МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ

1
МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ
Лекция № 4 ТОБ.
Общая схема метаболизма микроорганизмов и механизмы
его регуляции.
План лекции
1. Анаболизм и катаболизм микробной клетки, их взаимосвязь.
2. Влияние физико-химических факторов среды на метаболические
процессы.
3. Классификация механизмов регуляции метаболизма.
4. Ферментная регуляция метаболизма.
5. Генная регуляция метаболизма.
В. 1. Анаболизм и катаболизм микробной клетки, их взаимосвязь.
Метаболизм микробной клетки определяется суммой всех реакций
распада поступающих веществ (катаболизм) и синтеза структурных
компонентов клетки и метаболитов (анаболизм) катализируемых ферментами
клетки. Метаболизм микроорганизмов имеет ряд особенностей:

Микроорганизмы
используют
большое
количество
разнообразных источников углерода и энергии;

Метаболизм
эффективностью,
что
микроорганизмов
объясняется
характеризуется
большим
значением
высокой
отношения
поверхности к объему;

Главные внутриклеточные функции у микробов контролируются
ферментами;

Микроорганизмы способны выделять во внешнюю среду как
клеточные, так и промежуточные продукты обмена;
2

Микробная клетка нуждается в источниках внешней энергии для
поддержания процессов метаболизма, такими источниками являются богатые
энергией органические и неорганические соединения или свет;

