Автореферат - Российский государственный медицинский
реклама
На правах рукописи БИЧЕРОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА ОРГАНИЗАЦИЯ ФОЛЛИКУЛОВ И ПАРАФОЛЛИКУЛЯРНЫХ РЕГИОНОВ ЯИЧНИКОВ НА ЭТАПАХ ИХ ПОЗИТИВНОГО И АТРЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ (ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ) 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2008 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Волкова Ольга Васильевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна ГОУ ВПО РГМУ Росздрава доктор медицинских наук, профессор Ерофеева Людмила Михайловна ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава Ведущее учреждение: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова. Защита состоится «8» декабря 2008 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04. при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1). Автореферат разослан «27» октября 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор А.И.Щеголев 2 Общая характеристика работы Актуальность проблемы. В настоящее время актуальность проблемы овофолликулогенеза обусловлена высокой частотой заболеваний яичников, связанных с нарушениями процесса их развития, возникновением в репродуктивном периоде дисфункциональных состояний, возможностью бесплодия (Amsterdam A., Sasson R., 2002; Г.Т.Сухих и др. 2006 и многие другие). Накопленные данные позволяют сделать заключение, что женские половые железы относятся к наиболее динамичным системам организма, характеризующимся морфогенетических не только сложностью преобразований (для происходящих развивающихся в них фолликулов характерен целый комплекс тканей с высокой динамикой развития за очень короткий период времени), но и сложностью и многообразием механизмов регуляции их функции. Установлено, что система регуляции фолликулогенеза представлена сложным иерархическим комплексом, включающим гипоталамо- гипофизарный и гонадный уровни. Кроме того, в регуляции развития яичников и фолликулогенеза принимают участие гормоны периферических эндокринных желез (щитовидной, надпочечников) (Алкадарская И.М. 1980; Миловидова Н.С. 1987; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 1998). Нарушение физиологического баланса гормонов и других биологически активных веществ в рассматриваемой системе неблагоприятно влияет на органогенез и гистофизиологию яичников на последовательных этапах развития. Однако, полученные данные свидетельствуют о том, что именно внутрияичниковым, внутрифолликулярным механизмам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза, ибо они опосредуют и модулируют действие центральных и многих других механизмов регуляции (Волкова О.В. 1986; Бурлеев В.А. и др. 1998; О.В.Волкова, Т.Г.Боровая 1999; Adashi A. et al. 2000; Боярский К. Ю. 2001; Weestergaad L. et al. 2004; Erickson G. et al. 2007 и другие). 3 В настоящее время сохраняется пристальное внимание к локальным регуляторным механизмам. Именно им принадлежит определяющая роль в селекции фолликулов, генезе атрезии, ановуляторных состояний и бесплодия. Среди ведущих влияний этих механизмов: различия в активности рецепции фолликулами гонадотропных гормонов, разные уровни интрафолликулярного синтеза эстрадиола, неравноценное гемообеспечение фолликулярных регионов и многое другое. (Zeleznik A.J. 1981; Shipper I., Hop W. and Fauser B. 1998; Stouffer R., Dahl K. 2002 и др). К таким местным модуляторным механизмам относятся, неспецифичекие факторы роста и многочисленные внутриклеточные белки – регуляторы процессов пролиферации и апоптоза. Наиболее яркими и информативным белками, отражающими протекающие синтетические процессы в клетках и тканях, являются белки Кi-67 и PCNA. К белкам, регулирующим процессы апоптоза, относятся белки семейства Bс1-2, р-53, каспазы. В исследованиях последних лет уделено большое внимание экспрессии этих белков и факторов элементами яичника. Наиболее широко изучается пролиферативная активность, механизмы клеточных иммунологических взаимодействий, механизмы апоптоза клеток созревающих и атрезирующихся фолликулов (Huirne J. and Lambalk C. 2001; Gougeon L. 2004; Butt A.J., Dickson K.A., Jambazov S. et al. 2005; Dragovic R.A., Ritter L.J. 2005; McNatty K.P., Fidler A.E. 2006 и другие). С вопросом фолликулярной селекции тесно сопряжено и дальнейшее исследование систем передачи гормональных сигналов в соматических клетках фолликулярных гистионов, от состояния которых во многом зависит реализация всего комплекса регуляторных сигналов, поступающих в фолликул, включая местные пара- и аутокринные влияния. К таким вторичным мессенджерным системам относятся аденилилциклазная система, фосфатидилинозитольный механизм, принимающий участие в механизме передачи гормональных сигналов соматическим клеткам фолликулов в 4 процессе роста и атрезии (Кулинский В.И. 1997; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 2000; Kodaman P.H., Behrman H.R. 2005; Emmen J.M., Couse J.F. 2008 и др). Цель и задачи исследования Получить новую информацию о структурно-цитохимической организации фолликулов яичников и их тканевого микроокружения. Выявить внутриклеточные белки и факторы роста в различных структурах яичников и проследить динамику этих химических соединенеий на этапах позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел. Для этих целей использовать комплексный морфологический, иммуногистохимический анализ структур яичников: 1. Провести исследование спектра белков, участвующих в процессах пролиферации и регуляции апоптоза в указанных структурах (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9). 