Эпителиальный компонент криптолимфона глоточной миндалины
реклама
На правах рукописи КАЛИНИН Дмитрий Валерьевич ПАТОМОРФОЛОГИЯ АДЕНОИДНЫХ ВЕГЕТАЦИЙ В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ (МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.03.02 – патологическая анатомия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноклинический центр оториноларингологии ФМБА России» Научный руковолитель: доктор медицинских наук, профессор Быкова Валентина Павловна Официальные оппоненты: Заведующий кафедрой патологической анатомии ГБОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Зайратьянц Олег Владимирович Доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Ведущая организация: ГБОУ ВПО Рогов Константин Аркадьевич «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России Защита диссертации состоится «____»___________ 2013 года в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук (117418, Москва, ул. Цюрупы д.3). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук Автореферат разослан «___»___________ 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета Михайлова Лилия Петровна доктор медицинских наук 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы По данным ведущих педиатрических клиник, заболевания органов лимфаденоидного глоточного кольца Вальдейера занимают первое место по распространенности среди всей ЛОР-патологии детского возраста: доля детей с хроническими аденотонзиллитами колеблется от 20% до 50%, а в группе часто болеющих детей от 37% до 70% (Карпова Е.П., 2009). Аденоидные вегетации (разрастания), или аденоиды, представляют собой реактивную гиперплазию глоточной миндалины в ответ на антигенные воздействия (Быкова В.П., Бруевич О.А., Паюшина О.В., 2007). Наибольшая выраженность и распространенность аденоидных вегетаций отмечается в возрасте 3-4 и 5-7 лет. Приведенные «возрастные пики» реактивной гиперплазии глоточной миндалины педиатры и ЛОР врачи связывают с возрастным становлением «незрелой» иммунной системы вследствие расширения внешнего микробного окружением при поступлении детей в дошкольные учреждения и школу (Борзов Е.В., Соколов Р.О., 2003; Борзов Е.В., 2003; Гаращенко Т.И., 2006). Однако, используемый в клинической практике термин «незрелость» иммунной системы, в доступной литературе не имеет должного морфологического эквивалента, кроме того немногочисленные морфологические исследования не учитывают данные о возрастных различиях в структуре глоточной миндалины. До настоящего времени мы не встретили упоминания о возможной связи структуры глоточной миндалины с возрастной незрелостью иммунной системы. В то же время, несмотря на важную роль глоточной миндалины в становлении иммунной системы ребенка (Быкова В.П., Бруевич О.А., Паюшина О.В., 2007) аденотомия остается пока методом выбора в лечении аденоидита (Еремина Н.В., Русецкий Ю.Ю., Чернышенко И.О., 2002; Бруевич О.А., 2006; Гаращенко Т.И., 2007). Изучение удаленных аденоидов у детей разного возраста рассматривается нами как исключительно важная возможность получения информации о морфологических проявлениях возрастной иммунной реактивности детей на уровне данного лимфоэпителиального органа. Известно, что морфологическим эквивалентом иммунного ответа является гиперплазия лимфоидной ткани с образованием вторичных лимфатических фолликулов, в герминативных центрах которых осуществляется клональная пролиферация В клеток, что показано на примере лимфатических узлов и селезенки (Branrtzaeg P., Halstensen T. S. 1992; Быкова В.П., Иванов А.А., Пакина В.Р., 1996). Однако морфологические проявления иммунного ответа и реактивных изменений лимфоэпителиальных образований лимфаденоидного глоточного кольца Вальдейера, которые в настоящее время рассматриваются в качестве «сторожевых» охранных структур (Быкова В.П., Бруевич О.А., Паюшина О.В., 2007), остаются недостаточно изученными в возрастном аспекте, особенно в свете современной концепции врожденного иммунитета, предложеноой Medzhitov R., Janeway C.A. Jr. (Medzhitov R., Janeway C.A. Jr., 1997; 1998). Согласно этой концепции, запуск адаптивного иммунного ответа невозможен без участия факторов врожденного иммунитета: распознавание антигенной структуры патогена при первом взаимодействии с макроорганизмом и первый немедленный ответ реализуются механизмами врожденного иммунитета. Взаимодействуя с врожденной иммунной системой посредством дендритных клеток, адаптивный иммунитет включается последовательно и отсрочено (Iwasaki A., Medzhitov R., 2002). Система врожденного 3 иммунитета представлена разнообразными клетками, несущими паттерн распознающие рецепторы (pattern-recognition receptors – PRRs), такие как Toll-подобные рецепторы (Tolllike receptors — TLRs), RIG-I-подобные рецепторы (RIG-I-like receptors — RLRs) и др. PRRs взаимодействуют с консервативными молекулярными структурами (патогенассоциированными молекулярными паттернами - pathogen associated molecular patterns – PAMPs), общими и специфическими для родственных групп возбудителей (Pasare C, Medzhitov R., 2004; 2005; Kawai T., Akira S., 2006; Ярилин А.А., 2010; Друцкая М.С., Белоусов П.В., Недоспасов С.