Инструкция - ИнтерЛабСервис

ОКП
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор
ООО «ИнтерЛабСервис»
И. А. Гущина __________
«____»_________________2012 г.
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для
лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на
оборудовании Rotor-Gene, в том числе с функцией HRM
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ
PCR Kit (24)» на 24 образца.
Соответствует требованиям национальных стандартов и технической документации
изготовителя
 Компания QIAGEN является ведущим поставщиком инновационных технологий в
области молекулярной диагностики. Компания QIAGEN устанавливает стандарты в
следующих областях:





Очистка РНК, ДНК и белков
Исследование нуклеиновых кислот и белков
Исследование микроРНК и РНК-интерференции
Выявление генетических и эпигенетических факторов онкологических заболеваний
Автоматизация технологии пробоподготовки и исследований
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных
исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании RotorGene, в том числе с функцией HRM, предназначены для качественной оценки
мутационного статуса в онкогенах EGFR, KRAS, BRAF из ДНК человека, выделенной из
зафиксированных формалином и залитых в парафин образцов опухолевой ткани. Наборы
могут применяться в клинической лабораторной диагностике.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» предназначен для выявления 7 соматических мутаций в онкогене KRAS и
обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор реагентов валидирован
для прибора Rotor-Gene® Q 5plex HRM и для прибора Rotor-Gene® Q 6. Набор реагентов
для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» должен
применяться обученным персоналом в специально оборудованной лаборатории с пробами
ДНК, извлеченными из фиксированной формалином и залитой парафином опухолевой
ткани.
Используя праймеры Scorpions® и технологию ARMS®, набор реагентов для определения
соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» позволяет обнаружить
следующие мутации в кодонах 12 и 13 в гене KRAS:
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12 SER
12VAL
13ASP
2
I. Состав
1. Состав наборов реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для
лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на
оборудовании Rotor Gene в том числе с функцией HRM
1.1. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ
PCR Kit (24)» на 24 образца.
II. Общая информация
1. Хранение
2. Назначение
3. Ограничение использования
4. Контроль качества
5. Информация по технике безопасности
III. Принципы работы с наборами реагентов
1. Принципы работы с наборами реагентов для определения соматических мутаций
в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в
реальном времени на оборудовании Rotor Gene в том числе с функцией HRM
1.1. Общие сведения
1.2. Принцип метода
1.3. Оборудование и реактивы, приобретаемые отдельно
1.4. Меры предосторожности
1.5. Формат набора
1.6. Определение исходного материала для анализа
1.7. Выделение ДНК
1.8. Внутренние контроли. Контроль суммарной ДНК в пробе
1.9. Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе
1.10. Анализ данных
1.11. Протоколы
 Определение суммарной ДНК в пробах
 Выявление мутаций в гене KRAS
 Протокол: Rotor-Gene Q KRAS, программирование
Интерпретация результатов
1.1.
1.2.
1.3.
Анализ образцов ДНК
Анализ мутаций
Критерии оценки мутационного статуса
Приложение В: Дополнительная информация о мутациях
3
I. Состав
1. Состав наборов реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для
лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на
оборудовании Rotor-Gene, в том числе с функцией HRM
1.1. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ
PCR Kit (24)» на 24 образца.
Название
KRAS RGQ
PCR Kit (24)
Кат.№ 870001
Красный
Фиолетовый
Оранжевый
Розовый
Зеленый
Контрольная реакционная смесь
Control Reaction Mix
Реакционная смесь 12ALA
12ALA Reaction Mix
Реакционная смесь 12ASP
Reaction Mix 12ASP
Реакционная смесь 12ARG
12ARG Reaction Mix
Реакционная смесь 12CYS
12CYS Reaction Mix
Объем
Кол-во
1 Ctrl
650 мкл
2 шт.
2 12ALA
650 мкл
1 шт.
3 12ASP
650 мкл
1 шт.
4 12ARG
650 мкл
1 шт.
5 12CYS
650 мкл
1 шт.
Желтый
Реакционная смесь 12SER
12SER Reaction Mix
6 12SER
650 мкл
1 шт.
Серый
Реакционная смесь 2VAL
12VAL Reaction Mix
7 12VAL
650 мкл
1 шт.
Синий
Реакционная смесь 13ASP
13ASP Reaction Mix
8 13ASP
650 мкл
1 шт.
9 PC
300 мкл
1 шт.
Taq ДНК Полимераза
Taq DNA Polymerase
Taq
75 мкл
1 шт.
Вода для отрицательного контроля
Nuclease-Free Water
Вода для разведения образцов
Water for Sample Dilution
Руководство пользователя на английском языке
Handbook
NTC
1.9 мл
1 шт.
Dil.
1.9 мл
1 шт.
-
1 шт
Коричневый
Мятный
Белый
Белый
Положительный контроль KRAS
KRAS Positive Control
II. Общая информация
1. Хранение
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» доставляется на сухом льду и должен оставаться замороженным. Если набор
реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit
(24)» не заморожен, при транспортировке вскрывалась внешняя упаковка, посылка не
содержит упаковочного листа, руководства или реактивов, пожалуйста, свяжитесь со
специалистами компании «ИнтерЛабСервис» по телефону +7 (495) 664-28-84.
4
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» хранится при температуре от –15°C до –25°.
Для обеспечения оптимальной активности и производительности праймеров Scorpions®
набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR KRAS «KRAS RGQ
PCR Kit (24)» должен быть защищен от света во избежание дезактивации флуоресцентной
метки.
При хранении в рекомендуемых условиях и в исходной упаковке набор стабилен до даты
окончания срока хранения, указанной на этикетке.
2. Назначение
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» предназначен для выявления 7 соматических мутаций в онкогене EGFR и
обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор реагентов для
определения соматических мутаций в гене EGFR KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)»
