Давиденко Елена Борисовна Прогнозирование характера течения Аутоиммунной пузырчатки
реклама
На правах рукописи Давиденко Елена Борисовна Прогнозирование характера течения Аутоиммунной пузырчатки С применением клинических и иммуногистохимических Методов исследования 14.01.10 - кожные и венерические болезни 14.03.09 – клиническая иммунология и аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского» и лаборатории трансплантационной иммунологии ФГБУ «Федерального научного центра трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители: Доктор медицинских наук Доктор медицинских наук, профессор Махнева Наталия Викторовна Белецкая Людмила Вячеславовна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры дерматовенерологии и косметологии ФГБОУ ДПО «ИПКФМБА» России Матушевская Елена Владиславовна Доктор медицинских наук, профессор главный эксперт «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения РФ Авдеева Жанна Ильдаровна Ведущая организация: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва Защита состоится « » сентября 2013 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.115.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии». 107076 г. Москва, ул. Короленко, д.3, стр.6 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России. Автореферат разослан «…..» сентября 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук 2 Карамова Арфеня Эдуардовна АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Пузырчатка – это группа аутоиммунных буллезных дерматозов кожи и слизистых оболочек, где этиопатогенетическая роль принадлежит циркулирующим аутоантителам, направленным против антигенов системы десмосомального аппарата (межклеточной субстанции) многослойного плоского эпителия. Заболевание встречается на всех континентах мира. При этом формы заболевания варьируют в разных странах. Так, вульгарная пузырчатка наиболее часто встречается в Европе и США и поражает лиц еврейской национальности и других народов стран региона Средиземного и Японского морей. Листовидная пузырчатка встречается часто в некоторых областях слаборазвитых стран, где поражено около 3% популяции [Aboobaker J. et al., 2001; Amagai M., 2002; Warren S.J.P. et al., 2000]. Обнаружение на популяционном уровне сочетание пузырчатки с особым HLA гаплотипом подтверждает генетическую предрасположенность организма к этому заболеванию [Gazit E., Loewenthal R., 2005; Tong J.C. et al., 2006; Tron F. et al., 2005]. Тем не менее, наличие только определенных гаплотипов HLA II класса недостаточно для развития данной аутоиммунной патологии. Необходимы дополнительные факторы, способствующие развитию патологического процесса. Сочетание генетической предрасположенности с неблагоприятным влиянием факторов внешней среды стимулируют пролиферацию, дифференцировку В- лимфоцитов и продукцию аутоантител [Kavala M. et al., 2007]. Об этом свидетельствуют и данные иммунопатологического исследования. Несмотря на клинически регистрируемую эффективность проводимой терапии, наличие специфических фиксированных иммуноглобулинов как в нерастворимой, так и растворимой формах и ранних компонентов комплемента в тканевых структурах кожи свидетельствует о происходящих процессах в организме человека латентно. В таких случаях под действием «дополнительных» патогенных факторов возможно возникновение обострения болезни [Махнева Н.В., Белецкая Л.В., 2009]. Это и требует постоянного приема поддерживающих доз глюкокортикостероидов, а порой дополнительного назначения препаратов цитостатического действия (азатиоприн, метотрексат). Все воз- 3 можные факторы влияния на течение болезни следует выявлять и учитывать в повседневной жизни больного. Сведений об исследовании эпидемиологии аутоиммунной пузырчатки и изучения факторов дополнительного влияния на заболевание в отечественной литературе мало, что свидетельствует о необходимости проведения подобных научных изысканий. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью исследования является разработка дополнительных способов прогнозирования характера течения аутоиммунной пузырчатки с помощью выявления антител к антигенам системы десмосомального аппарата эпидермиса и иммуноморфологического метода исследования биоптатов кожи больных при сопоставлении полученных результатов с клинико- морфологическими наблюдениями. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучить частоту выявления циркулирующих субклассов имму- ноглобулина G и С3 компонента комплемента в сыворотке крови больных аутоиммунной пузырчатки в периоды активности болезни и ее ремиссии. 2. Изучить влияние триггерных факторов на развитие аутоиммун- ной пузырчатки. 3. Исследовать особенности локализации антигенов-мишеней для субклассов иммуноглобулина G и С3 компонента комплемента при аутоиммунной пузырчатке. 4. Изучить особенности течения аутоиммунной пузырчатки в зави- симости от характера отложения иммунных комплексов в межклеточных пространствах эпидермиса. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Продемонстрирована поликлональность гуморального ответа и хро- ническая антигенная стимуляция с участием системы комплемента при аутоиммунной пузырчатке. 2. Выявлено влияние дополнительных не менее двух провоцирующих факторов, среди которых присутствует психо-эмоциональное перенапряжение, на развитие и клинико-морфологические особенности аутоиммунной пузырчатки. 