А., 2011). Результатом этого взаимодействия является образование различных мессенджеров для инициации иммунного ответа, ключевым из которых является нуклеарный фактор κB (nuclear factor κB), запускающий экспрессию генов, отвечающих за синтез цитокинов и молекул адгезии (Medzhitov R., Janeway C.A. Jr., 2002; Akira S., Takeda K., 2004). По последним литературным данным методом ПЦР в реальном времени выявлена мРНК TLRs 1-10 в первичной культуре эпителиальных клеток глоточной миндалины как в нестимулированном состоянии, так и после антигеной стимуляции (Lange M., Lasiter J., Misfeldt M.L., 2009). Однако, в настоящее время, мы не встретили работ, в которых на морфологическом уровне показана экспрессия Toll-подобных рецепторов в аденоидах. Цель исследования: провести морфологическое и иммуногистохимическое исследование аденоидов детей и уточнить возрастные особенности морфофункциональной организации гипертрофированной глоточной миндалины как лимфоэпителиального органа в свете современных представлений о взаимодействии врожденной и адаптивной иммунной системы. Задачи исследования 1. Охарактеризовать с помощью гистологических и иммуногистохимических методов функциональные компартменты глоточной миндалины у детей по выделенным возрастным группам; 2. Провести морфометрическую оценку площади функциональных отделов криптолимфона глоточной миндалины в выделенных возрастных группах; 3. Провести количественную морфометрическую оценку иммуногистохимических маркеров функциональной активности клеток врожденного и адаптивного иммунитета глоточной миндалины в выделенных возрастных группах по экспрессии транскрипционного фактора bcl-6; проапоптотического белка p53; молекул В лимфоцитов (CD19, CD20, CD79a), Т лимфоцитов (CD3, CD5), макрофагов (CD68), фолликулярных дендритных клеток (CD21, CD23), тимоцитов (TdT, CD1a); антиапоптотического белка bcl2; ко-рецептора врожденной иммунной системы (CD80). 4. Оценить пролиферативную активность лимфоцитов по Ki67, как основу гиперплазии лимфоидной ткани в пределах выделенных возрастных групп; 5. Выявить в структуре аденоидов наличие TLR 2, 4, 9, молекулы CD14 и определить их взаимосвязь с выделенными функциональными компартментами; 6. Представить морфофункциональное обоснование возрастной незрелости иммунной системы у детей на уровне лимфоэпителиального органа; 7. На основе полученных данных разработать алгоритм морфологического исследования аденоидов для формулировки патоморфологического диагноза, адекватного запросам педиатрической и ЛОР клиник. 4 Научная новизна Морфометрическое исследование аденоидов выявило реципрокные отношения («ножницы») между относительными площадями фолликулярной и диффузной лимфоидной ткани в выделенных возрастных группах. Установлено снижение протяженности зоны лимфоэпителиального симбиоза и увеличение протяженности респираторного эпителия при сохранении локальных реактивных участков лимфоэпителиального симбиоза по мере увеличения возраста детей. По экспрессии молекул Т лимфоцитов (CD3, CD5), В лимфрцитов (CD19, CD20, CD79a), макрофагов (CD68) детально охарактеризован относительный клеточный состав функциональных компартментов глоточной миндалины. Определена экспрессия Ki67 как показателя пролиферативной активности в герминативных центрах фолликулов, установлено статистически достоверное снижение относительного количества пролиферирующих клеток диффузной лимфоидной ткани по мере увеличения возраста детей. Впервые на морфологическом уровне в структуре аденоидов выявлена экспрессия Toll-подобных 2, 4, 9 рецепторов, молекулы CD14 на эпителиоцитах респираторного эпителия, ретикулярных эпителиальных клетках зоны лимфоэпителиального симбиоза, эндотелиальных клетках венул с высоким эндотелием, а также на макрофагах и фолликулярных дендритных клетках герминативных центров. Экспрессия молекул TdT и CD1a клетками диффузной лимфоидной ткани, прилежащей к нижним полюсам фолликулов определена как особенность организации аденоидов детей младшей возрастной группы, что позволило разработать морфофункциональное обоснование возрастной «незрелости» иммунной системы у детей на уровне данного лимфоэпителиального органа. Практическая значимость На основе морфофункционального обоснования возрастной «незрелости» иммунной системы у детей на уровне лимфоэпителиального органа разработан алгоритм морфологического исследования аденоидных вегетаций для оценки удаленных аденоидов и формулировки патоморофологического диагноза, адекватного требованиям ЛОРклиники. Созданы базовые данные о морфологических особенностях организации аденоидов в различные возрастные периоды, необходимые для оценки вакцинации, дифференциальной диагностики с вирусными и лимфопролиферативными заболеваниями. Полученные данные служат основанием для органосохраняющего направления в лечении аденоидных вегетаций. Основные положения, выносимые на защиту 1. Структура глоточной миндалины детей в выделенные возрастные периоды различается: у детей младшей возрастной группы преобладает относительная и абсолютная площади вторичных фолликулов; по мере взросления детей нарастает относительная площадь парафолликулярной лимфоидной ткани, а также снижается протяженность зоны лимфоэпителиального симбиоза. В тоже время, относительный клеточный состав фолликулярной и диффузной лимфоидной ткани глоточной миндалины не имеет статистически достоверных различий по мере увеличения возраста детей. 5 2. Лакунарный и люминальный эпителий, дендритные клетки герминативных центров, эндотелий приносящих и выносящих сосудов, полиморфноядерные лейкоциты аденоидов экспрессируют TLR 2, 4, 9. 3. Возрастной особенностью структурной организации глоточной миндалины является наличие клеток с тимическим фенотипом (TdT+ и CD1a+) преимущественно у детей младшей возрастной группы. Клетки с данным фенотипом встречаются в диффузной лимфоидной ткани вблизи сосудистой зоны, прилежащей к нижним полюсам фолликулов. В этой же возрастной группе детей обнаруживаются клетки врожденной иммунной системы – B1a В лимфоциты, с фенотипом CD5+/CD19+, преимущественно в субэпителиальной зоне и просвете лакун. