НИИ КАРДИОЛОГИИ ИМ. А.Л. МЯСНИКОВА ФГБУ «РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-

Реклама
НИИ КАРДИОЛОГИИ ИМ. А.Л. МЯСНИКОВА
ФГБУ «РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНОПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КМПЛЕКС» МЗ РФ
На правах рукописи
Ефремова Юлия Евгеньевна
ИЗУЧЕНИЕ НАКОПЛЕНИЯ
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ В СОСУДИСТОЙ
СТЕНКЕ
(КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ)
14.01.05 - кардиология
03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2013
1
Работа выполнена в отделе ангиологии НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова
и лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии Института экспериментальной
кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс»
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научные руководители:
доктор медицинских наук
Карпов Юрий Александрович
профессор
доктор медицинских наук
Тарарак Эдуард Михайлович
профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Подзолков Валерий Иванович
заведующий кафедрой факультетской терапии №2 ГБОУ ВПО «Первый Московский
Государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова» МЗ РФ
доктор медицинских наук, профессор
Парфенова Елена Викторовна
руководитель лаборатории ангиогенеза ИЭК ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет
имени Н.И. Пирогова» Минздрава России
Защита диссертации состоится «30» мая 2013 г. в 13.30 на заседании диссертационного
совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГБУ
«Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ (Москва,
121552, 3-я Черепковская ул., д.15а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.
Автореферат разослан «
»
2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат медицинских наук
Полевая Татьяна Юльевна
2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ – артериальная гипертония
АЛК - аминолевулиновая кислота
АСБ – атеросклеротическая бляшка
ГКС – грудино-ключично-сосцевидная мышца
ГМК – гладкомышечные клетки
ИБС – ишемическая болезнь сердца
ИМТ – индекс массы тела
КШ - коронарное шунтирование
ОСА – общая сонная артерия
ПП IX - предшественник протопорфирина IX
ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания
ТИМ – толщина интима/медия
УЗДС - ультразвуковое дуплексное сканирование
ФДТ – фотодинамическая терапия
ФС – фотосенсибилизатор
ЧКВ – чрескожное коронарное вмешательство
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Заболевания сердечно-сосудистой системы являются ведущей причиной смертности,
как в России, так и в других странах [Ощепкова Е.В. 2009, Roger V.L. et al. 2011]. В
большинстве
случаев,
патогенетической
основой
этих
заболеваний
являются
атеросклеротические поражения артериальной стенки. С точки зрения клинического
прогноза наиболее опасными поражениями, являются так называемые нестабильные
атеросклеротические бляшки (АСБ). Риск развития осложнений (острый коронарный
синдром и инсульт) у пациентов, имеющих нестабильные, склонные к разрыву, «мягкие»
АСБ, значительно выше, в отличие от больных, имеющих фиброзные, кальцинированные
поражения.
В настоящее время для диагностики атеросклеротических поражений сосудистой
стенки применяются различные методики. Однако, неинвазивного метода, который давал
бы полную характеристику морфологического и функционального состояния АСБ в
настоящее время не существует. Современные поиски в области диагностики ведутся в
направлении получения такой возможности для выявления нестабильных АСБ. Это
позволит значительно усилить профилактическую составляющую в терапии сердечнососудистых заболеваний (ССЗ). Как было показано в ряде исследований, для решения
задачи по выявлению функционального состояния артерий в областях атеросклеротических
поражений
весьма
перспективными
могут
оказаться
диагностические
методы,
базирующиеся на регистрации флуоресценции [Drakopoulou M. et al. 2008]. Одним из таких
методов является флуоресцентная спектроскопия, основанная на измерении in vivo спектров
флуоресценции введенных в организм веществ - фотосенсибилизаторов (ФС). Эта методика
используется с 60-х годов прошлого века, в основном, в онкологической практике.
Известно, что ФС активно аккумулируют области, в которых протекают воспалительные
процессы, происходит избыточная пролиферация клеток или идут другие метаболически
активные процессы [Yamaguchi S. et al. 2005]. Поскольку атеросклеротические поражения
являются местом прохождения активных клеточных реакций, то и в них могут активно
накапливаться ФС, что и было показано в ряде научных работ [Pollock M.E. et al. 1987,
Delettre E. et al. 1991, Gonschior P. et al. 1993]. Результаты этих исследований позволили
предположить, что метод, разработанный на основе регистрации спектров флуоресценции
ФС, накопившихся в АСБ, может стать перспективным и для диагностики атеросклероза.
Селективное накопление ФС в участках атеросклеротически измененной сосудистой
стенки также может быть использовано и для лечения атеросклероза при помощи
фотодинамической терапии (ФДТ). ФДТ – это двухэтапный метод, одним элементом
4
которого является накопление клетками ФС – вещества, повышающего их чувствительность
к свету, а другим – низкоинтенсивное лазерное облучение тканей, накопивших ФС [Castano
A.P. et al. 2004]. При взаимодействии ФС со светом, запускается фотохимическая реакция, в
результате которой выделяется синглетный кислород, обладающий цитотоксическим
действием, и происходит повреждение и гибель клеток, накопивших ФС. Этот метод
активно применяется в медицинской практике для лечения онкологических заболеваний,
когда при помощи ФДТ устраняются малигнизированные клетки. При ФДТ атеросклероза,
по-видимому, также будет происходить гибель наиболее метаболически активных клеток,
таких, например, как макрофаги, которые, по сравнению с другими клетками АСБ, в
большей степени накапливают ФС. Можно предположить, что этот подход мог бы стать
одним
из
перспективных
методов,
для
регулирования
клеточного
состава
атеросклеротически измененной сосудистой стенки. В настоящее время в литературе уже
имеются данные, полученные с использованием экспериментальных животных моделей, по
успешному
применению
ФДТ
для
предотвращения
или
уменьшения
тяжести
атеросклеротических поражений и интимальной гиперплазии [LaMuraglia G.M. et al. 1994,
2000, Katoh T. et al. 1997, Peng C. et al. 2011]. На основании этих экспериментальных данных
были проведены первые клинические исследования по лечению пациентов с поражением
периферических артерий, которые также продемонстрировали положительные результаты
[Jenkins M.P. et al. 1999, Stanley G. et al. 2000, Kereiakes D.J. et al. 2003].
Данные, полученные при исследовании накопления ФС и ФДТ на экспериментальных
животных моделях, создают предпосылки для дальнейшего изучения возможности
применения этого метода для диагностики и лечения различных патологий артерий у
человека. Морфологическая база атеросклеротических поражений артерий человека –
результат сложного взаимодействия различных типов клеток. Поэтому необходимым
представляется обнаружение в АСБ клеток, которые будут накапливать ФС и определение
степени этого накопления для выявления клеток-мишеней при ФДТ. Известно, что
последующая ФДТ, будет элиминировать клетки, накопившие ФС в большей степени.
Например, селективная ФДТ макрофагов позволит уменьшить их популяцию в АСБ, что, в
свою очередь, приведет к стабилизации бляшки за счет снижения в ней активности
воспалительных процессов.
