Инструкция - ИнтерЛабСервис

ОКП
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор
ООО «ИнтерЛабСервис»
И. А. Гущина __________
«____»_________________2012 г.
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для
лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на
оборудовании Rotor-Gene с функцией HRM
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» на 24 образца
Соответствует требованиям национальных стандартов и технической документации
изготовителя
Компания QIAGEN является ведущим поставщиком инновационных технологий в
области молекулярной диагностики. Компания QIAGEN устанавливает стандарты в
следующих областях:





Очистка РНК, ДНК и белков
Исследование нуклеиновых кислот и белков
Исследование микроРНК и РНК-интерференции
Выявление генетических и эпигенетических факторов онкологических заболеваний
Автоматизация технологии пробоподготовки и исследований
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных
исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании RotorGene с функцией HRM предназначены для качественной оценки мутационного статуса в
онкогенах EGFR, KRAS, BRAF из ДНК человека, выделенной из зафиксированных в
формалине и залитых в парафин образцов опухолевой ткани. Наборы реагентов могут
применяться в клинической лабораторной диагностике.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» предназначен для выявления 29 соматических мутаций в
онкогене EGFR и обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор
реагентов валидирован для приборов Rotor-Gene® Q 5plex HRM и Rotor-Gene® Q 6.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» должен применяться обученным персоналом в специально
оборудованной лаборатории с пробами ДНК, извлеченными из фиксированной
формалином и залитой парафином ткани немелкоклеточного рака легких.
2
I. Состав
1. Состав наборов реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для
лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на
оборудовании Rotor Gene с функцией HRM
1.1. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» на 24 образца.
II. Общая информация
1. Хранение
2. Назначение
3. Ограничение использования
4. Контроль качества
5. Информация по технике безопасности
III. Принципы работы с наборами реагентов
1. Принципы работы с наборами реагентов для определения соматических мутаций
в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в
реальном времени на оборудовании Rotor Gene с функцией HRM
1.1. Общие сведения
1.2. Принцип метода
1.3. Оборудование и реактивы, приобретаемые отдельно
1.4. Меры предосторожности
1.5. Формат набора
1.6. Определение исходного материала для анализа
1.7. Выделение ДНК
1.8. Внутренние контроли. Контроль суммарной ДНК в пробе
1.9. Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе.
1.10. Анализ данных
1.11. Протоколы
 Определение суммарной ДНК в пробах
 Выявление мутаций в гене EGFR и анализ данных
1.12. Руководство по устранению неисправностей
Приложение А: Анализ данных на приборе Rotor Gene Q
1.1.
1.2.
1.3.
Анализ отрицательного контроля
Анализ проб и положительного контроля
Анализ проб с использованием программного обеспечения Rotor Gene серии 2.0.2
Приложение В: Дополнительная информация о мутациях
3
I. Состав
1. Состав наборов реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для
лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на
оборудовании Rotor Gene с функцией HRM
1.1. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» на 24 образца.
Название
Красный
Фиолетовый
Оранжевый
Розовый
Зеленый
Контрольная реакционная смесь
Control Reaction Mix
Реакционная смесь T790M
T790M Reaction Mix
Реакционная смесь для делеций
Deletions Reaction Mix
Реакционная смесь L858R
L858R Reaction Mix
Реакционная смесь L861Q
L861Q Reaction Mix
Объем
Кол-во
Ctrl
600 мкл
2 шт.
T790M
600 мкл
1 шт.
Del
600 мкл
1 шт.
L858R
600 мкл
1 шт.
L861Q
600 мкл
1 шт.
Желтый
Реакционная смесь G719
G719X Reaction Mix
G719X
600 мкл
1 шт.
Серый
Реакционная смесь S768I
S768I Reaction Mix
S768I
600 мкл
1 шт.
Синий
Реакционная смесь для вставки
Insertions Reaction Mix
Ins
600 мкл
1 шт.
Коричневый
Положительный контроль EGFR
EGFR Positive Control
PC
300 мкл
1 шт.
Taq ДНК Полимераза
Taq DNA Polymerase
Taq
140 мкл
1 шт.
Вода свободная от нуклеаз
Nuclease-Free Water
Руководство пользователя на английском языке
Handbook
H2O
1.9 мл
2 шт.
-
1 шт
Голубой
Белый
II. Общая информация
1. Хранение
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» доставляется на сухом льду и должен оставаться
замороженным. Если набор реагентов для определения соматических мутаций в гене
EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» не заморожен, при транспортировке
вскрывалась внешняя упаковка, посылка не содержит упаковочного листа, руководства
или реактивов, пожалуйста, свяжитесь со специалистами компании «ИнтерЛабСервис» по
телефону +7 (495) 664-28-84.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» хранят при температуре от –15°C до –25°.
4
Для обеспечения оптимальной активности и производительности праймеров Scorpions®
набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» должен быть защищен от света во избежание дезактивации
флуоресцентной метки.
При хранении в рекомендуемых условиях и в исходной упаковке набор стабилен до даты
окончания срока хранения, указанной на этикетке.
Следует избегать повторного оттаивания-замораживания. Мы рекомендуем максимум 7
циклов замораживания-оттаивания.
2. Назначение
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» предназначен для выявления 29 соматических мутаций в
онкогене EGFR и обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор
реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ
PCR Kit (24)» должен использоваться обученным персоналом в специально
оборудованной лаборатории с пробами ДНК, выделенными из фиксированной в
формалине и залитой парафином ткани немелкоклеточного рака легких.
3. Ограничение использования
Полученные
результаты
должны
интерпретироваться
только
совместно
с
соответствующими клиническими и лабораторными исследованиями и не должны
применяться для диагностики отдельно.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» должен использоваться только персоналом, специально
проинструктированным и обученным диагностике in vitro с использованием прибора
Rotor-Gene Q.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» валидирован для ДНК, выделенной с использованием набора
реагентов для выделения ДНК QIAGEN (Кат. № 56404) из парафинизированных блоков
образцов опухолевой ткани, предварительно зафиксированных в забуференном
формалине.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» предназначен для применения только в амплификаторах для
ПЦР в реальном времени Rotor-Gene Q серии 5plex HRM и Rotor-Gene® Q 6.
