Автор: Степанец Валерия Николаевна, учащаяся 11
реклама
ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРИТ- И НИТРАТ-ИОНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ Автор: Степанец Валерия Николаевна, учащаяся 11 класс, МБОУ Зимаревская СОШ, ул. Приозерная д.33 кв.4; 89628134997 Научный руководитель: Кандаурова Анна Михайовна, предмет преподавания химия и биология, учитель первой категории, магистр, МБОУ Зимаревская СОШ; адрес школы: Алтайский край, Калманский район, с. Зимари, ул. Центральная 54; дом. адрес: Калманский район, с. Зимари, ул. Центральная д.50 кв. 8; 8962-796-6369 Барнаул 2013 АННОТАЦИЯ Основные результаты научного исследования: 1. Приведены результаты адаптации методики В.М. Островской по определению нитрит-ионов для анализа мясной продукции путем: - замены реагента α-нафтиламина на N-(1-нафтил)-этилендиамин; - замены носителя. 2. Предложен экспресс-метод определения нитрат-ионов в продуктах растительного происхождения: - носителем выбрана стеклоткань; - использован в качестве реагента на нитрат-ионы дифениламин в концентрированной серной качественного анализа. кислоте, ранее применяемый лишь для СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….. 1 ТЕСТ-МЕТОДЫ 5 ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТ- И НИТРАТ-ИОНОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ………………………………………………………………………... 8 1.1 Нитрит- и нитрат-ионы, как объекты химического мониторинга пищевых продуктов ………………………………………………………… 8 1.2 Методика определения нитрит-ионов……………………………… 10 1.3 Фотометрический метод определения нитрита по ГОСТ 8558.1-78………….. 13 1.3.1 Сущность метода………………………………………………... 13 1.3.2 Отбор и подготовка проб……………………………………….. 13 1.3.3 Подготовка к анализу…………………………………………… 14 1.3.4 Построение градуировочного графика………………………… 15 1.3.5 Проведение анализа……………………………………………... 16 1.3.6 Обработка результатов………………………………………….. 16 1.4 Методика определения нитрат-ионов………………………………. 17 1.5 Фотометрический метод определения нитратов и нитритов по ISO 13395……………………………………...………………………………... 19 1.5.1 Сущность метода……………………………………………….... 19 1.5.2 Подготовка к анализу………………………................................. 20 1.5.3 Построение градуировочного графика……................................. 21 1.5.4 Проведение анализа…………………………………………….... 22 1.5.5 Обработка результатов……………………………………………. 22 2 ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМ АЗОТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНДИКАТОРНЫХ ПОЛОС В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ……………………………………………… 24 2.1 Вредное воздействие нитрит- и нитрат-ионов на организм человека…………………………………………………………………..... 24 2.2 Тест-метод определения нитрит-ионов в мясных продуктах…….... 25 2.3 Тест-метод определения нитрат-ионов в продуктах растительного происхождения……………………………………………………………. 29 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………… 32 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….. 35 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК………………………………………………... 36 ПРИЛОЖЕНИЕ А………………………………………………………………... 38 ПРИЛОЖЕНИЕ Б………………………………………………………………… 39 ВВЕДЕНИЕ Одной из важнейших тенденций развития современной аналитической химии является стремление к удешевлению и упрощению процедуры анализа в тех случаях, когда это возможно, за счет разработки методов и средств экспресс-контроля, к числу которых могут быть отнесены и тест-методы. Работы в области тест-методов анализа ведутся в России много лет. Есть области, где тест-методы применяют в течение длительного времени, например, клинический анализ, обнаружение боевых отравляющих веществ и наркотиков; в настоящее время тест-методы приобретают все большее значение для анализа объектов окружающей среды. Тест-системы могут быть использованы для качественного обнаружения компонентов, полуколичественного и количественного их определения. Они должны – обладать нужной чувствительностью и избирательностью действия, обеспечивать необходимую точность и надежность определения, быть простыми в использовании. Важно, чтобы взаимодействия и реакции протекали быстро, а их эффект был наглядным и доступным. Тест-методы особенно хороши для оценки обобщенных показателей безопасности объекта, например, общей токсичности воды или суммарного количества тяжелых металлов в воде. Их удобно использовать при анализе жидких пищевых продуктов. В первую очередь это относится к анализу питьевой и минеральной воды, фруктовых и овощных соков, винной продукции, водки, слабоокрашенных напитков [1]. Актуальность. Проблема токсичного накопления нитратного азота в пищевых продуктах и вредного воздействия его на организм человека на современном этапе является одной из наиболее острых и актуальных. Вредное воздействие нитрит- и нитрат-ионов на организм человека было доказано давно. Все опасные последствия для человека, в том числе рак и метгемоглобинемию, вызывают нитрит-ионы, восстанавливающиеся из нитратионов воды и пищи при хранении, кулинарной обработке и в пищеварительном тракте человека под действием разнообразных микроорганизмов и ферментов, необходимых для человека. Актуальность исследования обусловлена и тем, что в современных условиях необходима адаптация экспрессных методов определения нитрит- и нитрат-ионов в пищевых продуктах, к числу которых могут быть отнесены и тест-методы. Цель работы: адаптация и модификация тест-методов определения нитрит- и нитрат-ионов с использованием индикаторных полос и применение предлагаемых тест-систем для анализа реальных объектов. Задачи исследования: 1. Изучить современное состояние проблемы и подготовить обзор литературы по изучаемой теме. 2. Рассмотреть возможность применения известного тест-метода определения нитрит-ионов для анализа пищевых продуктов, путем замены носителя и реагента. 3. Разработать экспресс-метод определения нитрат-ионов с дифениламином. 