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: заседании Московского отделения Российского общества Патологоанатомов (г. Москва, 2010 г.); VIII всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2010 г.); VIII Конгрессе Ринологов России (г. Оренбург, 2009 г.); 25-й международной конференции молодых оториноларингологов (г. Амман, Иордания, 2009 г.); 26-й международной конференции молодых оториноларингологов (г. Санкт-Петербург, 2010 г.); на межлабораторной конференции ФГБУ «Научно-клинического Центра Оторинларингологии ФМБА России» (г. Москва, 11.2009 г.). Внедрение результатов исследования в практику. Разработанный алгоритм морфологического исследований аденоидных вегетаций внедрен в практическую работу патологоанатомических отделений Городской клинической больницы №67 (г. Москва), Детской городской клинической больницы №9 (г. Москвы), Лабораторию патологической анатомии ЛОР-органов ФГБУ «Научно-клинического центра оториноларингологии ФМБА России». Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 – в журналах, рекомендованых ВАК РФ. Личный вклад автора в проведённое исследование. Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных литературных источников по теме диссертации, разработан дизайн исследования. Проведена гистологическая обработка биопсийного и операционного материала, изготовлены срезы биоптатов, на которых в последующем осуществлена постановка иммуногистохимических реакций. С помощью светового микроскопа проведен анализ полученных гистологических и иммуногистохимических препаратов, проведено фотодокументирование и морфометрический анализ исследуемых показателей. Осуществлена статистическая обработка полученных данных. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 93 отечественных и 133 зарубежных источников, и двух приложений. Диссертация иллюстрирована 17 графиками, 65 рисунками, 10 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клинико-морфологическая характеристика операционного материала и методы исследования Среди обследованных и находившихся на лечении детей, в период с 2000 по 2010 год в отделении детской ЛОР-патологии ФГУ «НКЦО» на базе Детской Клинической 6 Больницы №9 им. Г.Н. Сперанского было отобрано 94 ребёнка (произвольная выборка) в возрасте от 15 месяцев до 15 лет, поступивших в клинику по поводу хронического аденоидита, гипертрофии глоточной миндалины, аденоидита в сочетании с гипертрофией небных миндалин и/или хроническим тонзиллитом. Собственно морфологическому исследованию предшествовало изучение сопроводительной медицинской документации (истории болезни и направления на патоморфологическое исследование). Среди 94 отобранных детей оказалось 54 мальчика и 40 девочек. Все дети были разделены на группы, в соответствии с возрастной периодизации, опирающейся на клинические наблюдения пиков аденоидных вегетаций (Бруевич О.А., 2006). При детализации анамнеза в ЛОР-клинике у детей всех возрастных групп были указания на хронические и перенесенные острые ЛОР-заболевания: риниты – 16, гаймориты – 27 (преимущественно дети III возрастной группы), отиты – 8, мезо- и эпитимпаниты – 12, ангины – 6 (преимущественно дети III возрастной группы), гипертрофия фолликулов задней стенки глотки и гипертрофия задних отделов нижней носовой раковины – 15, кондуктивная тугоухость – 4. Таблица 1. Распределение детей по полу и возрасту Возраст 1 год 3 месяца 4 года – 7 лет 8 лет – 15 лет Пол – 3 года 11 11 месяцев ВСЕГО месяцев (I ГРУППА) (II ГРУППА) (III ГРУППА) Мальчики 13 21 20 54 Девочки 12 15 13 40 ВСЕГО 24 36 34 94 Все дети до поступления в стационар получали консервативную терапию, направленную на лечение аденоидита по различным схемам, включавшим туширование протарголом, полоскания, иммуномодуляторы растительного происхождения (настойка туи, иов-малыш, эуфорбиум – 8) и иммуномодуляторы микробного происхождения (14) в сроки от 6 месяцев до 1 года. Детей, получавших иммуномодуляторы микробного происхождения (бактериальные лизаты), мы выделили в отдельную группу и исключили из диссертационной разработки, поскольку эти наблюдения составили объект отдельного исследования, выходящего за пределы поставленных задач. Оперативное удаление аденоидов выполнялось в связи с неэффективностью консервативной терапии. Таким образом, материалом нашего исследования послужили аденоиды 80 детей, полученные после аденоидэктомии, частичной аденотомии и аденотонзиллэктомии. Все операции были выполнены в период ремиссии, в сроки не менее 4 недель от последнего респираторного заболевания. Эти исходные клинические характеристики определили общий дизайн работы и выбор методов. Методы исследования Операционный материал оценивали макроскопически, фиксировали в 10% забуференном формалине (pH 7,0 - 7,2). Срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали 7 гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, альциановым синим, в ряде случаев проводили PAS-реакцию. Иммуногистохимическое исследование выполнялось на серийных парафиновых срезах отобранных образцов (случайная выборка), не менее чем в 10 случаях из каждой возрастной группы. Постановку реакций осуществляли в соответствии с методикой C.R. Taylor, R.J. Cote (1994), согласно протоколам фирм-производителей, прилагаемым к используемым моно- и поликлональным антителам. В случае необходимости, проводили высокотемпературное восстановление антигенных детерминант по методам S.R Shi et al. (1997, 2010, 2011). Панель моно- и поликлональных антител включала: основные дифференцировочные маркеры Т лимфоцитов (CD3, CD5), Про-В лимфоцитов (CD19) и В лимфоцитов (CD20), пан В-лимфоцитарного маркера (CD79a), маркеры фолликулярных дендритных клеток (CD21) и активированных В лимфоцитов (CD23), макрофагов (CD68), кортикальных тимоцитов (CD1a, TdT), маркеры пролиферации и апоптоза (Ki67, p53), антиапоптотический маркер (bcl-2), транскрипционный фактор (bcl-6), TLR 2 (распознает PAMPs грамположительных бактерий, дрожжей), TLR 4 (распознает молекулу MD2 в комплексе с CD14 и липополисахарид-связанным