На правах рукописи ВАВИЛОВА Ирина Ивановна

На правах рукописи
ВАВИЛОВА
Ирина Ивановна
ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ИННЕРВАЦИОННЫХ СТРУКТУР ПИЩЕВОДА
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток
2011
2
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования
«Владивостокский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Мотавкин Павел Александрович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Черток Виктор Михайлович
ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России
кандидат биологических наук
Пущина Евгения Владиславовна
Учреждение Российской академии наук
Институт биологии моря
им. А.В. Жирмунского ДВО РАН
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования
«Дальневосточный государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Защита диссертации состоится «_18_» _ноября___ 2011 года
на заседании диссертационного совета Д 208.007.01
при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России
по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Владивостокского государственного медицинского университета
по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2б.
Автореферат разослан «12» октября 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Г.В. Рева
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Структурной организации и функциям пищевода посвящено значительное число оригинальных и обзорных работ (Мельман Е.П., 1970; Байтингер М.А., 1988 и соавт.). Тем не
менее, интерес к этому органу, занимающему важное место в структуре болезней пищеварительной системы, сохраняется и в последние годы. В оригинальных и итоговых работах важное место занимают исследования мышечной оболочки (Ступикова Е.А., 2001; Мотавкин П.А,
2004 и соавт.). Между тем, весь объем подвижности органа целиком
зависит от состояния конечного нервного звена, которым, как известно, является межмышечное или Ауэрбахово сплетение (Чичинадзе
К.И., 1960; Байтингер В.Ф., 1988 и соавт.). Кроме перистальтики нервные клетки межмышечного сплетения регулируют секреторную деятельность слизистых (кардиального типа) желез и собственных желез
подслизистой оболочки пищевода (Никитюк Р.Б., 1990; Паршин М.М.,
1990 и соавт.).
Особое внимание исследователей привлекает структура, функция
и иннервация нижнего (диафрагмального) пищеводного сфинтера (Колесников Л.Л., 2000; N.P. Hyland, 2001; и соавт.). Этот орган, обеспечивающий поступление пищи в желудок, на последнем этапе движения
препятствует ее возвращению в пищевод (Meltzer S.J., 1998; Jimenes P.,
2005). Хотя, в некоторых исследованиях наличие самого сфинктера, как
и его роль замка между пищеводом и желудком полностью отрицается
(Brombart M., 1956; Willich E., 1971).
Не уменьшается интерес к исследованиям оксида азота (NO), как
регулятора функции висцеральных систем (Ковалева C.B., 2004; Cassebbranit A., 2005). Подобными исследованиями охвачены фактически все
органы пищеварительной системы, в том числе и пищевод (Мотавкин
П.А., Романова Н.Е., 2004; Реутов В.П., 2003). Доказана локализация
нитрооксидсинтазы (NOS) и значение оксида азота (NO) в работе желез
и при регенерации после повреждения слизистой желудка, взаимодействие NO и вазоинтестинального пептида (VIP) при регуляции тонуса
гладких мышечных клеток (ГМК) и нарушениях моторики органов пищеварения (Mashimo et al., 2000; Calatayud et al., 2001). Особый интерес
исследователей привлекает участие NO в работе сфинктеров, активно
4
обсуждается роль NO в патогенезе пищеводной ахалазии (Watanade et
al., 2002). Не вызывает сомнений тот факт, что эффекты NO тесно связаны или опосредуются другими биологически активными веществами.
В числе последних холецистокинин, цинк- и медьсодержащие соединения, СО (Miller et al, 2001; West et al, 2003).
В то же время не хватает данных о местной нитрооксидергической
регуляции мышечных клеток, железистых образований и кровеносных сосудов микроциркуляторного русла (Паршина С.С., 2006; Маев И.В., 2008).
Сведений, касающихся особенностей синтеза NO в эпителии, гладких
мышечных клетках пищевода у человека и животных, недостаточно. И
они не синтезированы и не сопоставлены с топографией и значением других энзимологических структур, таких как холин- и моноаминергические
образования. В отличие от существующих литературных данных, в представленной работе исследованы каждая из оболочек пищевода в отдельности. Кроме того, самостоятельно рассмотрена иннервация кровеносных
сосудов, дана сравнительная характеристика ГМК пищеводножелудочного сфинктера и миоцитов среднего отдела пищевода.
Цель и задачи работы. Установить нейрохимическую и ультраструктурную организацию нервного аппарата пищевода в соответствии с наличием в его стенке адвентициальной, мышечной, подслизистой и слизистой оболочек и на этой основе сделать заключение о роли
каждой из них в функции пищевода как целостного органа.
В соответствии с целью решались следующие задачи:
1. Изучить цитохимическую и структурную организацию нервного
аппарата оболочек пищевода.
2. Дать цитохимическую и структурную оценку организации нервного аппарата кровеносных сосудов пищевода.
3. Установить особенности иннервации нижнего пищеводного
сфинктера.
4. В пищеводно-желудочном сфинктере идентифицировать нитрооксидергические нейроны и показать их количество и связь с мышечными,
железистыми эффекторами и кровеносными сосудами.