4. Определить содержание нитрит- и нитрат-ионов с помощью тестметодов. 5. На основании полученных данных провести обсуждение результатов. Научная новизна. В данной работе предпринята попытка адаптации известного тест-метода определения нитрит-ионов в сточных водах и водной вытяжке почв для анализа пищевых продуктов. Методика модифицирована следующим образом: вместо бумаги марки F использована хроматографическая бумага. Это связано с тем, что последняя обладает более высокими адсорбционными свойствами, благодаря чему окраска по всей поверхности носителя распределяется равномерно и не возникает трудностей с ее идентификацией. Заменен канцерогенный реагент на его производное, отвечающее всем требованиям к импрегнируемых на бумаге реактивам. Предложен новый экспресс-метод определения нитрат-ионов с дифениламином, ранее применяемый лишь для качественного анализа. Выбор методики обусловлен следующими причинами: доступность используемых реактивов, отсутствие сложной, дорогостоящей аппаратуры, простота выполнения, экспрессность. Установлено, что оптимальные условия проведения реакции в растворах совпадают с условиями сорбции определяемых ионов на модифицированных органическими реагентами носителях. Учтены требования к аналитическим реагентам: контрастность цветовой шкалы, высокая скорость взаимодействия с определяемым компонентом, прочное удерживание реагента в порах бумаги. Наличие стандартных цветовых шкал и индикаторных полос позволяют определять содержание нитрит- и нитрат-ионов в пищевых продуктах. 1 ТЕСТ-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТ- И НИТРАТ-ИОНОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ 1.1 Нитрит- и нитрат-ионы, как объекты химического мониторинга пищевых продуктов Природные источники: основные источники нитрит- и нитрат-ионов в ненарушенных и агроландшафтах – органическое вещество почты, минерализация которого обеспечивает постоянное образование нитрит- и нитрат-ионов. Скорость минерализации органического вещества зависит от его состава, совокупности экологических факторов, степени и характера землепользования. Поэтому динамика нитрит- и нитрат-ионов в земных экосистемах определенным образом связана с малым биологическим круговоротом азота. Сельскохозяйственное использование почвы приводит к уменьшению запасов органического азота. Убыль почвенного азота усиливается при проведении агротехнических мероприятий, стимулирующих минерализацию органического вещества (севообороты с паром и пропашными культурами, интенсивная обработка почвы, внесение повышенных доз минеральных удобрений). В этой связи роль почвенного азота в загрязнении природных вод нитрат-ионами и в накоплении растениями, по-видимому, более существенная, чем считалась до сих пор. Антропогенные источники: антропогенные источники нитрит- и нитратионов подразделяются на аграрные (минеральные и органические удобрения, животноводческое производство), индустриальные (отходы промышленного производства и сточные воды) и коммунально-бытовые. Азотные удобрения представляют собой главный антропогенный источник азота, который по своим масштабам приближается к биологической его фиксации на суше и по некоторым прогнозам уже в ближайшие десятилетие превысит ее. В России, как и в других странах мира, азотные удобрения в основном производят в виде концентратов при этом из этого ассортимента наибольшее место занимают мочевина и аммиачная селитра. Преимущественное использование аммонийных и амидных форм азотных удобрений в земледелии не снижает опасности значительных потерь азота из почвы в силу нитрофикации аммонийного азота. Отходы животноводческого производства, главным образом сточные воды и активный избыточный ил, отличаются высоким содержанием общего азота (38-150 мг/л), большая часть которого представлена органической и аммонийной формами. Наряду с рассмотренными выше аграрными источниками увеличение уровня нитрат-ионов в агроландшафтах может быть обусловлено и иными формами сельскохозяйственной деятельности. Так, замена традиционных систем земледелия с участием и чередованием разнообразных культур более интенсивными и специализированными технологиями, которые способствуют усилению минерализации органического вещества почвы и разрушению ее структуры, ограничение площадей, занятых травами, распашка кормовых угодий под постоянную пашню, утяжеление машин и их использование на постоянных технологических колеях, отсутствие защитных зон вокруг полей приводят в конечном счете к усилению внутрипочвенного и поверхностного выноса азота. Концентрация нитрит- и нитрат-ионов в водоемах возрастает при мелиорации переувлажненных земель и в первые годы их сельскохозяйственного использования. Наиболее высокий уровень нитрат-ионов принимающих обнаруживается дренажные воды. в магистральных Длительное водостоках, сельскохозяйственное использование осушенных земель приводит к некоторому повышению содержания нитрат-ионов и в грунтовых водах. Потенциальное значение осадка сточных вод как источника нитрат-ионов определяется способом его утилизации, нормой внесения в почву и скоростью минерализации азотсодержащих соединений. Наиболее распространенный путь утилизации осадков сточных вод заключается в приготовлении на его основе компостов, непосредственном внесении в почву с целью мелиорации земель или в качестве удобрения. На первых этапах компостирования осадка сточных вод преобладают процессы аммонификации. В целом роль илов, шламов как источника нитрат-ионов невелика, так как основное количество азота в них находится в трудногидролизуемых соединениях. 1.2 Методика определения нитрит-ионов Для определения нитрит-ионов в работе была выбрана методика, предложенная В.М. Островской для анализа сточных вод и почв и перенесена на наш предмет исследования [1, 2]. Предлагаемый В.