Фармакокинетика лектинов природной омелы после подкожной

Фармакокинетика лектинов природной омелы после
подкожной инъекции
Roman Huber, Juergen Eisenbraun, Barbara Miletzki, Michael Adler, Rainer Scheer, Reinhild
Klein, Christoph H. Gleiter
Реферат
Цель: Изучение фармакокинетики лектинов природной омелы (nML) можно считать
принципиально важным элементом для дальнейших рациональных исследований препаратов
омелы. Исследования, выполненные при внутривенном введении рекомбинантного рибосомаинактивирующего протеина типа II (rML), аналогичного nML, выявили короткий период
полувыведения у онкобольных – примерно 13 минут. Это испытание фазы I, выполнявшееся в
одном исследовательском центре по открытой схеме, имело целью описание фармакокинетики
nML.
Методы: Оределение nML проводилось используя технику модифицированной цепной
полимеразной реакции (PCR) (Imperacer®, Chimera Biotech) после однократной подкожной
инъекции экстракта омелы (abnobaVISCUM® Fraxini 20мг), содержащего примерно 20 мкг nML
на мл и имеющего разрешение на маркетинг, 15 здоровым добровольцам мужского пола в
возрасте 18-42 лет. Вторичными целями были оценка безопасности, а также число
активированных природных клеток-киллеров. (CD54+/CD94+).
Результаты: До инъекции ни у одного из добровольцев nML не обнаруживались, а после
инъекции nML обнаруживались в сыворотке у всех добровольцев. Однако результаты
варьировали в широких пределах от одного индивидуума к другому. Средняя и медианная
пиковые концентрации достигались через 1 и 2 часа после инъекции, соответственно. У
некоторых добровольцев nML все еще обнаруживались при завершающем обследовании - через
2 недели после инъекции. Инъекция приводила к повышению температуры и появлению
гриппоподобных симптомов у всех добровольцев, однако никаких других более серьезных
побочных эффектов не наблюдалось. Все симптомы, а также местные реакции в месте
инъекции, полностью исчезали в пределах 4-95 суток. Число активированных природных
клеток-киллеров (NK) оставалось неизменным.
Заключения: Природные ML из abnobaVISCUM® Fraxini 20мг обнаруживаются в сыворотке
после однократной подкожной инъекции. Период, на протяжении которого они обнаружимы,
имеет значительно большую продолжительность, чем при внутривенном введении rML.
Подкожная инъекция этого препарата без обычного предварительного введения более низких
доз (аллергическая проба) приводит к непродолжительному повышению температуры и
появлению кратковременных гриппоподобных симптомов.
Ключевые слова: AbnobaVISCUM® Fraxini 20мг. Антропософские лекарственные средства.
Здоровые добровольцы. Фитотерапия. Безопасность. NK-клетки.
Введение
Препараты омелы использовались в течение десятилетий для поддерживающего лечения
онкобольных в рамках концепции антропософских лекарственных средств. Несмотря на то, что
было выполнено более 40 рандомизированных клинических испытаний, эффективность
применения препаратов омелы при лечении рака пока еще до конца не выяснена и продолжает
обсуждаться [1].Причиной этой неудовлетворительной ситуации является то, что тестированию
подвергались различные препараты омелы, с различными ингредиентами и в различных
1
концентрациях, а также то обстоятельство, что фармакология экстрактов омелы не выяснена.
Активными ингредиентами экстрактов омелы являются главным образом природные лектины
омелы (nML), вискотоксины и полисахариды. Из них наиболее интересными в отношении
противораковой активности являются nML. В экспериментах, проведенных in vitro и на
животных, было показано, что они обладают выраженными цитотоксическими свойствами
[2,3]. В дозах ниже цитотоксического уровня nML стимулируют неспецифическую и
специфическую иммунную систему человека [4].
ML являются гликопротеинами, и встречаются в природе в виде двух типов: рибосомаинактивирующих протеинов класса 2, подразделяемых на три субтипа: ML-I, -II и-III; и viscum
album хитин-связывающих ML (cbML). Молекулярный вес nML I-III составляет около 63 кДа.
Они имеют очень похожие биологические свойства и состоят из N-гликозидазы (А-цепь) и
галактозид-распознающего лектина (В-цепь), соединенных дисульфидным мостиком [5,6].Ацепь ингибирует синтез протеинов [7,8]. В-цепь связывается с углеводными остатками на
поверхности клетки, проникая таким образом в клетку путем эндоцитоза, опосредованного
рецепторами, и вызывает апоптоз клетки [8,9]. СbML принадлежит к другому классу лектинов с
другой структурой, с низкой антигенностью, и молекулярным весом лишь примерно 11 кДа
[10]. Он гораздо менее токсичен, чем nML I-III, и в наш анализ не включен.
Недавно была разработана методика обнаружения nML I-III в сыворотке человека в
нанограммовых количествах [11,12]. Рекомбинантный рибосома-инактивирующий протеин
типа II (rML), аналогичный nML I, показал короткий период полувыведения у онкобольных –
примерно 13 минут [12]. Знание фармакокинетики nML можно рассматривать как важный
элемент для оптимизации клинического применения и проведения дальнейших рациональных
исследований препаратов омелы. Вследствие этого, мы впервые исследовали фармакокинетику
nML, присутствующих в составе, поступающего в продажу, препарата омелы.
