Заключение - Институт токсикологии
реклама
на правах рукописи Дагаев Сергей Глебович Роль подтипов М-холинорецепторов в лечебном эффекте холинолитиков при экспериментальном паркинсонизме (галоперидоловая модель) 14.00.25 — фармакология, клиническая фармакология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2007 Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении Науки «Институт Токсикологии» Федерального Медико-биологического Агенства Научные руководители Доктор медицинских наук профессор Космачев Алексей Борисович Доктор медицинских наук Саватеева-Любимова Татьяна Николаевна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук профессор Лосев Николай Андреевич Доктор медицинских наук профессор Лапин Изяслав Петрович Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия МО РФ Защита диссертации состоится « 15 » мая 2007 г. в « 11 » часов на заседании Диссертационного совета Д 208.030.01 при ФГУН Институт Токсикологии ФМБА (192019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, д. 1) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Институт Токсикологии ФМБА Автореферат разослан « » апреля 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук Т. Н. Саватеева-Любимова 2 Введение Актуальность исследования: нарушение функций холинергического отдела нервной системы лежит в основе или сопутствует возникновению многих патологических состояний, к которым можно отнести паркинсонизм (Werneck G., 1997; Яхно Н. Н., Нодель М. Р., 2000), болезнь Альцгеймера (Рамш С. М., Петров А. Н., 1999; Takada-Takatori Y. et al., 2007; Keverne J. et al., 2005), некоторые нарушения сердечного ритма (Steve B., Mark E. D., 1999; Giessler C. et al, 1999; Xiao-Li Xu et al., 2006), язвенную болезнь (Машковский М. Д., 2005), отравления антихолинэстеразными ядами (Прозоровский В. Б., Саватеев Н. В., 1976; Крылов С. С. и др., 1999; Куценко С. А., 2004) и другие виды патологии (Fukutake T. et al., 1993). В связи с этим, холинергические лиганды, в частности блокаторы мускариновых рецепторов (синонимы: М-холинолитики, М-холиноблокаторы), находят широкое применение в качестве лекарственных средств. Среди лекарственных средств, применяемых для коррекции экстрапирамидных расстройств, важное место принадлежит препаратам, обладающим центральной холиноблокирующей активностью (McEvoy J. P., 1983). Наибольшее распространение получило применение таких М-холиноблокаторов как тригексифенидил (циклодол, паркопан, апо-трайгекс), а также близких по структуре и активности препаратов — трипериден (норакин) и бипериден (акинетон). Реже используются бенактизин (амизил, актозин, и т. д.), дифенилтропин (тропацин), дексетимид (тремблекс). До 1989 года применялся отечественный препарат амедин. В основе терапевтического действия мускариновых антагонистов так же, как и при возникновении побочных реакций, лежит их взаимодействие со специфическими биологическими мишенями — М-холинорецепторами. Кроме того, необходимость длительного применения холинонегативных препаратов также приводит к развитию «нежелательных» эффектов. В основном, речь идет о проявлениях их периферического антихолинергического действия. В связи с этим, разработка новых лекарственных средств из указанной группы 3 должна быть, прежде всего, направлена на поиск веществ, обладающих высокой эффективностью, наряду с их безопасностью. В настоящее время взгляды на использование мускариновых антагонистов в терапевтических целях претерпели существенные изменения в связи с развитием представлений о гетерогенности мускариновых рецепторов. Согласно этому представлению, мускариновые рецепторы в организме животных и человека образуют гетерогенную популяцию, состоящую из 5 генетически обусловленных подтипов. Подтипы мускариновых рецепторов отличаются химическим строением, расположением на различных частях нейрона, особенностями тканевой локализации, системой вторичных посредников и др. Одним из путей повышения эффективности и безопасности М-холинолитиков явилось создание селективных антагонистов. Эта задача достаточно успешно решалась для веществ, обладающих периферическим действием. Появились высокоэффективные противоязвенное (пирензепин) и бронхолитическое (атровент) средства. Однако, поиск селективных центральных М-холинолитиков пока серьезных результатов не принес. Причиной этого явилась фрагментарность сведений о распространенности подтипов М-холинорецепторов в мозге и их роли в организации его работы. Поэтому, для успешного поиска средств, обладающих необходимым профилем избирательности для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией холинергической системы, необходимо изучение роли отдельных подтипов мускариновых рецепторов в механизмах развития патологии ЦНС и особенностей влияния на них потенциальных лекарственных препаратов. Цель исследования: поиск антипаркинсонических средств из числа ацетиленовых аминоспиртов на базе изучения профиля их избирательности в отношении отдельных подтипов мускариновых рецепторов. Задачи исследования: 1. Провести скрининг активности соединений из ряда ацетиленовых аминоспиртов по их способности предупреждать развитие экстрапирамидных нарушений на модели нейролептического паркинсонизма. 