М. Островской αнафтиламин (реактив Грисса: сульфаниловая кислота + α-нафтиламин), обладающий канцерогенными свойствами, был заменен на другие сочетающиеся реагенты: диазотируемый амин + азосоставляющая: N-(1нафтил)-этилендиамин + сульфаниловая кислота. В работе вместо предложенной бумаги-основы марки F с фильтровальной способностью 40 мм/мин использовали хроматографическую бумагу. Индикаторные полосы готовили путем однократной пропитки ее реактивом Грисса. сульфаниловой Для кислоты этого в смешивали уксуснокислом равные растворе объемы и растворов N-(1-нафтил)- этилендиамина. Затем закрепляли 0,3%-ым раствором желатина. Высушивали в потоке теплого воздуха, бумагу нарезали полосами размером 12 х 30 мм. Индикаторная бумага не изменяет своих свойств в обычных условиях две недели, если над осушителем - до двух месяцев. Для создания стандартной цветовой шкалы использовали ГСО 7479-98 (С(NO2---) = 0,95-1,05 мг/см3). Для этого в колбу на 100 мл добавляли 1 мл ГСО и доводили до метки дистиллированной водой (С(NO2-) =10 мкг/мл). Рабочие растворы меньших концентраций 0,050; 0,100; 0,150; 0,175; 0,200; 0,250; 0,270 мкг/мл готовили последовательным разбавлением исходного раствора дистиллированной водой. При контакте индикаторных бумаг с рабочими растворами наблюдалось появление окраски и ее изменение в зависимости от концентрации определяемого компонента. Окраска изменялась от бледнорозовой до красной. Стандартная цветовая шкала представлена на Рисунке 1. Индикаторную бумагу использовали для определения нитрит-ионов в мясных продуктах. Пробоподготовка проводилась методом квартования [3, 4]. Затем пробы дважды измельчали в блендере. 10 г пробы, подготовленной к анализу помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили дистиллированной водой до метки и перемешивали. Колбу с содержимым нагревали на водяной бане, периодически встряхивая до (55 ± 2) °С, в течение 5 мин. Затем вытяжку фильтровали через бумажный фильтр «Черная лента», не перенося осадка на фильтр. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносили пипеткой 10 мл обезбелоченного фильтрата, доводили дистиллированной водой до метки и перемешивали. Тест-полосу опускали в полученный фильтрат на 5 секунду и наблюдали ее цвет после высушивания на воздухе через 1 минуту. Интенсивность окраски реакционной зоны оценивали по стандартной цветовой шкале (рисунок 1). Массовая доля нитрит-ионов в процентах при навеске 10 г и объеме 10 мл указана в Таблице 1. Таблица 1. Ориентировочное содержание нитрит-ионов Номер Массовая концентрация Массовая доля нитрит-иона, % нитрит-иона, мкг/мл 1 0,050 0,0010 2 0,100 0,0020 3 0,150 0,0030 4 0,175 0,0035 5 0,200 0,0040 6 0,250 0,0050 7 0,275 0,0055 Массовую долю нитрит-ионов (χ) в процентах вычисляли по формуле: (1) где М – массовая концентрация нитрит-ионов, найденная по стандартной цветовой шкале, мкг/мл; m – навеска продукта, г; ν – количество фильтрата, мл; 106 – коэффициент перевода в граммы. За окончательный результат испытания принимали среднее арифметическое результатов трех параллельных определений. Время анализа составляет 10-15 минут. Результаты анализа представлены в Таблице А.2 (Приложение А). Правильность метода контролировали фотометрическим методом [5]. 1.3 Фотометрический метод определения нитрита по ГОСТ 8558.1 -78 1.3.1 Сущность метода Настоящий стандарт распространяется на мясные продукты всех видов, при изготовлении которых применяют нитрит, а также рассолы и посолочные смеси и устанавливает методы определения нитрита. Первый метод основан на реакции нитрита с N-(1-нафтил)-этилендиамин дигидрохлоридом последующем и сульфаниламидом фотоколориметрическом в обезбелоченном или визуальном фильтрате и определении интенсивности окраски. При фотоколориметрическом определении интенсивности окраски метод соответствует международному стандарту ISO 2918-75 и применяется при разногласиях в оценке качества. Второй метод основан на реакции Грисса. В качестве параллельного метода был использован первый метод определения нитрита [5]. 1.3.2 Отбор и подготовка проб 1. Пробы колбасных изделий, продуктов из свинины, говядины, баранины, мяса птиц отбирают по ГОСТ 9792-73. 2. Пробы к анализу готовят следующим образом. С колбасных изделий снимают оболочку; с фаршированных колбас и языков в шпике – поверхностный слой шпика и оболочки; с окороков, лопаток, рулетов, корейки и грудинки – поверхностный слой шпика; затем пробы дважды измельчают на мясорубке с отверстиями решетки диаметром от 3 до 4 мм. Продукты, состоящие из шпика с промежуточными слоями мышечной ткани (ветчина в форме, прессованный бекон) измельчают полностью. Полученный фарш тщательно перемешивают, помещают в стеклянную или пластмассовую банку вместимостью от 200 до 400 см3, заполнив ее, и закрывают крышкой. 3. Пробу хранят при (4 ± 2) ºС до окончания анализа. Анализ проводят не позднее чем через 24 ч после отбора проб. Пробы сырых продуктов анализируют сразу после измельчения [5]. 1.3.3 Подготовка к анализу І. Растворы для осаждения белков 1. Реактив Карреза1: 106 г железистосинеродистого калия растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 1000 см 3. Реактив хранят в склянке из темного стекла не более месяца. 2. Реактив Карреза2: 220 г уксусно-кислого цинка и 30 см3 ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 1000 см3. Реактив хранят не более месяца. 3. Насыщенный раствор буры: 50 г тетраборно-кислого натрия растворяют в 1000 см3 теплой дистиллированной воды, и охлаждают до (20 ± 2) °С. ІІ. Растворы для проведения цветной реакции 1. Раствор 1. 2 г сульфаниламида растворяют в 400 см3 раствора соляной кислоты (1 : 1) и доводят этим раствором кислоты до объема 1000 см3. 2. Раствор 2. 