Пациенты и методы
Это исследование выполнялось в одном исследовательском центре по открытой схеме как
рандомизированное неконтролируемое клиническое испытание в фазе I. Первичной целью
являлась фармакокинетика nML после подкожного введения одной дозы (1 мл)
abnobaVISCUM® Fraxini 20мг здоровым добровольцам мужского пола. Вторичными целями
были оценка безопасности, а также маркеры активации (CD54+/CD94+) природных клетоккиллеров (NK). Этот маркер был выбран потому, что лечение пациентов с метастатическим
колоректальным раком и раком легкого NK-клетками (CD54+/CD94+), активированными
протеинами после теплового шока, показали наличие многообещающих противоопухолевых
эффектов [13]. Мы хотели проверить гипотезу, что повышение температуры, вызываемое
омелой, активирует NK-клетки.
Это исследование включало в себя скрининг (обследование 1), период госпитализации
(обследования 2-6), начиная с ночи перед подкожной инъекцией исследуемого лекарственного
препарата (IMP) - и до момента спустя 72 часа после нее, а также завершающий период
последующего наблюдения (обследование 7) – в День 14 ± 3 после инъекции IMP.
Концентрации природных ML в сыворотке добровольцев анализировались до и спустя 0.3, 0.7,
1.0, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48, 72 b 336 часов после инъекции IMP. Биохимические
показатели [креатинин, мочевина, мочевая кислота, натрий, калий, хлорид, кальций, креатинкиназа, аланин амин-трансфераза (ALT), аспартат амино-трансфераза (AST), лактатдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, гамма-глутамил-трансфераза, общий билирубин, общий
протеин, альбумин, альфа-амилаза, С-реактивный протеин (CRP), холестерин, триглицериды,
глюкоза] определялись при обследованиях 1, 2 и 7. NK-клетки CD54+/CD94+ определялись до
инъекции и через 6, 24 и 72 часа после инъекции.
В исследование включались субъекты, удовлетворяющие следующим критериям: здоровые
некурящие мужчины в возрасте от 18 до 45 лет, с показателем массы тела (BMI) 18.5 -28 кг/см2,
2
нормальными значениями артериального давления, частоты пульса, температуры тела,
гематологическими,
биохимическими,
коагуляционными
показателями
и
электрокардиограммой (ЭКГ). Критериями, исключающими участие в исследовании, были
признаки любого клинически значимого заболевания, регулярный прием лекарств,
злоупотребление лекарствами, положительный результат исследования мочи на присутствие
наркотиков, положительный результат анализа крови на этанол (алкоголь), участие в другом
клиническом испытании, предшествующая терапия препаратами омелы, аллергический анамнез
на какой-либо лекарственный препарат, аллергические заболевания, кроме случаев, когда
исследователь сочтет их не имеющими значения для целей данного исследования,
положительный серологический тест на ВИЧ, а также гепатиты В или С, регулярное
употребление более 20 г этанола в день, сдача донорской крови в пределах 3 месяцев перед
поступлением на исследование, ограниченный доступ к периферийным венам для забора крови,
или неспособность понять природу и объем этого испытания. В исследования включались
только те добровольцы, которые давали письменное согласие и удовлетворяли всем критериям
для участия в нем. Перед началом исследования соответствующий комитет по этике давал
положительный отзыв на проведение этого клинического испытания, и исследование
проводилось в соответствии с нормами надлежащей клинической практики и принципами,
изложенными в Хельсинкской декларации.
Лекарственный препарат
AbnobaVISCUM® Fraxini 20мг представляет собой инъекционный растительный не
содержащий эндотоксинов экстракт европейской разновидности омелы Viscum album L.,
предназначенный для лечения злокачественных опухолей, их рецидивов и некоторых
предраковых состояний. Поскольку abnobaVISCUM® Fraxini 20мг характеризуется самым
высоким содержанием nML (приблизительно 20000 нг/мл) в сравнении со всеми прочими
имеющимися в продаже препаратами омелы, он был выбран для того, чтобы обнаружить nML в
нанограммовых количествах после подкожной инъекции. Омела паразитирующая на
лиственных деревьях, таких как ясень, из которого получают abnobaVISCUM® Fraxini 20мг,
содержит относительно высокую долю nML-I по сравнению с nML II/III [14], однако вследствие
методологических трудностей в экстракте, поступающем в продажу, невозможно выполнить
разделение различных разновидностей ML. Содержание cbML в abnobaVISCUM® Fraxini 20мг
составляет приблизительно 1 мкг/мл [15]. Каждому добровольцу подкожно вводили одну и ту
же дозу (1 мл) abnobaVISCUM® Fraxini 20мг. В корректировках дозы не было необходимости,
поскольку критерий включения в исследование ограничивал показатель массы тела человека
значениями 18.5 -28 кг/см2. Внутриопухолевые иньекции abnobaVISCUM® Fraxini 20мг
приводили к весьма значительному уменьшению опухолей
у пациентов с
ксенотрансплантатами при раке поджелудочной железы [13].
Количественное определение nML и активированных NK-клеток
После отбора каждый образец крови немедленно охлаждался и центрифугировался в течение 10
минут при 4°С и при 2500 обор/мин. После этого, по меньшей мере 2 мл сыворотки
немедленно замораживались и хранились при – 80 °С в клиническом испытательном центре.
