экологический полиморфизм и территориальная значимость

На правах рукописи
ШЕСТОПАЛОВ
АЛЕКСАНДР МИХАЙЛОВИЧ
ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ
И ТЕРРИТОРИАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
РАЗЛИЧНЫХ ВИРУСНЫХ ПАТОГЕНОВ
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией
и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Новосибирск - 2010
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и
Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный
центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития
России.
Научный консультант:
доктор ветеринарных наук, профессор,
академик РАСХН
Донченко Александр Семенович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Ильичев Александр Алексеевич,
доктор ветеринарных наук,
старший научный сотрудник
Ирза Виктор Николаевич,
доктор биологических наук, профессор
Глотова Татьяна Ивановна
Ведущая организация:
ФГУН Омский научно-исследовательский институт
природноочаговых инфекций Роспотребнадзора
Защита состоится « 16 » ноября 2010 г. в «________» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск-1, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8,
тел/факс (383) 348-44-62.
С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной
библиотеке Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «___» _______________2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Стеблева Г.М.
2
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Изучение инфекционной патологии животных и человека на
популяционном уровне неизбежно связано с эпизоотическим и/или эпидемическим процессами. Оно сводится к изучению процесса взаимодействия популяций паразита и хозяина, механизмов функционирования систем паразит-хозяин или паразитарных систем.
Устойчивость паразитарных систем очень велика. Их полная ликвидация весьма
проблематична и сомнительна (В.Ю. Литвин, 1986; С.И. Джупина, 1991; Г.П. Сомов,
1994; О.В. Бухарин, 1997; А.С. Донченко, 1998; В.В. Макаров, 1998 и др.).
Основными факторами, обеспечивающими высокую устойчивость паразитарных
систем (О.В. Бухарин с соавт., 1997), являются их иерархическая организация, гибкость,
гетерогенность популяций паразита и хозяина, резервация паразита, многочисленность
хозяев и полигостальность паразита, неоднозначная зависимость паразита от хозяев.
В.Д. Беляковым с соавт. (1964-1994 гг.) разработана теория саморегуляции паразитарных систем и сформулировано одно из понятий эпизоотического процесса – процесс
взаимодействия популяции возбудителя-паразита и популяции животных, проявляющийся при определенных социальных и (или) природных условиях единичными и (или) множественными заболеваниями животных, а также бессимптомными формами инфекций.
Многим инфекционным болезням свойственна природная очаговость (Е.Н. Павловский, 1960; Э.И. Коренберг, 1979; В.Ю. Литвин, 2003; Э.И. Коренберг, 2010). Поэтому в
практической противоэпизоотической и противоэпидемической работе применительно к
природно-очаговым инфекциям важно знать:
– механизмы формирования и функционирования эпизоотических очагов, возможность расширения границ, взаимосвязь с другими территориями, популяциями животных и людей;
– способность конкретных природно-очаговых патогенов вызывать болезнь у животных и людей, механизмы формирования такой способности.
В.В. Макаров с соавт. (2005), анализируя эпизоотический процесс, вызываемый
природно-очаговыми патогенами, важную роль отводят их экологическому полиморфизму, который, как известно, проявляется как генотипическая и фенотипическая неоднородность конкретного вида в той или иной экосистеме и имеет важное эволюционное
значение для выживаемости и распространения живых организмов, включая вирусные и
бактериальные патогены, в новых экологических условиях.
В этой связи важное значение имеет изучение экологического полиморфизма и потенциала территориального распространения актуальных в эпизоотологическом, эпидемиологическом и экономическом отношении вирусных патогенов способных формировать природные очаги на той или иной территории.
Цель и задачи исследований.
Цель: обосновать и изучить эволюционные принципы экологического полиморфизма и территориального распространения некоторых актуальных в эпизоотологическом, эпидемиологическом и экономическом отношении вирусных патогенов.
Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:
1. Теоретически обосновать эволюционные принципы экологического полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов.
2. Изучить эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики вируса бешенства с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и
территориальной значимости в условиях юга Западной Сибири.
3
3. Изучить эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики вируса Западного Нила с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и территориальной значимости в условиях юга Западной Сибири.
4. Изучить эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики вируса гриппа птиц с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и
территориальной значимости в условиях юга Западной Сибири.
Научная новизна. Теоретически и практически обосновано, что основой критериев, определяющих степень эпизоотологической, эпидемиологической и экономической
значимости тех или иных патогенов для конкретного региона, является их способность
в резервационном и/или эпизоотическом вариантах циркулировать в природных экосистемах у максимума хозяев, распространяться на другие территории с реальными возможностями заболеваемости и гибели диких животных и птиц, «выхода» на сельскохозяйственных, домашних животных (птиц) и человека c их заболеваемостью и гибелью.
На территории юга Западной Сибири подтверждена ведущая роль диких плотоядных, прежде всего лисиц, в качестве основного резервуара вируса бешенства, обеспечивающих периодичность эпизоотий и служащих основным источником распространения
возбудителя болезни за пределы природных эпизоотических очагов.
Молекулярно-генетическими методами показана возможность циркуляции вируса
бешенства внутри конкретной популяции одного вида животных, «взаимопроникновения» из популяции одного вида животных в популяцию другого вида как внутри природного очага, так и за его пределами, в том числе без манифестации болезни.
Установлена различная эпизоотическая и/или эпидемическая значимость основных
резервуаров бешенства в зависимости от принимаемых на конкретных территориях антирабических мер (в частности, иммунизации).
Показано наличие в лесостепной и степной зонах юга Западной Сибири природных
очагов вируса Западного Нила (ВЗН) с различной степенью активности, во многом зависящей от численности комаров-переносчиков.
Молекулярно-генетическими методами доказана, наряду с оригинальностью сибирских вариантов ВЗН в результате адаптации к местной экосистеме, их высокая гомологичность (более 97-99% гомологии нуклеотидной последовательности) с высокопатогенными для человека штаммами этого вируса, выделенного ранее в Волгоградской области.
Показана важная роль территории юга Западной Сибири в распространении вируса
гриппа типа А в популяциях диких птиц, в возникновении и развитии эпизоотий среди
домашних птиц на различных территориях РФ.
У диких птиц, гнездующихся летом на юге Западной Сибири, установлено наличие
различных субтипов вируса гриппа типа А, имеющих филогенетическое родство с вирусами гриппа, выделенными у диких птиц в Европе и Южной Азии.
В период эпизоотии вируса гриппа H5N1 в 2005 году среди диких и домашних
птиц на территории юга Западной Сибири, а также в постэпизоотический период (20062007 гг.) отмечена циркуляция вирулентных вариантов вируса гриппа субтипа H5N1 c
филогенетическим родством с вирусами, выделенными в Северном Китае в мае
2005 года (озеро Цинхай). Выделенные в этот период вирусы гриппа H5N1 обладали
различной степенью патогенности для мышей.
Получены 2 патента РФ «Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса бешенства в образцах» (№ 2340673) и «Штамм вируса гриппа птиц А/
Goose / Krasnozerskoye/ 627/ 05 H5N1 субтипа для изучения биологии вируса гриппа,
4
лечебной и
(№ 2366709).
профилактической
эффективности
противовирусных
препаратов»
Теоретическая и практическая значимость. Использование доказанных в настоящей работе эволюционных принципов экологического полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов в процессе разработки оптимальных систем
противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий позволит, при их практической реализации, эффективно купировать развитие инфекций в природных очагах и
обеспечить защиту от них сельскохозяйственных, домашних животных и людей.
Внедрение полученных результатов. Созданная коллекция из 37 штаммов вируса
гриппа типа А, в том числе из 16 высокопатогенного H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2009 гг., принята на патентное депонирование в Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
По результатам работы 386 нуклеотидных последовательностей полных генов вируса бешенства, вируса Западного Нила и вируса гриппа типа А зарегистрированы в
международной базе данных GenBank и могут в дальнейшем служить основой для конструирования праймеров и филогенетических исследований этих вирусов.
Кроме того, результаты, полученные при выполнении настоящей работы, были использованы для подготовки методических указаний «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса
гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей», утвержденных Федеральной службой по надзору
в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 09.11.2006 г; методических
рекомендаций «Организация мониторинга заносов и распространения гриппа птиц в
природных условиях на территории Российской Федерации», утвержденных Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
26.12.2008; «Эпизоотологический мониторинг гриппа типа А среди диких птиц в местах
их обитания на территории полуострова Таймыр» (прот. № 5 от 28.05.2008 г.), «Система
противоэпизоотических и профилактических мероприятий при бешенстве в Новосибирской области» (прот. №4 от 14.10.2008 г.) и «Профилактика заражения представителей
семейства кошачьих вирусом А/H5N1 в период эпизоотии гриппа птиц» (прот. № 5 от
30.12.2009 г.), утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе
Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на 68 Российских и международных конференциях, в том числе на: Международной научнопроизводственной конференции «Современные проблемы охотничьего собаководства»
(Киров, 2004); III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008); Бангкокской международной конференции по птичьему гриппу «Интеграция от знаний к управлению» (Бангкок, Таиланд, 2008); Третьей европейской конференции по гриппу (Виламора, Португалия, 2008); X международном симпозиуме по респираторным инфекциям (Сингапур, 2008); 3-ем Международном Симпозиуме по вопросам Интегративной Зоологии (Пекин, Китай, 2009); Первом всемирном
конгрессе по вакцине WCV-2008 (Гуанджоу, Китай, 2008); Международной научнопрактической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в
5
противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009); 7-ом Международном Симпозиуме по птичьему гриппу: Птичий грипп у домашних и диких птиц
(Афины, Джорджия, США, 2009); 8-ом Азиатско-Тихоокеанском конгрессе медицинской вирусологии (САР Гонконг, Китай, 2009); Международной конференции «Зоонозные инфекции и туризм» (Улан-Батор, Монголия, 2009).
Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работы была
опубликована 61 научная статья, 35 из которых опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК для соискания степени доктора наук, получено 2 патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 306 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы, содержащий 475 работ отечественных и
зарубежных авторов, приложения. Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и 32 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Теоретическое обоснование эволюционных принципов экологического полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов.
2. Результаты изучения эколого-эпизоотологических и молекулярно-биологических
свойств некоторых актуальных вирусных патогенов с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и территориальной значимости (в условиях юга Западной Сибири).
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований
Работа была выполнена в 1998-2010 годах в Государственном научном учреждении
Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный
центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.
Для лабораторной диагностики и выделения вируса бешенства использовали образцы головного мозга диких, домашних и сельскохозяйственных животных. Для диагностики и выделения вируса Западного Нила использовали комаров, клещей, органы
птиц и млекопитающих, а также сыворотку крови и кровь от больных людей. Вирус
гриппа диагностировали и выделяли из органов и клоакальных смывов диких и домашних птиц.
Для сбора материала было организованно и проведено более 120 экспедиционных
выездов в различные регионы юга Западной Сибири.
Исследования на наличие вируса бешенства проводили согласно ГОСТу 26075-84.
Выборочные пробы материала тестировали в ОТ-ПЦР с использованием праймеров на
районы генов нуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства.
Все пробы, исследуемые на вирус Западного Нила, тестировали методом иммуноферментного анализа и ОТ-ПЦР. Для 8 образцов у полученных ПЦР–продуктов были
определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности фрагмента гена белка Е.
6
Все работы по выделению и идентификации вируса гриппа проводились в соответствии с рекомендациями ВОЗ и Международных Центров, сотрудничающих с ВОЗ по
гриппу: (The National Training Course on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. –
Harbin, China (May 20 – 26, 2001). – Harbin, 2001 – 79 p.; WHO Manual on Animal Influenza
Diagnosis and Surveillance World Health Organization WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1.)
Определение нуклеотидной последовательности выделенных ПЦР фрагментов
вирусов проводили на «Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System» («Beckman Coulter, Inc.»). Нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности были
анализированы с использованием программы MEGA (PSU, США) и DNASTAR
(DNAStar Inc., США).
Для статистической обработки данных были использованы общепринятые методы
описательной статистики с использованием пакета программ для статобработки Microsoft
Excel (Microsoft Office Professional Edition, 2007) и STATISTICA 6,0.
Личный вклад автора в исследования, вошедшие в диссертацию, был определяющим. Он состоял в постановке задач, участии в полевых работах и планировании экспериментов. Автор принимал участие в экспериментах, обработке и обсуждении экспериментальных данных, написании статей. Часть исследований была выполнена совместно
с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» А.В. Зайковской, Ю.В. Кононовой, Ю.В. Разумовой и К.А. Шаршовым, и сотрудником ГНУ ИЭВСиДВ Ю.Г.Юшковым.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Теоретическое обоснование эволюционных принципов экологического
полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов
Сущность эпизоотического и эпидемического процессов, как известно, заключается в механизмах функционирования систем паразит – хозяин или паразитарных систем
(И.А. Бакулов, 1986, 1991, 1998; В.Д. Беляков с соавт., 1987; С.И. Джупина, 1994, 2004;
В.А. Бриттов, 1998; С.К. Димов, 1998; В.В. Макаров, 1998; Д.Д. Новак, 1998;
В.П. Урбан, 1998; Б.Л. Черкасский, 2003 и др.).