должен использоваться обученным персоналом в специально оборудованной лаборатории
с пробами ДНК, выделенными из фиксированной формалином и залитой парафином
опухолевой ткани.
3. Ограничение использования
Полученные
результаты
должны
интерпретироваться
только
совместно
с
соответствующими клиническими и лабораторными исследованиями и не должны
применяться для диагностики отдельно.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» должен использоваться только персоналом, специально проинструктированным
и обученным диагностике in vitro и работе на Rotor-Gene Q.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» валидирован для ДНК, выделенной с использованием набора реагентов для
выделения ДНК QIAGEN (Кат. № 56404) из парафинизированных блоков образцов
опухолевой ткани, предварительно зафиксированных в забуференном формалине.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» предназначен для применения только в амплификаторах для ПЦР в реальном
времени Rotor-Gene Q серии 5plex HRM и Rotor-Gene® Q 6.
Для получения оптимальных результатов необходимо четкое следование руководству по
применению набора реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS
«KRAS RGQ PCR Kit (24)». Реактивы должны готовиться согласно рекомендациям данной
Инструкции. В противном случае, возможно, получение некорректных результатов.
Важно, чтобы количество и качество ДНК в пробе определялось непосредственно перед
проведением анализа данной пробы с использованием набора реагентов для определения
соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)».
5
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» имеет дополнительную контрольную смесь (Ctrl) для определения значения
порогового цикла (CT), приемлемого для анализа.
Следует обращать внимание на даты окончания срока годности и условия хранения,
напечатанные на коробке и этикетках всех компонентов. Не используйте компоненты с
истекшим сроком годности или неправильно хранившиеся.
4. Контроль качества
Каждая партия набора реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS
«KRAS RGQ PCR Kit (24)» тестируется согласно утвержденным техническим условиям
для обеспечения постоянного качества продукта в соответствии с сертифицированной по
ISO Системой контроля качества QIAGEN.
5. Информация по технике безопасности
Работать с реактивами необходимо в лабораторном халате, одноразовых перчатках и
защитных очках.
Весь химический и биологический материал считается потенциально опасным.
Пробы являются потенциальным источником инфекции, и с ними следует обращаться
соответствующим образом.
III. Принципы работы с наборами реагентов
1. Принципы работы с наборами реагентов для определения соматических мутаций
в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в
реальном времени на оборудовании Rotor-Gene, в том числе с функцией HRM.
1.1. Общие сведения
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» предназначен для выявления 7 соматических мутаций в онкогене KRAS и
обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор реагентов валидирован
для прибора Rotor-Gene® Q 5plex HRM и для прибора Rotor-Gene® Q 6. Набор реагентов
для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» должен
применяться обученным персоналом в специально оборудованной лаборатории с пробами
ДНК, извлеченными из фиксированной формалином и залитой парафином опухолевой
ткани.
Используя праймеры Scorpions® и технологию ARMS® набор реагентов для определения
соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» позволяет обнаружить
мутации в кодонах 12 и 13 в гене KRAS: 12ALA, 12ASP, 12ARG, 12CYS, 12 SER, 12VAL,
13ASP.
Используемые методы обладают высокой избирательностью и в зависимости от общего
количества ДНК в образце, позволяют выявлять невысокий процент мутантной ДНК на
фоне геномной ДНК дикого типа. Чувствительность и селективность набора реагентов для
6
определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» намного
выше по сравнению с такими технологиями как секвенирование.
1.2. Принцип метода
В наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ
PCR Kit (24)» применяется две технологии для выявления мутаций с помощью ПЦР в
реальном времени — аллель специфическую ПЦР (ARMS) и праймеры Scorpions.
Аллель специфичная ПЦР (ARMS)
Аллель-специфическая или специфичная для данной мутации амплификация достигается
с помощью ARMS (Amplification Refractory Mutation System, рефракторная мутационная
система амплификации). Taq ДНК-полимераза (Taq) эффективна для различения
соответствий и несоответствий на 3'-конце ПЦР-праймера. Специфические
последовательности, несущие мутации, селективно амплифицируются даже в пробах, где
большинство последовательностей не имеют данной мутации. Когда праймер полностью
соответствует, амплификация проходит в полном объеме. В случае несоответствия 3'конца последовательности геномной ДНК, происходит лишь незначительная фоновая
амплификация.
Праймеры Scorpions
Регистрация продуктов амплификации происходит с использованием праймеров
Scorpions. Праймеры Scorpions - это бифункциональные молекулы, содержащие ПЦРпраймеры ковалентно связанные с зондом. Флуорофор в этом зонде взаимодействует со
снижающим флуоресценцию гасителем, также встроенным в зонд. В ходе ПЦР, когда
зонд связывается с ампликоном, флуорофор и гаситель разделяются, что приводит к
повышению флуоресценции в реакционной пробирке.
Этапы работы
Работа с набором реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS
RGQ PCR Kit (24)» проходит в два этапа. На первом этапе выполняется контрольное
измерение для определения суммарной ДНК в пробе. На втором этапе определяется
наличие или отсутствие мутантной ДНК.
1.3.Оборудование и реактивы, приобретаемые отдельно
При работе с реактивами всегда надевайте лабораторный халат, одноразовые перчатки и
защитные очки. За дополнительными сведениями обращайтесь к соответствующим
паспортам безопасности (MSDS), имеющимся у поставщика продукта.