Содержание природных ML в сыворотке добровольцев измерялось с помощью исключительно
чувствительного метода, основанного на цепной иммуно-полимеразой реакции (PCR)
(Imperacer®, Chimera Biotech) [11,12,16], который сочетает в себе иммуносорбентный
твердофазный анализ (ELISA) и экспоненциальное усиление сигнала, типичное для PCR. Этот
метод прошел валидацию в Chimera Biotech GmbH, Дортмунд, Германия, в отношении
определения содержания природных лектинов омелы в сыворотке крови человека после
введения abnobaVISCUM®. Он не различает субтипы nML I – III. Он не обнаруживает cbML изза их совершенно другой структуры. Говоря вкратце, антиген иммобилизировался на
поверхности микропланшетов с покрытием, захватывающим антитела, непосредственно из
3
образцов сыворотки, подвергающихся анализу без дополнительной очистки. Для сведения к
минимуму фоновых эффектов образцы разбавлялись в соотношении 1:3 буфером для
разбавления образцов, содержащим детергент. Параллельно с образцами производилось
исследование серии разбавлений антигена. В качестве эталонных веществ использовались
abnobaVISCUM® Fraxini 20мг, партия № 407В04 и abnobaVISCUM® Mali 20мг, партия №
502В33 (оба от ABNOBA GmbH, Германия). Для количественного определения антигена с
помощью калибровочной кривой, а также проверки робастности и специфичности теста,
использовались образцы с добавками. Образцы для каждой калибровочной кривой (6000 – 93.75
антигена пг/мл) готовились в не содержащей антигена сыворотке индивидуума, взятой до
введения антигена. Образцы данной серии разбавлений дополнительно замораживались для
того, чтобы имитировать влияние замораживания, которому подвергались антигенсодержащие
образцы, предназначенные для анализа. После инкубации исследуемых образцов, а также
образцов для построения калибровочной кривой, иммобилизованный антиген соединяли со
специфичным конъюгатом антитело-ДНК. Этот анализ выполнялся с помощью набора
Imperacer® (№ 11-030, Chimera Biotech, Германия), специально предназначенного для
проведения анализа лектинов. В качестве антител для детектирования и захвата использовались
моноклональные анти-ML антитела мышей 5F5 (А-цепь анти-ML-I) и 5Н8, анти-ML-A [Institut
fuer Immuno praeparate und Naehrmeden(Институт иммунных препаратов и питательных сред)
GmbH, Германия], соответственно.
После промывания, маркер ДНК усиливался в реальном времени за счет PCR. При анализе
данных применялась корректировка по базовой линии. Программное обеспечение прибора
вычисляет пороговый цикл (Ct), представляющий собой первый цикл PCR, при котором сигнал,
несущий информацию, становится сильнее сигнала фона (порога), и устанавливает его в фазу,
где этот сигнал увеличивается линейно. Корректировки на базовую линию и пороговое
значение были идентичными во всех валидационных измерениях. Затем вычислялись значения
ΔCt – путем вычитания значений Ct, полученных для каждого сигнала из общего числа циклов,
выполненных в процессе эксперимента. Это чисто математическое преобразование облегчает
сравнение данных с данными классического метода ELISA, поскольку значения ΔCt прямо
пропорциональны концентрации антигена.
Точность, чувствительность, специфичность и робастность этого анализа были подходящими
для выполнения данного фармакокинетического исследования. Полученный в процессе
валидации диапазон линейности анализа с помощью Imperacer® соблюдается в пределах
концентраций 0.1 – 100 нг nML/мл. С учетом того, что в одной дозе содержится 20000 нг nML,
а объем сыворотки у человека составляет примерно 3000 мл, то можно ожидать максимальной
концентрации 6.6 нг nML/мл, если предположить, что 100 % введенных nML будут немедленно
распределены по кровеносной системе без метаболизации. Поскольку диапазон линейности
измерений начинается с 0.1 нг, было возможно количественно измерять концентрацию nML
если в кровеносной системе в каждой точке измерений появляется всего 5% от введенного
количества 1 мл abnobaVISCUM® Fraxini 20мг. Ожидалось, что этого будет достаточно для
успешного определения кинетических параметров. Граничное значение, выше которого
концентрации nML получались положительными, было равным 0.1 нг nML/мл. Для
идентификации NK-клеток использовалась гепаринизированная кровь, а одноядерные клетки
периферийной крови (PBMC) выделялись с помощью градиента Fricoll’a. После окрашивания
фикоэритрин-(РЕ)-конъюгировнными анти-CD56, перидинин-хлорофилл-протеин (РerСР)конъюгировнными анти-CD45 и флуоресцеин-изоцианат (FITC)- конъюгировнными анти-CD94
антителами (все получены от Becton-Dickinson, San Jose, CA, США), PBMC подвергались
инкубации с соответствующими антителами или контрольными антителами изотипов
иммуноглобулина G (IgG) (BD Biosciences Pharmingen). Подсчитывалось как минимум 10000
лимфоцитов. Квадранты устанавливались в зависимости от контрольного изотипа для каждого
антитела.
4
Статистика
Сравнения с контрольной группой не планировалось, и данных для сравнения получено не
было. Поскольку это испытание должно было проводиться в исследовательских целях, то
вычислений размеров образца на статистической основе не выполнялось. В исследование
планировалось включить n=16 (две группы по n=8) здоровых добровольцев мужского пола, так
как это достаточное число для того, чтобы получить возможность оценки фармакокинетики
после однократной дозы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг.