Структурно паразитарные системы могут быть двучленными (возбудитель – носитель) и трехчленными (возбудитель – переносчик – носитель), простыми и сложными в
зависимости от количества носителей и переносчиков (по одному и более).
Предложено различать три типа паразитарных систем, каждый из которых отражает определенную категорию паразитизма микроорганизмов у наземных животных.
1 – замкнутая паразитарная система, характерная для облигатных паразитов, общее
свойство которых – обязательная связь с организмом хозяина (хозяев) и принципиальная невозможность существования вне наземной паразитарной системы (во «внешней
среде»);
2 – полузамкнутая паразитарная система связана со спецификой, заключающейся в
сочетании «замкнутой» схемы циркуляции возбудителя внутри паразитарной системы с
«открытой» схемой циркуляции, предполагающей выход из паразитического цикла, и
передачу паразита новому хозяину нетрансмиссивными путями;
3 – открытая паразитарная система, свойственная только случайным паразитам
теплокровных, поскольку они являются нормальными обитателями почв и водоемов,
причем объекты внешней среды служат для них основной средой обитания.
Основными факторами, обеспечивающими высокую устойчивость паразитарных
систем (О.В. Бухарин с соавт., 1997) являются:
7
1. Иерархическая организация паразитарных систем. Различают три уровня организации паразитарных систем:
а) организменный – элементарная паразитарная система, состоящая из организмов
паразита (паразитов) и хозяина (инфекционный процесс);
б) биоценотический – паразитарная система надорганизменного уровня, в которой
межпопуляционные взаимодействия паразита и хозяина представлены эпидемическим,
эпизоотическим или эпифитотическим процессами;
в) биостроматический – паразитарная система надорганизменного уровня, в которой связи предыдущего (биоценотичекого) уровня интегрируются на уровне биосферы,
образуя пандемический, панзоотический или панфитотический процессы.
2. Гибкость паразитарных систем в структурном отношении обеспечивается
экологической пластичностью паразита, его способностью к использованию разных хозяев и замещению одного хозяина другим при изменении по каким-то причинам их видового состава.
3. Гетерогенность популяций паразита и хозяина – важнейшая движущая сила
эпизоотического и эпидемического процессов.
Гетерогенность популяции паразита, в частности, по признакам вирулентности и
антигенной структуры, обеспечивает наиболее полную его адаптацию к различным
условиям в организме хозяев, а по температурной устойчивости, питательным потребностям и пр. – к резко отличным от организма абиотическим условиям внешней среды.
Не менее важна и гетерогенность популяции хозяина, в частности, по его чувствительности к возбудителю.
Гетерогенность обеих популяций расширяет возможности, как циркуляции возбудителя, так и его сохранения в межэпидемические (межэпизоотические) периоды, что
имеет важное значение для устойчивости паразитарных систем.
4. Резервация паразита обеспечивает сохранение паразитарной системы в условиях, когда активная циркуляция возбудителя по каким-то причинам затруднена или временно исключена.
5. Многочисленность хозяев и полигостальность паразита обеспечивает устойчивость паразитарных систем за счет интенсивной циркуляции возбудителя в условиях
высокой численности и разнообразия хозяев в различных экосистемах.
6. Неоднозначная зависимость паразита от хозяев, наиболее выраженная в открытых паразитарных системах, ограничивает влияние хозяина на паразита при межпопуляционных взаимодействиях. В то же время, абиотические и биотические условия
среды нередко поддерживают устойчивое существование паразита в почвенных и водных экосистемах.
Поэтому ликвидация возбудителей зоонозных и сапронозных инфекций неизмеримо сложнее, нежели антропонозных, требует искоренения всех возможных резервуаров
возбудителя и блокирования разных каналов его циркуляции в очаге. Очевидно, что такая задача не выполнима. Реально лишь предотвращение заболеваемости животных и
людей.
В этой связи весьма актуально знать механизмы регуляции паразитарных систем.
Регуляция паразитарных систем в широком смысле может быть двух типов: внутренняя (саморегуляция) и внешняя (регуляция факторами, внешними по отношению к
паразитарной системе), хотя такое разделение носит весьма условный характер.
В.Д. Беляков с соавт. (1964-1994 гг.) в теории саморегуляции паразитарных систем саморегулирующие механизмы обосновали четырьмя положениями:
– генотипическая и фенотипическая гетерогенность популяций паразита и хозяина;
8
– взаимообусловленная изменчивость биологических свойств взаимодействующих
популяций;
– фазовая самоперестройка популяций паразита, определяющая неравномерность
развития эпидемического и/или эпизоотического процессов;
– регулирующая роль социальных и природных условий в фазовых преобразованиях эпидемического и/или эпизоотического процессов.
Согласно этой теории, искусственно вмешиваясь в механизмы внутренней регуляции эпидемического и/или эпизоотического процессов, можно добиться эффективного
управления ими. При этом важно, чтобы такие вмешательства носили оптимальный характер.
Общеизвестным является экологический феномен природной очаговости, заключающийся в приуроченности различных заразных болезней к определенным биогеоценотическим условиям (природные очаги), где возбудители циркулируют в природных
резервуарах без участия сельскохозяйственных и домашних животных, и людей, но могут передаваться им разными путями (Е.Н. Павловский, 1960; Э.И. Коренберг, 1979;
В.Ю. Литвин, 2003; Э.И. Коренберг, 2010).
С позиций природной очаговости весьма актуальны предложенные В.В. Макаровым (1998, 2005) 9 эволюционно-экологических аксиом эпизоотологии:
1. Эпизоотический процесс непрерывен; неизбежны встречи паразита с хозяином
для поддержания его биологического вида и жизненного цикла.
2. Возбудители и хозяева существуют в виде популяций с подчинением их взаимодействий биоценотическим закономерностям; их микроэволюция как динамика живых
систем происходит под влиянием общих для всего живого движущих сил.
3. Популяция восприимчивого хозяина служит средой обитания возбудителяпаразита, а восприимчивость организма определяется как его способность функционировать на популяционном (видовом) уровне в качестве биологически узнаваемого соактанта соответствующей паразитарной системы.
4. Популяции возбудителей генетически гетерогенны за счет случайного и ненаправленного процесса возникновения мутации и рекомбинаций; новые генотипы, случайно оказавшиеся приспособительными и имеющими селективные преимущества, могут подвергаться отбору.
5. В процессе эволюции возбудителей выработано большое число адаптаций.
К ним относятся: приспособления к образу жизни хозяина, механизмы накопления и
рассеивания во внешней среде, переход на новых хозяев по путям экологических, естественных связей последних с внешним миром в процессе реализации физиологических
функций (дыхание, пищеварение, размножение), способность к избыточной репродукции.
6. В обеспечении жизнестойкости биосистемы возбудитель-хозяин на популяционном уровне участвуют общие для всего живого механизмы приспособительного балансирования; такие системы динамически устойчивы.
7. Явления инфекционной патологии, как частный случай паразитизма, имеют биологическую природу и ни в коем случае не могут быть рассмотрены как антагонистические, как межвидовая борьба за существование. Это чрезвычайно развитое естественное
явление, сохраняющееся в результате отбора симбиотическое взаимодействие эволюционно приспособленных популяций возбудителей и восприимчивых организмов с вовлечением дополнительных компонентов системы, совместно регулирующих свои отношения с изменяющейся окружающей средой.
8. Эпизоотический процесс – это реальное экологическое явление с материальной
основой в виде взаимодействующих популяций микро- и макроорганизмов. Сущность
9
эпизоотического процесса заключается в экологии возбудителя в популяции восприимчивых организмов в пределах соответствующей паразитарной системы.
9. Понятие «окружающая среда» в ее экологической сущности предусматривает
размерную и временную детерминированность инфекционных паразитарных систем как
важнейшее условие их саморегуляции.
Нами предлагаются критерии, определяющие степень эпизоотологической, эпидемиологической и экономической значимости тех или иных вирусных патогенов для
конкретного региона (природно-географической зоны).
Вариант 1.
При циркуляции в природных экосистемах изучаемого региона резервационных и/или эпизоотических вариантов вирусов:
– способность циркулировать в резервационном и/или эпизоотическом вариантах у
максимума хозяев в природных экосистемах;
– способность распространяться в резервационном и/или эпизоотическом вариантах на другие территории у максимума хозяев;
– возможность вызывать заболеваемость и гибель хозяина в природных экосистемах;
– возможность «выхода» на сельскохозяйственных и домашних животных (птиц), а
также человека;
– возможность циркуляции у сельскохозяйственных и домашних животных (птиц),
а также человека;
– возможность вызывать заболеваемость и гибель домашних животных (птиц) в результате их прямого или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами;
– возможность вызывать заболеваемость и гибель людей в результате их прямого
или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами.
Вариант 2.
При отсутствии циркуляции на изучаемой территории в природных экосистемах резервационных и/или эпизоотических вариантов вирусов:
– возможность заноса резервационных и/или эпизоотических вариантов вирусов
извне в природные экосистемы изучаемого региона;
– способность распространиться в резервационном и/или эпизоотическом вариантах на другие территории у максимума хозяев в природных экосистемах;
– реальная возможность вызывать заболеваемость и гибель животных (птиц) в природных экосистемах;
– возможность «выхода» на сельскохозяйственных и домашних животных (птиц), а
также человека;
– возможность циркуляции у сельскохозяйственных и домашних животных (птиц),
а также человека;
– возможность вызывать заболеваемость и гибель домашних животных (птиц) в результате их прямого или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами;
– возможность вызывать заболеваемость и гибель людей в результате их прямого
или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами.
По этим критериям для юга Западной Сибири актуальными можно признать вирусы бешенства, Западного Нила и гриппа птиц.
10
2.2.2. Эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики
актуальных вирусных патогенов с эволюционных позиций их экологического
полиморфизма и территориальной значимости (в условиях юга Западной Сибири)
2.2.2.1. Вирус бешенства
Эколого-эпизоотологические характеристики
Согласно официальной статистике, бешенство среди животных разных видов в период с 1997 по 2009 год было зарегистрировано более чем в 2/3 субъектов РФ.
Эпизоотическая ситуация бешенства на юге Западной Сибири всегда определялась
функционированием Западно-Сибирско-Казахстанского природного очага с циркуляцией в нем возбудителя среди диких животных и активным вовлечением в эпизоотический
процесс домашних и сельскохозяйственных животных.
В Западной Сибири в восьмидесятые годы в динамике проявления эпизоотического
процесса бешенства отмечали достаточно резкие колебания. Наивысший подъем эпизоотии наблюдали в 1987-1988 годах. Период до 1997 года характеризовался депрессией
очага.
Эпизоотическая ситуация бешенства резко осложнилась в конце 1997 года. В течение 1998 года в Новосибирской области бешенство среди диких плотоядных было зарегистрировано в 90 населенных пунктах. В 1999 году – среди диких плотоядных было зарегистрировано в 22 пунктах, среди сельскохозяйственных животных – в 12 и среди домашних животных – в 8 пунктах.
В 1999 году, по сравнению с 1998 годом, произошло снижение числа неблагополучных пунктов по бешенству животных, в том числе и среди диких плотоядных. Если в
1998 году в целом по области было зарегистрировано 162 неблагополучных пункта по
бешенству, то в 1999 году – только 45 пунктов. Следует отметить, что в Новосибирской
области в 1998-99 годах практически во всех неблагополучных районах была проведена
пероральная иммунизация против бешенства диких плотоядных (вакцины "Лисвульпен"
и "Синраб").
По итогам 2000 года эпизоотическая ситуация по бешенству в Новосибирской области продолжала улучшаться: было зарегистрировано всего 10 неблагополучных пунктов в 4 районах.
Однако с 2001 года эпизоотическая ситуация обострилась. В 2001 году было зарегистрировано уже 34 неблагополучных пункта в 7 районах, в 2002 году – 163 неблагополучных пункта в 25 районах. В 2003 году в области было зарегистрировано 87 неблагополучных по бешенству пунктов (в 23 районах), в 2004 – 130 (в 27 районах), в 2005 –
49 (в 15 районах), в 2006 – 70 (в 17 районах) и в 2007 – 119 (в 20 районах). В 2008 и 2009
годах эпизоотическая ситуация бешенства оставалась напряженной. Было зарегистрировано 48 неблагополучных по бешенству пунктов.
Таким образом, в период 1997–2009 гг. в Новосибирской области наблюдалось
волнообразное изменение уровня заболеваемости с преобладанием бешенства диких
животных, но, в целом, сложившуюся ситуацию можно оценить как закономерное проявление эпизоотии, характеризующееся 3–5 летней цикличностью.