0,25 г N-(1-нафтил)-этилендиамин дигидрохлорида растворяют в воде и добавляют до 250 см3. Раствор хранят в склянке из темного стекла в холодильнике не более месяца. ІІІ. Приготовление стандартных растворов Для приготовления стандартных растворов использовали ГСО 7479-98 (С(NO2---) = 0,95-1,05 мг/см3). Для приготовления рабочего раствора 1 см3 основного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят водой до метки и перемешивают. Из полученного раствора готовят серию стандартных растворов: 2; 5 и 10 см3 рабочего раствора пипеткой вносят в три мерные колбы вместимостью 100 см3, доводят водой до метки и перемешивают. Полученные стандартные растворы содержат в 1 см3 соответственно 1,0; 2,5 и 5,0 мкг нитрит-иона. Готовят три серии стандартных растворов, начиная каждый с приготовления основного раствора из ГСО 7479-98 (С(NO2---) = 0,95-1,05 мг/см3). Стандартные растворы нитрит-иона не стойки, поэтому их готовят непосредственно перед построением градуировочного графика [5] 1.3.4 Построение градуировочного графика В четыре мерные колбы вместимостью 100 см3 пипеткой вносят: в первую колбу для сравнения 10 см3 воды, а в остальные по 10 см3 стандартных растворов, содержащих 1,0; 2,5 и 5,0 мкг нитрит-иона в 1 см3 раствора. В каждую колбу добавляют по 50 см3 воды; 10 см3 раствора 1 для проведения цветной реакции. Растворы в колбах перемешивают и выдерживают в темном месте 5 мин. Добавляют 2 см3 раствора 2 для проведения цветной реакции, перемешивают и снова выдерживают в темном месте при (20 ± 2) °С 3 мин. Растворы в колбах доводят водой до метки и перемешивают. Измеряют интенсивность красной окраски на спектрофотометре при длине волны 540 нм с зеленым светофильтром в кювете с толщиной поглощенного свет слоя 1 см в отношении раствора сравнения. По полученным средним данным из трех стандартных растворов строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают концентрацию нитритионов (в мкг в 1 см3 окрашенного раствора); на оси ординат – соответствующую оптическую плотность [5]. Градуировочный график должен проходить через начало координат (градуировочный график представлен на Рисунке 2). 1.3.5 Проведение анализа В мерную колбу вместимостью 200 см3 помещают 10 г подготовленной к анализу пробы, взвешенной с погрешностью не более 0,001 г добавляют последовательно 5 см3 насыщенного раствора буры и 100 см3 воды температурой (75 ± 2) ºС. Колбу с содержимым нагревают на кипящей водяной бане 15 мин., периодически встряхивая, затем охлаждают до (20 ± 2) ºС, тщательно перемешивая, последовательно добавляют по 2 см3 реактива Карреза1 и реактива Карреза2, доводят до метки и выдерживают 30 мин. при (20 ± 2) ºС. Затем содержимое колбы фильтруют через складчатый фильтр «Черная лента». Полученный обезбелоченный фильтрат вносят в количестве 10 см3 пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и проводят цветную реакцию и фотометрирование согласно 1.4.4 используя вместо стандартных растворов вышеуказанное количество обезбелоченного фильтрата. Параллельно проводят контрольный опыт на реактивы, помещая в мерную колбу вместимостью 200 см3 вместо 10 г пробы 10 см3 воды [5]. 1.3.6. Обработка результатов Массовую долю нитрита (χ1) в процентах вычисляют по формуле: (2) где М1 – массовая концентрация нитрита, найденная по градуировочному графику, мкг/см3; m – навеска продукта, г; ν – количество фильтрата, взятое для фотоколориметрического измерения, см3; 106 – коэффициент перевода в граммы. За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений и вычисляют с точностью до 0,0001 %. Предел возможных значений относительной погрешности измерений – 2 % при вероятности 0,95 [6]. Результаты анализа представлены в Таблице А.2 (Приложение А). 1.4 Методика определения нитрат-ионов Для определения нитрат-ионов была предложена качественная, химическая, специфическая реакция на анион третьей аналитической группы – нитрат-ион [7]. Для изготовления тест-полос использовали стеклоткань. Носитель готовили путем однократной пропитки в 4-5 каплях раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Раствор дифениламина в концентрированной серной кислоте является очень чувствительным реактивом на нитрат-ион. Носитель, пропитанный в сернокислом растворе дифениламина, закрепляли 0,3%-ым раствором желатина, затем высушивали в потоке теплого воздуха, нарезали полосами размером 12 х 30 мм. Носитель не изменяет своих свойств в течение двух месяцев при хранении в эксикаторе (в темном месте). Для создания стандартной цветовой шкалы использовали ГСО 6094-91 (С(NO3-) = 0,95-1,05 мг/см3). Рабочие растворы меньших концентраций 2,00; 4,00; 6,00; 8,00; 10,00; 12,00 и 15,00 мкг/мл готовили последовательным разбавлением исходного раствора дистиллированной водой. При контакте полученного носителя с рабочими растворами наблюдалось появление окраски и ее изменение в зависимости от концентрации определяемого компонента. Окраска изменялась от бледно-голубой до ярко-синей. Стандартная цветовая шкала представлена на Рисунке 3. Индикаторные реагентные полосы использовали для определения нитрат-ионов в яблоках. Анализируемое яблоко, не снимая кожуры, измельчали в блендере, затем отжимали сок. 10 мл, полученного сока переносили в колбу на 25 мл и доводили дистиллированной водой до метки. Тест-полосу опускали полученного раствор на 5 секунду и затем наблюдали ее цвет после высушивания на воздухе через 1 минуту. Интенсивность окраски реакционной зоны полосы оценивали по стандартной цветовой шкале. Время анализа составляет 3-5 минут. Расчет результатов анализа проводят по формуле: g = (C· Vc · Vк / Vа ) / mябл , (3) где g – содержание нитрат-ионов, мг/кг; C – содержание нитрат-ионов, найденное по градуировочному графику, мкг/мл; Vc – общий оъем сока, мл; Vк – объем колбы (с учетом разведения), мл; Vал – объем фильтрата, взятый для анализа, мл; mябл – масса яблока, взятого для анализа, кг За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений. Результаты анализа представлены в Таблице Б.3 (Приложение Б). Параллельно те же пробы проанализировали фотометрическим методом [8]. 