Для получения оптимальных результатов необходимо четкое следование руководству по
применению набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR
«Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)». Реактивы должны готовиться согласно
рекомендациям данной Инструкции. В противном случае, возможно, получить
некорректные результаты.
5
Важно, чтобы количество и качество ДНК в пробе определялось непосредственно перед
проведением анализа данной пробы с использованием набора реагентов для определения
соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)».
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» имеет дополнительную контрольную смесь (Ctrl) для
определения значения порогового цикла (CT), приемлемого для анализа.
Следует обращать внимание на даты окончания срока годности и условия хранения,
напечатанные на коробке и этикетках всех компонентов. Не используйте компоненты с
истекшим сроком годности или неправильно хранившиеся.
4. Контроль качества
Каждая партия набора реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR
«Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» тестируется согласно утвержденным
техническим условиям для обеспечения постоянного качества продукта в соответствии с
сертифицированной по ISO Системой контроля качества QIAGEN.
5. Информация по технике безопасности
Работать с реактивами необходимо в лабораторном халате, одноразовых перчатках и
защитных очках.
Весь химический и биологический материал считается потенциально опасным.
Пробы являются потенциальным источником инфекции, и с ними следует обращаться
соответствующим образом.
III. Принципы работы с наборами реагентов
1. Принципы работы с наборами реагентов для определения соматических
мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с
использованием ПЦР в реальном времени с использованием прибора RotorGene Q.
1.1. Общие сведения
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» представляет собой готовый к применению набор для
определения 29 соматических мутаций в онкогене EGFR методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) на приборе Rotor-Gene Q. Используется сочетание двух технологий:
праймеров Scorpions и аллель специфической ПЦР - ARMS®. Набор реагентов для
определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)»
позволяет выявлять мутации в сравнении с контрольной геномной ДНК дикого типа:
19 делеций в экзоне 19 (выявляет, но не различает делеции);
T790M;
6
L858R;
L861Q;
G719X (выявляет G719S, G719A или G719C, но не различает);
S768I;
3 инсерции в экзоне 20 (выявляет наличие любой из 3 инсерций, но не
различает их).
Используемые методы обладают высокой избирательностью и в зависимости от общего
количества ДНК в образце, позволяют выявлять невысокий процент мутантной ДНК на
фоне геномной ДНК дикого типа. Чувствительность и селективность набора реагентов для
определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)»
намного выше по сравнению с такими технологиями как секвенирование по Сенгеру.
1.2. Принцип метода
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» использует две технологии для выявления мутаций с помощью
ПЦР в реальном времени — аллель специфическую ПЦР (ARMS) и праймеры Scorpions.
Аллель специфичная ПЦР (ARMS)
Аллель специфическая или специфичная для данной мутации амплификация достигается с
помощью ARMS (Amplification Refractory Mutation System, рефракторная мутационная
система амплификации). Taq ДНК-полимераза (Taq) эффективна для определения
соответствий и несоответствий на 3'-конце ПЦР-праймера. Специфические
последовательности, несущие мутации, селективно амплифицируются даже в пробах, где
большинство последовательностей не имеют данной мутации. В случае полного
соответствия праймера амплификация проходит в полном объеме. В случае
несоответствия 3'-конца последовательности геномной ДНК, происходит лишь
незначительная фоновая амплификация.
Праймеры Scorpions
Регистрация продуктов амплификации происходит с использованием праймеров
Scorpions. Праймеры Scorpions - это бифункциональные молекулы, содержащие ПЦРпраймеры ковалентно связанные с зондом. Флуорофор в этом зонде взаимодействует со
снижающим флуоресценцию гасителем, также встроенным в зонд. В ходе ПЦР, когда
зонд связывается с ампликоном, флуорофор и гаситель разделяются, что приводит к
повышению флуоресценции в реакционной пробирке.
Этапы работы
Работа с набором реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR
«Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» проходит в два этапа. На первом этапе
выполняется контрольное измерение для определения суммарной ДНК в пробе. На втором
этапе определяется наличие или отсутствие мутантной ДНК.
7
1.3.Оборудование и реактивы, приобретаемые отдельно
При работе с реактивами всегда надевайте лабораторный халат, одноразовые перчатки и
защитные очки. За дополнительными сведениями обращайтесь к соответствующим
паспортам безопасности (MSDS), имеющимся у поставщика продукта.
Набор для выделения ДНК (см. «Выделение ДНК»)
Специальные регулируемые дозаторы для приготовления реакционной смеси для ПЦР
Специальные регулируемые дозаторы для добавления геномной ДНК*
Стерильные наконечники с фильтрами для пипеток
Настольная центрифуга* с ротором для 2-мл реакционных пробирок
Прибор Rotor-Gene Q 5plex HRM* с каналами флуоресценции Green и Yellow
Программное обеспечение для Rotor-Gene Q версия 2.0.2
Стрипованные пробирки и крышки, 0,1 мл, для использования с 72-гнездным ротором (№
по каталогу 981103 или 981106)
Стерильные микроцентрифужные пробирки для приготовления реакционных смесей
* Все приборы должны быть поверены и откалиброваны в соответствии с рекомендациями
производителя.
1.4.
Меры предосторожности
Пользователь должен всегда обращать внимание на следующее:
Использовать стерильные наконечники с фильтрами для дозаторов и следить за тем,
чтобы дозаторы были откалиброваны в соответствии с инструкциями производителя.
Хранить образцы, положительные контроли и экстрагированную из образцов ДНК
отдельно от других реактивов. Добавлять в реакционную смесь контроли и
экстрагированную из образцов ДНК на отдельном рабочем участке.