4 2. Изучить профиль фармакологической избирательности соединений из ряда ацетиленовых аминоспиртов в сравнении с М-холиноблокаторами из других химических групп в экспериментах на крысах. 3. Разработать способы оценки активности мускариновых антагонистов в отношении М4-холинорецепторов in vivo. 4. Определить роль блокады М4-холинорецепторов в противопаркинсонической активности соединений в опытах на крысах. 5. Оценить взаимодействие пентифина, соединения из ряда ацетиленовых аминоспиртов, с дофаминовыми рецепторами in vitro и in vivo. 6. Сопоставить антипаркинсоническую активность М-холиноблокаторов с их влиянием на высвобождение ацетилхолина в стриатуме крыс. Научная новизна работы: Настоящее исследование продолжает цикл работ, направленных на поиск препаратов, предназначенных для лечения паркинсонизма, а также на выяснение механизмов их лечебного действия. Новизна определяется тем, что в ней впервые установлена роль блокады М 4-холинорецепторов в лечебном действии препаратов при экспериментальном паркинсонизме. Впервые обнаружено выраженное избирательное М 4-холинолитическое действие у производных ацетиленовых аминоспиртов. Выявлена связь между способностью соединений блокировать М4-холинорецептор и их антипаркинсонической активностью. Доказана перспективность поиска новых антипаркинсонических средств среди холинолитиков, в частности, производных ацетиленовых аминоспиртов. Практическая значимость работы: В ходе проведения исследования был разработан способ оценки степени блокады холинорецепторов, принадлежащих к подтипу М4. Сочетание указанного способа с ранее разработанными приемами для оценки состояния М1-, М2- и М3-холинорецепторов дало возможность оценить профили рецепторной избирательности ряда мускариновых антагонистов in vivo. 5 В ходе этих исследований были выявлены мускариновые антагонисты, проявляющие высокую избирательность в отношении М-холинорецепторов, принадлежащих к М4- и М1-подтипам. На два таких соединения получены соответствующие патенты. Кроме того, указанные соединения могут быть использованы в аналитических целях, как избирательные блокаторы М4- и М1- холинорецепторов. Соединения, проявляющие высокую фармакологическую избирательность по отношению к М4-подтипу, могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения в качестве средств для лечения паркинсонизма. Положения, выносимые на защиту: 1. Соединения из химической группы ацетиленовых аминоспиртов проявляют выраженную антипаркинсоническую активность. 2. Блокада М4-холинорецепторов играет значимую роль в антипаркинсонической активности мускариновых антагонистов. 3. Соединение пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М4. Апробация работы: Основные положения работы доложены и обсуждены: на XVIII съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 2001; на XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология», 2003; на 2-ом съезде токсикологов России, 2003; на конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты», 2004; на конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты», 2005; на European Neuropsychopharmacology 8th ECNP Regional Meeting, 2005; на конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзиматические основы деятельности центральной нервной системы», 2006; на V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения», 2006; на Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга», 2006. Публикации: материалы диссертации опубликованы в 19 печатных работах, по материалам диссертации оформлено 2 патента на изобретение. 6 Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, иллюстрирована 5 рисунками и 15 таблицами. Указатель литературы содержит 53 отечественных и 166 иностранных источника. Работа выполнена в рамках программы МЗ РФ, шифр 024, «Разработка научных основ медицинского обеспечения химической безопасности населения России», 2001–2005 гг. и грантов РФФИ № 00-04-49432, 2000–2002 гг. и № 03-0449696, 2002–2004 гг. Содержание работы Материалы и методы Эксперименты выполнены на 1800 белых нелинейных крысах-самцах. Животных содержали в условиях вивария. По завершении исследования крыс подвергали эвтаназии (эфирный наркоз). В случае необходимости взятия у животных тканей, операция производилась с применением общей анестезии; для взятия ткани мозга применяли гильотину. В работе анализируются материалы, полученные автором в ходе нескольких серий исследований на экспериментальных животных. Холиноблокирующую активность препаратов и их избирательность в действии на отдельные подтипы мускариновых рецепторов изучали в тестах предупреждения ареколинового и пилокарпинового тремора, пилокарпиновой саливации, а также не связанных с поведенческой активностью спонтанных тремольных движений нижней челюсти. Исследуемые холиноблокаторы вводили подкожно в 4–5 возрастающих по логарифмической шкале дозах за 30 минут до введения холинопозитивных веществ. Дозы ареколина (тремор), пилокарпина (тремор), пилокарпина (саливация) и пилокарпина (тремольные движения нижней челюсти) составили 17,0; 75,0; 35,0 и 4,0 мг/кг в/б, соответственно. В качестве модели экспериментального паркинсонизма