4 3. Установлен факт корреляции торпидного течения аутоиммунной пу- зырчатки с гранулярной фиксацией IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса на высоком уровне статистической значимости. 4. Предложен метод прогнозирования характера течения аутоиммунной пузырчатки, основанный на анализе иммуноморфологической картины фиксации IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса. НАУЧНАЯ НОВИЗНА • Выяснена роль субклассов иммуноглобулина G в развитии аутоим- мунной пузырчатки. • Впервые детально изучено влияние внешних факторов на характер течения аутоиммунной пузырчатки. • Дано научное обоснование способа прогнозирования течения ауто- иммунной пузырчатки, базирующегося на выявлении гранулярных отложений иммунных комплексов в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ • Проведение иммуногистохимических исследований для получения дополнительных сведений о патологических процессах, происходящих при аутоиммунной пузырчатке, позволяет определить характер течения болезни и подобрать патогенетически обоснованные методы терапии. • Разработан способ прогнозирования течения аутоиммунной пузырчатки на основе оценки характера отложений иммунных комплексов в межклеточных пространствах эпидермиса, что может быть использовано для оптимизации лечения больных аутоиммунной пузырчаткой с учетом характера течения заболевания. ВНЕДРЕНИЕ РАБОТЫ Результаты работы внедрены в практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, кафедры дерматовенерологии и дерматовенерологии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, ГБУЗ МО «Московский Областной Клинический Кожно-Венерологический Диспансер», ГАУЗ МО «Королёвский Кожновенерологический диспансер». 5 АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Диссертация апробирована на научной конференции сотрудников отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии, кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, лаборатории иммуногистохимии ФГБУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова» (21 июня 2013 г.). Материалы диссертации доложены на XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, 2010 г.); IV Мировом форуме по астме и хронической обструктивной болезни легких и XVI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Париж, 2011 г.); 2-ом Конгрессе Евро-азиатской ассоциации дерматовенерологов (Москва, 2012 г.); V Мировом форуме по астме и хронической обструктивной болезни легких и XVII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Нью-Йорк, 2012 г.); II Московском Форуме Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики (Москва, 2012 г.); VI Международном форуме дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2013 г.) VI Мировом форуме по астме и хронической обструктивной болезни легких и XVIII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Лондон, 2013 г.); конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» (Москва, 2013 г.). ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 8 в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий …», рекомендуемых ВАК Российской Федерации, 1 методические рекомендации и 1 патент на изобретение. СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов. Работа иллюстрирована 145 таблицами и рисунками, заключающими в себе 71 фотографию и 30 микрофотографий. Библиографический указатель включает 35 отечественных и 188 иностранных источников. 6 ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА Настоящее исследование выполнено на основании анализа результатов ретроспективного и проспективного обследования 57 больных различными формами аутоиммунной пузырчатки в разные периоды развития заболевания. Все научные положения работы, выводы и рекомендации обоснованы и вытекают из анализа клинических и объективных данных. Все результаты, используемые в работе, получены автором лично. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа выполнена на основании изучения анамнеза, клинического обследования, исследования биопсийного материала и сывороток крови 57 больных аутоиммунной пузырчаткой в разные периоды ее развития. Из них 45 больных страдали вульгарной пузырчаткой, 2 - вегетирующей пузырчаткой, 7 - себорейной пузырчаткой, 2 - листовидной пузырчаткой, 1 – герпетиформной пузырчаткой. При этом у 34 пациентов аутоиммунная пузырчатка диагностирована впервые, у 13 наблюдается обострение заболевания, у 10 других - стадия клинической ремиссии. Обследование больных проведено в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского» (ГБУЗ МО МОНИКИ имени М.Ф. Владимирского), в ГБУЗ МО «Московский областной клинический кожновенерологический диспансер» (МОККВД). Изучение биоптатов кожи и сывороток крови больных проведено на базе ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И.