Прогностический тест на формирование

Проект
Клинические рекомендации
Прогностический тест на формирование пищевой
аллергии у детей путем определения цитокинов в
грудном молоке
Москва 2015 г
1
Содержание
Стр.
Разработчики……………………………………………………………………..
3
1. Введение……………………………………………………………………….
4
2. Методология…………………………………………………………………..
6
3. Описание медицинской разработки.………………………………………..
8
3.1. Результаты научно-исследовательской работы………………………
9
3.2. Сведения о патентовании………………………………………………
12
3.3. Степень готовности медицинской технологии к внедрению……….
12
3.4. Область применения медицинской технологии…………………….
12
3.5. Реализация в практике………………………………………………..
12
4. Заключение……………………………………………………………………
13
Список литературы……………………………………………………………….
14
2
Разработчики: д.м.н, профессор Ревякина В.А., д.м.н, профессор Сенцова Т.Б., к.м.н.
Кувшинова Е.Д., к.м.н. Ворожко И.В., Тимофеева А.М., Березина Е.Ю.
Организация-разработчик:
Федеральное
государственное
бюджетное
научное
учреждение «Научно-исследовательский институт питания»
3
Введение.
Пищевая
определенным
аллергия
(ПА)
видам
-
повышенная
пищевых
продуктов
чувствительность
организма
(аллергенов),
иммунопатологическими механизмами. Пищевая
к
обусловленных
аллергия
характеризуется
полиморфизмом клинических проявлений, поражая различные органы и системы. Среди
них значительный удельный вес принадлежит кожным и гастроинтестинальным
проявлениям аллергии.
пищевой
аллергии
Ведущим
являются
иммунологическим
IgE-опосредованные
механизмом
реакции.
При
реализации
аллергическом
поражении кожи и желудочно-кишечного тракта могут иметь место и не IgE-,
опосредованные
реакции,
обусловленные
IgG
антителами
или
реакциями
гиперчувствительности замедленного типа.
Профилактика пищевой аллергии проводится детям из группы высокого риска,
т.е. имеющим наследственную отягощенность по аллергическим заболеваниям
Определенным
превентивным
эффектом
обладает
исключительно
грудное
вскармливание до 4-6 месяцев жизни.
Грудное вскармливание – идеальная форма питания для ребенка, организм
которого нуждается в постоянной защите от патогенных микроорганизмов и агрессивных
факторов внешней среды. Грудное молоко содержит важные нутриенты (белки, жиры,
лактозу, минералы), имеющие питательную ценность и необходимые для оптимального
питания и развития ребенка. Помимо нутриентов, грудное молоко содержит гормоны,
факторы роста и вещества, связанные с иммунной системой, такие как секреторный IgA
(sIgA),
В и Т-лимфоциты
(5–10%),, нейтрофилы (30–40%), макрофаги (55–60%),
олигосахариды, цитокины. Вполне вероятно, что многие из этих веществ, не имеющих
пищевого значения, обеспечивают развитие иммунной системы ребенка и тем самым
защищают его от патогенных микроорганизмов и предупреждают развитие аллергии.
Большинство лимфоцитов в грудном молоке составляют CD3+, CD8+-клетки, которые
принимают участие в формировании феномена иммунологической толерантности, а также
являются
компонентом
противовирусного
и
противоопухолевого
иммунитета.
CD4+лимфоциты грудного молока экспрессируют маркеры CD40L, sCD30, рецептор к
IL-2 и CD45RO+ – маркер, ассоциированный с иммунологической памятью. Полагают,
что
активированные
Т-клетки
матери
компенсируют
функцию
Т-лимфоцитов
новорожденных и обеспечивают их дифференцировку и созревание. Тот факт, что у детей,
получающих грудное молоко, размеры тимуса в 2 раза больше, чем у детей, находящихся
на искусственном вскармливании, возможно, подтверждает это предположение.
4
Секреторный
содержатся
и
IgA
другие
(sIgA)–основной иммуноглобулин женского молока. В нем
растворимые
молекулы,
способные
оказывать
иммуномодулирующие эффекты – молекулы адгезии (например, внутриклеточная
молекула адгезии-1 и сосудистая молекула адгезии-1), гормоны, факторы роста и др.