протеином грамотрицательных бактерий), TLR 9 (распознает ДНК микроорганизмов и синтетические олигодезоксинуклеотиды, содержащие неметилированные CpG-мотивы), ко-рецептор врожденного иммунитета (CD80), высокомолекулярный цитокератин (клон 34βE12), маркер эндотелиальных клеток (CD34), маркер молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR). Для визуализации реакций применяли готовые тест-системы с универсальными вторичными антителами мечеными хромогеном (HRP-polymer Detection system, BioGenex: хромоген - 3,3'-диаминобензидин; Histophine, Nichirei Corp.: хромоген - 3,3'диаминобензидин; G|2 Doublestain Detection system, DAKO: хромоген - 3,3'диаминобензидин и перманентный красный). Позитивные результаты иммуногистохимической реакции учитывали при наличии двух негативных контролей: на специфичность реакции и отсутствие активной эндогенной пероксидазы (а также эндогенной щелочной фосфатазы, в случаях с использованием двойного окрашивания) и одного внутреннего позитивного контроля на специфичность реакции. Морфометрические исследования и статистическая обработка полученных данных Для определения площадей морфофункциональных компартментов глоточной миндалины, а также площадей вторичных фолликулов использовали компьютерную программу анализа изображений ImageJ и приложение Leica Application Suite 3.6 на гистопрепаратах при увеличении 50, отвечающих следующим требованиям: 1. Обязательно наличие всех составляющих криптолимфона; 2. Оценивали преимущественно поля с правильно ориентированными фолликулами: верхним полюсом к эпителию лимфоэпителиального симбиоза (ЛЭС) и нижним к сосудистой зоне; 3. Исключали фолликулы с прогрессивно трансформированным зародышевыми центрами (ПТЗЦ); 4. Оценивали от 6 до 12 фолликулов для каждого случая, находили среднюю. 8 Для гистоморфометрии были отобраны препараты, окрашенные гематоксилином и эозином: 15 наблюдений аденоидов детей I группы и по 12 препаратов аденоидов детей II и III групп. Для морфометрии по иммуногистохимическим препаратам было отобрано по 6 случаев из каждой группы. Подсчет протяженности неизмененного респираторного эпителия, респираторного эпителия с базально-клеточной пролиферацией и зоны ЛЭС проводили на срезах, окрашенных антителами к высокомолекулярному цитокератину в 12 репрезенативных полях зрения при увеличении 50. В эпителиальном компартменте подсчет T и B лимфоцитов, экспрессирующих молекулы CD3 и CD20 соответственно, а также макрофагов, экспрессирующих молекулу CD68 проводили в 24 полях зрения при увеличении 400 (не менее 12 для интраэпителиальных лимфоцитов и макрофагов в респираторном эпителии и не менее 12 для лимфоцитов и макрофагов зоны ЛЭС), для каждого случая определяли средний показатель. Подсчет клеток в герминативных центрах вторичных фолликулов, экспрессирующих CD3, CD5, bcl-2, bcl-6, p53, проводили в 10 полях зрения при увеличении 1000 (по 5 в светлой и темной зоне герминативного центра) для 3-6 фолликулов, для каждого случая определяли средний показатель. Подсчет клеток парафолликулярной лимфоидной ткани, экспрессирующих CD20, CD68 и Ki67, проводили минимум в 18 репрезенативных полях зрения (по 6-12 в зоне вен с высоким эндотелием (high endothelial venules – HEV), субэпителиальной, межфолликулярной зонах, при увеличении 1000), для каждого случая определяли средний показатель. Подсчет клеток зоны HEV парафолликулярной лимфоидной ткани, экспрессирующих CD1a, TdT, проводили в 12 репрезенативных полях зрения при увеличении 1000, для каждого случая находили среднюю. Полученные данные обрабатывали на программе STATISTICA 8.0 (Statsoft, Inc., США). Описательная статистика количественных признаков представлена минимальными, максимальными значениями признака, стандартным отклонением, ошибкой среднего, медианами и квартилями. Для анализа связей нескольких переменных определяли коэффициент корреляции Спирмена, который является непараметрическим аналогом коэффициента Пирсона для интервальных и порядковых переменных, не подчиняющихся нормальному распределению (Гланц С., 1998; Платонов А.Е., 2000). Гипотезы различия считали статистически значимыми при значении уровня достоверности ниже 0,05 (p<0,05). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Мы провели анализ анамнестических данных и результатов морфологического исследования 94 детей с аденоидными вегетациями в возрасте от 2 до 15 лет. Выявлено, что среди детей с данной патологией поступивших в стационар для оперативного лечения преобладали пациенты в возрасте то 4 лет до 7 лет 11 месяцев и от 8 лет до 15 лет, их доля составляла 38% и 36% соответственно, в то время как группа детей в возрасте от 2 лет до 3 лет 11 месяцев составила 26%. Количество мальчиков (57%) несколько превышало количество девочек (43%), что подтверждает исследования А. С. Юнусова (1986) относительно половых различий в распространенности аденоидитов среди детей. Преобладание детей от 4 до 7 лет мы объясняем тем, что именно в этом возрасте организм 9 ребенка сталкивается с новым антигенным окружением, что связано с началом посещения детского дошкольного или школьного учреждения. В тоже время, при анализе анамнестических данных было выявлено, что инфекционные заболевания протекали в возрастном физиологическом коридоре. Анализ клинических данных позволил установить, что весь операционный материал получен в период ремиссии. Наиболее реактивными, по степени гипертрофии глоточной миндалины, оказались дети I и II возрастных групп, то есть дети дошкольного и младшего школьного возраста. При макроскопическом исследовании глоточные миндалины после аденоидэктомии и аденотонзиллотомии (61 ребенок), как и аденоиды после частичной аденотомии (19 детей) были представлены рыхлыми фрагментами серо-розовой ткани