Шумакова» (ФГБУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова). В качестве сравнения использованы биоптаты кожи и сыворотки крови больных другими болезнями кожи (буллезный пемфигоид Левера – 8 человек, доброкачественная семейная пузырчатка Гужеро Хейли-Хейли - 5 человек, многоформная экссудативная эритема – 2 человека, дерматит Дюринга – 1 человек, буллезная форма токсидермии – 1 человек) и биообразцы практически здоровых лиц (3 человека). В каждом случае диагноз заболевания установлен на основании изучения жалоб, анамнеза, клинических проявлений, морфологической картины 7 кожи больных, результатов цитологического, патоморфологического, иммунологического и иммуноморфологического методов исследований. Цитологическое и патоморфологическое исследования проведено в лаборатории ГБУЗ МО МОККВД и в отделении патоморфологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, соответственно. Иммунологические и иммуноморфологические исследования проведены лично автором на базе лаборатории трансплантационной иммунологии ФГБУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова». Первичная обработка биопсийного материала. Под местной анестезией 2% раствором новокаина проведена биопсия кожи (из клинически непораженных участков) размером 0,3х0,5 см. Кусочки тканей кожи заморожены при минус 20°С. Срезы толщиной 5 мкм приготовлены в микротом-криостате (минус 20°С). Часть серийных срезов использованы в нефиксированном виде, часть серийных срезов предварительно обрабатаны 40% водной смесью этанола. Криостатные серийные срезы, фиксированные 96° этанолом, окрашены гематоксилином и эозином с целью морфологического контроля. Метод выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов) и полных иммунных комплексов. Применяли классический прямой метод иммунофлюоресценции [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1997; Beutner E., Chorzelski T.P., 1973] с использованием моноспецифических люминесцирующих сывороток против основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. М.Ф.Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва), люминесцирующих сывороток против С3 компонента комплемента (CHEMICON, Австралия) и фибриноген/фибрина (DAKO CYTOMATION, Дания). Дополнительно использовали моноклональные антитела (МкАТ) к субклассам иммуноглобулина класса G (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) (SIGMA-ALDRICH, USA). Серийные криостатные срезы помещали на предметное стекло, подсушивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывали сменяемым физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВS), рН 7,0-7,4, в течение 3-5 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывали люминесцирующей сывороткой (метка изо8 тиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов классов G, М, А, С3компонента комплемента и фибриноген/фибрина в течение 30 мин. Затем вновь промывали РВS, pH 7,0-7,4, в течение 3-5 мин и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляли кристаллик пара-фенилендиамина [Лейси А., 1992]. Для контроля одновременно проводили изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, в световом микроскопе. В случаях обнаружения IgG в межклеточных пространствах эпидермиса дополнительно исследованы серийные криостатные срезы кожи этих пациентов с использованием антител к субклассам IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) классическим прямым методом иммунофлюоресценции, описанным выше. Модифицированный прямой метод иммунофлюоресценции. Модифицированный метод диагностики пузырчатки используется с целью выявления растворимых иммунных комплексов [Белецкая Л.В., Махнева Н.В., 1995; Махнева Н.В., 1997]. Криостатные срезы предварительно обрабатывали стабилизирующим раствором 40% этанола в течение 1 минуты. Исходный 96° этанол принимали за 100%. После освобождения срезов от водной смеси этого органического растворителя подсушиванием при комнатной температуре промывали в сменяемом РВS, рН 7,0-7,4, в течение 5 минут. Далее партии срезов обработаны аналогично классическому прямому методу иммунофлюоресценции, описанному выше. В случае обнаружения растворимых иммунных комплексов, содержащих IgG, в межклеточных пространствах эпидермиса, серийные криостатные срезы этих пациентов дополнительно исследованы с использованием моноклональных антител к субклассам IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) модифицированным прямым методом иммунофлюоресценции, описанным выше. Метод выявления циркулирующих аутоантител. С целью выявления циркулирующих аутоантител применяли непрямой метод иммунофлюоресценции в принятой форме [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1997; Beutner E.H., Jordon R.E., 1964] с использованием люминесцирующих сывороток 9 против IgG (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. М.Ф.Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва) и С3 компонента комплемента (CHEMICON, Австралия). Дополнительно использованы моноклональные антитела (МкАТ) к субклассам иммуноглобулина класса G (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) (SIGMAALDRICH, USA). Поскольку аутоантитела при аутоиммунной пузырчатке направлены к тканеспецифическим антигенам, перекрестно реагирующими с аналогичными антигенами тканей большинства млекопитающих [Koch H., Schaller J. et al, 1992], в качестве субстрата использованы криостатные срезы кожи теленка. Криостатные нефиксированные срезы толщиной 5 мкм подсушивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем тщательно промывали в сменяемом растворе PBS, рН 7,0-7,4, в течение 10 минут. В последующем срезы обрабатывали исследуемой (первичной) немеченой сывороткой больного (сыворотку применяли в максимально большом числе разведений) во влажной камере при комнатной температуре в течение 45-60 мин. Далее срезы вновь промывали PBS, pH 7,0-7,4, в течение 10 минут и обрабатывали меченой сывороткой против иммуноглобулина человека класса