В зависимости от используемых источников энергии и углерода,
конечных продуктов у микроорганизмов выделяют 4 типа метаболизма –
бродильный, дыхательный, метаногенный и фототрофный.
Общая схема процессов катаболизма включает три стадии:
1).
Расщепление
макромолекул
под
действием
гидролитических
ферментов на простые субъединиц (аминокислоты, моносахара, жирные
кислоты,глицерин);
2).
Распад
простых
субъединиц
до
ПВК,
сопровождающийся
образованием насыщенных энергией (макроэргических) соединений;
3). Окисление или восстановление ПВК с образованием продуктов
метаболизма,
сопровождающееся
накоплением
большого
количества
энергии.
Анаболические процессы включают биосинтез микробной клеткой
полисахаридов, белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот, липидов.
Для биосинтеза полимеров клетки необходимо получение субъединиц
макромолекул
в
результате
катаболических
процессов;
накопление
макроэргических соединений и активирование субъединиц полимеров за счет
энергии макроэргических связей; образование специфических макромолекул
путем полимеризации активированных субъединиц.
Для построения макромолекул необходимы субъединицы с числом
атомов углерода от 1 до 6. Поставщиками этих соединений служат
следующие процессы катаболизма:
3
- С1 (СО2): окисление субстратов, гетероферментативное брожение;
- С2 (ацетил-СоА); гликолиз;
- С3 : гликолиз, пентозофосфатный цикл;
- С4: ЦТК, пентозофосфатный цикл;
- С5: ЦТК, пентозофосфатный цикл;
- С6: гидролиз полисахаридов и олигосахаридов до моносахаров.
Исходя из этого клеточный метаболизм может быть поделен на 3 стадии:
1.
окислительные реакции, направленные на расщепление субстрата
и ведущие к образованию промежуточных продуктов (ацетилСоА,
ПВК,
α-кетогоутаровой
кислоты),
восстановленных
кофакторов (НАДН2, ФАДН2) и АТФ;
2.
реакции регенерации (реокисления) кофакторов;
3.
биосинтетические
реакции
образования
макромолекул,
протекающие счет энергии АТФ.
Первые 2 части –катаболизм; 3-я – анаболизм.
1
биосинтез
2
окисление субстрата
синтез
продуктов
О2
АТФ
3
регенерация кофакторора
НАД
дыхание
НАДН2
[H]
Синтез промежуточных
продуктов
Промежуточные
продукты
Н2О,N2
H2S и др
окислители
(O2,NO2
SO42-и
др.)
Брожение Восстанов- проленные
дукты
продукты броже
ния
4
В.2. Влияние физико-химических факторов среды на метаболические
процессы.
Существенное влияние на рост культуры и метаболические процессы
оказывают факторы внешней среды, активизирующие или ингибирующие
действие клеточных ферментов.
1). Состав и концентрация компонентов питательной среды
обеспечивает
метаболические
реакции
необходимыми
субстратами.
Недостаток вызывает лимитирование ферментов клетки субстратом. Избыток
- субстратное насыщение и ингибирование роста в результате повышения
осмотического давления.
2). Концентрация продуктов метаболизма – замедляет протекание
биохимических реакций.
3). рН среды – важным условием нормальной жизнедеятельности
микроорганизмов
является
поддержание
постоянного
значения
внутриклеточного рН (для ацидофилов 6,0-7,0; алкалофилов 9,0-10,0;
нейтралофилов 7,5). Значение рН оказывает существенное влияние на синтез
того или иного метаболита. В ряде случаев оптимум для роста культуры и
образования
продукта
неодинаков.
С
увеличением
температуры
культивирования диапозон переносимых значений рН сужается.
4). Температура – оказывает влияние на эффективность конверсии
субстрата в клеточную массу, скорость роста, состав внутри- и внеклеточных
метаболитов.
Температурный
режим
предопределяет
выбор
микроорганизмом того или иного метаболического пути (Bacillus cereus: 30320C – гликолиз; 7-10оС – пентозофосфатный путь). Снижение температуры
менее оптимальной для роста культуры приводит к замедлению диффузии
растворенных веществ через мембрану и понижению энзиматической
активности. Температуры, превышающие оптимум роста, как правило,
5
стимулируют продукцию метаболитов.
Осмотическое
5).
давление
и
активность
воды.
Увеличение
концентрации растворенных веществ приводит к повышению осмотического
давления.
Метаболическая
реакция
микроорганизма
на
повышение
осмотического давления может быть двух типов:
- транспорт соли через мембрану в цитоплазму;
- синтез в клетке органических веществ, повышающих осмотическое
давление в цитоплазме.
Осморегуляторные механизмы могут вовлекать 5 групп веществ:
неорганические ионы, аминокислоты, дисахариды, полиолы, бетаины.
Со значением осмотического давления связан показатель активности
воды (отношение давления водяного пара раствора к давлению водяного пара
чистого
растворителя).
Для
большинства
микроорганизмов
границы
жизнедеятельности определяются значениями аw = 0,6-1,0/
6).
Содержание
растворенного
кислорода
–
обеспечивает
метаболические процессы аэробов, являясь акцептором ионов Н+; замедляет
или полностью подавляет развитие анаэробов.
7). Содержание растворенного диоксида углерода – необходимо для
метаболизма автотрофов, для гетеротрофов может как стимулировать, так и
подавлять метаболические процессы.
8). Вязкость среды – определяет диффузию питательных веществ из
объема среды к поверхности клетки.
В.3. Классификация механизмов регуляции метаболизма.
В микробных клетках функционируют различные системы регуляции
метаболизма. Одни из них направлены на регуляцию синтеза ферментов
клетки,
другие
–
на
регуляцию