Периодичность проявления бешенства, в первую очередь, связана с экологией животных – носителей вируса. Биологический цикл их активности и особенности мест
обитания обусловливают сезонные колебания заболеваемости бешенством среди животных.
11
Контакт с больными дикими животными является причиной заражения домашних
и сельскохозяйственных животных. Вспышкам бешенства в животноводческих хозяйствах часто предшествовали случаи появления в этих пунктах диких лисиц.
В Новосибирской области в период 1997 – 2009 годов в эпизоотический процесс, наряду
с дикими, были вовлечены домашние и сельскохозяйственных животные (рис. 1).
Дикие лисы;
50,17%
Др. дикие
животные
0,34%
Волки
0,08%
Сельскохозяйств
енные животные;
27,37%
Собаки и кошки;
22,03%
Рисунок 1 – Распределение заболевших бешенством сельскохозяйственных и диких
животных, собак и кошек за 1997-2009 годы по Новосибирской области.
Анализ эпизоотических данных показал, что на долю городского бешенства приходится 18,5% от общего количества случаев болезни, зарегистрированных в Новосибирской области за изучаемый период. В городе бешенство было диагностировано у кошек
и собак. Особо следует отметить значительный удельный вес бешенства кошек в 1998 –
1999 годы. На долю животных этого вида пришлось 11,15% от общего количества случаев бешенства животных за изучаемый период. В настоящее время все домашние животные подлежат обязательной вакцинации против бешенства. Возможно, благодаря таким мероприятиям (увеличение объемов вакцинации в три раза), удалось добиться заметного снижения удельного веса бешенства среди домашних животных.
Спонтанная зараженность вирусом бешенства лисиц без видимых признаков
болезни на стационарно неблагополучной территории
Показатель спонтанной зараженности лисиц в Западной Сибири в разные периоды
колебался от 0,0 до 5,6%. В связи с этим особый интерес для нас представляло исследование популяции диких лисиц, которые являются основным резервуаром вируса бешенства в природе, на наличие возбудителя данной болезни. Было проведено исследование
302 образцов головного мозга лисиц, добытых на территории Алтайского края. Спонтанная зараженность диких лисиц, добытых на стационарно неблагополучной по бешенству территории, была подтверждена различными диагностическими методами более чем у 2,3% особей из числа обследованных.
12
Изучение носительства лиссавирусов у летучих мышей,
обитающих на юге Западной Сибири
Исследованию на носительство лиссавирусов были подвергнуты рукокрылые, обитающие как в горной, так и в степной части юго-востока Западной Сибири. Всего было
собрано и обследовано 288 проб от летучих мышей 9 видов.
При исследовании материала методом ОТ-ПЦР в 34 образцах (18,27%) удалось выявить фрагменты РНК, специфичные для лиссавирусов. У трех полученных ПЦР–
продуктов были определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности. Филогенетический анализ показал, что все выделенные фрагменты относятся
к генотипу 1 лиссовирусов, что характерно для летучих мышей Американского континента. В Евразии от летучих мышей в основном выделяют European bat lyssavirus 1
(EBLV1) и 2 (EBLV2). Что касается Сибири, ранее здесь регистрировались лишь единичные случаи изоляции лиссавирусов от этих животных без изучения генотипа.
Используя материал, положительный в ПЦР-анализе, было проведено 3 пассажа на
беспородных белых мышах. На 5-21 день после заражения у 1–2 мышей из группы развивалось заболевание с паралитическими проявлениями. Однако все эти проявления с
каждым пассажем были выражены слабее и исчезали к третьему пассажу. Выделить
изоляты вируса бешенства от летучих мышей нам не удалось.
Таким образом, нами было показано наличие РНК лиссавирусов генотипа 1 у летучих мышей, обитающих в Новосибирской области и Алтайском крае.
Молекулярно-биологические характеристики вируса бешенства
Изучение молекулярно-генетических характеристик лиссавирусов, циркулирующих
у различных видов животных на территории юга Западной Сибири,
с позиций их эпизоотологической значимости
Для молекулярно-генетических исследований были выбраны образцы материала от
различных видов диких и домашних животных, полученные в период 2002-2008 гг., а
также от человека, умершего от бешенства. Всего с помощью ПЦР было исследовано
166 проб.
После подтверждения диагноза методом ОТ-ПЦР, для 31 пробы были определены
нуклеотидные последовательности гена, кодирующего NP белок, и выведены аминокислотные последовательности. При филогенетическом анализе было выявлено, что все вирусы бешенства, выделенные нами на юге Западной Сибири, группируются в одну филогенетическую группу (рис. 2), но полученные изоляты можно разделить на два основных кластера. Первый из них формируют лиссавирусы от летучих мышей, барсука, лисицы и человека (BAT-YN1, BAT-BN1, BAT-BА, BAT-PА, BADG-4983, MAN-44, FOX3728) и фиксированные штаммы вирусов бешенства CVS и HEP-Flury. Второй кластер
представлен изолятами вирусов бешенства, выделенными в 2004 году от трех собак,
лошади и быка (DOG-33650, DOG-35093, DOG-49142, HOR-19549, COW-38442). Эти
два кластера имеют достоверный индекс поддержки. Формально, можно сгруппировать
и третий кластер, в который можно отнести вирусы, выделенные от животных, заболевание которых произошло в 2003 и 2008 годах. Но третий кластер не имеет достоверного индекса поддержки. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей
фрагмента гена нуклеопротеина со штаммами, представленными в базе данных
13
SHEEP-2963/08
FOX-2961/08
AY352463
DOG-14846/08
CAT-41979//03
FOX-51093/03
AY352472
AY352473
AY352489
AY352490
RAT-24598/08
FOX-7671/08
FOX-12953/08
FOX-41135/03
AY352466
AY352464
AY352491
AY352465
AY352483
AF045664
AY352492
AY352456
AY352474
AY352479
AY352469
91 AY352470
AY352481
AY352482
AY352467
COW-2502/03
AY352471
AY352468
FOX-52099/03
COW-2962/08
COW-7670/08
FOX-10967/08
FOX-18347/08
FOX-8709/08
FOX-10940/08
FOX-49355/03
DOG-33650/04
COW-38442/04
HOR-19549/04
90
DOG-35093/04
DOG-49142/04
FOX-1153/03
Nishigahara
98 Ni-CE
Eth2003
SRV9
HEP-Flury
RAVRABCVSN
FOX-3728/02
98
BAT-YN1/01
BADG-4983/02
76
BAT-BN1/01
MAN-44/01
BAT-BA/01
71
AY352458
99
2 кластер
1 кластер
BAT-PA/01
AY352496
0.01
Рисунок 2 – Филогенетическое дерево, построенное на основании фрагмента гена нуклеопротеина (572-776 п.н.)
изолятов лиссавирусов, выделенных нами на ЮЗС (выделены жирным шрифтом) со штаммами, представленными
в базе данных GenBank
14
GenBank, показал, что на юге Западной Сибири циркулируют близкородственные генетические варианты вируса бешенства, относящиеся к генотипу 1.
Итогом работы по изучению вируса бешенства явилось подтверждение главной роли диких плотоядных (53,0%) в резервации и распространении рабической инфекции в
природных очагах на юге Западной Сибири. Кроме диких плотоядных установлено
наличие вируса бешенства у барсуков, косуль, зайцев, сурков, бобров и мышевидных
грызунов. Установлено, что периодичность эпизоотий бешенства на юге Западной Сибири в течение 1997–2008 годов составила 3–5 лет. Была установлена зависимость эпизоотологической роли основных резервуаров вируса бешенства от направленности и интенсивности антирабических мероприятий. Увеличение в 3 раза объемов иммунизации
домашних животных обеспечило снижение на 46,0% случаев бешенства у этой категории животных. Ежегодная пероральная иммунизация диких лисиц в природных эпизоотических очагах эффективно снижала проявление эпизоотии бешенства на 36,0%. Выявлены фрагменты гена нуклеопротеина лиссавирусов генотипа 1 у насекомоядных летучих мышей, обитающих на территории юга Западной Сибири. Показано близкое генетическое родство лиссавирусов, циркулирующих на территории юга Западной Сибири в
популяциях животных разных видов, которые формируют две основные филогенетические группы в пределах генотипа 1.
2.2.2.2. Вирус Западного Нила
Эколого-эпизоотологические характеристики
В настоящей главе диссертационной работы экосистемы юга Западной Сибири были рассмотрены с точки зрения существования в них условий, благоприятных для поддержания циркуляции ВЗН, не связанной с сезонным заносом вируса. При рассмотрении биотических сообществ основное внимание уделялось животным, способным вовлекаться в трансмиссивный цикл ВЗН (птицы, мелкие млекопитающие, кровососущие
комары и клещи). Из абиотической компоненты рассматривались физические факторы,
влияющие на видовой состав, численность и активность членистоногих переносчиков –
температура, влажность и скорость ветра, а также температурный диапазон, определяющий эффективность репликации вируса в их организме. Наличие вирусных маркеров у
позвоночных животных и кровососущих членистоногих, участвующих в трансмиссивном цикле ВЗН, а также существование благоприятных условий для репликации вируса
свидетельствуют о циркуляции ВЗН в цепочке птица↔комар (клещ)→другое позвоночное животное в пределах определенных биотопов.
Вовлечение в трансмиссивный цикл ВЗН случайных хозяев вируса, не являющихся
компонентами природных экосистем – сельскохозяйственных животных, людей – приводящее к развитию заболевания и (или) формированию иммунитета, является косвенным доказательством циркуляции вируса в местных популяциях кровососущих членистоногих и формирования сезонных очагов циркуляции. При составлении характеристики биотопов, выбранных для сбора полевого материала, учитывалось наличие перелетных птиц, мелких млекопитающих и членистоногих кровососущих, способных вовлекаться в трансмиссивный цикл ВЗН, а также антропогенная нагрузка, влияющая на
численность и видовой состав животных, участвующих в циркуляции ВЗН. Для большинства выбранных биотопов было характерно присутствие диких перелетных птиц и
кровососущих членистоногих, способных вовлекаться в циркуляцию ВЗН. В то же время, биотопы различались по экологическим условиям, влияющим на обитание и активность участников трансмиссивного цикла, а это, в свою очередь, может влиять на цир15
куляцию вируса в конкретном биотопе.
Подавляющее большинство добытых во всех ландшафтных зонах птиц относились
к воробьеобразным, т.е. к ВЗН-восприимчивым. Сравнение распределения вирусных
маркеров по сезонам и местам сбора материала выявило определенные различия. При
сопоставлении сезонов 2003-2004 гг. в Северной Кулунде было отмечено увеличение
степени инфицирования птиц в сезоне 2004 г. Степень инфицирования птиц, добытых в
южной лесостепи в разные периоды сезона 2004 г. оказалась различной как при сравнении между периодами сборов, так и при сравнении с тем же сезоном в Северной Кулунде. Среди птиц, добытых летом, доля особей, позитивных по наличию одного из главных маркеров ВЗН белка Е, была выше, чем у птиц, добытых весной. В целом, по выявлению гликопротеина и вирусной РНК процент инфицированных птиц в 2004 г. в южной лесостепи был меньше, чем у птиц, добытых в Северной Кулунде. РНК ВЗН не была выявлена ни в одном образце внутренних органов, вирусный белок Е не был обнаружен ни в одном образце головного мозга птиц, добытых в сезоны 2006 и 2007 гг. С
большой частотой гликопротеин Е обнаруживался в печени птиц, а в сезоне 2006 г. – в
селезенке у одной птицы. Суммарная частота выявления этого маркера составила в сезоне 2006 г. 43,2%, в сезоне 2007 г. – 42,4%.
Отдельно можно отметить особенности распределения гликопротеина Е и РНК
ВЗН в разных группах птиц. В группе грачей, добытых в начале мая на юге Барабинской
лесостепи, выявление белка Е совпадало с выявлением вирусной РНК, в то время как в
головном мозге большей части птиц, добытых там же в летние месяцы, выявлялся гликопротеин Е, а процент птиц с двумя маркерами был в несколько раз меньше. Высокий
процент совпадения по обоим маркерам отмечался и у птиц 2004 г. в Северной Кулунде.
Большая частота выявления гликопротеина и вирусной РНК у этих птиц свидетельствует о том, что в организме птиц имела место продуктивная ВЗН-инфекция с попаданием
вируса в ЦНС и последующей репликацией в головном мозге. В пользу этого говорит
тот факт, что часть грачей с положительными находками гликопротеина и РНК ВЗН
были найдены мертвыми, хотя нами за время сборов не было отмечено больших эпизоотий среди этих птиц.