G и С3 компонента комплемента в течение 30 минут с последующей промывкой PBS, pH 7,0-7,4, в течение 10 минут. Обработанные срезы заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляли кристаллик пара-фенилендиамина [Лейси А., 1992]. Учитывали самое большое разведение сыворотки, которое давало четкую положительную реакцию. Одновременно проводили контрольные исследования. В качестве отрицательного контроля использована нормальная сыворотка человека в тех же разведениях и инкубировали на срезе столько же времени, как и испытуемую сыворотку, содержащую антитела. В качестве положительного контроля использовали известную сыворотку больного, содержащую антитела против изучаемого антигена. В случае выявления циркулирующих IgG-аутоантител, сыворотки этих пациентов были исследованы с использованием моноклональных антител к 10 субклассам IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) человека непрямым методом иммунофлюоресценции, описанным выше. В качестве субстрата также использованы серийные срезы кожи теленка. Статистическая обработка. Все цифровые данные обрабатывались на персональном компьютере с использованием программ Microsoft Office Excel 2003, «БИОСТАТ», «Statistica 6.0 for Windows». Результаты представлены в абсолютных значениях и относительных частотах. В ходе работы были составлены таблицы сопряжения (частотные таблицы), результаты которых обрабатывали с помощью статистического анализа категорированных данных. Расчёты выполняли с помощью статистического пакета R, применяли критерий Хи-квадрат с расчётом уровня значимости методом Монте-Карло. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Среди наших больных чаще зарегистрированы женщины в возрасте 5060 и 70-80 лет (по 26,1%) и мужчины в возрасте 70-80 лет (54,5%). Частой формой проявления аутоиммунной пузырчатки у обоих полов является вульгарная пузырчатка (рис. 1). При этом женщины страдают данной формой пузырчатки чаще, чем мужчины в соотношение 2,4:1. Для последних наиболее характерны проявления пузырчатки в виде себорейной формы, соотношение мужчин и женщин составляет 1,7:1. a b Рисунок 1. Распределение клинических форм аутоиммунной пузырчатки среди обследуемых больных мужского и женского полов: a – больные мужского пола; b – больные женского пола. Для уточнения и подтверждения клинического диагноза у больных с впервые выявленным заболеванием использованы клинический (симптом 11 Никольского), цитологический, гистологический, иммунологический и иммуногистохимический методы исследования. У 34 больных с впервые выявленным заболеванием симптом Никольского как краевой, так и прямой выявлен в 58,8% и 5,9% случаях соответственно. Одновременно все четыре основных лабораторно-диагностических признака, характерных для пузырчатки: наличие акантолитических клеток, микроскопических внутриэпидермальных пузырей, обнаружение аутоантител непрямым и прямым методами иммунофлюоресценции, выявлены только у 14,7% обследованных больных. В 44,1% других случаях одновременно обнаружены только циркулирующие и фиксированные IgG - аутоантитела. Результаты последних двух методов являются решающими в постановке диагноза аутоиммунная пузырчатка. Обострение заболевания на фоне снижения дозы глюкокортикостероида до поддерживающей его дозы по нашим данным возникает спустя 3 года (3,15±2,65 года). Доза глюкокортикостероидов (преднизолон и/или метипред) при этом носит индивидуальный характер и составляет от 1 до 9 таблеток преднизолона в сутки per os. Клиническая картина аутоиммунной пузырчатки в стадии активного процесса (периоды начала развития и обострения иммунопатологического процесса) представлена преимущественно вторичными морфологическими элементами в виде обширных эрозивных поверхностей и геморрагическими и/или серозно-гнойными корками. Первичные морфологические элементы в виде пузырей с вялой покрышкой и серозным содержимым обнаружены у 44,1% больных с впервые выявленным заболеванием и у 53,8% больных с обострением пузырчатки. Продолжительность клинической ремиссии аутоиммунной пузырчатки по данным исследования варьирует от полугода до 8 лет (в среднем 3,15±2,5 года). При этом поддерживающая доза глюкокортикостероидов составляет от 5 до 20 мг/сутки per os в перерасчете на преднизолон. Клиническая картина пузырчатки в стадии ее клинической ремиссии представлена вторичными морфологическими элементами в виде гиперпигментированных пятен на месте разрешившихся высыпаний. При этом кожа у больных истончена, отмечается повышенная хрупкость кожного покрова, неустойчивость ее к меха12 ническим повреждениям и длительное заживление ран с формированием рубцов. Возникновению и дальнейшему обострению аутоиммунной пузырчатки способствуют не менее двух, чаще 3 и более, провоцирующих факторов, среди которых по нашим данным в 100% случаях присутствует сильное и длительное психо-эмоциональное перенапряжение. Другими дополнительными патогенетическими факторами являются лекарственные препараты, избыточная инсоляция, контакт с различными химическими веществами, вирусные инфекции (вирус простого герпеса, вирус Эпштейн-Барра, цитомегаловирус), гормональные нарушения, злоупотребление алкоголем, воздействие ионизирующего излучения. Кроме того, обострению заболевания способствует и нерациональное быстрое снижение дозы глюкокортикостероида, в частности от 100 до 10 мг/сутки per os в течение 