Цель исследования: изучить особенности накопления фотосенсибилизаторов в
сосудистой стенке: в аорте кроликов с экспериментальным атеросклерозом, в АСБ человека,
удаленных во время операции каротидной эндартерэктомии и в сонных артериях у
5
пациентов при помощи лазерной электронной спектроскопии, для дальнейшей разработки
методов флуоресцентной диагностики и ФДТ атеросклероза.
Задачи исследования:
1.
Изучить
особенности
накопления
фотосенсибилизаторов
(Фотосенса
и
АЛК-
индуцированного ПП IX) в аорте кроликов с экспериментальным атеросклерозом при
помощи флуоресцентной микроскопии и лазерной электронной спектроскопии.
2.
Определить
типы
атеросклеротических
поражений
и
идентифицировать
иммунофенотипы клеток в аорте кроликов, в которых преимущественно накапливаются
фотосенсибилизаторы.
3.
Изучить
особенности
накопления
фотосенсибилизатора
Фотосенса
в
атеросклеротической бляшке человека, удаленной во время каротидной эндартерэктомии, in
vitro методом флуоресцентной микроскопии.
4. Определить особенности исследованных атеросклеротических бляшек человека и
идентифицировать иммунофенотипы клеток, в которых преимущественно накапливается
фотосенсибилизатор.
5. Провести апробацию неинвазивного метода диагностики атеросклероза сонных артерий
человека при помощи лазерной электронной спектроскопии с предварительным введением
фотосенсибилизаторов. Сопоставить данные лазерной электронной спектроскопии с
результатами ультразвукового дуплексного сканирования.
Научная новизна. На основе анализа экспериментального атеросклероза и АСБ
человека изучено накопление ФС в сосудистой стенке. Впервые по результатам
иммуногистохимического исследования было продемонстрировано селективное накопление
ФС в атеросклеротически измененной сосудистой стенке, в областях, содержащих
наибольшее количество макрофагов, в аорте гиперхолестеринемических кроликов и в АСБ
человека, удаленных во время каротидной эндартерэктомии. Впервые проведена апробация
неинвазивного метода флуоресцентной диагностики атеросклероза сонных артерий при
помощи лазерной электронной спектроскопии с предварительным введением ФС. Было
показано, что при использовании Фотосенса или Аласенса у пациентов не обнаружено
достоверных различий между интенсивностью флуоресценции вне зависимости от степени
выраженности атеросклеротического поражения в проекции общей сонной артерии и
прилежащей мышцы. Это свидетельствует о том, что применение неинвазивной лазерной
спектроскопии не может быть использовано для диагностики атеросклероза сонных
артерий.
Практическая значимость. Применение лазерной электронной спектроскопии для
диагностики атеросклероза сонных артерий, с использованием накожного измерения, не
6
целесообразно.
Дальнейшее
развитие
этого
диагностического
направления
с
использованием флуоресцентной спектроскопии для идентификации атеросклеротических
изменений должно быть связано с разработкой принципиально новой аппаратуры,
регистрирующей сигнал непосредственно от стенки сосуда, и новых, более селективных
ФС.
Внедрение. Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу
отдела ангиологии института кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.
Апробация работы. Материалы доложены на межотделенческой конференции НИИ
кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ по апробации кандидатских
диссертаций 24.12.2012.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Материалы диссертации были представлены на: Российском национальном
конгрессе кардиологов, Москва, октябрь 2010 г.; Всероссийской научно-практической
конференции «Новые возможности в диагностике, лечении и снижении смертности от
ССЗ», Москва, июнь 2010 г.; 9-й международной конференции «Hight medical technologies
in XXI century». Spain, Benidorm, 2011 г.; Всероссийской научно-практической
конференции «Инновации в кардиологии», Москва, июнь 2011 г.; «European Meeting on
Hypertension 2011», Milan, Italy, июнь 2011 г.; Научно-практической конференции
«Инновационные технологии в лазерной медицине», Москва, 2011 г.; «European society of
cardiology congress 2011», France, Paris, август 2011 г.
Объем
и
структура
работы.
Диссертация
изложена
на
144
страницах
машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций
и списка использованных источников, включающего 193 публикации отечественных и
иностранных авторов. Работа содержит 18 таблиц и 33 рисунка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Структура исследования. Работа выполнена в отделении ангиологии Института
клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова и в лаборатории молекулярной и клеточной
кардиологии Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ
совместно с ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и лабораторией лазерной биоспектроскопии
учреждения Российской академии наук УРАН «Института общей физики им. А.М.
Прохорова РАН». Исследование проводилось при финансовой поддержке Правительства
Москвы, Госконтракт №8/3-279н-10.
Работа состояла из трех разделов: 1 – изучение накопления ФС Фотосенса и
Аласенса в аорте кроликов с экспериментальным атеросклерозом; 2 – изучение
7
накопления Фотосенса в АСБ сонных артерий человека, удаленных во время операции
каротидной эндартерэктомии; 3 – апробация неинвазивного метода диагностики
атеросклероза сонных артерий при помощи лазерной электронной спектроскопии с
предварительным введением ФС.
Ультразвуковое дуплексное сканирование (УЗДС) сонных артерий проводилось на
базе отдела новых методов диагностики ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ. Забор материала АСБ
сонных артерий после эндартерэктомии осуществлялся на базе ФГУ «Институт хирургии
им. А.В. Вишневского» Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской
помощи. Набор пациентов для изучения накопления ФС в сонных артериях методом
лазерной электронной спектроскопии производился на базе отделения реабилитации ФГУ
«МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологий» и ГУ «НИИ Глазных Болезней РАМН» им.
Краснова М.М.
1. Изучение накопления ФС Фотосенса и Аласенса в аорте кроликов с
экспериментальным атеросклерозом
Лабораторные животные. В работе использовано 25 3-х месячных самцов
кроликов породы «Шиншилла». Уход за животными и проведение экспериментов
осуществлялось в условиях вивария согласно основным морально-этическим принципам
проведения биомедицинских экспериментов на животных. Для индукции атеросклероза
кроликов (n=21) содержали на 0,5% холестериновой диете в течение 16 недель.
Введение фотосенсибилизаторов кроликам. Были использованы два ФС: Фотосенс
– сульфированный фталоцианин алюминия (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»), в виде раствора 2
мг/мл и Аласенс – 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК), в виде сухого порошка. Через 16
недель холестериновой диеты, препарат вводили в ушную вену кроликов: Фотосенс - за 24
часа до умерщвления в дозе 2 мг/кг (n=11), а Аласенс - за 2 часа до умерщвления (n=8) в
дозе 60 мг/кг [Kwon O.C. et al. 2008]. Умерщвление животных проводили путем
передозировки внутривенного кетамина. В качестве контрольных были использованы 6
кроликов: 2 кролика получали гиперхолестериновую диету, без введения ФС и 4 кролика,
содержались на нормальном пищевом рационе, с введением Фотосенса или Аласенса.