использовали реакцию каталепсии, вызванную введением нейролептика галоперидола, который применяли в широком диапазоне доз от 0,3 до 10,0 мг/кг. Наблюдение за животными после введения галоперидола осуществляли в интервале 30–60 мин (60–90 мин при применении низких доз препарата). Исследуемые препараты 7 вводили за 30 минут до инъекции галоперидола. Результат учитывали в альтернативной форме (есть каталепсия — нет каталепсии). За наличие каталепсии принимали нахождение животного у бортика в «позе лектора» в течение двух минут. Для исключения эффекта обучаемости, каждую крысу тестировали на наличие каталепсии не более трех раз. Полученные данные использовали для расчета показателя ЕД50 М-холиноблокатора. Действие пентифина на дофаминовые, адреналовые и М-холинорецепторы исследовали на семявыносящих протоках, изолированных семенных пузырьках и отрезках тонкой кишки животных. Тест-объекты под нагрузкой помещали в термостатируемый аэрируемый раствор Тироде. Изменение тонуса тест-объекта регистрировали с помощью изометрического датчика на приборе «Hugo Basile», модели 4050, Италия. В качестве агонистов использовали дофамин, ацетилхолин и норадреналин. Препарат сравнения — SCH-23390, высокоселективный блокатор Д1-рецепторов. В работе был использован классический метод определения ацетилхолина в тканях животных (Crosland L., Slater P., 1968). Крыс декапитировали, на холоду выделяли стриатум мозга. После гомогенизации и обработки реактивами получали супернатант, содержащий «связанный» ацетилхолин; измерение концентрации которого производили биологическим методом на препарате спинной мышцы медицинской пиявки. Содержание ацетилхолина в пробах (в г × 10–7) относительно массы мозга (в г) определяли по формуле: (С × 10 × v)/p; где: C — концентрация ацетилхолина (г × 10–7/л); v — объем супернатанта (л); р — вес мозга (г); 10 — разведение супернатанта. Использовали М-холиноблокаторы атропин, глипин, амедин, амизил, циклодол, норакин, норглипин, пирензепин, метоктрамин, гексагидросиладифенидол, тропацин; призводные ацетиленовых аминоспиртов (шифр — СЛ), включая пентифин, впервые полученые в лаборатории синтеза лекарственных препаратов Института Токсикологии Кузнецовым С. Г. и Либманом Н. М., а также холинопозитивные вещества ареколин и пилокарпин. Для изучения воздействия на дофаминергическую систему применяли апоморфин, SCH-23390 и галоперидол. 8 Показатели EД50 и LD50 рассчитывали методом пробит-анализа. Полученные данные обрабатывали методами описательной статистики и регрессионного анализа. Сравнение средних величин проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты исследования и их обсуждение Изучение эффективности ряда соединений в тесте каталепсии и сопоставление ее с холиноблокирующей активностью Для ряда соединений были установлены среднеэффективные дозы в тесте по предупреждению развития экстрапирамидных нарушений (каталепсия), вызываемых однократным введением галоперидола в дозе 10,0 мг/кг в/б. Релевантность дозы нейролептика обусловлена предварительными исследованиями, в которых была определена среднеэффективная каталептогенная доза галоперидола (0,3 ± 0,025 мг/кг); среднесмертельная доза равнялась 44,7 ± 6,1 мг/кг. Доза галоперидола 10,0 мг/кг составляла приблизительно ¼ от LD50 и устойчиво вызывала токсические эффекты — экстрапирамидные расстройства (каталепсию) у экспериментальных животных. Сравнение среднеэффективных доз, необходимых для предотвращения развития специфического действия галоперидола, позволило сделать вывод, что четыре соединения из исследованных аминоспиртов обладают выраженной активностью. Так, пентифин в 53 раза активнее атропина; СЛ-28 и СЛ-22 — в 3 и 6 раз, соответственно. СЛ-23 по активности в этом тесте сравним с циклодолом; их эффективность превосходит активность атропина примерно в 4 раза (табл. 1). Оценку холиноблокирующей активности и сопоставление ее со способностью предотвращать развитие экстрапирамидых нарушений изучаемых соединений производили на основании данных ареколинового теста (табл. 2). 9 Таблица 1 Среднеэффективные дозы холиноблокаторов по их способности предупреждать развитие каталепсии (галоперидол 10,0 мг/кг в/б) Название соединения или его шифр Атропин Амедин Пентифин Циклодол Глипин Норакин Амизил Тропацин Норглипин СЛ-17 СЛ-18 СЛ-22 СЛ-23 СЛ-26 СЛ-28 СЛ-31 СЛ-32 n (кол-во животных) ЕД50, мг/кг (М±m) 132 36 42 36 34 36 32 46 36 24 36 18 52 36 36 36 18 1,230 ± 0,200 0,147 ± 0,020 0,023 ± 0,002 0,395 ± 0,04 0,340 ± 0,040 0,410 ± 0,050 0,960± 0,12 1,130 ± 0,060 11,200 ± 0,130 6,500 ± 1,500 14,100 ± 2,400 0,148 ± 0,080 0,325 ± 0,070 2,700 ± 0,350 0,074 ± 0,002 20,100 ± 10,200 10,300 ± 3,400 Таблица 2 Среднеэффективные дозы различных холиноблокаторов по их способности предупреждать развитие тремора (ареколин 17,0 мг/кг в/б) Название соединения или его шифр Атропин Амедин Пентифин Циклодол Глипин Норакин Амизил Тропацин Норглипин СЛ-22 СЛ-23 n (кол-во животных) ЕД50, мг/кг (М±m) 28 36 34 18 36 24 36 36 36 30 36 1,320 ± 0,100 3,580 ± 0,240 20,000 ± 0,610 22,400 ± 0,370 0,500 ± 0,004 3,070 ± 0,190 2,670 ± 0,350 21,400 ± 0,200 17,900 ± 1,900 18,700 ± 2,010 3,500 ± 0,040 Прямое сопоставление