Перед началом анализа разморозить все компоненты при комнатной температуре (15–
25°C).
После размораживания перемешать компоненты (переворачивая каждую пробирку по 10
раз) и затем кратковременно центрифугировать.
Необходимо проявлять осторожность во избежание загрязнения ПЦР-смеси
синтетическим контрольным материалом. Рекомендуется использовать отдельные
дозаторы, специально предназначенные для приготовления реакционных смесей и
добавления матричной ДНК. Приготовление и раскапывание реакционных смесей должно
8
производиться в отдельном помещении, в котором не производится раскапывание
образцов. Пробирки Rotor-Gene Q не должны открываться по окончании ПЦР-анализа.
1.5.
Формат набора
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» состоит из восьми аналитических систем:
- Одна контрольная (Ctrl) система;
- Семь мутационных систем для анализа мутаций.
Все реакционные смеси содержат внутреннюю контрольную пробу (внутренний
контроль), помеченную HEX™. Это контроль наличия ингибиторов в пробе, присутствие
которых могут привести к ложноотрицательным результатам.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» имеет оптимальный состав и концентрацию. Не рекомендуется
дальнейшее разведение реагентов, поскольку это может привести к потере
производительности. Не рекомендуется ставить реакции, объемом менее 25 мкл,
поскольку это может повысить риск ложноотрицательных результатов.
Все реактивы, поставляемые в наборе реагентов для определения соматических мутаций в
гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» предназначены для использования
только в том же наборе. Для поддержания оптимальной производительности реактивы в
наборе не должны замещаться.
Используйте только Taq ДНК-полимеразу (Taq), которая поставляется в наборе. Не
замещайте ее Taq ДНК-полимеразой (Taq) из других наборов того же или иного типа или
Taq ДНК-полимеразой (Taq) от других поставщиков.
Контрольная проба
Контрольная проба (Ctrl), помеченная FAM™, используется для определения суммарной
ДНК в пробе. В контрольной пробе амплифицируется участок экзона 2 гена EGFR.
Праймер и зонд подобраны таким образом, чтобы избежать любых известных
полиморфизмов EGFR..
Мутационные анализы
Каждая мутационная проба, помеченная FAM, содержит один зонд Scorpion плюс
праймеры для различения дикой и мутантной ДНК. Мутантная ДНК выявляется методом
ПЦР в реальном времени.
1.6.
Определение исходного материала для анализа
Со всем и пробами следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом.
Материалом для анализа должна быть геномная ДНК человека, выделенная из
фиксированных формалином и залитых в парафин проб опухолей немелкоклеточного рака
9
легких. Образцы должны транспортироваться в соответствии со стандартными
требованиями работы с патологическим материалом, обеспечивающим качество образцов.
Опухолевые образцы негомогенны, срезы из одного образца опухоли могут не
соответствовать срезам той же опухоли. Опухолевые пробы могут также содержать
неопухолевую ткань. ДНК неопухолевой ткани не должны содержать мутации EGFR,
выявляемые набором «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)».
1.7.
Выделение ДНК
Для выделения геномной ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин
образцов опухолей немелкоклеточного рака легких рекомендуется использовать набор
реагентов QIAamp® DNA FFPE (QIAGEN, кат.№ 56404). Выделение геномной ДНК
проводить согласно инструкции к набору реагентов QIAamp® DNA FFPE:
- Поместить срезы, фиксированные формалином и залитые в парафин, на покровные
стекла;
- удалить избыток парафина вокруг срезов ткани, используя свежий стерильный
скальпель;
- срезы тканей перенести в микроцентрифужные пробирки, используя свежий скальпель
для каждой пробы, предназначенной для выделения ДНК;
- добавить протеиназу К (протеолиз в течение 1 часа);
- очищенную геномную ДНК растворить в 50 - 200 мкл буфера ATE (входит в состав
набора реагентов QIAamp® DNA FFPE).
Очищенную геномную ДНК хранить при температуре минус 15–30°C.
1.8. Внутренние контроли.
Определение количества ДНК в пробе должно основываться на ПЦР и может отличаться
от количественного определения, основанного на значениях поглощения. Смесь для
дополнительной контрольной реакции (Ctrl) поставляется для определения качества и
количества ДНК в пробах перед анализом с использованием набора реагентов для
определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)».
Все пробы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR
«Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» генерируют короткие продукты ПЦР. Набор
реагентов не подходит для работы с тяжелыми фрагментами ДНК.
Все аналитические системы содержат внутренний контроль (см. «Анализ данных»). Если
контроли оказываются неудачными, данные следует автоматически отбросить, поскольку
присутствовавшие ингибиторы могли привести к ложноотрицательным результатам.
Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, однако следует отметить, что это
также разбавит ДНК. Все экспериментальные анализы должны содержать контроли.
1.9. Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе.
Рекомендуется применение дополнительной контрольной реакционной смеси (Ctrl),
10
поставляемой с набором реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR
«Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» для определения суммарной ДНК в пробе. В
контрольном анализе амплифицируется участок экзона 2 гена EGFR. Мы рекомендуем
постановку проб только с контрольной пробой, используя положительный контроль EGFR
(ПК) в качестве положительного контроля и воду (H2O) в качестве отрицательного
контроля (ОК).
Для оптимального использования реактивов в наборе для определения соматических
мутаций в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)» пробы следует
обрабатывать партиями. Если пробы тестируются индивидуально, это требует большего
количества реактивов и снижает количество проб, которые можно протестировать данным
набором.
1.10. Анализ данных
При проведении анализов в режиме реального времени с помощью праймеров Scorpions
используется количество циклов ПЦР, необходимое для выявления флуоресцентного
сигнала выше фонового в качестве меры молекул-мишеней, присутствующих в начале
реакции. Точка, в которой сигнал получается выше фоновой флуоресценции, называется
пороговым циклом (CT).
