19]. Ранее считалось, что цепи разделяются АТФ -зависимыми геликазамы [20], сейчас стало известно, что данный процесс является АТФнезависимым и осуществляется непосредственно белками, которые входят в состав RISC [21] [22] . По направляющий обычно выбирается тот цепь, 5'-конец которого менее прочно присоединен к комплементарной цепи, на выбор не влияет направление, в котором разрезает длРНК Дайсер [23] [24]. Более стабильный 5'-конец цепи-спутника может выделяться белком R2D2 [25]. Рентгеноструктурный анализ позволил проанализировать связывания молекул РНК с РНК-связывающим доменом белков аргонавтов. Было установлено, что фосфорилированный 5'-конец одноцепочечной РНК попадает в положительно заряженную карман белка, и через ионы Mg 2 + поступает в стекинг-взаимодействие с консервативными остатком тирозина. Данный участок белка стимулирует связывание интерферирующих РКН с мишенью мРНК [26]. Механизм по которому RISC находит комплементарную мРНК исследован недостаточно. Показано, что для успешной деградации мРНК комплексом siRISC трансляция не является необходимым [27], более того путь РНК интерференции может быть эффективным для мРНК-мишеней, которые не транслируются в настоящее время [28]. Белки арогонавты является каталитической частью RISC, они локализуются в специальных районах цитоплазмы, известных как Р-тельца ( англ. Processing bodies ) [29]. Р-тельца - это участками с высокими уровнями деградации РНК, показано, что именно здесь наблюдается максимальная активность микроРНК. Разрушение Р-телец приводит к значительному снижению эффективности процесса РНК интерференции [30]. 2.4. Подавление транскрипции Кроме того, РНК действует на уровне угнетения трансляции, она также может влиять и на транскрипцию генов. Многие эукариот используют этот путь для поддержания структуры генома. Модификация гистонов позволяет уменьшить экспрессию генов с определенного участка, поскольку этот участок переходит в состояние гетерохроматина. Иногда этот процесс связан с РНК интерференции, тогда его называют RITS ( англ. RNA-induced transcriptional silencing , РНК-индуцированное подавление транскрипции). Изучение явления RITS, в основном, было ограничено исследованием экспрессии участка, отвечающего за тип спаривания в Schizosaccharomyces pombe, но полученные данные могут опровергнуть для геномов других организмов. У дрожжей S.pombe подавления транскрипции обеспечивает RITS комплекс, содержащий белок аргонавт, белок Chp1 с хромодоменом (домен, который находят у белков, связанных с организацией и перестройкой хроматина), и белок с неизвестной функцией Tas3 [31]. Для индукции образования участков гетерохроматина необходим фермент Дайсер, а также белок аргонавт и РНК-зависимая РНК-полимераза [32] [33]. Делеция этих генов в S.pombe нарушает метилирования гистонов и формирование центромер [34], из-за чего деление клетки останавливается или замедляется в анафазе [35]. Для поддержания уже сложившихся участков гетерохроматиу RITS формирует комплекс с siRNA, комплементарными к генам в данной области и стабильно связывается с метильванимы гистонами. Этот комплекс обеспечивает котранcкрипцийну деградацию любых пре-мРНК, синтез которых инициирует РНК-полимераза. Считается, что участки гетерохроматина поддерживаются на основе положительной обратной связи, так как новые siRNA формируются РНК-зависимой РНК-полимеразой из случайных транскриптов и включаются в комплекс RITS [36]. Все описанные данные были получены только для S.pombe, в млекопитающих поддержания участков гетерохроматина может быть РНК-независимым [37]. 2.5. Связь с редактированием РНК Наиболее распространенной формой редактирования РНК в высших эукариот является превращение аденозина в инозин в двухцепочечной РНК, которое осуществляется ферментом аденозиндеаминазою [38]. В 2000 году было предположено, что путь РНК интерференции и путь редактирования РНК A → I могут конкурировать за общий субстрат - двухцепную РНК [39]. Действительно, некоторые pre-miRNA могут подлежать редактированию A → I [40] [41], причем этот механизм может регулировать процессинг и экспрессию зрелых молекул микроРНК [41]. В млекопитающих описан как минимуму один фермент РНК-редактирования, что может вывести молекулы siRNA из системы РНК [42]. Исследование линии C.elegans, что не генов редактирования A → I показали, что редактирование РНК может предотвращать подавлению экспрессии эндогенных генов и трансгенов по пути РНК [43]. 2.6. Различия между организмами Cхематичне изображения основных различий между угнетением экспрессии генов у растений и животных. Эндогенные микроРНК или экзогенные малые интерферирующие РНК режутся ферментом Дайсер и включаются в RISC комплекс, который обеспечивает подавление экспрессии. [44] Организмы отличаются между собой по способности воспринимать чужеродные дволанцюгови РНК и использовать их в процессе РНК-интерференции. В растений и C.elegans (но не в дрозофилы и млекопитающих) эффект РНК-интерференции может быть системным: введение даже небольшого количества длРНК в клетки вызывает угнетение экспрессии соответствующего гена во всем организме, в C.elegans эффект РНК может даже наследоваться. Для системного действия РНК сигнал должен амплификуватись и передаваться между клетками. В амплификации сигнала участвует РНК-зависимая РНКполимераза, считается, что siRNA может выступать праймером для синтеза следующих молекул двухцепочечной РНК, станет субстратом для фермента Дайсер [45]. Транспорт siRNA у растений может происходить по плазмодесмам [20]. Наследование эффектов РНК у растений может быть независимым от самих РНК, а обеспечиваться метилирование промоторов соответствующих генов, изменен характер метилирования передается каждой из дочиринх клеток при разделении [46]. Основные различия в механизме РНК у животных и растений состоит в том, что у растений эндогенные микроРНК идеально комплементарные к мРНК мишени и в комплексе с RISC вызывают деградацию этой РНК. У животных микроРНК не полностью комплементарные к гену-мишени и вызывают пригниччення трансляции [44], например щлях предотвращения взаимодействия факторов инициации трансляции и поле-(А)-хвоста мРНК [47]. В некоторых эукариот, например, паразитических одноклеточных Leishmania major и Trypanosoma cruzi все компоненты РНК отсутствуют [48] [49]. Большая часть компонентов системы РНК интерференции также отсутствует и у некоторых грибов, например в пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae [50]. В других дрожжей, размножаются почкованием, например в Saccharomyces castellii и Candida albicans присутствуют все компоненты РНК интерференции. Перенос двух белков системы РНК с S.castellii в клетки S.cerevisiae делает возможным РНК интерференцию в последних [51]. Тот факт, что некоторые аскомицеты и базидиомицеты не имеют пути РНК интерференции указывает на то, что гены, кодирующие белки необходимы для данного процесса, были потеряны независимо во многих филогенетических ветвях грибов, вероятно, через эволюцию нового пути с похожими функциями, или из-за потери адаптивной преимущества в данных экологических нишах [52]. 