Набор для выделения ДНК: QIAamp® DNA FFPE Tissue (QIAGEN), Кат.№ 56404
(см. «Выделение ДНК»)
Ксилен (Xylene)
Этанол (96–100%)
Микроцентрифужные пробирки 1.5 мл или 2 мл (для лизиса)
7









Специальные регулируемые дозаторы для приготовления реакционной смеси для
ПЦР*
Специальные регулируемые дозаторы для добавления геномной ДНК*
Стерильные наконечники с фильтрами для пипеток
Настольная центрифуга* с ротором для 2-мл реакционных пробирок
Вортекс
Прибор Rotor-Gene Q 5plex HRM* или Rotor-Gene® Q 6* с каналами
флуоресценции для Cycling Green and Cycling Yellow
Программное обеспечение для Rotor-Gene Q версия 2.0.2
Стрипованные пробирки и колпачки, 0,1 мл, для использования с 72-гнездным
ротором (№ по каталогу 981103 или 981106)
Стерильные микроцентрифужные пробирки для приготовления реакционной
смеси.
* Все приборы должны быть поверены и откалиброваны в соответствии с рекомендациями
производителя.
1.4.
Меры предосторожности
Пользователь должен всегда обращать внимание на следующее:
Использовать стерильные наконечники с фильтрами для дозаторов и следить за тем,
чтобы дозаторы были откалиброваны в соответствии с инструкциями производителя.
Хранить образцы, положительные контроли и экстрагированную из образцов ДНК
отдельно от других реактивов. Добавлять в реакционную смесь контроли и
экстрагированную из образцов ДНК на отдельном рабочем участке.
Перед началом анализа разморозить все компоненты при комнатной температуре (15–
25°C).
После размораживания перемешать компоненты (переворачивая каждую пробирку по 10
раз) и затем кратковременно центрифугировать.
Необходимо проявлять осторожность во избежание загрязнения ПЦР-смеси
синтетическим контрольным материалом. Рекомендуется использовать отдельные
дозаторы, специально предназначенные для приготовления реакционных смесей и
добавления матричной ДНК. Приготовление и раскапывание реакционных смесей должно
производиться в отдельном помещении, в котором не производится раскапывание
образцов. Пробирки Rotor-Gene Q не должны открываться по окончании ПЦР-анализа.
1.5.
Формат набора
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» состоит из восьми аналитических систем:
- Одна контрольная система (Control Reaction Mix), Ctrl;
8
- Семь мутационных систем для анализа мутаций (12ALA, 12ASP, 12ARG, 12CYS, 12SER,
12VAL и 13ASP).
Все реакционные смеси содержат внутреннюю контрольную пробу (внутренний
контроль), помеченную HEX™. Это контроль наличия ингибиторов в пробе, присутствие
которых могут привести к ложноотрицательным результатам.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» имеет оптимальный состав и концентрацию. Не рекомендуется дальнейшее
разведение реагентов, поскольку это может привести к потере производительности. Не
рекомендуется ставить реакции, объемом менее 25 мкл, поскольку это может повысить
риск ложноотрицательных результатов.
Все реактивы, поставляемые в наборе реагентов для определения соматических мутаций в
гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» предназначены для использования только в том же
наборе. Для поддержания оптимальной производительности реактивы в наборе не должны
замещаться.
Используйте только Taq ДНК-полимеразу (Taq), которая поставляется в наборе. Не
замещайте ее Taq ДНК-полимеразой (Taq) из других наборов того же или иного типа или
Taq ДНК-полимеразой (Taq) от других поставщиков.
Контрольная проба
Контрольная проба (Ctrl), помеченная FAM™, используется для определения суммарной
ДНК в пробе. В контрольной пробе амплифицируется участок экзона 4 гена KRAS.
Праймер и зонд подобраны таким образом, чтобы избежать любых известных
полиморфизмов EGFR.
Мутационные анализы
Каждая мутационная проба, помеченная FAM, содержит один зонд Scorpion плюс
праймеры для различения дикой и мутантной ДНК. Мутантная ДНК выявляется методом
ПЦР в реальном времени.
Контроли Все запуски должны включать положительный и отрицательный контроли.
Позитивный контроль
Каждый запуск должен включать позитивный контроль в лунках с 1 по 8. Набор реагентов
для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)»
содержит позитивный контрольный образец, который должен использоваться в качестве
матрицы для положительного контроля. Использование позитивного контроля
необходимо для оценки и гарантии правильного прохождения реакции в каждой лунке.
Отрицательный контроль
Каждый запуск должен включать отрицательный контроль в лунках с 9 по16. Набор
реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit
9
(24)» содержит воду для отрицательного контроля (NTC), которая должна использоваться
в качестве шаблона отрицательного контроля в реакции. Данный контроль позволяет
оценить загрязнение во время постановки анализа и провести оценку внутреннего
контроля постановки.
Оценка реакции внутреннего контроля
Каждый реакционная смесь содержит дополнительно внутренний контроль. Неудачное
прохождение внутреннего контроля указывает на возможность ингибирования реакции и
получения ложноотрицательных результатов. При неправильном прохождении
внутреннего контроля смотрите раздел «Критерии оценки мутационного статуса».
Разведение образца может уменьшить ингибирование реакции ПЦР, но следует учесть,
что также будет разведена ДНК.
1.6.
Определение исходного материала для анализа
Со всеми пробами следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом.
Материалом для анализа должна быть геномная ДНК человека, выделенная из
фиксированных формалином и залитых в парафин проб опухолевой ткани. Образцы
должны транспортироваться в соответствии со стандартными требованиями работы с
патологическим материалом, обеспечивающим качество образцов.
Опухолевые образцы негомогенны, срезы из одного образца опухоли могут не
соответствовать срезам той же опухоли. Опухолевые пробы могут также содержать
неопухолевую ткань. ДНК неопухолевой ткани не должны содержать мутации KRAS,
выявляемые набором реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS
«KRAS RGQ PCR Kit (24)».
1.7.
Выделение ДНК
Для выделения геномной ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин
образцов опухолей немелкоклеточного рака легких рекомендуется использовать набор
реагентов QIAamp® DNA FFPE (QIAGEN, кат.№ 56404). Выделение геномной ДНК
проводить согласно инструкции к набору реагентов QIAamp® DNA FFPE:
- Поместить срезы, фиксированные формалином и залитые в парафин, на покровные
стекла;
- удалить избыток парафина вокруг срезов ткани, используя свежий стерильный
скальпель;
- срезы тканей перенести в микроцентрифужные пробирки, используя свежий скальпель
для каждой пробы, предназначенной для выделения ДНК;
- добавить протеиназу К (протеолиз в течение 1 часа);