Большое
значение
придаётся
содержанию
в
грудном
молоке
TGF-β
(трансформирующий фактор роста β), где он находится преимущественно в виде TGFβ2-изоформ. Он играет важную роль в регуляции иммунной системы. Через белок Foxp3
TGF-β влияет на регуляторные Т-клетки и T-хелперы, оказывает противовоспалительное
влияние
на иммунный ответ, стимулирует синтез IgA и
блокирует активацию
лимфоцитов и макрофагов. В проведенных экспериментальных исследованиях было
показано, что мыши с врожденным дефицитом TGF-β выживали в течение всего периода
грудного вскармливания за счет содержания этого цитокина в материнском молоке.
Назначение лабораторным животным TGF-β внутрь индуцировало формирование
оральной толерантности.
В последнее время обсуждается вопрос о взаимосвязи
наличия TGF-β в
материнском молоке и развитием аллергических заболеваний. В ряде клинических
исследований
было
показано,
что
в
67%
случаев
отмечалась
положительная
корреляционная связь между низким содержанием TGF-β в грудном молоке и
последующим развитием аллергических заболеваний.
В грудном молоке содержатся и другие цитокины, например, IL-1, IL-6, IL-8
вместе с их растворимыми рецепторами, ограничивающих их активность (ссылка).
Установлено, что в первые месяцы лактации в грудном молоке содержатся достаточное
количество цитокинов, предполагая, что таким образом компенсируются, «незрелость»
иммунной системы новорожденного ребенка. Цитокины, антитела и другие компоненты
иммунной системы, содержащие в грудном молоке,
подтверждают,
что собственная
иммунная система ребенка находится под влиянием грудного вскармливания. Участие
цитокинов грудного молока в регуляции иммунного ответа ребенка, рожденного с
«незрелостью» иммунной системы возможно предупреждает развитие ряда заболеваний,
влияет на формирование оральной толерантности и развития пищевой аллергии.
5
2. Методология
Методы, использованные для сбора/селекции доказательств:
 поиск в электронных базах данных.
Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:
 оценка значимости в соответствии с уровнями доказательности и классами
рекомендаций (табл.1, 2).
Таблица 1. Уровни доказательности
Уровень
1
2
3
4
Источник доказательств
Проспективные рандомизированные контролируемые исследования.
Достаточное количество исследований с достаточной мощностью, с участием
большого количества пациентов и получением большого количества данных.
Крупные мета-анализы.
Как минимум одно хорошо организованное рандомизированное контролируемое
исследование.
Репрезентативная выборка пациентов
Проспективные с рандомизацией или без исследования с ограниченным количеством
данных.
Несколько исследований с небольшим количеством пациентов.
Хорошо организованное проспективное исследование когорты.
Мета-анализы ограничены, но проведены на хорошем уровне.
Результаты непрезентативны в отношении целевой популяции.
Хорошо организованные исследования «случай-контроль»
Нерандомизированные контролируемые исследования.
Исследования с недостаточным контролем.
Рандомизированные клинические исследования с как минимум 1 значительной или
как минимум 3 незначительными методологическими ошибками.
Ретроспективные или наблюдательные исследования.
Серия клинических наблюдений.
Противоречивые данные, не позволяющие сформировать окончательную
рекомендацию
Мнение эксперта/данные из отчета экспертной комиссии, экспериментально
подтвержденные и теоретически обоснованные
6
Таблица 2. Уровни рекомендаций.
Уровень
A
B
Описание
Рекомендация основана на высоком уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 1 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
Рекомендация основана на среднем уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 2 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
C
Рекомендация основана на слабом уровне
доказательности (но как минимум 1
убедительная публикация 3 уровня
доказательности, показывающая значительное
превосходство пользы над риском) или
нет убедительных данных ни о пользе, ни о
риске)
D
Отсутствие убедительных публикаций 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающих
значительное превосходство пользы над риском,
либо убедительные публикации 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающие
значительное превосходство риска над пользой
Расшифровка
Метод/терапия первой линии;
либо в сочетании со
стандартной
методикой/терапией
Метод/терапия второй линии;
либо при отказе,
противопоказании, или
неэффективности стандартной
методики/терапии.
