Глава VIIІ
реклама
Глава VIIІ. Пробиотические продукты питания. Актимель. 1. Вступление. Co времени первых наблюдений, сделанных Ильей Мечниковым, проведено множество экспериментов по использованию отобранных микроорганизмов, главным образом, принадлежащих к семейству молочнокислых бактерий, для профилактики или лечения разнообразных патологических состояний. Естественное желание людей использовать для сохранения здоровья природные средства и методы, а не химиотерапевтические агенты длительного действия, например, антибиотики, основано на твердом убеждении в том, что основным источником здоровья и долголетия должна быть пища. Пищевые молочнокислые бактерии (МКБ) известны, главным широкому применению образом, по их в производстве ферментированных, пищевых продуктов, т.н. пробиотические продукты питания. Предметом самых активных прошедшем столетии были полезные эффекты специфических научных исследований в штаммов или видов бактерий, способствующие укреплению здоровья людей. Вместе с тем, несмотря на потенциально большое социально-экономическое значение, исследования пробиотиков в течение многих десятилетий проводились на довольно слабом уровне. Даже, несмотря на то, что недавние клинические исследования надежно обосновали определенные полезные эффекты пробиотиков, механизмы, лежащие в их основе, остаются во многом неизвестными. Ожидается, что широкое внедрение в эту сферу современных методов молекулярной биологии позволит уже в ближайшем будущем создать прочную научную основу для доказательства утверждений о полезных эффектах пробиотиков и их оздоравливающем действии. В этом плане следует отметить компанию Данон, которая многие годы проводит последовательные научные исследования в области создания пробиотических продуктов питания. Компании Данон принадлежит специфический штамм, известный под научным именем Lactobacillus casei DN 114-001, а также под торговыми марками Lactobacillus casei DEFENSIS или IMMUNITAS. Компания Данон создала пробиотический продукт Actimel, который содержит 2 обычно используемых пробиотических йогуртовых штамма, а также 108 КОЕ/г Lactobacillus casei DEFENSIS (10 миллиардов в каждой 100 мл бутылочке), концентрация которой гарантируется в течение всего срока годности продукта (28 суток во Франции). Торговое название Actimel происходит от фламандских слов «actieve melk», означающих активное молоко, чем подчеркивается положительное влияние этого продукта на здоровье. В последние годы компания Danone проводит многочисленные научные исследования, показывающие, что Actimel и/или Lactobacillus casei DEFENSIS оказывает биологические, физиологические или клинические влияния в различных типах экспериментов, и это влияние способствует оптимизации функционирования организма, приводящей к усилению его природных защитных сил. Actimel по сравнению с другими пробиотическими молочными продуктами обладает рядом преимуществ, а именно: - L.Сasei DN-114001, находятся в продукте в активном состоянии, стабильная концентрация которых гарантирована на протяжении всего срока его годности; - бактериальная флора Actimel устойчива к действию желудочного сока, ферментов и секретов двенадцатиперстной кишки; - продукт содержит бактериальные метаболиты, необходимые для саморегуляции пробиотической микрофлоры; - обладает лактозной активностью, т.е. способствует более легкому расщеплению и усвоению лактозы; - содержит сниженное количество жира, что уменьшает нагрузку на ферментный аппарат желудочно-кишечного тракта; - относится к низкокалорийным продуктам, что значительно уменьшает риск возникновения ожирения и других алиментарных болезней; - не содержит консервантов и красителей. 2. Выживание организмов Actimel в желудочно-кишечном тракте. При прохождении через желудочно-кишечный тракт бактерии подвергаются мощному физиологическому стрессу (кислотность, присутствие пищеварительных ферментов и солей желчных кислот), который влияет на их выживание. Считается, однако, что выживание пробиотического микроорганизма необходимо для оказания им влияния на организм хозяина. 2.1. Исследования in vitro. Выживаемость L. casei DEFENSIS изучалась на мультискоростной модели, и результаты исследований показывают его способность противостоять физиологическим условиям желудочно-кишечного тракта. Его устойчивость, в сравнении с другими изученными штаммами, в особенности высока в тонком кишечнике (Havenaar R. et al., 1994). Исследования на людях подтверждают данные, полученные на животных, показывая, что Lactobacillus casei DEFENSIS выживает при прохождении через желудочно-кишечный тракт и что пробиотический штамм может быть выделен из кала в количестве от 106 до 108 на грамм (Oozer R. et al., 2003). Более того, эта бактерия проходит через желудочнокишечный тракт, не заселяя его. Следовательно, Actimel может оказывать свое положительное воздействие только при регулярном употреблении. Известно, что человеческому организму постоянно требуется адаптироваться в ответ на изменения, связанные с различными периодами жизни, а также на ежедневное влияние окружающей среды и стиля жизни. Старение, стресс, интенсивные физические тренировки, погода – вот только некоторые факторы, для которых установлено ослабление природной защитной системы, из-за чего организм становится более подверженным внешней бактериальной атаке. Возраст может ослаблять природные защитные силы организма, что объясняет, почему пожилые люди отличаются повышенной восприимчивостью к респираторным и желудочно-кишечным инфекциям. Данные Всемирной Организации Здравоохранения показывают, что происходит 400-кратное увеличение смертности от последствий желудочнокишечных инфекций в пожилом возрасте в сравнении с молодыми взрослыми людьми. Исследования показали, что возможные изменения флоры, связанные