- очищенную геномную ДНК растворить в 50 - 200 мкл буфера ATE (входит в состав
набора реагентов QIAamp® DNA FFPE).
Очищенную геномную ДНК хранить при температуре минус 15–30°C.
10
1.8. Внутренние контроли.
Определение количества ДНК в пробе должно основываться на ПЦР и может отличаться
от количественного определения, основанного на значениях поглощения. Смесь для
дополнительной контрольной реакции (Ctrl) поставляется для определения качества и
количества ДНК в пробах перед анализом с использованием набора реагентов для
определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)».
Все пробы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS
«KRAS RGQ PCR Kit (24)» генерируют короткие продукты ПЦР. Набор не будет работать
с тяжелыми фрагментами ДНК.
Все аналитические системы содержат внутренний контроль (см. «Анализ данных»). Если
оба контроля оказались неудачными, данные следует автоматически отбросить, поскольку
присутствовавшие ингибиторы могут привести к ложноотрицательным результатам.
Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, однако следует отметить, что это
также разбавит ДНК. Все экспериментальные анализы должны содержать контроли.
1.9. Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе.
Мы настоятельно рекомендуем применение дополнительной контрольной реакционной
смеси (Ctrl), поставляемой с набором набора реагентов для определения соматических
мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» для определения суммарной ДНК в
пробе. В контрольном анализе амплифицируется участок экзона 4 гена KRAS. Мы
рекомендуем постановку проб только с контрольной пробой, используя положительный
контроль EGFR (ПК) в качестве положительного контроля и воду (H2O) в качестве
отрицательного контроля (ОК).
Для оптимального использования реактивов в наборе для определения соматических
мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24)» пробы следует обрабатывать партиями.
Если пробы тестируются индивидуально, это требует большего количества реактивов и
снижает количество проб, которые можно протестировать данным набором.
1.10. Анализ данных
При проведении анализов в режиме реального времени с помощью праймеров Scorpions
используется количество циклов ПЦР, необходимое для выявления флуоресцентного
сигнала выше фонового в качестве меры молекул-мишеней, присутствующих в начале
реакции. Точка, в которой сигнал получается выше фоновой флуоресценции, называется
пороговым циклом (CT).
Значения ∆CT пробы вычисляются как разница между значением CT для мутации и
значением CT для контрольного измерения от той же пробы. Пробы классифицируются
как положительные (наличие мутации), если они дают ∆CT меньше, чем вычисленное
значение ∆CT для этого анализа.
Если это значение выше, то проба либо содержит очень низкий процент мутантной ДНК,
которая не может быть обнаружена с помощью данного набора (за аналитическим
пределом), либо проба отрицательна по мутациям.
11
Значения CT для мутаций, равные 40 или выше будут считаться отрицательными или
находящимися за пределами чувствительности набора.
При использовании праймеров ARMS может происходить некоторое неэффективное
праймирование, давая очень запоздалый фоновый CT от ДНК, не содержащей мутации.
Все значения ∆CT, рассчитанные от фоновой амплификации, будут выше урезанных
значений ∆CT, и проба будет классифицироваться как отрицательная по мутациям.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене KRAS «KRAS RGQ PCR
Kit (24)» предназначен для использования на приборе для амплификации в реальном
времени QIAGEN Rotor-Gene Q 72-луночного формата.
1.11. Протоколы
Протокол: Определение суммарной ДНК в пробах
Действия перед началом работы:
Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены,
перемешаны (переворачивать 10 раз) и кратковременно центрифугированы.
Перед каждым применением необходимо убедиться, что Taq ДНК-полимераза находится
при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугировать пробирку для
того, чтобы собрать фермент на дно пробирки.
Ход работы
1. Размораживать контрольную реакционную смесь (Ctrl), воду для отрицательного
контроля и положительный контроль (ПК) KRAS при комнатной температуре (15–25°C) в
течение 1 часа. Когда реагенты растают, перемешать их, переворачивая каждую пробирку
10 раз во избежание локализованного скопления солей.
2. Приготовить достаточное количество реакционных смесей (контрольная реакционная
смесь (Ctrl) плюс Taq ДНК-полимераза (Taq)) для ДНК образцов, для одного
положительного контроля и одного отрицательного контроля (ОК) в соответствии с
объемами, приведенными в Таблице 1. Добавить в расчет реактивы для 1 дополнительной
пробы. Реакционная смесь содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за
исключением образца.
Не встряхивать Taq -полимеразу (Taq) на вортексе, так как это может инактивировать фермент.
Таблица 1. Приготовление контрольной реакционной смеси
Компоненты
Объем
Контрольная реакционная смесь (Ctrl)*
19.76 мкл x (n+1)*
Taq ДНК-полимераза (Taq)*
0.24 мкл x (n+1)*
Общий объем
20 мкл/реак цию
* n=количество реакций (образцы плюс контроли). При приготовлении реакционной смеси
готовить так, чтобы хватило еще на 1 пробу. Общее количество n не должно превышать 24.
12
3. Аккуратно перемешать реакционную смесь пипетированием не менее 10 раз. Сразу же
добавить по 20 мкл реакционной смеси в каждую пробирку Rotor-Gene.
Для стандартной оценки запуска к контрольной смеси должны быть добавлены один
положительный контроль и один отрицательный контроль для каждого образца.
4. Немедленно добавить 5 мкл воды в контрольную пробирку для отрицательного
контроля (ПЦР пробирка 2) и закрыть пробирку. Добавить в пробирку 5 мкл KRAS
положительного контроля (ПК) (ПЦР пробирка 1) и закрыть пробирку. В пробирки с
реакционными смесями немедленно добавить по 5 мкл образца закрыть пробирки.
5. Закрыть пробирки для ПЦР, перевернуть 4 раза для перемешивания реакционной смеси
и образцов.
6. Разместить ПЦР-стрипы в диске Rotor-Disc™ в соответствующих положениях (см.
рис.1). Если ротор загружен неравномерно, необходимо уравновесить его
дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q. После переноса пробирок в ротор
рекомендуется визуально проверить, все ли пробирки содержат одинаковый объем.
Контроль
1 (ПК)
9
17
25
-
-
-
-
-
Контроль
2 (ОК)
10
18
26
-
-
-
-
-
Контроль
3
11
19
-
-
-
-
-
-
Контроль
4
12
20
-
-
-
-
-
-
Контроль
5
13
21
-
-
-
-
-
-
Контроль
6
14
22
-
-
-
-
-
-
Контроль
7
15
23
-
-
-
-
-
-
Контроль
8
16
24
-
-
-
-
-
-
Рис. 1. Схема проведения анализа и раскапывания образцов и контролей
7. Немедленно установить 72-луночный диск в прибор Rotor-Gene Q. Проследить, чтобы
запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для