различных размеров, с наличием 1-2 складок слизистой оболочки на поверхности одного или нескольких фрагментов. Обращало внимание частое несоответствие клинической оценки степени гипертрофии глоточной миндалины с её фактическими размерами в доставленном материале. Так, при II клинической степени гипертрофии материал мог быть более объёмным, чем при III. Эти обстоятельства и то, что практически весь операционный материал был фрагментирован, не позволили нам проводить измерение аденоидов, тем более, что у 19 детей была выполнена частичная (парциальная) аденотомия. При микроскопическом исследовании на гистологических срезах толщиной 4-5 мкм и 7-9 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, при световой микроскопии в структуре глоточной миндалины четко дифференцировалась фолликулярная и диффузная лимфоидная ткань, а также эпителиальный пласт, выделяя компоненты криптолимфонов (Рис. 1, 2, стр. 11). Фолликулярная и диффузная лимфоидная ткань была распределена весьма неравномерно, общая структура аденоидов напоминала по строению лимфатический узел. Вторичные лимфатические фолликулы с морфологически различимыми зонами располагались в один ряд под эпителиальным пластом между плотно упакованной диффузной парафолликулярной лимфоидной тканью, при правильной продольной ориентации среза имели выраженную полярностью. Наряду с описанной структурой встречались участки диффузной лимфоидной ткани, лишенной фолликулов и/или с наличием дискретно расположенных первичных фолликулов. Наблюдение разноразмерности и разнонаправленности вторичных фолликулов, обнаружение в единичных случаях крупных вторичных фолликулов у детей старшей возрастной группы и вторичных фолликулов с прогрессивно трансформированными зародышевыми центрами у детей младшей возрастной группы потребовало соблюдения следующих условий: обязательное наличие всех составляющих криптолимфона; оценка полей с правильно ориентированными фолликулами (верхним полюсом к эпителию (ЛЭС) и нижним к сосудистой зоне); исключались фолликулы с ПТЗЦ; оценке подвергали от 6 до 12 фолликулов для каждого случая. Морфометрическое исследование было выполнено на гистологических препаратах аденоидов окрашенных гематоксилином и эозином 39 детей. 10 Рис. 1. Крупные вторичные фолликулы, разделенные узкими полями диффузной лимфоидной ткани. Встречаются широкие поля диффузной лимфоидной ткани, лишенные фолликулов. Аденоиды девочки 2 лет. Гематоксилин и эозин, ув. 50. Рис. 2. Мелкие вторичные фолликулы, окруженные широкой полоской диффузной лимфоидной ткани. Аденоиды девочки 14 лет. Гематоксилин и эозин, ув. 50. Рис. 3. Средняя относительная площадь фолликулярного лимфоидного (красный столбик – %F), диффузного лимфоидного (синий столбик – %P) и эпителиального (зелёный столбик – %E) компонентов криптолимфона аденоидов детей выделенных возрастных групп в процентах. Точка в центре столбца – средняя, «усики» ± 2 стандартных отклонения. Рис. 4. Экспрессия TLR9 (polyclonal) клетками респираторного эпителия люминальной поверхности аденоидов мальчика 4 лет, иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 1000. На основании данных морфометрического исследования выявлены статистически достоверные (p <0,05) реципрокные отношения между относительными площадями фолликулярной и диффузной лимфоидной ткани в аденоидах детей выделенных возрастных групп (Рис. 3, стр. 11). В тоже время абсолютная площадь вторичных фолликулов снижалась по мере взросления детей. Полученные факты соответствуют данным А. И. Иванова (1988), изучавшего глоточные миндалины без патологических изменений. 11 Поскольку при морфометрическом исследовании компонентов криптолимфона выявлена статистически достоверная возрастная разница в структуре гипертрофированных глоточных миндалин, дальнейшее изучение возрастных особенностей, проводилось на основе анализа гистологической структуры, иммуногистохимических показателей и морфометрических данных компонентов криптолимфона. Эпителиальный компонент криптолимфона глоточной миндалины характеризовался взаимодействием лимфоидной ткани с покровным и лакунарным эпителием во всех возрастных группах. Характер этого взаимодействия проявлялся проникновением лимфоцитов в эпителиальный пласт, перестроенный в эпителиальный ретикулум и формирующий зону ЛЭС, или проникновением эффекторных лимфоцитов в дифференцированный респираторный эпителий в виде ИЭЛ. Респираторный эпителий аденоидов, как структура, обращенная во внешнюю среду, всегда проявлял признаки реактивных изменений в виде базально-клеточной гиперплазии с метаплазией в переходный, дальнейшей ретикуляцией (G. Kelemen (1954) ретикулярный эпителий образует систему связанных между собой отростчатых эпителиальных клеток, создающих губчатую, или сетчатую структуру, в ячейках которой находятся лимфоидные клетки) и формированием зоны ЛЭС у детей всех возрастных групп. В настоящем исследовании наличие многослойного плоского эпителия и «тонзиллярного региона» было выявлено в 36,25% случаев, что подтверждало результаты исследований эмбрионального развития глоточной миндалины человека выполненные В.