Таким образом, по результатам анализа маркеров ВЗН, большинство обследованных птиц как мигрирующих, так и оседлых видов ранее имели контакт с вирусом Западного Нила. Результатом этого у части птиц стало развитие продуктивной ВЗНинфекции с попаданием вируса в ЦНС, которая могла стать причиной их гибели; у другой части птиц имела место абортивная инфекция, ограниченная внутренними органами. В таком случае, при различном исходе инфекции у птиц, эффективность передачи
вируса от них другим участникам трансмиссивного цикла (как позвоночным, так и членистоногим) также должна различаться и коррелировать с распределением в организме
этих животных вирусных маркеров. Для проверки этого предположения был проведен
анализ внутренних органов млекопитающих на наличие и особенности распределения
маркеров ВЗН.
Млекопитающие
Из отловленных мелких млекопитающих в степной зоне большую часть составили
мышевидные грызуны. Распределение маркеров ВЗН у зверьков степных и лесостепных
биотопов отличалось от такового для подзоны осиново-березовых лесов. Наиболее часто гликопротеин Е и вирусная РНК встречались в головном мозге животных лесостепных биотопов, причем вирусный антиген был обнаружен во всех образцах головного
мозга. Почти полное совпадение в выявлении гликопротеина Е и РНК наблюдалось у
16
грызунов, отловленных во влажном колке с действующей колонией грачей, далее по частоте встречаемости маркеров следовали животные, отловленные на остепненном лугу
и прибрежной полосе р. Чулым. Этот факт свидетельствует о протекании в организме
всех обследованных животных продуктивной ВЗН-инфекции с попаданием вируса в
ЦНС.
В Северной Кулунде чаще всего вирусные маркеры встречались у зверьков, отловленных на заросшем поле у оз. Кротово. На втором месте по частоте встречаемости
маркеров следовали животные, отловленные на участке полынно-злаковой степи, несмотря на отсутствие в этих биотопах благоприятных условий для активности комаров.
Этот факт можно объяснить как перемещением животных в биотопы, где активны комары, так и возможным участием в передаче вируса преимагинальных стадий клещей рода Dermacentor. В целом, частота встречаемости обоих вирусных маркеров (белок Е/РНК)
у мелких млекопитающих Северной Кулунды составила 40,0%/12,7%. Таким образом,
среди мелких млекопитающих Северной Кулунды доля животных с протеканием продуктивной ВЗН-инфекции заметно меньше по сравнению с животными южной лесостепи.
Кровососущие членистоногие
Комары
Хотя маркеры ВЗН у комаров нами выявлены не были, в Северной Кулунде и на
юге Барабинской лесостепи имеются виды комаров, способные участвовать в трансмиссивном цикле ВЗН и для которых характерна высокая численность в некоторых биотопах. Это создает предпосылки для поддержания циркуляции вируса в период их активности.
Клещи
Результат анализа на распределение маркеров ВЗН у иксодовых клещей из разных
биотопов в сезоне 2006 г. показали, что наиболее часто белок Е и РНК ВЗН встречались
у имаго Ix. рersulcatus и Ix. pavlovskyi с участием всех возрастных стадий.
Молекулярно-биологические характеристики вариантов ВЗН
Из части образцов, в которых были выявлены вирусные маркеры, с помощью ОТПЦР были получены фрагменты кДНК, соответствующие участку гена белка Е ВЗН, которые были секвенированы. Секвенированные образцы имели следующее происхождение: два образца от серых ворон из Северной Кулунды 2003 г. (ChCorvus10-03,
ChCorvus31-03), три образца от грачей из южной лесостепи 2004 г. (ChRook7-04,
ChRook14-04, ChRook27-04), образец от красной полёвки из южной лесостепи 2004 г.
(ChRodent-04), два образца от заболевших людей (Пациенты №1 и №3, ChiWS-04 и
HumWS-04 соответственно) и два пула имаго клещей Ix. persulcatus и Ix. pavlovskiy из
подзоны осиново-березовых лесов 2006 г. (Tomsk-1, Tomsk-2).
Генотипирование исследуемых нуклеотидных последовательностей позволило
идентифицировать эти последовательности как относящиеся к генотипу Ia вируса Западного Нила. Западносибирские варианты ВЗН 2003-2004 гг. и 2006 г. оказались высоко гомологичными (не более 1-3% расхождения) с волгоградским штаммом VLG-4 ВЗН.
При анализе филогенетического дерева (рис.3) можно видеть, что исследованные варианты характеризуются невысоким уровнем генетических отличий. Можно также видеть,
что исследованные западносибирские варианты ВЗН не имеют гостальной специфичности. Филогенетический анализ показал, что выявленные в 2003-2004 гг. и 2006 г. после17
довательности ВЗН кластеризуются вместе с другими современными российскими изолятами ВЗН. Это говорит о том, что эти варианты вируса генетически связаны со штаммами ВЗН, изолированными на юге Европейской части России. В отношении вариантов,
выделенных от птиц, полученные результаты согласуются с орнитологическими данными, и это может служить доказательством заноса ВЗН перелётными птицами на юг
Западной Сибири с эндемичных территорий на юге РФ. Поскольку для клещей Ix.
persulcatus и особенно Ix. pavlovskiy, птицы являются прокормителями, выявление вариантов ВЗН в клещах свидетельствует об участии птиц в заносе вируса и передаче членистоногим переносчикам. Генетическая близость исследуемых вариантов с патогенными
для людей штаммами ВЗН юга России позволяет предполагать, что западносибирские
варианты ВЗН обладают эпидемическим потенциалом и могут быть причиной заболевания ВЗН людей на юге Западной Сибири.
Из филогенетического дерева можно видеть, что варианты ВЗН от серых ворон и
грача (ChRook27-04) образуют одну группу. По сравнению с прототипным штаммом
VLG-4, они характеризуются общей консервативной заменой Arg94Lys, которая также
свойственна вариантам ВЗН, выделенным в различных регионах мира и относящимся к
генотипам Ib, II, III и IV, но не выявлена у чирков и грачей юга Западной Сибири в 2002
году (генотип Ia). Каждый вариант от серых ворон имеет индивидуальные консервативные уникальные замены – у одного обнаружена Ala73Thr, у другого – Pro89Ala, также не встречавшиеся ранее у других вариантов вируса. В целом эта группа характеризуется консервативной уникальной заменой Pro76Ala и значимой заменой Leu69Hys,
выявленной у грача и вороны, также являющейся уникальной. Эти замены выявлены в
вариантах ВЗН от птиц, принадлежащих к видам с разным миграционным статусом, добытых в разное время и в разных ландшафтных зонах, что может указывать на общий
источник инфицирования птиц ВЗН, а также на возможное участие организма хозяина в
воздействии на изменчивость вируса.
Таким образом, генотипирование позволило характеризовать западносибирские варианты ВЗН как генетически близкие между собой и патогенным для людей штаммам
ВЗН, изолированным на юге России. Сравнительный аминокислотный анализ выявил
замены только в вариантах от восприимчивых к ВЗН врановых птиц, несмотря на значительную генетическую близость этих вариантов ВЗН с вариантами от других хозяев.
Полученные результаты свидетельствуют о способности вируса адаптироваться к разным хозяевам в различных ландшафтно-экологических условиях, а также об эпидемическом потенциале ВЗН, циркулирующего на юге Западной Сибири.
Итогом по изучению циркуляции вируса западного Нила на территории юга Западной Сибири явилось выявление циркуляции ВЗН среди воробьеобразных птиц
(Passeriformes), мигрирующих и оседлых видов, в степной, лесостепной зонах и подзоне
осиново-березовых лесов юга Западной Сибири. Также было установлено, что в циркуляцию ВЗН в степной, лесостепной зонах и подзоне осиново-берёзовых лесов юга Западной Сибири вовлекаются мелкие млекопитающие – грызуны, насекомоядные и мелкие хищники. Среди комаров-эудоминантов выявлены эпидемиологически значимые
виды, способные принимать участие в трансмиссивном цикле ВЗН. Показано вовлечение в циркуляцию ВЗН имагинальных и преимагинальных стадий иксодовых клещей Ix.
persulcatus и Ix. pavlovskiy в подзоне осиново-берёзовых лесов юга Западной Сибири. В
степной, лесостепной зонах и подзоне осиново-берёзовых лесов юга Западной Сибири
показано формирование природных очагов ВЗН, не связанных с сезонным заносом. Было установлено вовлечение в трансмиссивный цикл ВЗН на юге Западной Сибири случайных участников – сельскохозяйственных животных и людей.
18
Рисунок 3 – Филогенетическое дерево полевых изолятов и штаммов ВЗН, построенное на основании сравнения
нуклеотидных последовательностей фрагмента гена белка Е (322 нуклеотида) со штаммами, представленными в
базе данных GenBank .
Примечания: – птицы (серые вороны и грачи);
– красная полёвка;
- - люди;
– клещи Ix. persulcatus и Ix.
Pavlovskiy (фрагменты РНК выявленные нами у различных хозяев на ЮЗС).
19
Секвенирование и последующий анализ фрагментов гена белка Е ВЗН, выделенного от разных хозяев, показал, что западносибирские варианты ВЗН принадлежат
генотипу Iа ВЗН, являются генетически близкими между собой и близки с патогенными для людей штаммами ВЗН, изолированными на юге России.
2.2.2.3. Вирус гриппа
Эколого-эпизоотологические характеристики
Анализ орнитологических данных показал, что юг Западной Сибири является
уникальным местом, где пересекаются три из шести миграционных путей, проходящих через территорию Евразии. Через лесостепную и степную зону юга Западной
Сибири мигрирует более 250-ти видов птиц, причем на отдельных ее участках весной
может обитать до 220 видов птиц одновременно. Массовые миграции птиц протекают
с конца марта до первой половины июня и со второй половины июля почти до середины октября. В послегнездовое время и при пролете образуются локальные скопления с включением до 50 видов птиц с общей численностью до 20 и более тысяч особей единовременно. При массовых скоплениях возникают контакты птиц, посещающих в течение своего жизненного цикла различные ландшафтные зоны ряда регионов
и континентов (от Западной Сибири до субтропиков и тропиков Европы, Азии и Африки). Все это создает благоприятные условия для распространения возбудителей
различных болезней, в том числе вируса гриппа птиц. Основными объектами при
сборе проб для лабораторного анализа являлись водоплавающие и околоводные птицы: гуси, утки, кулики, чайки и крачки и др. Кроме этого, собирали материал от птиц
синантропных видов: голубей, сорок, ворон и воробьев. За период с 2002 по сентябрь
2009 года в обследуемом районе было проведено 109 экспедиций по сбору проб от
диких и домашних птиц. Было собрано и обследовано на наличие вируса гриппа
19856 проб. За время наблюдения (исключая период эпизоотии высокопатогенного
вируса гриппа H5N1 2005-2006 годов) нами было выделено 219 изолятов вируса
гриппа от 34 различных видов диких птиц.
По результатам анализа, вирусы гриппа А, циркулировавшие в предэпизотический период (2002-2005 гг). среди диких птиц на юге Западной Сибири, оказались
филогенетически близкими вирусам гриппа, изолированным от диких птиц в странах
Европы и южной Азии. Это указывает на распространение перелетными птицами различных вариантов вирусов гриппа А между различными регионами Евразии.
Эпизоотия высокопатогенного вируса гриппа Н5 на юге Западной Сибири
и ее последствия
Первая в России эпизоотия высокопатогенного вируса гриппа H5N1 субтипа
началась на юге Западной Сибири в Новосибирской области в июле 2005 года. Первичные очаги гриппа птиц представляли собой водоемы, находящиеся на территории
населенных пунктов, либо в непосредственной близости от них. Пик активности возбудителя гриппа птиц совпал с перемещением выводков диких птиц с мест гнездования на кормовые водоемы с наименьшим фактором беспокойства, которыми, как правило, и являются озера близ населенных пунктов. Развитие эпизоотии в августе, сентябре можно связать с тем, что инфицированные домашние утки и гуси занесли вирус
во дворы, где происходила его передача другим видам домашней птицы и, в первую
очередь, наиболее чувствительным: курам и индюкам.
20
Первый материал от погибшей птицы поступил на исследование 20 июля 2005
года из села Суздалка (Новосибирская область), где была зарегистрирована гибель
домашних птиц. Вирусы гриппа Н5N1 были изолированы из органов трех погибших
птиц: одной индюшки и двух кур. Гены, кодирующие гемагглютинин у выделенных
изолятов, были секвенированы. Их филогенетический анализ показал, что выделенные штаммы образуют кластер (индекс поддержки = 99) с H5N1 штаммами, изолированными от птиц во время вспышки птичьего гриппа на озере Цинхай (Qinghai) в Китае в апреле 2005 года. У всех выделенных нами изолятов сайт протеолитического
расщепления был – ERRRKKR/GL, что соответствовало сайту расщепления высокопатогенных штаммов, циркулирующих в странах Юго-Восточной Азии. Тест на патогенность с использованием 6-ти недельных цыплят также подтвердил, что все выделенные штаммы являются высокопатогенными для птиц (HPAI).