способности изученных соединений предупреждать развитие экстрапирамидных нарушений с их активностью в тесте ареколиново10 го тремора выявило отсутствие взаимосвязи этих эффектов: полученное регрессионное уравнение имело низкий уровень достоверности. Характеристика химического строения ацетиленовых аминоспиртов По химической структуре препараты из группы ацетиленовых аминоспиртов, представляют собой гидрохлориды замещенных ацетиленовых аминоспиртов бутинолов или пентинолов общей формулы: R1R2C(OH)CH2C ≡ CCH2Am • HCl, где R1 это C6H5; R2 — циклопентил или циклогексил; группа Am может представлять собой пиперидиновый остаток, либо может быть замещена на морфолиновый, диэтаноламиновый или диизопропиламиновый остаток. Для всех соединений этого ряда является характерным наличие тройной связи в основной углеродной цепочке, что обеспечивает способность молекулы к конформационным изменениям под влиянием зарядов, вводимых в молекулу радикалами R1, R2 и Am. Условием высокой активности соединения является наличие в его структурной формуле, в положении первого атома углерода, фенольного кольца (R1), а у концевого — пиперидинового остатка. Менее жесткие требования относятся к длине собственно углеродной цепочки (4–5 атомов углерода) и второму радикалу первого атома углерода (R2) — он должен являтся кольцевой структурой произвольной длинны. Изучение фармакологической избирательности исследуемых препаратов к подтипам М-холинорецепторов Основываясь на данных об участии в организации тремольных движений нижней челюсти холинорецептора М4-подтипа, локализованного в области стриатума (Mayorga A. J. et al., 1999), нами был разработан способ количественной оценки фармакологической активности соединений, обладающих холиноблокирующими свойствами в отношении М4-подтипа рецепторов. Суть предлагаемого способа заключалась в регистрации влияния возрастающих доз исследуемого соединения на количество движений нижней челюсти у крыс (ДНЧ), вызванных введением пилокарпина в тестовой дозе (4,0 мг/кг). 11 Используя разработанный метод определения фармакологической избирательности к М4- подтипу холинорецептора, провели изучение эффективности ряда холиноблокаторов. Было показано, что величина ЕД50 угнетающего влияния пентифина на выраженность специфических движений нижней челюсти крыс, индуцированных пилокарпином, составляла 0,14 ± 0,02 мг/кг (табл. 3). Эффективные дозы изученных холиноблокаторов — глипина, атропина, циклодола и других — находились в дипазоне 0,28–8,2 мг/кг. Проведенная экспресс-оценка позволила построить ранжированый ряд активности ацетиленовых аминоспиртов по их способности предупреждать специфическую активность (ДНЧ), вызванную введением пилокарпина: ЕД50 > 20,0 мг/кг (СЛ-15, 18, 19, 20, 21, 29, 31, 35); 20 > ЕД50 > 10,0 мг/кг (СЛ-27, 30, 32, 34, 37); 10,0 > ЕД50 > 1,0 мг/кг (СЛ-16, 17, 22, 24, 25, 33, 36); ЕД50 < 1,0 мг/кг (СЛ-23, пентифин). Для трех наиболее активных соединений этого ряда была определена среднеэффективная доза, предотвращающая миметический эффект пилокарпина, использованного в дозе 4,0 мг/кг (табл. 3). Таблица 3 Холиноблокирующая активность мускариновых антагонистов в отношении холинорецепторов М4-подтипа в тесте подсчета ДНЧ Препарат Атропин Глипин Амизил Норглипин Норакин Амедин Циклодол Тропацин Пентифин СЛ-22 СЛ-23 ЕД50, мг/кг (М ± м) 1,40 ± 1,12 0,28 ± 0,03 2,20 ± 0,54 8,20 ± 0,37 2,40 ± 0,08 0,56 ± 0,06 2,10 ± 0,19 5,60 ± 0,15 0,14 ± 0,02 3,55 ± 0,17 0,26 ± 0,09 Способность холинолитиков «нормализовать» количество ДНЧ в условиях действия пилокарпина изменяется следующим образом: пентифин > СЛ-23 > 12 глипин > амедин > атропин. Остальные соединения проявляют активность в дозах более высоких, чем атропин; их активность снижается в ряду циклодол > амизил > норакин. Наименьшая фармакологическая активность в отношении М4-холинорецепторов, по данному тесту, отмечена для трех препаратов — СЛ-22, тропацин и норглипин. Оценка избирательности мускариновых антагонистов, принадлежащих к различным группам химических веществ, в отношении М4- холинорецепторов в условиях in vivo Схема изучения фармакологической активности препаратов по их способности связываться с М- холинорецепторами определенных подтипов (М1–М3) и препятствовать развитию определенного паттерна поведенческой активности, при их преимущественной блокаде, была ранее предложена А. Б. Космачевым на основании ряда исследований с использованием тканей, с преимущественным содержанием рецепторов одного подтипа, гидробионтах и млекопитающих. При разработке набора тестов были решены задачи подбора дозы миметика, проведено доказательство связи наблюдаемой реакции с возбуждением определенного подтипа центрального М-холинорецептора. В таблице 4 приведены среднеэффективные дозы мускариновых антагонистов в фармакологических тестах по предупреждению пилокарпинового тремора, ареколинового тремора, пилокарпиновой саливации и ДНЧ, а также показатели М1/М4, М2/М4 и М3/М4, характеризующие их избирательность в отношении М4- холинорецепторов. 