А. Савенко (1987). В возрастном аспекте особенностью покровного эпителия являлось снижение протяженности и выраженности зоны ЛЭС и увеличение протяженности гистотипического респираторного эпителия, при сохранении локальных реактивных участков ЛЭС у детей II и III возрастной группы. По полученным данным в респираторном эпителии лакун с интраэпителиальными лимфоцитами преобладали Т лимфоциты по экспрессии молекулы CD3, а в ретикулярном эпителии ЛЭС преобладали В лимфоциты, экспрессирующие CD20. Наличие ядерной экспрессии молекулы p53 в ретикулярных клетках зоны ЛЭС отражает как процессы апоптоза, так и репарации ДНК в эпителиальном компартменте (Anderson G., Lane P. L. J., Jenkinson E. J., 2007). Иммуногистохимическое исследование выявило наличие экспрессии паттернраспознающих рецепторов в эпителиальном компоненте криптолимфона: TLR 2 клетками респираторного эпителия, в зонах ЛЭС эпителиальными ретикулярными клетками; TLR4 клетками респираторного эпителия и ретикулярными эпителиальными клетками в зонах ЛЭС; TLR9 клетками респираторного эпителия, эпителиальными ретикулярными клетками в зонах ЛЭС (Рис. 4, стр. 11). Факт экспрессии рецепторов врожденной иммунной системы клетками респираторного эпителия и ретикулярными эпителиальными клетками зоны ЛЭС, указывает на возможное участие этих клеток в инициации реакций врожденного иммунитета и в последующем адаптивного иммунного ответа в глоточной миндалине (Lange M., Lasiter J., Misfeldt M.L., 2009). 12 Характеристика диффузной лимфоидной ткани глоточной миндалины. При световой микроскопии препаратов глоточной миндалины детей всех возрастных групп, окрашенных гематоксилином и эозином, сразу под базальной мембраной эпителиального пласта находился собственный слой слизистой оболочки, в котором располагалась плотно упакованная диффузная лимфоидная ткань, содержащая первичные и вторичные лимфатические фолликулы. В целом диффузная лимфоидная ткань была представлена малыми лимфоцитами с тонким ободком цитоплазмы и плотным базофильным ядром, а также обнаруживались гистиоциты, эозинофилы, плазматические клетки, последние располагались преимущественно в субэпителиальной зоне. По отношению к фолликулу и эпителию, диффузная лимфоидная ткань могла быть условно разделена на межфолликулярную, располагающуюся между фолликулами, субэпителиальную и зону сосудистого слоя. Субэпителиальная зона диффузной лимфоидной ткани аденоидов детей всех возрастных групп была несколько плотнее диффузной межфолликулярной и диффузной лимфоидной ткани сосудистого слоя. В диффузной лимфоидной ткани сосудистого слоя обнаруживались отводящие лимфатические сосуды, артериолы, венулы. Преимущественно у нижних полюсов фолликулов располагались посткапиллярные венулы, с высоким кубическим эндотелием. По данным литературы диффузная лимфоидная ткань относится к Т-зависимой области (Korsrud F. R., Brandtzaeg P., 1980; Yamanaka N. et al., 1983; Быкова В. П. и др., 2000; Musiatowicz M. al., 2001; Brandtzaeg P., Johansen F.E., 2005). По данным настоящего исследования лимфоциты диффузной лимфоидной ткани аденоидов детей всех возрастных групп экспрессировали молекулы Т лимфоцитов (CD3 и CD5), в тоже время в диффузной лимфоидной ткани обнаруживались В лимфоциты, экспрессирующие молекулы CD19, CD20, CD79a, при этом лимфоциты в субэпителиальной зоне диффузной межфолликулярной лимфоидной ткани экспрессировали преимущественно молекулу CD79a (пан В-лимфоцитарный маркер, обнаруживаемый, в том числе и на плазматических клетках). При иммуногистохимическом исследовании эндотелиальные клетки артериол, венул и лимфатических капилляров экспрессировали молекулу CD34, выявляя общую архитектонику сосудистого русла. Морфометрическое исследование относительного количества клеток диффузной лимфоидной ткани аденоидов, экспрессирующих молекулы CD20, CD68 в пределах криптолимфона не выявило статистически значимых различий в выделенных возрастных группах, что позволило высказаться об относительном постоянстве Т-зависимой области глоточной миндалины. В тоже время относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани аденоидов, экспрессирующих молекулу Ki67, снижалось по мере увеличения возраста детей (Рис. 5-7, стр. 14). Данные литературы по количественной экспрессии молекулы Ki67 клетками аденоидов в возрастном аспекте отсутствуют. Как известно, одним из ведущих механизмов в становлении приобретенного иммунитета, опосредуемого Т и В лимфоцитами, является генерация этими клетками на ранних этапах развития и дифференцировки Т- и В-клеточных рецепторов, отличающихся чрезвычайно большим разнообразием. Первым этапом в отногенезе Т и В лимфоцитов, начинающимся в пре-Т клетках тимуса и пре-В клетках костного мозга, то есть центральных органах иммунитета, является реаранжировка V, D, J генов, кодирующих вариабельную область H-, κ-, λ- цепей иммуноглобулинов и α-, β- γ- цепей Т-клеточного 13 рецептора (Ярилин А.А., 2010), для создания функционирующего Т- или В-клеточного рецептора. Этот процесс происходит до антигенной стимуляции и совершается V(D)Jрекомбинационным комплексом, в состав которого входят молекулы димера рекомбиназ RAG-1/RAG-2, а также терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT). Рис. 5. Экспрессия молекулы Ki67 (клон MIB-1) клетками диффузной лимфоидной ткани и герминативными центрами аденоидов девочки 4 лет, иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 100. Рис. 6. Экспрессия молекулы Ki67 (клон MIB-1) клетками диффузной лимфоидной ткани и герминативными центрами аденоидов девочки 11 лет, иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 100. Рис. 7. Относительное количество Ki67 позитивных клеток диффузной лимфоидной ткани аденоидов детей в зависимости от возраста (указан в месяцах) (Ki67: r = -0,6754; p = 0,0041). Рис. 8. Среднее относительное количество клеток экспрессирующих молекулу TdT и CD1a диффузной лимфоидной ткани аденоидов детей в зависимости от возраста (указан в месяцах) (TdT r = -0,3253; p = 0,1878; CD1a: r = -0,4750; p = 0,0463). В настоящем исследовании в диффузной лимфоидной ткани нами были обнаружены клетки с фенотипом кортикальных тимоцитов, экспрессирующие молекулы TdT и CD1a и образующие инфильтраты окружающие нижний полюс фолликулов. В то же время, мы не обнаружили клеток с фенотипом TdT+ и CD1a+ в герминативных центрах вторичных фолликулов и просвете сосудистого русла глоточной миндалины. При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани, экспрессирующих молекулы TdT и CD1a имело тенденцию к снижению (Рис. 8, стр. 14). 