4-6 месяцев или полной его отмены. Основные факторы, способствующие развитию и прогрессированию аутоиммунной пузырчатки, представлены на рисунке 2. Рисунок 2. Основные патогенетические факторы при аутоиммунной пузырчатке. Среди лекарственных препаратов стоит выделить препараты, содержащие тиоловую группу, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) – 14% случаев (производные уксусной кислоты – 5,2%, салицилаты – 8,8%), гипотензивные препараты – 40,3% (ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента – 35,1%, β-адреноблокаторы – 5,2%) и антибиотики группы β-лактамов – 26,3% (цефалоспорины - 17,5%, пенициллины – 5,3% или их сочетание – 3,5%). При этом первичному развитию заболевания способствует длительный (от 2 до 10 лет) и/или частый прием (от 1 раза в 2 месяца до 2-3 раз в месяц в течение более 5 лет) НПВП, антибиотиков, а также 13 наличие простудных инфекций (ОРЗ, ОРВИ, грипп), по поводу которых пациенты также принимали препараты группы салицилатов. Прием гипотензивных препаратов способствует развитию и обострению патологического процесса в 41,2% и 46,1% случаях соответственно. Отмечено, что лекарственные препараты участвуют преимущественно в развитии вульгарной и вегетирующей пузырчатки, а инсоляция – себорейной и листовидной пузырчатки. При этом отрицательное воздействие инсоляции проявляется у пациентов как с впервые выявленным заболеванием (32,3%), так и с обострением иммунопатологического процесса (46,1%). Комплексное клинико-лабораторное обследование больных демонстрирует наличие сопутствующей соматической патологии - заболевания сердечно-сосудистой системы (63,9%), эндокринопатии (40,4%), заболевания желудочно-кишечного тракта и печени (57,5%). Реже у больных аутоиммунной пузырчаткой наблюдаются неврологические расстройства (14,9%), изменения мочевыделительной системы (11,7%) и патология органов зрения (19,1%). У 3,5% больных в разные стадии развития аутоиммунная пузырчатка протекала на фоне паранеоплазии. Необходимо отметить, что комплексное общесоматическое лечение в условиях стационара и дальнейшее грамотное амбулаторное ведение пациента совместно со смежными специалистами позволяет достичь длительную клиническую ремиссию со стороны не только аутоиммунной пузырчатки, но и сопутствующих заболеваний. При изучении роли аутоантител, относящихся к IgG и его субклассам, в развитии и течении аутоиммунной пузырчатки с помощью непрямого метода иммунофлюоресценции специфические IgG-аутоантитела выявлены в 80,5% случаях. При этом наиболее часто циркулирующие IgG-аутоантитела выявлены в активный период аутоиммунного процесса - начало развития (83,3%) и обострение (87,5%) болезни. Наиболее высокие титры (до 1:2560) аутоантител отмечены в период обострения заболевания. При впервые выявленном заболевании максимальный уровень титров аутоантител составляет 1:1280. В стадии клинической ремиссии болезни циркулирующие аутоантитела обнаружены в 70% случаях с максимальным значением уровня их титра 1:320. 14 При изучении субклассовой характеристики циркулирующих IgGаутоантител в сыворотке крови больных выявлено, что у всех (100%) больных независимо от клинической формы и стадии развития пузырчатки присутствуют IgG2-аутоантитела и в 86,2% случаях - IgG4-аутоантитела. IgG1- и IgG3-аутоантитела выявляются в 60,1% и 41,4% случаев соответственно. Наиболее выраженная иммунофлюоресцентная реакция (оценивалась по интенсивности свечения) выявлена с IgG4- и/или IgG1-аутоантителами, что еще раз подтверждает их основную патогенетическую роль в развитии и течении аутоиммунной пузырчатки. При этом оба указанных субкласса присутствуют на протяжении всего периода развития болезни, что может свидетельствовать об их ключевой роли в патогенезе заболевания. Об этом свидетельствует наличие циркулирующих аутоантител в сыворотке больных пузырчаткой в стадии ее клинической ремиссии с доминирующими (71,4%) IgG4аутоантителами. Следует отметить, что IgG4-аутоантитела являются доминирующим субклассом на всем протяжении развития заболевания с наибольшей активностью в стадии обострения (100%). Напротив, IgG1аутоантитела проявляют наибольшую активность при впервые выявленной патологии (75%). При дальнейшем развитии аутоиммунной пузырчатки роль IgG1-аутоантител снижается – 57,1% в стадии обострения и 28,6% в стадии клинической ремиссии. Фиксированный IgG в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса в клинически интактных участках кожи больных обнаружен в 94,4% случаях. При этом во всех (100%) случаях его фиксация выявлена в период активного патологического процесса и в 66,7% случаях - в стадии клинической ремиссии болезни. Отмечен интересный факт разнообразия иммуноморфологической картины характера фиксации IgG. Это сетевидное отложение, в виде «пунктира», «гранул» или, как правило, их сочетание во всевозможных комбинациях. Вероятно, характер фиксации IgG связан с наличием различных антигенов-мишеней для аутоантител и их особым расположением в десмосоме. Под действием дополнительных патогенетических факторов мишенью для аутоантител могут быть одна или несколько антигенных детерминант десмосомы. Отличные друг от друга иммуноморфлогические кар15 тины характера фиксации IgG отражают особенности течения болезни. При сопоставлении иммуноморфологической картины фиксации IgG в межклеточных пространствах эпидермиса с особенностями