Научная новизна. Впервые исследована самостоятельно каждая
оболочка стенки пищевода и в соответствии с ее функцией установлены
особенности иннервации каждой в отдельности. В адвентиции найдены
5
микроганглии чувствительных нейронов. Установлено, что нервный аппарат средней оболочки не ограничивается иннервацией мышц, его
нейроны иннервируют железистый аппарат слизистой и подслизистой
оболочек. Микрососудистое русло всех оболочек пищевода имеет эффекторную холинергическую/нитрооксидергическую иннервацию, которая осуществляется нейронами Догеля первого типа в основном Ауэрбахова сплетения.
Анализ данных литературы показал, что вопросы сравнительной
характеристики ГМК пищеводно-желудочного сфинктера и миоцитов
среднего отдела пищевода человека изучены недостаточно. Установлено, что концентрация нервных волокон в нижнем пищеводном сфинктере значительно выше других отделов органа, что соответствует уровню
развития мышечных элементов данной структуры.
Теоретическое и практическое значение. Полученные сведения расширяют представление о механизмах регуляции пищевода.
Приведенные в работе данные о функциях оболочек пищевода, интегрируемых в его физиологическую деятельность, как целостного
органа, посредством местных и центральных механизмов, важны
для изучения процессов иннервации и васкуляризации данного органа, а также для исследования патогенетических механизмов при
заболеваниях пищеварительной системы. Результаты могут быть
использованы в научно-исследовательских работах, лекционном
курсе и при проведении практических занятий по гистологии у студентов медицинских вузов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научной конференции «Успехи современного
естествознания»,
2003.
Тихоокеанских
научнопрактических конференциях с международным участием студентов и
молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» III (Владивосток, 2002); V (Владивосток, 2004); IХ (Владивосток, 2008); Х (Владивосток, 2009); ХI
(Владивосток, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ,
в том числе 1 – в журнале, рекомендуемом ВАК для публикации материалов докторских диссертаций.
6
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, шести глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из 186 источников, в том числе 96
отечественных и 90 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 69 рисунками, 4 таблицами и 3 приложениями.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Нейроны адвентиции пищевода, положительно реагирующие на
синтазу оксида азота, являются начальным звеном местных рефлексов.
2. В Ауэрбаховом сплетении мышечной оболочки существует
прямая связь нитрооксидергических/холинергических аксонов с мышечными волокнами, ГМК, мастоцитами и кровеносными сосудами.
3. Простые трубчатые железы кардиального типа нижней трети
пищевода и мышечная пластинка слизистой получают иннервацию от
нейронов слизистой оболочки и подслизистой основы пищевода. Дополнительно трубчатые железы и мышечная пластинка пищевода иннервируются из Ауэрбахова сплетения аксонами нейронов первого типа.
4. Кровеносные сосуды оболочек пищевода получают двойную нитрооксидергическую/холинергическую и моноаминергическую иннервацию.
5. Все оболочки пищевода имеют хорошо развитую сенсорную
иннервацию. Дендриты протонейронов образуют в основном два вида
рецепторов: древовидные окончания с широким ветвлением терминальных ветвей и густые нервные клубочки с высокой концентрацией тончайших нервных волокон.
6. Функция оболочек интегрируется в физиологическую деятельность пищевода, как целостного органа, местными (Ауэрбахово сплетение) и центральными механизмами, главным образом системой блуждающего нерва.
Соответствие диссертации паспорту специальности. Согласно
формуле специальности, клеточная биология, цитология, гистология –
область науки, занимающаяся исследованием происхождения, строения,
развития, функционирования клеток и тканей, их взаимодействия в процессе жизнедеятельности организма как в норме, так и при различных
патологических нарушениях. Отраженные в диссертации научные положения соответствуют формуле и области исследования специальности
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология.
7
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Иннервация пищевода
кошки, крысы и человека изучалась на всем протяжении, включая
верхнюю, среднюю и нижнюю трети. Исследование проводилось на
белых половозрелых крысах-самцах (массой 150-165 грамм), содержащихся в стандартных условиях вивария (n=17), кошках (n=6) и
аутопсийном материале (n=8). Материал обрабатывали в течение 20
мин после забоя; эвтаназия крыс проводилась путем декапитации.
Исследовались кошки, погибшие от травм или во время операций и
не имевшие к моменту смерти патологии органов пищеварения. Пищевод изымался на всем протяжении для изготовления продольных и
поперечных срезов.
Аутопсийный материал получен при судебно-медицинской экспертизе (n=8), от умерших или погибших в возрасте 32-65 лет от случайных причин, не связанных с патологией органов пищеварения. Из
пищевода (верхняя, средняя и нижняя части) вырезали кусочки до 1,5
см для изготовления продольных и поперечных срезов.
В работе использованы морфологические (импрегнация азотнокислым серебром по Кахалю, окраска гематоксилин-эозин, окраска метиленовым синим), гистохимические (NADPH-диафораза, метод Келле,
метод Фурнеса и Коста с глиоксиловой кислотой), электронномикроскопический и морфометрические методы.