с возрастом, могли быть связаны со снижением сопротивляемости к колонизации. Это может быть связано с изменениями физико-химических условий в кишечнике и повреждением слизистой оболочки кишечника с возрастом (Bertazzoni-Minelli E. et al., 1993). Потеря способности к клеточному делению и дегенерация тканей и органов находятся среди наиболее важных проявлений возрастных процессов и могут оказывать воздействие на целостность кишечного эпителия. Влияние стресса (как психологического, так и физического) на клиническое течение ряда кишечных заболеваний в настоящее время интенсивно исследуется (Bennet E.J. et al., 1998). Продемонстрирована прямая связь между стрессом и повышенной чувствительностью к инфекциям (Sheridan J.F. et al., 1994; Shepard R.J. a. Shek P.N., 1994), атопическими болезнями (Michel F.B., 1994; Kodama A. et al., 1999) и астмой (Buse W.W. et al., 1995). Стресс может изменять баланс кишечной флоры у здоровых людей (Virkha G.V. et al., 1999). Показано, что различные типы физического и психологического стресса влияют на некоторые компоненты функционирования кишечного барьера (Söderholm J.D. et al., 2001). Например, склонность к инфекциям была обнаружена у профессиональных спортсменов. Очевидно, что даже холодная погода негативно влияет на природные защитные силы организма. Эпидемиологические данные показывают, что респираторные заболевания диарея случаются много чаще в зимние месяцы. Ряд клинических исследований и экспериментов на животных продемонстрировали, что L. casei DEFENSIS, содержащийся в Actimel, оказывает положительное влияние на состав и метаболизм кишечной микробиоты. Исследование, проведенное на крысах с человеческой микрофлорой показало, что Lactobacillus casei DEFENSIS может изменять кишечную флору особым образом, что вероятно полезно для организма-хозяина, а именно увеличивать эндогенную популяцию бактерий (Bifidobacteria) совместно с изменением метаболических и энзиматических параметров (подкисление фекалий и снижение активности β-глюкуронидазы). Крыс кормили одной из четырех добавок ежедневно в течение четырех недель: молоком; молоком, ферментированным только Lactobacillus casei DEFENSIS; молоком, ферментированным только йогуртовыми культурами; и молоком, ферментированным Lactobacillus casei DEFENSIS и йогуртовыми культурами. Экскременты собирали в конце периода исследований и животных умерщвляли через шесть недель после начала исследования для изучения метаболитов бактерий и активности ферментов. Содержание Bifidobacteria в экскрементах было более высоким в группах, которых кормили молоком, ферментированным L. casei DEFENSIS, и кислотность экскрементов была несколько выше. Концентрации короткоцепочных жирных кислот: уксусной, пропионовой и масляной – были значительно выше в группе, которой скармливали Lactobacillus casei DEFENSIS. Кроме того, активности -галактозидазы и - и -глюкозидазы были значительно выше. 2.2. Клинические исследования. Были исследованы образцы кала детей, принимавших участие в клиническом исследовании Pedone (Pedone C.A. et al., 1999). После 1 недели исходного периода 39 здоровых детей в возрасте 10-18 месяцев были случайным образом распределены в 1 из 3 групп по продуктам: молоко, ферментированное L. bulgaricus и S. Thermophilus; Actimel и молочное желе, которое использовалось в качестве контроля. Каждый продукт добавляли к основному питанию в количестве 125 г/сутки в течение месяца, после чего проходил период наблюдения в течение 1 недели. Образцы кала собирали во время исходного периода, через 2 недели и 1 месяц приема продуктов и в конце наблюдения. Флора детей, питавшихся Actimel, содержала более высокие концентрации Lactobacillus, чем у детей, которые употребляли контрольный продукт. В группе, употреблявшей Actimel процент детей с >6 log10 КОЕ lactobacilli/г кала увеличивалось (p<0,05). В том же исследовании в группе, принимавшей Actimel, уменьшалась активность глюкуронидазы и -гликозидазы (p<0,05), особенно у тех детей, у которых активность этих ферментов была первоначально высокой, что демонстрирует его положительное влияние на улучшение метаболизма кишечной флоры. Таким образом, результаты, полученные в исследованиях на людях и животных, показали, что Actimel может способствовать восстановлению микробиоты. На моделях, у которых флора не была правильно сбалансирована (крысы, заселенные человеческой флорой и дети, у которых характеристики флоры отличаются от средних), происходило изменение состава и/или метаболизма в сторону обыкновенно обнаруживаемых характеристик, и в целом принимаемых как благоприятные. Вместе с тем, у здоровых людей со сбалансированной микробиотой, никаких изменений не наблюдалось (Rochet V. et al., 2006). Это может рассматриваться как доказательство регуляторной роли Actimel, в соответствии с которой он не действует на правильно сбалансированную кишечную флору. 3. Влияние Actimel на слизистую оболочку кишечника. Исследования были проведены на модельных животных и клетках человека и продемонстрировали влияние Actimel на эпителиальные клетки и их секреторную функцию. В исследовании было показано, что L. casei DEFENSIS усиливает рост эпителиальных клеток у крыс. Это исследование in vitro выявило влияние четырех бактериальных штаммов на слизистую оболочку кишечника крыс путем измерения биохимических параметров митохондриальной дегидрогеназной активности (маркер цитотоксичности), синтеза ДНК (индикатор клеточной пролиферативной активности) и общего образования ц-АМФ (медиатор клеточного метаболизма). В этом исследовании использована линия эпителиальных клеток (IEC-6) из тонкого кишечника новорожденных крыс. Результаты показывают, что исследованные ферментированные молочные продукты влияют на рост и дифференциацию клеток (Thoreux K. et al., 1996). Йогуртовые культуры и Lactobacillus casei DEFENSIS были особенно активны и усиливали синтез ДНК, а также общее образование цАМФ. В другом исследовании было продемонстрировано, что L. casei DEFENSIS стимулирует дифференциацию эпителиальных клеток мыши. В этом исследовании изучали влияние L. casei DEFENSIS как на гистологические (измерение клеточного деления и роста), так и метаболические параметры (изменение активности ферментов, связанных с функционированием эпителия) у мышей (Thoreux K. et al., 1998). Сравнивались два ферментированных молочных продукта – один содержал только йогуртовые культуры, другой – йогуртовые культуры с добавкой Lactobacillus casei DEFENSIS – с неферментированным молоком и отсутствием молочных продуктов. 