13 14 2,200±0,540 8,200±0,370 2,400±0,080 0,560±0,060 2,100±0,190 5,600±0,150 3,550±0,170 0,255±0,090 2,240±0,300 2,720±0,410 8,000±0,680 2,300±0,240 4,100±0,400 22,600±3,240 1,360±0,070 0,250±0,001 2,670±0,350 17,900±1,900 3,070±0,190 3,580±0,240 22,400±0,370 21,400±0,200 20,000±0,610 18,700±2,010 3,500±0,040 2,250±0,360 8,340±0,250 3,320±0,150 1,380±0,180 5,400±0,380 13,300±1,590 9,200±0,910 0,920±0,072 0,069±0,009 -22 -23 0,140±0,020 0,280±0,030 0,260±0,040 0,500 ±0,004 0,230±0,080 5,600±0,430 1,400±1,120 1,300±0,160 M4 1,320±0,100 M3 in vivo 1,240±0,130 / ) M2 , 50 M1 50 ( 4 0,3 0,3 65,7 2,4 2,6 2,5 1,4 1,0 1,0 0,8 0,9 M 1/M 4 - 13,7 5,3 142,9 3,8 10,7 6,4 1,3 2,2 1,2 1,8 0,9 M 2/M 4 4 1,0 0,4 40,0 4,0 2,0 4,1 3,3 0,3 1,0 0,9 0,9 M 3/M 4 Анализ данных, представленных в таблице 4 показывает, что атропин, глипин, амизил и норглипин не проявляют тропность по отношению к М4-подтипу холинорецепторов. Амедин, циклодол, тропацин, пентифин, СЛ-22, СЛ-23 проявляют более выраженную избирательность к М4-рецепторам, чем к М2-подтипу. Кроме того, следует отметить, что амедин и тропацин характеризуются более выраженной избирательностью к М4-холинорецепторам нежели к рецепторам М3-подтипа. В ряду изученных холиноблокаторов привлекает особое внимание пентифин, фармакологическая избирательность которого к рецепторам М4-подтипа существенно превосходит таковую к рецепторам других подтипов. Показатели его фармакологической избирательности, выраженные отношениями М1/М4, М2/М4 и М3/М4, составили 65,7; 142,9; 40,0. Анализ фармакологического профиля ацетиленовых аминоспиртов позволил выявить высокоизбирательный, по отношению к М1-подтипу холинорецептора, препарат СЛ-23, который характеризуется соотношением вычисленных среднеэффективных доз 1 : 50 : 3,6 : 3,7 (М1- : М2- : М3- : М4-), соответственно. Представляется крайне важным тот факт, что из ряда исследованных соединений наибольшей способностью блокировать М4-подтип холинорецепторов обладают именно те препараты, которые в практической медицине используются как антипаркинсонические средства (циклодол, амедин, тропацин), что, в свою очередь, тоже свидетельствовует об определенной роли М4-холинорецептора в патогенезе паркинсоноподобных состояний. Построение математической модели, отражающей зависимость противогалоперидоловой активности препаратов от их избирательности к различным подтипам М-холинорецепторов Параметры модели рассчитывали на основе показателя, обратного величине ЕД50 (1/ЕД50), для каждого теста, который был обозначен как «эффективность холиноблокатора» (таб. 5). 15 Таблица 5 Уровень эффективности холиноблокаторов (1/ЕД50), приведенный к дозе, эквиэффективной 1 мг/кг атропина Препарат М1 М2 М3 М4 Галоперидол Атропин 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Амедин 0,90 0,37 0,57 2,50 8,36 Пентифин 0,13 0,07 0,23 10,00 53,49 Циклодол 0,23 0,06 0,32 0,67 2,73 Глипин 5,39 2,64 5,00 5,00 3,62 Норакин 0,37 0,43 0,16 0,58 3,00 Амизил 0,55 0,49 0,58 0,64 1,28 Тропацин 0,09 0,06 0,06 0,25 1,09 Норглипин 0,15 0,07 0,48 0,17 0,11 СЛ 22 1,35 0,07 0,96 0,39 8,31 СЛ 23 17,97 0,38 5,20 5,49 3,78 При проведении линейного регрессионного анализа было показано, что практически все модели, предполагающие связь между функциональной активностью отдельно взятого подтипа М-холинорецепторов и способностью лиганда оказывать антигалоперидоловое действие, не имели прогностического значения. Для проверки гипотезы о совместном влиянии блокады различных подтипов холинорецепторов на способность предупреждать развитие двигательных расстройств, модель строилась на основании всего ряда холиноблокаторов с учетом уровня блокады каждого из подтипов (М1-М4) холинорецепторов. Получена линейная модель вида: У=b+а1 × ((Х3)3/Х1) + а2 × ((Х4)2/Х2) с высоким уровнем значимости по критерию Фишера (Р<0,001), где за У принималась активность холиноблокатора по способности предупреждать развитие каталепсии, вызванной введением галоперидола. При этом свободный член уравнения был равен 2,99 (Р<0,05), а коэффициенты а1=0,16 и а2 = 0,03 (Р<0,01 и Р<0,001, соответственно), что предполагает включение рецепторов М4- и М2-подтипов 16 в систему с антагонистическими свойствами. Блокада М4-холинорецепторов противодействует развитию кататонического синдрома, а блокада М2-подтипа не оказывает корригирующего действия, и, возможно, потенцирует развитие каталепсии. Наибольшая эффективность пентифина в коррекции экстрапирамидных нарушений, обусловленных действием Д2-блокатора галоперидола, по сравнению с другими исследованными соединениями, определила необходимость изучения его возможного непосредственного влияния на дофаминергическую систему. Таблица 6 Блокирующее действие пентифина и SCH-23390 на некоторые рецепторы изолированных органов крыс Вещества ЕС50, М. Д1-Р А-Р М1-ХР SCH-23390 3 × 10–12 > 5 × 10–5 > 5 × 10–5 Пентифин 7 × 10–5 8 × 10–6 2 × 10–7 где: Д-Р - дофаминовый рецептор, А-Р - адреналовый рецептор, М1-ХР - М1-холинорецептор Способность пентифина связываться с рецепторами различных медиаторных систем в экспериментах in vitro возрастает в ряду: рецепторы дофаминовой < адреналовой < мускариновой систем. Для проверки негативной роли блокады М2-подтипа, введение галоперидола осуществляли на фоне одновременного введения двух холинолитиков — пентифина и метоктрамина 0,066 мг/кг в/б (или пентифина и СЛ-2 0,086 мг/кг в/б) (табл. 7). Таблица 7 ЕД50 холиноблокаторов в тесте предупреждения ЭПН (каталепсия) у крыс, вызванных введением галоперидола (10,0 мг/кг в/б) (M ± m) Препарат Условия определения ЕД50 Пентифин Циклодол Амедин Галоперидол 0,023 ± 0,003 0,340 ± 0,020 0,148 ± 0,018 Галоперидол + метоктрамин 0,094 ± 0,001* 1,410 ± 0,020* 0,470 ± 0,08* Галоперидол + СЛ-2 0,141 ± 0,015* 1,120 ± 0,060* 0,680 ± 0,05* *— достоверное отличие от контроля (галоперидол) (P<0,01). 