Значения ∆CT пробы вычисляются как разница между значением CT для мутации и
значением CT для контрольного измерения от той же пробы. Пробы классифицируются
как положительные (наличие мутации), если они дают ∆CT меньше, чем вычисленное
значение ∆CT для данной анализируемой пробы.
Если значение ∆CT выше, то проба либо содержит очень низкий процент мутантной ДНК,
которая не может быть обнаружена с помощью данного набора (за аналитическим
пределом), либо проба отрицательна по мутациям.
Значения CT для мутаций, равные 40 или выше будут считаться отрицательными или
находящимися за пределами чувствительности набора.
При использовании праймеров ARMS может происходить некоторое неэффективное
праймирование, давая запоздалый фоновый CT от ДНК, не содержащей мутации. Все
значения ∆CT, рассчитанные от фоновой амплификации, будут выше вычисленных
значений ∆CT, проба оценивается как отрицательная по мутациям.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене EGFR «Therascreen®
EGFR RGQ PCR Kit (24)» предназначен для использования на приборе для амплификации
в реальном времени QIAGEN Rotor-Gene Q 72-луночного формата.
1.11. Протоколы
Протокол 1: Оценка проб
Определение суммарной ДНК в пробах
Перед началом работы прочтите «Важные замечания».
11
Перед тем, как начать работу по протоколу ознакомьтесь с инструкцией к прибору RotorGene Q.
Действия перед началом работы:
Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены,
перемешаны (переворачивать 10 раз) и кратковременно центрифугированы.
Перед каждым применением необходимо убедиться, что Taq ДНК-полимераза находится
при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугировать пробирку для
того, чтобы собрать фермент на дно пробирки.
Ход работы
1. Разморозить контрольную реакционную смесь (Ctrl) и положительный контроль (ПК)
EGFR при комнатной температуре (15–25°C). Когда контрольная реакционная смесь (Ctrl)
и положительный контроль (ПК) EGFR растают, перемешать их, переворачивая каждую
пробирку 10 раз во избежание локализованного скопления солей.
2. Приготовить достаточное количество реакционных смесей (контрольная реакционная
смесь (Ctrl) плюс Taq ДНК-полимераза (Taq)) для ДНК образцов, для одного
положительного контроля и одного отрицательного контроля (ОК) в соответствии с
объемами, приведенными в Таблице 1. Добавить в расчет реактивы для 1 дополнительной
пробы. Реакционная смесь содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за
исключением образца.
Не перемешивать Taq ДНК-полимеразу (Taq) на вортексе, так как это может
инактивировать фермент.
Убедиться, что Taq ДНК-полимераза перед использованием находится при комнатной
температуре. Кратковременно центрифугировать пробирку с Taq ДНК-полимеразой.
Убедиться, что весь фермент находится на дне пробирки. Пипеткой отобрать ДНКполимеразу (Taq), размещая наконечник пипетки прямо под поверхностью жидкости во
избежание обволакивания наконечника избыточным ферментом.
Таблица 1. Приготовление контрольной реакционной смеси
Реакционная смесь (Мастер микс)
Анализ
Контрольный анализ
Контрольная реакционная смесь (Ctrl)*
Taq ДНК-полимераза (Taq)*
19.5 мкл
0.5 мкл
* При приготовлении реакционной смеси готовить так, чтобы хватило еще на 1 пробу.
3. Аккуратно перемешать реакционную смесь пипетированием. Сразу же добавить по 20
мкл реакционной смеси в каждую пробирку Rotor-Gene.
4. В пробирки немедленно добавить по 5 мкл образца, EGFR-положительного контроля
(ПК) и воды, свободной от нуклеаз (H2O) для отрицательного контроля (ОК).
12
5. Закрыть пробирки и разместить их в диске Rotor-Disc™ в соответствующих
положениях. Если ротор загружен неравномерно, необходимо уравновесить его
дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q.
После переноса пробирок в ротор рекомендуется визуально проверить, все ли пробирки
содержат одинаковый объем.
6. Установить диск Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q.
Проследить, чтобы запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней
части ротора для предотвращения случайного открывания пробирок при анализе.
7. Для оценки проб создать температурный профиль в соответствии со следующими
этапами.
Установка общих параметров анализа
Рис. 1, 2, 3
Первоначальная активация фермента горячего старта
Рис. 4, 5
Амплификация ДНК
Рис. 6, 7, 8, 9
Подгонка флуоресцентных каналов
Рис. 10, 11, 12, 13
Запуск анализа
Рис. 14
Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2.
Подробные сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q смотреть в
руководстве по применению прибора. На иллюстрациях установки обведены толстыми
черными рамками. Иллюстрации показаны для прибора Rotor-Gene Q.
8. Дважды щелкнуть значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2.
На рабочем столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q, выбрать
вкладку “Advanced” («Усложненный») в появившемся диалоговом окне “New Run”
(«Новый анализ»).
9. Для создания нового шаблона выберать “Empty Run” («Холостой запуск»), а затем
нажать “New” («Новый»), чтобы ввести “New Run Wizard” («Мастер нового запуска»).
10. Выбрать 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметить, что
запирающее кольцо присоединено. Поставить галочку в квадрате “Locking Ring Attached”
(«Запирающее кольцо присоединено») и нажать “Next” («Далее») (Рис. 1).
13
Рис. 1. Диалоговое окно «Мастер нового запуска.
11. Ввести имя оператора, объем реакции - 25 мкл и дополнительные примечания.
Щелкнуть “Next” (Рис. 2).
Рис. 2. Установка общих параметров анализа.
12. Щелкнуть кнопку “Edit Profile” («Редактировать профиль») в следующем диалоговом
окне “New Run Wizard” (Рис. 3) и запрограммировать температурный профиль в
соответствии с информацией на следующих этапах.
