Анализ частых мутаций гена ATP7B у российских больных… М.Е. МЕЦГЕР

Анализ частых мутаций гена ATP7B у российских больных…
М.Е. МЕЦГЕР1,2, О.А. ЩАГИНА2
Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»
2
Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
1
АНАЛИЗ ЧАСТЫХ МУТАЦИЙ ГЕНА ATP7B
У РОССИЙСКИХ БОЛЬНЫХ ГЕПАТОЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ДИСТРОФИЕЙ
В данной работе было исследовано 12 мутаций гена ATP7B, отвечающего за развитие гепатоцеребральной дистрофии. Исследование проводилось на выборке, состоящей из 186 российских неродственных пациентов. В выборке
были выявлены шесть мутаций, наиболее частой из которых является замена c. C3207А. Данная мутация была обнаружена на 23 % хромосом.
Введение. Гепатоцеребральная дистрофия (болезнь Вильсона–Коновалова, БВК) – наследственное моногенное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования. Заболевание
связано с нарушением метаболизма меди и характеризуется поражением печени и нарушением
функций ЦНС. Частота БВК в различных популяциях мира варьирует от 1/30000 до 1/100000
[1, 2].
Причиной развития гепатоцеребральной дистрофии являются мутации в гене ATP7B. Продукт этого гена принадлежит к группе ATP-аз P-типа, которые играют важную роль в транспорте
меди и гомеостазе организма. Белок ATP7B определяет транспорт меди в аппарате Гольджи и последующее ее выделение лизосомами в желчь [3]. Ген локализован на хромосоме 13q14.3-q21.1,
содержит 21 экзон и имеет длину 80kb. На сегодняшний день описано более 300 различных мутаций в этом гене [4, 5]. Спектр и частоты мутаций отличаются значительной вариабельностью в
различных популяциях мира. Длина кодирущей части гена превышает 5000 пар нуклеотидов, в
связи с чем прямое секвенирование всех экзонов является дорогостоящим и длительным методом
для проведения диагностики. Превалирование определенных мутаций в некоторых популяциях
позволяет создавать системы для значительно более быстрой и доступной ДНК-диагностики болезни Вильсона–Коновалова.
В связи с этим целью нашей работы является выявление частых мутаций в гене ATP7B у
российских больных и создание на основе этих данных эффективной системы для ДНКдиагностики гепатоцеребральной дистрофии.
Материалы и методы. Материалом для исследования являлись образцы ДНК 186 российских неродственных пациентов с гепатоцеребральной дистрофией.
Мутацию c. С3207A мы детектировали с помощью метода MLPA. Затем нами были составлены две системы для поиска 11 мутаций (инсерций и делеций) с помощью метода анализа полиморфизма длин амплификационных фрагментов (ПДАФ-анализа) и прямого автоматического секвенирования.
Для проведения исследования с согласия членов семьи пробандов был предоставлен биологический материал – периферическая кровь. Выделение ДНК производилось с помощью наборов
для выделения DLAtomTMDNA, согласно протоколу фирмы-производителя. Для анализа последовательностей экзонов гена ATP7B применялась полимеразная цепная реакция с праймерами, синтезированными ЗАО “Евроген”. Последовательность праймеров выбиралась из прилежащих интронных областей на основе нуклеотидных последовательностей анализируемых фрагментов
ДНК, имеющихся в базе данных GeneBank. Определение нуклеотидной последовательности методом прямого автоматического секвенирования фрагментов ДНК проводили по методу Сенгера
на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) с использованием набора для секвенирования и
протокола фирмы производителя.
Результаты исследования. Первоначально выборка была исследована на наличие миссенсмутации с. С3207A, приводящей к замене аминокислоты гистидина на глутамин в 1069 положении. Эта мутация гена ATP7B является наиболее распространенной в европейских популяциях [1–
11]. В нашей выборке данная мутация была обнаружена на 23,4 % хромосом, – у 27 человек в гомозиготном состоянии и у 33 человек – в гетерозиготном.
Затем нами была составлена системы для поиска шести мутаций (инсерций и делеций) с
помощью метода ПДАФ-анализа. В нашей выборке были обнаружены четыре мутации:
c. 3402 del C, c. 2304 ins C, c. 1770 ins T, c. 3649_3654 del 6. Генотипы и аллельные частоты мутаций из этой системы представлены в табл. 1.