Для статистического анализа были определены две популяции участников испытания:
1. Популяция, в которой изучалась фармакокинетика, включала всех участников, для которых
были получены интерпретируемые и пригодные для оценки фармакокинетические результаты
на протяжении 72 часов после введения дозы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг.
2. Популяция, в которой оценивалась безопасность препарата, охватывала всех участников,
которые удовлетворяли критериям пригодности и были включены в испытания.
Анализы фармакокинетики nML и маркера иммунологической активации выполнялись для
Таблица 1. Демографические данные добровольцев.
Возраст
(годы)
Рост (см)
Вес (кг)
Показатель
массы тела
(кг/м2)
Демографические характеристики (n=15)
Среднее
Стандартное Минимум
арифметическое отклонение
Медиана
Максимум
31,4
6,3
18,0
30,0
42,0
95 %-ный доверительный интервал
Нижний
Верхний
предел
предел
18,0
42,0
181,3
78,0
23,7
6,4
10,4
2,4
171,0
65,0
20,3
180,0
74,0
23,5
193,0
99,0
27,7
171,0
65,0
20,3
193,0
99,0
27,7
популяции, в которой изучалась фармакокинетика. Оценка безопасности и переносимости
выполнялась для популяции, в которой оценивалась безопасность препарата. Про возможности
проводилась корректировка на недостающие и недостоверные данные. Если такой возможности
не было, то такие данные считались отсутствующими.
Результаты
Скринингу подвергались 35 добровольцев, из них 20 были признаны пригодными. В
отклонение от первоначально запланированного размера образца n=16, IMP вводился только 15
добровольцам; пятеро были исключены до получения препарата по причине появления новых
критериев исключения в период между скринингом и госпитализацией. Демографические
данные добровольцев представлены в Таблице 1. Природные ML не обнаруживались ни у
одного из добровольцев до инъекции IMP, и обнаруживались у всех добровольцев после
инъекции. Несмотря на то, что все добровольцы получали подкожные инъекции IMP от одного
и того же опытного исследователя, индивидуальные профили изменения концентрации со
временем значительно варьировали: Добровольцы 1-9 и 14 [10/15 (67 %)] показывали быстрый
рост с высокими концентрациями nML, после чего следовал медленный спад. Второе
повышение наблюдалось у добровольцев 2, 5, 9 и 14 (27 %). У остальных 5/15 (33 %) , т.е.
добровольцев 10-13 и 15, профиль изменялся волнообразно и на низком уровне концентраций
nML. При завершающем обследовании (в день 14 ± 3 после инъекции) nML в сыворотке 5/15
добровольцев не обнаруживались, однако у 9/15 (60 %) nML все еще присутствовали в
измеряемых концентрациях. У одного из добровольцев запланированное последнее измерение
5
концентрации nML не было проведено, поскольку он не явился на завершающее обследование.
Ход изменений концентраций nML показан на Рис 1, а фармакокинетические данные
представлены в Таблицах 2 и 3. Средняя пиковая концентрация в сыворотке наблюдалась
спустя 01:00 ч после введения дозы. К концу исследования кривая не вернулась, но почти
вернулась к состоянию, существовавшему до введения дозы. Средние арифметические
значения максимальных концентраций в плазме Cmax , а также площадь под кривой зависимости
концентрации в плазме от времени, от нуля до бесконечности (AUC0-∞), составили 1043 пг/мл и
8395 ч*пг/мл, соответственно. Значение Tmax варьировало в пределах от 0.3 до336.0 ч, при
медианном значении 2.0 ч. Концентрация nML, равная 3.7 нг/мл, вычисленная для самого
высокого сигнала, зарегистрированного в этом исследовании у добровольца 3 через 1 ч после
инъекции, соответствует наличию 56 % лекарства в сыворотке для этой точки во времени (100
% = 6.6 нг/мл). Вычисление λz и t½ (t½ = ln2/ λz) ,было невозможно ни для одного из
добровольцев из-за нелинейности профиля зависимости концентрации от времени.
Рис. 1. Индивидуальные профили изменения концентраций природных лектинов омелы
со временем (n=15).
По вертикали: Концентрация природных лектинов омелы (пг/мл).
По горизонтали: время (ч) после подкожной инъекции abnobaVISCUM® Fraxini 20мг.
Значение AUC(0- tпоследнее) определялось с помощью трапецеидального анализа. Значение
AUC(tпоследнее-∞) для добровольцев2, 3, 9-13 и 15 определить не удалось, поскольку кривые
концентрация nML - время не могли быть экстраполированы на бесконечность по причине их
нелинейности. Для добровольцев 1, 4-8 и 14 в определении значения AUC(tпоследнее-∞) не было
необходимости, поскольку концентрации nML уменьшались ниже порога обнаружения в
период времени отбора образца крови. У добровольцев, чьи концентрации nML в сыворотке не
уменьшались ниже порога обнаружения (100 пг/мл) в период отбора образца крови, т.е. у 10/15
(67 %) добровольцев, значения AUC0-∞ и CLsc(0-∞) не поддавались определению. После
инъекции IMP доля активированных NK-клеток (CD54+/CD94+) в общем числе NK-клеток
(CD16+/CD56+) существенно не изменялась по сравнению с базовой линией.