1. Морфологические методы. Кусочки пищевода толщиной 0,5
фиксировали в нейтральном формалине и импрегнировали in toto по методу Кахаля и изготовляли срезы толщиной от 25 до 30 мкм. Цитоархитектоника и структура нейронов пищевода изучалась с применением
окраски гематоксилин-эозином и метиленовым синим; окраска производилась по общепринятой методике (Меркулов, 1968).
2. Гистохимические методы. Холинергические нервные проводники устанавливали на препаратах, приготовленных на криостате по активности ацетилхолинэстеразы тиохолиновым методом Келле. Препараты выдерживали в инкубационной среде, используя в качестве субстрата ацетилтиохолин йодистый. Инкубацию проводили в термостате при
постоянной tº-ре 37ºС от 30 мин до 2х часов. Для определения биогенных аминов использовали флуоресцентно-гистохимический метод Фур-
8
неса и Коста с глиоксиловой кислотой. Флуоресценцию продуктов реакции наблюдали и фотографировали на люминесцентном микроскопе
МЛ-2 при свете с длиной волны 390 – 410.
NADPH-диафоразу, исследовали методом предложенным Hope,
Vincent (1989). Метод позволяет диагностировать морфологию нейронов за счет выявления тел и отростков. Изучение состояния фермента
проводилось на срезах, взятых из верхней, средней и нижней частей
пищевода. Материал погружали в охлажденный, приготовленный на 0,1
М фосфатном буфере (pH 7,4) 4% параформальдегид, который из всего
класса диафораз сохраняет активность только NADPH-диафоразы; два
часа фиксировали при температуре 4ºС, затем сутки промывали при той
же температуре в 15% растворе сахарозы. Из замороженных в криостате
срезов изготавливали образцы толщиной 10 мкм, монтировали на предметные стекла и помещали в среду. Инкубацию проводили в течение 60
мин при температуре 370С, после чего ополаскивали в дистилляте, обезвоживали и заключали в бальзам. Обработку изображения проводили с
помощью программ Adobe Photoshop 5.0. Активность фермента выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).
3. Электронная микроскопия. Для электронной микроскопии кусочки материала размером 1-2 мм фиксировали в 2-5% растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (ph 7,3) в течение двух часов при tº-ре 4ºС. Дофиксацию проводили в 1% 4окси осмия в течение двух часов при той же температуре. Обезвоживали материал в
спиртах возрастающей крепости от 70º до 100º. После чего материал
заливали в смесь эпона-812 и эралдита. Из блоков изготавливали
срезы, которые изучали в электронном микроскопе на базе института микробиологии.
4. Морфометрия. Морфометрическую обработку данных проводили с
помощью видеосистемы, смонтированной на микроденситометре Olimpus
(видео-тест-5.0) Определяли величину мышечных клеток, количество
нейронов, среднюю площадь нейрона, среднюю площадь ядра, толщину
аксона; высчитывали среднее арифметическое, стандартную ошибку и
критерий различий. Разницу между средними арифметическими считали достоверной при значении р<0,05.
Использованные методы и количество изготовленных препаратов
представлено на табл. 1.
9
Таблица 1
Методы и количество изученных препаратов
Количество изученных препаратов
Методы
крыса (n=17)
кошка (n=6)
человек (n=8)
NADPH-диафоразу
Импрегнация по Кахалю
Метиленовым синим
Гематоксили-эозин
Келле
Фурнеса и Коста
Электронная микроскопия
20
12
8
10
10
12
10
9
8
-
20
15
12
8
10
Результаты исследования и их обсуждение
Оболочки пищевода, имея определенную автономность, образуют
орган как целое. Орган имеет ключевые нервные механизмы, обеспечивающие его интегративную деятельность. В плане относительной автономности оболочек, особенностей их иннервации и васкуляризации мы
подведем некоторые общие итоги наших исследований.
Одной из наиболее заметных структур адвентициальной оболочки
пищевода мы считаем наличие в ней небольших групп нейронов. Гетеротопические псевдоуниполяры установлены у человека, кошки, крысы (табл. 2).
Они - постоянные образования адвентиции и являются чувствительным элементом местных рефлексов. В адвентиции пищевода у всех исследованных
видов установлены довольно крупные нервы. Они делятся на ветви разной
толщины, которые частично пенетрируют мышечную оболочку. В составе
нервов имелись как мякотные волокна толщиной 12–18 мкм, так и типичные
безмякотные кабельной организации. В цитоплазме одной швановской
клетки находилось 10–20 аксонов диаметром от 0,3 до 1 мкм.
Перерезкой блуждающего нерва у крыс установлено, что в нервах адвентиции имеются преимущественно мякотные преганглионарные волокна.
В то же время тонкие амиелиновые аксоны молиниформного вида сохраняли анатомическую целостность и, очевидно, были симпатическими. Цитохимическая ревизия нервов показала наличие в них адренергических аксонов и вывод об их симпатической природе не может быть оспорен.