Таким образом, нами впервые было показано, что массовая гибель домашней
птицы на юге Западной Сибири летом 2005 года была вызвана высокопатогенным вирусом гриппа Н5N1 субтипа, генетически родственным вирусам, выделенным во время майской вспышки (2005г.) на озере Цинхай (Северный Китай).
Всего за время эпизоотии 2005 года нами было собрано или получено 4993 образца от диких и домашних птиц и выделено 55 изолятов высокопатогенного вируса
гриппа H5N1 субтипа.
Исследование роли синантропных птиц в эпизоотии высокопатогенного гриппа
у диких и домашних птиц на юге Западной Сибири
При изучении эпизоотии и особенно ситуации в постэпизоотический период
важным оставался вопрос о роли синантропных птиц в распространении высокопатогенного вируса гриппа птиц и возможности формирования локальных очагов данного
патогена у птиц, не являющихся основным резервуаром. Для этого был проведен мониторинг вируса гриппа А среди синантропных видов птиц в эпизоотический и постэпизоотический периоды (с сентября 2005 по март 2006) в местах первичного распространения гриппозной инфекции на юге Западной Сибири. Было собрано 458 образцов от 10 видов птиц, в т.ч. 70 образцов в эпизоотический и 388 – в постэпизоотический периоды. В результате проведенных исследований ни одного высокопатогенного
вируса гриппа H5N1-субтипа выделено не было. Был выявлено один изолят непатогенного вируса гриппа субтипа H4N6 у обычной сороки. Полученные данные указывают на то, что синантропные птицы играли незначительную роль в поддержании
циркуляции высокопатогенного вируса гриппа H5N1 во время эпизоотии 2005-2006
гг. на юге Западной Сибири.
Особенности циркуляции вируса гриппа у диких и домашних птиц
в постэпизоотический период
Несмотря на то, что осенью 2005 и весной 2006 годов на юге Западной Сибири
было зафиксировано несколько случаев локальной гибели домашней птицы, мы считаем, что эпизоотия высокопатогенного гриппа Н5N1 на этой территории закончилась
осенью 2005 года с окончанием осенней миграции птиц и наступлением холодов.
Анализируя циркуляцию вирусов гриппа у диких и домашних птиц в летне-осенний
период 2005 года (во время эпизоотии), хотелось бы отметить, что мы не выявили
циркуляции ни одного иного серотипа вируса гриппа, кроме высокопатогенного
21
Н5N1. Весна 2006 года характеризовалась также практически полным отсутствием
любых субтипов вируса гриппа у диких птиц обследованных на территории юга Западной Сибири. Был выделен только один изолят вируса гриппа Н5N1 из 237 собранных проб. Характерно, что утка была отстрелена во время весенней охоты и была
клинически здоровой. Этот факт указывал на то, что во время весенней миграции
2006 был возможен повторный занос вирусов Н5N1 субтипа на юге Западной Сибири,
что в дальнейшем и случилось. Так, в мае 2006 года одновременно в двух селах Омской и Новосибирской областей была зафиксирована гибель домашней птицы на
частных подворьях. Из органов погибших птиц был выделен и охарактеризован высокопатогенный вирус гриппа Н5N1 субтипа, генетически близкий вирусам, циркулировавшим на территории Западной Сибири в 2005 году. Все вспышки, описанные на
этот период, были вызваны вирусом гриппа H5N1-субтипа, принадлежащего к генетической линии Цинхай-подобных вирусов – клада 2.2 (clade 2.2) (рис. 4, 5) .
При проведении мониторинга вируса гриппа на юге Западной Сибири в последующие годы (2006-2009) нами было собранно и обследовано 14307 проб от диких и
домашних птиц. За этот период было выделено 133 изолята вируса гриппа различного
субтипа, не считая высокопатогенных H5N1. Анализ полученных данных показал, что
начиная со второй половины 2006 года, появляется разнообразие выделяемых субтипов вируса гриппа, которое полностью отсутствовало во время эпизоотии 2005 года и
в постэпизоотический период 2006 года (январь – август). Во второй половине 2006
года и в 2007 году были выделены и субтипы H3N8, H5N2, H4N6 и др. Аналогичная
картина наблюдалась и в 2008 и 2009 годах.
При обследовании колонии сизых чаек (Larus canus) в июле 2006 г. на оз. Чаны в
Новосибирской области из клоакального смыва, взятого прижизненно, был выделен
изолят H5N1. Выделение высокопатогенного вируса гриппа H5N1-субтипа от клинически здоровой особи является чрезвычайно интересным и важным в эпизоотологии
данного заболевания. Данный факт указывает на то, что в популяциях некоторых видов птиц наступило равновесие между паразитом и хозяином, когда паразиту (в данном случае вирусу гриппа) не целесообразно уничтожать своего хозяина, а предпочтительно сосуществовать вместе.
В мае–июне 2009 г. новая вспышка высокопатогенного гриппа птиц была отмечена на берегу оз. Увс-Нуур. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина выделенных изолятов показал, что все они принадлежат к кладе 2.3.2 (рис. 4, 5) и наиболее близки вирусам, выделенным ранее в ЮгоВосточной Азии и Китае. Судя по всему, на территорию России вирусы с новым генотипом были занесены перелетными птицами таким же образом, как и в 20052006 гг.
Молекулярно-биологические характеристики вариантов вируса гриппа,
выделенных на юге Западной Сибири
Филогенетический анализ позволяет определить и показать степень родства вирусов или отдельных генов вирусов, циркулирующих на разных территориях. В связи
с этим для нас представлял большой интерес анализ не только орнитологических данных о разлете птиц с территории юга Западной Сибири, но и родство вирусов гриппа
и/или генов вирусов, выделенных в различных регионах. Учитывая, что при мониторинге вируса гриппа у диких птиц в основном выделялись и определялись вирусы Н2,
22
Н3 и Н4 субтипов гемагглютинина, нами был проведен филогенетический анализ генов, кодирующих гемагглютинин вируса гриппа именно этих субтипов.
Результаты филогенетического анализа показали, что вирусы гриппа подтипа Н4,
изолированные нами в период 2002-2005 гг. от диких уток, отстреленных на юге Западной Сибири, эволюционно близки вирусам, изолированным от диких уток годом
ранее в Европе; изоляты вируса гриппа подтипа Н2, выделенные нами в 2003 году от
диких уток на юге Западной Сибири, эволюционно близки штаммам, изолированным
от диких уток двумя годами ранее в южной Азии и штамму, изолированному от дикой утки 4-мя годами ранее в Европе; изоляты гриппа А подтипа Н3, циркулировавшие среди диких птиц на юге Западной Сибири, эволюционно близки вирусам, циркулировавшим практически в то же время среди диких птиц в Европе и штамму, изолированному ранее в Китае.
Таким образом, вирусы гриппа А различных субтипов, циркулировавшие среди
диких птиц на юге Западной Сибири, филогенетически близки вирусам гриппа, изолированным от диких птиц в эти же годы в странах Европы и южной Азии. Это указывает на широкие связи юга Западной Сибири с различными регионами Евразии и
подтверждает орнитологические данные о важной роли юга Западной Сибири в быстром распространении различных вариантов вирусов гриппа А во время миграций
птиц на этом континенте. Быстрое распространение родственных вариантов вирусов
гриппа птиц между районом проведения мониторинга и значительно от него удаленными регионами Евразии, установленное нами при орнитологическом и филогенетическом анализе изолятов вируса гриппа, объясняется уникальным пересечением миграционных путей диких птиц на юге Западной Сибири. Во время весенних миграций в данный регион
могут быть занесены вирусы гриппа, циркулирующие как среди птиц восточно-азиатского миграционного русла, пролегающего через Дальний Восток и Юго-Восточную Азию, так и среди
птиц восточно-европейского миграционного потока.
Изучение высокопатогенных вирусов гриппа, выделенных на территории
юга Западной Сибири
Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа,
выделенных от диких и домашних птиц на юге Западной Сибири (2005-2009 гг.)
Учитывая большую экономическую и эпизоотическую значимость высокопатогенных вирусов гриппа H5N1, изучению биологических свойств данной группы вирусов было уделено особое внимание. Культивирование в системе развивающихся куриных эмбрионов показало, что все изученные нами штаммы вируса гриппа H5N1
вызывали гибель развивающихся куриных эмбрионов в течении 2 суток культивирования. В процессе визуального анализа инфицированных эмбрионов регистрировались поверхностные геморрагии и образование желеобразной аллантоисной жидкости. Наблюдалось глубокое поражение зародышевых оболочек эмбриона. Для определения оптимальной дозы заражения, являющейся интегральной характеристикой,
описывающей инфекционные свойства различных штаммов вируса, был проведен
подбор условий культивирования и оптимизирована доза заражения. Все штаммы вызывали высокую продукцию вируса в РКЭ.
Логическим продолжением работ на эмбрионах явилось изучение экспериментальной инфекции гриппа, вызываемого штаммами H5N1, у кур как наиболее релевантной модели заболевания у птиц. Тест, который был использован нами для количественной оценки патогенности конкретного штамма, заключался в определении ве23
личины индекса IVPI (intravenous pathogenicity index) при внутривенном заражении
кур. Индекс IVPI может принимать значение от 0.00 до 3.00. Принято, что при значении IVPI=1.2 и выше штамм считается высокопатогенным, в остальных случаях –
низкопатогенным. Первые клинические проявления инфекции и начало гибели птиц
были отмечены на 1-2-е сутки после инфицирования. К третьим суткам для всех изученных штаммов, кроме A/common gull/Chany/P/2006, падеж составил 100%. Типичная картина заболевания выглядела следующим образом: снижалась двигательная активность; нахохлившись, птицы сбивались в кучки; у отдельных особей регистрировались признаки поражения желудочно-кишечного тракта. Далее отмечались поражения нервной системы: изменение походки, больная птица при передвижении приседала, прихрамывала, падала, упиралась клювом в пол, вытягивала ноги, крылья, прикрывала глаза, либо падала на спину и не могла перевернуться, беспокойно подергивала конечностями. При внешнем осмотре погибшие птицы лежали на боку с вытянутыми конечностями, либо на спине, чаще голова запрокинута, наблюдались бледность, либо умеренная цианотичность гребня и сережек. При патологоанатомическом
исследовании выявлены: бледность, либо умеренная цианотичность мышечной ткани;
легкие отечные, наполненные кровью, с геморрагиями и очагами некроза, тонут в воде, на разрезе темно-бордового цвета, с поверхности разреза выступает темнобордовая, не свернувшаяся кровь. Сосуды брыжейки желудочно-кишечного тракта
инъецированы, зоб и мышечный желудок наполнены кормовыми массами, либо вздуты. Печень темно-вишневого или кирпичного цвета. Желчный пузырь наполнен. Почки отечные, наполненные кровью, дряблые, имеющие зернистую консистенцию на
разрезе, структура почек не различима. Селезенка темно-вишневого или темнорозового цвета с синюшным оттенком.
В результате проведенного исследования было показано, что все штаммы вируса
гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенные на юге Западной Сибири, были высокопатогенными для кур.
Поскольку ВОЗ рассматривает вирус H5N1-субтипа как потенциально пандемичный, актуально изучение патогенности различных вариантов вируса гриппа H5N1
для млекопитающих. Общепризнанной моделью изучения гриппозной инфекции является мышиная модель. Для оценки восприимчивости и летальности мышей было
проведено интраназальное заражение их рядом штаммов, выделенных от диких птиц
в разные годы (табл. 1).
Таблица 1 – Штаммы вируса гриппа, использованные в эксперименте по заражению мышей
1
2
3
4
Штамм
A/duck/Omsk/1822/2006
A/Black-headed gull/Tyva/115/09
A/duck/Tuva/01/06
A/common gull/Chany/P/2006
Lg ГАЕ/мл
3,41±0,15
3,71±0,15
3,71±0,15
4,61±0,15
Lg EID50/мл
8,38±0,23
9,0±0,20
9,13±0,34
9,75±0,30
LD50/мл
6,5±0,18
6,4±0,25
7,0±0,26
7,3±0,22
Примечание: В таблице приведены средние значения показателя (M±m), p<0.05; доверительный интервал
определения гемагглютинирующей активности при двукратных разведениях аллантоисной жидкости 0.30
lgГАЕ/мл.
24
Все исследованные штаммы вызывали острую летальную инфекцию у белых
мышей при интраназальном заражении, иными словами, оказались высокопатогенными для мышей. Таким образом, все выделенные штаммы потенциально опасны для
млекопитающих.
Молекулярно-биологический и филогенетический анализ генов HA и NA штаммов
вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных на юге Западной Сибири
от диких и домашних птиц (2005-2009 гг.)