течения заболевания, выявлено, что благоприятное течение заболевания, при котором достигается положительный клинический эффект только препаратами глюкокортикостероидного ряда, сопровождается расположением фиксированных IgG в виде «сеточки». Торпидное течение заболевания - фиксацией IgG в виде гранул в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса (X-squared = 21.3333 при p = 0,001499). Безусловно, дальнейшее изучение патогенеза аутоиммунной пузырчатки с использованием иммуногистохимических методов исследований должно способствовать идентификации природы антигенных детерминант, как мишеней при различных формах локализации фиксированного IgG. На рисунке 3 представлены данные о характере фиксации иммуноглобулина в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса у больных с разным течением аутоиммунной пузырчатки. Рисунок 3. Характер фиксации IgG у больных с различным характером течения аутоиммунной пузырчатки. Изучение субклассовой характеристики фиксированного в тканях IgG демонстрирует, что независимо от клинической формы и стадии развития аутоиммунной пузырчатки доминирующими являются фиксированные IgG4 (94,1%) и IgG1 (64,7%). Фиксированный IgG2 в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса обнаружен в 19,6% случаях. Фиксации IgG3 в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса не выявлено ни в одном из исследуемых случаях. При этом отмечено, что на фоне высокой частоты выявления фиксированного IgG4 в течение всего периода развития аутоиммун16 ной пузырчатки происходит снижение частоты обнаружения фиксированного IgG1 – при первоначальном развитии заболевания - 92,8%, при обострении 50%, в период клинической ремиссии - 12,5%. Полученные данные иммуноморфологического исследования, подтверждая основную роль субклассов IgG1 и IgG4 в патогенезе аутоиммунной пузырчатки, наводят на мысль о возможном «переключении» синтеза субклассов IgG: с IgG1 на IgG4. Клинически это может проявляться переходом активной стадии процесса в стадию клинической ремиссии болезни. Общая картина распределения циркулирующих и фиксированных IgG и его субклассов в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса в разные периоды развития аутоиммунной пузырчатки представлена на рисунке 4. Рисунок 4. Распределение циркулирующих и фиксированных IgG и их субклассов в разные периоды развития аутоиммунной пузырчатки. Особый интерес в изучении патогенеза аутоиммунной пузырчатки представляет собой определение антигенов-мишеней для IgG и его субклассов. Так, для циркулирующих IgG-аутоантител во всех (100%) случаях независимо от формы и стадии развития заболевания мишенью является межклеточная связывающая субстанция базального слоя с одновременным вовлечением в иммунопатологический процесс антигенов межклеточной связывающей субстанции шиповатого (86,7%) и зернистого (58,6%) слоев эпидермиса. При этом для циркулирующих IgG1-, IgG3- и IgG4-аутоантител в большин17 стве случаев (94,5%, 91,7% и 100% случаев соответственно) антигенамимишенями является межклеточная связывающая субстанция базального и шиповатого слоев эпидермиса и реже – межклеточная связывающая субстанция зернистого слоя эпидермиса для циркулирующих IgG1- и IgG4-антител (11,8% и 20% соответственно). Для IgG2-аутоантител во всех случаях (100%) мишенью служит межклеточная связывающая субстанция зернистого слоя эпидермиса, реже (27,6%) - межклеточная связывающая субстанция базального и шиповатого слоев эпидермиса. В процессе исследования отмечено, что IgG2- и IgG4-аутоантитела имеют более широкий спектр антигенов-мишеней, способный изменяться на протяжении всего периода болезни, в зависимости от стадии ее развития и проводимой терапии. При изучении антигенов-мишеней для IgG-аутоантител пузырчатки в стадии ее клинической ремиссии выявлен факт наличия мишени в межклеточной связывающей субстанция базального слоя эпидермиса и эпителия волосяных фолликулов. В ряде случаев (28,6%) дополнительно мишенью служит и межклеточная связывающая субстанции шиповатого слоя, но с более выраженной иммунологической реакцией в межклеточной связывающей субстанции базального слоя эпидермиса. Подобные исследования [Grob P.J., Inderbitzin T. M., 1967; Inderbitzin T.M., Grob P.J., 1968] и наши наблюдения наводят на мысль о возможно существующей ключевой роли десомосомального аппарата базального слоя эпидермиса в развитии аутоиммунной пузырчатки. Детальное изучение на молекулярно-биологическом уровне данной структуры ткани позволит приблизиться к пониманию глубины механизмов развития данного буллезного дерматоза, тем самым обеспечивая условия для разработки новых патогенетически обоснованных терапевтических подходов. При изучении биоптатов клинически интактных участков кожи больных прямым методом иммунофлюоресценции продемонстрировано, что независимо от клинической формы и стадии развития аутоиммунной пузырчатки в большинстве случаев (97,8%) фиксированный IgG обнаруживается в межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев 18 эпидермиса. В ряде случаев - в межклеточной связывающей субстанции зернистого слоя (28%) и зоне базальной мембраны эпидермиса (6%). При этом межклеточная связывающая субстанция базального и шиповатого слоев эпидермиса является мишенью для фиксированных IgG1, IgG2, IgG4 (в 90,1%, 80% и 68,75% соответственно) без участия IgG3. Локализация антигеновмишеней