14
Рис. 3. Редактирование профиля
13. Щелкнуть кнопку “Insert after” («Ввести после») и выбрать “New Hold at Temperature”
(«Новая выдержка при температуре») (Рис. 4). Щелкнуть “60”, чтобы изменить
температуру на 95°C.
Рис. 4. Первоначальный этап инкубации при 95°C.
14. Щелкнуть “60°C” и изменить “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C,
щелкнуть “1” для замены “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкнуть кнопку
“Insert After” («Ввести после»), а затем выберать “New Cycling” («Новое циклирование»)
(Рис. 5).
15
Рис. 5. Начальный этап инкубации при 95°C.
15. Установить число циклов на 40, нажав число. Выбрать “95°C на 20 секунд”.
Установить время “30 secs” («30 с») (Рис. 6).
Рис. 6. Этап амплификации при 95°C.
16. Выделить следующую позицию “60°C for 20 secs”. Установить время 60 секунд.
Выберать кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 7).
16
Рис. 7. Этап амплификации при 60°C.
17. В панели “Available Channels” («Доступные каналы») выбрать каналы каналы “Yellow”
(«Желтый») и “Green” («Зеленый»), подсвечивая их, а затем нажмите “>”, чтобы
перенести их в панель “Acquiring Channels” («Запрашиваемые каналы») (Рис. 8).
Рис. 8. Запрос на этапе амплификации при 60°C
18. Поставить подсветку на “72°C for 20 secs” и удалить этот раздел, затем нажать “OK”
(Рис. 9).
17
Рис. 9. Этап устранения элонгации.
19. Щелкнуть кнопку “Gain Optimisation” («Оптимизация результатов») (Рис. 10).
Рис. 10. Оптимизация результатов.
20. Выберать кнопку “Optimise Acquiring” («Оптимизировать запрос»), а затем щелкнуть
“OK” для зеленого и желтого каналов (Рис. 11 и 12).
18
Рис. 11. Оптимизация автоматического получения результатов с зеленого канала.
Рис. 12. Оптимизация автоматического получения результатов для желтого канала.
21. Поставить галочку напротив “Perform Optimisation before 1st Acquisition”, («Провести
оптимизацию перед 1-м сбором данных»), а затем щелкнуть кнопку “Close” («Закрыть»),
чтобы вернуться к Мастеру настройки (Рис. 13).
19
Рис. 13. Выбор по зеленому и желтому каналам.
22. Щелкните “Next” для сохранения шаблона, выберите “Save Template” («Сохранить
шаблон»), а затем сохраните шаблон в папку шаблонов.
23. Проверьте программирование и затем щелкните “Start Run” («Запустить анализ») для
сохранения файла анализа и его запуска (Рис. 14).
Рис. 14. Запуск анализа.
24. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно или ввести названия
проб, или щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести названия проб позже.
20
25. Сохранить все данные в соответствующей папке.
26. По окончании анализа проанализировать данные.
27. Определить значения CT отрицательного контроля (ОК) для того, чтобы убедиться в
отсутствии загрязнения - положительная амплификация в канале FAM (CT меньше 40) или
возможные на проблемы с постановкой – не прошел внутренний контроль в канале HEX
(без CT). Положительный контроль EGFR (ПК) должен давать контрольные значения CT
по каналу FAM между 26.26 и 30.95. Подробнее об анализе данных см. в Приложении А.
Данные анализа не должны использоваться, если хотя бы один из двух контролей оказался
неудачным!
Значение контроля проб CT между 30.69 и 37: Результаты следует интерпретировать с
осторожностью, так как очень низкий уровень мутаций может не обнаруживаться.
Значение контроля проб CT между 37 и 40: В таких пробах присутствует лишь
несколько пригодных к амплификации копий ДНК, и мутации можно увидеть, если
большинство из них содержат мутацию.
Если проба дает позднее значение CT для контроля, внутренний контроль пробы CT
должен сравниваться с внутренним отрицательным контролем (ОК без матрицы). Если
внутренний контроль пробы выходит на поздних циклах или отрицательный по
сравнению с ОК (без матрицы), возможно, происходит ингибирование реакции. Действие
ингибитора можно уменьшить разведением пробы, однако, это также разбавит ДНК.
Разведение пробы: Если при контроле количества ДНК в пробах CT <23, необходимо
разбавить ДНК из образцов. Концентрированные пробы должны разбавляться так, чтобы
быть >23, но <30.69. Разбавление в два раза увеличит CT на 1 цикл!
Протокол 2: Выявление мутаций в гене EGFR и анализ данных.
Выявление мутаций EGFR и анализ данных.
Для эффективного применения набора реагентов для определения соматических мутаций
в гене EGFR «Therascreen® EGFR RGQ PCR Kit (24)», пробы должны быть собраны в
группы по 7 (для заполнения 72-гнездного ротора). При проведении анализа с меньшим
количеством образцов, одним набором можно будет протестировать меньшее число проб.
Для каждой пробы ДНК в одном и том же ПЦР - анализе должны ставиться контроль и
проба на мутации во избежание вариаций от анализа к анализу.
Действия перед началом работы:
Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены,
перемешаны (переворачивать пробирки 10 раз) и кратковременно центрифугированы.
Перед каждым применением убедитесь, что Taq ДНК-полимераза находится при
21
комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугировать пробирку, чтобы
собрать фермент на дне пробирки.
Ход работы
1. Разморозить реакционные смеси и положительный контроль EGFR (ПК) при комнатной
температуре (15–25°C). Когда реакционные смеси и положительный контроль EGFR (ПК)
растают, перемешать их, переворачивая каждую пробирку 10 раз во избежание локального
концентрирования солей.
2. Приготовить достаточное количество реакционных смесей (контрольная реакционная
смесь (Ctrl) плюс Taq ДНК-полимераза (Taq)) для проб ДНК, одна реакция
положительного контроля и одна реакция отрицательного контроля без матрицы (ОК) в
соответствии с объемами, приведенными в Таблице 2. Расчет количества реагентов
проводить с учетом 1 дополнительной пробы (берется на ошибку пипетирования).