2. Исследовать (васкулярного распределение эндотелиального, неспецифических эпидермального, факторов роста инсулиноподобного фактора роста-1) и оценить их роль в процессе овофолликулогенеза и лютеогенеза. 3. Исследовать состояние внутри- и парафолликулярного матрикса на примере системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2. 4. Исследовать состояние гормонтрансдукторных систем соматических клеток фолликулов (на примере анализа содержания универсальных мессенджерных соединений – α-субъединиц G-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-β). 5. Сопоставить активность и количественное распределение исследуемых соединений в структурах фолликулов и их микроокружения, временные параметры их взаимодействия в течение процесса позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел. 5 Научная новизна В настоящей работе впервые проведено комплексное, многогранное изучение распределения химических соединений, выполняющих пара- и аутокринное влияние в обеспечении жизнедеятельности структур яичников: 1)белков клеточной пролиферации и апоптоза (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p53, каспаза-9), 2)универсальных ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1), 3)системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2, 4)гормонтрансдукторной системы ( αсубъединиц G-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-β). Оценены распределение и закономерности синтеза этих соединений в половых клетках, фолликулярном эпителии, клетках желтых тел, в структурах парафолликулярных регионов (в текальных оболочках, интерстиции и кровеносных сосудах) на этапах позитивного и атретического развития фолликулов и желтых тел. Получены свидетельства о том, что регуляция жизнедеятельности яичников осуществляется не одним специфическим фактором, а экспрессией различных химических соединений, присутствующих в структурных компонентах яичника одновременно и меняющихся в количественном отношении в течении фолликулогенеза. Сочетание комплекса этих факторов обеспечивает адекватную реализацию функционального эффекта в каждый период овофолликуло- и лютеогенеза. Кроме качественной оценки интенсивности иммуногистохимических реакций нами впервые был проведен сравнительный количественный анализ функциональной активности структур фолликулов и их регионов методом компьютерной морфоденситометрии (КМДМ). Теоретическая и практическая значимость работы. Исследование носит экспериментальный характер, направлено на изучение закономерностей овофолликулогенеза и лютеогенеза, оценки механизмов регуляции этих процессов (в частности пара- и аутокринных). 6 С использованием метода иммуногистохимии получена новая информация о наличии, взаимодействии и динамических преобразованиях важнейших внутриорганных белков (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза9) и ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) в структурах фолликулов (овоцит, фолликулярные клетки), гормонпродуцирующей желтых тел интерстициальной и ткани окружающей на всех этапах их их позитивного и атретического развития. Особенности структуры яичника позволили одновременно визуализировать на серийных срезах исследуемые белки на этапах роста и атрезии фолликулов и желтых тел. При подробном анализе фолликулогенеза были уточнены наиболее ответственные (круциальные) процессы в химической организации структур яичников, необходимые для поддержания жизнеспособности овоцитов, сохранения блока мейоза, подготовки к овуляции, образованию гормонопродуцирующих желтых тел и атретических фолликулов. Положения, выносимые на защиту: 1. Выявлен комплекс факторов - химических соединений, взаимодействие которых обуславливает оптимальность течения процессов роста и атрезии фолликулов и развития желтых тел. Этим местным внутрияичниковым регуляторным факторам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза и лютеогенеза (они опосредуют и модулируют действия центральных нервных и гуморальных механизмов). 2. Важнейшими компонентами этих химических соединений в овоцитах, фолликулярном эпителии, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани, в желтых телах на всех этапах позитивного роста и атрезии являются: а) группа внутриклеточных белков (PCNA, Ki-67), ответственных за пролиферацию и дифференцировку, индукцию митотической активности; б) группа внутриклеточных белков (Всl-2, р-53, каспаза-9), осуществляющих контроль за процессами апоптоза в указанных элементах яичника. Интенсивность их экспресси варьирует на этапах фолликулогенеза. 7 3. Универсальные ростовые факторы (инсулиноподобный-1, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный) – перманентные компоненты химической организации овоцитов, фолликулярного эпителия, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани и желтых тел яичника. Интенсивность их экспрессии неоднозначна на различных этапах овофолликулогенеза, лютеогенеза и атретических процессов. 4. Выявлена экспрессия матриксных металлопротеиназ (1,9) и их тканевых ингибиторов (1,2) структурами фолликулов, желтых тел и парафолликулярного окружения. Спектр этих соединений меняется в соответствии со стадией развития фолликулов и желтых тел на этапах позитивного и атретического процесса, что свидетельствует об их значении, как региональных механизмов в реаранжировке тканевых структур яичников, обеспечивающих оптимальные условия роста фолликулов и желтых тел. 5. Выявлена закономерность в интенсивности экспрессии компонентов гормонотрансдукторной системы фолликулярного эпителия в процессе развития и созревания фолликулов. Внедрение в практику. Полученные данные найдут применение в курсах обучения студентов гистологии, эмбриологии, эндокринологии, работе научно-исследовательских лабораторий по репродукции и в клинической практике для разработки новых подходов в оценке гипопластических и дисфункциональных состояний яичников. Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Всероссийской научной конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2005); Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2006); Всероссийском конгрессе гистологов и морфологов (Москва, 2006); на съезде Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (Казань, 2007); совместной научной конференции кафедр гистологии, цитологии, эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ. 8 Публикации. Результаты исследования отражены в одиннадцати печатных работах. Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 192 источника отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и иллюстрированы микрофотографиями, графиками, таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на 100 белых беспородных половозрелых самках крыс, находящихся в репродуктивном периоде. В ходе работы применялись следующие варианты обработки экспериментального материала: Морфологический анализ. Исследовались серийные срезы яичников толщиной 5 мкм. Подготовку материала для гистологического исследования проводили по общепринятой методике. Морфологическая оценка состояния гонад крыс основывалась на: 1) анализе популяции примордиальных идентифицировались до на фолликулов разных преовуляторных). основании стадий развития (от Пулы фолликулов Международной классификации (1999).Определение видов фолликулов унифицировано проводилось на сечениях фолликулов, прошедших через ядрышки овоцитов, на каждом пятом срезе серии. 2) анализе желтых тел на разных стадиях развития и регрессии. 3) анализе атрезии фолликулов на разных стадиях атретического процесса (согласно критериям Byskov, 1979). 4) анализе стероидпродуцирующей интерстициальной ткани (по методу С.Б.Стефанова,1974). 9 Важно почеркнуть, что анализировалось серийныене срезы яичников каждого животного: один срез окрашивался гематоксилином и эозином, а соседние срезы обрабатывались реакции. Приготовление на различные иммуногистохимические препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, проводилось с целью определения добротности материала, для получения обзорного препарата и для последующего сравнительного сопоставления препаратов, полученных после иммуногистохимических реакций. Для трансмиссионной электронной микроскопии приготовление материала проводили по стандартной методике Millonig (Гайер Г., 1974). Полученные наблюдения позволили лишь детализировать уже известные сведения по ультрамикроскопической организации клеток фолликулов и дополнительно оценить состояние овоцитов. Метод непрямого иммуногистохимического анализа. Этот метод использовали для выявления: а) белков пролиферации и апоптоза (р53, bcl-2, PCNA, Ki-67, каспаза-9), б) универсальных ростовых факторов (васкулярный эндотелиальный, инсулиноподобный и эпидермальный), в) группы ферментных систем матриксных металлопротеиназ (ММП-1,9) и их тканевых ингибиторов (ТИММП-1,2). Реакции проводились на серийных парафиновых срезах яичников половозрелых крыс. В работе применялись наборы реактивов фирмы ДАКО (2002) и Santa Cruz Biotechnology (2004). В качестве первичных антител использованы моноклональные кроличьи антитела (разведение 1:100). Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали LSAB+Detection System (ДАКО) согласно инструкции, пероксидазную активность выявляли с помощью 3,3 диаминобензидина (DAB), препараты докрашивали гематоксилином Майера и заключали в бальзам. Выявление аденилилциклазы α-субъединиц проводили при G-белков, помощи фосфолипазы-С, реакции непрямого иммуномечения. Реакцию ставили на криосрезах, фиксированных в 96% ацетоне. В качестве первичных антител использовали специфические наборы 10 антител фирмы Dupon в разведении 1:500 в фосфатном буфере PBS с рН= 7,2, содержащем 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Визуализацию первичных связанных антител проводили с помощью авидинбиотин-пероксидазного комплекса (фирмы Результаты Camon). иммуногистохимических реакций в случае цитоплазматической локализации продукта оценивали в баллах (от 1 до 6) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток (n). Реакция считалась отрицательной при полном отсутствии или экспрессии антигена менее чем в 5%; n от 5 до 24% - 1-2 балла (слабая экспрессия); n от 25 до 75% - 3-4 балла (умеренная); n более 75% - 5-6 баллов (выраженная). В случае ядерной локализации продукта реакции подсчитывался процент окрашенных ядер на 100 клеток. Анализ материала и подсчет активности мечения проводили с помощью микроскопа «Lеika». Кроме полуколичественной иммуногистохимических реакций оценки был интенсивности проведен сравнительный количественный анализ функциональной активности фолликулов и их регионов с использованием метода компьютерной морфоденситометрии . Результаты исследования и их обсуждение. Иммуногистохимическая характеристика развивающихся фолликулов. Внутриклеточные участвующие в белки (PCNA, регуляции Ki-67, процессов Bcl-2, каспаза-9), p-53, пролиферации и апоптоза. Анализировалось время появления, распределение, количественная оценка исследуемых белков. Белок PCNA. По данным наших наблюдений этот белок экспрессируют овоциты и гранулезные клетки фолликулов всех стадий развития. Однако, экспрессия наиболее яркая в первичных и вторичных фолликулах. В овоцитах и клетках гранулезной оболочки крупных и атрезирующихся фолликулов обнаружено слабое иммуномечение. При этом theca interna и стероидпродуцирующие клетки стромы также проявляют слабое иммуномечение. 