2.7. Аналог РНК у прокариот В прокариот экспрессия генов зависит от РНК-зависимой системы, похожей к РНК: РНКкодирующие гены контролируют количество мРНК и трансляцию через образование комплементарных РНК, которые присоединяются к мРНК. Однако, эти регуляторные РНК не считаются гомологичными к микроРНК, поскольку фермент Дайсер не задействован в их образовании [53]. Также предполагается, что система интерференции CRISPR ( англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats , Короткие палиндромный повторы, регулярно размещены группами), которая обеспечивает бактериям защиту от бактериофагов является аналогом эукариотической системы РНК интерференции. Однако ни один из белковых компонентов этих двух систем не является гомологичинмы [54]. 3. Биологические функции 3.1. Иммунитет Система РНК-интерференции - важная часть иммунной ответы на вирусы и другой генетически чужеродный материал, особенно у растений, в которых она также ограничивает распространение транспозонов [55]. Растения (например A.thaliana) имеют несколько гомологов белка Дайсер, которые используются против различных типов вирусов [56]. У растений РНК, возникающее в ответ на заражение вирусом имеет системный характер - т.е. может распространяться по всему телу растения, а также передаваться от подвоя к привоя [57]. Итак РНК является механизмом приобретенного противовирусного иммунитета у растений, локализованного инфицирования вирусом, этот механизм запускает защиту по всему организму растения. В ответ в ходе эволюции многие вирусы развили механизмы подавления РНК-инерференции в клетках растений [58] . Описаны вирусные белки, которые могут связывать короткие дволанцюгови РНК из двонуклеотиднимы выступлениями на концах, являющиеся продуктами фермента Дайсер [59] . Некоторые растения после заражения определенными бактериями начинают экспрессировать эндогенные siRNA бактериями [60]. Такая реакция может быть частью генерализованной ответа организма на патогены, осуществляется путем пригинчення многих метаболических процессов [61]. Хотя в клетках животных, как правило, экспрессируется меньше вариантов белка Дайсер, чем у растений, система РНК может участвовать в антивирусной ответа и в них. РНК играет важную роль в врожденном противовирусного иммунитета, в частности защищает от Х-вируса дрозофилы ювенильные и взрослые особи D.melanogaster [62] [63]. Подобную роль в иммунитете система РНК играет в C.elegans : экспрессия белков аргонавтов повышается при вирусной инфекции, при этом нематоды получают устойчивость к вирусным инфекциям [64] [65]. Роль РНК в врожденном иммунитете млекопитающих не полностью исследована. Однако, тот факт, что некоторые вирусы млекопитающих содержат гены, которые могут подавлять эту систему в клетках живителя, свидетельствует о том, что РНК может быть частью противовирусного иммунитета млекопитающих [66] [67]. Однако эта гипотеза не имеет достаточного основания и требует дальнейших исследований [68]. Вирусы млекопитающих могут использовать РНК интерференцию и в других целях, например малые интерфереруючи РНК, экспрессируются вирусом герпеса, могут вызвать образование гетерохроматина, что приводит к переходу вируса в латентное состояние [69]. 3.2. Подавление экспрессии генов В геноме большинства эукариот есть гены микроРНК, которые могут располагаться или в участках между белок-кодирующих генами или интронов. Эти гены играют важную роль в подавлении экспрессии других генов [44] и в регуляции развития, особенно в определении времени морфогенеза и поддержании недифференцированных или не полностью дифференцированных типов клеток, таких как стволовые клетки [70]. Роль эндогенных микроРНК в подавлении экспрессии генов была впервые описана в C.elegans в 1993 году [71]. У растений такую функцию обнаружили, когда было показано, что "JAW микроРНК" A.thaliana задействована в регуляции нескольких генов, определяющих форму растения [72]. У растений большинство генов, на экспрессию которых влияют микроРНК, это гены транскрипционных факторов [73], таким образом размах активности РНК очень широкий, она регулирует цели сетки генов во время эмбриогенеза и влияет на экспрессию главных регуляторных генов, включая факторы траснкрипции и белки F-box [74]. Во многих организмов, в том числе и у людей, микроРНК также могут быть связаны с формированием опухолей и угнетением клеточного цикла. В этом случае отдельные микроРНК могут действовать и как онкогены, и как супрессоры опухолевого роста [75]. 3.3. Активация экспрессии генов РНК последовательности (siRNA или микроРНК), комплементарные к участкам промотора могут повышать транскрипцию соответствующих генов, этот феномен назвали РНК активацией. В данном механизме активации генов участвуют белки Дайсер и аргонавты [76] [77]. 