1.5 Фотометрический метод определения нитратов и нитритов по ISO 13395 1.5.1 Сущность метода ISO 13395 устанавливает метод определения нитритов, нитратов или их суммарного содержания в различных типах вод – грунтовых, поверхностных, сточных, а также в питьевой воде. Система может быть адаптирована для анализа проб пищевых продуктов (водной вытяжки). Сущность метода заключается в восстановлении нитрата в нитрит с помощью металлического кадмия с последующим определением окрашенного соединения, полученного после ряда реакций с участием нитрита. Содержание нитрита в пробе определяют без обработки кадмиевым восстановителем. Реакция проходит в две стадии: при действии на сульфаниловую кислоту нитрита, который в уксуснокислой среде переходит в азотистую кислоту, образуется диазосоединения (фенилдиазонийсульфокислота), которое реагирует с α-нафтиламином и образует азокраситель [8]: O N OH + NH2 HO3S + CH3COOH -H2O HO3S N N CH3COO (1) HO3S HO3S CH3COOH N N CH3COO NH2 N N NH2 (2) Реакция относится к числу наиболее чувствительных колориметрических реакций и дает возможность определить 0,5 мкг N/л (чувствительность метода). Данный метод позволяет определять без разбавления до 0,3 мг NO2---/л. Определению мешают взвешенные вещества и мутность воды, поэтому перед анализом пробу фильтруют. В анализируемой пробе не должны присутствовать сильные окислители или восстановители. Мешают определению медь, железо, ртуть, серебро, метованодаты. висмут, Железо сурьма, маскируют свинец, золото, лимонной хлороплатинаты кислотой. При и больших концентрациях исследуемую пробу рекомендуется разбавлять. Высокая чувствительность метода требует тщательного предохранения применяемых в анализе реактивов и дистиллированной воды от загрязнения нитритами. Исследуемые пробы и реактивы нельзя оставлять открытыми, так как в воздухе почти всегда содержатся следы окислов азота. Особое внимание должно быть обращено на чистоту посуды. 1.5.2 Подготовка к анализу Система должна быть оборудована колонкой с кадмиевым восстановителем с эффективностью 90 %. Кадмиевая колонка (редуктор с амальгамой кадмия) представляет собой трубку высотой около 40 см, внутренним диаметром 10 мм. В верхней части трубки желательно воронкообразное расширение для удобного наполнения трубки жидкостью. Для приготовления амальгамы кадмия берут 100 г гранулированного кадмия, очищают их поверхность, обрабатывая их поверхность 1 н. хлористоводородной кислотой, затем промывают водой и для стабилизации погружают в раствор сульфата меди с концентрацией 2,5 г/л (при этом поверхность гранул становится чёрной). Полученный амальгированный кадмий промывают достаточным объемом дистиллированной воды и наполняют им трубку редуктора, на дно которого предварительно помещают слой стеклянной ваты. Переносят амальгированный кадмий в трубку вместе с дистиллированной водой и заливают его водой так, чтобы вода его покрывала и в колонке не было пузурьков воздуха. Амальгама кадмия должна заполнять 1/3 трубки. Пропускают анализируемый раствор через редуктор со скоростью 4 мл/мин. Первые несколько миллилитров прошедшего через редуктор раствора отбрасывают, далее определяют содержание нитрит-ионов фотометрическим методом. Метод применяется для определения нитрат-ионов в концентрациях от 0,002 до 0,5 мг/л. Определению мешают взвешенные вещества и мутность, поэтому перед анализом пробу фильтруют. Мешают фосфат-ионы в концентрациях превышающих 100 мг/л. Присутствующие в пробе нитриты проходят через редуктор без изменения. Их определяют отдельно, и результат вычитают из результата определения нитратов. Не мешают хлориды (до 50 мг), фториды (до 25 мг), сульфаты (до 25 мг), сульфиты (до 10 мг), фосфаты (до 25 мг) и бораты (до 1 мг). Недостатком этого метода является низкая скорость прохождения анализируемого раствора через кадмиевую колонку, поэтому этот процесс занимает много времени [8]. 1.5.3 Построение градуировочного графика Приготовление рабочего раствора нитрита. Для приготовления рабочего раствора 1 мл ГСО (С(NO2---) = 0,95-1,05 мг/см3) переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают (С(NO2---) =10 мкг/мл). Построение градуировочного графика для нитрита. В 6 мерных колб на 25 мл из рабочего раствора нитрита берут аликвоты 0,00; 3,00; 3,50; 4,00; 4,50; 5,00 мл. Затем последовательно во все колбы приливалют по 1 мл реактива Грисса, растворы в колбах доводят дистиллированной водой до метки и через 30 минут после развития окраски выполняют фотометрирование. Измеряют поглощающую способность красной окраски на спектрофотометре при длине волны 540 нм с зеленым светофильтром в кювете с толщиной поглощенного свет слоя 1 см в отношении раствора сравнения (1 мл реактива Грисса в 25 мл воды). По полученным данным строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают концентрацию нитрит-ионов (в мкг в 1 мл окрашенного раствора); на оси ординат – соответствующую оптическую плотность [8]. Градуировочный график должен проходить через начало координат (градуировочный график представлен на Рисунке 4). 1.5.4 Проведение анализа В центрифужные пробирки помещают 10 мл яблочного сока, 5 мл насыщенного раствора лимонной кислоты (для связывания железа, с константой нестойкости Кнест=3,54*10-15). Затем центрифугируют 15-20 раз, отделяют осадок от раствора. 10 мл последнего помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл реактива Грисса, доводят дистиллированной водой до метки и относительно «холостого» раствора, через 30 минут после развития окраски фотометрируют. По градуировочному графику определяют концентрацию нитрата/нитрита. Для определения нитрат-ионов пропускают анализируемый раствор через кадмиевую колонку, состоящую из стеклянной трубки, заполненной амальгамированным кадмием: NO3 Cd 2CH3COOH NO2 Cd 2 2CH3COO H2O (3) По разности концентраций в пробе нитрата/нитрита и нитрит-ионов, найденных по градуировочному графику, определяют содержание нитрат-ионов в анализируемом объекте [8]. 