11 Кроме полуколичественной иммуногистохимической сравнительный реакции количественный оценки на белок анализ интенсивности PCNA был иммуномечения проведен активности фолликулов и их регионов с использованием компьютерного метода морфоденситометрии (КМДМ). Распределение интегральной плотности (IOD) содержания белка PCNA (ODxA) в фолликулоцитах яичников на разных стадиях позитивног развития фолликулов. 120 100 97 80 60 57 40 39 20 10 0 I II III IV t Рис. 1. Распределение интегральной плотности (IOD) содержания белка PCNA (ODxA) в овоцитах фолликулов яичника на разных стадиях позитивного развития. 50 45 45 40 35 32 30 28 25 20 15 13 10 5 0 I II III IV t Рис. 2 I – примордиальный фолликул, II – первичный фолликул, III – вторичный фолликул IV – третичный фолликул Впервые с помощью системного подхода была проанализирована морфофункциональная взаимосвязь в системе «овоцит-фолликулярная зона» путем сравнительного анализа иммуногистохимического маркера в структурах яичника. Интегральный показатель морфофункционального состояния овоцита (как единичной клетки), в котором краситель распределен диффузно и интегральный показатель фолликулярной зоны (совокупности 12 клеток) оказались различными. Фолликулярная зона оценивалась как средняя оптическая плотность (OD) и в то же время считалось количество зон (n) и брался интегральный показатель средней OD на количество зон. Аналогичным способом был проанализирован интегральный показатель оптической плотности некоторых других исследованных белков. Контролируя наши данные, оцененные визуально (полуколичественно), мы выборочно сопоставили их с результатами, полученными методом КМДМ и на примере с оценкой интенсивности мечения белка PCNA выявили близкое сходство результатов оценки этих двух методов. Белок PCNA – белок клеточной пролиферации - дополнительный белок к репарационной полимеразе ДНК. Эта полимераза устраняет различные поломки молекулы ДНК при размножении и формировании клеток в эмбриональном развитии и в течение всей жизни. Содержание PCNA в ходе клеточного цикла увеличивается и остается высоким до границы фаз G2/М. Учитывая важнейшее значение белка PCNA в жизнедеятельности клеток понятна и целесообразна необходимость увеличения его экспрессии по мере высокой активации пролиферации и дифференцировки структур растущих фолликулов и желтых тел. Тем более, что эти процессы характеризуются не только высокой напряженностью, но и кратковременностью. Белок Ki-67. Иммуногистохимическая метка на этот белок выявляется в цитоплазме овоцитов и фолликулярных клеток примордиальных и вступивших в рост первичных фолликулов. В развивающихся фолликулах отмечается активная экспрессия в овоците, клетках гранулезной оболочки и единичных клетках формирующейся теки. Наиболее яркое мечение отмечается в фолликулярных клетках зрелых фолликулов. Степень мечения стероидпродуцирующих клеток, лютеоцитов желтых тел, клеток покровного эпителия оказывается менее интенсивной. В овоцитах атретических фолликулов специфической метки на белок Ki-67 не обнаруживается. 13 Белок Ki-67 участвует в стимуляции процесса репликации ДНК. Экспрессия Ki-67 четко ассоциирована с клеточной пролиферацией. Тот факт, что белок Кi-67 присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1,S,G2 и митоз), но отсутствует в покоящемся состоянии (G0), делает его определение весьма информативным для характеристики пролиферации в конкретной клеточной популяции - в овоцит-гранулезном комплексе яичника. Белок bcl-2. При проведении иммуногистохимической реакции регистрируется экспрессия белка овоцитами и фолликулярными клетками. Интенсивность пропорциональна иммуномечения степени фолликулярных развития фолликулов. клеток прямо Наиболее яркая экспрессия в овоците и в гранулезной оболочке характерна для третичных фолликулов. В клетках theca interna реакция значительно слабее. Интенсивно маркируются лютеоциты желтых тел. Стероидпродуцирующая строма иммунопозитивна. Сравнительно высокая экспрессия белка в клетках покровного эпителия свидетельствует об функционировании структур яичника. В овоцитах его участии в атрезирующихся фолликулов экспрессия bcl-2 отсутствует. В клетках уже сформированного атретического тела отмечается высокий уровень экспрессии данного белка. Белок bcl-2 – ключевое белковое соединение - занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. Запуск процесса апоптоза происходит за счет высвобождения митохондриальных факторов, которыми являются цитохром С, а также апоптозиндуцирующий фактор (по-видимому, протеаза). Высвобождение этих факторов приводит к распаду комплекса Bcl2/неакгивная каспаза-9, что вызывает активацию каспазы-9, индуцирующей финальные стадии апоптоза. Однако, белок всl-2, связывая белок «bax», может выступать и в роли ингибитора апоптоза. В развитии и атрезии фолликулов, также как и в формировании и обратном развитии желтых тел, эта многогранная функция белка bcl-2 несомненно определяющая: контроль прогрессирующего фолликулярного развития, 14 перехода в атрезию, формирование новой эндокринной структуры – атретического