Как уже говорилось выше, важной характеристикой вируса является первичная
структура его генома. Для вируса гриппа А актуальны исследование и молекулярнобиологический анализ структуры его поверхностных белков – гемагглютинина HA и
нейраминидазы NA. Эти белки являются важнейшими антигенами вируса и непосредственно участвуют в инфекционном процессе. Филогенетический анализ показал,
что все выделенные на юге Западной Сибири в 2005-2009 гг. штаммы относятся к
двум генетическим группам, в соответствии с последовательностью гена HA. Это
клады 2.2 и 2.3.2. (рис. 4, 5). При этом штаммы, выделенные на юге Западной Сибири
во время первых эпизоотий гриппа птиц, образуют отдельный кластер и принадлежат
к Цинхай-подобным штаммам (клада 2.2) (рис. 4, 5). Штаммы A/Black-headed
gull/Tyva/115/09, A/Great crested grebe/Tyva/120/09, A/Little grebe/Tyva/118/09 и
A/Spoonbill/Tyva/117/09 принадлежат к совершенно другой кладе – 2.3.2. (Гуанкси/Фуджан-подобные штаммы) (рис. 4, 5). Генетически они наиболее близки штаммам, выделенным в Японии в 2007-2008 гг., и штаммам, вызвавшим вспышку среди
диких и домашних птиц в Приморском крае в апреле 2008 г.
Одной из важнейших характеристик штаммов вируса гриппа А является наличие
маркера чувствительности к лечебным препаратам, особенно к Тамифлю (активное
начало озельтамивир) который является наиболее эффективным при лечении гриппа
и рекомендован ВОЗ к широкому применению. Озельтамивир является ингибитором
нейраминидазы и известно, что аминокислотные замены в позициях 119, 274, 292 и
294 в нейраминидазе (нумерация в соответствии с NA субтипа 2), указывают на
устойчивость штаммов вируса гриппа А к озельтамивиру. Все штаммы вируса гриппа
H5N1, выделенные на территории юга Западной Сибири, имеют в этой позиции гистидин и являются потенциально чувствительными к озельтамивиру.
Таким образом, основным результатом мониторинга вируса гриппа у птиц на
территории юга Западной Сибири явилось установление факта активной циркуляции
этого патогена как у диких, так и домашних птиц. Важным результатом мониторинга
считаем создание коллекции штаммов высокопатогенного вируса гриппа H5N1субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в России в 2005-2009 гг. и отсутствие выявленных случаев высокопатогенного гриппа H5N1-субтипа у синантропных
видов птиц на юге Западной Сибири в 2005-2006 гг. Филогенетический анализ выделенных высокопатогенных вирусов гриппа H5N1 показал, что все циркулировавшие
на юге Западной Сибири в 2005-2009гг. варианты вируса гриппа H5N1-субтипа имеют свое происхождение от вариантов, вызвавших эпизоотии среди диких и домашних
птиц в Юго-Восточной Азии и Китае, принадлежащих к двум различным генетическим линиям - кладам 2.2 и 2.3.2.
25
A/turkey/Suzdalka/12/05
A/chicken/Suzdalka/06/05
A/goose/Suzdalka/10/05
A/tufted duck/Germany/R1240/06
A/whooper swan/Mongolia/244/2005
A/chicken/Kurgan/3/2005
A/swan/Slovenia/760/2006
A/chicken/Tambov/570-2/05
A/wild duck/Omsk/103-01/05
A/chicken/Krasnodar/02/06
A/goose/Krasnoozerskoe/627/05
A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-1/2005
A/Cygnus olor/Caspian sea/2005
A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-7/2005
A/common gull/Chany/P/2006
клада
A/grebe/Tyva/Tyv06-2/06
A/duck/Tuva/01/2006
A/chicken/Rostov/22-1/2007
A/starling/Rostov-on-Don/39/07
A/chicken/Domodedovo/MK/2007
A/chicken/Adygea/203/06
A/chicken/Krasnodar/199/06
A/cygnus olor/Italy/742/2006
A/chicken/Omsk/06
A/barheadedgoose/Qinghai/1A/2005
A/chicken/Dagestan/06
A/Bar-headed Goose/Qinghai/62/05
A/domestic goose/Pavlodar/1/2005
A/chicken/Korea/ES/03
A/duck/Fujian/11094/2005
A/chicken/Guangdong/191/04
A/chicken/Guangdong/178/04
A/black-headed gull/Tyva/115/2009
A/great crested grebe/Tyva/120/2009
клада
A/littleegret/HongKong/8863/2007
A/whooperswan/Hokkaido/1/2008
A/chicken/Primorje/1/2008
A/chicken/Primorsky/85/2008
A/quail/Shantou/3054/2002
A/Viet Nam/1194/2004
клада
A/duck/Vietnam/1231/2005
A/VietNam/1231/2005
клада
A/Ck/HK/YU777/02
A/duck/Fujian/897/2005
клада
A/Goose/Shantou/1621/05
A/blackbird/Hunan/1/2004
клада
A/duck/Guangxi/1681/2004
клада
A/goose/Guangxi/1097/2004
A/treesparrow/Henan/2/2004
клада
A/Beijing/01/2003
A/chicken/Shanxi/2/2006
A/goose/Guiyang/337/2006
клада
A/goose/Guiyang/1175/2006
A/duck/Fujian/17/2001
A/Chicken/Hong Kong/YU562/01
клада
A/Pheasant/HongKong/FY155/01
A/Goose/Guangdong/1/96
A/Goose/Guangdong/3/97
Рисунок 4 – Филогенетическое дерево вируса гриппа H5N1 построенное на основании сравнения нуклеотидных
последовательностей гена, кодирующего гемагглютинин. Подчеркнуты штаммы выделенные нами на ЮЗС.
26
A/chicken/Krasnodar/01/2006
A/duck/Tuva/01/2006
A/chicken/Krasnodar/123/06
A/chicken/Domodedovo/MK/2007
A/chicken/Rostov/22-1/2007
A/common gull/Chany/P/2006
A/chicken/Dagestan/2006
A/Cygnus olor/Caspian sea/2005
A/chicken/Omsk/14/05
Шт аммы, принад лежащие клад е 2.2. по НА
A/goose/Krasnoozerskoe/627/05
A/turkey/Turkey/1/2005
A/chicken/Suzdalka/06/05
A/goose/Suzdalka/10/05
A/turkey/Suzdalka/12/05
A/chicken/Tula/4/05
A/duck/Novosibirsk/02/05
A/duck/Korea/ESD1/03
A/crow/Osaka/102/2004
A/crow/Kyoto/53/2004
A/blow fly/Kyoto/93/2004
A/chicken/Yunnan/6885/2003
A/turkey/Kedaton/BPPV3/2004
A/Indonesia/5/05
A/duck/Hunan/15/2004
A/duck/Fujian/12032/2005
A/Great crested grebe/Tyva/120/09
A/Black-headed gull/Tyva/115/09
Шт аммы, принад лежащие клад е 2.3.2. по НА
A/whooper swan/Hokkaido/1/2008
A/chicken/Primorje/1/2008
A/whooper swan/Aomori/2/2008
A/chicken/Vietnam/15/2004
A/chicken/Vietnam/53/2004
A/chicken/Vietnam/G04/2004
A/Ck/Thailand/73/2004
A/Thailand/LFPN-2004/2004
A/crested eagle/Belgium/01/2004
A/duck/Fujian/13/2002
A/chicken/Scotland/59
A/wood duck/MD/04-623/2004
A/duck/Yokohama/aq10/2003
A/tree sparrow/Henan/4/2004
A/Goose/Guangdong/1/96
Рисунок 5 – Филогенетическое дерево вируса гриппа H5N1 построенное на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена, кодирующего нейраминидазу. Выделены штаммы изолированные нами на ЮЗС.
27
3. ВЫВОДЫ
1. Научная и практическая актуальность различных вирусных патогенов обусловлена потенциалом их экологического полиморфизма, максимальные эволюционные последствия реализации которого могут выражаться в их широком эпизоотическом и/или эпидемическом распространении за пределами первичного природного
очага. С учетом имеющихся литературных данных, а также результатов собственных
исследований, вирусы бешенства, Западного Нила и гриппа птиц являются актуальными вирусными патогенами на территории юга Западной Сибири.
2. Критерии, определяющие степень эпизоотологической, эпидемиологической
и экономической значимости тех или иных патогенов для конкретного региона основаны на их способности в резервационном и/или эпизоотическом вариантах циркулировать в природных экосистемах у максимума хозяев, а в дальнейшем – распространиться на другие территории как внутри региона, так и за его пределами с реальными
возможностями заболеваемости и гибели диких животных и птиц, заболеваемости и
гибели сельскохозяйственных и домашних животных (птиц), а также человека.
3. Лисицы, являющиеся на территории юга Западной Сибири основными резервуарами вируса бешенства, обеспечивают периодичность эпизоотий (3-5 лет) и служат основным источником его дальнейшего распространения за пределы природных
эпизоотических очагов. Проведение пероральной антирабической иммунизации способствует купированию инфекции не только среди диких плотоядных, но и среди
сельскохозяйственных животных, а также сокращает случаи обращения за антирабической помощью людей.
4. Результаты изучения молекулярно-генетических характеристик лиссавирусов
от 17 видов диких, сельскохозяйственных и домашних животных показали наличие
трех основных филогенетических кластеров в пределах генотипа 1 вируса бешенства,
циркулирующего на юге Западной Сибири, что свидетельствует о широком распространении этого патогена в данном регионе.
5. Лесостепная и степная зоны юга Западной Сибири обладают обязательными
признаками традиционных очагов циркуляции вируса Западного Нила (ВЗН): наличие
высокой численности восприимчивых птиц, разнообразие эпизоотически и эпидемически значимых комаров-переносчиков, а также климатические условия, благоприятные для активности переносчиков.
6. Возможная эпизоотическая вспышка ВЗН на ЮЗС подтверждается фактами
обнаружения мертвых птиц, инфицированных этим патогеном. Маркеры ВЗН обнаружены у ряда мелких млекопитающих, причем в лесостепной зоне до 100% случаев,
в степной – до 40%. Разницу показателей можно объяснить различной численностью
комаров-переносчиков.
7. Филогенетический анализ показал, что западносибирские варианты ВЗН являются генетически близкими между собой, имеют ряд уникальных мутаций, но
близки с патогенными для людей штаммами ВЗН, изолированными на юге России,
что вызывает опасение о возможности формирования природных очагов с уникальными эколого-вирусологическими характеристиками, и распространению этих вариантов вируса в популяции сельскохозяйственных и домашних животных и человека.
8. На юге Западной Сибири сходятся миграционные потоки более 250 видов диких птиц, зимующих в различных регионах мира, в том числе неблагополучных по
высокопатогенному гриппу птиц H5N1. В этой связи указанная территория в значи-
28
тельной степени способствует широкому географическому распространению вирусов
гриппа А в популяциях диких птиц в Евразии.
9. В течение трех лет до начала эпизоотии высокопатогенного гриппа птиц
H5N1 в РФ (август 2002 – июнь 2005 г.) на юге Западной Сибири подтверждалась
циркуляция вируса гриппа типа А у диких птиц. Средняя зараженность вирусами
гриппа обследованного поголовья диких птиц составила 9,4%. Все исследованные
изоляты имели филогенетическое родство с вирусами гриппа, выделенными в 20002005 годах у диких птиц в Европе и Азии.
10. Эпизоотия гриппа птиц типа А (субтип Н5N1) на территории юга Западной
Сибири началась в июле 2005 года и в течение последующих 30 дней проявилась
прежде всего «переходом» возбудителя от естественных носителей (диких птиц) на
домашнюю птицу с высоким уровнем ее заболеваемости и гибели. Вторую волну эпизоотических вспышек гриппа среди домашней птицы наблюдали в октябре. В общей
структуре падежа домашней птицы от гриппа за весь период эпизоотии 2005 года на
июль приходится 55,2%, на август – 32% и на октябрь – 12,4%.
11. В период эпизоотии 2005 года на территории юга Западной Сибири от диких
и домашних птиц выделяли только изоляты вируса гриппа типа А субтипа Н5N1.
Среди птиц синантропных видов на ЮЗС в 2005-2006 годах случаев выделения высокопатогенного вируса гриппа H5N1 не выявлено, что указывает на их незначительную роль в распространении и циркуляции вируса гриппа данного субтипа во время
этой эпизоотии.
12. Изоляты высокопатогенного вируса гриппа птиц субтипа Н5N1, выделенные
в период эпизоотии 2005 года, во всех случаях имели филогенетическое родство с вирусом, выделенным в Северном Китае в мае 2005 года (клада 2.2.). В 2009 году произошел занос с дикими птицами нового генотипа высокопатогенного вируса гриппа
H5N1 (клада 2.3.2.) на территорию ЮЗС. Наиболее вероятным районом, из которого
был занесен этот вариант вируса, явилось, так же как и в 2005 году, озеро Цинхай
(Северный Китай).
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Создана коллекция из 37 штаммов вируса гриппа типа А, в том числе из 16 высокопатогенного H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2009 гг., которые приняты на патентное депонирование в Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ
«Вектор» Роспотребнадзора и могут использоваться в дальнейших научных исследованиях в том числе для разработки диагностических препаратов и вакцин.
