На правах рукописи ТВОРОГОВА Татьяна Васильевна ВЛИЯНИЕ НЕЙРОПЕПТИДОВ ПРОИЗВОДНЫХ ТАФТСИНА

На правах рукописи
ТВОРОГОВА Татьяна Васильевна
ВЛИЯНИЕ НЕЙРОПЕПТИДОВ ПРОИЗВОДНЫХ ТАФТСИНА
НА ДИНАМИКУ ФОРМИРОВАНИЯ
ВНУТРИМОЗГОВОЙ ГЕМАТОМЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ
ВОССТАНОВЛЕНИЕ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО
ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА У КРЫС
14.00.13 — «Нервные болезни»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2009
1
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Российский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук,
профессор
Скворцова Вероника Игоревна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор
Румянцева Софья Алексеевна
доктор медицинских наук,
профессор
Стулин Игорь Дмитриевич
Ведущая организация:
Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени
М.Ф.Владимирского.
Защита состоится «28» декабря 2009 года в 14-00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.09 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу:
117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по
адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
Автореферат разослан «27» .ноября 2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета:
кандидат медицинских наук, профессор
2
Л.В.Губский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В современном мире геморрагический инсульт (ГИ) занимает лидирующие
позиции в качестве причины смертности среди всех типов инсульта, особенно у
пациентов до 55 лет (В.И.Скворцова с соавт., 2006 г).
В 85% случаях ГИ представляет собой кровоизлияние по типу внутримозговой
гематомы. Тактика лечения пациентов с нетравматическими внутримозговыми
кровоизлияниями (ВМК) остается предметом дискуссии, так как совершенствование
методик хирургического лечения, способствуя сохранению жизни больных, не
решает полностью вопроса функционального восстановления пациентов. В этой
связи, особую актуальность приобретает проблема защиты и стимуляции
репаративных возможностей ткани мозга в условиях катастрофического действия
ВМК: механического давления с формированием масс-эффекта и нарушением
локальной перфузии, ранней прогрессии гематомы, токсического действия
компонентов плазмы крови и продуктов распада гемоглобина. В частности, интерес
представляют нейропротекторные вещества, способные оказывать комплексное
действие на каскадные процессы реализации некротической гибели нейронов и глии
и процессы апоптоза, прежде всего, из группы нейропептидов, эндогенных
регуляторов функций центральной нервной системы.
В последние годы выявлены интересные аспекты действия регуляторных
пептидов, являющихся производными тафтсина (Thr-Lys-Pro-Arg), в частности,
трипептида – макрофагально-микроглиального ингибирующего фактора (МИФ, ThrLys-Pro). S.Tsirka с соавт. (2003 г), моделируя внутримозговую гематому при
помощи введения бактериальной коллагеназы в головной мозг мышей, показали
влияние МИФ на функциональное восстановление животных, объем гематомы и
перифокального
отека.
Экспериментальные
исследования
показали,
что
регуляторный пептид воздействует на процессы свободно-радикального окисления
и реакции активации глии.
3
В Институте молекулярной генетики РАН был синтезирован отечественный
препарат Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro), также являющийся дериватом
тафтсина (Л.А.Андреева, Ф.И.Ершов, А.А.Зозуля с соавт., 2000г). По результатам
экспериментальных и клинических исследований, этот гептапептид обладает
широким спектром действия, включающим анксиолитическое и ноотропное, а также
влияние на реакции коагуляционного каскада и выработку цитокинов. Клинические
испытания у здоровых добровольцев и пациентов с различной структурой
тревожных расстройств показали отсутствие у препарата побочных эффектов и его
хорошую переносимость даже при длительном применении.
Учитывая структурно-функциональные сходства пептидов МИФ и Селанк,
представляло интерес провести сравнительное изучение их воздействия на головной
мозг в условиях экспериментального ГИ.
Цель работы
Исследовать действие нейропептидов МИФ и Селанк при экспериментальном
геморрагическом инсульте у крыс.
Задачи исследования:
1. Отработать модель геморрагического инсульта у крыс путем двухэтапного
введения
аутологичной
крови
в
вещество
головного
мозга
и
изучить
воспроизводимость модели.