фолликула, развитие и дегенерация желтых тел. Белок р53. Экспрессия этого белка в цитоплазме примордиальных фолликулов в наших препаратах овоцитов минимальна. В первичных фолликулах (с двуслойной гранулезной оболочкой) экспрессия несколько более выражена. Во вторичных фолликулах (без полости, с многослойной гранулезной оболочкой интенсивность иммуномечения нарастает и формирующейся и цитоплазма текой) овоцитов положительно маркируется. Затем маркирование цитоплазмы овоцитов, как и клеток гранулезной оболочки вторичных и третичных фолликулов, становится интенсивнее. Локусы стероидпродуцирующих клеток и покровный эпителий включают метку. Соединительнотканная строма инертна. В атретических фолликулах специфическая метка на белок р-53 в овоцитах не определяется. Интенсивное маркирование цитоплазмы овоцитов и фолликулоцитов вторичных и третичных фолликулов на исследуемый белок может быть связано с определяющим участием этого белкового соединения на этапах большого роста фолликулов. Возможность репарации поврежденной ДНК в структурах растущих фолликулов мутантных клеток, то предотвращает тем самым появление есть сохраняется генетическая полноценность созревающих овоцитов в ходе сложного процесса овофолликулогенеза. Каспаза-9. Иммуногистохимическая метка выявляется и в ядрах, и в цитоплазме овоцитов и клеток фолликулярного эпителия. В примордиальных фолликулах слабо маркируются ядра овоцитов и клетки фолликулярного эпителия. В первичных фолликулах с двуслойной гранулезной оболочкой, во вторичных и третичных фолликулах выраженно маркируется большинство ядер фолликулярных клеток. Клетки theca interna третичных фолликулов также активно включают метку. В стромальных элементах определяется положительная реакция в ядрах отдельных гладкомышечных клеток сосудов, эндотелии и в клетках покровного эпителия. 15 Свои особенности имеет распределение метки в популяции желтых тел. Выявляется метка в свежесформированных желтых телах. В лютеоцитах, лежащих на периферии желтых тел позитивны и ядра, и цитоплазма, а в лютеоцитах, лежащих ближе к центру – только ядра. Иначе выглядят старые генерации желтых тел: умеренно маркируется часть ядер соединительнотканных клеток, слабо окрашивается цитоплазма лютеоцитов, расположенных по периферии этой временной железы. Активно маркируются и ядра, и цитоплазма клеток атретических тел. Цистеиновые протеазы – каспазы – являются основными фигурантами эффекторной фазы апоптоза. Каспаза-9 относится к группе индукторов, принимающих апоптотический сигнал и передающих его на эффекторные каспазы, которые будучи активированными, начинают цепь протеолитических событий, цель которых – демонтаж клетки. Участие каспаз в апоптозе направлено на разрыв связей с окружающими клетками, реорганизацию цитоскелета, снижение возможностей репарации и репликации ДНК, разрыв ядерной мембраны и разрушение ДНК, выброс сигналов, маркирующих клетку для апоптоза, расчленение клетки на апоптотические тельца. В яичнике, как ни в каком другом органе, процессы роста и обратного развития являются составляющими его жизнедеятельности, превалируя или уменьшаясь на разных этапах фолликулогенеза, лютеогенеза и атрезии. Поэтому каспаза-9 – обязательный и постоянно работающий фермент в структурах яичника. Матриксные металлопротеиназы (ММП) и их тканевые ингибиторы (ТИММП). Экспрессия ММП-1 обнаруживается в половых клетках всех стадий развития фолликулов. Специфическое маркирование выявляется и в ядре, и в цитоплазме овоцитов. Иммунопозитивны и клетки гранулезной оболочки фолликулов разных стадий развития. Степень мечения гранулезных клеток прямо пропорциональна степени зрелости фолликулов: в примордиальном и начавшем рост первичном фолликуле гранулезные клетки слабо включают метку, в то время как наибольшее количество 16 иммуногистохимических включений обнаруживается в клетках полостных вторичных и третичных фолликулах. Клетки theca interna маркируются умеренно, в то время как локусы интерстициальных гормопродуцирующих клеток и клетки покровного эпителия визуализируются четко. В сосудах определяется следовая реакция. Соединительнотканная строма яичника иммунонегативна. В лютеиновых клетках функционально активных желтых тел ММП-1 определяется, в стромальных компонентах – не выявляется. Распределение ММП-9 в соматических и половых клетках фолликулов разных стадий развития, клетках желтых и атретических тел, интерстициальной ткани яичников и покровного эпителия практически идентично ММП-1. Как показывают проводимые исследования, семейство ММП и ТИММП является мощной ферментной системой, способной активно перестраивать матрикс в процессе физиологического и патологического развития тканей. В яичнике происходит постоянный рост фолликулов и желтых тел, что требует непрерывной реорганизации в клеточном составе этих структур и реорганизации окружающего соединительнотканного матрикса. Этим объясняется иммуномечение этих ферментов не только в фолликулоцитах растущих фолликулов, но и в овоцитах. При участии коллагеназы ММП-1 происходит перестраивание фибриллярного коллагена (важного структурного компонента матрикса), а при участии желатиназы ММП-9 – перестройка коллагена четвертого типа (основного компонента базальных мембран). Благодаря этой перестройке создаются оптимальные условия для быстрорастущих фолликулов и желтых тел, образования атретических тел. В результате этого овоциты и фолликулоциты созревающих фолликулов получают возможность коллагена также расти способствует и дифференцироваться. клеточной