для IgG и его субклассов представлена на рисунке 5. a b Рисунок 5. Локализация антигенов-мишеней для IgG и его субклассов в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса и базальной мембране эпидермиса. a – циркулирующие IgG-аутоантитела и его субклассы; b – фиксированный IgG и его субклассы. Участие системы компонентов комплемента в развитии аутоиммунной пузырчатки вызывает до настоящего времени немало споров среди исследователей [Кawana S., Geoghegan W.D. et al, 1985; Kotnik V., 2011; Lessey E., Li 19 N. et al, 2008]. По нашим данным циркулирующий С3 компонент комплемента присутствует одновременно с циркулирующими IgG-аутоантителами независимо от клинической формы и стадии развития болезни в низких титрах – 1:5. Мишенью является межклеточная связывающая субстанция зернистого слоя, что совпадает с локализацией циркулирующих IgG2-аутоантител. Это свидетельствует о связи комплемента с неполным иммунным комплексом (антиген-антитело) и его участии в качестве дополнительного фактора, в частности при переходе одной клинической формы пузырчатки в другую [Махнева Н.В., Белецкая Л.В., 2012]. Кроме того, преобладание IgG2/IgG4антител свидетельствует о хронической антигенной стимуляции с участием системы комплемента, активируемым классическим путем. При исследовании биоптатов клинически интактных участков кожи больных аутоиммунной пузырчаткой фиксация С3 компонента комплемента выявлена в 79,6% случаях независимо от клинической формы и стадии развития болезни. При этом антигеном-мишенью в большинстве случаев (72,1%) являются компоненты межклеточной связывающей субстанции базального слоя эпидермиса с одновременным вовлечением в процесс межклеточной связывающей субстанции шиповатого слоя (65,6%) и зоны базальной мембраны эпидермиса (34,4%). В ряде случаев (25,6%) наблюдается изолированная фиксация С3 компонента комплемента только в зоне базальной мембраны эпидермиса, что свидетельствует об участии системы комплемента не только в специфической защите организма в месте локализации антигена-мишени, но и о его распространении на все возможные тканевые нарушения разных структур тканей кожи. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что аутоиммунная пузырчатка представляет собой гетерогенную группу заболеваний органов с поликлональным гуморальным ответом. Вовлечение в общий иммунопатологический процесс одновременно разных антигенов-мишеней системы десмосомального аппарата и других структур тканей кожи приводит к разнообразию клинических проявлений и определенному течению болезни. Постановка точного диагноза и прогнозирование исхода иммунопатологического процесса требует широкого внедрения со20 временных молекулярно-биологических методов исследования, включая методы меченых антител. Использование последних открывает возможность изучения тонких механизмов развития аутоиммунной пузырчатки. В частности речь идет о существовании прочного гистоиммунологического барьера между эпителием и кровотоком, который способствует уменьшению поступления аутоантител в большом количестве в кожу и создает условия для клинической ремиссии. Полученные фундаментальные знания позволяют понять о происходящих процессах в организме пациента, способствуя разработке более совершенных патогенетически обоснованных методов терапии. ВЫВОДЫ 1. В результате иммунологического исследования в сыворотке крови больных аутоиммунной пузырчаткой обнаруживаются все субклассы IgG и третий компонент комплемента независимо от стадии развития и клинической формы заболевания. Ключевая роль в развитии и течении болезни принадлежит циркулирующим IgG4- и/или IgG1-аутоантителам. При этом IgG4 является доминирующим субклассом на всем протяжении развития с наибольшей частотой его выявления в стадии обострения болезни (100%). Напротив, наиболее высокая частота выявления циркулирующих IgG1аутоантител обнаруживается при впервые выявленном заболевании (75%) с последующим снижением в стадии обострения процесса (57,1%) и клинической ремиссии (28,6%). 2. Возникновению аутоиммунной пузырчатки способствуют не менее двух провоцирующих факторов, среди которых присутствует психоэмоциональный стресс. Другими триггерными факторами являются некоторые лекарственные препараты (70,1%), избыточная инсоляция (38,6%), химические вещества (15,8%) и другие. При этом лекарственные препараты участвуют преимущественно в развитии вульгарной пузырчатки (51%), а инсоляция – себорейной (85%) и листовидной (50%) пузырчатки. 3. Результаты исследования по изучению локализации антигенов- мишеней для субклассов иммуноглобулина G и третьего компонента комплемента показывают вовлечение широкого спектра антигенных детерми21 нант межклеточной связывающей субстанции эпидермиса независимо от клинической формы и стадии развития аутоиммунной пузырчатки. Так, для IgG1-, IgG3- и IgG4-аутоантител, выявляемых непрямым методом иммунофлюоресценции, мишенью служит преимущественно межклеточная связывающая субстанция базального и шиповатого слоев эпидермиса, которая одновременно является мишенью и для фиксированных IgG1, IgG2, IgG4 и С3 компонента комплемента, выявляемых прямым методом иммунофлюоресценции. Межклеточная связывающая субстанция зернистого слоя представляет собой мишень преимущественно для IgG2-аутоантител и исключительно для циркулирующего С3 компонента комплемента. 