Рекомендуется
мониторирование побочных
явлений
Нет возражений против
данного метода/терапии
или нет возражений против
продолжения данного
метода/терапии.
Рекомендовано при отказе,
противопоказании или
неэффективности стандартной
методики/терапии, при
условии отсутствия побочных
эффектов
Рекомендация основана на
мнении экспертов, нуждается
в проведении исследований
Методы, использованные для анализа доказательств:
Доказательной базой для рекомендаций служили публикации, входящие в Кохрайновскую
библиотеку, в базы данных EMBASE и PubMED/MEDLINE
Описание методов, использованных для анализа доказательств:
Были использованы: Ким Флейшер Микаэльсон. Грудное вскармливание. В кн.
Практические аспекты педиатрической диетологии. Под ред. Б. Колецко. 2008, с.92-97;
Фатеева Е.М. История организации вскармливания детей первого года жизни.
Биотехнология, 2012, №1, с.21-26; Lawrence RA, Lawrence RM: Breastfeeding: A Guide for
the Medical Profession, ed 6. St. Louis, Mosby,2005; Oddy WH, Halonen M, Martinez FD, et al;
TGF- β in human milk is associated with wheezing in infancy. J Allergy Clin Immunol. 2003;
112. (4): 723-728
7
Основные рекомендации:
Сила рекомендаций (A-D) приводятся при изложении текста технологии.
3. Описание медицинской разработки
Разработана диагностическая технология определения цитокинов и sIgA
в грудном
молоке матери для прогноза развития пищевой аллергии у детей (уровень В).
Поставленная задача решена следующим образом. Сбор грудного молока у
наблюдаемых
женщин
осуществлялся
через
месяц
после
рождения
ребенка.
Определялось содержание sIgA, IL-17A, IL-2, TNF-β (трансформирующий фактор роста β)
в грудном молоке этих матерей.
Образцы грудного молока забирались в стерильные пластмассовые пробирки на
28-30 день от рождения ребенка. Исследование SIgA проводили в течение 2 часов после
забора молока, которое центрифугировали в течение 15 минут (3000 об/мин), снимали
жировую пленку с поверхности молока и определяли содержание секреторного IgA. Для
исследования содержания sIgA в грудном молоке
применялся
метод радиальной
иммунодиффузии с использованием моноспецифических антисывороток к SC- фрагменту
IgA
производства
Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.И.
Габричесвкого. Образцы грудного молока для определения цитокинов (IL-17A, IL-2,
TNF-β) после центрифугирования хранили при температуре 400.
Обработку полученных результатов исследования проводили с использованием
пакета прикладных программ
Statistica
фирмы StatSoft Inc (США). Для анализа
полученных результатов определяли средние значения признака
(М), стандартные
ошибки среднего (m). Достоверность различий оценивалась с помощью критерия
Стъюдента для независимых и связанных выборок при значениях вероятности p<0,05.
Различия групп расценивались как статистически значимые при p<0,05 или статистически
высокозначимые при p<0,01.
Результаты и обсуждение
Под наблюдением находилось 44 корящих женщин и их дети с момента рождения
до 6 месячного возраста.
В зависимости
от данных аллергологического анамнеза
кормящие женщины были разделены на две группы: В первую группу вошли 26 (59,1%)
кормящих матерей, страдающие сами аллергическими заболеваниями (бронхиальная
астма, аллергический ринит, поллиноз) или имеющие аллергические заболевания в роду.
Вторую группу составили 18 (40,9%) кормящих женщин, не имеющих аллергических
заболеваний у себя и ближайших родственников
8
Результаты исследования
уровней sIgA и цитокинов (TGF-β IL-17A IL-2) в
грудном молоке кормящих женщин представлены в табл.3.
секреторного IgA в грудном молоке
Анализ показателей
показал, что у женщин с аллергией они были
достоверно ниже по сравнению с женщинами без аллергии (P<0,05).