миграции: Перестройка пролиферация фолликулярных клеток, разрастание и накопление клеток theca interna вокруг увеличивающихся в объеме фолликулов, врастание клеток тека при 17 формировании атретических тел, прогрессивное увеличение лютеоцитов, врастание периферических лютеоцитов в формирующиеся желтые тела. Действие ММП ингибиторы регулируется ММП (ТИММП). рядом В – ингибиторов наших препаратах присутствует в овоцитах и гранулезных клетках тканевые ТИММП-1 фолликулов разных стадий развития. Фолликулы ранних стадий развития выявляют слабую экспрессию. Наиболее ярко маркируются зрелые фолликулы. Более выражено маркируются фолликулоциты, theca interna, интерстициальные эндокриноциты и покровный эпителий. Экспрессия ТИММП-1 в соединительнотканной строме не выявляется и слабо определяется в атретических телах. Экспрессия ТИММП-2 наиболее ярко проявляется в гранулезной оболочке и theca interna вторичных и третичных фолликулов и на ранних этапах атрезирующихся фолликулов. Интенсивность маркирования зависит от степени атрезии и давности существования атретических тел. Лютеоциты и клетки атретических тел метятся менее интенсивно. Отмечена экспрессия и в клетках покровного эпителия. В клетках и сосудах соединительной ткани специфическое мечение отсутствует, выявляется слабая реакция в отдельных эндотелиальных и гладкомышечных клетках. Таким образом, матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы вовлечены в процесс ремоделирования внеклеточного матрикса яичника, что является определяющим фактором в течение процесса фолликулогенеза и обратного развития фолликулов, обуславливая стремительный рост, дифференцировку, структурные изменения гонад в кратчайший промежуток времени. Помимо данных о способности ТИММП регулировать активность ММП в настоящее время существует предположение, что ТИММП определенным образом влияют на апоптоз, клеточный цикл, стимулируют стероидную продукцию в яичниках. Состояние мессенджерных соединений гормонтрансдукторной системы. Активность иммуномечения гранулезных клеток на α-субъединицы G-белков: 18 Специфического мечения α-субъединиц G-белков в гранулезных клетках примордиальных фолликулов не отмечается, в первичных фолликулах – активность включения метки незначительна. С увеличением размеров фолликулов число меченых клеток возрастает до 44% и к преовуляторным стадиям достигает 75%. Эндокриноциты внутренней текальной оболочки фолликулов (начиная со стадии малых вторичных фолликулов) также включают метку. Активность мечения клеток гранулёзной оболочки на аденилилциклазу (АЦ) возрастает прямо пропорционально степени развития фолликула и достигает максимума в клетках гранулёзы третичного фолликула. Фосфолипаза-С не обнаруживается в клетках гистионов примордиальных и первичных овариальных фолликулов, но активно экспрессируется в гранулезных клетках фолликулов поздних стадий. Позитивная динамика включения метки на активные α-субъединицы Gбелков свидетельствует об активации передачи гормональных сигналов в гранулезных клетках и текацитах в процессе роста фолликулов. Отсутствие экспрессии фосфолипазы-С в фолликулах ранних стадий развития и увеличение активности иммуномечения гранулезных клеток вторичных фолликулов может быть связано с увеличением внутриклеточного синтеза простагландинов, поддерживающих финальные стадии роста фолликулов и инициирующих преовуляторную перестройку. Соответственно, вторичные мессенджерные соединения - G-белки, АЦкомплекс и фосфатидилинозитольный механизм принимают участие в восприятии гормональных сигналов, стимулирующих и ингибирующих фолликулогенез. Ростовые факторы Экспрессия инсулиноподобного фактора роста –I (ИПФР) ярко выражена в половых и фолликулярных клетках примордиальных фолликулов. В первичных фолликулах маркируется цитоплазма всех гранулезных клеток. Во вторичных фолликулах отмечается интенсивная экспрессия не только 19 клеток гранулезной оболочки, но и формирующихся клеток внутренней теки. В малых полостных фолликулах позитивно маркируется цитоплазма всех клеток theca externa, в то время как в крупных полостных положительная реакция определяется соединительнотканной только оболочки. в отдельных Положительно клетках наружной маркируются клетки интраовариальной сети, покровного эпителия, эндотелиальные клетки и некоторые ядра гладкомышечных клеток сосудов. Иммунонегативны стромальные клетки и миоидные элементы. В желтых телах выраженная реакция в цитоплазме лютеоцитов. ИПФР принимает активное участие не только в фолликулогенезе, но и в процессах атрезии фолликулов – его транскрипты были обнаружены в атретических фолликулах. В атретических телах, находящихся в стадии расцвета, регистрируется выраженное маркирование и в ядрах, и в цитоплазме эндокриноцитов. В погибающих атретических телах сохраняется метка в ядрах. Стромальные клетки обнаруживают иммунонегативность. Наши материалы подтверждают данные, что инсулиноподобные факторы роста имеют широкие митогенные и метаболические эффекты в яичнике. ИПФР синтезируетя в фолликулах яичника, что подтверждает наличие рецепторов в клетках фолликулов и самого фактора в фолликулярной жидкости. Высокие концентрации ИПФР способствуют воздействию ФСГ на клетки гранулезы (Erickson G., Shimasaki S.,2001). Доминантный фолликул содержит ИПФР-I в большей концентрации, чем недоминантные когорты. Более того, уровень ИПФР-I в фолликулярной жидкости положительно коррелирует как с концентрацией эстрадиола и прогестерона, так и с объемом фолликулярной жидкости. ИПФР стимулирует рост, пролиферацию и дифференцировку различных клеточных элементов фолликула, усиливает продукцию эстрадиола. ИПФР, действуя синергично с ФСГ, стимулирует ароматазную активность в клетках гранулезы и таким образом увеличивает синтез эстрогенов. 