Подготовка препаратов для макро- и микроскопического исследования
накопления фотосенсибилизаторов в аорте кроликов. После умерщвления у животных
извлекали аорту, очищали от адвентиции и вскрывали продольно. Для исследования из
каждой аорты брали по 2-3 кусочка ткани, содержащей атеросклеротические изменения, и
2 кусочка макроскопически нормальной аорты. В выбранных кусочках измеряли
интенсивность флуоресценции ФС с помощью лазерной электронной спектроскопии,
затем замораживали их в парах жидкого азота в среде O.C.T. Compound (Tissue Tek,
8
Sakura, Япония) и готовили криомикротомные срезы толщиной 7-12 мкм.
Лазерная электронная спектроскопия кусочков аорты кролика. Исследование
проводилось с использованием лазерного электронно-спектроскопического анализатора
«LESA-01-BIOSPEC» («Биоспек», Россия). Накопление Фотосенса в ткани выявляли по
его
собственной
флуоресценции.
Поскольку
препарат
Аласенс
является
предшественником эндогенного протопорфирина IX (ПП IX), который образуется после
введения препарата в организм, выявляли флуоресценцию ПП IX. Для возбуждения
флуоресценции Фотосенса ткань облучали лазером с длиной волны 632,8 нм, а для АЛКиндуцированного ПП IX - 532 нм. В каждом участке проводили по 5-7 измерений,
которые усредняли с целью минимизации погрешности. Построение и анализ спектров
проводили с помощью компьютерной программы LESASoft "9" для Windows 1998-2000.
Численные величины накопления выражали в условных единицах (у.е.).
Микроскопическое исследование препаратов аорты кролика. Гистологические
препараты окрашивали гематоксилином и эозином и изучали при помощи световой
микроскопии. Степень поражения сосудистой стенки условно разделяли на 5 типов: 1отсутствие атеросклеротических изменений (норма), 2-липидное пятно, 3-липидная
полоса, 4-липофиброзная АСБ, занимающая 50-90% внутренней поверхности сосуда, 5АСБ, занимающая более 90% внутренней поверхности сосуда. Исследование накопления
ФС проводилось на неокрашенных, нефиксированных срезах с помощью флуоресцентной
микроскопии. Степень накопления ФС оценивали по интенсивности его флуоресценции в
нескольких областях среза полуколичественным методом, по 5-ти балльной шкале.
Отсутствие флуоресценции принималось за 0, 4 соответствовала максимальной
интенсивности флуоресценции. Промежуточным величинам были присвоены значения 1,
2 и 3, соответственно. Для идентификации типов клеток, применяли непрямой
пероксидазный
метод
иммуногистохимического
окрашивания
с
использованием
стрептавидин-биотинового комплекса согласно стандартной методике. Для выявления
гладкомышечных клеток (ГМК) использовали маркер гладких мышц -актин, для
выявления макрофагов – антиген RAM, лимфоцитов – CD3. Полуколичественный анализ
клеточного состава проводили на срезах, параллельных тем, в которых ранее определяли
интенсивность флуоресценции, в аналогичных полях зрения. Отсутствие клеток
принималось за ноль, от 1 до 5 клеток соответствовало единице; двойке – от 6 до 10
клеток; тройке – от 11 до 15 клеток; четверке – более 16 клеток.
2. Изучение накопления ФС Фотосенса в АСБ сонных артерий человека,
удаленной во время операции каротидной эндартерэктомии
В этой части работы использовали биоптаты сонных артерий, удаленные во время
9
операции эндартерэктомии, у 30 пациентов с атеросклерозом сонных артерий. В качестве
контроля было использовано 5 биоптатов, которые не инкубировали с ФС.
Подготовка биопсийного материала для последующего микроскопического
исследования. Биоптаты сонных артерий доставляли в лабораторию в течение 1-2 часов
после проведения операции. Материал инкубировали в течение 24 часов в среде «RPMI
1640» с добавлением 75 мкг/мл Фотосенса. Затем тщательно отмывали, фотографировали
и разрезали перпендикулярно длинной оси сосуда на кусочки толщиной 5-7 мм. Образцы
замораживали и готовили криомикротомные срезы. В работе было проанализировано 67
кусочков, взятых из 30 АСБ.
Микроскопическое
исследование
эндартерэктомического
материала.
Для
проведения морфологического исследования препараты окрашивали гематоксилином и
эозином и по ван Гизону. Атеросклеротические поражения классифицировали по AHA
(American Heart Association) [Stary H.C. 2000] и по Virmani [Virmani R. еt al. 2000]. Также
проводилась
определение
стабильности/нестабильности
АСБ
[Falk
E.
2006].
Флуоресцентно-микроскопическое исследование, оценка интенсивности флуоресценции и
иммуногистохимическая идентификация типов клеток проводились аналогично тому, как
это делалось при исследовании накопления ФС в аорте кроликов. Анализ клеточного
состава поражений проводили на срезах, параллельных таковым, где определяли
интенсивность флуоресценции, в аналогичных полях зрения полуколичественным
методом. Отсутствие клеток принималось за 0, от 0 до 5 клеток соответствовало 1; 2 – от 6
о 15 клеток; 3 – от 16 о 25 клеток; 4 – более 26 клеток.
3. Апробация неинвазивного метода диагностики атеросклероза сонных
артерий при помощи лазерной электронной спектроскопии с предварительным
введением фотосенсибилизаторов
В этом разделе работы изучался уровень накопления ФС Фотосенса и Аласенса у
пациентов с различной степенью выраженности атеросклероза сонных артерий при
помощи лазерной электронной спектроскопии. Степень выраженности атеросклероза
определяли при помощи УЗДС и допплерографии сонных артерий. В исследование было
включено 34 пациента, проходящих курс обследования и лечения, включающий
флуоресцентную диагностику и ФДТ.
Оценка состояния сонных артерий
с использованием ультразвукового
дуплексного сканирования и допплерографии. УЗДС сонных артерий проводилось на
аппарате Philips iU 22 (США) с ультразвуковой системой «АСUSON 128 ХР 10»
линейным датчиком более 10 Мгц по стандартной методике. По результатам УЗДС,
пациенты были разделены на 3 группы: 1 - с наличием АСБ в каротидных артериях
10
(стеноз ≥20%); 2 - с утолщением комплекса интима-медия > 0,9 мм; 3 - с неизмененными
сонными артериями. Во время проведения исследования накожно при помощи маркера
отмечалось место бифуркации общей сонной артерии (ОСА).
Лазерная электронная спектроскопия сонных артерий человека. После
проведения УЗДС всем пациентам в проекции правой и левой ОСА и в проекции грудиноключично-сосцевидной мышцы (ГКС) до введения ФС производилась лазерная
электронная спектроскопия. После чего внутривенно вводился Фотосенс (n=18), в дозе
0,25±0,09 мг/кг и перорально Аласенс в дозе 20±3 мг/кг (n=16). Затем проводилась
лазерная электронная спектроскопия на аппарате «LESA-01-BIOSPEC» («Биоспек»,
Россия)- сразу после введения ФС, через 1,2,4,6 часов и каждые сутки до 13-х суток для
Фотосенса - и через 2 и 4 часа для Аласенса (т.к. Аласенс выводится из организма в
течение суток). Измерения производились на поверхности кожи в местах проекции ОСА и
в проекции ГКС. В каждой точке проводили по 5-7 измерений, которые затем усредняли.
Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили в
программе «Statistica 6.0» и «Excel» для Windows XP. При описании количественных
показателей с нормальным распределением приводили среднее значение и стандартное
отклонение. Для анализируемых качественных порядковых признаков и количественных
показателей с ненормальным распределением вычислялись медиана (Ме) и процентили
распределения – нижний квартиль (LQ) и верхний квартиль (UQ). Достоверность
различий величин в группах определялась при помощи непараметрического критерия
Манна-Уитни. Анализ корреляции проводился непараметрическим методом Спирмана.
Пороговая величина вероятности ошибки была установлена на уровне 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Накопление фотосенсибилизаторов в аорте кроликов с экспериментальным
атеросклерозом
Лазерная электронная спектроскопия ткани аорты кролика. Для анализа
интенсивности флуоресценции при помощи лазерной спектроскопии было выполнено
разделение кусочков на группы по степени выраженности атеросклеротического процесса.
На рисунке 1 и 2 представлены результаты лазерной электронной спектроскопии в аортах
кроликов.
11
Рисунок 1. Средние значения интенсивности флуоресценции Фотосенса в аорте
кролика с экспериментальным атеросклерозом по данным лазерной электронной
спектроскопии.
Рисунок 2. Средние значения интенсивности флуоресценции АЛК индуцированного
ПП IX в аорте кролика с экспериментальным атеросклерозом по данным лазерной
электронной спектроскопии.
Как видно из рисунка 1, в группе кроликов после введения Фотосенса значимых
различий между интенсивностью его флуоресценции в различных типах поражений аорты
не
наблюдалось.
Так,
интенсивность
флуоресценции
в
участках
аорты
с
атеросклеротическими изменениями (липидное пятно, липидная полоса и АСБ, 2-5 тип
поражения), в среднем составила 68±27 у.е. и была сопоставима с интенсивностью
флуоресценции, определяемой в нормальной аорте - 60±26 у.е., различия статистически не
достоверны
(р=0.33).
интенсивность
Напротив,
флуоресценции
в
АЛК
группе
кроликов
индуцированного
12
после
ПП
введения
IX
была
Аласенса
выше
в
атеросклеротически измененной сосудистой стенке по сравнению с нормой (рис. 2).
Интенсивность флуоресценции в участках аорты с атеросклеротическими изменениями (25 тип поражения) в среднем составила 30±22 у.е., а в норме - 12±13 у.е., при этом различия
были статистически достоверны (р=0.03). У контрольных животных интенсивность
флуоресценции была минимальной.
Таким образом, наибольшая интенсивность флуоресценции АЛК индуцированного
ПП IX, определялась в выраженных АСБ и была связана с максимальным присутствием в
них макрофагов, которые преимущественно и накапливают ФС. Эти данные были
подтверждены
при
фенотипировании
разных
типов
клеток,
при
помощи
иммуногистохимии. Наши результаты хорошо согласуются с данными работы Kwon и
соавт.,
которые
преимущественное
также
используя
накопление
АЛК
метод
лазерной
индуцированного
спектроскопии
ПП
IX
в
выявили
участках
атеросклеротически измененной аорты кролика по сравнению с нормой [Kwon O.C. et al.
2008]. Однако, в работе этих авторов, в отличие от нашего исследования, не было
выполнено иммуногистохимической идентификации типов клеток, находящихся в АСБ.
Микроскопическое исследование препаратов аорты кролика, сравнительный
анализ результатов. В результате исследования было показано, что накопление
Фотосенса (табл. 1) и ПП IX (табл. 2) происходило во всех атеросклеротических аортах.
Напротив, в участках сосудистой стенки без поражений флуоресценция ФС не
определялась. Основное накопление красителей выявлялось в атеросклеротически
измененной интиме, а уровень накопления зависел от степени выраженности поражения.
В медии и адвентиции флуоресценции ФС практически не наблюдалось. В участках с
большим количеством клеточных элементов (чаще всего это были плечи и поверхностный
слой АСБ) была обнаружена более интенсивная флуоресценция ФС, чем в областях с
меньшим количеством клеток (табл. 1,2). В бесклеточных структурах поражений
флуоресценция не определялась вовсе.
13
Таблица 1. Клеточный состав и накопление Фотосенса в различных
морфологических структурах атеросклеротических поражений аорты кроликов.
Корреляционный анализ количества клеток каждого иммунофенотипа и
интенсивности флуоресценции.
Типы поражения аорты/зоны
АСБ
ГМК
Макрофаги
Лимфоциты
Нормальная интима
0 (0-0);r=0
0 (0-0);r=0
0 (0-0);r=0
Интенсивность
флуоресценции
0 (0-0)
Липидное пятно
2 (2-3)
3 (3-4)
1 (0-3)
3 (3-3)
Липидная полоса
3 (2-3)
2 (1-4)
1 (0-3)
2 (1-3)
АСБ
Плечо
1 (1-2);r=0,27
3 (3-4);r=0,78* 1 (0-1,5);r=0,12
3 (2,5-3)
занимающая
Поверхностный
50% и более
2 (1-3);r=0,25
3 (3-4);r=0,89*
1 (0-2);r=-0,44
3 (2-4)
слой АСБ
внутренней
Глубокий слой
поверхности
1 (0-2);r=0,27
2 (1-2);r=0,85*
0 (0-0);r=0,39
1 (1-2)
АСБ
сосуда
АСБ
Поверхностный
4 (3-4);r=-0,3
3 (3-3);r=0,53
1 (1-2);r=0,61*
3 (2-3)
занимающая
слой АСБ
90% и более
внутренней
Глубокий слой
1 (1-2);r=-0,008
2 (1-2);r=0,6*
0 (0-1);r=0,52
1 (1-2)
поверхности
АСБ
сосуда
Число клеток и интенсивность флуоресценции Фотосенса оценивали по шкале от 0 до 4. Данные
представлены в таблице в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей - (Ме (LQ-UQ)), показывающих
интервал 50% значений, наиболее близких к среднему. r – коэффициент корреляции между количеством
клеток и интенсивностью флуоресценции, * - р<0,05.
Таблица 2. Клеточный состав и накопление АЛК индуцированного ПП IX в
различных морфологических структурах атеросклеротических поражений аорты
кроликов. Корреляционный анализ количества клеток каждого иммунофенотипа и
интенсивности флуоресценции.