секреторные IgA
Известно, что
в большом количестве поступают с материнским молоком,
и
осуществляет функцию местного иммунитета. В ранее проведенных исследованиях у 3месячных детей,
чьи
родители имели атопию,
недостаточность sIgA.
Поэтому,
выявлялась
транзиторная
«незрелая» местная иммунная система
у
новорожденных не может справиться с повышенной нагрузкой антигенами. В связи с
этим,
у детей с высоким риском развития атопии
повышенное всасывание антигенов
может привести к сенсибилизации и в дальнейшем повторный контакт даже с небольшим
количеством антигена оказывается достаточным для появления симптомов аллергии.
Концентрация TGF-β в грудном молоке кормящих женщин первой группы
статически значимо ниже (P<0.01) аналогичного показателя у корящих матерей второй
группы. Как показали проведенные исследования, у
женщин с положительным
аллергологическим анамнезом заболеваниями отмечены статистически низкие значения
IL-17A в грудном молоке по сравнению с кормящими женщинами без аллергии. Уровни
IL-2 в грудном молоке у кормящих женщин достоверно не отличались от аналогичного
показателя женщин второй группы (P<0,1).
Таблица 3 Уровни sIgA и цитокинов в грудном молоке
Показатели
sIgA мг/дл
TGF-β,
pg/ml
IL-17A,
pg/ml
Первая группа (n=28)
Корящие женщины с
положительным
аллергологическим
анамнезом
2,76  0,13
Вторая группа (n=18)
Корящие женщины с
отрицательным
аллергологическим
анамнезом
2,88  0,16
Р-вероятность
различий между
первой и второй
групп
43,2  4,8
56,7  6,4
P<0,01
0,33  0,12
0,24  0,11
P<0,05
5,5  0,7
4,6  1,4
P<0,1
IL-2, pg/ml
Таким
образом,
в
грудном
молоке
кормящих
женщин,
P<0,05
страдающих
аллергическими заболеваниями или имеющие аллергические проявления в семье,
выявлялись низкие показатели
sIgA,
TGF-β,
высокие IL-17A по сравнению с
9
кормящими женщинами без аллергии. Не выявлено статистически значимых различий
концентраций IL-2
в грудном молоке у женщин
в двух наблюдаемых группах.
Выявленный цитокиновый дисбаланс у корящих матерей с аллергией (низкие значения
TGF-β и высокие уровни IL-17A) по-видимому, является основой для развития пищевой
сенсибилизации, как пускового фактора для аллергических заболеваний. По-видимому,
дисбаланс цитокинов у детей в периоде формирования сенсибилизации определяет
последующую форму иммунного ответа. Можно предположить, что уровни TGF-β и IL17A в грудном молоке
определяют прогноз развития пищевой сенсибилизации и
возникновения аллергической патологии у детей. С некоторой долей вероятности это
подтверждается данными
Наблюдение
клинического исследования
за детьми в
за детьми от
этих матерей.
течение 6 месяцев показали, что у детей от женщин с
аллергией, первые проявления на коже в виде гиперемии, участков экссудации отмечались
у 13 (46,4%) на 1-3-ем месяце жизни, а у 7 (28,6%) – с3-х до 6 месяцев. Во второй группе
– первые аллергические проявления на коже наблюдались у 4 (22,2%) детей. Проведенное
исследование подтверждает, что наследственная предрасположенность к атопии является
высоким фактором риска развития аллергических заболеваний у ребенка. Среди других
факторов, способствующих развитию аллергической патологии у новорожденного
ребенка, следует указать на низкие значения SIgA, TGF-β и высокие IL-17A в грудном
молоке кормящих женщин.
Таким образом, в силу особенностей иммунной системы ребенка раннего возраста
основные защитные функции выполняют пассивно приобретенные сывороточные и
секреторные антитела. Основными сывороточными антителами являются IgG матери,
часть из которых переходит из грудного молока в кровоток ребенка из кишечника. В
регуляции
иммунного
ответа
у
новорожденного
ребенка
участвуют
противовоспалительные и провоспалительные цитокины.