4. Эволюция Методы вычислительного филогенетического анализа показывают, что ближайший общий предок всех эукариотических организмов имел ранний путь РНК. Отсутствие этого пути в некоторых эукариот является признаком, приобретенной позже в процессе эволюции [78]. Предковая система РНК содержала минимум один Дайсер-образный белок, один аргонавт, один белок PIWI и РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая могла участвовать и в других клеточных процессах. Первичный функцией РНК был иммунную защиту от экзогенных генетических элементов, таких как вирусные геномы и транспозоны [78] [79], другие функции, такие как модификация гистонов также могли присутствовать в предковых форм. Однако участвовать в менее родственных процессах, в частности регуляции эмбриогенеза микроРНК стали позже в процессе эволюции [78]. Гены РНК интерференции, как часть врожденной иммунной системы многих эукариот, постоянно меняются вследствие эволюционной гонки вооружений. Некоторые вирусы "научились" подавлять РНК в клетках живителя, в том числе много вирусов растений [58]. Исследование скорости эволюции в дрозофилы показали, что на гены пути РНК действует сильный движущий отбор. Скорость эволюции этих генов является одной из самых высоких в геноме дрозофилы [80]. 5. Прикладное применение 5.1. Нокдаун генов Путь РНК интерференции часто используется в биологии для изучения функций отдельных генов, как в культурах клеток, так и in vivo [1]. Двухцепная РНК, один из цепей которой комплементарный к исследуемому гену, вводится в клетку или организм, где она распознается как чужеродная и активирует РНК интерференцию. Используя этот механизм ученые могут очень сильно снизить экспрессию гена-мишени. Изучение влияния "выключения" соответствующего гена на организм или клетку дает возможность делать выводы о физиологической роли продукта данного гена. Поскольку РНК может не полностью устраняет экспрессию гена, а только очень существенно ее снижает, такая методика называется "нокдауном" гена, в противовес "нокаута" гена, при котором ген полностью удаляется [81]. Усилия биоинформатики направлены на то, чтобы разработать успешные дволанцюгови РНК, которые будут иметь максимальное влияние на ген-мишень и минимальные побочные эффекты. Побочные эффекты возникают, когда введена в клетку РНК имеет общие нуклеотидные последовательности с несколькими генами и влияет на них все. Исследования геномов H.sapiens, C.elegans и Schizosaccharomyces pombe показали, что около 10% возможных siRNA будут действовать на гены отличные от своей мишени [82]. Разработано большое количество программного обеспечения для подбора последовательностей siRNA [83] [84], в том числе специфических для млекопитающих [85] и вирусов [86]. Эти программы автоматически проверяют возможность перекрестного реагирования с последовательностями других генов. В зависимости от вида организма и экспериментальной системы, экзогенные РНК могут быть либо длинными, в таком случае она должна стать субстратом для расщепления Дайсер, или короткими фрагментами, что уже готовыми молекулами siRNA. Для большинства клеток млекопитающих используют короткие РНК, поскольку долгие дволанцюгови РНК могут запускать интерфероновую ответ - форму врожденного иммунитета, которая специфично реагирует на любой чужеродный генетический материал [87] . В мышиных ооцитов и клеток эмбрионов ранних стадий такая реакция на чужеродное длРНК отсутствует, поэтому эти клетки являются распространенными моделями для изучения эффектов нокдауна генов у млекопитающих [88]. Разрабатываются специальные лабораторные методы, позволяющие улучшить использование РНК у млекопитающих, избегая прямого ввода siRNA. Одним из таких методов является стабильная трансфекция клеток плазмиды, содержащий последовательность, с которой могут считываться siRNA [89] . Сложная процедура, в которой используются лентивирусни векторы, предусматривает возможность индуцированной активации или деактивации транскрипции, и известна под названием условная РНК ( англ. conditional RNAi ) [90] [91]. 5.2. Функциональная геномика Нормальная взрослая муха дрозофила, организм, часто використовуюеться в экспериментах посвященных РНК Взрослая нематода C.elegans выращенная в условиях угнетения РНК интерференции ядерного рецептора гормона, участвующего в регуляции десатуразы. Этот червь имеет нарушенный обмен жирных кислот но жизнеспособен и фертильный. [92] Методы функциональной геномики, использующие РНК, обычно применяют для C.elegans [93] и дрозофилы [94], так как в этих модельных организмов РНК наиболее эффективна. C. elegans особенно удобный объект по двум причинам: во-первых, эффекты подавления экспрессии генов у нее наследуются, во-вторых - доставка длРНК чрезвычайно проста. Хотя механизм этого явления не вполне понятен, при скармливании бактерий, например E.coli, экспрессирующих нужную РНК, нематоде, РНК проходит через пищеварительную систему в клетки C. elegans. Такая "доставка кормлением" столь же эффективна, как и другие, дорогие методы, например погружения нематоды в раствор длРНК или введения последней в гонады [95]. Хотя в других организмов доставка значительно сложнее, прикладывается много усилий по использованию методов РНК в широкомасштабном геномной скрининга в культурах клеток млекопитающих [96]. Подходы к созданию РНК библиотек для целых геномов организмов значительно сложнее, чем создание одной siRNA для конкретного эксперимента. Для создания таких библиотек siRNA и предсказания эффективности их действия используются искусственные нейронные системы [97]. Массовый геномный скрининг считается многообещающим методом толкования геномов, поэтому развиваются высокопроизводительные методы скрининга, основанные на технологии ДНК-микрочипов [98] [99] . Однако, вопросом остается то, можно распространять полученные данные даже на близкие виды, например сведения о C.elegans на паразитические виды нематод [100] [101] Функциональная геномика, использующий РНК, является особенно привлекательной методике для картирования и толкования геномов растений, потому что многие из них полиплоидные, что затрудняет использование стандартных методов генетической инженерии. Например, РНК успешно используется для исследования генома пшеницы мягкой Triticum aestivum (гексаплоиды) [102], а также классических объектов, таких как Arabidopsis и кукуруза [103]. 