Остаточная ДНК культуры клеток VERO*

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ КАК НОВЫЙ МЕТОД ДЕТЕКЦИИ ОСТАТОЧНОЙ ДНК
КЛЕТОК VERO В ПРЕПАРАТАХ ВИРУСОВ ВАКЦИННОГО НАЗНАЧЕНИЯ
Смирнова М.С., Баловнева М.В., Шибаева А.В., Зарипова Р.С., Белоусова Ж.В.,
Валиуллин Л.Ф., Малышева Е.В., Дудорова М.Г., Гусева М.А., Елагина Е.М.
Учреждение российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных
энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, МО, Россия
ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных»,
Казань, Татарстан, Россия
Набережночелнинский государственный педагогический институт, Набережные Челны,
Татарстан, Россия
Курский государственный университет, Курск, Россия
Смоленский государственный университет, Смоленск, Россия
В настоящее время иммуноферментный анализ и гибридизационный метод с
использованием радиоактивных изотопов являются основными для детекции содержания
остаточной геномной ДНК в препаратах, используемых для получения вакцин. Однако
существует более простой, дешевый и безопасный метод для определения содержания
остаточной ДНК в вакцинных препаратах – это полимеразная цепная реакция в реальном
времени (реал-тайм ПЦР). Данный метод
является удобной альтернативой
вышеупомянутым методам, однако, до настоящего времени не применялся в нашей
стране.
Главной целью данной работы было разработать методику количественного
определения остаточной ДНК клеток Vero в очищенных инактивированных препаратах
хантавируса Пуумала и вируса клещевого энцефалита, предназначенных для получения
вакцин.
Вторичные концентраты хантавируса Пуумала и вируса клещевого энцефалита
являлись вакцинным материалом в настоящем исследовании. Для проведения
аналитических измерений использовали анализатор нуклеиновых кислот и
фотометрический колориметр со встроенными функциями обработки данных фирмы
Amersham. Для того чтобы получить контрольный препарат геномной ДНК клетки
культуры Vero выращивали на среде Игла МЕМ с 4% раствором сыворотки, затем из
клеток осажденных специально разработанным способом выделяли геномную ДНК в
соответствии
с рекомендациями производителя набора «Комплект реагентов для
выделения геномной ДНК из тканей животных» (ЗАО Синтол). Полученный осадок
клеток инкубировали с раствором протеиназы К (№1) в течение 14-16 часов при +50С.
Далее проводили двойное переосаждение изопропанолом
и 70%-ым этанолом.
Концентрацию полученного осадка ДНК измеряли спектрофотеометрически без
построения калибровочного графика с использованием прибора Amersham Bioscience
Ultraspec Pro 6300, пользуясь встроенным методом «Определение концентрации ДНК».
Фенольную экстракцию ДНК из препаратов вторичного концентрата (полуфабрикат
вакцины) проводили с 750 мкл исследуемого препарата вторичного концентрата. ДНК
инкубировали с фенолом и хлороформом при 65С в течение 5 минут. Разделение водной
и органической фаз проводили центрифугированием и осадок переосаждали
хлороформом, изопропанолом и этанолом, и высушивали при 37±1С в течение 10 мин,
растворяя затем в воде. До проведения ПЦР-анализа полученный препарат
экстрагированный из вакцинного препарата нуклеиновой кислоты может храниться в
течение 24 часов при 2-8С. Непосредственно перед использованием, находившийся на
хранении раствор ДНК должен быть прогрет в течение 5 минут при +65С. Из
полученного препарата очищенной ДНК отбирали 5 мкл раствора в качестве образца для
внесения в реакционную смесь ПЦР. Для получения серийных разведений стандартной
ДНК клеток Vero с шагом в 4 раза, первичный рабочий раствор ДНК с концентрацией
1 мкг/мл разводили с водой и прогревали в течение 15 минут при +65С. Полученный
контрольный ряд разведений хранят при температуре 4±2С не более 1 суток.
Состав реакционной смеси для проведения ПЦР содержал (мкм): реакционная
смесь (dNTP 500 мкМ каждого, термобуфер B9004S (New England Biolabs), MgCl2 2,5 мМ)
– 10; праймеры - 5 пмоль/мкл каждого – 2; зонд (3 пмоль/мкл) – 1; вода – 7; ДНКполимераза (Антительный хот-старт, 10 ед/мкл) - 0,2. В каждую из пробирок с
реакционной смесью вносили по 5 мкл ДНК. В качестве ряда серийных разведений
контрольной ДНК для построения калибровочного графика использовали 6 образцов с
концентрацией ДНК 977 пг/мл, 3906 пг/мл, 15625 пг/мл, 62500 пг/мл, 250000 пг/мл,
1000000 пг/мл. Для проведения ПЦР использовали следующую программу:
предварительная денатурация 95С – 300 сек; основной режим (50 циклов) - 95С – 50
сек;- 60С – 50 сек.
Результаты анализировали при условии величины сигнала в ПКО, рассчитанной в
автоматическом режиме, менее 105 пг/мл и величины сигнала ОКО не более 5×104 пг/мл,
затем проводили построение калибровочного графика. Для расчета истинной
концентрации ДНК в исследуемых препаратах полученные в результате значения
определенной геномной ДНК делили на 75, чтобы учесть эффект концентрирования
препарата в процессе его фенольной экстракции. Расчет концентрации остаточной ДНК в
образце проводили по формуле:
[С0] = [Cr1]Ctr2 – [Cr2]CtR1
Ctr2-Ctr1
[С0] – условная точка, соответствующая параметру Ct при нулевой
концентрации ДНК в образце (результат линейной экстраполяции).
[C] – lg концентрации ДНК, пг/мл;–
[Ct] - значения
[Cr1] - произвольных точки R1 и R2 с точно известными координатами
Концентрацию ДНК в экспериментальной точке Х (в виде lg концентрации ДНК, пг/мл)
рассчитывали по формуле:
[Cx] = [С0] – ([C0]- [Cr1])Ctx
Ctr1
В настоящем работе впервые описана процедура количественного определения
остаточной ДНК клеток Vero в очищенных инактивированных препаратах хантавируса
Пуумала и вируса клещевого энцефалита, предназначенных для получения вакцин.
Настоящая работа выполнена при поддержке Государственных контрактов
№ 14.740.11.0184, №П807, №П1253, №П1263, № 16.740.11.0027, №14.740.11.0123, №
14.740.11.0122; проектов в рамках мероприятия 1.2.2 шифры заявок (2010-1.2.2-203-002038, 2010-1.2.2-207-003-082, 2010-1.2.2-141-022-040, 2010-1.2.2-141-022-018); мероприятия
1.3.1 шифры заявок (2010-1.3.1-207-003-043, 2010-1.3.1-203-002-017, 2010-1.3.1-203-002018, 2010-1.3.1-220-006-021); проектов № 2.1.1/2468, № 2.1.1/4510, № 2.1.1/2516 ФЦП
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы, а
также гранта РФФИ № 09-04-99002-р_офи.