4 группы мышей получали такую диету в течение 3 суток, другие 4 группы получали диету в течение 15 суток. Наблюдалось увеличение ворсинчатых клеток (принимающих участие в кишечной абсорбции), слизистых клеток (ответственны за секрецию слизи) и клеток Панета (содержащих секреторные гранулы). Происходило увеличение активности специфических ферментов: лактазы, щелочной фосфатазы и аминопептидазы. В исследовании in vitro было показано также, что Lactobacillus casei DEFENSIS ингибирует ротавирусную инфекцию, изменяя профиль гликозилирования на апикальной поверхности эпителиальных клеток человеческого кишечника (культура эпителиальных клеток НТ29-МТХ) (Freitas M. et al., 2003). Инкубирование кишечных клеток НТ29-МТХ, дифференцированных в среде, содержащей 20% надосадочной жидкости, взятой от культуры Lactobacillus casei DEFENSIS, усиливало связывание -галактозы со специфическими лектинами более, чем на 60%, а также уменьшало инфицирование клеток ротавирусом на 70%. Механизм активности, наблюдавшийся в этой линии клеток, может объяснить результаты, полученные в исследовании на детях, посещавших детские сады. В работе Tanabe H. и соавт. (2004) было показано, что штамм Lactobacillus casei DEFENSIS индуцирует секреторную активность клеток Панета, и что он чувствителен к кишечным -дефезинам. Влияние Lactobacillus casei DEFENSIS исследовалось в тестах ex vivo на криптах кишечника мыши. Они были выделены из тонкого кишечника взрослых мышей и инкубировались с Lactobacillus casei DEFENSIS. Надосадочные жидкости были протестированы на бактерицидную активность против Salmonella typhimuricum и было показано, что Lactobacillus casei DEFENSIS индуцирует секреторную активность клеток Панета. 3.1. Исследования ex vivo на клетках человека. В исследовании ex vivo (Parassol N. и соавт., 2005) показано, что Lactobacillus casei DEFENSIS подавляет увеличение парацеллюллярной проницаемости клеток линии Т84, инфицированных энтеропатогенной Escherichia coli. Клетки человеческого кишечника линии Т84, инфицированные энтеропатогенной E.coli (штамм дикого типа), инкубировали с Lactobacillus casei DEFENSIS. Использовали два метода: совместное инкубирование (патогенный и пробиотический штаммы одновременно инкубировали с клетками Т84) и постинфекционный (пробиотик добавляли через 3ч после инфицирования патогенными бактериями). Lactobacillus casei DEFENSIS привела к зависящему от дозы ингибированию снижения E.coli-индуцированного трансэпителиального сопротивления и перераспределению zonula occludens-1. Вместе с тем, L. casei, однако, не ингибировал адгезию патогенного штамма. Lactobacillus casei DEFENSIS ингибировал увеличение индуцированной энтеропатогенными кишечными палочками парацеллюлярной проницаемости. Это свойство может частично объяснить наблюдавшееся положительное влияние на здоровье этого пробиотика действием на естественные защитные силы человеческого организма, например, на механизмы, связанные с предотвращением диареи. Было показано, что Lactobacillus casei DEFENSIS ингибирует способность Escherichia coli, выделенной у пациентов с болезнью Крона, к адгезии и инвазии в эпителиальные клетки кишечника. Эффекты ингибирования у Lactobacillus casei DEFENSIS были определены после совместного инкубирования с E.coli, прикрепляющейся по механизму адгезии инвазивных микроорганизмов, или после предварительного инкубирования кишечных клеток с L. casei перед инфицированием данными штаммами E.coli. (Ingrassia I. et al., 2005). Ингибирующее влияние L. casei на прикрепление адгезионной формы инвазивной E.coli к дифференцированным и недифференцированным эпителиальным клеткам кишечника достигало 75-84% при совместном инкубировании и 43-62% в эксперименте с предварительным инкубированием, в зависимости от линии использованных клеток. Добавление Lactobacillus casei DEFENSIS и его надосадочной жидкости в инкубационную среду увеличивало адгезию Lactobacillus casei DEFENSIS к клеткам кишечного эпителия и усиливало ингибирующие свойства Lactobacillus casei DEFENSIS. Ингибирование инвазии E.coli происходило параллельно с подавлением ее адгезии. Этот эффект происходил не из-за бактерицидного влияния на адгезионную форму инвазивной E.coli или цитотоксических эффектов на клетки кишечного эпителия. 1. Влияние Actimel на параметры иммунной системы. 4.1.Влияние Actimel на кишечную лимфоидную ткань. В исследовании Medici M. et al. (2005) было показано, что Actimel предотвращает инфицирование мышей Escherichia coli. Этот опыт был проведен на мышах, которых кормили в течение 2, 5 или 7 суток ферментированным молоком, в котором содержание Lactobacillus casei DEFENSIS, L.bulgaricus и Streptococcus thermophilus составляло 107 КОЕ/г, т.е. Actimel. Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов и число клеток, синтезирующих IgA+, в тонком и толстом кишечнике определяли в конце периода кормления. Результаты показали, что неспецифический иммунный ответ увеличивался после 5 суток постоянного употребления ферментированного молока (увеличение процента фагоцитоза и количества клеток, синтезирующих IgA+ в тонком кишечнике). У получавших Actimel животных наблюдалась более низкая колонизация печени E.coli, чем у контрольных мышей и более высокая концентрация секреторного анти-E.coli IgA в содержимом кишечника. Эти результаты показывают, что защита против энтероинвазивной инфекции, вызванной Е. coli, наблюдавшаяся в результате приема ферментированного молока, содержащего пробиотические бактерии, может быть связана с увеличением иммунитета слизистой кишечника. Показано, что колонизация слизистой кишечника Lactobacillus casei DEFENSIS уменьшает повреждение барьера, вызванное воздействием тринитробензолсульфокислоты. У крыс хирургическим путем исключили из транспорта кала участок кишечника (Llopis M. et al., 2005). После промывания просвета кишечника раствором антибиотиков, исключенный участок вновь колонизировали (контрольная группа: стандартная флора крысиного происхождения; экспериментальная группа: стандартная флора и Lactobacillus casei DEFENSIS). После этого вызывали колит введением тринитробензолсульфокислоты. У экспериментальных крыс обнаружена меньшая площадь повреждения слизистой, чем в контроле (р < 0,05). Доля максимальной глубины поражений была сходной в обеих группах, но миелопероксидазная активность была более низкая в экспериментальной группе, чем в контрольной (р < 0,05). Примечательно, что транслокация бактерий была количественно более низкой (р < 0,01) и менее частой (р < 0,05) в экспериментальной группе в сравнении с контрольной. Это исследование продемонстрировало, что у крыс, колонизированных Lactobacillus casei DEFENSIS, повреждения слизистой, воспалительный ответ, и разрушение барьера после обработки тринитробензолсульфокислотой были уменьшены. Бактериальные сообщества, колонизирующие слизистую оболочку, могут модифицировать воспалительный ответ на повреждения кишечника. В эксплантатах слизистой пациентов с болезнью Крона штамм Lactobacillus casei DEFENSIS способствовал уменьшению образования TNF- (маркер воспаления). В двух исследованиях in vitro на воспаленной и невоспаленной ткани в результате применения Lactobacillus casei DEFENSIS уменьшалось спонтанное выделение слизистой TNF-, ИЛ-8 и ИЛ10 и предотвращалась воспалительная сверхреакция на непатогенный штамм Е. coli. Actimel модулирует иммунный ответ на воспаленных тканях, полученных от пациентов с болезнью Крона. Оказалось, что выделение воспалительных цитокинов играет роль при инициировании воспалительных заболеваний кишечника. Например, TNF- является маркером болезни Крона. Для оценки влияния Actimel на модулирование воспалительного ответа исследование было выполнено при совместном культивировании бактерий и биопсийных тканей кишечника от пациентов с болезнью Крона (Borruel N. et al., 2002). Эксплантаты слизистой от 10 пациентов культивировали in vitro в течение 24 ч в присутствии 4 штаммов бактерий: неэнтеропатогенной Е. coli, L. bulgaricus LB10, L. chspatus и L. casei DEFENSIS. При последующем совместном культивировании были выделены лимфоциты кишечника, и была определена концентрация TNF- в культуральной жидкости. Результаты показали, что L. casei DEFENSIS уменьшает образование TNF- в воспаленной ткани. Соответствующее уменьшение концентрации CD4+ лимфоцитов и лимфоцитов, синтезирующих TNF-, предполагает, что существует взаимодействие между бактериями и эпителием, а также что бактерии способны изменять степень активации иммунных клеток кишечника во время воспаления. L casei DEFENSIS значимо снижал спонтанное выделение слизистой воспалительных цитокинов TNF-α, ИЛ-8 и ИЛ-10, как показано в исследовании на невоспаленной ткани (Borruel N. et al., 2003). Было также возможным предотвратить сверхреакцию воспаления на непатогенный штамм Escherichia coli. Были испытаны 4 штамма Lactobacilli: L casei DEFENSIS, L. casei DN-114 056, L. casei ATCC 334 и L. bulgaricus LB10. Для приведения клеток в состояние воспаления использовалась Escherichia coli. Каждый штамм культивировался в течение 24 ч совместно со здоровой кишечной тканью, полученной от девяти пациентов с раком кишечника. Эксперименты со смешанными культурами L. casei DEFENSIS и Е. coli показали снижение уровня TNF-α, показывая, что L. casei DEFENSIS может предотвращать воспалительную реакцию, вызванную грам-отрицательным штаммом. Эти два исследования показали, что L casei DEFENSIS способна специфически взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками слизистой кишечника и изменять выделение воспалительных цитокинов, таким способом влияя на природные механизмы защиты слизистой. В исследовании Tien M.T. et al. (2006) обнаружено, что L casei DEFENSIS оказал противовоспалительное действие на эпителиальные клетки кишечника человека, инфицированные Shigella. Эпителиальные клетки, культивированные с L. casei DEFENSIS, заражали Shigella flexneri. L. casei DEFENSIS уменьшал транскрипцию ряда генов, кодирующих эффекторы воспаления, такие как цитокины, хемокины и адгезивные молекулы, индуцированные инвазией S. flexneri. Противовоспалительное влияние связано с ингибированием пути синтеза NF-αB. Кишечный эпителий, в особенности в месте Пееровых бляшек, является воротами для системного иммунного ответа. Влияние Actimel (или Lactobacillus casei DEFENSIS, в зависимости от протокола) на общую иммунную систему будут рассмотрены ниже. 4.2. Влияние Actimel на общую иммунную систему Actimel (и/или Lactobacillus casei DEFENSIS, в зависимости от протокола) может влиять на активность иммунной системы, как кишечной, так и общей. Это влияние продемонстрировано на различных экспериментальных моделях, которые разработаны так, чтобы «дестабилизировать» эту иммунную функцию, либо путем подавления (физический или психологический стресс), либо путем индуцирования (воспаление, инфекция, сенсибилизация). Actimel может увеличивать восстановление «нормального» функционирования, т.