10
Примечания
Активность
NO-синтазы
Оптическая
Плотность осадка
на NADPH-d
(ЕОП)
Ср. S ядра (в мкм2)
Ср.S (в мкм2)
нейрона
Кол-во нейронов
в группе «усл. узле»
Человек
(n=8)
9,0±3,2
732±32,1
168±8,1
0,493±0,2
Кошка
(n=6)
Спорадические
нейроны имеют
высокая S=1641 мкм2 и
не реагируют на
NADPH-d
12±2,1
710±41,2
156±6,9
0,539±0,19 высокая
Крыса
(n=17)
Вид
Таблица 2
Морфометрические характеристики чувствительных нейронов
адвентиции пищевода
10±1,5
705±39,6
170±12,2
0,546±0,3
высокая
Адвентиция пищевода является источником интерорецепторных
рефлексов. Толстые мякотные нервные проводники, исключая преганглионарные волокна, являются чувствительными, так как образуют в
наружной оболочке пищевода типичные по строению древовидные и
клубочковые рецепторы.
Из трех исследованных нами видов наиболее мощное развитие
имеет мышечная оболочка человека. На протяжении оболочки имеется
несколько сужений и расширений. В связи с клиническим значением
особое внимание получил нижний пищеводный сфинктер. Мышечная
оболочка пищевода человека структурно и функционально на протяжении органа заметно меняется. В верхних отделах она состоит из поперечно-полосатой мышечной ткани, а в нижних отделах оболочку формируют гладкие мышечные клетки (ГМК). Однако обе ткани функционально автономны, их работа не контролируется сознанием. У крысы
11
мышечная оболочка на всем протяжении пищевода образована поперечно-полосатой мышечной тканью. У кошки эта ткань в нижней поддиафрагмальной части полностью заменяется ГМК.
Взаимодействие между нервами и мышечным вооружением
пищевода является одной из особо важных проблем. Прямыми микроскопическими наблюдениями нами установлено, что с мышцами
взаимодействуют постганглионарные холинергичесике волокна
местных нейронов. Таких волокон, как показывают наши исследования, довольно много. Они образуют на мышцах характерные терминали с двигательной функцией. Структура двигательного аппарата
лучше определяется импрегнацией материала азотно-кислым серебром. Терминали имели гроздевидный тип и напоминали двигательную бляшку. Сходные терминали установлены нами при исследовании нитрооксидсинтазы.
В циркулярном слое гладких мышц пищевода человека такие
гроздевидные аппараты идентифицировались неоднократно, иногда
группами на ограниченном участке мышечной ткани. Наличие терминалей на мышцах пищевода окончательно доказано электронномикроскопическими исследованиями. На электроннограммах видны
профили холинергических и адренергических окончаний, расположенных от ГМК на расстоянии 250 нм – 1,5 мкм. Однако это не препятствует аксональному комплексу взаимодействовать с мышцами
путем объемной нейротрансмиссии.
Мы полагаем, что в регуляции мышц пищевода решающее значение имеют не нервные окончания, а многочисленные варикозные утолщения аксона. Система этих утолщений позволяет вовлекать в рабочий
акт одновременно группы мышечных волокон и воздействовать на всем
их протяжении.
Между поперечным и продольным мышечными слоями располагаются межмышечное или Ауэрбахово сплетение, которое у животных и
человека хорошо развито. Оно состоит из одиночных нейронов, их
групп и сетей из нервных волокон, большинство из которых идентифицируется на NADPH-d. У крысы в межмышечном соединительнотканном интерстиции на всем протяжении пищевода нейроны имеют высокую активность нитрооксидсинтазы. Это в основном клетки первого типа. Очень редко выявлялись мини нейроны, которые характерны для
12
межмышечного сплетения крысы. Мини нейроны чаще наблюдались в
верхней части проксимального отдела пищевода.
Группы нейронов межмышечной локализации нельзя назвать истинными ганглиями. Они не имели капсулы, т.е. не были выделены из
межуточной ткани, не имели собственного микроциркуляторного русла;
их трофика зависела от интерстициальных капилляров. Группы нейронов включали от 8 до 12 клеток примерно одинаковой величины и формы. Около нервных клеток постоянно выявлялись густые сети из тонких
молиниформных нитрооксидергических волокон. Из нервных сетей, а
иногда прямо от тел нервных клеток отходили в мышечную ткань аксоны, которые стелились по мышечному волокну, контактируя с ним веретеновидными утолщениями. Связи между нейронами и стенками кровеносных сосудов наблюдались постоянно. В сплетениях из нитрооксидергических волокон у крысы располагались группами тучные клетки
диаметром в 15-20 мкм. Аксоны нервных сплетений взаимодействовали
с мастоцитами и, вполне вероятно, могли контролировать их функцию с
помощью объемной (дистантной) трансмиссии.
У кошки межмышечное сплетение развито несколько лучше, чем у
крысы. Отдельные нитрооксидергические нейроны – это довольно редкое явление. Группы клеток состояли из 8–12 нейронов. Нервные сплетения имели густую сеть аксонов, среди которых лежали нейроны различной величины и формы. Из сплетений начинались волокна, которые
контурировали ГМК в продольном и циркулярном слоях оболочки.