Типы поражения аорты/зоны
АСБ
ГМК
Макрофаги
Лимфоциты
Нормальная интима
0 (0-0);r=0
0 (0-0);r=0
0 (0-0);r=0
Интенсивность
флуоресценции
0 (0-0)
Липидная полоса
2 (2-3);r=-0,4
2 (2-2);r=0,25
0 (0-1);r=0,39
1 (1-1)
АСБ
Плечо
2 (1,5-3);r=0,26
3 (2-3);r=0,84*
0 (0-1);r=0,56
2,5 (2-3)
занимающая
50% и более
Поверхностный
3 (3-3);r=0,24
3 (2-3);r=0,59*
0 (0-1);r=0,11
2 (2-3)
внутренней
слой АСБ
поверхности
Глубокий слой
2,5 (1-3);r=0,4
1,5 (1-2);r=0,88* 0 (0-0);r=-0,32
1 (0-2)
сосуда
АСБ
АСБ
Поверхностный
3 (3-4);r=-0,42
2 (2-3);r=0,93*
1 (1-2);r=0,23
2 (1-3)
занимающая
слой АСБ
90% и более
внутренней
Глубокий слой
1 (0-1);r=0,8*
1 (1-2);r=0,92*
0 (0-0);r=0,21
1 (1-2)
поверхности
АСБ
сосуда
Число клеток и интенсивность флуоресценции ПП IX оценивали по шкале от 0 до 4. Данные представлены в
таблице в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей - (Ме (LQ-UQ)), показывающих интервал 50%
значений, наиболее близких к среднему. r – коэффициент корреляции между количеством клеток и
интенсивностью флуоресценции, * - р<0,05.
14
Статистическая
флуоресцентной
обработка
микроскопии
данных
выявила
иммуногистохимического
наличие
положительной
анализа
и
корреляционной
зависимости между количеством макрофагов и интенсивностью флуоресценции обоих ФС
в различных зонах АСБ (4 и 5 типы поражений). В 1-3 типах поражения аорты
достоверной корреляционной зависимости между этими показателями найдено не было.
Положительная корреляция между интенсивностью флуоресценции и количеством
лимфоцитов была обнаружена только в поверхностном слое 5-го типа поражения после
введения препарата Фотосенс. Что касается корреляционной зависимости между
количеством ГМК и интенсивностью флуоресценции, то она была выявлена в одном
случае - глубокий слой АСБ, после введения Аласенса. При сравнении между собой
различных типов поражений аорты было показано, что в более выраженных (4 и 5 типы) интенсивность флуоресценции ФС оказалась достоверно выше чем в поражениях 1-3
типов и составила 2 (1,5-3) и 0 (0-2), соответственно, (р<0,001) после введения Фотосенса
и 2 (1-3) и 1 (0-1), соответственно, (р<0,001) после введения Аласенса. При этом в этих
группах были выявлены достоверные различия и по количеству макрофагов: в
поражениях 4 и 5 типов количество макрофагов было больше, чем в поражениях 1-3 типов
и составило 3 (2-3) и 0,5 (0-2), соответственно, (р<0,001) после введения препарата
Фотосенс и 2 (2-3) и 1 (0-2), соответственно, (р<0,001) после введения препарата Аласенс.
Аналогичные данные по селективному накоплению ФС в атеросклеротически
измененных участках артерий были получены и в других работах с использованием той
же экспериментальной модели [Spears J.R. et al. 1983, Pollock M.E. et al. 1987, Eldar M. et
al. 1990, Katoh T. et al. 1997, Allison B.A. et al. 1997, Kwon O.C. et al. 2008], на аутопсийном
материале аорты и коронарных артерий человека [Delettre E. et al. 1991, Biały D. et al.
2003] и на образцах артерий (сонные, коронарные, бедренные и подколенные артерии),
взятых при эндартерэктомии [Spokojny A.M. et al. 1986, Gonschior P. et al. 1993, Hsiang
Y.N. et al. 1993]. Нами было продемонстрировано, что преимущественное накопление
красителя происходило в участках АСБ, содержащих наибольшее количество клеток
(чаще всего это были плечи и поверхностный слой АСБ). Напротив, в участках, не
содержащих клеточных элементов, накопления ФС вообще не выявлялось. Этот факт был
отмечен и другими авторами при исследовании эндартерэктомического материала
человека [Gonschior P. et al. 1993]. Однако, работ по идентификации типов клеток,
находящихся
в
участках
преимущественного
накопления
красителя,
ранее
не
проводилось. Иммунотипирование клеток в этих зонах впервые было проведено в нашей
работе.
По результатам исследований после проведения ФДТ на экспериментальных
15
моделях атеросклероза и рестеноза у животных происходит значительное снижение
количества макрофагов в пораженной интиме [Hayase M. et al. 2001, Waksman R. et al.
2008, Peng C. et al. 2011]. Учитывая эти данные, мы предположили, что, накопление ФС
происходит, в первую очередь, именно в этих клетках. Действительно, проведенный нами
иммуногистохимический анализ клеточного состава в областях аорты с наибольшей
интенсивностью флуоресценции продемонстрировал, что в этих зонах содержится
максимальное количество макрофагов. Учитывая эти факты, мы сделали заключение о
том, что статистически значимые различия в интенсивности флуоресценции ФС в
поражениях аорты разной степени выраженности в большей степени связаны с
количеством присутствующих в них макрофагов.
2. Накопление Фотосенса в АСБ человека, удаленных во время операции
каротидной эндартерэктомии
Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование. Было
включено 30 пациентов (20 мужчин и 10 женщин). Клиническая характеристика больных
представлена в таблице 3.
Таблица 3. Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование (n=30).
–
–
Показатель
Значение
Пол (муж./жен.)
20/10
Возраст, годы (Mm)
709
«Классические» факторы риска
Артериальная гипертония
93,3 % (n=28)
Курение
в анамнезе
36,6 % (n=11)
в настоящее время
23,3 % (n=7)
2
Ожирение (ИМТ > 30 кг/м )
33,3 % (n=10)
Сахарный диабет
20 % (n=6)
5,38±1,35
Общий холестерин, ммоль/л (Mm)
100% (n=30)
Цереброваскулярная болезнь
Ишемический инсульт в анамнезе
33,3% (n=10)
Транзиторная ишемическая атака в анамнезе
10% (n=3)
Эндартерэктомия/ангиопластика контралатеральной сонной артерии в 10% (n=3)
анамнезе
73,3% (n=22)
ИБС
Стенокардия напряжения
43,3% (n=13)
Инфаркт миокарда в анамнезе
10% (n=3)
ЧКВ/КШ в анамнезе
10% (n=3)
Была выявлена высокая распространенность «классических» факторов риска ССЗ:
большая часть пациентов страдали артериальной гипертонией (АГ) (93,3%), у трети
больных было выявлено ожирение (среднее значение индекса массы тела (ИМТ)
составило 27,9±3,9 кг/м2), сахарный диабет встречался у каждого пятого пациента
(углеводный обмен был компенсирован только у 25% из них). К моменту включения в
16
исследование продолжали курить 23,3% больных. Относительно невысокий средний
уровень холестерина (5,38±1,3 ммоль/л) и триглицеридов (1,34±1,0) был связан с приемом
большинством пациентов липидснижающей терапии (статинов – 93,3%). Почти половина
пациентов (43,3%) перенесла транзиторную ишемическую атаку или ишемический
инсульт, при этом в 23,3% случаев это осложнение произошло менее чем 6 месяцев назад.
Большая часть пациентов (73,3%) страдала ишемической болезнью сердца (ИБС), а
процедуры реваскуляризации выполнялись в 10% случаев.