17 При введении метоктрамина увеличение EД50 пентифина по предупреждению каталепсии было 5-кратным, а при введении СЛ-2 — 7-кратным. Следовательно, одновременное с пентифином (п/к) введение М2-избирательного антагониста (в/б) приводило к значительному снижению «антигалоперидоловой» эффективности, т.е. увеличению дозы пентифина, купирующей экстрапирамидные нарушения. Таким образом, основным критерием при направленном отборе препаратов, обладающих холиноблокирующей активностью, с целью получения максимального эффекта по предупреждению экстрапирамидных нарушений, представляется наличие у лиганда высокой фармакологической избирательности к М4-подтипу и, низкой — к М2-подтипу холинорецептора. Влияние пентифина на уровень ацетилхолина в условиях блокады Д2рецепторов Содержание связанного ацетилхолина является величиной обратно пропорциональной выбросу медиатора в синаптическую щель. Таким образом, по этому показателю, можно косвенно судить о возбуждении холинореактивных структур изучаемой области мозга. В таблице 8 представлены результаты оценки уровня связанного ацетилхолина в области стриатума при введении различных лигандов. Таблица 8 Уровень связанного АХ (г 10-7/г ткани) в стриатуме крыс при парентеральном введении различных препаратов (М ± m) Контроль (ф/р-р) n=12 Галоперидол n=6 Атропин n=8 Пентифин n=10 21,2 ± 2,0 9,2 ± 1,8 6,8 ± 1,7 20,5 ± 3,3 Как следует из анализа данных таблицы 8, введение галоперидола вызывает статистически значимое понижение связанного ацетилхолина на 56 % от исходного уровня. Этот показатель при введении ЕД50 атропина (1,23 мг/кг) снижался на 67 % от исходного уровня (Р<0,001), а при введении ЕД50 пентифина (0,023 мг/кг) — значимо не изменялся (табл. 8). При оценке влияния этих холинолитиков на уровень связанного ацетилхолина в стриатуме в условиях моде18 лирования нейролептического паркинсонизма было показано, что атропин не изменял сниженный уровень связанного ацетилхолина (табл. 9), а пентифин — способствовал «нормализации» уровня ацетилхолина до значений контроля. Таблица 9 Уровень связанного ацетилхолина (г 10-7/г ткани) в стриатуме крыс при парентеральном введении галоперидола и холиноблокатора в дозе, предупреждающей развитие каталепсии (М ± m) Контроль (ф/р-р) n=12 Атропин+Галоперидол n=6 Пентифин+Галоперидол n=10 21,2 ± 2,0 6,1 ± 3,1 14,9 ± 5,4 Исходя из предположения о регулирующей роли ацетилхолина в поддержании уровня дофамина, можно было ожидать, что однонаправленные фармакологические эффекты, т. е. предупреждение экстрапирамидных нарушений, должны обеспечиваться одинаковым уровнем ацетилхолина. Учитывая, что снижение внутриклеточного ацетилхолина является следствием его увеличенного выброса в синаптическую щель, можно предположить, что гиперхолинергия не оказывала в этом случае влияния на функциональное состояние дофаминергической системы. Наличие защитного эффекта холиноблокаторов, вероятно, объясняется их влиянием на постсинаптические М-холинорецепторы стриатума. Заключение На базе Института Токсикологии д. х. н. профессором С. Г. Кузнецовым и д. х .н. Н. М. Либманом был синтезирован ряд химических соединений из группы ацетиленовых аминоспиртов и, к началу настоящего исследования, было известно, что некоторые из них обладают холиноблокирующей активностью. Из 21 изученных соединений, в тесте фармакологической избирательности к М4-подтипу холинорецептора, было отобрано 9 наиболее активных (СЛ-17, СЛ-18, СЛ-22, СЛ-23, СЛ-26, СЛ-28, СЛ-31, СЛ-32, пентифин). Анализ их эффективности в сравнении с холиноблокаторами из других химических групп проводили на общепринятой модели нейролептического паркинсонизма (гало19 перидоловая каталепсия). Среди них высокая активность по предупреждению каталепсии, сравнимая с применяющимся корректором экстрапирамидных нарушений циклодолом, отмечена у 4 соединений (СЛ-22, СЛ-23, СЛ-28, пентифин). При этом, активность соединений СЛ-17, СЛ-18, СЛ-26, СЛ-31, СЛ-32 в тесте каталепсии была значительно ниже активности неселективного холиноблокатора атропина. Отсутствие в исследованной группе соединений с промежуточными значениями фармакологической активности делит их на группы высоко- и низкоактивных веществ. Анализ химического строения высокоактивных соединений выявил их особенности, которые заключаются в наличии определенных концевых радикалов и основной углеродной цепи. Обязательным является наличие фенольного кольца в положении первого атома углерода, а у концевого — пиперидинового остатка. Менее жесткие требования относятся к длине собственно углеродной цепочки (4–5 атомов углерода) и второму радикалу первого атома углерода — он должен являтся кольцевой структурой произвольной