Реакционная смесь содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за исключением
пробы.
Не встряхивать Taq ДНК-полимеразу (Taq), так как это может инактивировать фермент.
Убедитесь, что Taq ДНК-полимераза перед использованием находится при комнатной
температуре. Кратковременно центрифугировать флакон для того, чтобы убедиться, что
весь фермент находится у дна пробирки. Отобрать пипеткой ДНК-полимеразу (Taq),
размещая наконечник пипетки прямо под поверхностью жидкости во избежание
обволакивания наконечника избытком фермента.
Обязательно ставить реакции в правильном порядке.
Таблица 2. Приготовление реакционной смеси для контроля
Реакционная смесь (мастер микс)
Контрольная реакционная смесь (Ctrl)*
Taq ДНК-полимераза (Taq)*
Контрольный анализ
19.5 мкл
0.5 мкл
Анализ мутаций
19.5 мкл
0.5 мкл
Анализ
* При приготовлении реакционной смеси готовить на 1 пробу больше.
3. Аккуратно перемешать реакционную смесь пипетированием. Сразу же добавить по 20
мкл реакционной смеси в каждую пробирку Rotor-Gene.
4. Добавить по 5 мкл пробы, EGFR-положительного контроля (ПК) и воды, свободной от
нуклеаз (H2O) для ОК в каждую пробирку Rotor-Gene. Каждая проба ДНК должна
сравниваться как с контролем, так и со всеми мутационными анализами. Схема
раскапывания реагентов приведена в Таблице 3.
22
Таблица 3. Расположение контрольных (Ctrl) и мутационных анализов
Ctrl
790M
Делеции
L858R
L861Q
G719X
S768I
Инсерции
Контроли
ПК
ОК
1
9
2
10
3
11
4
12
5
13
6
14
7
15
8
16
1
17
18
19
20
21
22
23
24
2
25
26
27
28
29
30
31
32
3
33
34
35
36
37
38
39
40
Пробы
4
41
42
43
44
45
46
47
48
5
49
50
51
52
52
54
55
56
6
57
58
59
60
61
61
63
64
7
65
66
67
68
69
70
71
72
5. Закрыть пробирки Rotor-Gene Q и разместить их в соответствующих положениях в
роторном диске. Если ротор загружен неравномерно, уравновесить его дополнительными
пустыми пробирками Rotor-Gene Q.
6. Сразу же поместить диск Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q. Проследить, чтобы
запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для
предотвращения случайного открывания пробирок при анализе.
7. Для оценки проб создать температурный профиль в соответствии со следующими
этапами.
Установка общих параметров анализа
Рис. 15, 16, 17
Первоначальная активация фермента горячего старта
Рис. 18
Амплификация ДНК
Рис. 19
Подгонка флуоресцентных каналов
Рис. 20, 21
Запуск анализа
Рис. 22
Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2.
Сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q можно найти в руководстве по
применению прибора. На иллюстрациях эти установки обведены толстыми черными
рамками. Иллюстрации показаны для приборов Rotor-Gene Q.
8. Дважды щелкнуть значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2 на рабочем
столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q. Выбрать вкладку
“Advanced” («Усложненный») в появившемся диалоговом окне “New Run” («Новый
запуск»).
9. Для создания нового шаблона выбрать “Empty Run” («Холостой запуск»), а затем
нажать “New” («Новый»), чтобы ввести “New Run Wizard” («Мастер нового запуска»).
23
10. Выбрать 72-Well Rotor (72-луночный ротор) в качестве типа ротора. Отметить, что
запирающее кольцо присоединено. Поставить галочку в квадрате “Locking Ring Attached”
(«Запирающее кольцо присоединено») и нажать “Next” («Далее») (Рис. 15).
Рис. 15. Диалоговое окно «Мастер нового запуска».
11. Ввести имя оператора, объем реакции - 25 мкл, дополнительные примечания.
Щелкнуть “Next (Рис. 16).
Рис. 16. Установка общих параметров анализа.
24
12. Щелкнуть кнопку “Edit Profile” («Редактировать профиль») в следующем диалоговом
окне “New Run Wizard” (Рис. 17) и запрограммировать температурный профиль в
соответствии с информацией на следующих этапах.
Рис. 17. Редактирование профиля.
13. Щелкнуть кнопку “Insert after” («Ввести после») и выберите “New Hold at Temperature”
(«Новая выдержка при температуре») (Рис. 18). Щелкнуть “60”, чтобы изменить
температуру на 95°C.
Рис. 18. Начальный этап инкубации при 95°C.
25
14. Щелкнуть “60°C” и изменить “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C,
щелкнуть “1” для установки “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкнуть
кнопку “Insert After” («Вести после»), а затем выбрать “New Cycling” («Новая
амплификация») (Рис. 19).
Рис. 19. Начальная инкубация при 95°C.
15. Установить число циклов на 40, нажав число. Выбрать “95°C на 20 секунд”.
Установить время на 30 секунд (Рис. 20).
Рис. 20. Этап амплификации при 95°C.
26
16. Переместить выделенный участок на “60°C” на 20 секунд. Установить время 60
секунд. Выбрать кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 21).
Рис. 21. Этап амплификации при 60°C.
17. В панели “Available Channels” («Доступные каналы»), подсвечивая, выбрать каналы
“Yellow” («Желтый») и “Green” («Зеленый») для запроса, а затем нажать “>”, чтобы
перенести их в панель “Acquiring Channels” («Запрашиваемые каналы») (Рис. 22).
Рис. 22. Запрос на этапе 60°C.
27
18. Поставить подсветку на “72°C for 20 secs” и удалить этот раздел, затем нажать “OK”
(Рис. 23).
Рис. 23. Этап удаления расширения.
19. Щелкнуть кнопку “Gain Optimisation” («Оптимизация результатов») (Рис. 24).