Довольно крупные ярко окрашенные нервы и отдельные нитрооксидергические веретеновидные волокна десятками присутствовали в
циркулярном слое по всей его толщине. По ходу они давали тончайшие
коллатерали, которые контактировали утолщениями с оболочкой мышечной клетки, так же плотно, как это мы наблюдали у крысы.
В продольном слое нитрооксидергические нервы шли параллельно
пучками из миоцитов и крайне редко обменивались между собой аксонами. Общее построение Ауэрбахова сплетения кошки качественно не
отличалось от того, что наблюдалось нами у крысы. Количественные
различия, несомненно, были, так как у кошки пищевод больше, чем у
крысы и в длину, и в толщину.
Организация Ауэрбахова сплетения пищевода человека в основных своих чертах повторяла организацию его в пищеводе крысы и кош-
13
ки. Нервные сплетения животных и человека различались, прежде всего, по количественным параметрам, которые соответствовали длине и
толщине пищевода, массивностью мышечного вооружения.
В межмышечном сплетении человека формировались нервные
ганглии. Они имели тонкую хорошо различимую соединительнотканную оболочку. Ее пенетрировали мелкие кровеносные сосуды,
распадавшиеся в узле на капилляры. Узлы имели в длину до 1 мм и в
толщину до 0,5–0,6 мм. Их форма разнообразилась от довольно правильной овальной до сильно вытянутой веретеновидной, иногда
узел суживался до формы похожей на копье. В срезах узла насчитывалось не менее 10 и очень редко до 15 нейронов. Относительное
число нитрооксидергических нейронов у человека составляло 79%; у
крысы их содержание поднималось до 89% (рис. 1). Одиночные
нейроны встречались редко, то есть большинство их было аккумулировано в ганглии.
%
100
89
90
77
80
79
70
60
50
40
30
20
10
0
Крыса
Кошка
Человек
Рис. 1. Относительное число нейронов с положительной реакцией на
NADPH-d.
14
Большинство нейронов это типичные клетки первого типа. От
их тела широким основанием отходили толстые короткие дендриты,
заканчивающиеся рецепторными площадками. У человека преобладали нейроциты с профильным полем от 896,68 до 1916,94 мкм 2. У
крысы по размеру профильного поля преобладали клетки от 213,29
до 916,31; у кошки большинство нейронов имели поле 794,91, а самые крупные клетки уступали по размерам нейронов человека и
крысы (рис. 2).
2
1800
1600
мкм
1516
1349
1239
1400
1200
1000
896
916
794
800
600
400
246
196
213
200
0
Человек
Кошка
Крупные нейроны
Средние нейроны
Крыса
Малые нейроны
Рис. 2. Профильное поле нейронов. Диаграмма составлена согласно табл. 3.
Мы считаем, что территорию Ауэрбахова сплетения нельзя
ограничивать межмышечной областью. Оно простирается на всю
толщу стенки пищевода и имеет отношение ко всем его клеточным и
тканевым структурам. Вероятно, аксоны нейронов Ауэрбахова сплетения составляют не малую долю нервных элементов подслизистой
оболочки.
В пищеводе выделяют некоторое число сужений. Однако к типичному сфинктеру относят только один – нижний пищеводный или
15
пищеводно-желудочный, который начинает формироваться у детей
4–5 недель, его организация заканчивается в юношеском возрасте
(Еремченко К.В., 2009). У животных, например, крыс характерного
сфинктера нет.
Толщина ГМК сфинктера больше толщины клеток средней части
пищевода, по активности NO-синтазы они не различаются (табл. 3).
Таблица 3
Морфометрия гладких мышечных клеток
(n=6)
Кошка
Человек (n=8)
Вид
Средний диаметр
в ядерной части
(в мкм)
средняя
нижний
часть писфинктер
щевода
3,75±0,01
–
1,66±0,02
1,96±0,03
Плотность осадка
при реакции
на NADPH-d (ЕОП)
средняя
нижний
часть писфинктер
щевода
0,279±0,03
–
Активность
Различий в активности NOсинтазы между
0,264±0,04 сфинктером и
средней частью
пищевода нет
0,238±0,09
–
Примечание: различия в диаметре миоцитов между сфинктером и средней
частью пищевода достоверны (р < 0,001). Различия в активности NADPH-d
не достоверны (p>0,05).
Вдоль ГМК располагаются тонкие нитрооксидпозитивные аксоны,
которые находятся по бокам клеток. Реакция на ацетилхолинэстеразу
показала наличие в сфинктере ограниченного числа холинергических
нейронов, собранных в группы по периферии пищеводного сужения.
Обилие холинергических нервных волокон, сопровождающих ГМК, допускает предположение о том, что часть нервных проводников приходит из других узлов Ауэрбахова сплетения. Количественный анализ аксонов на препаратах, окрашенных на NADPH-диафоразу и препаратах,
на которых идентифицирована ацетилхолинэстераза, показывает их
16
примерное равенство (18 против 20, 17 против 19). Это убеждает нас в
том, что это один и тот же аксон имеет оба фермента.