5.3. Медицина Клеточный путь РНК интерференции потенциально можно использовать для лечения многих заболеваний, в том числе СПИДа, злокачественных новообразований и нейродегенративних расстройств. Хотя введение длинных длРНК в клетки млекопитающих проблематично через интерфероновую ответ, короткие РНК, копирующие действие siRNA дают желаемый эффект [104]. Были проведены первые клинические исследования метода РНК для лечения дегенерации желтого пятна сетчатки и заражение респираторным синцитиальный вирусом [105]. Также эта методика успешно использовалась для терапии повреждения печени у лабораторных мышей [106]. Потенциально РНК может использоваться в антивирусной терапии для лечения инфекции вирусом герпеса 2-го типа, угнетение экспрессии вирусных генов в опухолевых клетках [107] , нокдауна рецепторов и корецепторов к ВИЧ [108], для супрессии генов вирусов гепатита А [109] и В [110], вируса гриппа [69], ингибирования репликации вируса кору [111]. Также методики, основанные на РНК, являются многообещающими для терапии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Хантингтона [112]. Исследуется возможность использования РНК для лечения рака путем угнетения экспрессии генов, активность которых селективно увеличена в опухолевых клетках, и генов задействованных в регуляции клеточного цикла [113] [114]. Ключевым вопросом в исследованиях медицинского использования РНК является разработка безопасных методов доставки длРНК. Сейчас для этого используется много вирусных векторов, похожих на те, что предложены к использованию в генной терапии [115] [116]. Разрабатываются также методики основаны на РНК для лечения персистентной инфекции ВИЧ первого типа. Вирусы похожи на ВИЧ-1 особенно проблематичны в терапии, поскольку требуют комбинации нескольких путей РНК [117]. Несмотря на стремительный рост количества исследований, в которых лекарства на основе РНК интерференции успешно используются в культурах клеток, возникают также и вопрос о безопасности использования таких методов лечения, особенно учитывая возможность побочных эффектов - супрессию генов, имеющих сходные последовательности к гену-мишени [ 118]. С помощью методов вычислительной геномики было установлено, что вероятность такого неспецифического действия составляет около 10% [82]. Масштабное исследование заболеваний печени мышей показало высокий уровень смертности среди подопытных животных при лечении РНК. Ученые объясняют такие результаты "перенасыщением" пути длРНК [119], так как используются РНК с шипами, что процесуються в ядре и должны переноситься в цитоплазму по механизму активного транспорта. Все эти аспекты сейчас активно исследуются, чтобы установить насколько безопасным является использование данной методики в терапии. Итак РНК интерференция является многообещающим инструментом в лечении многих заболеваний, однако очень важно проводить тщательные пре-клинические исследования и оценку вероятности неспецифических взаимодействий. 5.4. Биотехнология РНК интерференция используется в биотехнологии, в частности для создания съедобных растений с меньшим содержанием природных токсинов. Например, семян хлопка содержит много питательного белка, но в его состав входит и токсический терпеноиды госсипол, через что эти семена не пригодно для потребления. Использование РНК позволило создать сорта хлопка с уменьшенной активностью фермента, синтезирующего госсипол, в семенах, но не в других частях растения, где это вещество необходимо для защиты растения от вредителей [120]. Были осуществлены похожие попытки сократить количество цианогенный гликозид линамарину в растениях маниоки (Manihot utilissima) [121] . Хотя ни один из сортов растений, созданных с помощью техники основанной на РНК, не прошли пока экспериментальной стадии, эти методы продолжают стремительно развиваться: разработаны сорта помидоров с пониженным содержанием аллергенов [122], табак с пониженным содержанием предшественников канцерогенных веществ [123]. Методики РНК также использовались для создания мака Papaver somniferum, содержащий меньше опийных алкалоидов [124], повышения устойчивости растений к вирусным инфекциям [125], повышение содержания антикосидантив в томатах [126]. Первые трансгенные растения - помидоры Flavr Sarv и папайя устойчива к вирусам - были созданы с использованием методики антисенсРНК, которая, скорее всего, действует по пути РНК интерференции [127] [128]. Источники 1. ↑ а б в г д Daneholt, Bertil. "Advanced Information: RNA interference". The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 . http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/adv.html . Проверено 200701-25 . 2. ↑ а б Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans / / Nature. - 391. - (1998) (6669) 806-11. DOI : 10.1038/35888. PMID 9486653 . 3. Matzke MA, Matzke AJM. Planting the Seeds of a New Paradigm. / / PLoS Biol. - 2. (2004) (5) e133. DOI : 10.1371/journal.pbio.0020133. PMID 15138502 . 4. Ecker JR, Davis RW Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA / / Proc Natl Acad Sci USA. - 83. - (1986) (15) 5372-5376. DOI : 10.1073/pnas.83.15.5372. PMID 16593734 . 5. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans / / Plant Cell. - 2. - (1990) (4) 279-289. DOI : 10.1105/tpc.2.4.279. PMID 12354959 . 6. Romano N, Macino G Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences / / Mol Microbiol. - 6. - (1992) (22) 3343-53. DOI : 10.1111/j.1365-2958.1992.tb02202.x. PMID 1484489 . 7. Van Blokland R, Van der Geest N, Mol JNM, Kooter JM Transgene-mediated suppression of chalcone synthase expression in Petunia hybrida results from an increase in RNA turnover / / Plant J. - 6. - (1994) 861-77. DOI : 10.1046/j.1365-313X.1994.6060861.x/abs /. 8. Covey S, Al-Kaff N, L?ngara A, Turner D Plants combat infection by gene silencing / / Nature. - 385. - (1997) (6619) 781-2. DOI : 10.1038/385781a0. 9. Ratcliff F, Harrison B, Baulcombe D A Similarity Between Viral Defense and Gene Silencing in Plants / / Science. - 276. - (1997) (5318) 1558-60. DOI : 10.1126/science.276.5318.1558. PMID 18610513 . 10. Macrae I, Zhou K, Li F, Repic A, Brooks A, Cande W, Adams P, Doudna J Structural basis for double-stranded RNA processing by dicer / / Science. - 311. - (2006) (5758) 195-8. DOI : 10.1126/science.1121638. PMID 16410517 . 11. Bagasra O, Prilliman KR RNA Interference: the molecular immune system / / J. Mol. Histol .. - 35. - (2004) (6) 545-53. DOI : 10.1007/s10735-004-2192-8. PMID 15614608 . 12. Bernstein E, Caudy A, Hammond S, Hannon G Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference / / Nature. - 409. - (2001) (6818) 363-6. DOI : 10.1038/35053110. PMID 11201747 . 