1.5.5. Обработка результатов Расчет результатов анализа проводят по формуле: g = (C· Vc · Vк / Vа ) / mябл , (4) где g – содержание нитрат-ионов, мг/кг; C – содержание нитрат-ионов, найденное по градуировочному графику, мкг/мл; Vc – общий оъем сока, мл; Vк – объем колбы (с учетом разведения), мл; Vал – объем фильтрата, взятый для анализа, мл; mябл – масса яблока, взятого для анализа, мл За окончательный результат испытания принимают арифметическое результатов трех параллельных определений [8]. Результаты анализа представлены в Таблице Б.3 (Приложение Б). среднее 2 ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРИТ- И НИТРАТ-ИОНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНДИКАТОРНЫХ ПОЛОС В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ 2.1 Вредное воздействие нитрит- и нитрат-ионов на организм человека Проблема токсичного накопления нитратного азота в пищевых продуктах и вредного воздействия его на организм человека на современном этапе является одной из наиболее острых и актуальных. Впервые заговорили о нитратах в нашей стране в 70-х годах, когда в Узбекистане случилось несколько массовых желудочно-кишечных отравлений арбузами, при их чрезмерной подкормке аммиачной селитрой. В мировой науке о нитратах знали еще гораздо раньше. Сейчас общеизвестно, что нитрат-ионы обладают высокой токсичностью для человека и сельско-хозяйственных животных: Нитрат-ионы под воздействием фермента нитратредуктазы восстанавливаются до нитрит-ионов, которые взаимодействуют с гемоглобином крови и окисляют в нем 2-х валентное железо в 3-х валентное. В результате образуется вещество метгемоглобин, который уже не способен переносить кислород. Поэтому нарушается нормальное дыхание клеток и тканей организма (тканевая гипоксия), в результате чего накапливается молочная кислота, холестерин, и резко падает количество белка. Особенно опасны нитрат-ионы для грудных детей, так как их ферментная основа несовершенна, и восстановление метгемоглобина в гемоглобин идет медленно. Нитрат-ионы способствуют развитию патогенной (вредной) кишечной микрофлоры, которая выделяет в организм человека ядовитые вещества токсины, в результате чего идет токсикация, то есть отравление организма. Основными признаками нитратных отравлений у человека являются: - синюшность ногтей, лица, губ и видимых слизистых оболочек; - тошнота, рвота, боли в животе; - понос, часто с кровью, увеличение печени, желтизна белков глаз; - головные боли, повышенная усталость, сонливость, снижение работоспособности; - одышка, усиленное сердцебиение, вплоть до потери сознания; - при выраженном отравлении – смерть. Нитрат-ионы снижают содержание витаминов в пище, которые входят в состав многих ферментов, стимулируют действие гормонов, а через них влияют на все виды обмена веществ. У беременных женщин возникают выкидыши, а у мужчин – снижение потенции. При длительном поступлении нитрат-ионов в организм человека (пусть даже в незначительных дозах) уменьшается количество йода, что приводит к увеличению щитовидной железы. Установлено, что нитрат-ионы сильно влияют на возникновение раковых опухолей в желудочно-кишечном тракте у человека. Нитрат-ионы способны вызвать резкое расширение сосудов, в результате чего понижается кровяное давление. При всем вышеизложенном следует помнить, вред наносят организму человека не сами нитрат-ионы, но и их метаболиты: нитрит-ионы и нитрозосоединения, в которые они превращаются при определенных условиях [9]. 2.2 Тест-метод определения нитрит-ионов в мясных продуктах В методике, предложенной В.М. Островской [1, 2], в качестве носителя использовалась бумага марки F с фильтровальной способностью 40 мм/мин, которая была заменена на хроматографическую бумагу. Это связано с тем, что последняя обладает более высокими адсорбционными свойствами, благодаря чему окраска по всей поверхности носителя распределяется равномерно и не возникает трудностей с ее идентификацией. Предлагаемый в методике В.М. Островской α-нафтиламин был заменен на N-(1-нафтил)-этилендиамин. N-(1-нафтил)-этилендиамин обладает рядом преимуществ перед канцерогенным α-нафтиламином: -N-(1-нафтил)-этилендиамин не имеет неприятного запаха, подобного запаху более летучего 1-нафтиламина; -N-(1-нафтил)-этилендиамин более трудно растворим; -N-(1-нафтил)-этилендиамин обладает значительно большей устойчивостью к окислению и разложению, что особенно заметно при хранении на воздухе и на свету и, как следствие, большей устойчивостью при хранении как в таре, в адсорбированном виде на бумаге, так и в продуктах его азосочетания. В основе применяемого тест-метода лежит реакция Грисса - реакция диазотирования и азосочетания с образованием азокрасителя. Так как реакция диазотирования может проходить как в кислой, так и щелочной среде, то было решено провести исследования по выявлению влияния рН среды на образование окрашенной зоны. Контроль рН осуществлялся с помощью рН-метра. Необходимое значение рН создавалось при помощи концентрированных растворов соляной кислоты и гидроксида натрия. Максимально различимая контрастность окраски наблюдалась в интервале рН от 2 до 4. Начиная с рН=5, тональность окраски ближайших концентраций все более сглаживалась, и разница почти была не видна. При рН ≥ 7, нитрат-ионы начинали восстанавливаться до аммиака; происходило выделение тепла, которое разрушало образующуюся соль диазония [2, 10]. Реакция Грисса: O N OH + NH2 HO3S + CH3COOH -H2O HO3S N N CH3COO (4) HO3S HO3S N N CH3OO CH3COOH NHR N N NHR (5) где R = CH2 – CH2 – NH2 Оптимальной средой для проведения реакции служит кислая среда (рН=2-4) В случае появления при смешивании растворов розовой окраски добавляли цинковую пыль. При действии цинка в присутствии уксусной кислоты нитрат-ионы восстанавливаются до нитрит-ионов. [7, 11]: NO3 Zn 2CH3COOH NO2 Zn 2 2CH3COO H 2 O (6) При изготовлении индикаторных полос использован метод закрепления реагентов с помощью 0,3%-го раствора желатина, который препятствует вымыванию реагента с поверхности носителя, что ранее не использовалось в предложенной методике [1]. Полученные индикаторные бумаги использованы для создания стандартной цветовой шкалы (Рисунок 1). 