6
Серьезных побочных реакций не наблюдалось. Из 55 зарегистрированных побочных реакций 53
были классифицированы исследователем, как по меньшей мере связанные с IMP, причем у
каждого из 15 добровольцев имел место один или более побочный эффект, имеющий по
меньшей мере возможную причинную связь с IMP. Только 5 из 55 зарегистрированных
побочных реакций, наблюдавшихся у 2/15 (13 %) добровольцев были значительно выражены
(гриппоподобные симптомы у двоих и тошнота у одного). Как и ожидалось, местная
воспалительная реакция на месте инъекции наблюдалась почти у всех участников (14/15, 93 %),
а у 15/15 температура тела повышалась до >37.5°С (Рис. 2), что сопровождалось
гриппоподобными симптомами у всех субъектов и тошнотой у восьми. Одиннадцать
добровольцев (73.5 %) принимали сопутствующие лекарства из-за боли на месте инъекции во
время госпитализации, а 3/15 – также после выписки из клинического исследовательского
центра. У 12 добровольцев (80 %) воспалительная реакция сохранялась и после завершающего
обследования: самый длительный период составил 95 дней.
Что касается оценки лабораторных данных, то при завершающем обследовании,
проводившемся на 14-й (± 3) день после введения IMP, никаких клинически значимых
отклонений от нормальных значений гематологических, биохимических и урологических
показателей не наблюдалось (Таблица 4). На протяжении всего исследования ни у одного из
добровольцев не было зарегистрировано какого-либо клинически значимого отклонения в ЭКГ.
Во время общего обследования никаких клинически значимых нарушений, кроме местной
воспалительной реакции на месте инъекции, выявлено не было.
7
Таблица 2. Сводка фармакокинетических параметров природных лектинов омелы (nML).
Параметры, зарегистрированные после однократной подкожной дозы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг
Номер
Минимум
Максимум
Среднее
арифметическое
Стандартное
отклонение
Нижний
квартиль
Медиана
Верхний
квартиль
Нижний предел, 95 %-ный
доверительный интервал
Верхний предел, 95 %-ный
доверительный интервал
Cmax (пг/мл)
15
188,7
3738
1043
1162
283
594
1029
189
3738
tmax (ч)
15
0,3
336,0
26,4
85,8
1,0
2,0
10,0
0,3
336
AUC(0- tпоследнее)
15
1401
125405
34652
35768
4533
20984
58116
1401
125405
(чапг/мл)
AUC0-∞ (чапг/мл)
7
1401
20984
8395
8173
2552
4533
19084
1401
20984
CLsc(0-72ч)b (л/ч)
15
428
14279
3819
3543
1510
2739
4589
428
14279
CLsc(0-336ч)b (л/ч)
15
160
14279
2779
4001
344
953
4412
160
14279
CLsc(0-∞)* (л/ч)
15
953
14279
5412
4001
1048
4412
7837
953
14279
Максимальная концентрация в плазме Cmax. Время достижения максимальной концентрации в плазме tmax (ч) и константа скорости выведения λz (1/ч) не могли быт определены
ни для одного из добровольцев вследствие нелинейности профиля концентрация-время.. Площадь под кривой концентрация-время AUC(0- tпоследнее) не могла быть определена,
поскольку экстраполяция кривых концентрация-время от последней точки во времени до бесконечности было невозможной у добровольцев 2, 3, 9-13 и 15 вследствие
нелинейного хода кривых, и не была необходимой у добровольцев 1, 4-8 и 14, так как концентрация лектинов омелы в сыворотке уже снизилась до или ниже уровня ,
предшествующего введению дозы в период отбора образца крови, т.е. к моменту последнего отбора образца крови, tпоследнее.
a
AUC0-∞ и кажущийся подкожный клиренс (CLsc(0-∞)): в итоговую статистику для AUC0-∞ и CLsc(0-∞) включались только добровольцы 1, 4-8 и 14,, для которых общая AUC
равнялась AUC(0- tпоследнее). Добровольцы 2, 3, 9-13 и 15 не могли учитываться в общей статистике AUC0-∞ и CLsc(0-∞), поскольку в этих случаях величина AUC(tпоследнее-∞) не
могла быть определена (см. выше).
b
CLsc(0-72ч) и CLsc(0-336ч): Поскольку кажущийся подкожный клиренс [CLsc(0-∞)] не мог быть определен у большинства добровольцев. То для всех добровольцев
определялись величины кажущегося подкожного клиренса за периоды времени от 0 до 72 ч [CLsc(0-72ч)] и от 0 до 336 ч [CLsc(0-336ч)].