13. ↑ а б Pillai RS, Bhattacharyya SN, Filipowicz W Repression of protein synthesis by miRNAs: how many mechanisms? / / Trends Cell Biol. - 17. - (2007) (3) 118-26. DOI : 10.1016/j.tcb.2006.12.007. PMID 17197185 . 14. Wang QL, Li ZH The functions of microRNAs in plants / / Front. Biosci .. - 12. - (2007) 3975-82. PMID 17485351 . 15. Zhao Y, Srivastava D A developmental view of microRNA function / / Trends Biochem. Sci .. - 32. - (2007) (4) 189-97. DOI : 10.1016/j.tibs.2007.02.006. PMID 17350266 . 16. Lee Y, Nakahara K, Pham J, Kim K, He Z, Sontheimer E, Carthew R Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA / miRNA silencing pathways / / Cell. - 117. - (2004) (1) 69-81. DOI : 10.1016/S0092-8674 (04) 00261-2. PMID 15066283 . 17. Gregory R, Chendrimada T, Shiekhattar R MicroRNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex / / Methods Mol Biol. - 342. - (2006) 3347. DOI : 10.1385/1-59745-123-1: 33. PMID 16957365 . 18. Cheloufi S, Dos Santos CO, Chong MM, Hannon GJ A dicer-independent miRNA biogenesis pathway that requires Ago catalysis / / Nature. - 2010. - В. doi: 10.1038/nature09092. - С. Published Online April 27, 2010. 19. Gregory R, Chendrimada T, Cooch N, Shiekhattar R Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing / / Cell. - 123. - (2005) (4) 631-40. DOI : 10.1016/j.cell.2005.10.022. PMID 16271387 . 20. ↑ а б Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipurksy SL, Darnell J Molecular Cell Biology 5th. - WH Freeman: New York, NY, 2004. ISBN 9780716743668. 21. Matranga C, Tomari Y, Shin C, Bartel D, Zamore P Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes / / Cell. - 123. (2005) (4) 607-20. DOI : 10.1016/j.cell.2005.08.044. PMID 16271386 . 22. Leuschner P, Ameres S, Kueng S, Martinez J Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells / / EMBO Rep. - 7. - (2006) (3) 314-20. DOI : 10.1038/sj.embor.7400637. PMID 16439995 . 23. Schwarz DS, Hutv?gner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex / / Cell. - 115. - (2003) (2) 199-208. DOI : 10.1016/S0092-8674 (03) 00759-1. PMID 14567917 . 24. Preall J, He Z, Gorra J, Sontheimer E Short interfering RNA strand selection is independent of dsRNA processing polarity during RNAi in Drosophila / / Curr Biol. - 16. - (2006) (5) 530-5. DOI : 10.1016/j.cub.2006.01.061. PMID 16527750 . 25. Tomari Y, Matranga C, Haley B, Martinez N, Zamore P A protein sensor for siRNA asymmetry / / Science. - 306. - (2004) (5700) 1377-80. DOI : 10.1126/science.1102755. PMID 15550672 . 26. Ma J, Yuan Y, Meister G, Pei Y, Tuschl T, Patel D Structural basis for 5-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein / / Nature. - 434. - (2005) (7033) 666-70. DOI : 10.1038/nature03514. PMID 15800629 . 27. Sen G, Wehrman T, Blau H mRNA translation is not a prerequisite for small interfering RNA-mediated mRNA cleavage / / Differentiation. - 73. - (2005) (6) 287-93. DOI : 10.1111/j.1432-0436.2005.00029.x. PMID 16138829 . 28. Gu S, Rossi J Uncoupling of RNAi from active translation in mammalian cells / / RNA. 11. - (2005) (1) 38-44. DOI : 10.1261/rna.7158605. PMID 15574516 . 29. Sen G, Blau H Argonaute 2/RISC resides in sites of mammalian mRNA decay known as cytoplasmic bodies / / Nat Cell Biol. - 7. - (2005) (6) 633-6. DOI : 10.1038/ncb1265. PMID 15908945 . 30. Jakymiw A, Lian S, Eystathioy T, Li S, Satoh M, Hamel J, Fritzler M, Chan E Disruption of P bodies impairs mammalian RNA interference / / Nat Cell Biol. - 7. - (2005) (12) 1267-74. DOI : 10.1038/ncb1334. PMID 16284622 . 31. Verdel A, Jia S, Gerber S, Sugiyama T, Gygi S, Grewal S, Moazed D RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex / / Science. - 303. - (2004) (5658) 672-6. DOI : 10.1126/science.1093686. PMID 14704433 . 32. Irvine D, Zaratiegui M, Tolia N, Goto D, Chitwood D, Vaughn M, Joshua-Tor L, Martienssen R Argonaute slicing is required for heterochromatic silencing and spreading / / Science. - 313. - (2006) (5790) 1134-7. DOI : 10.1126/science.1128813. PMID 16931764 . 33. Noma K, Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Zofall M, Jia S, Moazed D, Grewal S RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing / / Nat Genet. - 36. - (2004) (11) 1174-80. DOI : 10.1038/ng1452. PMID 15475954 . 34. Volpe T, Kidner C, Hall I, Teng G, Grewal S, Martienssen R Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi / / Science. 297. - (2002) (5588) 1833-7. DOI : 10.1126/science.1074973. PMID 12193640 . 35. Volpe T, Schramke V, Hamilton G, White S, Teng G, Martienssen R, Allshire R RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast / / Chromosome Res. - 11. - (2003) (2) 137-46. DOI : 10.1023 / A: 1022815931524. PMID 12733640 . 36. Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Moazed D, Grewal S RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production / / Proc Natl Acad Sci USA. - 102. - (2005) (1) 152-7. DOI : 10.1073/pnas.0407641102. PMID 15615848 . 37. Wang F, Koyama N, Nishida H, Haraguchi T, Reith W, Tsukamoto T The assembly and maintenance of heterochromatin initiated by transgene repeats are independent of the RNA interference pathway in mammalian cells / / Mol Cell Biol. - 26. - (2006) (11) 4028-40. DOI : 10.1128/MCB.02189-05. PMID 16705157 . 38. Bass B RNA editing by adenosine deaminases that act on RNA / / Annu Rev Biochem. 71. - (2002) 817-46. DOI : 10.1146/annurev.biochem.71.110601.135501. PMID 12045112 . 39. Bass B Double-stranded RNA as a template for gene silencing / / Cell. - 101. - (2000) (3) 235-8. DOI : 10.1016/S0092-8674 (02) 71133-1. PMID 10847677 . 40. Luciano D, Mirsky H, Vendetti N, Maas S RNA editing of a miRNA precursor / / RNA. 10. - (2004) (8) 1174-7. DOI : 10.1261/rna.7350304. PMID 15272117 . 41. ↑ а б Yang W, Chendrimada T, Wang Q, Higuchi M, Seeburg P, Shiekhattar R, Nishikura K Modulation of microRNA processing and expression through RNA editing by ADAR deaminases / / Nat Struct Mol Biol. - 13. - (2006) (1) 13-21. DOI : 10.1038/nsmb1041. PMID 16369484 . 42. Yang W, Wang Q, Howell K, Lee J, Cho D, Murray J, Nishikura K ADAR1 RNA deaminase limits short interfering RNA efficacy in mammalian cells / / J Biol Chem. 280. - (2005) (5) 3946-53. DOI : 10.1074/jbc.M407876200. PMID 15556947 . 