2. Изучить влияние нейропептидов МИФ и Селанк при разных способах их
введения на объем гематомы на основе динамического МРТ-исследования.
3. Исследовать влияние нейропептидов МИФ и Селанк при разных способах их
введения на динамику неврологических проявлений у экспериментальных крыс.
Научная новизна
Впервые
при
исследовании
действия
нейропротеидов
применяли
моделирование внутримозговой гематомы у крыс путем двухэтапного введения
4
аутологичной крови по методу W.Deinsberger с соавт. (1996г), позволяющее
наиболее точно отразить изменения, происходящие при развитии спонтанного
внутримозгового кровоизлияния у человека.
Впервые проведено изучение действия нейропептидов МИФ и Селанк на
крысах с экспериментальной внутримозговой гематомой при системном и
интраназальном введении препаратов.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Отработана хорошо воспроизводимая модель геморрагического инсульта путем
двухэтапного введения аутологичной крови у крыс в вещество головного мозга под
контролем динамического МРТ-исследования.
Показана безопасность и эффективность нейропептидов МИФ и Селанк при
применении у крыс с экспериментальной внутримозговой гематомой.
Результаты исследования являются предпосылкой для дальнейшего изучения
возможностей применения нейропептидов в качестве нейропротекторной терапии
при ГИ, в том числе и в клинических условиях, для ускорения восстановления
нарушенных неврологических функций у пациентов со спонтанным ВМК.
Получены данные, указывающие на значимость интраназального способа
введения нейропептидов, легко осуществимого в клинических условиях.
Внедрение в практику
Результаты настоящего исследования применяются при обучении студентов,
интернов, ординаторов и врачей на кафедре фундаментальной и клинической
неврологии ГОУ ВПО «РГМУ».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Отработана хорошо воспроизводимая модель ГИ у крыс путем двухэтапного
введения аутологичной крови в область подкорковых ядер головного мозга.
5
2. Установлено
ускорение
восстановления
нарушенных
неврологических
функций у крыс с ГИ под влиянием нейропептидов МИФ и Селанк при их
внутрибрюшинном и интраназальном введении.
3. Показано ускорение трансформации внутримозговой гематомы и регресса
перифокального отека в условиях экспериментального геморрагического
инсульта у крыс под влиянием нейропептида Селанк при интраназальном его
введении.
4. Выявлено нормализующее влияние нейропептидов при их интраназальном
введении на изменение поведенческих реакций у крыс с экспериментальным
ВМК.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры
фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО РГМУ и
НИИ Инсульта РГМУ (протокол №19 от 26 июня 2009 года).
Основные результаты исследования были доложены на Международной
конференции II Российский конгресс "Цереброваскулярная патология и инсульт" в
г.Санкт-Петербурге 18 сентября 2007 г.
Публикации: по теме диссертации опубликованы 16 печатных работ.
Структура диссертационной работы
Работа выполнена на
127 страницах машинописного текста, включает
введение, 6 основных глав, заключение, выводы и библиографический указатель.
Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 53 таблицами.
6
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика материала и методов исследования
Объектом исследования явились половозрелые самцы нелинейных крыс
(N=40). Крыс содержали в стандартных условиях при свободном доступе к воде и
пище.
Все
манипуляции
с
животными
одобрены
этическим
комитетом
Государственного образовательного учреждения высшего профессионального
образования ГОУ ВПО «РГМУ».
Моделирование внутримозговой гематомы проводили путем двухэтапного
введения аутологичной крови животных в подкорковые ядра головного мозга по
методу W.Deinsberger с соавт. (1996 г), с модификацией (Е.И.Гусев, В.А.Стоник,
М.Ю.Мартынов с соавт., 2005 г). Манипуляции проводили под общим наркозом
(хлоралгидрат 300 мкг/кг внутрибрюшинно); введение аутологичной крови
осуществляли по координатам – 2 мм кпереди и 3 мм вправо от брэгмы на глубину
5,5 мм; забор крови проводили из бедренной артерии животного. Гепарин во
вводимую кровь не добавляли. Случаев летального исхода во время операции не
было. Непосредственно до момента взятия крови из бедренной вены и на всем
периоде формирования внутримозговой гематомы проводили мониторирование
артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС) животного.