8
Таблица 3. Индивидуальные фармакокинетические параметры природных лектинов омелы
Параметры, зарегистрированные после однократной подкожной дозы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг
Cmax (пг/мл)
tmax (ч)
AUC(0- tпоследнее)
AUC(tпоследнее- AUC0-∞
CLsc (0-72ч)
CLsc (0-336ч) CLsc(0-∞)
λz (1/ч) t ½ (ч)
(чапг/мл)
∞) (чапг/мл)
(чапг/мл)
(л/ч)
(л/ч)
(л/ч)
1
715
1,0
a
a
19083
b
19083
3084
1048
1048
2
2970
0,7
a
a
125405
a
a
428
159
a
3
3738
1,0
a
a
30141
a
a
1719
663
a
4
2916
1,0
a
a
3049
b
3049
6559
6559
6559
5
593
18,0
a
a
7161
b
7161
2792
2792
2792
6
660
1,0
a
a
20984
b
20984
2739
953
953
7
1028
2,0
a
a
4533
b
4533
4411
4411
4411
8
959
2,0
a
a
2552
a
2552
7836
7836
7836
9
368
10,0
a
a
66726
a
a
1510
299
a
10
447
2,0
a
a
58115
a
a
890
344
a
11
307
336,0
a
a
85601
a
a
1429
233
a
12
188
0,3
a
a
39024
a
a
2585
512
a
13
283
12,0
a
a
18971
a
a
4588
1054
a
14
222
1,5
a
a
1400
b
1400
14279
14279
14279
15
250
8,0
a
a
37028
a
a
2432
540
a
a
Определение невозможно вследствие нелинейного хода кривой.
b
Экстраполяция не требуется, поскольку концентрация в сыворотке снизилась до или ниже значения, измеренного до введения дозы, в период, истекший до взятия образца
крови.
9
Обсуждение
В этом исследовании впервые изучалась фармакокинетика природных ML в экстракте омелы с
высоким содержанием nML. Основные факты, установленные в ходе эксперимента, были
следующими:
1 Природные ML из экстрактов омелы могут быть обнаружены в сыворотке человека после
однократной подкожной инъекции.
2. В сыворотке человека nML обнаруживаются в течение значительно более длительного
времени, чем рекомбинантный рибосома-анактивирующий протеин типа II (rML), аналогичный
лектину омелы.
3. Фармакокинетика nML после подкожной инъекции варьирует в значительных пределах от
индивидуума к индивидууму.
Рис. 2. Средние арифметические значения температуры тела (измеряемой под языком)
после инъекции исследуемого лекарственного продукта (n=15).
По вертикали: Температура тела (измеряемая под языком) [°С].
По горизонтали: Время после подкожной инъекции abnobaVISCUM® Fraxini 20мг.
Из-за нелинейной кинетики период полувыведения nML не мог быть определен, поскольку
вычисление периода полувыведения не имеет смысла в случаях нелинейности профилей
концентрация-время. Поскольку период полувыведения rML составляет лишь 13 минут [12], а у
9/15 наших добровольцев nML обнаруживался даже спустя 2 недели после инъекции, то можно
прийти к выводу, что период обнаружения nML в сыворотке более длителен, несмотря на то,
что способ введения препарата в работе Schoeffski et al. [12] был внутривенный, а в нашем
исследовании – подкожный. В отличие от rML, nML гликозилирован и характеризуется другой
кинетикой ассоциации-диссоциации в сравнении с гликоконъюгатами. Кроме этого, В-цепи
rML и nML различаются по специфичности связывания с углеводами [17]. Это может быть
причиной различий в абсорбции и распределении в крови и по тканям, и может объяснить более
длительное время обнаружения nML в сыворотке крови. Цитотоксичность rML и nML для
культур клеточной линии острой лимфобластной Т-клеточной лимфомы человека (MOLT-4)
была схожей [17]. Однако в исследованиях, проведенных in vitro с использованием
одноядерных клеток периферийной крови человека, были найдены значительные различия
между rML и nML в жизнеспособности и иммуномодуляции клеток [18]. Значительный период
10
обнаружения nML в сыворотке крови, рассматривается как благоприятный фактор для терапии,
которому можно противопоставить большие индивидуальные различия в фармакокинетике
после подкожного введения.
Наблюдаемые значимые индивидуальные различия – хотя инъекции производились одним и
тем же опытным исследователем и в один и тот же квадрант живота – можно отнести за счет
различных картин связывания nML с углеводами и выхода из подкожной ткани. Наблюдаемая
нелинейная фармакокинетика больших молекул nML (50-63 кДа) могла бы подтвердить эту
гипотезу. Фармакокинетические исследования, проводившиеся на крысах в рамках изучения
токсичности субхронических доз abnobaVISCUM® Fraxini 20мг, также показали
индивидуальные различия между животными при соблюдении надлежащих норм лабораторной
практики [19]. Способность к перекрестным реакциям потенциально могла бы повлиять на
результаты теста, однако такие реакции маловероятны. Способность к перекрестным реакциям
с cbML может быть исключена вследствие его совершенно другой структуры, а также потому,
что сравнительные эксперименты с антителами к nML I-III и cbML, проведенные на здоровых
добровольцах и на онкобольных, показали отсутствие перекрестной реакционной способности
[10]. Так как nML I-III является сильным антигеном после парентерального введения – почти у
100 % индивидуумов, подвергавшихся воздействию nML, развивались антитела против nML – а
антитела против nML отсутствуют у индивидуумов, ранее не подвергавшихся воздействию на
препараты омелы [20], то перекрестная реакционная способность по отношению к таким
факторам окружения, как пища или вдыхаемые антигены окружающей среды, также могут быть
по большей части исключены. Метаболиты nML, насколько мы знаем, неизвестны.
Таблица 4. Лабораторные параметры безопасности: различия между показателями,
полученными до подкожного введения 1 мл abnobaVISCUM® Fraxini 20мг и спустя 14 ± 3
суток после (n=15).