20 При постановке иммуногистохимической реакции на выявление васкулярного эндотелиального фактора роста (ВЭФР) метка в структурах яичника распределялась следующим образом: на начальных этапах развития фолликулов, уже в примордиальных и затем в первичных, выраженно маркируется цитоплазма овоцитов. Также ярко маркируется и цитоплазма всех фолликулярных клеток. Положительная экспрессия ВЭФР отмечена в овоцитах, фолликулоцитах и в прилежащих к фолликулу клетках интерстициальной ткани (будущие клетки теки) первичных фолликулов. По мере роста фолликулов, начиная с вторичных, цитоплазма овоцитов и фолликулоцитов маркируется менее интенсивно. В третичных фолликулах метка обнаруживается во всех фолликулярных клетках и клетках theca interna, однако, по сравнению с вторичными активность включения метки менее выражена. В функционально активных желтых телах маркируется цитоплазма лютеиновых клеток. В формирующихся атретических телах выраженная реакция отмечена в цитоплазме эндотелия растущих сосудов. Позитивно реагируют локусы гормонопродуцирующих клеток, эндотелиоциты и ядра отдельных гладкомышечных клеток сосудов, ядра клеток покровного эпителия, цитоплазма клеток интраовариальной сети. ВЭФР, стимулируя пролиферацию и ингибируя апоптоз овоцитов, обладает ангиогенной активностью. Образование сосудов и васкуляризация играют важнейшую роль в росте и формировании доминантного фолликула. С самого начала развития адекватное гемообеспечение примордиальных фолликулов играет важную роль в инициации большого роста овоцита, в дальнейшем ВЭФР способствует активной пролиферации клеток и дифференцировки во время роста фолликулов и формирования желтого тела. Проведенное иммуногистохимическое исследование выявило наличие рецепции к эпидермальному фактору роста (ЭФР). Активно маркируются фолликулоциты и клетки theca interna вторичных фолликулов. В третичных 21 фолликулах эффект неоднозначный: фолликулоциты corona radiatа и кумулюса слабо позитивны, а в клетках гранулезного слоя экспрессия более интенсивная. Максимально преовуляторных ярко фолликулов. маркируются Цитоплазма гранулезные овоцитов клетки созревающих фолликулов выявляет только слабое мечение. Активно метится цитоплазма лютеоцитов, клетки атретических тел и покровного эпителия. Максимальное содержание рецепторов эпидермального фактора роста в гранулезных клетках приходится на стадию преовуляторной подготовки. Установлено, что ЭФР потенцирует эффект гонадотропных гормонов, подавляет апоптоз в клетках зернистого слоя путем стимуляции синтеза прогестерона и регуляции распределения внутриклеточного свободного кальция, стимулирует созревание овоцитов. ЭФР принимает участие в атрезии фолликулов. развивающегося Избыточное фолликула образование ЭФР способствует в регионе переключению внутрифолликулярного эстрогенобразования на синтез прогестерона. Такой фолликул не сможет закончить свое развитие и уйдет в атрезию. Таким образом, активная экспрессия исследованных факторов роста как соматическими, так и половыми компонентами гонад подтверждает их функциональную необходимость в региональном механизме ауто- и паракринной регуляции текущих процессов в яичнике. Обобщая полученные данные, следует заключить, что в основе физиологического течения фолликулогенеза и лютеогенеза лежит комплекс структурно-функциональных интрагонадных механизмов – различных химических соединений, которые синтезируются в яичнике и накапливаются в его структурах. К ним относятся ростовые факторы (васкулярный эндотелиальный, эпидермальный, инсулиноподобный фактор роста-1), белки пролиферации и апоптоза (PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9), трансформирующие различные центральные сигналы, и, таким образом, паракринно регулирующие овофолликулогенез и лютеогенез. 22 Выводы 1) Использование метода иммуногистохимии позволило определить различия в активности ряда химических соединений в структурах яичников: ростовые факторы (инсулиноподобный, васкулярный эндотелиальный и эпидермальный), внутриклеточные белки пролиферации (PCNA, Ki-67) и апоптоза (вс1-2, р-53, каспаза-9), матриксные металлопротеиназы-1,9, тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ-1,2, гормонтрансдукторная система. 2) Выявлена динамика экспрессии исследуемых внутриклеточных белков на стадиях позитивного и атретического процесса овофолликулогенеза и лютеогенеза: В примордиальных фолликулах (в овоцитах и фолликулярных клетках) на границе их начала роста уже выявляется иммуномечение, что обеспечивает активный положительное переход фолликулов в стадию большого роста. В течение последующего роста фолликулов и, особенно, в антральных стадиях и стадии расцвета желтых тел происходит прогрессирование экспрессии изучаемых белков с дальнейшим снижением их активности в финальных стадиях овофолликулогенеза. В стадии преовуляторных фолликулов (и затем в начале овуляции в период отрыва овоцита и лучистого венца) выявляется резкое снижение экспрессии внутриклеточных белков («опустошение»), в то время как в фолликулярной жидкости идентифицируется видимое накопление пептидов. В ходе атретических процессов минимальная экспрессия белков отмечена в начале стадии атрезии с последующим максимальным содержанием в период завершения формирования атретического тела. 3)Выявлена перманентная экспрессия ростовых факторов: инсулиноподобного, васкулярного эндотелиального и эпидермального. Иммуномечение овоцитов, фолликулоцитов, стероидпродуцирующих клеток 23 теки, интерстициальной ткани и желтых тел свидетельстует о постоянстве этих химических компонентов в обеспечении хода процессов развития и атрезии в яичнике. Для фолликулов на начальных стадиях атрезии характерна волна снижения экспрессии ростовых факторов с последующим подъемом их количественного представительства при формировании активно продуцирующего гормоны атретического тела. По своей динамике экспрессии эти факторы во многом тождественны динамике экспрессии внутриклеточных белков, активизирующих процессы пролиферации. Особенно функционально активны инсулиноподобный и васкулярный эндотелиальный факторы. 