Для исследования неврологического статуса животных использовали шкалы
Menzes (S.Menzes; 1992 г) и ЛПТ (limb placing test) (De Rick; 1995 г) в модификации.
Шкала Menzes основана на градации неврологических нарушений: отсутствие
симптомов (0 баллов); тоническая флексия передней противоположной лапы при
подъёме за хвост (1 балл); меньшее сопротивление пассивному движению,
оказываемое противоположной передней лапой, при потягивании за хвост (2 балла);
движение в противоположную очагу сторону при удержании крысы за хвост (3
балла);
спонтанное
вращение
крысы
противоположную очагу сторону (4 балла).
7
на
горизонтальной
поверхности
в
Шкала ЛПТ включает оценку двигательного ответа передних и задних
конечностей. Сначала оценивают способность животного вытягивать передние
конечности при подвешивании за хвост на 10 см над поверхностью стола
(нормальное вытягивание – 0 баллов, аномальная флексия – 1 балл). Затем животное
помещают передними конечностями к краю стола, свешивают ему передние лапы,
оценивая способность животного возвращать конечности на опору. Таким же
образом оценивают
функции
задних
конечностей
животного
(нормальный
двигательный ответ соответствует нулю баллов, возвращение лап с латентным
периодом до 2 секунд или неполное возвращение конечности – 1 баллу, отсутствие
реакции – 2 баллам).
Для оценки изменений поведенческих реакций использовали поведенческие
тесты «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт».
При тестировании в «Открытом поле» визуально фиксировали: перемещения по
горизонтальной плоскости (по числу радиальных перемещений с пересечением
внешней и внутренней окружности), вертикальную двигательную активность,
интенсивность груминга и количество дефекаций.
В тесте «Крестообразный лабиринт» регистрировали следующие показатели
количество переходов через центр лабиринта, количество стоек, груминг,
количество выглядываний животных из закрытых концов лабиринта и общее время
их нахождения на свету.
Для проведения магнитно-резонансной томографии использовали томограф
BioSpec 70/30 с частотой 300МГц и напряженностью магнитного поля 7 Тесла
(Центр Магнитной Томографии и Спектроскопии МГУ, под руководством
профессора
Ю.А.Пирогова, г.Москва). Исследование животных проводили под
общей анестезией (хлоралгидрат 300 мг/кг внутрибрюшинно). Общее время
исследования составило около 40 минут. Использовали режимы 1-Tripilot-multi, 2RARE-T1 в аксиальной и корональной проекциях, RARE-3xEch в аксиальной
проекции и MSME-T1 в аксиальной проекции. Измерение объема патологического
8
очага и его составляющих выполняли в программе ImageJ (USA). Измерение
объемов осуществляли по изображениям Т2 ВИ, позволяющим оценивать как саму
гематому, так и перифокальный отек, с четким разграничением их между собой.
Объем внутримозговой гематомы вычисляли как произведение суммы ее
изображений и толщины срезов. Объем перифокального отека в каждом из
анализированных изображений определяли как разность площади, образованной
контуром внешней его границы, и площади изображения внутримозговой гематомы.
После этого объем вычисляли по той же формуле, что и в случае самой гематомы.
Для статистического анализа использовали непараметрические критерии
Крускала-Уоллиса (непараметрический аналог дисперсионного анализа), НьюменаКейлса и Данна (непараметрические аналоги множественных сравнений), а также
критерий Фридмана (непараметрический аналог дисперсионного анализа повторных
измерений). Для всех тестов был принят 5% уровень значимости. Для проведения
анализа использовали программы BIOSTAT и пакет программ Microsoft Office 2003,
2007.
Исследование проводили в три этапа: на первом этапе изучены характеристики
использованной модели. Для этого животные были разделены на две группы.
Первая группа, контрольная (n=4), представляла собой ложнооперированных
животных. Второй группе (опытной, n=6) проводили формирование внутримозговой
гематомы. Всем крысам проводили МРТ-исследование головного мозга через 24
час., 72 час. и на 10-е сутки после операции. До проведения операции, через 24 час.,
72 час. и на 10-е сутки проводили оценку массы тела животных и неврологическое
обследование.