их
активности.
Посредниками
в
6
осуществлении этих механизмов являются низкомолекулярные соединения,
синтезируемые клеткой или поступающие из питательной среды.
По механизму синтеза все ферменты клетки можно разделить на две
группы:
1). Конститутивные – начинают синтезироваться как только клетка
попадает в оптимальную для действия данных ферментов среду, к ним
относятся ферменты гликолиза, и других путей распада сахаров, ЦТК и др.;
2). Индуцируемые – образуются только при наличии специфических
веществ (индукторов); примерами таких ферментов являются целлюлазы,
амилазы, липазы и др.
В настоящее время принято выделять три вида внутриклеточной
регуляции метаболизма микроорганизмов:
1).
Регуляция
концентраций
метаболитами.
метаболитов
Осуществляется
(промежуточных
изменениями
продуктов
обмена)
без
изменения количества ферментов и их активности. Примером этого типа
является регуляция дыхания. Поток электронов через дыхательные цепи
связан со скоростью образования АТФ. Т.к. интенсивность образования АТФ
лимитируется
количеством
АДФ,
то
последнее
ограничивает
и
интенсивность реакции переноса электронов по дыхательной цепи.
2). Ферментная регуляция – связана с изменением активности
ферментов без изменения их количеств, при воздействии на ферменты
регулирующих
(активирующих
или
ингибирующих
факторов).
На
ферментном уровне выявлено несколько механизмов регуляции. Для
анаболических путей метаболизма преобладающим является механизм
регуляции конечным продуктом – конечный продукт ингибирует один из
первых ферментов последовательности реакций биосинтеза.
3). Генная регуляция – основана на изменении количества ферментов
7
вследствие влияния регулирующего фактора на биосинтез или разрушение
ферментов. Данный тип оказывает наиболее глубокое и эффективное
воздействие на процессы метаболизма клетки, т.к. генная регуляция
определяет количество и активность синтезируемого фермента, в то время
как другие механизмы регуляции лишь непосредственно или косвенно
воздействуют
на
активность
ферментов
(по
выражению
М.Е.Бекер
«обеспечивают их тонкую настройку»).
В.4. Ферментная регуляция метаболизма.
В настоящее время расшифрованы следующие механизмы регуляции
метаболизма микроорганизмов:
- регуляция конечным продуктом;
- регуляция путем обратимого фосфорилирования;
- регуляция посредством ковалентной модификации;
- регуляция аллостерических ферментов;
- регуляция в результате ограниченного протеолиза;
- регуляция белками – ингибиторами ферментной активности.
Регуляция конечным продуктом. Общий механизм биохимической
активности у микроорганизмов заключается в ингибировании фермента,
катализирующего новую стадию метаболического пути конечным продуктом
этого пути по типу обратной связи. Механизм регуляции по принципу
обратной связи раскрыт для многих вторичных метаболитов. В частности,для
пенициллина регулирующим агентом является аминоцил-L-лизин.
Регуляция путем обратимого фосфорилирования. Основана на
циклическом переходе ферментов. Катализирующих ключевые реакции
катаболизма
и
анаболизма
из
фосфорилированных
форм
дефосфорилированные. Присутствие фосфат ионов необходимо в среде для
в
8
осуществления
каталитических
реакций
распада
углеводов,биосинтеза
фосфолипидов, полифосфатов, нуклеиновых кислот. Во всех этих случаях
ферменты, способные образовывать фосфорилированные формы, выполняют
функции транспорта фосфата.
Регуляция посредством ковалентной модификации.
При ковалентной модификации происходит взаимопревращение двух
форм
ферментов
определенной
путем
ковалентного
функциональной
присоединения
группы:
ацетила,
или
удаления
адениловой
или
фосфорильной группы. Например, активность глутанатсинтетазы у многих
бактерий регулируется через обратимое аденилирование и деаденирование.
Регуляция путем ограниченного протеолиза. Ограниченный протеолиз
является одним из распространенных методов перевода неактивной формы
белковой молекулы в форму, проявляющую каталитическую активность. При
протеолитическом
отщепления
определенного
участка
молекулы
высвобождается активный центр, изменяется его строение и т.д. Такой
механизм широко распространен для клеточный протеаз. В ряде случаев
ограниченный
протеолиз
обеспечивает
подавление
биологической
активности ферментов.
Регуляция аллостерических ферментов. Основана на изменениях
конформации фермента, ведущей к изменению его активности. Свойства
аллостерических
белков
изменяются
в
результате
присоединения
специфической низкомолекулярной молекулы – эффектора. Аллостерические
ферменты
имеют,
как
правило,
четвертичную
структуру.
Каждая
субъединица имеет два разобщенных связывающих участка: каталитический
и регуляторный (аллостерический), присоединение к которому эффектора
изменяет конформацию каталитического центра, активируя или инактивируя
его. У микроорганизмов широко распространен механизм регуляции, при
котором
метаболит
действует
как
аллостерический
эффектор,
9
катализирующий либо его собственное превращение, либо образование
продукта, находящегося далее в цепи.
Белки-ингибирты – являются одной из универсальных систем контроля
метаболизма микробной клетки. Многие известные ингибиторы белковой
природы имеют высокий уровень специфичности. В настоящее время
наиболее
изучены
ингибиторы
гидролаз.
Это
белки
с
небольшой