0,050 0,100 0,0010 0,150 0,0020 0,175 0,0030 0,200 0,0035 0,250 0,0040 0,270 мкг/мл 0,0050 0,0055 % Рисунок 1 – Стандартная цветовая шкала для определения нитрит-ионов Индикаторную бумагу использовали для определения нитрит-ионов в мясных продуктах. Соли этого кислотного остатка добавляют в готовую мясную продукцию с целью улучшения ее потребительских свойств, которые придают ей розовый мясной цвет, а также для более длительного хранения (нитриты натрия и калия обуславливают цвет, вкус и аромат мясных изделий, ингибируют рост микрофлоры и образование токсинов в мясопродуктах). Это пищевые добавки Е249-Е252 [12]. В качестве метода сравнения в работе использовали фотометрический метод [5]. Концентрацию нитрит-ионов определяли по градуировочному графику (Рисунок 2). Рисунок 2 – Зависимость оптической плотности от концентрации нитрит-ионов Результаты анализа представлены в Таблице А.2 (Приложение А). Массовая доля нитрит-ионов не должна превышать 0,0050% [12]. Из результатов анализа можно сделать выводы, что образцы 3 и 4 содержат нитритионы больше допустимого значения. 2.3 Тест-метод определения нитрат-ионов в продуктах растительного происхождения В основе применяемого тест-метода лежит реакция взаимодействия дифениламина в концентрированной серной кислоте с нитрат-ионами. В присутствии нитрат-ионов появляется интенсивно синяя окраска вследствие окисления дифениламина образующейся азотной кислотой с образованием имониевых солей дифенилбензидина (схема реакции Кермана) [6, 13]: C6H5 NH C6H5 H2SO4 k HNO3 C6H5N NHC6H5 OSO3H (7) В литературе существует описание этой реакции, но описание химизма не встречается. В качестве носителя использовали стеклоткань (ткань стеклянная) – волокнистая основа, состоящая из переплетенных стеклянных нитей. Это экологически чистый материал, обладающий высокой стойкостью к разложению и механическому износу, долговечен, прочен, сочетает в себе пористость структуры и гидрофильность, не притягивает пыль, так как не обладает статистическим зарядом. Степень удержания реагентов на стеклоткани выше (70-90%), чем на бумаге (40-50%) по причине беспорядочной сшивки стеклянных крученных комплексных нитей. Установлено, что оптимальные условия проведения реакции в растворах совпадают с условиями сорбции определяемых ионов на модифицированных органическими реагентами носителях. При изготовлении индикаторных полос также использован метод закрепления реагентов с помощью 0,3%-го раствора желатина. Полученные индикаторные полосы использованы для создания стандартной цветовой шкалы (Рисунок 3). 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 15,00мкг/мл Рисунок 3 – Стандартная цветовая шкала для определения нитрат-ионов Индикаторную бумагу использовали для определения нитрат-ионов в яблоках. В качестве метода сравнения в работе использовали фотометрический метод [8]. По разности концентраций в пробе нитрата/нитрита и нитрит-ионов, найденных по градуировочному графику, определяли содержание нитрат-ионов в анализируемом объекте (Рисунок 4). Рисунок 4 – Зависимость оптической плотности от концентрации нитрит-ионов Результаты анализа представлены в Таблице Б.3 (Приложение Б). Предельно допустимая норма нитрат-ионов в яблоках 60 мг/кг (0,060 мг/г). Из результатов анализа можно сделать вывод, что содержание нитратионов не превышает предельно допустимого значения только лишь в Образце 2 «Мария-Ра». ЗАКЛЮЧЕНИЕ В начале экспериментальной деятельности по определению нитритионов за основу была взята методика, предложенная В.М. Островской для анализа сточных вод и почв и перенесена на наш предмет исследования. Впоследствии в первоначальный вариант внесены следующие изменения: - В качестве носителя вместо бумаги марки F с впитывающей способностью 40 мм/мин, использовалась хроматографическая бумага. Это связано с тем, что последняя обладает более высокими адсорбционными свойствами, благодаря чему окраска по всей поверхности носителя распределяется равномерно и не возникает трудностей с ее идентификацией, а так же обладает лучшими светоотражающими свойствами. - В основе применяемого тест-метода была положена реакция Грисса реакция диазотирования и азосочетания с образованием азокрасителя, и ее различные модификации: H+ RNH2 + NO2- → RN ≡ N+ RN ≡ N+ + R1H → RN = NR1 Использовано несколько (8) (азоиндикатор) вариантов замены (9) канцерогенного α- нафтиламина: 1. Замена на 1-нафтиламин-7-сульфокислоту (кислота Клеве). При замене α-нафтиламина на 1-нафтиламин-7-сульфокислоту (кислота Клеве) нитрит-ионы можно определить только качественно, так как тональность при различных концентрациях визуально неотличима. 2. Замена на N-(1-нафтил)-этилендиамин. Было установлено, что N-(1нафтил)-этилендиамин обладает рядом преимуществ перед канцерогенным αнафтиламином: -N-(1-нафтил)-этилендиамин не имеет неприятного запаха, подобного запаху более летучего 1-нафтиламина; -N-(1-нафтил)-этилендиамин более трудно растворим; обладает -N-(1-нафтил)-этилендиамин значительно большей устойчивостью к окислению и разложению, что особенно заметно при хранении на воздухе и на свету и, как следствие, большей устойчивостью при хранении как в таре, в адсорбированном виде на бумаге, так и в продуктах его азосочетания. Поэтому для определения нитрит-ионов в качестве реагента был выбран N-(1-нафтил)-этилендиамин. - Подобран оптимальный интервал рН: от 2 до 4. Именно при таких условиях удается получить шкалу с максимально различимой тональностью окраски ближайших концентраций. При определении нитрат-ионов так же возник вопрос в выборе реагента. Были апробированы различные модификации реакции Грисса. Но эти процессы требовали длительного