Контроль над эффектами
провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-ά,
IFN-γ, IFN-β) выполняют
противовоспалительные цитокины (IL-4, IL-10, IL-13, TNF-β). Они способны подавлять
транскрипцию генов провоспалительных цитокинов в клетках-продуцентах, индуцировать
синтез рецепторных антагонистов интерлейкинов и усиливать образование растворимых
рецепторов.
В разных
ситуациях
некоторые цитокины способны осуществлять
противоположные эффекты, что свидетельствует о широком спектре их физиологических
функций.
Для подавления гиперчувствительных (аллергических) реакций на пищевые
антигены,
попадающие
толерантность. Она
в
желудочно-кишечный
тракт,
существует
оральная
индуцируется иммунной системой слизистой кишечника против
10
пищевых антигенов, и препятствует развитию у большинства людей пищевой аллергии.
Оральная толерантность сопровождается появлением функционально активных Трегуляторных клеток с фенотипом CD4+CD25+, которые способны продуцировать
регуляторные иммуносупрессивные цитокины - TGF-β и IL-10. Считается, что
иммуносупрессия
механизмом,
посредством
поддерживающим
способствующих
формированию
Т-регуляторных
оральную
оральной
клеток,
может
толерантность.
толерантности,
быть
Среди
главным
цитокинов,
наибольшее
внимание
привлекает TGF–β. Значительные количества TGF–β обнаруживаются в кишечнике в
норме. Он синтезируется гемопоэтическими и эпителиальными клетками, важен в
регуляции эпителиального гомеостаза и синтеза в B–клетках IgM и IgA, TGF–β и IL–12,
IFN–γ играет
противоположную
роль в иммунной регуляции в кишечнике и имеет
решающее значение в индукции слизистого иммунного ответа и толерантности
Недостаточное количество TGF-β в грудном молоке матерей с аллергией подтверждает
факт нарушения формирования оральной толерантности у рожденных детей.
Для формирования оральной толерантности необходимо также и множество
клеточных субпопуляций. Возможными кандидатами на данную роль являются CD4+ и
CD8+ Т–клетки. Большинство исследователей считают, что CD4+ T–клетки обязательны
для развития оральной толерантности. Особую роль среди CD4+ T–клеток в индукции
оральной
толерантности
отводят
регуляторной
субпопуляции
Th3.
Эти
клетки
располагаются внутри Пейровых бляшек и способствуют толерантности, прежде всего
путем секреции TGF–β и, в меньшей степени, IL–10 и IL–4..
Нарушение формирования оральной толерантности, приводящий к пищевой
аллергии, тесно связано с состоянием местного противомикробного иммунитета,
качественным и количественным состоянием микробиоты. За противомикробный
иммунитет
ответственны
Th17- клетки, дифференцирующиеся, как FoxP3+Тreg, из
антиген-стимулированных наивных CD4+ в собственной пластинке слизистой оболочке в
присутствии TGF-β, IL-1, IL-6, IL-23 которые активирует фактор транскрипции RORγt.
Весьма любопытным является тот факт, что антиген-стимулированные Т-клетки в
естественных условиях могут нести на себе и FoxP3+ и RORγt, таким образом, выполняя
и защитную и регуляторную функцию одновременно. Роль Th17 – клеток состоит в
обеспечении иммунных реакций против внеклеточных патогенов, за счет продукции
семейства IL-17, которые ответственны за привлечение нейтрофилов в очаг воспаления.
IL-17-мощный посредник в реакции замедленного типа за счет увеличения
производства хемокинов в различных тканях, миграции моноцитов и нейтрофилов к месту
воспаления, аналогично INF-γ. Функции IL-17 разнообразны, он активирует и подавляет
11
продукцию
различных
факторов
эпителиальными,
эндотелиальными
и
гладкомышечными клетками, фибробластами, нейтрофилами, дендритными клетками,
макрофагами
и
кератиноцитами.
Семейство
IL-17
функционирует
как
противовоспалительные цитокины, реагирующие на вторжение в иммунную систему
внеклеточных патогенов и индуцирующих
разрушение
патогена.