На втором этапе исследования проводили оценку действия нейропептидов в
условиях экспериментального ГИ при системном (внутрибрюшинном) введении.
Для этого животные были разделены на три группы по пять особей в каждой.
Первая группа – контрольная – в ней животным вводили физиологический раствор
NaCl, крысы второй группы получали МИФ, третьей – Селанк. Препараты вводили
9
животным
внутрибрюшинно,
начиная
с
2
часов
после
формирования
внутримозговой гематомы, далее – три раза в сутки в течение 72 часов. До
операции, а также через 24 час., 72 час. и на 10-е сутки всем животным проводили
оценку массы тела и неврологическое обследование. Для оценки объема гематомы и
перифокального отека проводили МРТ-исследование через 24 час., 72 час. и на 10-е
сутки после формирования экспериментального кровоизлияния.
Третий этап исследования проводили для оценки действия нейропептидов при
интраназальном введении. Животные были разделены на три группы по пять крыс в
каждой.
Животные первой (контрольной) группы получали физиологический
раствор NaCl, во второй группе животным вводили МИФ, в третьей – Селанк.
Препараты животным вводили интраназально, начиная с 2 часов после
формирования внутримозговой гематомы, далее – три раза в сутки в течение 72
часов. До операции, а также через 24 час., 72 час. и на 10-е сутки всем животным
проводили оценку массы тела, неврологическое обследование, а также исследование
поведенческих реакций при помощи тестов «Открытое поле» и «Крестообразный
лабиринт». Для оценки объема гематомы и перифокального отека проводили МРТисследование на ранних сроках после формирования внутримозговой гематомы
(через 2 – 4 часа), далее через 72 час., на 10-е и 21-е сутки после операции.
Результаты и их обсуждение
Первый этап исследования
На этапе отработки методики формирования ГИ в ходе исследования получено
подтверждение, что использование модели двухэтапного введения аутологичной
крови
в
подкорковые
ядра
головного
крыс
позволяет
получать
хорошо
воспроизводимое по локализации и объему ВМК в соответствующих отделах
головного мозга. Гематомы визуализировались при МРТ-исследовании уже через 24
час. после операции, а, учитывая данные третьего этапа исследования, и через 2 – 4
часа после их формирования, и имели высокую степень мономорфности, рис.1.
Проведение магнитно-резонансной томографии головного мозга позволило
10
проследить динамику экспериментального ВМК. Наибольший объем гематомы у
животных опытной группы зафиксирован через 24 час. и составил 67,6±21 мкм3
(среднее
значение±95%ДИ).
В
дальнейшем
объем
гематомы
уменьшался,
достоверное снижение параметра, по сравнению с первыми сутками наблюдения
отмечено на 10-е сутки после операции (p<0,05). Объем перифокального отека
через 24 часа после операции у животных опытной группы составил 70,6±23 мкм3
(среднее значение±95%ДИ). Через 72 час. после формирования внутримозговой
гематомы отмечена тенденция к нарастанию перифокального отека с дальнейшим
его
снижением,
статистически
значимым
на
10-е
сутки
наблюдения.
У
ложнооперированных животных на Т2 ВИ через 24 час. после операции можно было
отметить узкую полосу гипоинтенсивного сигнала, отражающую ход иглы в ткани
головного мозга. На 10-е сутки после операции признаков изменения ткани
головного мозга не отмечено.
Образование
экспериментальной
гематомы
сопровождалось
развитием
значительного локального неврологического дефекта, который оценивали при
помощи специального обследования. Использование шкал Menzes и ЛПТ позволило
выявить стойкий неврологический дефект у животных опытной группы. При этом
статистически достоверные различия неврологического статуса опытной и
контрольной групп зафиксированы на всем периоде наблюдения: по шкале Menzes
через 24 час., 72 час. и на 10-е сутки – соответственно р=0,0001, p=0,0001, р=0,0001;
по шкале ЛПТ – соответственно p=0,002, р=0,002, р=0,005 (рис.2).