Рис. 24. Оптимизация результатов.
28
20. Выбрать кнопку “Optimise Acquiring” («Оптимизировать запрос»), а затем щелкнуть
“OK” для зеленого и желтого каналов (Рис. 25 и 26).
Рис. 25. Оптимизация автоматического получения результатов с зеленого канала.
Рис. 26. Оптимизация автоматического получения результатов для желтого канала.
29
21. Поставить галочку напротив “Perform Optimisation before 1st Acquisition”,
(«Провести оптимизацию перед 1-м сбором данных»), а затем щелкнуть кнопку “Close”
(«Закрыть»), чтобы вернуться к Мастеру (Рис. 27).
Рис. 27. Выбор зеленого и желтого каналов.
22. Щелкнуть “Next” для сохранения шаблона, выбрать “Save Template” («Сохранить
шаблон»), а затем сохранить шаблон в папку шаблонов.
23. Проверить сводку и затем щелкнуть “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения
файла анализа и его запуска (Рис. 28).
Рис. 28. Запуск анализа.
24. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно либо ввести название
проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить»), а пробы ввести позже.
30
25. Сохранить все данные в соответствующей папке.
26. По окончании анализа проанализировать данные.
Информацию об анализе данных см. в Приложении A.
Руководство по устранению неисправностей
Руководство по устранению неполадок может помочь в решении проблем, которые могут
возникнуть. Подробнее см. также страницу «Часто задаваемые вопросы» в Центре технической
поддержки: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx.
Комментарии и советы
Нет сигнала с положительным контролем EGFR (ПК) на флуоресцентном канале Cycling Green.
a) Выбранный флуоресцентный канал Для анализа данных выберите канал флуоресценции
для анализа данных ПЦР не Cycling Green для проведения аналитической ПЦР и
соответствует данному протоколу
флуоресцентный канал Cycling Yellow - для ПЦР
внутреннего контроля.
b)
Неверное
программирование Сравнить температурный профиль с протоколом.
температурного профиля прибора
Rotor-Gene
c) Неверная конфигурация ПЦР
Проверить свою работу пошагово с помощью схемы
расположения образцов. При необходимости повторить
ПЦР.
d) Условия хранения для одного или Проверить условия хранения и дату окончания срока
нескольких компонентов набора не хранения (см. этикетку набора) реактивов. При
соответствует инструкциям,
необходимости использовать новый набор.
данным в разделе «Доставка
и хранение» на стр. 5.
e) Срок хранения набора истек
Проверить условия хранения и дату окончания срока
хранения (см. этикетку набора) реактивов. При
необходимости использовать новый набор..
Комментарии и советы:
Сигналы с отрицательными контролями в канале Cycling Green для аналитической ПЦР.
а) В ходе подготовки
произошло загрязнение
b) При экстракции
загрязнение
ПЦР Повторить ПЦР с новыми реактивами в нескольких
повторах.
По возможности закрывайте пробирки для ПЦР сразу
после
добавления
пробы,
предназначенной
для
тестирования.
Следить, чтобы загрязнение рабочего пространства и
инструментов устранялось регулярно.
произошло Повторить экстракцию и ПЦР пробы, предназначенную
для тестирования, с использованием новых реактивов.
Следить, чтобы загрязнение рабочего пространства и
инструментов устранялось регулярно.
31
Приложение А: Анализ данных на приборе Rotor Gene Q
Следует проверить графики на Rotor-Gene Q во всех реакциях. Иногда наблюдается
усиление флуоресцентного сигнала в отрицательном контроле без матрицы (ОК) и
отрицательных пробах. При встрече с подобной ситуацией и при наличии значения CT
пользователю нужно отличить истинный случай амплификации, который указывает на
загрязнение отрицательного (без матрицы) от линейного роста флуоресценции, который
может возникнуть из-за флуоресцирующего артефакта.
1.1 Анализ отрицательного контроля (без матрицы)
На Рис. 29 и 30 представлены графики кривых для отрицательного контроля. На Рис. 29
представлена нелинейная, т.е. истинная амплификация, возникшая из-за загрязнения.
Такой анализ следует отбросить, а пробы протестировать повторно. На Рис. 30 показана
линейная амплификация для отрицательного (ОК). В этом случае должна проверяться
исходная флуоресценция. Соответствующий график исходной флуоресценции показан на
Рис. 31, демонстрируя линейный рост флуоресценции, а не истинную амплификацию.
Данные анализа могут использоваться, если прошли положительный и внутренний
контроли. По сравнению с Рис. 31, Рис. 32 показывает исходные данные флуоресценции,
где присутствует истинная амплификация. В этом случае данные должны отбрасываться, а
пробы тестироваться заново, так как это указывает на наличие контаминации.
Рис. 29. Загрязнение ОК
32
Рис. 30. Пример линейного роста флуоресценции в пробирке с ОК.
Рис. 31. Исходная флуоресценция Рис.30.
Рис. 32. Исходные данные флуоресценции, показывающие, что в пробирке с отрицательным
контролем (ОК) амплификация происходит правильно.
33
1.2 Анализ проб и положительного контроля
На Рис. 33 и 34 показаны два примера амплификации проб. На Рис. 33 представлен анализ
пробы с истинной амплификацией. Если анализ показывает такой тип сигмоидальной
амплификационной кривой, то это истинная амплификация, и данные этого анализа могут
быть использованы, при условии, что прошли положительный и внутренний контроли. На
Рис. 34 показана линейная амплификация в реакции с пробой. При этих условиях должны
проверяться исходные данные флуоресценции: соответствующий график исходной
флуоресценции показан на Рис. 35, указывая, что линейный рост на Рис. 33 соответствует
линейному росту исходной флуоресценции. При условии, что прошли положительный и
внутренний контроли, могут быть получены результаты анализов для этих проб.
Рис. 33. Истинная амплификация пробы в анализируемой группе.