4) Наличие маркирования клеток покровного эпителия и интраовариальной сети предполагает возможность их функционального участия в жизнедеятельности структур яичника. 5) Соединительнотканная строма при иммуногистохимическом анализе на указанные белки и ростовые факторы иммунонегативна. В структурных компонентах сосудов экспрессия слабая и локусная. Более выраженное иммуномечение эндотелия обнаруживается при реакции на выявление васкулярного эндотелиального фактора роста. 6) Матриксные металлопротеиназы (ММП-1,9) и тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (ТИММП-1,2) параллельно нарастающие по мере роста фолликулов и желтых тел, в своем взаимодействии контролируют специфичность локального ремоделирования внеклеточного матрикса яичника, обуславливая адекватность условий как для роста и размещения значительно увеличивающихся в объеме фолликулов и желтых тел, так и для перестройки тека при атрезии. 7)Позитивная динамика иммуномечения компонентов гормонтрансдукторной системы свидетельствует об активации передачи гормональных сигналов фолликулярными клетками по мере роста фолликулов, достигая максимума к преовуляторной стадии. 24 8) Распределение и динамика экспрессии исследуемых внутриклеточных белков (белки пролиферации PCNA, Ki-67 и апоптоза вс1-2, р-53, каспаза-9), ростовых факторов (инсулиноподобный, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный), матриксных металлопротеиназ-1,9, тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2, состояния гормонтрансдукторной системы свидетельствуют о функционировании многогранной локальной регуляции функции яичников. Эти механизмы являются неотъемлемыми компонентами прогрессивного развития овофолликулогенеза, лютеогенеза и процесса атрезии, и их динамичное взаимодействие лежит в основе оптимального течения этих сложнейших, скоротечных процессов в яичнике. Практические рекомендации Полученные результаты могут быть использованы в лекционных курсах для студентов медицинских вузов на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, акушерства и гинекологии. Кроме того, полученные данные могут послужить основой для развития и совершенствования методов терапии дисфункциональных состояний женской репродуктивной системы, для разработки новых подходов при диагностике и лечении врожденной яичниковой формы бесплодия и комбинированной адьювантной терапии опухолей яичника. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Т.Г.Боровая, О.В.Волкова, И.А.Бичерова. Актуальные аспекты проблемы репродукции// Материалы конференции «Функциональная нейро- морфология – фундаментальные и прикладные исследования» - Минск. – 2001.- С.242-245. 2. О.В.Волкова, Т.Г.Боровая, Е.О.Погорельская, И.А.Бичерова. Актуальные аспекты ово-фолликулогенеза // Ж. «Успехи современного естествознания» Москва. - 2003.- № 1.- с.45-47. 3. Т.Г.Боровая, О.В.Волкова, И.А.Бичерова. Исследование матриксных металлопротеиназ и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ в 25 структурах яичника// Материалы I съезда физиологов стран СНГ. – Сочи. 2005. - с.149-150. 4. О.В.Волкова, Т.Г.Боровая, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. Аспекты проблемы регуляции физиологических и репаративных процессов // Материалы Всероссийского научного конгресса «Человек и лекарство». – Москва. – 2005.- с.244-246. 5. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.Г.Кругликов, Г.А.Демяшкин. Морфоцитохимические особенности гамет в процессе роста // «Морфология» - Москва. - 2006. - №4. - с.34. 6. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. Факторы локальной регуляции гаметогенеза // Материалы 5-й Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле». – Орел. – 2006. - с.58-60. 7. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. Факторы роста и их значение в процессах репродукции // Ж. «Фундаментальные исследования» - Москва. – 2006. - №5.- с.82-83. 8. И.А.Бичерова, О.В.Волкова, В.А.Степаненко. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы в морфогенезе яичника // Материалы Всероссийского научного конгресса морфологов. - Москва. – 2006.- № 4.- с.23. 9. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. О механизмах регуляции репродукции // «Морфология». – Москва. - 2007. - №2. - с.73-74. 10. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин, Н.В.Шевлягина. Ранние этапы гаметогенеза и специфика их гистионов // «Астраханский медицинский журнал». - 2007. - №2. - с.49-50. 11. И.А.Бичерова. Иммуноцитохимические аспекты фолликулогенеза и система его локальной регуляции // Материалы Международного конгресса «Здоровье и образование в ХХI веке. Концепции болезней цивилизации». – Москва. - РУДН. – 2007. - с.145. 26