Рефлекторная регуляция функций нижнего пищеводного сфинктера всецело зависит от наличия в нем нервных рецепторов, их количества
и особенностей структурной организации. Импрегнация соответствующего материала выделила характерные для местного афферентного аппарата структуры. Прежде всего, наличие толстых нервных волокон типа А, для которых характерны многочисленные дихотомии с образованием дочерних веточек. Эти волокна являются дендритами чувствительных клеток узлов блуждающего нерва. Дендриты формировали в
пределах сфинктера рецепторы двух видов. Одни из них имели форму
рыхлых клубочков и располагались одновременно на стенке артериолы
и рядом в интерстиции. Они образованы в большинстве сильно извитыми нервными волокнами. В формировании солитарных нервных клубочков принимали участие иногда несколько чувствительных волокон.
Таким образом, сфинктер имеет афферентные и эфферентные
нервные формирования, которые обеспечивают его нервно-рефлекторную регуляцию.
В слизистой и подслизистой основе имеются единичные
нейроны, дающие положительную реакцию на NADPH-диафоразу.
Прямыми микроскопическими наблюдениями установлено, что они
имеют отношение к иннервации ГМК слизистой оболочки и простых трубчатых желез. Этих клеток явно недостаточно для полной
иннервации железистых и сократительных клеток мышечной пластинки слизистой. Нами замечено, что полнота их иннервации более значительна, чем число местных нейронов. Поэтому иннервацию слизистой оболочки дополняют аксоны клеток межмышечного
сплетения, которые поднимаются до базальной мембраны многослойного плоского эпителия и, местами пенетрируя ее, заканчиваются на основании примембранных эпителиоцитов.
Эфферентную нитрооксидергическую иннервацию получают слизистые железы подслизистой пластинки. По внутренней поверхности
этих железистых органов циркулярно располагаются сети из нитрооксидергических аксонов, образующие густые сплетения в основании желез. Оксид азота, триггером которого является ацетилхолин, регулирует
секрецию слизи, постоянно покрывающую эпителиальную поверхность
17
пищевода. Железы подслизистого слоя получают эфферентную иннервацию из мышечного сплетения. Из него начинаются аксоны, объединяющиеся в пучки. Разветвляясь веерообразно, они пронизывают железу от основания до общего протока, тесно с ним контактируя. Слизистая
оболочка и подслизистая основа имеют развитую сеть из микрососудов
и среди них особо высокую концентрацию капилляров. Вся микроциркуляторная система обильно иннервирована нитрооксидергическими
аксонами.
Слизистая оболочка пищевода чувствительна к температурным и
механическим раздражителям, способным вызвать болевые ощущения,
в которых принимают участие чувствительные нервы. Мякотные проводники вагуса образуют нервные рецепторы, часть из которых принадлежит нейронам спинномозговых узлов и, вероятно, местным сенсорным нейроцитам (Амвросьев Д.П; Ковик Л.Н., 1978). Последних очень
мало и охватить весь пищевод чувствительными нервными окончаниями они не в состоянии. Поэтому основная чувствительность тканей пищевода зависит от псевдоуниполярных нейронов верхних грудных ганглиев (Емануйлов А.И., 2004), и, как нами показано ранее, от нейронов
блуждающего нерва. Следовательно, в слизистой оболочке и подслизистой основе имеется свой местный и центральный нервнорефлекторный аппарат, обеспечивающий весь объем функций этих оболочек. Определяющим трофическим фактором всей деятельности пищевода являются структурно-функциональные составные его сосудистой системы.
В нашей работе показано, что вся микрососудистая сеть оболочек
представляет собой терминальные ветвления артерий наружной оболочки пищевода. Распадаясь на ветви, эти сосуды заметнее всего обеспечивают трофику средней оболочки. Ее мышечное вооружение постепенно
уменьшается, количество мышечных слоев сокращается до одного на
терминальных артериолах. В соответствии с этим изменяется на стенке
артерии содержание нервных волокон, количество их на артериолах падает до 3 – 4, иногда собранных в тонкий пучок.
Мы уделили наибольшее внимание нитрооксидергической иннервации сосудов пищевода, прежде всего потому, что, если нервный аппарат органа, особенно Ауэрбахово нервное сплетение, исследовано в
многочисленных работах (Колосов Н.Г., 1956; Шугольский В.Ф., 2008),
18
то кровеносным сосудам уделено недостаточное внимание. Отмечена
возможность аксонов клеток I типа вступать в сосудистые периадвентициальные нервы. Этот очень важный факт нами подтвержден и зарегистрирован многократно, как свидетельство парасимпатической иннервации кровеносных сосудов пищевода. Исследование ацетилхолинэстеразы и NADPH- на предмет наличия холинергических/нитрооксидергических аксонов и клеток подтверждает это положение. Холинергические волокна диагностированы и электронномикроскопическими исследованиями. В терминалях аксона установлены электронносветлые синаптические пузырьки.