предотвращения случайного открывания пробирок при анализе.
8. Открыть соответствующее программное обеспечение (версия 2.0.2 и выше) и создать
температурный профиль согласно протоколу Протокол: Rotor-Gene Q KRAS,
программирование «Rotor-Gene Q KRAS setup».
9. Выбрать 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметить, что
запирающее кольцо присоединено. Поставить галочку в квадрате “Locking Ring Attached”
(«Запирающее кольцо присоединено») и нажать “Next” («Далее») (Рис. 2).
13
Рис. 2. Диалоговое окно «Мастер нового запуска.
10. Ввести имя оператора, объем реакции - 25 мкл и дополнительные примечания.
Щелкнуть “Next” (Рис. 2).
Рис. 3. Диалоговое окно “New Run Wizard”.
11. Окно «New Run Wizard» позволяет редактировать температурный профиль. Если
температурный профиль был создан согласно инструкции в «Протоколе: Rotor-Gene Q
KRAS установка», редактирование профиля не требуется. Щелкните “Next” (Рис. 4).
14
Рис. 4 Диалоговое окно “New Run Wizard”.
12. Проверьте резюме и нажмите “Start Run”, чтобы сохранить файл и начать анализ (Рис.
5).
Рис. 5. Диалоговое окно “New Run Wizard”.
13. После запуска появляется новое окно, в котором Вы можете также ввести названия
образцов, далее нажать “Finish”. Образцы можно посмотреть позже, выбирая кнопку
“Sample” (во время анализа или после окончания). После активации на «Finish and Lock
Samples» редактирование образцов невозможно.
14. По окончанию анализа проанализируйте данные. Анализ данных описана в разделе
«Интерпретация результатов» “Sample assessment data analysis”.
15
Протокол: Выявление мутаций в гене KRAS
 После оценки образцов ДНК можно приступить к определению мутаций в гене
KRAS.
 Не встряхивайте ДНК Taq - полимеразу, так как это может ее инактивировать
 Фермент отбирать с поверхности, не погружая на дно пробирки, избегая тем самым
перерасхода данного реагента
Для эффективного применения набора реагентов для определения соматических мутаций
в гене KRAS «KRAS RGQ PCR Kit (24) пробы должны быть собраны в группы по 7
(чтобы заполнить 72-гнездный ротор). При проведении анализа с меньшим количеством
образцов можно будет протестировать меньшее число проб.
Для каждой пробы ДНК в одном и том же ПЦР - анализе должны ставиться контроль и
проба на мутации во избежание вариаций от анализа к анализу.
Действия перед началом работы:
Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены в
течение 1 часа при комнатной температуре (15–25°C), перемешаны (переворачивая 10 раз)
и кратковременно центрифугированы.
Перед каждым применением убедитесь, что Taq ДНК-полимераза находится при
комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы
собрать фермент на дне пробирки.
Ход работы
1. Разморозьте реакционные смеси и положительный контроль EGFR при комнатной
температуре (15–25°C). Когда реакционные смеси и положительный контроль EGFR
растают, перемешайте их, переворачивая каждую пробирку по 10 раз во избежание
локального концентрирования солей.
2. Приготовьте достаточное количество реакционных смесей (контрольная реакционная
смесь (Ctrl) плюс Taq ДНК-полимераза (Taq)) для проб ДНК, одна реакция
положительного контроля и одна реакция отрицательного контроля без матрицы (ОК) в
соответствии с объемами, приведенными в Таблице 2. Включите реактивы для 1
дополнительной пробы. Реакционные смеси содержит все компоненты, необходимые для
ПЦР за исключением пробы.
Таблица 2. Приготовление реакционных смесей
Анализ
Объем реакционной смеси
Объем Taq DNA полимеразы (Taq)
Control
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
12ALA
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
12ASP
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
16
12ARG
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
12CYS
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
12SER
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
12VAL
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
13ASP
19.76 мкл x (n+2)
1.24 мкл x (n+2)
n = количество реакций (плюс контрольные образцы). При приготовлении реакционных смесей добавить
еще один образец - n+1)
Не встряхивать Taq ДНК-полимеразу (Taq) на вортексе, так как это может инактивировать
фермент.
Убедитесь, что Taq ДНК-полимераза перед использованием находится при комнатной
температуре. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы быть уверенным, что
весь фермент находится у дна пробирки. Пипеткой отберите ДНК-полимеразу (Taq),
размещая наконечник пипетки прямо под поверхностью жидкости во избежание
обволакивания наконечника избытком фермента.
3. Перемешайте реакционные смеси пипетированием 10 раз, немедленно добавить по 20
мкл в пробирки.
4. Немедленно добавить по 5 мкл пробы воды свободной от нуклеаз (H2O) для
отрицательного контроля (ПЦР-пробирки 9–16) и закрыть крышками, добавить по 5 мкл
KRAS-положительного контроля (ПЦР-пробирки 1–8) и закрыть крышками. Затем
добавить по 5 мкл тестируемой ДНК по схеме. Каждая проба ДНК должна сравниваться
как с контролем, так и со всеми мутационными анализами.
5. Закрыть пробирки Rotor-Gene Q и разместить их в соответствующих положениях в
роторном диске. Если ротор загружен неравномерно, уравновесить его дополнительными
пустыми пробирками Rotor-Gene Q. Максимально может быть проанализировано 7
образцов.
Таблица 6. Расположение контрольных (Ctrl) и анализируемых образцов
Контроли
Анализ
Control
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
13ASP
ПК
1
2
3
4
5
6
7
8
Номера образцов
ОК
9
10
11
12
13
14
15
16
1
17
18
19
20
21
22
23
24
2
25
26
27
28
29
30
31
32
3
33
34
35
36
37
38
39
40
4
41
42
43
44
45
46
47
48
5
49
50
51
52
52
54
55
56
6
57
58
59
60
61
61
63
64
7
65
66
67
68
69
70
71
72
17
6. Сразу же поместите Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q. Проследите, чтобы запирающее
кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для предотвращения
случайного открывания пробирок при анализе.
7. Открыть программу Rotor-Gene Q серии 2.0.2 или созданный температурный профиль ,
созданный согласно протокола «Rotor-Gene Q KRAS, программирование»
8. Выбрать 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметить, что
запирающее кольцо присоединено. Поставьте галочку в квадрате “Locking Ring
Attached” («Запирающее кольцо присоединено») и нажмите “Next” («Далее») (Рис. 7).
Рис. 7 Диалоговое окно «Мастер нового запуска.
9. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции, названия образцов
“Sample Layout” “1, 2, 3…” и добавьте любые дополнительные примечания. Щелкните
“Next” (Рис. 8).
Рис. 8. Установка общих параметров анализа
18
10. Это окно позволяет отредактировать температурный профиль. Щелкните “Next”
(рисунок 9).
Рис.9 Диалоговое окно «Мастер нового запуска.