Неврологические нарушения у крыс опытной группы проявлялись в ослаблении
двигательной активности контралатеральных конечностей, асимметрии тонуса тела
и тенденции к круговому движению в сторону гематомы. В контрольной группе
ложнооперированных животных наличие неврологического дефекта в виде легкого
ослабления тонуса контралатеральной передней конечности обнаружено только
через 24 часа после операции у двух животных.
11
24 часа
72 часа
10-е сутки
Рисунок 1. Т2-взвешенные изображения головного мозга животных
опытной группы
*
Рисунок 2. Динамика показателей неврологического статуса по шкалам
Menzes и ЛПТ в опытной и контрольной группах
Представлены 25-й и 75-й процентили, максимальное и минимальное значения.
12
Второй этап исследования
Изучение
действия
нейропептидов
при
системном
введении
показало
отсутствие различий у животных в группах контроль, МИФ и Селанк в динамике
гематомы и перифокального отека, а также по показателям неврологического
статуса через 24 час., 72 час. и на 10-е сутки наблюдения (р>0,05; табл.1).
Таблица 1. Показатели обследования животных на первом этапе
Показатель
Время
после
операции
Оценка по
шкале
Menzes,
баллы
Оценка по
шкале
LPT,
баллы
Объем
гематомы,
мкл
Объем
отека, мкл
X±95%ДО
Контроль
МИФ
Селанк
H
P
24 час.
7,6±2,1
8±1,75
7,4±1,9
0,208
0,901
72 час.
5,8±1,7
4,25±1,3
4,4±1,18
1,768
0,413
10-сут.
5
4,25±1,3
4±1,2
2,113
0,348
24 час.
2,2±0,4
2,5±0,5
3±0,6
3,804
0,149
72 час.
2,4±0,5
1,5±0,9
2,4±0,78
2,759
0,252
10-сут.
24 час.
72 час.
10-сут.
24 час.
72 час.
10-сут.
2±0,7
83,36±44,5
66,84±42,7
30,55±19,4
90,0±52,9
118,32±60,5
38,9±29,0
1±0,7
56,7±17,5
41,95±167,5
26,4±73,4
67,0±14,4
91,2±29,3
37,95±7,2
1,8±0,7
111,7±49,8
86,2±45,1
50,4±29,9
105,9±29,9
183,56±25,5
52,8±26,8
2,824
3,25
0,447
1,942
2,191
4,386
1,991
0,244
0,197
0,788
0,372
0,334
0,112
0,370
Примечание: X±95%ДО – выборочное среднее±95% доверительный интервал; H – критерий
Крускалла-Уоллиса; р – вероятность справедливости нулевой гипотезы.
Максимальный объем гематомы зафиксирован у всех животных через 24 час.
после операции. Изучение динамики объема гематомы в исследуемых группах
позволило выявить статистически значимое (p<0,05) снижение объема гематомы на
10-е сутки после операции у всех животных (КФ=10,0; 8,0; 10,0; q=4,472; 4,0; 4,472
для групп контроль, МИФ и Селанк соответственно). У всех животных
прослеживалось нарастание перифокального отека через 72 часа после операции, но
показатель
не
был
статистически
достоверным
(p>0,05).
В
дальнейшем
выраженность перифокального отека у животных всех экспериментальных групп
уменьшалась. На 10-е сутки после формирования внутримозговой гематомы в
группах контроль, МИФ и Селанк зафиксировано статистически значимое снижение
13
показателя (КФ=8,4; 8,0; 10,0; q=4,025; 4,0; 4,472 для групп контроль, МИФ и
Селанк соответственно; р<0,05).
Однако при этом обнаружено, что динамика неврологического статуса у
животных в группах, получавших нейропептиды МИФ и Селанк, отличалась от
таковой в контрольной группе. Так, у животных, получавших МИФ, выявлено
статистически достоверное улучшение неврологического статуса по шкале ЛПТ на
10-е сутки после операции (КФ=6,615, р<0,05, q=3,250). У животных, получавших
Селанк, обнаружено достоверное уменьшение баллов по шкале Menzes на 10-е сутки
после формирования внутримозговой гематомы (КФ=8,4; p<0,05; q=3,354).