Элементы моноаминергической иннервации выявлены в виде
довольно густых сетей из веретеновидных ярко люминесцирующих
волокон. Их терминали, взаимодействующие с мышечными клетками, заключают синаптические везикулы до 120 нм с электронноплотными глобулами или пузырьки 40 – 50 нм с одной точечной
гранулой; это, несомненно, моноаминергические аксоны и окончания.
Можно считать, что в иннервации мышечной оболочки артерии принимают участие холин/нитрооксидергические и моноаминергические нервные механизмы. Наиболее яркие доказательства об
участии в местной регуляции сосудов и тучных клеток показаны на
крысах. На примере многих органов доказано, что холинергическая
иннервация обеспечивает выведение из мастоцитов биологически
активных веществ в среду, а адренергические нервы стимулируют
секреторные процессы в этих клетках. Нитрооксидергические аксоны находятся рядом с мастоцитами и, очевидно, могут считаться по
отношению к тучной клетке эффекторными.
Многолетние дискуссии о возможности эффекторной нервной
регуляции капиллярного кровотока оказались малорезультативными.
Показано, что двигательная иннервация, регулирующая приток крови в капиллярах, заканчивается на терминальных артериолах. В результате поиска капиллярных эффекторов в эндотелии капилляров
мозга найдена холинацетилтрансфераза, синтезирующая ацетилхолин (Черток В.М., 1980; Мотавкин П.А., 1983). Другой фермент холинергической трансмиссии, ацетилхолинэстераза, описана на микрососудах мозга многократно (Furchgott R.F., 1980; Zoccoli G., 2000
19
et. al.). Совокупность ХАТ и АХ решает одну сторону подвижности
капилляров, например, их дилатацию. Этот механизм взаимосвязан
со способностью эндотелия капилляра синтезировать NO. Реакцию
капилляра – его сужение, при наличии в эндотелиоцитах активных
филаментов, может выполнять эндотелин. В подвижности капилляра
играют роль перициты. Капиллярный кровоток зависит, бесспорно,
от функций нитрооксидергических нервов. Аксоны идут в пучках и
по отдельности, то приближаясь вплотную к стенке сосуда, то удаляясь от нее. Эти дистанции не превышают 250 нм – 1,5 мкм, а местами
аксон прилегает вплотную к стенке капилляра. Обозначенные расстояния не препятствуют аксону взаимодействовать со стенкой микрососуда.
Недавними исследованиями установлено, что капилляры большинства органов, имеют чувствительную иннервацию (Григорьева,
1954). Особого внимания заслуживают нервные рецепторы поливалентного типа, иннервирующие одновременно разные тканевые элементы. Через них возможна интегрированная регуляция оболочек
пищевода. Большое значение в интегративной функции принадлежит
униполярному нейрону, дендриты которого, широко ветвясь, захватывает всю толщу стенки пищевода, и его значительную территорию
по длине. Именно за это свойство акад. Заварзин (1985) назвал чувствительный нейрон поливалентным. Нервные рецепторы этой организации установлены нами во всех оболочках пищевода. Общие
принципы организации нервного аппарата у исследованных нами
животных и человека в основных своих чертах весьма сходны.
Имеются чисто количественные различия, они связаны с особенностями строения пищевода, его длиной и толщиной стенок. Различия в количестве нейронов в условном нервном узле и в равной
единице площади у человека и животных одинаковы. Нейроны статистически не различаются по размерам и активности NADPHдиафоразы. Надо полагать, что все NO-ергические нейроны с их отростками и окончаниями являются холинергическими. В то же время
адренергические клетки не экспрессируют NO.
В наших исследованиях это доказывается весьма наглядно на
примере моноаминергических тучных клеток. Их много у крысы, они
имеют размеры по диаметру от 15 до 20 мкм; встречаются изредка
20
экземпляры до 30 мкм. Ни в одном случае мы не зарегестрировали в
этих клетках положительную реакцию на NADPH-d. Хотя в условиях
патологии, при смене позиционной информации, этот фермент может
экспрессироваться (Мотавкин, Гельцер, 1999).
Каждая оболочка пищевода в соответствии со своим положением и структурной организацией имеет заметные различия в содержании нервных элементов. Только в наружной оболочке содержатся
нейроны сходные с чувствительными псевдоуниполярами и крупные
нервные стволы центрального происхождения.
По количественному содержанию нейронов выделяется мышечная оболочка, где имеются клетки первого и второго типов и мини-нейроны в составе Ауэрбахова сплетения. Установлено твердо,
что нейроны его являются в основном холинергическими, а их NOергическая характеристика раньше нас была показана в работах Романовой (2004) и Мотавкина (1998, 2000); наши результаты совпадают с данными исследованиями. Нами достоверно установлено, что
аксоны первого типа вступают в периферические нервы и иннервируют не только мышцы, но и кровеносные сосуды пищевода.
Среди особенностей организации слизистой и подслизистой
оболочек следует считать наличие желез и мышечной пластинки.
Она хорошо развита в нижних отделах пищевода, но в верхних отделах представлена отдельными мышечными пучками. В подслизистой
и слизистой встречаются мини-нейроны. Количество их не велико.