времени, так как нитрат-ионы можно было определить только после их предварительного восстановления до нитрит-ионов. Пробовали в качестве реагента использовать фенилдисульфокислоту, Недостатком данного метода является то, что ее нужно синтезировать из фенола и концентрированной серной кислоты, что очень опасно, требует большого внимания и много времени. Поэтому было решено разработать экспресс-метод определения нитратионов с дифениламином, ранее применяемый лишь для качественного анализа. Выбор методики обусловлен следующими причинами: доступность используемых реактивов, отсутствие сложной, дорогостоящей аппаратуры, простота выполнения, экспрессность. Недостатком предложенного метода является то, что реакция дифениламина в концентрированной серной кислоте характерна так же для NO2, CrO42-, MnO4-, Fe3+, [Fe(CN)6]3- и других окислителей, имеющих достаточно высокий стандартный потенциал. Но как показывает опыт, при низких концентрациях эти ионы не дают реакции с дифениламином. Основным недостатком определения нитрат-ионов параллельным методом является необходимость их восстанавливать. Однако здесь имеется небольшая проблема: при избытке восстановителя возможно нитрат-ионы восстановить до аммиака, который уже определяется реактивом Несслера. Учтены требования к аналитическим реагентам: контрастность цветовой шкалы, высокая скорость взаимодействия с определяемым компонентом, прочное удерживание реагента в порах бумаги и стеклоткани. Наличие стандартных цветных шкал (Рисунок 1, 3) и индикаторных полос позволяют определять содержание нитрит- и нитрат-ионов в пищевых продуктах. Конечно, данные методы не могут соперничать по точности с другими методами анализа, поскольку являются полуколичественным. Однако они обладают рядом неоспоримых преимуществ: простотой, экспрессностью, отсутствием сложной аппаратуры. Предлагаемые методы позволяют значительно повысить наглядность анализа по сравнению с контролируемым методом, получить оперативную информацию о качестве анализируемого объекта. ВЫВОДЫ 1. Адаптирован известный тест-метод определения нитрит-иона для анализа пищевых продуктов, путем замены носителя и реагента: α-нафтиламина на его алкилпроизводное. 2. Предложен экспресс-метод с дифениламином для полуколичественного определения нитрат-иона 3. Изготовлены индикаторные полосы и созданы стандартные цветовые шкалы для быстрого определения содержания нитрит- и нитратионов. Индикаторные полосы сохраняют свои реакционные свойства при правильном хранении не менее двух месяцев. 4. Тест-методы апробированы на содержание нитрит-иона в мясной продукции, а нитрат-иона в продуктах растительного происхождения. 5. Диапазоны определяемых содержаний нитрит-иона составляют 0,010-0,275 мкг/мл, время определений 10-15 минут. Диапазоны определяемых содержаний нитрат-иона составляют 2,00-15,00 мкг/мл, время определений 3-5 минут. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Островская В.М. Вода индикаторные системы. М.: Мир, 2002. 265 с. 2. Золотов Ю.А., В.М. Иванов., В.Г. Амелин. Химические тест-методы анализа. М.: Едиториал, УКСС, 2002. 304 с. 3. ГОСТ 9792-73 Отбор и подготовка проб колбасных изделий. Введ. 1993-01-01. М.: Изд-во стандартов, 1993. 6 с. 4. ГОСТ 26929-94 Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения содержания токсичных элементов. Введ. 1996–01-01. М.: Изд-во стандартов, 1996. 14 с. 5. ГОСТ 8558.1-78 Продукты мясные. Методы определения нитрита. Введ. 1993-01-01. М.: Изд-во стандартов, 1993. 21 с. 6. Каррер П. Курс органической химии. 2-е изд., перераб. и доп. Л.: 1962. 570 с. 7. Крешков А.П. Основы аналитической химии. Теоретические основы. Количественный анализ. М.: Химия. 1999. Т 2. 472 с. 8. Фомин радиационной Г.С. Вода безопасности Контроль по химической, бактериальной международным и стандартам: энциклопедический справочник 2-е изд., перераб. И доп. М.: Протектор, 2000. 848 с. 9. Соколов О.Н., Агаев В.Ю. Нитраты в окружающей среде. М.: 1990. 46 с. 10. Yamaguchi K.F. Spectral data of natural products // Journal of An alytical Chemistry. 2000. № 6. P. 295-297. 11. Алексеев В.Н. Курс качественного химического полумикроанализа. М.: Химия, 1973. 584 с. 12. ГОСТ 16290-86. Характеристики на мясные продукты. Введ. 1993– 01–01. М.: Изд-во стандартов, 1993. 11 с. 13. Аверина А.В., Снегирева А.Я. Лабораторный практикум по органической химии. Учебное пособие для техникумов. М.: 1980. 184 с. ПРИЛОЖЕНИЕ А Результаты мониторинга нитрит-ионов в мясных продуктах Таблица А.2 – Результаты мониторинга нитрит-ионов в мясных продуктах (n=3, Р=0,95) Объект анализа Образец 1 Найдено тестметодом, % (103) 2,7 ± 1,2 Найдено фотометрическ им методом, % (103) 2,8 ± 0,6 Срок реализации при t хранения от 0º до +6ºС и относительной влажности 75±5% 30 суток Образец 2 2,7 ± 1,2 2,1 ± 0,5 15 суток Образец 3 5,3 ± 0,7 5,4 ± 0,5 72 часа Образец 4 5,3 ± 0,7 5,2 ± 0,3 60 суток Образец 5 4,8 ± 1,7 3,5 ± 0,2 30 суток Примечания Образец 1 - колбаса московская, вареная, высший сорт, охлажденная ГОСТ Р 52196-2003; Образец 2 - колбаса любительская, вареная ТУ 9213-186-01597945-03; Образец 3 – колбаса молочная, вареная ГОСТ 16351-86; Образец 4 – колбаса докторская, вареная ГОСТ ОСТ 5647-88; Образец 5 – колбаса нежная, вареная ГОСТ ОСТ 4938-85. ПДК нитрит-ионов в мясных продуктах составляет 50 мг(NO2-)/кг (0,0050 %) Приложение Б Результаты мониторинга нитрат-ионов в яблоках Таблица Б.3 – Результаты мониторинга нитрат-ионов в яблоках (n=3, Р=0,95) Объект анализа Образец 1 Образец 2 Сектор торговли Найдено тестметодом, мг/г Мария-Ра Рынок Старый базар Мария-Ра Рынок Старый базар 0,090 ± 0,012 0,100 ± 0,034 Найдено фотометрическим методом, мг/г 0,088 ± 0,002 0,118 ± 0,006 0,045 ± 0,015 0,065 ± 0,012 0,044 ± 0,001 0,061 ± 0,003 Примечания МДУ=0,060 мг∕г Образец 1 - яблоки «Фуши», Китай; Образец 2 - яблоки «Гала», Италия. ПДК нитрат-ионов в яблоках составляет 60 мг(NO3-)/кг