Анализ частых мутаций гена ATP7B у российских больных…
Таблица 1
Генотипы и аллельные частоты мутаций гена ATP7B у российских больных
гепатолентикулярной дегенерацией. Число исследованных хромосом N = 372
Участок гена Экзон 14
Мутация
Экзон 15
Экзон 8
Экзон 5
Экзон 3
c. C 3207 A c. 3402 del C c. 2304 ins C c. 1770 ins T
Число
гетерозигот
Число
гомозигот
Аллельная
частота, %
Экзон 17
c. 1340_1343 c. 3649_3654 c. 3627_3630
del 4
del 6
del 4
33
7
9
3
0
1
0
27
0
0
0
0
0
0
23,4
1,9
2,4
0,8
0
0,3
0
Таблица 2
Генотипы и аллельные частоты мутаций гена ATP7B у российских больных
гепатолентикулярной дегенерацией. Число исследованных хромосом N = 372
Мутация
c. 3472_3482 del 11
c. 3942 del TA+3947 del G
c. 845 del A
c. 3140 del A
Число гетерозигот
0
3
0
0
Число гомозигот
0
0
0
0
Аллельная частота, %
0
0,8
0
0
Таблица 3
Мутации гена ATP7B, выявленные при проведении пилотного исследования.
Число исследованных хромосом N = 52
Участок гена
Мутация
Число хромосом
c данной мутацией
Экзон 8
с. 2355+7 G > C
Экзон 8
c. 2332 C > G
Экзон 13
c. 3036 ins C
Экзон 18
c. 3716 T > C
Экзон 18
c. 3800 A > T
2
2
3
1
1
Для дальнейших исследований мы составили вторую систему для поиска четырех мутаций
и исследовали выборку с ее помощью, также используя метод ПДАФ-анализа. Результаты исследования представлены в табл. 2. На исследованных хромосомах была обнаружена мутация c. 3942
del TA+3947 del G. Она встретилась у трех человек в гетерозиготном состоянии, и ее аллельная
частота составила 0,8 %.
Для корректировки дальнейшего направления работы нами было проведено пилотное исследование. В пилотную выборку вошли пациенты с одной детектированной мутацией, объем
этой выборки составил 26 человек. Для исследования нами были выбраны шесть экзонов гена
ATP7B (Ex 8, 13,17,18,19,20), в которых описано наибольшее количество частых мутаций в европейских популяциях. Данные экзоны с прилежащими интронными областями были проанализированы методом прямого автоматического секвенирования. Результаты пилотного исследования
представлены в табл. 3. В процессе исследования было выявлено пять мутаций. Мутации c. 3036
ins C и с. 2355+7 G > C, обнаруженные нами на 3 и 2 хромосомах соответственно, являются ранее
не описанными. Для определения влияния замены 2355 + 7 G > C на положение сайта сплайсинга
использовалась программа NetGene2 (CBS). Изменений сайта сплайсинга в результате данной замены не обнаружено. В ближайшем будущем планируется исследовать частоту встречаемости
данной нуклеотидной замены в популяции. Общая выборка будет исследована на наличие мутаций c. 3036 ins C и c. 2332 C > G.
Анализ частых мутаций гена ATP7B у российских больных…
Выводы. Таким образом, в результате проведенных исследований были выявлено шесть
мутаций: c. C 3207 A, c. 3402 del C, c. 2304 ins C, c. 1770 ins T, c. 3649_3654 del 6, c. 3942 del
TA+3947 del G. На основании полученных данных усовершенствована существующая система
для ДНК-диагностики гепатоцеребральной дегенерации, и ее эффективность повысилась на 4,3 %.
В процессе пилотного исследования были выявлены мутации c. 3036 ins C и c. 2332 C > G, которые планируется детектировать в общей выборке пациентов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
61. P. 317.
3.
4.
5.
P. 223.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Thomas G.R., Forbes J.R., Roberts E.A. et al. // Nature genetics. 1995. V. 9. P. 210.
Shah A.B., Chernov I., Zhang H.T. et al. // American journal of human genetics. 1997. V.
Lutsenko S, Barnes NL, Bartee M.Y. et al. // Physiol Rev. 2007. V. 87(3). P.1011.
Loudianos G., Dessi V., Lovicu M. et al. // Human mutation. 1998. V. 12. P. 89.
Butler P., McIntyre N., Mistry P.K. // Molecular genetics and metabolism. 2001. V. 72.
Brage A., Tome S., Garcia A. et al. // Hepatol Res. 2007. V. 37. P. 18.
Genschel J., Sommer G., Haas R. et al. // Human mutation. 2000. V. 16. P. 278.
Genschel J., Czlonkowska A., Sommer G. et al. // Human mutation. 2001. V. 17. P. 156.
Olsson C., Waldenstrom E., Westermark K. et al. // Eur J Hum Genet. 2000. V. 8. P. 933.
Caca K., Ferenci P., Kuhn H.J. et al. // Journal of hepatology. 2001. V. 35. P. 575.
Cox D.W., Prat L., Walshe J.M. et al. // Human mutation. 2005. V. 26. P. 280.