длинны. Соблюдение вышеперечисленных условий, очевидно, обеспечивает строго определенную конформацию молекулы, коррелирующую с ее высокой биологической активностью. Это положение хорошо иллюстрируется при сравнении структуры соединения СЛ-17 и СЛ-23 (введение в радикал циклопентил метильной группы увеличивает активность почти в 20 раз). Для выявления М4-избирательных свойств была разработана методика оценки фармакологической избирательности холиноблокатора к М4-подтипу рецептора. Показано, что способность холинолитиков нормализовать количество ДНЧ в условиях действия пилокарпина изменяется следующим образом: пентифин > СЛ23 > глипин > амедин > атропин. На основе анализа эффективности ряда лигандов, обладающих холиноблокирующей активностью, было высказано предположение о профиле фармакологической селективности, которым должен обладать холиноблокатор максимально эффективный в предупреждении развития экстрапирамидных нарушений, вызванных нейролептиком. Для проверки гипотезы о значении одновре20 менной блокады различных подтипов холинорецепторов на способность ряда холиноблоепторов предупреждать развитие двигательных расстройств, с учетом уровня блокады каждого из подтипов (М1-М4) холинорецепторов, была построена регрессионная модель с высоким уровнем значимости по критерию Фишера (Р<0,001). Модель предполагает включение рецепторов М4- и М2-подтипов в систему с антагонистическими свойствами. Блокада М4-холинорецепторов противодействует развитию кататонического синдрома, а блокада М2- холинорецепторов не оказывает корригирующего действия, и, возможно, потенцирует развитие каталепсии. Применение математического анализа позволило построить модель, описывающую связь фармакологических свойств антагонистов М-холинорецептора с эффективностью коррекции двигательных нарушений, вызванных блокадой Д2-рецепторов. Из анализа модели следовало, что определяющим фактором является способность препарата максимально блокировать М4-холинорецептор, при минимальном влиянии на М2-подтип рецептора. Оказалось, что в ряду обследованных холиноблокаторов, именно у пентифина наиболее высока избирательность по отношению к М4-холинорецептору. В этом ряду следующими стоят официнальные препараты — циклодол и амедин. Выводы 1. Соединения пентифин, СЛ-22, СЛ-23, СЛ-28, из химической группы ацетиленовых аминоспиртов, проявляют выраженную антипаркинсоническую активность, сопоставимую и, в отдельных случаях, превосходящую активность официнального препарата циклодол. 2. На модели нейролептического паркинсонизма показано, что в организации нарушения деятельности экстрапирамидной системы ведущим фактором является возбуждение М4-подтипа холинорецептора. Эффективность блокады М4-холинорецептора определяет способность лиганда оказывать защитное действие. 21 3. Эффективность М-холиноблокаторов в отношении экстрапирамидных нарушений в условиях нейролептического паркинсонизма обусловлена как их высокой фармакологической избирательностью к М4-холинорецептору, так и низкой избирательностью к М2-холинорецептору. 4. Пентифин предотвращает увеличение выброса ацетилхолина в области стриатума, вызванное введением галоперидола, что не наблюдается в случае коррекции экстрапирамидных нарушений неселективными холиноблокаторами. 5. Способность пентифина связываться с рецепторами различных медиаторных систем в экспериментах in vitro снижается в ряду: рецепторы мускариновой > адреналовой > дофаминовой систем. В экспериментах in vivo, с применением метода «открытого поля» и изучением параметров ориентировочного рефлекса, было выявлено отсутствие непосредственного влияния пентифина на дофаминергическую систему. 6. На основании проведенных фармакологических тестов показано, что пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М4. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Роль отдельных подтипов М-холинорецепторов ЦНС (системный подход) // Тез. докл. «XVIII съезд физиологического общества им. И. П. Павлова». — Казань; М.; ГЭОТАР-МЕД, 2001. — С. 75 (Соавт. Космачев А. Б., Долго-Сабуров В. Б., Муковский Л. А., Саватеева Т. Н., Филько О. А., Хоботова З. И.) 2. Теоретическое обоснование оптимизации профиля рецепторной селективности мускариновых антагонистов для лечения нейролептического паркинсонизма // Психофармакол. и биол. наркология. 2002. № 3-4. с. 389 (Соавт. С. Г., Космачев А. Б., Филько О. А., Соловьева Н. Е., Беляев В. А., Долго-Сабуров В. Б.) 3. Новые подходы к оценке типовой принадлежности мускариновых рецепторов различных отделов головного мозга // Психофармакол. и биол. наркология. 22 2002. № 3-4. с. 453 (Соавт. Соловьева Н. Е., Космачев А. Б., Подосиновикова Н. П., Филько О. А., Долго-Сабуров В. Б.) 4. Математический анализ типовой принадлежности мускариновых рецепторов, модулирующих сердечный и дыхательный ритм у крыс // Бюлл. эксперим. биол. 2002, Т. 133, №4, С. 595-597 (Соавт. Лычаков А.