Крупные пучки нервов, подходящих к собственной пластинке слизистой оболочки приходят из Ауэрбахова сплетения.
Обильную NO-ергическую иннервацию, за счет нервов межмышечного сплетения, получают железы подслизистой и простые
трубчатые железы пищевода. Нервы отвечают за секрецию и выделение на поверхность пищевода секрета, увлажняющего его покровный эпителий.
Целостную работу пищевода, связь оболочек в орган обеспечивают два механизма: центральный парасимпатический – блуждающий
нерв, участие которого мы показали в эксперименте, и симпатический –
адренергические волокна которого постоянно имеются в пищеводе; а
также местный механизм, в котором принимают чувствительные и эф-
21
фекторные, в основном холин/нитрооксидергические интрамуральные
нейроны и, по всем данным, тучные клетки.
ВЫВОДЫ
1. Исследована структура, цитохимия и энзимохимия нервного аппарата пищевода в соответствии с организацией его стенки из оболочек у человека, кошки, крысы.
2. В адвентиции пищевода установлено наличие местных нейронов с
сенсорной функцией, положительно реагирующих на нитрооксидсинтазу. Высказано предположение, что эти нейроны могут
быть начальным звеном местных рефлексов.
3. В Ауэрбаховом сплетении мышечной оболочки выявлены нитрооксидергические/холинергические нейроны, в основном первого типа
Догеля. Показаны связи нитрооксидергических/холинергических аксонов с поперечно-полосатыми мышечными волокнами, гладкомышечными клетками, мастоцитами и кровеносными сосудами.
4. В слизистой оболочке и подслизистой основе найдено ограниченное число нитрооксидергических/холинергических нейронов,
участвующих в иннервации tunica muscularis mucosae и простых
трубчатых желез.
5. Железы подслизистой основы иннервируются из Ауэрбахова сплетения
нитрооксидергическими/холинергическими
аксонами
нейронов первого типа. Нервные сплетения охватывают выводные
протоки и альвеолярно-трубчатые отделы главных желез.
6. Нижний пищеводно-желудочный сфинктер человека образован из
гладкомышечных клеток, имеющих достоверно больший диаметр,
чем соответствующие клетки среднего отдела пищевода. Сфинктер
иннервируется местными нейронами межмышечного сплетения.
7. Артерии и вены оболочек пищевода получают двойную нитрооксидергическую/холинергическую и моноаминергическую иннервацию. Капилляры на всем протяжении сопровождаются нитрооксидергическими аксонами.
8. Все оболочки пищевода имеют хорошо развитую сенсорную иннервацию. Дендриты протонейронов образуют два вида рецепторов: древовидные окончания и густые нервные клубочки с высокой концентрацией нервных волокон.
22
9. Деятельность оболочек пищевода интегрируется местными (Ауэрбахово сплетение) и центральными механизмами, главным образом системой блуждающего нерва.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Вавилова И.И. Нитрооксидергические нейроны пищевода человека и крысы // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: Тез. докладов III Тихоокеанской науч.-практ. конф. – Владивосток. 2002. – С. 21.
2. Вавилова И.И. Морфологические основы NO-ергической регуляции органов желудочно-кишечного тракта // Успехи современного
естествознания. – 2003. – № 10. – С. 96–98.
3. Вавилова И.И. Особенности NO-продуцирующей функции эпителия и нервного аппарата пищевода у крысы и человека.// Успехи
современного естествознания. – 2003. – № 7. – С. 120–123.
4. Вавилова И.И. Нитрооксидергическая иннервация пищевода крысы // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: Тез. докладов V Тихоокеанской
науч.-практ. конф. – Владивосток. 2004. – С. 19.
5. Вавилова И.И. NO-ергическая иннервация артериол нижнего отдела пищевода // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: Тез. докладов IХ Тихоокеанской науч.-практ. конф. – Владивосток. 2008. – С. 34–35.
6. Вавилова И.И. Нитрооксидергическая иннервация поперечнополосатых мышц пищевода // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: Тез.
докладов III Тихоокеанской науч.-практ. конф. – Владивосток.
2009. – С. 23.
7. Вавилова И.И. Местная афферентная иннервация пищевода // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и
клинической медицины: Тез. докладов III Тихоокеанской науч.практ. конф. – Владивосток. 2009. – С. 24.
8. Вавилова И.И., Андреева Н.А., Романова Н.Е. Эффекторная иннервация внутриорганных артериол пищевода // Тихоокеанский
медицинский журнал. 2009. № 1. С. 37–39.
23
9. Вавилова И.И. Нитрооксидергическая иннервация кровеносных
сосудов //Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: Тез. докладов XI Тихоокеанской науч.-практ. конф. – Владивосток. 2010. – С. 26–27.
Вавилова Ирина Ивановна
ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ИННЕРВАЦИОННЫХ СТРУКТУР ПИЩЕВОДА
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Подписано в печать 05.10.2011
Формат 60×90 1/16. Усл. п.л. 1,0.
Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 676
Отпечатано на участке оперативной полиграфии
24
типографии ООО «Рея»
г. Владивосток, ул. Адм. Юмашева, 42б