В
контрольной группе у животных показано отсутствие достоверных отличий
неврологического статуса по шкалам Menzes и ЛПТ через 24, 72 часа и на 10-е сутки
после операции (p>0,05) (табл.2).
Таблица
2.
Показатели
анализа
динамики
неврологического
восстановления в экспериментальных группах при системном введении
нейропептидов
Показатель
Оценка по шкале
Menzes
Оценка по шкале
ЛПТ
Группа
Контроль
МИФ
Селанк
Контроль
МИФ
Селанк
КФ
3,181
6,00
8,4
1,5
6,615
5,375
p
>0,05
>0,05
<0,05
>0,05
<0,05
>0,05
q1
3,354*
3,250*
-
q2
2,683
1,625
-
q3
0,671
0,625
-
Примечание: КФ – критерий Фридмана; q1 – критерий Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 24
час. и 10-х суток; q2 – критерий Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 24 час. и 72 час.; q3 – критерий
Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 72 час. и 10-х суток; р – вероятность справедливости нулевой
гипотезы; *р <0,05.
Следует подчеркнуть, что полученные данные не полностью согласуются с
результатами исследования J.Wang, S.E.Tsirka, которые показали, что введение
МИФ в ткань мозга через два часа после формирования внутримозговой гематомы
сопровождается уменьшением объема гематомы и перифокального отека, а также
положительной
Полученные
динамикой
различия
неврологического
результатов
могут
14
быть,
восстановления
по-видимому,
животных.
связаны
с
использованием
разных
экспериментальных
моделей
и
способов
введения
препарата.
С учетом труднодоступности в клинических условиях внутримозгового способа
введения, было решено продолжить исследование действия нейропептидов при
интраназальном введении. Существуют данные о наличии транспортного пути
лекарственных веществ непосредственно в головной мозг через нейроны
обонятельного
тракта
у
животных
в
условиях
экспериментального
ГИ
(А.Н.Макаренко с соавт., 2004 г). Это позволяет рассматривать интраназальный
способ введения нейропептидов в качестве своеобразного аналога внутримозговому
введению препаратов,
но легко осуществимого in vivo у человека. Введение
нейропептидов на слизистую оболочку носовой полости обеспечивает их быстрое
всасывание с обнаруживанием в периферической крови уже через 30 секунд.
Третий этап исследования
Результаты третьего этапа исследования позволяют говорить о существенном
положительном влиянии нейропептидов при интраназальном введении на процессы
неврологического восстановления у животных. Так, уже через 24 час. после
формирования гематомы и на всем периоде наблюдения животные, получавшие
пептиды, характеризовались менее выраженным неврологическим дефектом. При
этом различия между группами отмечаются при оценке по обеим шкалам.
Необходимо отметить, что в группе с применением МИФ различия проявлялись
преимущественно тенденциями и не достигали статистической достоверности
(p>0,05). В то же время, у животных из группы с применением Селанка
неврологический дефицит, оцененный по шкале Menzes, достоверно быстрее
регрессировал, чем у животных контрольной группы. Различия зафиксированы уже
через 24 часа и сохранялись до конца периода наблюдения (p=0,015; 0,006; 0,007 и
0,018 через 24 час., 72 час., на 10-е и 21-е сутки после операции соответственно).
Кроме того, изучение динамики неврологического статуса по шкалам Menzes и ЛПТ
в каждой из исследуемых групп показало достоверное улучшение показателя
15
(р<0,05) на 21-е сутки после формирования внутримозговой гематомы в
контрольной
группе,
что
отражало
в
целом
меньшую
выраженность
неврологического дефекта после формирования гематомы у животных в группах,
получавших нейропептиды МИФ и Селанк (табл.3).
Таблица 3. Показатели неврологического обследования животных при
интраназальном введении нейропептидов
Показатель
Оценка
по
шкале
Menzes
Оценка
по
шкале
LPT
Время
после
операции
24 час.
X±95%ДО
Контроль
МИФ
Селанк
H
p
Q'1
Q'2
Q'3
5,6±0,5
4±1,1
2±1,9
8,441
0,015
1,620
2,891*
1,105
72 час.