В., Беляев В. А., Космачев А. Б., Глухова Р. И., Долго-Сабуров В. Б.) 5. Изучение действия пентифина на некоторые нейромедиаторные системы организма in vitro // Бюлл. эксперим. биол. 2003, Т. 136, №8, С.200-201 (Соавт. Е. Н. Горбатова, В. Б. Долго-Сабуров, Ф. С. Духович) 6. Способ количественной оценки избирательной блокады мускариновых холинорецепторов М4-подтипа в условиях целостного организма // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2003. - Т. 135, № 5. - С. 524-526 (Соавт. Космачев А. Б., Либман Н. М., Кубарская Л. Г., Храброва А. В., Саноцкий В. И., Филько О. А., Долго-Сабуров В. Б.) 7. Антикаталептогенная эффективность совместного применения центральных холиноблокаторов на модели экспериментального паркинсонизма // Нейроиммунология (Мат. XII Всеросс. конф. "Нейроиммунология"). 2003. Т. 1., № 2, С. 43-44 (Соавт. Филько О. А., Кубарская Л. Г., Храброва А. В., ДолгоСабуров В. Б.) 8. Межмедиаторные взаимодействия в патогенезе интоксикации нейролептиками. 2-й съезд токсикологов России, 10-13 ноября 2003г. М., 2003. с. 334 (Соавт. Филько О. А.. Кубарская Л. Г., Храброва А. В., Долго-Сабуров В. Б.) 9. Экспериментальное моделирование токсического паркинсонизма // 2-й съезд токсикологов России, 10-13 ноября 2003г. М., 2003. с. 339 (Соавт. А. Н. Петров, М. К. Шевчук, А. В. Лычаков, Е. Н. Кучер) 10. Влияние блокады М4-холинорецепторов на кататонический синдром у крыс, вызванный введением галоперидола // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2004. Т.137. № 2. С. 174-177 (Соавт. А. Б. Космачев, О. А. Филько, Л. Г. Кубарская, А. В. Храброва, В. А. Беляев, Н. П. Подосиновикова, Н. М. Либман, В. И. Саноцкий, В. Б. Долго-Сабуров) 23 11. Влияние холиноблокаторов на содержание ацетилхолина в стриатуме крыс при нейролептическом паркинсонизме // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2004. Т.137. № 2. С. 187-189 (Соавт. Космачев А. Б., Соловьева Н. Е., Филько О. А., Саноцкий В. И., Долго-Сабуров В. Б.) 12. Влияние блокады М2-холинорецепторов на кататонический синдром у крыс, вызванный введением галоперидола // Бюлл. эксперим. биол. мед. 2004. Т. 137., № 5., С. 535-537 (Соавт. О. А. Филько, Л. Г. Кубарская, А. В. Храброва, Л. А. Муковский, Р. И. Глухова, В. И. Саноцкий, В. Б. Долго-Сабуров) 13. Снижение эффективности защитного действия при применении двух холиноблокаторов в условиях интоксикации нейролептиком // Сб. науч. конфер. "Медико-биологической проблемы противолучевой и противохимической защиты". СПб.: ООО "Издательство Фолиант", 2004. С. 338 (Соавт. О. А. Филько, Л. Г. Кубарская, А. В. Храброва, Н. Е.Соловьева, Н. М. Либман, А. Я. Беспалов, В. Б. Долго-Сабуров) 14. The role of M- and GABA-ergic system in the development of the neurolepticinduced extrapyramidal disturbances // «European Neuropsychopharmacology». 8th ECNP Regional Meeting., Moscow, Russia, April 14-16. 2005. V. 15. Suppl. 2. S. 210 (Соавт. Philko O. A., Solovieva N. E., Kubarskaya L.G., Khrabrova A. V., Dolgo-Saburov V. B.) 15. Межмедиаторные взаимодействия в условиях различной степени Д2 блокады у крыс. Тез. док. и стендовых сообщений "Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты", 2005, М., с. 92 (Соавт. О. А. Филько, Л. Г. Кубарская, А. В. Храброва, Н. Е. Соловьева, Л. Я. Либин, В. Б. Долго-Сабуров) 16. Влияние блокады дофаминергической и глутаматной систем на перекисное окисление липидов в стриатуме и гиппокампе крыс в условиях экспериментального паркинсонизма // Мат. Всеросс. конф. с междунар. участием «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга», 2006, М.: «Информкнига», - с. 395 (Соавт. Либин Л. Я., Кубарская Л. Г., Филько О. А., Храброва А. В., Соловьёва Н. Е., ДолгоСабуров Б. В., Ещенко Н. Д.) 24 17. Влияние дофаминергической и глутаматной систем на выброс ацетилхолина и активность ацетилхолинэстеразы в стриатуме и гиппокампе крыс в условиях экспериментального паркинсонизма // Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга. 2006.— М:— С. 110–113 (Соавт. Соловьева Н. Е., Кубарская Л. Г., Филько О. А., Храброва А. В., Саноцкий В. И., Либин Л. Я.) 18. Роль ацетилхолинестеразы в стриатуме и гиппокампе крыс // Мат. конф. «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» 2006.— Пенза, С. 97–98 (Соавт. Кубарская Л. Г., Филько О. А., Храброва А. В., Соловьева Н. Е., Либин Л. Я., Ещенко Н. Д., Долго-Сабуров В. Б.) 19. Изменение показателей перекисного окисления липидов в некоторых отделах головного мозга крыс в условиях центральной блокады D2- и NMDAрецепторов // Морфология. -2006.- Т 129-№ 2.. с. 54 (Соавт. Либин Л. Я., Ещенко Н. Д., Филько О. А., Кубарская Л. Г., Храброва А. В., Соловьева Н. Е.) Патенты 1. Гидрохлорид 1-фенил-1-циклопентил-4-пиперидино-2-бутин-1-ола (пентифин), обладающий М4 холиноблокирующей активностью. Патент на изобретение № 2224516 приоритет 17 октября 2002. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 27 февраля 2002 (Соавт. Космачев А. Б., Либман Н. М., Филько О. А., Храброва А. В., Кубарская Л.Г., Соловьева Н. Е., Долго-Сабуров В. Б.) 2. Гидрохлорид 1-фенил-1-(1’-метилциклопентил)-4-пиперидино-2-бутин-1-ола (СЛ 23), обладающий М1 холиноблокирующей активностью. Патент на изобретение № 2273478 приоритет 13 мая 2004. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10 апреля 2006. (Соавт. Космачев А. Б., Филько О. А., Либман Н. М., Кубарская Л. Г., Храброва А. В., Соловьева Н. Е., Подосиновикова Н. П., Беляев В. А., Долго-Сабуров В. Б.) 25