14 Полученные факты соотносятся с данными N. Meru et al. (2002), обнаружившими экпрессию TdT единичными мелкими лимфоцитами диффузной лимфоидной ткани у нижних полюсов вторичных фолликулов нёбных миндалин иммуногистохимическим методом. Этими же авторами методом in situ гибридизации была обнаружена экспрессия RAG1 и RAG2 рекомбиназ клетками диффузной лимфоидной ткани, прилежащей к нижним полюсам вторичных фолликулов нёбных миндалин, вблизи сосудистой зоны. Эндотелиальные клетки вен с высоким эндотелием и единичные дендритные клетки экспрессировали TLR9 (Рис. 9, стр. 16). Возрастные различия по экспрессии были неоднозначны, а характер экспрессии не позволил проводить морфометрическое исследование. Характеристика фолликулярного компонента криптолимфона глоточной миндалины При световой микроскопии препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в структуре аденоидов детей всех возрастных групп встречались первичные и вторичные лимфатические фолликулы с герминативными центрами. В пределах одного гистологического среза обращали внимание форма, разноразмерность и расположение вторичных фолликулов, а также зональность герминативных центров. На гистологических срезах глоточной миндалины, окрашенных гематоксилином и эозином, у детей всех возрастных групп обнаруживались вторичные фолликулы, герминативные центры которых были представлены лишь центробластами или центроцитами с единичными макрофагами или без них. Встречались вторичные фолликулы, в герминативных центрах которых обнаруживалось большое количество макрофагов по всей плоскости среза. Данное наблюдение мы расценивали как результат ориентации среза, который отражает уровень сечения не по диаметру вторичного фолликула, а по параллели к диаметру, что подтверждалось обнаружением этого же фолликула с выраженной полярностью на серийных срезах. Зональное строение и разноразмерность вторичных фолликулов подтвердили серийные гистологические срезы. При продольной ориентации среза, вторичные фолликулы не только имели форму эллипса, но и обладали выраженной полярностью, которая проявлялась различием между базальной частью фолликула, которая прилежала к сосудистому слою и апикальной – обращенной к эпителию. При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток герминативного центра, экспрессирующих Ki67 оставалось постоянным, вне зависимости от возраста, что также подтверждено при статистическом исследовании. Центробласты и центроциты, герминативных центров вторичных фолликулов аденоидов детей всех возрастных групп экспрессировали транскрипционный фактор bcl-6. Относительное количество клеток в герминативном центре, экспрессирующих молекулу bcl-6 оставалось постоянным, вне зависимости от возраста, что также подтверждено при статистическом исследовании. Полярное строение вторичных фолликулов аденоидов детей всех возрастных групп прослеживалось не только при окраске гематоксилином и эозином, но по экспрессии молекул Ki67, bcl-6, CD3, CD5, CD14, CD20, CD21, CD23. В светлой зоне герминативных центров, которые являются В-зависимой областью, присутствовали Т лимфоциты, экспрессирующие молекулы CD3 и CD5. При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток 15 герминативного центра, экспрессирующих CD3 и CD5 остаётся постоянным, вне зависимости от возраста, что также подтверждено при статистическом исследовании (Рис. 10, стр. 16). Рис. 9. Экспрессия TLR9 эндотелиальными клетками вен с высоким эндотелием и единичными дендритными клетками диффузной лимфоидной ткани аденоидов мальчика 4 лет. Иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 1000. Рис. 10. Среднее относительное количество CD3 и CD5 позитивных клеток в герминативных центрах вторичных фолликулов аденоидов детей выделенных возрастных групп, в процентах. Точка в центре столбца – средняя, «усики» ± 2 ошибки среднего. Рис. 11. Цитоплазматическая экспрессия молекулы CD80 (B7-1) центроцитами и центробластами вторичного фолликула в аденоидах мальчика 9 лет. Иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 200. Рис. 12. Экспрессия TLR9 (polyclonal) клетками герминативных центров в аденоидах девочки 4 лет, иммунопероксидазный метод, DAB, гематоксилин, ув. 400. Центроциты, центробласты и клетки зоны мантии экспрессировали молекулы Вклеточной дифференцировки (CD19+, CD20+, CD79a+), что подтверждало данные литературы (Korsrud F. R., Brandtzaeg P., 1980; Yamanaka N. et al., 1983; Быкова В. П. и др., 2000; Musiatowicz M. al., 2001; Brandtzaeg P., Johansen F.E., 2005). В зоне центробластов присутствуют единичные фолликулярные дендритные клетки (CD21+). В цитоплазме центроцитов и центробластов герминативных центров нами выявлена крупногранулярная экспрессия молекулы CD80, более известной как В7-1, лиганда для CD28 рецептора Т лимфоцитов и CD40 рецептора В лимфоцитов (Рис. 11, стр. 16). 