Всем пациентам перед проведением каротидной эндартерэктомии выполнялось
УЗДС экстракраниального отдела брахиоцефальных артерий. В большинстве случаев
стеноз был более 70% и АСБ являлись гипоэхогенными (46,6%) с наличием гетерогенной
структуры (90%). У четверти проанализированных АСБ определялись признаки
кальциноза. Признаки нестабильности АСБ, такие как наличие дефектов на ее
поверхности, определялись в 16,7% случаев. 26 пациентам была выполнена стандартная
каротидная эндартерэктомия, 4 – протезирование заплатой Core-Tex.
Микроскопическое исследование препаратов атеросклеротических бляшек
человека, сравнительный анализ полученных данных. Из 30-ти проанализированных
случаев согласно классификации Stary большинство поражений (n=18) принадлежало к VI
типу (осложненное поражение с поверхностным дефектом, кровоизлиянием и/или
тромботическими наложениями). По классификации Virmany 11 поражений были
охарактеризованы как многослойные, среди которых чаще встречалась заживающая
эрозия (n=8), 19 АСБ были однослойными. При разделении АСБ на стабильные и
нестабильные (в соответствии с общепринятыми морфологическими критериями) 18
бляшек оказались нестабильными и 12 стабильными.
В результате исследования накопление ФС (по данным флуоресцентной
микроскопии) было выявлено во всех АСБ. Однако, интенсивность флуоресценции ФС
значительно отличалась в разных отделах бляшек. Так, в участках с наибольшим
количеством клеточных элементов была выявлена наиболее интенсивная флуоресценция
(рис. 3).
17
Рис. 3. Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика участков накопления
Фотосенса в АСБ. ×200, а-в, г-е, ж-и – параллельные срезы.
а
б
в
г
д
е
е
ж
з
и
а - периферическая зона атеронекротического ядра АСБ, содержащая большое количество клеточных
элементов. Окраска гематоксилином и эозином;
б - тот же фрагмент. Экспрессия антигена макрофагов HAM (коричневое окрашивание). Стрептавидинбиотиновый метод. Ядра докрашены метиловым зеленым;
в - тот же фрагмент. Флуоресценция ФС (красный цвет, интенсивность 4) выявляется в зоне расположения
макрофагов. Аутофлуоресценция соединительнотканных волокон голубого цвета, фильтр UV;
г - участок плеча АСБ, содержащий большое количество клеток с округлыми ядрами. Окраска
гематоксилином и эозином;
д - тот же фрагмент АСБ. Экспрессия антигена лимфоцитов CD3 (коричневое окрашивание). Стрептавидинбиотиновый метод. Ядра докрашены метиловым зеленым;
е - тот же фрагмент АСБ. Флуоресценция ФС (красный цвет, интенсивность 4), выявляется в области
скопления лимфоцитов. Аутофлуоресценция соединительнотканных волокон голубого цвета, фильтр UV;
ж - фрагмент покрышки АСБ. Окраска гематоксилином и эозином;
з - тот же участок. Экспрессия антигена гладкомышечных клеток α-актина (коричневое окрашивание).
Стрептавидин-биотиновый метод. Ядра докрашены метиловым зеленым;
и - тот же фрагмент. Флуоресценция ФС (красный цвет, интенсивность 4) выявляется в зоне расположения
гладкомышечных клеток. Аутофлуоресценция соединительнотканных волокон голубого цвета, фильтр UV.
В областях атеросклеротического поражения практически не содержащих клеток,
таких как участки кальциноза, соединительнотканный матрикс, центральная зона
атеронекротического ядра, а также неизмененная интима, флуоресценция практически не
определялась (табл. 4).
18
Таблица 4. Характеристика клеточного состава и накопления ФС в различных областях
АСБ.
Области АСБ
ГМК
Макрофаги
Лимфоциты
Интенсивность
флуоресценции
3 (2-3)
Покрышка n=54
3 (2-3);r=0,35
1,5 (0-2);r=0,32* 1 (0-2);r=0,04
Периферическая зона ядра
1 (0,5-2);r=0,4*
3 (2-3);r=0,61*
2 (1-3);r=0,4*
3 (2-3)
n=64
Плечи n=43
2 (2-3);r=0,25
3 (2-4);r=0,63*
3 (1-3);r=0,3*
3 (2-4)
Области скопления
новообразованных
3 (2-3);r=-0,06
3 (2-4);r=0,31
4 (3-4);r=0,26
3 (2-4)
капилляров n=22
Области скопления
2 (1-2);r=-0,3
3 (2-4);r=0,2
4 (3-4);r=0,28
4 (3-4)
гематогенных клеток n=31
Участки вновь
образованной
4 (3-4);r=0,15
1 (0-2);r=0,24
2 (0-2);r=-0,21
4 (3-4)
соединительной ткани
n=19
Диффузное интимальное
2,5 (2-3);r=0,18
1 (0-2);r=0,35
0 (0-2);r=0,32
1,5 (1-2)
утолщение n=22
Медия n=21
3 (2-4);r=-0,35
0 (0-0);r=0,04
0 (0-0);r=0
1 (1-2)
Нормальная интима n=14
2 (1-3);r=0,34
0 (0-1);r=0,29
0 (0-0);r=0
0,5 (0-1)
Области, не содержащие
клеток (кальциноз,
соединительнотканный
0 (0-0);r=0
0 (0-0);r=0
0 (0-0);r=0
0 (0-0)
матрикс, центральная зона
ядра) n=22
Число клеток и интенсивность флуоресценции ПП IX оценивали по шкале от 0 до 4. Данные представлены в
виде медианы, нижнего и верхнего квартилей - (Ме (LQ-UQ)), показывающие интервал 50% значений,
наиболее близкий к среднему. r – коэффициент корреляции между количеством клеток и интенсивностью
флуоресценции, * - р<0,05. n – число наблюдений данных областей во всех проанализированных кусочках.
Как видно из таблицы 4, анализ корреляционной зависимости между количеством
клеток определенного иммунофенотипа и интенсивностью флуоресценции ФС обнаружил
достоверную положительную корреляцию в плечах, покрышке и периферических зонах
ядра АСБ. В остальных областях АСБ достоверной корреляционной зависимости, между
этими показателями, найдено не было. При объединении данных по всем отделам АСБ,
содержащим клетки, положительная корреляция была выявлена между интенсивностью
флуоресценции и количеством макрофагов (r=0.51, р<0.05) и лимфоцитов (r=0.5, р<0.05).
Также при сравнении интенсивности флуоресценции ФС было показано, что в
нестабильных АСБ интенсивность флуоресценции была достоверно выше, чем в
стабильных и составила 3 (2-4) и 2 (1-2) соответственно (р<0,05).
Таким образом, в результате нашего исследования было показано, что накопления
ФС
Фотосенс
в
АСБ
человека,
удаленных
во
время
операции
каротидной
эндартерэктомии происходит в первую очередь в областях АСБ наиболее богатых
клеточными элементами. Напротив, в участках АСБ, не содержащих клеточных элементов
накопления ФС выявлено не было. Наши данные хорошо согласуются с результатами,
полученными при исследовании эндартерэктомического материала из коронарных
артерий и артерий нижних конечностей, где также было показано преимущественное
19
накопление ФС в участках АСБ, содержащих наибольшее количество клеток [Gonschior P.
et al. 1993]. Однако, в этих работах, в отличие от нашего исследования, не проводилось
иммуногистохимического
анализа.