43. Nishikura K Editor meets silencer: crosstalk between RNA editing and RNA interference / / Nat Rev Mol Cell Biol. - 7. - (2006) (12) 919-31. DOI : 10.1038/nrm2061. PMID 17139332 . 44. ↑ а б в Saumet A, Lecellier CH Anti-viral RNA silencing: do we look like plants? / / Retrovirology. - 3. - (2006) (3) 3. DOI : 10.1186/1742-4690-3-3. PMID 16409629 . 45. Hannon GL RNA interference / / Nature. - 418. - (2002) 244-51. PMID 12110901 . 46. Jones L, Ratcliff F, Baulcombe DC RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance / / Current Biology. - 11. - (2001) (10) 747-757. DOI : 10.1016/S0960-9822 (01) 00226-3. PMID 11378384 . 47. Humphreys DT, Westman BJ, Martin DI, Preiss T MicroRNAs control translation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly (A) tail function. / / Proc Natl Acad Sci USA. - 102. - (2005) (47) 16961-16966. DOI : 10.1073/pnas.0506482102. PMID 16287976 . 48. DaRocha W, Otsu K, Teixeira S, Donelson J Tests of cytoplasmic RNA interference (RNAi) and construction of a tetracycline-inducible T7 promoter system in Trypanosoma cruzi / / Mol Biochem Parasitol. - 133. - (2004) (2) 175-86. DOI : 10.1016/j.molbiopara.2003.10.005. PMID 14698430 . 49. Robinson K, Beverley S Improvements in transfection efficiency and tests of RNA interference (RNAi) approaches in the protozoan parasite Leishmania / / Mol Biochem Parasitol. - 128. - (2003) (2) 217-28. DOI : 10.1016/S0166-6851 (03) 00079-3. PMID 12742588 . 50. L. Aravind, Hidemi Watanabe, David J. Lipman, and Eugene V. Koonin Lineage-specific loss and divergence of functionally linked genes in eukaryotes / / Proceedings of the National Academy of Sciences. - 97. - (2000) (21) 11319-11324. DOI : 10.1073/pnas.200346997. PMID 11016957 . 51. Drinnenberg IA, Weinberg DE, Xie KT, Nower JP, Wolfe KH, Fink GR, Bartel DP RNAi in Budding Yeast / / Science. - 326. - (2009) (5952) 544-50. DOI : 10.1126/science.1176945. PMID 19745116 . 52. Nakayashiki H, Kadotani N, Mayama S Evolution and diversification of RNA silencing proteins in fungi / / J Mol Evol. - 63. - (2006) (1) 127-35. DOI : 10.1007/s00239-0050257-2. PMID 16786437 . 53. Morita T, Mochizuki Y, Aiba H Translational repression is sufficient for gene silencing by bacterial small noncoding RNAs in the absence of mRNA destruction / / Proc Natl Acad Sci USA. - 103. - (2006) (13) 4858-63. DOI : 10.1073/pnas.0509638103. PMID 16549791 . 54. Makarova K, Grishin N, Shabalina S, Wolf Y, Koonin E A putative RNA-interferencebased immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action / / Biol Direct. - 1. - (2006) 7. DOI : 10.1186/1745-6150-1-7. PMID 16545108 . 55. Stram Y, Kuzntzova L Inhibition of viruses by RNA interference / / Virus Genes. - 32. (2006) (3) 299-306. DOI : 10.1007/s11262-005-6914-0. PMID 16732482 . 56. Blevins T, Rajeswaran R, Shivaprasad P, Beknazariants D, Si-Ammour A, Park H, Vazquez F, Robertson D, Meins F, Hohn T, Pooggin M Four plant Dicers mediate viral small RNA biogenesis and DNA virus induced silencing / / Nucleic Acids Res. - 34. (2006) (21) 6233-46. DOI : 10.1093/nar/gkl886. PMID 17090584 . 57. Palauqui J, Elmayan T, Pollien J, Vaucheret H Systemic acquired silencing: transgenespecific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions / / EMBO J. - 16. - (1997) (15) 4738-45. DOI : 10.1093/emboj/16.15.4738. PMID 9303318 . 58. ↑ а б Lucy A, Guo H, Li W, Ding S Suppression of post-transcriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus / / EMBO J. - 19. - (2000) (7) 1672-80. DOI : 10.1093/emboj/19.7.1672. PMID 10747034 . 59. M?rai Z, Ker?nyi Z, Kert?sz S, Magna M, Lakatos L, Silhavy D Double-stranded RNA binding may be a general plant RNA viral strategy to suppress RNA silencing / / J Virol. - 80. - (2006) (12) 5747-56. DOI : 10.1128/JVI.01963-05. PMID 16731914 . 60. Katiyar-Agarwal S, Morgan R, Dahlbeck D, Borsani O, Villegas A, Zhu J, Staskawicz B, Jin H A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity / / Proc Natl Acad Sci USA. - 103. - (2006) (47) 18002-7. DOI : 10.1073/pnas.0608258103. PMID 17071740 . 61. Fritz J, Girardin S, Philpott D Innate immune defense through RNA interference / / Sci STKE. - 2006. - (2006) (339) pe27. DOI : 10.1126/stke.3392006pe27. PMID 16772641 . 62. Zambon R, Vakharia V, Wu L RNAi is an antiviral immune response against a dsRNA virus in Drosophila melanogaster / / Cell Microbiol. - 8. - (2006) (5) 880-9. DOI : 10.1111/j.1462-5822.2006.00688.x. PMID 16611236 . 63. Wang X, Aliyari R, Li W, Li H, Kim K, Carthew R, Atkinson P, Ding S RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila / / Science. - 312. - (2006) (5772) 452-4. DOI : 10.1126/science.1125694. PMID 16556799 . 64. Lu R, Maduro M, Li F, Li H, Broitman-Maduro G, Li W, Ding S Animal virus replication and RNAi-mediated antiviral silencing in Caenorhabditis elegans / / Nature. - 436. (2005) (7053) 1040-3. DOI : 10.1038/nature03870. PMID 16107851 . 65. Wilkins C, Dishongh R, Moore S, Whitt M, Chow M, Machaca K RNA interference is an antiviral defence mechanism in Caenorhabditis elegans / / Nature. - 436. - (2005) (7053) 1044-7. DOI : 10.1038/nature03957. PMID 16107852 . 66. Berkhout B, Haasnoot J The interplay between virus infection and the cellular RNA interference machinery / / FEBS Lett. - 580. - (2006) (12) 2896-902. DOI : 10.1016/j.febslet.2006.02.070. PMID 16563388 . 67. Sch?tz S, Sarnow P Interaction of viruses with the mammalian RNA interference pathway / / Virology. - 344. - (2006) (1) 151-7. DOI : 10.1016/j.virol.2005.09.034. PMID 16364746 . 68. Cullen B Is RNA interference involved in intrinsic antiviral immunity in mammals? / / Nat Immunol. - 7. - (2006) (6) 563-7. DOI : 10.1038/ni1352. PMID 16715068 . 69. ↑ а б Li H, Ding S Antiviral silencing in animals / / FEBS Lett. - 579. - (2005) (26) 596573. DOI : 10.1016/j.febslet.2005.08.034. PMID 16154568 . 70. Carrington J, Ambros V Role of microRNAs in plant and animal development / / Science. - 301. - (2003) (5631) 336-8. DOI : 10.1126/science.1085242. PMID 12869753 . 