11. Проверьте программирование, затем щелкните «Start Run» (Запустить программу),
чтобы сохранить файл и начните анализ (Рис. 10).
Рис. 10. Диалоговое окно «Мастер нового запуска.
19
12. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно либо ввести название
проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести их позже, нажав кнопку “Sample” во
время или после анализа. Нажатие на "Finish and Lock Samples" будет препятствовать
редактированию образцов.
13. По окончании анализа проанализируйте данные. См раздел Анализ мутаций «Mutation
detection data Analysis».
Протокол: Rotor-Gene Q KRAS, программирование
Процедура
1.Программирование температурного профиля
Установка общих параметров анализа
Рис. 11-13
Первоначальная активация фермента горячего Рис. 14
старта
Амплификация ДНК
Рис. 15-17
Подгонка флуоресцентных каналов
Рис. 18-22
Запуск анализа
Рис. 23
Суммирование параметров амплификации
Табл. 3. Программирование амплификации
Циклы
Температура
Время
1
40
95°C
95°C
60°C
15 мин.
30 сек.
60 сек.
Получение и накопление
данных
нет
нет
зеленый и желтый
Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2. На
иллюстрациях эти установки обведены толстыми черными рамками. Иллюстрации
показаны для приборов Rotor-Gene Q.
2. Дважды щелкните значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2 на рабочем
столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q. Выберите вкладку
“Advanced” («Усложненный») в появившемся диалоговом окне “New Run” («Новый
запуск»).
3. Для создания нового шаблона выберите “Empty Run” («Холостой запуск»), а затем
нажмите “New” («Новый»), чтобы ввести “New Run Wizard” («Мастер нового запуска»).
4. Выберите 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметьте, что
запирающее кольцо присоединено. Поставьте галочку в квадрате “Locking Ring Attached”
(«Запирающее кольцо присоединено») и нажмите “Next” («Далее») (Рис. 11).
20
Рис. 11. Диалоговое окно «Мастер нового запуска».
5. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции и добавьте любые
дополнительные примечания. Щелкните “Next (Рис. 12).
Рис. 12. Установка общих параметров анализа.
6. Щелкните кнопку “Edit Profile” («Редактировать профиль») в следующем диалоговом
окне “New Run Wizard” (Рис. 13) и запрограммируйте температурный профиль в
соответствии с информацией на следующих этапах.
21
Рис. 13. Редактирование профиля.
7. Щелкните кнопку “Insert after” («Ввести после») и выберите “New Hold at Temperature”
(«Новая выдержка при температуре») (Рис. 14).
Рис. 14. Начальный этап инкубации при 95°C.
8. Изменить “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C, щелкните “1” для
замены “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкните кнопку “Insert After”
(«Вести после»), а затем выберите “New Cycling” («Новая амплификация») Рис. 15).
22
Рис. 15. Начальная инкубация при 95°C.
9. Установите число циклов на 40, нажав число. Выберите первый шаг и установить “95°C
на 30 секунд” (Рис. 16).
Рис. 16. Этап амплификации при 95°C.
10. Выделить второй шаг и установить “60°C и время 60” секунд. Выберите кнопку “Not
Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 17).
23
Рис. 17. Этап амплификации при 60°C.
11. В панели “Available Channels” («Доступные каналы») выберите каналы “Yellow”
(Желтый) и “Green” (Зеленый) каналы для запроса, подсвечивая их, а затем нажмите “>”,
чтобы перенести их в панель “Acquiring Channels” («Запрашиваемые каналы») (Рис. 18).
Рис. 18. Запрос на этапе 60°C.
12. Выделите третий шаг и удалите, щелкая “–“ кнопка. Нажмите "ОК" (рисунок 19).
24
Рис. 19. Удаление этапа элонгации.
13. Щелкните кнопку “Gain Optimisation” («Оптимизация результатов») (Рис. 20).
Рис. 20. Оптимизация результатов.
14. Щелкните кнопкой “Optimise Acquiring”. Параметры настройки канала показаны для
каждого канала. Примите эти значения по умолчанию, щелкните “OK” для зеленого и
желтого каналов (рисунок 21).
25
Рис. 21. Оптимизация автоматического получения результатов с зеленого канала.
15. Щелкните “Perform Optimisation before 1st Acquisition” (Провести оптимизацию перед
1-м сбором данных), затем щелкните кнопку “Close” (Закрыть), чтобы вернуться к
Мастеру (wizard) (Рис. 22).
Рис. 22. Выбор зеленого и желтого каналов.
16. Щелкните “Next” для сохранения шаблона, выберите “Save Template” (Сохранить
шаблон), а затем сохраните шаблон в папку шаблонов.
26
17. Проверьте сводку и затем щелкните “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения
файла анализа и его запуска (Рис. 23).
Рис. 23. Запуск анализа.
18. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно либо ввести название
проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести их позже.
19. По окончании анализа проанализируйте данные согласно протоколу.
Информацию об анализе образца - см. раздел «Анализобразцов» “Sample assessment data
analysis”.
Информацию об анализе данных по мутациям - см. раздел «Анализ мутаций» “Mutation
detection data analysis”.
27
Интерпретация результатов
Анализ образцов
Аналитические параметры настройки программного обеспечения
1. Используя программное обеспечение Rotor-Gene Q series (2.0.2), откройте
соответствующий файл.
2. Щелкните “Analyse” («Анализировать»). На странице анализа щелкните
“Cycling A, Yellow” (Амплификация А, Желтый»), чтобы проверить канал
HEX.
3. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните Linear scale”
(«Линейное масштабирование»).
4. Щелкните “Outlier removal” (Удаление выбросов) и выберите "10 %".
5. Установите порог 0.05 и отметьте значения CT.
6. На странице анализа щелкните “Cycling A , Green” («Амплификация А,
Зеленый»), чтобы проверить канал FAM.
7. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните Linear scale”
(«Линейное масштабирование»).
8. Щелкните “ Удаление выбросов ” и выберите "10 %".
9. Установите порог в 0.05 и отметьте значения CT.
После окончания работы прибора проанализируйте данные.
Положительный контроль: Позитивный контроль KRAS (ПК) должен давать
контрольное значение CT (канал FAM) 23.5–29.5. Значения ΔCT положительного контроля
KRAS должны попадать в указанные интервалы значений. Значения вне этого диапазона
указывает на проблему постановки эксперимента.
Отрицательный контроль: Определите значения CT для отрицательного контроля,
чтобы удостовериться в отсутствии контаминации, дающей положительную
амплификацию в сигнале FAM (CT < 40). Гарантией правильной настройки является
попадание в диапазон 31.91–35.16 в желтом канале (yellow). В противном случае, все
результаты должны быть исключены.
При условии получения результатов с требуемыми значениями CT (в пределах диапазона
21.92–32.00) в зеленом канале (green), полученные данные анализируют.