Они действуют
синергически с TGF-β и IL-1.
Таким образом, проведенные исследования показали, что в грудном молоке
матерей с аллергией выявлялись низкие значения sIgA, трансформирующего ростового
фактора бета (TGF-β), высокие уровни IL-17A (P<0,05) по сравнению с группой матерей
без аллергии. Концентрации IL-2 в грудном молоке матерей в обеих групп достоверно не
отличались. Наблюдение за детьми в течение 6 месяцев показали, что у 75% детей от
матерей с аллергией имели кожные проявления аллергии, против 22.2% детей от матерей
без аллергии. Данные показатели можно рассматривать как прогностический тест для
развития пищевой аллергии у детей.
3.2 Сведения о патентовании: нет
3.3 Степень готовности разработки к внедрению: научно-исследовательская разработка
может быть внедрена в практику лечебно-профилактических учреждений, центров
здоровья,
диетологических
кабинетов
лечебно-профилактических
учреждений
в
Российской Федерации в виде методических указаний по определению. определения
цитокинов и sIgA в грудном молоке матери для прогноза развития пищевой аллергии у
детей
3.4 Область применения разработки:
- здравоохранение: педиатрия; внутренние болезни, диетология, гастроэнтерология,
аллергология, иммунология, терапия, обучение студентов высших медицинских учебных
заведений, курсантов сертификационных и тематических циклов усовершенствования и
специализации врачей по диетологии и нутрициологии.
3.5. Где реализовано в практике: клиника ФГБНУ «НИИ питания», кафедра диетологии
и нутрициологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного
образования» Минздрава России, кафедра диетологии и нутрициологии ГБОУ ВПО
«Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.
Пирогова» Минздрава России.
12
4.Заключение
Описанный способ опробован при обследовании
44 корящих женщин и
наблюдения за их детьми с момента рождения до 6 месячного возраста. В грудном молоке
матерей с аллергией выявлялись низкие значения sIgA, трансформирующего ростового
фактора бета (TGF-β), высокие уровни IL-17A (P<0,05) по сравнению с группой матерей
без аллергии. Концентрации IL-2 в грудном молоке матерей в обеих групп достоверно не
отличались. В ходе наблюдения было установлено, что у 75% детей от матерей с
аллергией имели кожные проявления аллергии, против 22.2% детей от матерей без
аллергии.
Данные
показатели можно рассматривать как прогностический тест для
развития пищевой аллергии у детей.
Исследование проводилось
на базе
отделения аллергологии, лаборатории
клинической биохимии, иммунологии и аллергологии ФГБНУ «НИИ питания» с
использованием иммуноферментного метода (ИФА) с
применением коммерческих
наборов BioSource International Inc., Бельгия.
Предложенный способ прогноза развития пищевой аллергии у детей позволяет
внедрить систему ранней профилактической диетотерапии и добиться значительного
уменьшения клинических
проявлений заболевания, снижению эффективных
доз
лекарственных препаратов, повышению качества жизни больных.
13
Литература.
1.
Ким Флейшер Микаэльсон. Грудное вскармливание. В кн. Практические
аспекты педиатрической диетологии. Под ред. Б. Колецко. 2008, с.92-97
2.
Фатеева Е.М. История организации вскармливания детей первого года
жизни. Биотехнология, 2012, №1, с.21-26
3.
Lawrence RA, Lawrence RM: Breastfeeding: A Guide for the Medical
Profession, ed 6. St. Louis, Mosby,2005
4.
5.
Oddy WH, Halonen M, Martinez FD, et al. TGF- β in human milk is associated
with wheezing in infancy. J Allergy Clin Immunol. 2003; 112. (4): 723-728
Kramer MS, Kakuma R: The optimal duration of exclusive breastfeeding: a
systematic revive. Adv Exp Med Biol 2004; 554; 63-77
6.
Черешнев В.А., Шмагель К.В. Иммунология.. – М.: Издательский Дом
«Магистр-ПРЕСС», 2013. – 448 с.
14