71. Lee R, Feinbaum R, Ambros V The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 / / Cell. - 75. - (1993) (5) 843-54. DOI : 10.1016/0092-8674 (93) 90529-Y. PMID 8252621 . 72. Palatnik J, Allen E, Wu X, Schommer C, Schwab R, Carrington J, Weigel D Control of leaf morphogenesis by microRNAs / / Nature. - 425. - (2003) (6955) 257-63. DOI : 10.1038/nature01958. PMID 12931144 . 73. Zhang B, Pan X, Cobb G, Anderson T Plant microRNA: a small regulatory molecule with big impact / / Dev Biol. - 289. - (2006) (1) 3-16. DOI : 10.1016/j.ydbio.2005.10.036. PMID 16325172 . 74. Jones-Rhoades M, Bartel D, Bartel B MicroRNAS and their regulatory roles in plants / / Annu Rev Plant Biol. - 57. - (2006) 19-53. DOI : 10.1146/annurev.arplant.57.032905.105218. PMID 16669754 . 75. Zhang B, Pan X, Cobb G, Anderson T microRNAs as oncogenes and tumor suppressors / / Dev Biol. - 302. - (2007) (1) 1-12. DOI : 10.1016/j.ydbio.2006.08.028. PMID 16989803 . 76. Check E RNA interference: hitting the on switch / / Nature. - 448. - (2007) (7156) 855858. DOI : 10.1038/448855a. PMID 17713502 . 77. Li LC, Okino ST, Zhao H, et al. 'Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 103. - (2006) (46) 17337-42. DOI : 10.1073/pnas.0607015103. PMID 17085592 . 78. ↑ а б в Cerutti H, Casas-Mollano J On the origin and functions of RNA-mediated silencing: from protists to man / / Curr Genet. - 50. - (2006) (2) 81-99. DOI : 10.1007/s00294-006-0078-x. PMID 16691418 . 79. Buchon N, Vaury C RNAi: a defensive RNA-silencing against viruses and transposable elements / / Heredity. - 96. - (2006) (2) 195-202. DOI : 10.1038/sj.hdy.6800789. PMID 16369574 . 80. Obbard D, Jiggins F, Halligan D, Little T Natural selection drives extremely rapid evolution in antiviral RNAi genes / / Curr Biol. - 16. - (2006) (6) 580-5. DOI : 10.1016/j.cub.2006.01.065. PMID 16546082 . 81. Voorhoeve PM, Agami R Knockdown stands Up / / Trends Biotechnol .. - 21. - (2003) (1) 2-4. DOI : 10.1016/S0167-7799 (02) 00002-1. PMID 12480342 . 82. ↑ а б Qiu S, Adema C, Lane T A computational study of off-target effects of RNA interference / / Nucleic Acids Res. - 33. - (2005) (6) 1834-47. DOI : 10.1093/nar/gki324. PMID 15800213 . 83. Naito Y, Yamada T, Matsumiya T, Ui-Tei K, Saigo K, Morishita S dsCheck: highly sensitive off-target search software for double-stranded RNA-mediated RNA interference / / Nucleic Acids Res. - 33. - (2005) (Web Server issue) W589-91. DOI : 10.1093/nar/gki419. PMID 15980542 . 84. Henschel A, Buchholz F, Habermann B DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs / / Nucleic Acids Res. - 32. - (2004) (Web Server issue) W11320. DOI : 10.1093/nar/gkh408. PMID 15215362 . 85. Naito Y, Yamada T, Ui-Tei K, Morishita S, Saigo K siDirect: highly effective, targetspecific siRNA design software for mammalian RNA interference / / Nucleic Acids Res. - 32. - (2004) (Web Server issue) W124-9. DOI : 10.1093/nar/gkh442. PMID 15215364 . 86. Naito Y, Ui-Tei K, Nishikawa T, Takebe Y, Saigo K siVirus: web-based antiviral siRNA design software for highly divergent viral sequences / / Nucleic Acids Res. - 34. - (2006) (Web Server issue) W448-50. DOI : 10.1093/nar/gkl214. PMID 16845046 . 87. Reynolds A, Anderson E, Vermeulen A, Fedorov Y, Robinson K, Leake D, Karpilow J, Marshall W, Khvorova A Induction of the interferon response by siRNA is cell type-and duplex length-dependent / / RNA. - 12. - (2006) (6) 988-93. DOI : 10.1261/rna.2340906. PMID 16611941 . 88. Stein P, Zeng F, Pan H, Schultz R Absence of non-specific effects of RNA interference triggered by long double-stranded RNA in mouse oocytes / / Dev Biol. - 286. - (2005) (2) 464-71. DOI : 10.1016/j.ydbio.2005.08.015. PMID 16154556 . 89. Brummelkamp T, Bernards R, Agami R A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells / / Science. - 296. - (2002) (5567) 550-3. DOI : 10.1126/science.1068999. PMID 11910072 . 90. Tiscornia G, Tergaonkar V, Galimi F, Verma I CRE recombinase-inducible RNA interference mediated by lentiviral vectors / / Proc Natl Acad Sci USA. - 101. - (2004) (19) 7347-51. DOI : 10.1073/pnas.0402107101. PMID 15123829 . 91. Ventura A, Meissner A, Dillon C, McManus M, Sharp P, Van Parijs L, Jaenisch R, Jacks T Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes / / Proc Natl Acad Sci USA. - 101. - (2004) (28) 10380-5. DOI : 10.1073/pnas.0403954101. PMID 15240889 . 92. Brock T, Browse J, Watts J Genetic Regulation Of unsaturated fatty Acid Composition In C. elegans / / PLoS Genet. - 2. - (2006) (7) e108. DOI : 10.1371/journal.pgen.0020108. PMID 16839188 . 93. Kamath R, Ahringer J Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans / / Methods. - 30. - (2003) (4) 313-21. DOI : 10.1016/S1046-2023 (03) 00050-1. PMID 12828945 . 94. Boutros M, Kiger A, Armknecht S, Kerr K, Hild M, Koch B, Haas S, Paro R, Perrimon N Genome-wide RNAi analysis of growth and viability in Drosophila cells / / Science. 303. - (2004) (5659) 832-5. DOI : 10.1126/science.1091266. PMID 14764878 . 95. Fortunato A, Fraser A Uncover genetic interactions in Caenorhabditis elegans by RNA interference / / Biosci Rep. - 25. - (2005) (5-6) 299-307. DOI : 10.1007/s10540-0052892-7. PMID 16307378 . 96. Cullen L, Arndt G Genome-wide screening for gene function using RNAi in mammalian cells / / Immunol Cell Biol. - 83. - (2005) (3) 217-23. DOI : 10.1111/j.14401711.2005.01332.x. PMID 15877598 . 97. Huesken D, Lange J, Mickanin C, Weiler J, Asselbergs F, Warner J, Meloon B, Engel S, Rosenberg A, Cohen D, Labow M, Reinhardt M, Natt F, Hall J Design of a genome-wide siRNA library using an artificial neural network / / Nat Biotechnol. - 23. - (2005) (8) 9951001. DOI : 10.1038/nbt1118. PMID 16025102 . 98. Janitz M, Vanhecke D, Lehrach H High-throughput RNA interference in functional genomics / / Handb Exp Pharmacol. - 173. - (2006) (173) 97-104. DOI : 10.1007/3-54027262-3_5. PMID 16594612 . 99. Vanhecke D, Janitz M Functional genomics using high-throughput RNA interference / / Drug Discov Today. - 10. - (2005) (3) 205-12. DOI : 10.1016/S1359-6446 (04) 03352-5. PMID 15708535 . 100. Geldhof P, Murray L, Couthier A, Gilleard J, McLauchlan G, Knox D, Britton C Testing the efficacy of RNA interference in Haemonchus contortus / / Int J Parasitol. 