Параметр
Гемоглобин (г/дл)
Число лейкоцитов /μл
Число тромбоцитов/μл
Креатинин (мг/дл)
Мочевая кислота (мг/дл)
Натрий (ммоль/л)
Калий (моль/л)
Кальций (ммоль/л)
Креатин киназа (МЕ/л)
Аланин-аминотрансфераза (МЕ/л)
Аспартат-аминотрансфераза (МЕ/л)
Лактат-дегидрогеназа (МЕ/л)
Гамма-глутамил-трансфераза МЕ/л)
Билирубин (мг/дл)
Альфа-амилаза (мгд/л)
Общий белок (г/дл)
Альбумин (г/дл)
С-реактивный белок (мг/дл)
Холестерин (мг/дл)
Триглицериды (мг/дл)
Глюкоза (мг/дл)
Нижний
квартиль
-0,9
70
58000
0
-0,3
-1
0,1
0
-39
1
-1
11
0
-0,3
-2
0
-0,1
0
-7
-19
-3
Медиана
Верхний
квартиль
Нижний предел, 95 %ный доверительный
интервал
-0,2
640
108000
0
0,3
1
0,3
0,1
1
5
2
22
3
-0,1
4
0,5
0,4
0,2
2
5
-1
0
1220
136000
0,1
0,9
2
0,7
0,2
19
20
4
27
8
0
11
0,8
0,6
0,5
14
52
4
-1,5
-990
3000
-0,1
-1,0
-5
-0,3
0
-80
-5
-6
-10
-2
-1,3
-5
-0,4
-0,4
0
-35
-62
-4
Верхний предел, 95 %ный доверительный
интервал
1,4
2680
18000
0,3
1,2
3
1,2
0,3
119
31
11
48
30
0,4
25
1,2
0,9
0,7
32
103
21
Мы выбрали подкожный путь введения, поскольку это распространенный способ введения
препаратов омелы, а также потому, что abnobaVISCUM® Fraxini 20 мг имеет
11
896
маркетинговое разрешение только для подкожных инъекций. Кроме этого, фармакокинетика
других молекул, таких как растворимый рекомбинантный рецептор интерлейкина-4 (sIL-4R)
[21] и эритропоэтин [22], размеры которых – 140 и 34 кДа, соответственно - сравнимы с
размерами nML, также исследовались после подкожных инъекций. Период полувыведения
мышиного sIL-4R после внутривенной инъекции составляло 2.3 ч, а после подкожной инъекции
– 6.2 ч. Кроме этого, уровень sIL-4R в крови был более низким после подкожной инъекции, но
биологическое действие было сравнимым. Подкожное введение эритропоэтина 48
добровольцам приводило к значительным индивидуальным различиям в Cmax: от 40 до 95 МЕ/л.
Период полувыведения был примерно в три раза большим, чем после внутривенного
применения. Несмотря на то, что правомерность сравнения результатов для этих веществ
эндогенной природы ограничена, экспериментальные факты – более длительный период
обнаружения и более выраженные индивидуальные различия – в принципе согласуются с
нашими результатами.
Первоначальные высокие дозы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг дают разнообразные побочные
эффекты, в особенности высокую температуру и связанные с этим симптомы, а также
выраженную местную реакцию. Вследствие этого, производитель рекомендует вводить более
низкие дозы в начале курса лечения. Однако в одной публикации вначале использовались даже
высокие дозы (две ампулы abnobaVISCUM® Fraxini 20мг), и они оказали благотворное
воздействие на 23 пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой [23]. Токсичность проявлялась
в виде высокой температуры, эритемы и боли на месте инъекции, как и у наших добровольцев.
Проявлений токсичности со стороны кроветворной системы не наблюдалось. Эти
опубликованные данные из клинического опыта дали нам основания считать, что одна ампула
abnobaVISCUM® Fraxini 20мг является безопасной для этого фармакокинетического
исследования, фазы I. Гипотезу о том, что процент активированных NK-клеток (CD54+/CD94+)
увеличивается после однократной инъекции abnobaVISCUM® Fraxini 20мг подтвердить не
удалось. Поскольку известно, что после подкожной инъекции abnobaVISCUM® Fraxini 20мг у
здоровых добровольцев nML абсорбируются в кровь, то вопросы фармакокинетики должны
также изучаться и в последующих клинических испытаниях по применению препаратов омелы
для онкобольных.
Благодарность. Это исследование было спонсировано компанией Abnoba GmbH, Pforzheim,
Германия.
Литература
1. Homeber MA, Bueschel G, Huber R, Linde K, Rostock M (2008) Mistletoe therapy in oncology.
Cochrane Database Syst Rev (2): CD003297
2. Ribereau-Gayon G, Jung ML, Frantz M, Anton R (1997) Modulation of cytotoxicity and
enhancement of cytokine release induced by Viscum album L. extracts or mistletoe lectins.
Anticancer Drugs 8 (Suppl 1):S3-S8
3. Rostock M, Huber R, Greiner T, Fritz P, Scheer R, Schueler J, Fiebig HH (2005) Anticancer activity
of a lectin-rich mistletoe extract injected intratumorally into human pancreatic cancer xenografts.