Проведенное
нами
фенотипирование
клеток,
находящихся в зонах АСБ с максимальной интенсивностью флуоресценции, показало, что
в этих зонах содержится максимальное количество макрофагов и лимфоцитов.
Сравнительный анализ интенсивности флуоресценции в стабильных и нестабильных АСБ
показал, что накопление ФС было более выраженным в нестабильных бляшках. Повидимому, это связано с тем, что нестабильные бляшки содержат большее количество
клеточных
элементов,
в
особенности
макрофагов.
В
других
работах
было
продемонстрировано значительное снижение количества макрофагов в АСБ после
проведения ФДТ на кроликах с экспериментальным атеросклерозом [Waksman R. et al.
2008, Peng C. et al. 2011]. Это позволяет предположить, что наиболее перспективным
направлением дальнейших исследований будет изучение эффектов ФДТ именно на
нестабильные АСБ.
3. Апробация неинвазивного метода диагностики атеросклероза сонных
артерий при помощи лазерной электронной спектроскопии с предварительным
введением фотосенсибилизаторов
Клиническая характеристика обследованных пациентов. В исследование было
включено 34 пациента, проходящих курс обследования и лечения, включающий
флуоресцентную диагностику и ФДТ. Клиническая характеристика больных представлена
в таблице 5.
Таблица 5. Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование.
–
–
Показатель
Пол (муж./жен.)
Возраст, годы (Mem)
Основной клинический диагноз:
- базальноклеточный рак кожи
- макулярная дистрофия сетчатки
- рак молочной железы
«Классические» факторы риска ССЗ
Артериальная гипертония
Курение
в анамнезе
в настоящее время
Ожирение (ИМТ > 30 кг/м2)
Сахарный диабет
Общий холестерин, ммоль/л (Mem)
ИБС
Стенокардия напряжения
Инфаркт миокарда в анамнезе
ЧКВ/КШ в анамнезе
Значение
12/22
6812
67,6 % (n=23)
20,6 % (n=7)
11,8 % (n=4)
23,5 % (n=8)
38,2 % (n=13)
11,8 % (n=4)
14,7 % (n=5)
5,9 % (n=2)
4,58±0,9
23,5% (n=8)
8,8% (n=3)
11,8% (n=4)
8,8% (n=3)
20
У четверти пациентов (8 чел.) были выявлены ССЗ, из них 6 пациентов имели
сочетание ИБС и АГ. Определялись «классические» факторы риска ССЗ: четверть
больных страдала АГ (23,5%), ожирение было выявлено у 14,7%, сахарный диабет
встречался лишь у двух человек. К моменту включения в исследование продолжали
курить 11,8% больных. У пациентов регистрировался относительно невысокий средний
уровень холестерина (4,58±0,9 ммоль/л) и триглицеридов (1,1±0,5). Четверть пациентов
(23,5%) страдала ИБС, при этом процедуры реваскуляризации выполнялись в 8,8%
случаев.
Всем пациентам (n=34) перед проведением лазерной электронной спектроскопии
выполнялось УЗДС экстракраниального отдела брахиоцефальных артерий. В результате
было показано, что 67,6% (n=23) больных имели поражения сонных артерий в виде
сформированных АСБ, у 23,5% (n=8) отмечалось утолщение комплекса интима-медия
более чем 0.9 мм и у 8,8% (n=3) - патологии выявлено не было. В таблице 6 представлены
данные УЗДС сонных артерий (n=68 – правая и левая сонные артерии).
Таблица 6. Результаты УЗДС сонных артерий (n=68).
Показатель
Норма
ТИМ мм (Mеm), n=16
Процент стеноза (Mеm), n=46
Гиперэхогенная АСБ
Наличие гетерогенности
Значение
n=6
1,10,1
308,5
8,7% (n=4)
91,3% (n=42)
Ровная – 89,1 % (n=41)
Неровная (с дефектами) 10,9% (n=5)
23,9% (n=11)
Поверхность АСБ
Признаки кальциноза АСБ
Средняя
степень
стенозирования
сонных
артерий
была
порядка
30%
(максимальный стеноз – 45%, минимальный – 20%). В подавляющем большинстве
случаев АСБ были
гетерогенной
структуры (91,3%).
Практически
у четверти
проанализированных АСБ определялись признаки кальциноза. Признаки нестабильности
АСБ, такие как наличие дефектов на ее поверхности, наблюдались в 10,9% случаев.
Результаты лазерной электронной спектроскопии. Всем пациентам в проекции
правой и левой ОСА и прилежащей ГКС мышцы до и в различные временные промежутки
после введения ФС производилась лазерная электронная спектроскопия. Из них Фотосенс
был введен 18-и пациентам и Аласенс - 16. По результатам электронной спектроскопии
оценивалась интенсивность флуоресценции, которая отражает степень накопления ФС. На
рисунке 4 и 5 представлены результаты лазерной электронной спектроскопии,
отражающей уровень накопления ФС (Фотосенса и Аласенса), у пациентов, в зависимости
от степени выраженности атеросклеротического процесса.
21
Рисунок 4. Интенсивность флуоресценции Фотосенса у пациентов в зависимости
от степени выраженности атеросклеротического процесса по данным лазерной
электронной спектроскопии. n – количество сонных артерий. Интенсивность
флуоресценции представлена в виде медианы.
Рисунок 5. Интенсивность флуоресценции АЛК индуцированного ПП IX у
пациентов в зависимости от степени выраженности атеросклеротического
процесса по данным лазерной электронной спектроскопии. n – количество сонных
артерий. Интенсивность флуоресценции представлена в виде медианы.
В предыдущих разделах нашей работы и в ряде других исследований, проведенных в
данной области, было показано, что преимущественное накопление ФС происходит в
атеросклеротически
измененных
участках
сосудистой
стенки
по
сравнению
с
нормальными зонами [Hsiang Y.N. et al. 1993, Allison B.A. et al. 1997, Kwon O.C. et al.
2008, Peng C. et al. 2011]. Учитывая эти данные, предполагалось, что после введения ФС
пациентам препарат будет селективно накапливаться в атеросклеротически измененных
22
участках
сонной
артерии.
Соответственно,
предполагалось,
что
более
высокая
интенсивность флуоресценции ФС будет определяться в атеросклеротически измененной
ОСА, чем в прилегающей к ней мышце. Однако, анализируя результаты исследования
можно заключить, что постоянного и достоверного увеличения сигнала интенсивности
флуоресценции в проекции ОСА по сравнению с прилежащей ГКС не наблюдалось как
при использовании Фотосенса, так и Аласенса. При этом интенсивность флуоресценции
ФС, определяемая в проекции ОСА с наличием АСБ, с утолщением комплекса интимамедия и нормальной артерии также достоверно не отличалась. Данные результаты
свидетельствуют о том, что применение этой методики, по крайней мере, с
использованием накожного измерения флуоресценции, для диагностики атеросклероза
нецелесообразно. По всей видимости, при использовании этой методики в неинвазивном
режиме, избирательной регистрации флуоресценции ФС в стенке артерий, препятствует
флуоресценция препарата, накопившегося в коже, подкожно-жировой клетчатке и
прилегающих тканях. По-видимому, дальнейшее развитие этого диагностического
направления должно быть связано с разработкой принципиально новой аппаратуры,
регистрирующей сигнал непосредственно от стенки сосуда, и новых более селективных
ФС.