Рис. 34. Пример линейного роста флуоресценции в двух пробирках с пробами.
34
Рис. 35. Исходная флуоресценция для графика Рис. 34.
1.3 Анализ проб на приборе Rotor-Gene Q
программного обеспечения Rotor Gene серии 2.0.2
Используя программное
соответствующий файл.
обеспечение
Rotor-Gene
Q
с
series
использованием
(2.0.2),
открыть
Выделить пробы.
Находясь на странице исходного канала для каждого детектируемого канала, щелкнуть
“Options” («Возможности») и введите “Crop start cycles” («Урезать стартовые циклы»).
На странице анализа для значения «Remove data before cycle» («Удалить данные перед
циклом») введите 15 и щелкните «OK».
Щелкнуть “Analyse” («Анализировать»). На странице анализа щелкнуть “Cycling A (from
15), Yellow” (Амплификация А (с 15), Желтый») для канала HEX.
Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкнуть “Slope
(«Корректировка наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»).
correct”
Установить порог для канала Yellow 0.02 и отметьте значения CT.
На странице анализа щелкнуть “Cycling A (from 15), Green” («Амплификация А (с 15),
Зеленый») для канала FAM.
Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкнуть “Slope
(«Корректировка наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»).
correct”
Установите порог для канала Green 0.075 и отметьте значения CT.
35
Анализ проб: отрицательный контроль (ОК) и внутренний контроль
1. Определить значения CT для отрицательного контроля, чтобы удостовериться в
отсутствии контаминации, дающей положительную амплификацию по каналу FAM - CT
меньше 40. См. Приложение А. В пробирках с отрицательным контролем сигнал HEX
для анализа внутреннего контроля должен давать положительный результат во всех 8
образцах (CT ≤37).
Если в канале FAM есть положительная амплификация, а в канале HEX амплификация >
37, результаты должны быть исключены!
2. То же для всех других образцов. Необходимо проверить, чтобы в каждой пробирке для
внутреннего контроля был сигнал в канале HEX. Возможно 3 варианта:
a. Внутренний контроль дает положительный результат - можно продолжить анализ.
b. Если внутренний контроль (HEX) оказался неудачным, но реакция по каналу FAM
идет хорошо можно продолжить анализ, так как реакция по каналу FAM вытесняет
реакцию внутреннего контроля.
c. Если реакция в канале FAM и внутренний контроль (HEX) не прошли, данные
должны быть отброшены, поскольку в реакционной смеси могли присутствовать
ингибиторы, приведшие к ложноотрицательным результатам. Разведение пробы
может снизить действие ингибиторов, но следует отметить, что ДНК также будет
разбавлена.
3. Значение CT контроля должно быть выше 23 во избежание перегрузки анализа.
Анализ образцов: положительный контроль
1. Вычислите значение ΔCT следующим образом, удостоверившись в том, что значения CT
как мутации, так и контроля от одной и той же пробы:
[мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT
Значения ΔCT положительного контроля EGFR (ПК) должны попадать в интервалы
значений, приведенные в Таблице 4.
Таблица 4. Ожидаемые значения ΔCT для положительного контроля (ПК) для программы RotorGene Q (2.0.2)
Анализ
Значение ΔCT для положительного контроля (ПК)
790M
Делеции
L858R
L861Q
G719X
S768I
Инсерции
от –2.88 до 3.01
от –6.71 до 4.16
от –2.41 до 0.90
от –4.61 до 1.48
от –2.89 до 1.03
от –3.37 до 2.31
от –2.93 до 1.28
36
Анализ проб: образцы пациентов
1. Вычислить значение ΔCT, убедившись, что значения CT для мутации и контроля от
одной и той же пробы. См. Приложение А.
[мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT
2. Сравните значение ΔCT для пробы с точкой отсечения для каждой аналитической
системы (Таблица 5), удостоверившись, что для каждого анализа применена правильная
точка отсечения. Точка отсечения расположена выше точки, в которой положительный
сигнал мог быть благодаря фоновому сигналу праймера ARMS для ДНК дикого типа.
Если значение ΔCT пробы выше точки отсечения, оно классифицируется как
отрицательное или за пределами чувствительности набора. Если значение ΔCT для
пробы ниже точки отсечения, оно классифицируется как положительное для
мутации, выявленной этим анализом. См. Приложение А.
Таблица 5. Значения точки отсечения для программы Rotor-Gene Q (2.0.2).
Анализ
Усеченное значение ΔCT
790M
Делеции
L858R
L861Q
G719X
S768I
6.38
9.06
8.58
9.26
9.31
9.26
Инсерции
7.91
Приложение В: Дополнительная информация о мутациях
Номера COSMIC взяты из Каталога соматических мутаций при раке
(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic).
Таблица 6. Перечень мутаций и номера по COSMIC
Анализ
Экзон
790M
L858R
L861Q
S768I
G719A
G719S
G719C
20
21
21
20
18
18
18
Инсерции
20
Делеции
19
Замена основания
2369C>T
2573T>G
2582T>A
2303G>T
2156G>C
2155G>A
2155G>T
2307_2308ins9
2319_2320insCAC
2310_2311insGGT
2235_2249del15
2235_2252>AAT (комплексная)
Номер по
COSMIC
6240
6224
6213
6241
6239
6252
6253
12376
12377
12378
6223
13551
37
2236_2253del18
2237_2251del15
2237_2254del18
2237_2255>T (комплексная)
2236_2250del15
2238_2255del18
2238_2248>GC (комплексная)
2238_2252>GCA (комплексная)
2239_2247del9
2239_2253del15
2239_2256del18
2239_2248TTAAGAGAAG>C
(комплексная)
2239_2258>CA (комплексная)
2240_2251del12
2240_2257del18
2240_2254del15
2239_2251>C (комплексная)
12728
12678
12367
12384
6225
6220
12422
12419
6218
6254
6255
12382
12387
6210
12370
12369
12383
38