е. привести в состояние, бывшее до дестабилизации. 4.2.1. Обзор результатов исследований: * Показано, что у мышей L. casei DEFENSIS активен в тесте с контактной сенсибилизацией, приводя к 50% уменьшению воспаления, вызванного раздражающим веществом, и к ингибированию специфического ответа CD8+ Т эффекторов. * При обследовании людей показано, что Actimel повышает естественные защитные силы у здоровых людей среднего возраста. * Выявлено, что у людей, употреблявших молоко, ферментированное L. casei DEFENSIS во время интенсивной свидетельствуя, физической активности, снижается количество NK-клеток, что L. casei DEFENSIS может регулировать иммунный ответ во время физической тренировочной нагрузки. * В исследовании группы студентов университета показано, что Actimel модулирует подавление иммунитета, вызванное психологическим стрессом, путем увеличения числа лимфоцитов и уменьшения снижения NK-клеток. 4.2.2. Модели на животных Исследование продемонстрировало, что прием Actimel способствует уменьшению реакции контактной чувствительности у нормальных мышей на 50%. Из результатов следует, что Actimel может оказывать иммуномодуляторное действие на воспалительную реакцию, опосредованную CD8+ Т-клетками посредством влияния на регуляторные CD4+ Т-клетки (Chapat L. et al., 2004). В этом исследовании мышам давали Actimel или воду в течение 7, 14 или 21 суток перед сенсибилизацией экспериментальным раздражающим веществом, динитрофторбензолом. Это продолжалось на протяжении всего исследования, вплоть до момента измерения отека ушей (измерение использовалось для оценки интенсивности воспалительной реакции). У мышей, которые получали Actimel в течение 21 суток и 14 суток до сенсибилизации, наблюдалось 50% ингибирование интенсивности воспалительной реакции. Если скармливание перед сенсибилизацией продолжалось всего 7 суток, эффекта не наблюдалось. 4.2.3. Клинические исследования Parra D. и соавт. (2004) опубликовали результаты проспективного одноцентрового двойного слепого контролированного исследования, целью которого являлось изучение влияния употребления Actimel на способность к иммунному ответу у добровольцев среднего возраста. После «очистительного» периода продолжительностью 3 недели, в течение которого испытуемые не употребляли ферментированные молочные продукты, 45 здоровых добровольцев в возрасте от 51 до 58 лет были случайным образом распределены в группы, употреблявших либо 3 чашки Actimel в сутки (группа А, n = 23), либо плацебо, состоящее из неферментированного молока без живых организмов (группа В, n = 22). Каждая чашка содержала 95 г продукта, который нужно было принимать в течение 8 недель. Исследовались метаболические и иммунные биомаркеры, кроме того был проведен анализ субпопуляций лимфоцитов, а именно функционирование моноцитов, гранулоцитов и NK-клеток. Пищевые и иммунологические параметры оценивались до (день 0) и после 8-недельного периода исследования (день 56). Исследование метаболизма показало, что никаких изменений не наблюдалось в обеих группах после исследования массы тела и биохимических показателей. Не изменилось также общее содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула. Вместе с тем, противоопухолевая активность NK-клеток достоверно увеличилась у добровольцев в группе А; авторы подчеркнули, что такие достоверные результаты были получены, когда соотношение NKклетки: опухолевые клетки составляло 12:1 (р = 0,042) и 25:1 (р = 0,023). По завершению исследования в группе В, употреблявшей плацебо, не было обнаружено никаких изменений как в пропорциях иммунных клеток обеих групп, так и в активности моноцитов (р = 0,625). Однако у добровольцев группы А, которая получала пробиотики, кислород-зависимая окислительная активность моноцитов достоверно увеличивалась ( р = 0,029). Это увеличение было обратно пропорционально интенсивности этого параметра, зарегистрированной до начала эксперимента (r = -0,653, р = 0,004). По мнению авторов ежедневное употребление молока, ферментированного Lactobacillus casei, влияет на регулирование окислительной активности субпопуляции моноцитов у здоровых людей среднего возраста, особенно утех, кто на начальном этапе имел более низкие показатели; считают, что можно предлагать данную стратегию питания для поддержания иммунокомпетентности в процессе старения. Исследования, проведенные Pujol P. и соавт. (2000) на спортсменах, показали, что Actimel может модулировать врожденный клеточно-опосредованный иммунный ответ во время интенсивных физических нагрузок. Интенсивные физические упражнения, как известно, подавляют иммунную систему, в особенности NK-клетки (Shinkai S. et al., 1992; Pedersen B.K. a. Ullum H., 1994). Для исследования были отобраны 25 спортсменов, у которых через 2 ч после интенсивной тренировки наблюдалось значимое снижение уровня NK-клеток. Участники употребляли 500 мл Actimel в сутки в течение 30 суток с последующим 30-дневным периодом «очищения», а затем — 30 суток обычное молоко. Таким образом, каждый испытуемый служил «контролем» для себя самого. В конце каждого периода приема продукта (день 30 и день 90) испытуемые проходили исследование, в котором замерялись характеристики иммунитета перед тренировкой, через 5 и 120 мин после нее. Наблюдалось значимо меньшее снижение концентрации NK-клеток через 2 ч после тренировки, когда спортсмены употребляли Actimel (13,4%) по сравнению с периодами употребления обычного молока (5,24%) Изучая изменения иммунитета, вызванного психологическим стрессом, Marcos A. et al. (2004) показали, что употребление Actimel способствовало увеличению количества лимфоцитов в крови и уменьшению степени снижения численности