Anticancer Res 25(3B): 1969-1975
4. Huber R, Rostock M, Goedl R, Ludtke R, Urech K, Buck S, Klein R (2005) Mistletoe treatment
induces GM-CSF-and IL-5 production by PBMC and increases blood granulocyte-and eosinophil
counts: a placebo controlled randomized study in healthy subjects. Eur J Med Res 10(10):411 -418
5. Franz H (1985) Inhaltsstoffe der Mistel (Viscum album L.) als potentielle Arzneimittel.
Pharmazie 40:97-104
6. Franz H (1991) Mistletoe lectins (2). In: Franz H (ed) Advances in lectin research. Springer Berlin,
pp 33-50
12
7. Franz H, Friemel H, Buchwald S, Plantikow A, Kopp J, Korner IJ (1990) The A chain of lectin 1
from European mistletoe (Viscum album) induces interleukin-I and interleukin-II in human mononuclear cells. In: Kocourek J, Freed DLJ (eds) Lectins: biology, biochemistry, clinical biochemistry,
Vol. 7. Sigma Chemical Company, St. Louis, pp 247-250
8. Stirpe F, Barbieri L, Batteli MG, Soria M, Lappi DA (1992) Ribosome-inactivating proteins from
plants: present status and fiiture prospects. Bio Technology 10:405-412
9. Bussing A (2000) Biological and pharmacological properties of Viscum album L. In: Bussing A (ed)
Mistletoe, the Genus Viscum. Amsterdam
10. Klein R, Franz M, Wacker R, Classen K, Scheer R, Von Laue HB, Stoeva S, Voelter W (2004)
Demonstration of antibodies to the chitin-binding mistletoe lectin (cbML) in tumor patients before and
during therapy with an aqueous mistletoe extract. Eur J Med Res 9(6):316-322
11. Adler M, Langer M, Witthohn K, Eck J, Blohm D, Niemeyer CM (2003) Detection of rViscumin
in plasma samples by immuno-PCR. Biochem Biophys Res Comm 300:757-763
12. Schoffski P, Riggert S, Fumoleau P, Campone M, Bolte O, Marreaud S, Lacombe D, Baron B,
Herold M, Zwierzina H, Wilhelm-Ogunbiyi K, Lentzen H, Twelves С (2004) Phase I trial of
intravenous aviscumine (rViscumin) in patients with solid tumors: a study of the European
Organization for Research of Cancer New Drug Development Group. Ann Oncol 15:1816-1824
13. Krause SW, Gastpar R, Andreesen R, Gross C, Ullrich H, Thonigs G, Pfister K, Multhoff G (2004)
Treatment of colon and lung cancer patients with ex vivo heat shock protein 70-peptide-activated,
autologous natural killer cells: a clinical phase I trial. Clin Cancer Res 10(11):3699-3707
14. Samtleben R, Kiefer M, Luther P (1985) Characterization of the different lectins from Viscum
album L. (mistletoe) and their structural relationships with the agglutinins from Abrus precaratorius
and Ricinus communis. In: Kocourek J, Freed DLJ (eds) Lectins: biology, biochemistry, clinical
biochemistry Vol. 4. Sigma Chemical Company, St. Louis, pp 617-626
15. Franz M, Volkner S, Wacker R, Jager S, Scheer R, Stoeva S, Lehmann R, Tsitsilonis R, Voelter W
(2005) Isolation and quantification of the chitin-binding mistletoe lectins (cbMLs) from mistletoe
extracts and the validation of this method. In: Scheer R, Bauer R, Becker H, Fintelmann V, Kemper
FH, Schilcher H (eds) Fortschritte in der Misteltherapie, KVC Verlag, pp 69-81
16. Adler M, Wacker R, Niemeyer CM (2008) Sensitivity by combination: immuno-PCR and related
technologies. Analyst 133(6):702-718
17. Eck J, Langer M, Meckel B, Witthohn K, Zinke H, Lentzen H (1999) Characterization of
recombinant and plant-derived mistletoe lectin and their B-chains. Eur J Biochem 265(2): 788-797
18. Elsiisser-Beile U, Voss M, Schuhle R, Wetterauer U (2000) Biological effects of natural and
recombinant mistletoe lectin and an aqueous mistletoe extract on human monocytes and lymphocytes
in vitro. J Clin Lab Anal 14(6):255-259
19. ADVINUS Therapeutics Private Limited (2009) Mistletoe extract Abnoba Viscum Fraxini 20 mg:
90 day study in Sprague-Dawley rats by subcutaneous route with toxicokinetics and 4 week recovery
period. ADVINUS report-No. G5087-90R-SC, Bangalore, India
20. Klein R, Classen K, Berg PA, Ludtke R, Werner M, Huber R (2002) In vivo-induction of
antibodies to mistletoe lectin-1 and viscotoxin by exposure to aqueous mistletoe extracts: a randomised
double-blinded placebo controlled phase I study in healthy individuals. Eur J Med Res 7(4): 155-163
21. Jacobs CA, Lynch DH, Roux ER, Miller R, Davis B, Widmer MB, Wignall J, VandenBos T, Park
LS, Beckmann MP (1991) Characterization and pharmacokinetic parameters of recombinant soluble
interieukin-4 receptor. Blood 77(11):2396-2403
22. Hayashi N, Kinoshita H, Yukawa E, Higuchi S (1998) Pharmacokinetic analysis of subcutaneous
erythropoietin administration with nonlinear mixed effect model including endogenous production.
Br J Clin Pharmacol 46(1):11-19
23. Mabed M, El-Helw L, Shamaa S (2004) Phase II study of viscum fraxini-2 in patients with
advanced hepatocellular carcinoma. Br J Cancer 90(l):65-69
13