Выводы:
1. Фотосенсибилизаторы Фотосенс и АЛК-индуцированный протопорфририн IX
накапливаются в атеросклеротических поражениях аорты кролика в отличие от
нормальной сосудистой стенки. Преимущественное накопление препаратов происходит в
участках атеросклеротических бляшек, содержащих наибольшее количество клеточных
элементов.
2. Существует достоверная положительная корреляционная зависимость между
интенсивностью флуоресценции Фотосенса и АЛК-индуцированного протопорфририна
IX и количеством макрофагов. Максимальное накопление фотосенсибилизаторов
происходит в более выраженных атеросклеротических поражениях, что связано с большей
инфильтрацией их макрофагами.
3. Фотосенс накапливается в атеросклеротической бляшке сонных артерий человека,
удаленной во время эндартерэктомии, in vitro преимущественно в участках, содержащих
наибольшее количество клеточных элементов.
4.
В
участках
атеросклеротических
бляшек
человека
с
максимальной
интенсивностью флуоресценции Фотосенса (покрышка, плечи и периферическая зона
ядра) содержится наибольшее количество макрофагов и лимфоцитов.
23
5. В нестабильных атеросклеротических бляшках человека Фотосенс накапливается в
большей степени, чем в стабильных поражениях, что связано с более выраженной
инфильтрацией нестабильных бляшек клетками воспаления.
6. По данным лазерной электронной спектроскопии при использовании Фотосенса
или Аласенса у пациентов не обнаружено достоверных различий между интенсивностью
флуоресценции вне зависимости от степени выраженности атеросклеротического
поражения в проекции общей сонной артерии и прилежащей мышцы. Это свидетельствует
о том, что применение неинвазивной лазерной спектроскопии для диагностики
атеросклероза сонных артерий нецелесообразно.
Практические рекомендации:
Применение лазерной электронной спектроскопии для диагностики атеросклероза
сонных артерий, с использованием накожного измерения, нецелесообразно. Дальнейшее
развитие этого диагностического направления с использованием флуоресцентной
спектроскопии для идентификации атеросклеротических изменений должно быть связано с
разработкой принципиально новой аппаратуры, регистрирующей сигнал непосредственно
от стенки сосуда, и новых более селективных фотосенсибилизаторов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ю.Е. Ефремова, Г.Н. Соболева, Е.Р. Андреева, Ю.А. Карпов, Э.М. Тарарак
Фотодинамическая
терапия
при
сердечно-сосудистой
патологии.
Атмосфера
Кардиология. 2010; 2-3: с. 15-18.
2. Ю.Е. Ефремова, Е.Р. Андреева, Г.Н. Соболева, Н.В. Радюхина, С.Г. Кузьмин, Ю.А.
Карпов, Э. М. Тарарак. Накопление фотосенсибилизаторов: сульфированного
фталоцианина алюминия и 5-АЛК индуцированного протопорфирина IX, в аорте
кролика с экспериментальным атеросклерозом. Технологии живых систем. 2012; т.9,
№8: с. 31-38.
3. Ю.Е. Ефремова, Е.Р. Андреева, Г.Н. Соболева, Н.В. Радюхина, Д.Ф. Белоярцев, Ю.А.
Карпов,
Э.М.
Тарарак.
Накопление
фотосенсибилизатора
«Фотосенс»
в
атеросклеротической бляшке сонной артерии человека in vitro. Архив патологии.
2012; №5: с. 18-22.
4. Ю.Е. Ефремова, Г.Н. Соболева, Ю.А. Карпов, Э.М. Тарарак. Применение
фотодинамической терапии при патологии сосудистой стенки. Атеросклероз и
дислипидемии. 2013; №1: с. 20-25.
5. Ю.Е. Ефремова, Г.Н. Соболева, Е.Р. Андреева, Н.В. Радюхина, Ю.А. Карпов, Э.М.
Тарарак. Накопление фтолоцианина алюминия в атеросклеротических бляшках
24
сонных артерий, удаленных при операции эндартерэктомии: исследование in vitro.
Тезисы на Российский национальный конгресс кардиологов. Кардиоваскулярная
терапия и профилактика, приложение 1. 2010, 9 (6): 112.
6. Ю.Е. Ефремова, Г.Н. Соболева, Е.Р. Андреева, Н.В. Радюхина, Ю.А. Карпов, Э.М.
Тарарак. Метод флуоресцентной диагностики атеросклероза сонных артерий. Тезисы
на конференцию «Новые возможности в диагностике, лечении и снижении
смертности от ССЗ». 2010: 18-19.
7. Spain, Benidorm. Loshchenov V.B., Vasilchenko S.Yu., Efremova Yu.E., Tararak E.M.,
Kuzmin S.G., Vorozhtsov G.N. Evaluation of possibility of photosensitizers application for
optical diagnostics and photodynamic therapy of atherosclerotic plaques. Тезисы на 9
междунардную конференцию «Hight medical technologies in XXI century». 2010: 60.
8. Ефремова Ю.Е., Соболева Г.Н., Андреева Е.Р., Радюхина Н.В., Кузьмин С.Г., Карпов
Ю.А.,
Тарарак
Э.М.
Накопление
фотосенсибилизатора
«Фотосенс»
в
атеросклеротических бляшках сонных артерий: исследование in vitro. Тезисы на
конференцию «Инновации в кардиологии». 2011 г: с. 42-43.
9. Y. Efremova, G. Soboleva, E. Andreeva, N. Radukhina, E. Tararak, Y. Karpov. Alluminium
phtalocyanine accumulation in endarterectomy carotid plaques in patients with arterial
hypertension and atherosclerosis: study in vitro. Тезисы на «European Meeting on
Hypertension 2011». р.5.132.
10. Васильченко С.Ю., Лощенов В.Б., Макаров В.И., Ефремова Ю.Е., Тарарак Э.М.,
Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Оптическая диагностика и фотодинамическая терапия
атеросклеротических бляшек. Тезисы на конференцию «Инновационные технологии в
лазерной медицине». Журнал «Лазерная Медицина». 2011: Т.15, вып.2: 61.
11. Yu.E. Efremova, G.N. Soboleva, E.R. Andreeva, N.V. Radukhina, E.M. Tararak, Yu.A.
Karpov. Uptake of aluminium phtalocyanine in endarterectomy carotid plaques in human:
study in vitro. Тезисы на «European society of cardiology congress 2011». European Heart
Journal 2011: Vol. 32 (abstr. supplement) 834.
25
Скачать