NK-клеток. Исследование, включающее студентов университета, началось за 3 недели до начала экзаменов и продолжалось на протяжении трехнедельного экзаменационного периода. Одна группа (75 студентов) принимала по 2 бутылочки Actimel в сутки в течение б недель, другая группа (63 студента) употребляла 1 стакан снятого молока в сутки. Во время исследования средняя тревожность увеличивалась примерно одинаково в обеих группах (40—61%), но количество лимфоцитов уменьшалось в контрольной группе и увеличивалось в группе, принимавшей Actimel. Кроме того, имело место значимое уменьшение CD56+ клеток в контрольной группе, тогда как в группе, принимавшей Actimel, количество этих NK-клеток не уменьшалось. Несколько клинических исследований продемонстрировали общее влияние на здоровье употребления Actimel благодаря его способности укреплять защитные силы организма.Так, по данным Pedone C.A. и соавт. (1999), употребление Actimel приводило к значительному уменьшению продолжительности заболевания диареей у маленьких детей, посещавших детские сады во Франции. Целью этого исследования было установить влияние употребления молока, ферментированного йогуртовыми культурами совместно с L. casei DEFENSIS на течение острой диареи. При шестимесячном предварительном исследовании случайным образом определили 287 детей в возрасте от 3 до 36 месяцев в одну из трех групп: принимавших йогурт, молочное желе или молоко, ферментированное L. casei DEFENSIS. Это исследование было проведено в зимнее время, когда обычно наблюдается эпидемия гастроэнтерита. Оно началось с периода приема добавок продолжительностью 1 месяц (125 г или 250 г ежедневно в зависимости от возраста ребенка) с последующим периодом в 1 месяц без приема добавок. Эти циклы повторялись трижды. В данном исследовании диареей считали 3 и более жидких стула в течение 24 ч, а острой диареей считали заболевание, длившееся меньше 2 недель; период нормализации определялся как интервал между последним жидким стулом и стулом нормальной консистенции. Индекс диареи был средним значением числа случаев заболевания диареей. Во время первых трех месяцев исследования у 69 детей (26%) из всей группы наблюдались эпизоды диареи, причем у большинства из них (84%) — только один эпизод. Хотя эпизоды диареи не различались значимо в исследуемых группах, продолжительность каждого эпизода диареи была значимо короче в группе, принимавшей Actimel (3,9±2,4 суток), по сравнению как с группой, принимавшей йогурт (4,8±2,3 суток), так и с группой, принимавшей молочное желе (6,9±3,0 суток). Кроме того, третий период нормализации был короче в группе, принимавшей Actimel (l,2±l,0 суток) чем в группах, принимавших йогурт или молочное желе (соответственно 2,0±1,6 суток и 2,6±2,4 суток). Другое исследование, проведенное в Индии и также посвященное изучению тяжести диареи, было уникальным в том, что оно оценивало влияние Actimel на детей, которым поставлен диагноз острой диареи, и которые находились под медицинским наблюдением (Agarwal S.K. a. Marshall G.D., 2001). В этом исследовании сравнивалось влияние молока, ферментированного L casei DEFENSIS (Actimel), с влиянием кислого молока, сквашенного в соответствии с местными традициями (Dahi), на тяжесть и продолжительность заболевания диареей у маленьких детей. Трехмесячное исследование было проведено в двух группах детей в возрасте от шести месяцев до 5 лет с острой диареей. Одна из этих групп была помещена в педиатрическое отделение, а другая — в клинику. Каждая группа была разделена на три подгруппы по 25 детей в каждой, получавших по 100 мл добавки либо Actimel, либо Dahi, либо термически обработанного йогурта (без живых бактерий) трижды в течение суток. У детей наблюдалась диарея разных степеней тяжести продолжительностью от одних суток (43%) до 5 суток (1,1%). В целом, диарея более эффективно подавлялась у детей, получавших Actimel, но этот эффект был статистически значим только у детей, госпитализированных в педиатрическое отделение. У 40,4% детей, принимавших Actimel в больнице, эпизоды диареи ограничились 1,5±0,5 сутками в сравнении с 2,07±0,75 сутками для группы, принимавшей термически обработанный йогурт, и 2,00±0,60 сутками в группе, принимавшей Dahi. В работе Pujot P. et al. (2000) показано, что Actimel может уменьшать число случаев заболевания диареей у маленьких детей. 928 детей в возрасте от б до 24 месяцев, включенных в исследование, были разделены на 2 группы: одна получала Actimel (463 ребенка), другая — йогурт (465 детей). Во время 12-недельной стадии приема число детей с диареей было значительно ниже (р = 0,029) в группе, принимавшей Actimel (15,9%), в сравнении с группой, принимавшей йогурт (22%). Во время 6-недельной стадии наблюдения 1,9% детей из группы, принимавшей Actimel, страдали диареей в сравнении с 3,8% случаев среди детей, принимавших йогурт, разница не была статистически значимой. В отношении продолжительности заболевания диареей не было статистически значимой разницы между группой, принимавшей Actimel (3,95±2,30 суток) или йогурт (3,53±2,09 суток). Во время стадии употребления добавок процент детей, у которых был выявлен ротавирус, снизился с 5,21% до 0,29% в группе, принимавшей Actimel, и с 4,81% до 2,2% в группе, принимавшей йогурт. Кроме того, стул у всех принимавших добавки детей был богаче Lactobacilli, в особенности в группе, принимавшей Actimel. Активность ферментов также изменялась на протяжении исследования с двукратным снижением активности р-глюкуронидазы (32,5%) в группе, принимавшей Actimel по сравнению с группой, принимавшей йогурт (15%). Таким образом, это исследование продемонстрировало, что употребление Actimel способствует значительному уменьшению числа случаев заболевания диареей у маленьких детей в сравнении с употреблением