16 Клетки зоны мантии экспрессировали антиапоптотический белок – молекулу bcl-2,. В светлой и темной зонах герминативного центра также обнаруживались единичные bcl-2+ клетки. При морфометрическом исследовании в возрастном аспекте количество их статистически не различалось. Иммуногистохимическое исследование выявило наличие экспрессии паттернраспознающих рецепторов клетками вторичных фолликулов: TLR2 дендритными клетками герминативных центров лимфоидных фолликулов; TLR 9 дендритными клетками герминативных центров лимфоидных фолликулов (Рис. 12, стр. 16). Возрастные различия по экспрессии были неоднозначны, а характер экспрессии не позволил проводить морфометрическое исследование. Экспрессия рецепторов врожденного иммунитета дендритными клетками герминативных центров лимфоидных фолликулов и ко-рецепторных молекул врожденного иммунитета подтверждает участие механизмов врожденного иммунитета в управлении адаптивным иммунным ответом на этапе клональной пролиферации. Выводы 1. Аденоидные вегетации представляют собой реактивно измененную глоточную миндалину в виде гиперплазии её лимфоидной ткани. Гистологическая структура гиперплазированной глоточной миндалины, как лимфоэпителиального органа отражает взаимодействие иммунокомпетентных клеток с эпителием органа в форме лимфоэпителиального симбиоза и присутствия интраэпителиальных лимфоцитов в пласте респираторного эпителия. Выявленное при иммуногистохимическом исследовании распределение основных популяций Т и В лимфоцитов в диффузной и фолликулярной лимфоидной ткани аденоидов подтверждает существующее выделение функциональных компартментов и отражает кооперативный иммунный ответ с участием гуморального и клеточного звеньев иммунитета. 2. Структура аденоидных вегетаций в выделенные возрастные периоды отражает преобладание у детей младшей возрастной группы реакций клеточного звена иммунитета в виде пролиферации лимфоцитов диффузной лимфоидной ткани при активном формировании структур гуморального иммунитета в виде фолликулярной гиперплазии (Ki67+). Морфометрическое исследование выявило реципрокные отношения («ножницы») между относительными площадями фолликулярной и парафолликулярной лимфоидной ткани в выделенных возрастных группах: снижение относительной площади фолликулярного компонента критолимфона и нарастание относительной площади парафолликулярной лимфоидной ткани. 3. Возрастная динамика структуры покровного эпителия аденоидных вегетаций характеризуется снижением протяженности зоны лимфоэпителиального симбиоза и увеличением протяженности гистотипического респираторного эпителия при сохранении локальных реактивных участков лимфоэпителиального симбиоза по мере взросления детей. 4. В диффузной лимфоидной ткани относительное количество В лимфоцитов (CD20+) и клеток моноцитарно-макрофагального ряда (CD68+) обнаруживает статистически недостоверные различия. В герминативных центрах вторичных фолликулов относительное количество Т лимфоцитов (CD3+, CD5+), клеток экспрессирующих антиапоптотический 17 белок bcl-2 и транскрипционный фактор bcl-6, как и количество пролиферирующих клеток (Ki67+) имеют тенденцию к постоянству. 5. В структуре аденоидных вегетаций постоянно выявляются клетки, несущие рецепторы и ко-рецепторы врожденной иммунной системы (TLR2, TLR4, TLR9, CD14). Экспрессия этих молекул выявлена на эпителиоцитах респираторного эпителия, ретикулярных эпителиальных клетках зоны лимфоэпителиального симбиоза, эндотелиальных клетках венул с высоким эндотелием (на нелимфоидных клетках эффекторных структур, обслуживающих врожденный иммунитет), а также на макрофагах и фолликулярных дендритных клетках герминативных центров, составляющих микроокружение лимфоцитов в индуктивных структурах адаптивного иммунитета. 6. Возрастной особенностью структурной организации гиперплазированной глоточной миндалины детей младшей возрастной группы является экспрессия молекул TdT и CD1a, наличие B-1a B лимфоцитов (CD5+/CD19+) в диффузной лимфоидной ткани, а также преобладание Т-клеточных реакций на фоне фолликулярной гиперплазии, что в совокупности допустимо считать проявлением возрастной «незрелости» иммунной системы детей, отмечаемой в клинике. Наличие клеток с тимическим фенотипом (TdT+ и CD1a+) показывает что развитие Т лимфоцитов, сопровождающееся реаранжировкой Тклеточного рецептора, может происходить и в периферическом органе иммунной системы. Практические рекомендации Разработанный алгоритм морфологического исследования аденоидных вегетаций рекомендуется к использованию для оценки удаленных аденоидов и формулировки патологоанатомического диагноза, адекватного требованиям ЛОР-клиники. Ниже мы приводим алгоритм морфологического исследования, следуя которому, клинический патолог наиболее полно сможет ответить на вопросы ЛОР-клиники. Следует отметить, что в практической работе патологу необходимо знать анамнестические данные пациентов для адекватной трактовки изменений в глоточной миндалине и формулировки морфологического диагноза. 18 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Быкова В.П., Калинин Д.В. Иммунный барьер слизистых оболочек в современном прочтении // Российская ринология. – 2009. – № 1. – С. 40 – 43. 2. Калинин Д.В., Быкова В.П. Распознающие рецепторы врожденного иммунитета в органах МАЛТ системы дыхательных путей // Российская ринология. – 2009. – № 2. – С. 31 – 32. 3. Калинин Д.В., Быкова В.П. Морфологические типы иммунного ответа глоточной миндалины у детей с аденоидами // III научно-практическая конференция отоларингологов центрального федерального округа. Актуальное в оториноларингологии. Москва, 15-16 октября 2009, с. 252 4. Kalinin D. Recognition receptors of innate immunity in adenoids // Folia Otorhinolaryngologiae et Pathologiae Respiratoriae. 2009. – Vol. 15, №2. – P. 6. 5. Kalinin D. Recognition receptors of innate immunity in adenoids // Folia Otorhinolaryngologiae et Pathologiae Respiratoriae. 2009. – Vol. 15, №4. – P. 24 – 25. 6. Калинин Д.В. Межклеточные взаимодействия в возрастной гистоархитектонике глоточной миндалины // Сборник научных трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. – М.: МДВ, 2010. – C. 112 – 114. 7. Калинин Д.В., Быкова В.П. Гистоархитектоника глоточной миндалины в возрастном аспекте. Морфометрическое и иммуногистохимическое исследование // Архив патологии. – 2011. – №1. – С. 14-19. 8. Быкова В.П., Калинин Д.В. Состояние глоточной миндалины часто болеющих детей после местной иммуномодулирующей терапии // Российская ринология. – 2011. – № 3. – С. 4-10. 19 Для заметок: 20