Значение CT контрольного образца < 21.92: Если значения ΔCT контрольного
образца < 21.92, это говорит о перегрузке. Для правильного проведения анализа
образцов необходимо сконцентрированные образцы развести, чтобы они
находились в пределах вышеупомянутого диапазона (21.92–32.00).

Если значения ΔCT контрольного образца > 32,
выделение ДНК.
рекомендуется другое
28
Анализ мутаций
1. Используя программное обеспечение Rotor-Gene Q series (2.0.2), откройте
соответствующий файл.
2. Щелкните “Analyse” («Анализировать»). На странице анализа щелкните “Cycling A,
Yellow” (Амплификация А, Желтый»), чтобы проверить канал HEX.
3. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните Linear scale” («Линейное
масштабирование»).
4. Щелкните “Outlier removal” (Удаление выбросов) и выберите "10 %".
5. Установите порог 0.05 и отметьте значения CT.
6. На странице анализа щелкните “Cycling A , Green” («Амплификация А, Зеленый»),
чтобы проверить канал FAM.
7. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните Linear scale” («Линейное
масштабирование»).
8. Щелкните “Outlier removal” (Удаление выбросов) и выберите "10 %".
9. Установите порог 0.05 и отметьте значения CT.
Положительный контоль: Положительный контоль KRAS (ПК) должен давать
контрольное значение CT (канал FAM) 23.5–29.5. Значения ΔCT положительного
контроля KRAS должны попадать в указанные интервалы значений. Значения вне этого
диапазона указывает на проблему постановки эксперимента.
Отрицательный контроль: Чтобы убедиться в отсутствии загрязнения матрицы,
значение CT в контроле канале green должен быть ниже 40.
Гарантией правильной настройки является попадание в диапазон 31.91–35.16 в канале
yellow для отрицательного контроля. В противном случае, все результаты должны быть
исключены.
Анализ проб: образцы пациентов
При условии, что оба контроля валидны, значения CT для каждого образца должна быть
в пределах диапазона 21.92–32.00 в зеленом канале. Если образец вне этого диапазона,
действуйте следующим образом:

Значение CT <21.92 для контроля: Контрольные образцы с CT менее 21.92
показывают перегрузку образца. Для правильного проведения анализа
сконцентрированные образцы должны быть разведены, чтобы находится в
пределах вышеупомянутого диапазона (21.92–32.00). Чтобы попасть в пределы
вышеупомянутого диапазона необходимо развести образец, растворение на
половину увеличит CT на 1. Образцы должны растворяться с использованием воды
из набора реагентов для разведения образцов.

Значение CT для контроля > 32 интерпретируйте с осторожностью, так как очень
низкий уровень мутации может быть не обнаружен с использованием данного
набора реагентов.
29
Критерии оценки мутационного статуса
Все образцы должны быть проанализированы. Проверьте, чтобы каждая пробирка давала
сигнал HEX от внутреннего контроля. Возможно 3 варианта:

Если внутренний контроль CT находится в пределах указанного диапазона
(31.91–35.16), это - положительное амплификация.

Если внутренний контроль имеет значение CT выше указанного диапазона (>
35.16), это – отрицательная амплификация.

Если внутренний контроль, который CT ниже указанного диапазона (<31.91),
это недопустимый результат.
Значения FAM для всех семи реакционных смесей приведены в Таб. 4.
Таблица 4. Допустимые значения точки отсечения для мутаций (FAM)
Анализ
Control
12ALA
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
Значения точки отсечения CT
0.00–40.00
0.00–40.00
0.00–40.00
0.00–40.00
0.00–40.00
0.00–40.00
0.00–40.00
Значения ΔCT
≤8.00
≤6.60
≤8.00
≤8.00
≤8.00
≤7.50
≤7.50

Если значение CT по каналу FAM находится в пределах указанного диапазона, это
- положительная амплификация

Если значение CT по каналу FAM выше указанного диапазона или нет
амплификации - это отрицательный результат.
Вычислить значение ΔCT следующим образом, удостоверившись в том, что значения CT
как для мутации, так и контроля от одной и той же пробы:
[мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT
Сравните значение ΔCT для образца с допустимыми значениями (Таблица 4).
Точка отсечения это расположенная выше точка, в которой положительный сигнал мог
быть благодаря фоновому сигналу праймера ARMS для ДНК дикого типа. Если значение
ΔCT пробы выше точки отсечения, оно классифицируется как отрицательное или за
пределами чувствительности набора. Если значение ΔCT для пробы ниже точки
отсечения, оно классифицируется как положительное для мутации, выявленной
данным анализом.
30
Для каждого образца должен быть определен статус положительный, отрицательный, или
недействительный, используя следующие критерии.

Положительный: положительная амплификация в канале FAM и CT ниже точки
отсечения.

Отрицательный:
Положительная амплификация в канале FAM и CT выше точки отсечения.
Нет амплификации в канале FAM и положительная амплификация в канале HEX
(внутренний контроль).

Недействительный:
Внутренний контроль (HEX) недействителен.
Отсутствие амплификации в канале FAM и HEX.
Оценка статуса образцов на наличие мутаций.
После оценки статуса амплификации (положительная, отрицательная, недопустимые)
можно перейти к оценке наличия мутаций.
Положительный: Одна или более из семи мутаций присутствуют.
Отрицательный: Все семь мутаций отрицательны.
Недействительный: Нет положительных мутаций и одна или более аналитических
реакций на наличие мутаций недействительны.
Примечания: Если амплификация образца в канале - HEX отрицательная, а в канале FAM
- положительная, результат нужно считать действительным.
Если амплификация образца в канале - HEX отрицательная, а в канале FAM положительная, в различных пробирках, тогда результат “наличие мутации” можно
считать действительным, идентификация мутации может быть неточной.
1.1 Дополнительная информация о мутациях
Номера COSMIC взяты из Каталога
(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic).
соматических
мутаций
при
раке
Таблица 8.5. Перечень мутаций в гене KRAS и номера по COSMIC
Мутация
Замена основания
COSMID ID
12ALA
GGT>GCT
522
12ASP
12ARG
12CYS
12SER
12VAL
Gly13Asp
GGT>GAT
GGT>CGT
GGT>TGT
GGT>AGT
GGT>GTT
GGC>GAC
521
518
516
517
520
532
31
32