только стандартного йогурта. Этот эффект, однако, перестает наблюдаться во время прекращения приема пробиотической пищи, показывая, что регулярное употребление Actimel необходимо для поддержания его полезных эффектов. В исследовании также установлено, что количество детей, у которых был выявлен ротавирус, было ниже в группе, принимавшей Actimel. Исследование Guerin-Danan (1998) кала, взятого у детей, показало, что те, кто принимал Actimel, имели более благоприятные соотношение и метаболическиe характеристики кишечной флоры в сравнении с группой детей, не принимавших Actimel. Turchet P. и соавт. (2003) опубликовали результаты предварительного исследования, включившего 360 людей в возрасте старше 60 лет, в котором показали, что Actimel может сокращать продолжительность зимних инфекций. Этот положительный эффект может происходить из-за улучшения эффективности функционирования общей иммунной системы, связанной с иммунной системой кишечника, которая, в свою очередь, зависит от кишечной флоры. В одноцентровом рандомизированном контролируемом испытании, одна группа принимала по две бутылочки Actimel ежедневно в течение 3 недель, другая не принимала этого продукта. Участникам не позволялось употреблять более 2 порций в неделю ферментированных молочных продуктов. Равное количество человек (82) в обеих группах были вакцинированы против гриппа за 3 месяца до исследования. Продолжительность болезни была на 20% ниже в группе, употреблявшей Actimel (7,0±3,2 суток), чем в контрольной группе (8,7±3,7 суток) со статистически значимой разницей (р = 0,024). В невакцинированных подгруппах разница в продолжительности была на границе значимости. Максимальная температура тела при всех заболеваниях была также ниже в группе, принимавшей Actimel, по сравнению с контрольной группой (38,3±0,5°С против 38,5±0,5°С). Это соответствует снижению среднего значения температуры в сравнении с нормальным (37°С) приблизительно на 13%. Однако, не наблюдалось статистически значимой разницы между двумя группами в плане частоты исследуемых зимних заболеваний. Результаты этого исследования показали, что употребление Actimel приводит к снижению тяжести (продолжительности и максимальной температуры) зимних заболеваний. Это означает, что Actimel может увеличивать природные защитные силы против инфекций у здоровых пожилых людей, которые имеют относительно высокий риск инфекции. Интересное исследование было проведено Sykora J. и соавт. (2005). Авторы пытались установить, может ли употребление Actimel способствовать ликвидации Н. pylori у детей, проходивших лечение гастрита по методу тройной терапии. 96 Н. pylori-положительных детей с соответствующими симптомами были случайным образом разделены на контрольную, получающую терапию только омепразолом, амоксициллином и кларитромицином (OAK) в течение 7 суток, и экспериментальную группу, где терапия OAK в течение 7 суток сопровождалась употреблением Actimel в течение 14 суток. Контрольная группа принимала плацебо (неферментированное пастеризованное молоко). Тесты на наличие Н. pylori проводили через 4 недели после терапии с использованием неинвазивных методов. Инфекция Н. pylori считалась ликвидированной, если одновременно результаты анализа кала на антигены и анализа выдыхаемого воздуха на 13 СО2 с использованием 13 С- мочевины были отрицательными через 4 недели после лечения. Результаты этих анализов обрабатывались слепым методом, исследователями, не знакомыми с результатами других исследований, а также со схемой эрадикации. Степень эрадикации достигла 91,6% в группе, принимавшей Actimel, против 61,3% в группе с терапией OAK. Первоначальная устойчивость к кларитромицину наблюдалась у 10 испытуемых. 5 из 6 испытуемых были вылечены в группе с резистентными штаммами, принимавшей Actimel, по сравнению с 1 из 4 испытуемых в контрольной группе. Это исследование показало, что употребление Actimel увеличивает полноту эрадикации и способствует успешному проведению эрадикационной тройной терапии, направленной на ликвидацию Н. pylori у детей с гастритом. Отт В.Д. и Мисник В.П. (2004) в открытом, проспективном медицинском исследовании изучали пробиотическую эффективность кисломолочного продукта Actimel в питании детей дошкольного возраста. Под наблюдением находилось 33 ребенка в возрасте от 4 до 8 лет. Критерии включения пациентов в исследование: - периодическое появление симптомов пищеварительного дискомфорта (лабильный аппетит, метеоризм, кишечная колика, неустойчивый стул и т.д.); - адекватное физическое развитие; - отсутствие острого или хронического заболевания, в том числе желудочнокишечного; - отсутствие в анамнезе аллергии на белки коровьего молока или непереносимости лактозы; - отсутствие иммунодефицитного состояния. Продолжительность применения продукта составляла 6 недель. На период наблюдения из диеты детей были исключены все другие виды кисломолочных продуктов (кефир, биокефир, йогурт и др.), а также биопрепараты. Наблюдение проводилось в амбулаторных условиях. Дети ежедневно получали два раза в день по 100 мл Actimel (без добавок) – во время завтрака и на ужин. Клинический мониторинг детей осуществлялся каждые две недели наблюдения. Все лабораторные исследования проводились перед началом введения в рацион детей продукта Actimel и после завершения наблюдений. Количественный бактериологический анализ фекалий на дисбактериоз проводили дважды путем посева серийных разведений кала на дифференциально-диагностические среды (Метод. рекомендации №10-13/31 14/IU, 1986): исходный – до введения в рацион питания кисломолочного продукта Actimel и заключительный – через 10-14 дней после окончания его применения. Таким образом, первое исследование служило базовым значением, а результат второго исследования характеризовал клиническую