По результатам работы 386 нуклеотидные последовательности полных генов вируса бешенства, вируса Западного Нила и вируса гриппа типа А зарегистрированы в
международной базе данных GenBank и могут в дальнейшем служить основой для
конструирования праймеров и филогенетических исследований этих вирусов.
Обоснованные результатами комплексных исследований эволюционные принципы экологического полиморфизма и территориального распространения природноочаговых вирусных патогенно необходимо использовать в процессе разработки и
практической реализации оптимальных систем противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий при актуальных природно-очаговых зооантропонозных
инфекционных болезнях, а также в дальнейших научных исследованиях.
Указанные принципы нашли отражение в 5 утвержденных на российском и региональном уровнях методических указаниях и рекомендациях.
29
5. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных
ВАК Минобразования и науки РФ
1. Шестопалов, А.М. Бешенство и его распространение в мире / А.М. Шестопалов,
М.И. Кисурина, К.Н. Груздев // Вопросы вирусологии. – 2001. – Т. 46. - № 2. –
С. 7-12.
2. Шестопалов, А.М. Влияние фактора некроза опухоли α на эффективность вакцинации против бешенства / А.М. Шестопалов, Ю.Н. Рассадкин, Е.Н. Устинова,
Е.Д. Даниленко, А.О. Белкина, Н.М. Пустошилова, В.И. Масычева // Вопросы вирусологии. – 2002. – № 2. – С. 37-40.
3. Терновой, В.А. Выявление вируса Западного Нила у птиц на территории Барабинской и Кулундинской низменностей (Западно-Сибирский пролетный путь) в летнеосенний период 2002 г. / В.А. Терновой, М.Ю. Щелканов, А.М. Шестопалов,
В.А. Аристова, Е.В. Протопопова, В.Л. Грамошевский, А.В. Друзяка, А.А. Славский, С.И. Золотых, В.Б. Локтев, Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. – 2004. –
Т. 49(3). – С. 52-56.
4. Зайковская, А.В. Эпизоотическая обстановка по бешенству в Новосибирской области в период 1997 – 2003 гг. / А.В. Зайковская, В.И. Аксенов, Ю.Н. Рассадкин,
А.М. Шестопалов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. –
2005. – № 4. – С. 37-40.
5. Зайковская, А.В. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Западной Сибири / А.В. Зайковская,
В.А. Терновой, В.И. Аксенов, Ю.Н. Рассадкин, А.М. Шестопалов // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2005. – № 2. – С. 30-35.
6. Разумова, Ю.В. Генетическое разнообразие вирусов гриппа А в популяциях диких
птиц на юге Западной Сибири / Ю.В. Разумова, М.Ю. Щелканов, А.А. Дурыманова, С.И. Золотых, В.А. Терновой, А.А. Славский, А.К. Юрлов, А.Б. Беклемишев,
А.М. Шестопалов, Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. – 2005. – №4. – С.31-35.
7. Терновой, В.А. Лиссавирусы у летучих мышей, обитающих на юге Западной Сибири / В.А. Терновой, А.В. Зайковская, А.А. Томиленко, Ю.Н. Рассадкин, В.И. Аксенов, Е.В. Чаусов, B. Scharf, А.М. Шестопалов // Вопросы вирусологии. – 2005. –
№ 1. – С. 31-35.
8. Донченко, А.С. Выявление в Западной Сибири высокопатогенных вирусов гриппа
птиц типа А субтипа H5N1 / А.С. Донченко, А.М. Шестопалов, А.Г. Дурыманов,
С.И. Золотых, С.В. Нетесов, Ю.Г. Юшков // Достижения науки и техники АПК. 2006. – № 1. – С. 23-25.
9. Зайковская, А.В. Изучение участия рукокрылых (Mammalia, Chiroptera), обитающих в Западной Сибири, в циркуляции возбудителей зоонозов, потенциально
опасных для человека / А.В. Зайковская, Д.А. Васеньков, Н.Л. Першикова,
В.А. Терновой, А.М. Шестопалов, Н.А. Донченко, М.А. Потапов // Вестник Красноярского государственного университета. – 2006. – № 5/1. – С. 98-104.
10. Кононова, Ю.В. Генотипирование вируса Западного Нила в популяциях диких
птиц наземного и древесно-кустарникового комплексов на территории Барабинской лесостепи и Кулундинской степи (2003-2004 гг.) / Ю.В. Кононова, В.А. Терновой, М.Ю. Щелканов, Е.В. Протопопова, С.И. Золотых, А.К. Юрлов, А.В. Дру30
зяка, А.А. Славский, А.М. Шестопалов, Д.К. Львов, В.Б. Локтев // Вопросы вирусологии. – 2006. – Т. 51. – № 4. – С. 19-23.
11. Онищенко, Г.Г. Изучение высокопатогенного H5N1 вируса гриппа, выделенного
от больных и погибших птиц в Западной Сибири / Г.Г. Онищенко, А.М. Шестопалов, В.А. Терновой, В.А. Евсеенко, А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, А.В. Зайковская, С.И. Золотых, А.К. Юрлов, В.Н. Михеев, С.В. Нетесов, И.Г. Дроздов //
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2006. – № 5. –
С. 47-54.
12. Разумова, Ю.В. Результаты мониторинга вируса гриппа А в популяциях диких
птиц на юге Западной Сибири (данные 2003 г.) / Ю.В. Разумова, М.Ю. Щелканов,
С.И. Золотых, А.А. Дурыманова, В.А. Терновой, А.Б. Беклемишев, А.К. Юрлов,
А.М. Шестопалов, Д.К. Львов, С.В. Нетесов // Вопросы вирусологии. – 2006. –
№ 3. – С. 32-37.
13. Терновой, В.А. Генотипирование вируса Западного Нила, выявленного у птиц на
юге Приморского края в течение 2002-2004 гг. / В.А. Терновой, Е.В. Протопопова,
С.Г. Сурмач, М.В. Газетдинов, С.И. Золотых, А.М. Шестопалов, Е.В. Павленко,
Г.Н. Леонова, В.Б. Локтев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2006. – № 4. – С. 30-35.
14. Шестопалов, А.М. Результаты двухлетнего обследования диких птиц на территории Западной Монголии на присутствие вируса гриппа / А.М. Шестопалов,
С.И. Золотых, М.Ю. Щелканов, Ю.В. Разумова, А.Ю. Алексеев, А.Г. Дурыманов,
А.К. Юрлов, Даважав Авмед., Т. Алтантсетсег, Д. Цэрэнноров, Д. Отгонбаатар,
С.В. Нетесов, И.Г. Дроздов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2006. – № 5. – С.55 - 59.
15. Юшков, Ю.Г. Циркуляция вирусов гриппа типа А у домашней птицы в предэпизоотический период 2005 г. в Новосибирской области / Ю.Г. Юшков, А.Ю. Алексеев, С.И. Золотых, А.Г. Дурыманов, Ю.В. Кононова, А.В. Зайковская, А.М. Шестопалов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2006. –
№ 5. – С. 59-65.
16. Евсеенко, В.А. Изучение разнообразия высоко патогенных вирусов гриппа H5N1,
вызвавших эпизоотии среди птиц на территории Западной Сибири в 2005 году /
В.А. Евсеенко, А.В. Зайковская, В.А. Терновой, А.Г. Дурыманов, С.И. Золотых,
Ю.Н. Рассадкин, А.С. Липатов, R.G. Webster, А.М. Шестопалов, С.В. Нетесов,
И.Г. Дроздов, Г.Г. Онищенко // Доклады Академии наук. – 2007. – Т. 414 (4). –
С. 561-565.
17. Ильичева, Т.Н. Мониторинг свиней в неблагополучных пунктах по гриппу птиц
H5N1 / Т.Н. Ильичева, А.В. Зайковская, Ю.Г. Юшков, А.А. Пашков, А.М. Шестопалов // Ветеринария. – 2007. – № 5. – C. 23-25.
18. Ковалевская, А.А. Мониторинг вируса гриппа среди дикой и синантропной птицы
на территории Омской области (данные за 2006 г.) / А.А. Ковалевская, Н.Ф. Хатько, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Ветеринарная патология. –
2007. – № 1. –С. 178-181.
19. Кононова, Ю.В. Видовой состав кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) и
возможность формирования очагов циркуляции вируса Западного Нила на юге Западной Сибири / Ю.В. Кононова, А.Г. Мирзаева, Ю.А. Смирнова, Е.В. Протопопова, Т.А. Дупал, В.А. Терновой, Ю.А. Юрченко, А.М. Шестопалов, В.Б. Локтев //
Паразитология. – 2007. – Т. 41. –№ 6. – С. 459-470.
31
20. Евсеенко, В.А. Патогенез инфекционного заболевания мышей, вызванного вирусом гриппа птиц H5N1-подтипа / В.А. Евсеенко, К.А. Шаршов, Е.К. Букин,
А.В. Зайковская, В.А. Терновой, Г.М. Игнатьев, А.М. Шестопалов, С.В. Нетесов,
В.А. Шкурупий, И.Г. Дроздов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Приложение №1 «Труды научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН». – С. 52-55.
21. Потапова, О.В. Структурные изменения в лимфоидных органах мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц H5N1-субтипа А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 /
О.В. Потапова, В.А. Шкурупий, Н.Г. Лузгина, А.М. Шестопалов, И.Г. Дроздов,
И.В. Одарченко, Л.В. Шестопалова // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. – 2008. – № 5. – С. 162-165.
22. Прокудин, А.В. Эпизоотологический мониторинг гриппа А у диких птиц на Таймыре в 2005-2007 гг. / А.В. Прокудин, К.А. Лайшев, К.А. Шаршов, А.Г. Дурыманов, А.М. Шестопалов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2008.
– № 6. – С. 92-94.
23. Шаркова, Т.В. Структурные изменения в печени мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц субтипа H5N1 // Т.В. Шаркова, О.В. Потапова, В.А. Шкурупий,
А.М. Шестопалов, И.Г. Дроздов, Л.В. Шестопалова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т. 146 (7). – С. 210-212.
24. Шаршов, К.А. Некоторые биологические характеристики вновь выделенного высокопатогенного вируса гриппа H5N1 / К.А. Шаршов, В.Ю. Марченко, И.М. Суслопаров, А.Г. Дурыманов, А.М. Шестопалов, О.Г. Курская // Российский иммунологический журнал. – 2008. –Т. 2 (11). – № 2-3. – С. 265.
25. Шестопалов, A.M. Изучение патогенности штаммов вируса гриппа птиц H5N1субтипа, выделенных на территории Российской Федерации, на мышиной модели
/ A.M. Шестопалов, К.А. Шаршов, А.В. Зайковская, Ю.Н. Рассадкин, И.Г. Дроздов, В.А. Шкурупий, О.В. Потапова, Н.Г. Лузгина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т.146. – № 9. – С. 317-319.
26. Шестопалова, Л.В. Морфологические изменения внутренних органов птиц при
экспериментальном заражении высокопатогенным вирусом гриппа птиц H5N1подтипа / Л.В. Шестопалова, В.А. Шкурупий, Т.В. Шаркова, А.М. Шестопалов //
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Приложение № 1
«Труды научного центра клинической и экспериментальной медицины СО
РАМН». – С. 56-59.
27. Яцышина, С.Б. Изоляция и молекулярная характеристика вирусов гриппа
A/H5N1, выделенных во время вспышек гриппа у птиц в 2005 г. в европейской части России: выделение штамма вируса с мутацией устойчивости к озельтамивиру /
С.Б. Яцышина, А.М. Шестопалов, В.А. Евсеенко, Т.С. Астахова, С.И. Браславская,
В.А. Терновой, Т.Ю. Кондратьева, А.Ю. Алексеев, С.И. Золотых, Ю.Н. Рассадкин,
А.В. Зайковская, А.Г. Дурыманов, С.В. Нетесов, Г.А. Шипулин // Молекулярная
генетика, микробиология и вирусология. – 2008. – № 1. – С. 26-34.
28. Донченко, А.С. Изучение биологических свойств вируса гриппа птиц H5N1субтипа, выделенного в России / А.С. Донченко, Ю.Г. Юшков, К.А. Шаршов,
Е.М. Шестопалова, А.М. Шестопалов, И.Г. Дроздов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2009. – № 10. – С. 84-89.
32
29. Донченко, А.С. Разработка вакцины против высокопатогенного вируса гриппа
птиц Н5N1 / А.С. Донченко, Ю.Г. Юшков, С.В. Леонов, И.Г. Дроздов, А.М. Шестопалов, Ю.Н. Рассадкин, А.Г. Дурыманов, А.В. Зайковская, С.И. Золотых // Ветеринария. – 2009. – № 2. – С.23-26.