36. - (2006) (7) 801-10. DOI : 10.1016/j.ijpara.2005.12.004. PMID 16469321 . 101. Geldhof P, Visser A, Clark D, Saunders G, Britton C, Gilleard J, Berriman M, Knox D. RNA interference in parasitic helminths: current situation, potential pitfalls and future prospects / / Parasitology. - 134. - (2007) (Pt 5) 1-11. DOI : 10.1017/S0031182006002071. PMID 17201997 . 102. Travella S, Klimm T, Keller B RNA interference-based gene silencing as an efficient tool for functional genomics in hexaploid bread wheat / / Plant Physiol. - 142. (2006) (1) 6-20. DOI : 10.1104/pp.106.084517. PMID 16861570 . 103. McGinnis K, Chandler V, Cone K, Kaeppler H, Kaeppler S, Kerschen A, Pikaard C, Richards E, Sidorenko L, Smith T, Springer N, Wulan T Transgene-induced RNA interference as a tool for plant functional genomics / / Methods Enzymol. - 392. - (2005) 1-24. DOI : 10.1016/S0076-6879 (04) 92001-0. PMID 15644172 . 104. Paddison P, Caudy A, Hannon G Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells / / Proc Natl Acad Sci USA. - 99. - (2002) (3) 1443-8. DOI : 10.1073/pnas.032652399. PMID 11818553 . 105. Sah D Therapeutic potential of RNA interference for neurological disorders / / Life Sci. - 79. - (2006) (19) 1773-80. DOI : 10.1016/j.lfs.2006.06.011. PMID 16815477 . 106. Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann H, Zender S, Mundt B, Waltemathe M, Gosling T, Flemming P, Malek N, Trautwein C, Manns M, Kuhnel F, Kubicka S Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice / / Proc Natl Acad Sci USA. 100. - (2003) (13) 7797-802. DOI : 10.1073/pnas.1330920100. PMID 12810955 . 107. Jiang M, Milner J Selective silencing of viral gene expression in HPV-positive human cervical carcinoma cells treated with siRNA, a primer of RNA interference / / Oncogene. - 21. - (2002) (39) 6041-8. DOI : 10.1038/sj.onc.1205878. PMID 12203116 . 108. Crowe S Suppression Of chemokine Receptor Expression By RNA Interference allows For inhibition Of HIV-1 replication, by Mart?nez et al. / / AIDS. - 17 Suppl 4. (2003) S103-5. PMID 15080188 . 109. Kusov Y, Kanda T, Palmenberg A, Sgro J, Gauss-M?ller V Silencing of hepatitis A virus infection by small interfering RNAs / / J Virol. - 80. - (2006) (11) 5599-610. DOI : 10.1128/JVI.01773-05. PMID 16699041 . 110. Jia F, Zhang Y, Liu C A retrovirus-based system to stably silence hepatitis B virus genes by RNA interference / / Biotechnol Lett. - 28. - (2006) (20) 1679-85. DOI : 10.1007/s10529-006-9138-z. PMID 16900331 . 111. Hu L, Wang Z, Hu C, Liu X, Yao L, Li W, Qi Y Inhibition of Measles virus multiplication in cell culture by RNA interference / / Acta Virol. - 49. - (2005) (4) 22734. PMID 16402679 . 112. Raoul C, Barker S, Aebischer P Viral-based modelling and correction of neurodegenerative diseases by RNA interference / / Gene Ther. - 13. - (2006) (6) 487-95. DOI : 10.1038/sj.gt.3302690. PMID 16319945 . 113. Putral L, Gu W, McMillan N RNA interference for the treatment of cancer / / Drug News Perspect. - 19. - (2006) (6) 317-24. DOI : 10.1358/dnp.2006.19.6.985937. PMID 16971967 . 114. Izquierdo M Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy / / Cancer Gene Ther. - 12. - (2005) (3) 217-27. DOI : 10.1038/sj.cgt.7700791. PMID 15550938 . 115. Li C, Parker A, Menocal E, Xiang S, Borodyansky L, Fruehauf J Delivery of RNA interference / / Cell Cycle. - 5. - (2006) (18) 2103-9. DOI : 10.4161/cc.5.18.3192. PMID 16940756 . 116. Takeshita F, Ochiya T Therapeutic potential of RNA interference against cancer / / Cancer Sci. - 97. - (2006) (8) 689-96. DOI : 10.1111/j.1349-7006.2006.00234.x. PMID 16863503 . 117. Berkhout, B; ter Brake, O "RNAi Gene Therapy to Control HIV-1 Infection", RNA Interference and Viruses: Current Innovations and Future Trends. - Caister Academic Press, 2010. ISBN 978-1-904455-56-1. 118. Tong A, Zhang Y, Nemunaitis J Small interfering RNA for experimental cancer therapy / / Curr Opin Mol Ther. - 7. - (2005) (2) 114-24. PMID 15844618 . 119. Grimm D, Streetz K, Jopling C, Storm T, Pandey K, Davis C, Marion P, Salazar F, Kay M Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA / short hairpin RNA pathways / / Nature. - 441. - (2006) (7092) 537-41. DOI : 10.1038/nature04791. PMID 16724069 . 120. Sunilkumar G, Campbell L, Puckhaber L, Stipanovic R, Rathore K Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction of toxic gossypol / / Proc Natl Acad Sci USA. - 103. - (2006) (48) 18054-9. DOI : 10.1073/pnas.0605389103. PMID 17110445 . 121. Siritunga D, Sayre R Generation of cyanogen-free transgenic cassava / / Planta. 217. - (2003) (3) 367-73. DOI : 10.1007/s00425-003-1005-8. PMID 14520563 . 122. Le L, Lorenz Y, Scheurer S, F?tisch K, Enrique E, Bartra J, Biemelt S, Vieths S, Sonnewald U Design of tomato fruits with reduced allergenicity by dsRNAi-mediated inhibition of ns-LTP (Lyc e 3) expression / / Plant Biotechnol J. - 4. - (2006) (2) 231-42. DOI : 10.1111/j.1467-7652.2005.00175.x. PMID 17177799 . 123. Gavilano L, Coleman N, Burnley L, Bowman M, Kalengamaliro N, Hayes A, Bush L, Siminszky B Genetic engineering of Nicotiana tabacum for reduced nornicotine content / / J Agric Food Chem. - 54. - (2006) (24) 9071-8. DOI : 10.1021/jf0610458. PMID 17117792 . 124. Allen R, Millgate A, Chitty J, Thisleton J, Miller J, Fist A, Gerlach W, Larkin P RNAi-mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy / / Nat Biotechnol. - 22. - (2004) (12) 1559-66. DOI : 10.1038/nbt1033. PMID 15543134 . 125. Zadeh A, Foster G Transgenic resistance to tobacco ringspot virus / / Acta Virol. 48. - (2004) (3) 145-52. PMID 15595207 . 126. Niggeweg R, Michael A, Martin C Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid / / Nat Biotechnol. - 22. - (2004) (6) 746-54. DOI : 10.1038/nbt966. PMID 15107863 . 127. Sanders R, Hiatt W Tomato transgene structure and silencing / / Nat Biotechnol. 23. - (2005) (3) 287-9. DOI : 10.1038/nbt0305-287b. PMID 15765076 . 128. Chiang C, Wang J, Jan F, Yeh S, Gonsalves D Comparative reactions of recombinant papaya ringspot viruses with chimeric coat protein (CP) genes and wild-type viruses on CP-transgenic papaya / / J Gen Virol. - 82. - (2001) (Pt 11) 2827-36. PMID 11602796 . http://nado.znate.ru