4. Установлено, что при аутоиммунной пузырчатке иммуногистохимиче- скими методами выявляется разнообразная форма отложений IgG- аутоантител, по-видимому, связанная с вовлечением в патологический процесс нескольких антигенов-мишеней в десмосоме, что приводит к особенностям течения болезни. Благоприятное течение заболевания сопровождается сетевидным отложением IgG-аутоантител в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса, торпидное течение – гранулярным отложением IgG (Xsquared = 21.3333 при p = 0,001499). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ • Своевременная постановка точного диагноза, выявление провоцирующих факторов и прогнозирование характера течения аутоиммунной пузырчатки способствуют выработке индивидуальной тактики ведения больного. Безусловно, полученные в работе иммунологические и иммуноморфологические результаты могут быть в дальнейшем использованы для оптимизации конечных результатов лечения больных аутоиммунной пузырчаткой. 22 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Махнева Н.В. Влияние характера фиксации иммуноглобулина класса G на течение аутоиммунной пузырчатки / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Тезисы научных работ XI Всероссийского съезда дерматовенерологов и косметологов, г.Екатеринбург, 2010 г. – С. 58. 2. Махнева Н.В. Значение результатов использования иммунофлюоресценции в диагностике и прогнозировании течения аутоиммунной пузырчатки (пример синтеза науки и практики) / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Современные наукоемкие технологии. – 2010. - №12. – С. 45-46. 3. Махнева Н.В. Влияние субклассов иммуноглобулина G на развитие аутоиммунной пузырчатки / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - №6. - 2011 год. – С. 45-46. 4. Makhneva N.V. Clinical course prognosis for the autoimmune pemphigus by evaluation of the character of immunoglobulin fixing in sites of antigen targets localization / Makhneva N.V., Davidenko E.B., Beletskaya L.V. - // Allergy, asthma &immunology: from genes to clinical application. – 2011.- P. 199-204. 5. Makhneva N.V. Clinical course prognosis for the autoimmune pemphigus by evaluation of the character of immunoglobulin fixing in sites of antigen targets localization / Makhneva N.V., Davidenko E.B., Beletskaya L.V. - // International journal on immunorehabilitation. – 2011.- V. 12. №3. - P. 68. 6. Махнева Н.В. Прогнозирование течения аутоиммунной пузырчатки путем оценки характера фиксации иммуноглобулина в местах локализации антигенов-мишеней / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Аллергология и иммунология. – 2011. – Т. 12. - №1. – С. 32. 7. Давиденко Е.Б. Роль дополнительных патогенетических факторов в развитии аутоиммунной пузырчатки / Давиденко Е.Б., Махнева Н.В., Чистякова Т.В. и др. - // Сборник тезисов 2-ого Конгресса Евро-азиатской ассоциации дерматовенерологов, г.Москва, 2012 г. – С. 150. 8. Makhneva N.V . The humoral response in the autoimmune pemphigus / Makhneva N.V., Davidenko E.B., Potekaev N.N. et al. - // Allergy, asthma &immunology: from genes to clinical application. – 2012. – P. 157-160. 9. Makhneva N.V. The humoral response in the autoimmune pemphigus / Makhneva N.V., Davidenko E.B., Potekaev N.N. et al. - // International journal of immunorehabilitation. – 2012. – V. 14. - № 1. – P. 81. 10. Махнева Н.В. Гуморальный ответ при аутоиммунной пузырчатки / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Потекаев Н.Н. и др. - // Аллергология и иммунология. – 2012. – Т. 13. - №1. – С. 34. 11. Давиденко Е.Б. Триггерные факторы и аутоиммунная пузырчатка / Давиденко Е.Б., Махнева Н.В. - // Клиническая дерматология и венерология. – 2012. - №6.- С. 16-22. 12. Махнева Н.В. Продукция специфических аутоантител при аутоиммунной пузырчатке в стадии клинической ремиссии / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Сборник тезисов VI Международного форума дерматовенерологов и косметологов, Москва, 2013 г. – С. 133-134. 13. Makhneva N.V. The role of serum C3 component of complement in the development of autoimmune pemphigus / Makhneva N.V., Davidenko E.B., Beletskaya L.V. - // Allergy, asthma &immunology: from genes to clinical application. – 2013. – P. 129-131. 14. Makhneva N.V. The role of serum C3 component of complement in the development of autoimmune pemphigus / Makhneva N.V., Davidenko E.B., Beletskaya L.V. - // International journal of immunorehabilitation. – 2013. – V. 14. - № 1. – P. 51. 15. Махнева Н.В. Роль сывороточного С3 компонента комплемента в развитии аутоиммунной пузырчатки / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Аллергология и иммунология. – 2013. – Т. 14. - №1. – С. 36. 16. Махнева Н.В. Роль гисто-иммунологических барьеров и триггерных факторов в развитии аутоиммунной пузырчатки / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Сборник статей "Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии". – 2013. – С. 13-14. Научно-методические труды 1. Махнева Н.В. Диагностика аутоиммунных буллезных дерматозов с помощью методов иммунофлюоресценции / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. - // Методические рекомендации, Москва, 2012. – 17 с. Патенты 1. Махнева Н.В. Способ прогнозирования характера течения аутоиммунной пузырчатки / Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В.- // Патент на изобретение №2429482 от 20 сентября 2011 г. 23