30. Зайковская, А.В. Зараженность вирусом бешенства лисиц без клинических признаков болезни на стационарно неблагополучных территориях / А.В. Зайковская,
В.И. Аксенов, О.А. Меркушев, А.М. Шестопалов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2009. – № 2. – С. 117-119.
31. Курская, О.Г. Реакция торможения гемагглютинации для ретроспективной диагностики гриппа птиц у млекопитающих / О.Г. Курская, А.Г. Дурыманов,
К.А. Шаршов, А.В. Зайковская, А.М. Шестопалов, Т.Н. Ильичева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009 – № 5. – С. 75-79.
32. Курская, О.Г. Мониторинг антител к вирусу гриппа А у населения различных регионов Западной Сибири / О.Г. Курская, Т.Н. Ильичева, А.В. Зайковская,
Л.М. Горбатовская, А.М. Шестопалов, И.Г. Дроздов // Журнал микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. – № 3. – С. 92-95.
33. Романовская, А.А. Изучение чувствительности вирусов гриппа A(H1N1), вызвавших заболевания в апреле-мае 2009 года, к противовирусным препаратам в культуре клеток MDCK / А.А. Романовская, А.М. Дурыманов, К.А. Шаршов, А.В. Зайковская, И.М. Суслопаров, А.М. Шестопалов, И.А. Ленёва, И.Г. Дроздов // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. – Т. 54(5-6). – С. 41-47.
34. Ковалевская, А.А. Экспериментальная инфекция вируса гриппа А/H5N1 у представителей вида felis catus / А.А. Ковалевская, В.И. Околелов, А.М. Шестопалов,
А.В. Зайковская, И.Г. Дроздов // Ветеринария. – 2010. – № 3. – С. 28-30.
35. Шаршов, К.А. Характеристика высокопатогенного штамма вируса гриппа Н5N1субтипа, выделенного от сизой чайки (Larus canus) / К.А Шаршов, О.Г. Курская,
А.В. Зайковская, А.К. Юрлов, И.М. Суслопаров, В.А. Терновой, А.Г. Дурыманов,
С.И. Золотых, А.М. Шестопалов, И.Г. Дроздов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. – № 1. – С. 29-32.
Патенты
36. Патент 2340673 Российская Федерация, МПК С 12N 15/00. Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса бешенства в образцах / Зайковская А.В., Нетесов С.В., Рассадкин Ю.Н., Терновой В.А., Шестопалов А.М.; заявитель и патентообладатель ФГУН Государственный научный центр вирусологии
и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора. – № 2007113415, заявл. 10.04.07;
опуб. 10.12.08, Бюл. № 34. – С. 54.
37. Патент 2366709 Российская Федерация, МПК С 12 N 7/00. Штамм вируса гриппа
птиц А/ Goose / Krasnozerskoye/ 627/ 05 H5N1 субтипа для изучения биологии вируса гриппа, лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов / Шестопалов А.М., Зайковская А.В., Дурыманов А.Г., Золотых С.И.,
Шаршов К.А., Рассадкин Ю.Н., Дроздов И.Г.; заявитель и патентообладатель
ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Роспотребнадзора. – № 2008118903/13, заявл. 13.05.08, опубл. 10.09.09, Бюл. № 25
– С.57.
33
Книги
38. Дроздов И.Г. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: практическое руководство / И.Г. Дроздов, А.Н. Сергеев, С.В. Нетесов, В.Б. Локтев,
А.П. Агафонов, Ю.В. Туманов, С.Н. Щелкунов, Е.И. Рябчикова, Л.Н. Яшина, В.А.
Терновой, А.Г. Полтавченко, В.С. Петров, А.А. Сергеев, В.Н. Дутов, А.М. Шестопалов, А.Ю. Алексеев, О.К. Демина.- Москва, ОАО « Изд-во «Медицина, изд-во
«Шико», 2009. – 472 с.
39. Грипп птиц в Сибири: Лабораторные и эпидемиологические исследования, противоэпидемические и противоэпизоотические мероприятия в период эпизоотии вируса гриппа среди домашней птицы в Сибирском и Уральском федеральных округах Российской федерации (июль – ноябрь 2005 года)/ Под общ. ред. акад.
Г.Г. Онищенко. / Г.Г. Онищенко, Г.Ф. Лазикова, Е.Б. Ежлова, В.Н. Михеев,
Н.И. Шульгина, Т.А. Уфимцева, И.Г. Дроздов, С.В. Нетесов, Т.П. Лобанова,
А.М. Шестопалов, С.И. Золотых, А.К. Юрлов, Ю.Г. Юшков // Новосибирск:
ЦЭРИС. - 2006. – 192 с.
Статьи в научных журналах
40. Шестопалов, А.М. Обстановка по рабической инфекции в Новосибирской области
/ А.М. Шестопалов, В.И. Аксенов, Ю.Н. Рассадкин, Е.Н. Устинова // Микробиология. – 1999. – № 3. – С. 115-116.
41. Кононова, Ю.В. Мониторинг вируса Западного Нила у врановых юга Западной
Сибири / Ю.В. Кононова, А.К. Юрлов, В.А. Терновой, С.И. Золотых, Е.В. Протопопова, А.В. Друзяка, С.Н. Борисов, В.Б. Локтев, А.М. Шестопалов // Журнал инфекционной патологии. – 2004. – Т. 11 (3-4). – С.73-76.
42. Разумова, Ю.В. Особенности циркуляции вирусов гриппа А в популяциях диких
птиц на юге Западной Сибири / Ю.В. Разумова, М.Ю. Щелканов, А.К. Юрлов,
А.Б. Беклемишев, А.М. Шестопалов, Д.К. Львов // Журнал инфекционной патологии. – 2004. – Т. 11 (3-4). – С.91-94.
43. Онищенко, Г.Г. Выявление в Западной Сибири высокопатогенных H5N1 вирусов
гриппа, генетически родственных вирусам, циркулирующим в Юго-Восточной
Азии в 2003-2005 гг. / Г.Г. Онищенко, А.М. Шестопалов, В.А. Терновой, В.А. Евсеенко, А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, Ю.В. Разумова, А.В. Зайковская, С.И.
Золотых, С.В. Нетесов, Л.С. Сандахчиев // Доклады Академии наук. – 2006. – № 2.
– С. 278-280.
44. Платонова Л.В. О первых результатах эпидемиологического мониторинга лихорадки Западного Нила в Новосибирской области / Л.В. Платонова, В.Н. Михеев,
В.Б. Локтев, Ю.В. Кононова, А.М. Шестопалов, Т.А. Дупал // Сибирь-Восток. 2006. – № 3. – С. 45-48.
45. Ковалевская, А.А. Мониторинг вируса гриппа среди дикой и синантропной птицы
на территории Омской области в 2006 г. / А.А. Ковалевская, Н.Ф. Хатько,
В.И. Околелов, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Ветеринарный консультант. –
2007. – № 5 (144). – C. 7-10
46. Онищенко, Г.Г. Молекулярно-биологический анализ изолятов вируса гриппа
птиц, вызвавших эпизоотии на юге западной Сибири и в Крыму / Г.Г.Онищенко,
С.П.Бережнов, А.М.Шестопалов, А.Ю.Алексеев, В.А.Терновой, А.Б.Хайтович,
34
М.Т.Кровякова, С.В.Нетесов, И.Г. Дроздов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2007. – № 5. – С. 28-32.
47. Разумова Ю.В. Молекулярно-генетический анализ гена гемагглютинина штамма
вируса гриппа А подтипа Н5, изолированного на юге Западной Сибири в 2003 году
/ Ю.В. Разумова, Ю.С. Букин, А.Б. Беклемишев, А.М. Шестопалов // Бюллетень
Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. – 2007. – № 5
(127). – С.78-82.
48. Терновой В.А. Случаи лихорадки Западного Нила в Новосибирской области в
2004 г. и генотипирование вируса, вызвавшего заболевание / В.А. Терновой,
Е.В. Протопопова, Ю.В. Кононова, Е.А. Ольховикова, Э.А. Спиридонова,
Г.Д. Акопов, А.М. Шестопалов, В.Б. Локтев // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2007. – № 1. – С. 21-26.
49. Хатько Н.Ф. Диагностика и мониторинг гриппа птиц на территории Омской области / Н.Ф. Хатько, А.А. Ковалевская, В.И. Околелов, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Молекулярная диагностика. – 2007. – Т. 1. – С. 217-219.
50. Шаршов К.А. Результаты мониторинга вируса гриппа среди синантропных птиц в
эпизоотический и постэпизоотический периоды на юге Западной Сибири /
К.А. Шаршов, С.И. Золотых, Е.Г. Федоров, И.В. Иванов, А.В. Друзяка, А.М. Шестопалов, С.В. Нетесов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2007. – № 4. – С. 53-56.
51. Чернявский, В.Ф. Птичий грипп в Якутии: проблема, опыт, диагностика и профилактика / В.Ф. Чернявский, А.М. Шестопалов, М.М. Тяптиргянов, А.Г. Дегтярев,
Е.Ф. Беланов, К.А. Шаршов, О.И. Никифоров, В.В. Герасимова, Н.А. Антонов //
Якутский медицинский журнал. – 2008. – № 1. – С. 39-41.
52. Шестопалова, Л.В. Структурные изменения легких у мышей, инфицированных
вирусом гриппа птиц H5N1 субтипа / Л.В. Шестопалова, В.А. Шкурупий,
Т.В. Шаркова, О.В. Потапова, А.В. Зайковская, А.М. Шестопалов // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. – 2008. – Т. 6. – № 3-2. – С. 3-10.
53. Ковалевская, А.А. Изучение патогенности вирусов гриппа А/H5N1 для домашних
кошек / А.А. Ковалевская, В.И. Околелов, А.В. Зайковская, А.М. Шестопалов //
Сборник Института Природно-очаговых инфекций. – 2009. –С. 230-231.
54. Онищенко, Г.Г. Свойства штаммов пандемического вируса гриппа, выделенных
на территории России / Г.Г. Онищенко, А.П. Агафонов, О.К. Демина, А.А. Сергеев, В.А. Терновой, Л.Н. Шишкина, Н.И. Бормотов, А.С. Кабанов, М.О. Скарнович,
А.Н. Шиков, А.О. Семенцова, А.М. Шестопалов, С.Н. Шпынов, Е.А. Ставский,
И.Г. Дроздов // Проблемы особо опасных инфекций. – 2009. – № 101.– С.5-9.
55. Силко, Н.Ю. Исследование онколитической активности штаммов вируса болезни
Ньюкасла / Н.Ю. Силко, А.М. Шестопалов, Л.В. Шестопалова // Казанская наука.
– 2009. – Вып. 1. – С. 13.
56. Силко, Н.Ю. Случаи выделения вируса болезни Ньюкасла на территории России
/ Н.Ю. Силко, А.М. Шестопалов, Л.В. Шестопалова // Вестник Новосибирского
государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. – 2010.
– Т. 8. – № 1. – С. 57-61.
35
Статьи в иностранных научных журналах
57. Evseenko, V.A. Investigation of HPAI viruses caused epizooty in Russia in 2005 / V.A.
Evseenko, A.V. Zaikovskaya, A.S. Lipatov, A.M. Shestopalov // International Journal of
Infectious Diseases (IJID) supplemental edition. –2006. – June. – Р. 127.
58. Shestopalov, A.M. H5N1 Influenza Virus, Domestic Birds, Western Siberia, Russia /
A.M. Shestopalov, A.G. Durimanov, V.A. Evseenko, V.A. Ternovoi, Y.N. Rassadkin,
Y.V. Razumova, A.V. Zaykovskaya, S.I. Zolotykh, S.V. Netesov // Emerging Infectious
Diseases. – 2006. – V. 12(7). – Р. 1167-1169.
59. Marchenko, V.Yu. Results of the influenza virus surveillance in wild birds in Western
part of Mongolia / V.Yu. Marchenko, A.Yu. Alekseev, D. Tserennorov, A.K. Yurlov,
I.M. Susloparov, K.A. Sharshov, F.A. Ilyinykh, S.I. Zolotykh, D. Abmed, D. Otgonbaatar, A.M. Shestopalov // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. – 2010. – V.1. – P.
6-10.
60. Evseenko, V.A. Experimental infection of H5N1 HPAI in BALB/c mice /
V.A. Evseenko, E.K. Bukin, A.V. Zaykovskaya, K.A. Sharshov, V.A. Ternovoi,
G.M. Ignatyev, A.M. Shestopalov // Virology Journal. – 2007. –V. 27(4). – P. 77.
61. Lipatov, A.S. Influenza (H5N1) viruses in poultry, Russian Federation, 2005-2006 /
A.S. Lipatov, V.A. Evseenko, H.L. Yen, A.V. Zaykovskaya, A.G. Durymanov,
S.I. Zolotykh, S.V. Netesov, I.G. Drozdov, G.G. Onishchenko, R.G. Webster,
A.M. Shestopalov // Emerging Infectious Diseases. – 2007. – V. 13(4). – P. 539-546.
36