эффективность применявшегося продукта. Исследование рН копрофильтрата проводили на аппарате Acidimetr-333 (ЧНР). Полученные результаты свидетельствуют, что кисломолочный продукт Actimel является достаточно эффективным продуктом функционального питания. Он оказывает выраженное положительное влияние на общее и эмоциональное состояние детей, аппетит, соматические показатели и способствует убыванию симптомов пищеварительного дискомфорта, обусловленного дисбактериозом кишечника. Включение кисломолочного продукта Actimel в рационы питания детей с явлениями кишечного дисбиоза приводит к увеличению популяции бифидо- и лактофлоры, уменьшению степени колонизации, вплоть до полной элиминации условнопатогенных бактерий, таких как стафилококки, грибы рода Кандида, стрептококки, представители рода энтеробактерий, клебсиелла. Использование кисломолочного продукта с пробиотическими свойствами у детей с функциональными запорами способствует нормализации консистенции стула и частоты дефекации. Также выявлено благотворное влияние регулярного употребления продукта Actimel на общее состояние детей, естественные защитные функции организма, что, в свою лчередь, способствует повышению устойчивости к заболеваниям, в том числе и желудочнокишечным. А.В. Горелов и Д.В. Усенко (2003) изучали влияние пробиотического продукта Actimel на состояние здоровья детей. Под наблюдением находилось 400 детей в возрасте от 3 до 8 лет. Работа проводилась в рамках Международного многоцентрового исследования по специальному протоколу. Дети в течение 6 недель ежедневно употребляли во время завтрака 1 бутылочку Actimel. Каждый ребенок осматривался педиатром 1 раз в 2 недели. В течение 1,5 мес. после окончания исследования проводилось катамнестическое наблюдение за 50 детьми. Все участвовавшие в исследовании дети не имели хронических заболеваний, аллергии к белкам коровьего молока или непереносимости лактозы, не находились на стационарном лечении в течении 6 недель, предшествующих исследованию. Кроме того, на время исследования исключался прием ребенком препаратов, положительно влияющих на показатели иммунитета. На основании анализа данных, полученных в ходе исследования, авторы сделали следующие выводы: - ежедневное употребление на протяжении 6 нед 1 бутылочки кисломолочного пробиотического продукта Actimel улучшает общее состояние детей, повышает активность, аппетит, облегчает просыпание по утрам, при этом наиболее выраженные положительные сдвиги отмечаются у «ослабленных детей»; - на фоне включения в рацион питания Actimel отмечено снижение числа обращений к врачам по поводу различных заболеваний, в первую очередь – ОРЗ и ЛОР-заболеваний; - дети стали меньше предъявлять жалоб, связанных с задержкой стула и диареей; - родители детей, участвовавших в исследовании, стали уделять больше внимания рациону питания, что отразилось в увеличении доли «здоровых завтраков», а у части детей способствовало продолжению постоянного употребления кисломолочного пробиотического продукта Actimel. J.M. Cobo Sanz et al. (2006) изучали влияние Actimel на частоту инфекционных заболеваний у детей. Всего под наблюдением находился 251 ребенок в возрасте от 3 до 12 лет, обоего пола. Исследование проводилось в течение 20 недель как параллельное, проспективное, двойное слепое, рандомизированноеж 142 человека получали дважды в день Actimel 109 – получали плацебо. Все, участвовавшие в исследовании дети, обследовались через 12, 16 и 20 недель. Анализ полученных результатов показал, что в группе детей, получавших Actimel, частота инфекций нижнего отдела респираторного тракта (бронхиты или пневмония) была достоверно ниже (32%), чем у детей в группе плацебо (49%). Отметили также достоверно реже встречавшиеся признаки хронической усталости у детей, получавших Actimel (3% против 13% в группе плацебо). Alexa L. Meyer et al. (2006) изучали влияние пробиотического продукта, содержащего L. casei defensis (DN 114001), L. delbruckii subsp – bulgaricus a streptococcus termophilus, на клеточный иммунитет у здоровых женщин в возрасте от 22 до 29лет. Эксперимент длился 7 недель. В первую неделю эксперимента испытуемые не употребляли никакие пробиотические продукты; затем в течение 2-х недель они принимали по 100г продукта в день; после этого, еще в течение 2-х недель количесвто принимаемого продукта увеличивали до 200г/д, и наконец в последние 2 недели, испытуемые вновь не принимали никаких пробиотических продуктов. Кровь брали после 1й недели (базовый уровень), 3й, 5й и 7й недели. Анализ полученных данных показал, что на всех этапах приема пробиотического продукта количество количество СД3+СД16+СД56+ (цитотокисческие NKT-лимфоциты) было достоверно повышенным по сравнению с базовым уровнем. Авторы делают вывод, что ежедневное употребление указанного продукта оказывает достоверный стимулирующий (до 32,7%) эффект на иммунные функции. Интересные данные были представлены C.Schiffer-Mannjoni et al (2007) на Всемирном конгрессе аллергологов в Бангкоке (Тайланд, 2-3 декабря). Авторы изучали способность in vitro L. casei defensis ингибировать IgE-индуцированную активацию моноцитов. Опыты показали, что облученные L. casei defensis способны подавлять IgE-индуцированную активацию тучных клеток. Ингибиция для своего проявления требовала контакта между тучными клетками и Lactobacillus; ее эффект был обратим. Авторы считают, что механизмы, лежащие в основе ингибиции, не связаны с активацией Toll-like рецепторов и MyD88 зависимого трансдукционного пути; считают, что это ингибирование обусловлено влиянием на FcεRI сигнальный каскад. Делают вывод, что регулярный прием пищевых пробиотических продуктов (ферментированного молока), содержащих L. casei defensis, может оказывать протективный эффект от аллергических реакций.