молекулярной массой (около 10000 ед.), не содержат простетической группы.
Белки – ингибиторы характеризуются высокой устойчивостью к протеолизу.
Локализация их может быть как внутри-, так и внеклеточной.
В.5. Генная регуляция метаболизма.
Индуцируемый ферменты синтезируются клеткой в ответ на воздействие
определенного фактора внешней среды, в качестве которого выступает, как
правило, какой-либо компонент внешней среды – эффектор.
Под эффекторами понимают вещества, вызывающие изменение скорости
синтеза белков при их попадании в микробную клетку. При этом вещества.
Индуцирующие
синтез
клеткой
определенного
фермента
называют
индукторами, а вещества, подавляющие синтез – репрессорами. Регуляция
метаболизма микроорганизмов на генном уровне основана на использовании
механизмов индукции и репрессии синтеза клеточных ферментов.
Индукция. Впервые механизм индукции был изучен Жакобом и Моно на
примере синтеза индуцируемого фермента β-галактозидазы E.coli.
Гены, определяющие структуру ферментов с близкими функциями,
сгруппированы в хромосоме в единичный оперон. Например, в состав lagоперона E.coli входят три гена: ген z –кодирующий аминокислотную
последовательность β-галактозидазы, ген у – структурный ген пермеазы
(транспорт лактозы в клетку), ген а – структурный ген ацилазы. Оперон
10
находится под контролем регуляторного участка молекулы ДНК - промотора.
Функции промотора заключаются в связывании РНК-полимеразы,
ответственной за синтез
и-РНК, которая переносит информацию о
аминокислотной последовательности определенного фермента или группы
ферментов. Последовательность пуриновых и пиримидиновых оснований в
промоторе
определяет,
с
какой
частотой
РНК-полимераза
будет
присоединяться к нему, т.е. задает максимальную скорость транскрипции
гена и, как следствие, количество синтезируемого фермента.
На участке ДНК между промотором и опероном к молекуле
присоединяется репрессор – аллостерический белок, каждая субъединица
которого имеет сродство к нуклеоидной последовательности молекулы ДНК
в месте присоединения; второй способен присоединять молекулу эффектора
(индуктора или репрессора).
Жакоб и Моно предложили следующую модель деятельности lagоперона E.coli. В отсутствии индуктора белок-репрессор связан с молекулой
ДНК, блокируя структурные гены, т.е. синтез β-галактозидазы подавлен. При
присоединении к аллостерическому центру индуктора (аллолактоза β-Дгал(1-6) Д-глю) изменяется конформация белка-репрессора и его сродство с
молекулой ДНК. В результате высвобождаются структурные гены и
активируется синтез ферментов. Данный механизм получил название
негативной регуляции индукции синтеза ферментов.
В ряде случаев имеет место позитивная регуляция индукции. Например,
ферменты метаболизма арабинозы у E.coli синтезируются под контролем
белка-репрессора, способного осуществлять позитивную регуляцию. В
отсутствии арабинозы ферменты, участвующие в ее расщеплении (изомераза,
киназа, эпимераза), синтезируются клеткой E.coli в малых количествах, т.к.
репрессор блокирует транскрипцию соответствующего оперона.
11
ЛАКТОЗА
АРАБИНОЗА
Репрессор
промотор
ген в
ген а
ген d
Р ген с ДНК
lag-оперон
z
y
a
РНК
эпимераза изоме- киназа
раза
репрессор
арабиноза
Арабиноза, связавшись с репрессом приводит его в активированное
состояние.
Аутогенная регуляция. В данном случае в качестве репрессора
выступает фермент, информация о синтезе которого зашифрована на
контролируемом участке ДНК. Индуктором, как правило, является продукт
катаболизма, образующийся под действием фермента.
(+)
Х1
Х1 – нуклеотидные предшественники;
(-)
Х2
Х2 – специфическая и-РНК;
Х3 – аминокислотные предшественники
Х3
Х4
Х4 – фермент катаболизма;
Х5 – субстрат;
Х5
Х6 Х6 – продукт-индуктор.
Аутоиндукция. Сущность этого явления заключается в перестройке
метаболизма клетки в направлении синтеза за счет внутриклеточных
компонентов. Так, культура гриба Asp.niger, культивируемая в условиях
дефицита источников азота, вырабатывает индуктор, ускоряющий синтез
протеаз.
Репрессия. При регуляции метаболизма по механизму репрессии белокрепрессор в отсутствии эффектора находится в неактивном состоянии, т.е.
12
транскрипция генов и синтез фермента не ограничены. При достижении
определенной концентрации продукта катаболизма, образующегося при
участии фермента, репрессор переходит в активную форму, блокируя
транскрипцию. Таким образом, продукт метаболизма в данном случае
выступает
в
роли
специфического
эффектора
(корепрессора),
ингибирующего синтез фермента.
Частным
случаем
данного
механизма
является
катаболическая
репрессия, тесно связанная с глюкозным эффектом. Катаболическая
репрессия заключается в блокировании синтеза ферментов, отвечающих за
расщепление лактозы, галактозы, мальтозы и др. сахаров, продуктами
расщепления глюкозы. Синтез ферментов, ответственных за включение
углеводов в процесс гликолиза индуцируется циклическим аденозинмонофосфатом (ц АМФ), который взаимодействует со специфическим
белком-активатором катаболизма (БАК; сар-белок). В результате образуется
активированный комплекс, связывающийся с промотором и тем самым
инициирующий
транскрипцию
соответствующих
генов.
Образование
продуктов катаболизма глюкозы ингибирует синтез ц-АМФ и в результате
блокирует транскрипцию генов, несущих информацию о синтезе ферментов
катаболизма лактозы, мальтозы и др. сахаров.