5,2±0,4
2,25±0,9
1±1,2
10,204
0,006
2,048
3,128*
0,901
10-е сут.
4,6±0,8
2,5±2
0
9,934
0,007
1,351
3,148*
1,617
21-е сут.
2,4±0,5
1,25±1,5
0
8,044
0,018
1,269
2,434*
1,404
24 час.
1,6±0,8
1,25±0,9
0,8±0,7
1,749
0,408
-
-
-
72 час.
0,8±0,4
0,5±0,6
0,8±0,7
0,678
0,713
-
-
-
10-е сут.
1±0,6
0,5±0,6
0,2±0,4
3,804
0,149
-
-
-
21-е сут.
0,4±0,8
0,25±0,5
0,2±0,4
0,035
0,983
-
-
-
Примечение: X±95%ДО – выборочное среднее±95% доверительный интервал; H – критерий
Крускалла-Уоллиса; р – вероятность справедливости нулевой гипотезы; Q1 – критерий Данна при
сравнении данных 24 час. и 10-х суток; Q2 – критерий Данна при сравнении данных 24 час. и 72 ч; Q3 –
критерий Данна при сравнении данных 72 час. и 10-х суток; р – вероятность справедливости нулевой
гипотезы; *р <0,05.
Анализ результатов поведенческих тестов позволил выявить общую тенденцию
изменения поведения животных в условиях экспериментального ГИ. Через 24 часа
после
формирования
ВМК
у
животных
происходило
явное
снижение
исследовательской активности, что проявлялось в уменьшении числа пересеченных
квадратов и количества переходов в центр открытого поля, снижении вертикальной
активности, уменьшения количества выглядываний животных из лабиринта.
Некоторое увеличение активности отмечено
через 72 часа после операции, с
последующей тенденцией к снижению показателей на 10-е сутки наблюдения.
Изучение динамики показателей в экспериментальных группах позволило
обнаружить у всех животных уменьшение количества пересеченных квадратов в
16
«Открытом поле» через 24 час. после формирования внутримозговой гематомы, по
сравнению с исследованием до операции. При этом, только в группах, получавших
пептиды, это снижение было статистически значимым (КФ=12,359; p=0,015 и
КФ=10,600; p=0,031 – для групп МИФ и Селанк соответственно). Анализируя этот
факт, необходимо учитывать, что при повторном проведении тестов имеет место
привыкание
и
исследовательской
адаптация
животных,
активности
крыс
и
в
это
отражается
«Открытом
поле».
уменьшением
Поскольку
неврологический дефект у животных в группах МИФ и Селанк был менее выражен,
чем в контрольной группе, эти результаты могут отражать интенсивность адаптации
и лучшее привыкание к новым условиям. То есть можно предположить, что на фоне
нейропептидов, несмотря на формирование гематомы, животные проявляли
некоторую способность к «запоминанию» окружающей обстановки. Этим же можно
объяснить наблюдавшееся значительное (p<0,05) уменьшение числа стоек у
животных в группе с применением Селанка на 21-е сутки наблюдения. Выявлено
отсутствие достоверного уменьшения количества вертикальных стоек животных
через 24 часа после моделирования гематомы в группе с применением Селанка
(p>0,05), в отличие от крыс других экспериментальных групп (p<0,05), что может
указывать на менее выраженное снижение исследовательской активности в
указанной группе. Показано также отсутствие достоверного снижения количества
выглядываний из закрытых концов лабиринта и стоек животных в группе с
применением Селанка через 24 часа после формирования внутримозговой гематомы
(p>0,05). Обнаружена тенденция к разнонаправленному изменению интенсивности
груминга при исследовании в «Открытом поле» на 10-е сутки экспериментального
кровоизлияния в контрольной группе и у животных, получавших пептиды. Эти
факты говорят о меньшей выраженности реакции тревоги у животных, получавших
пептиды, в большей степени Селанк.
В целом, результаты поведенческих тестов указывают на повышение
способности к адаптации и уменьшение реакции тревоги у животных, получавших
пептиды, что было более выражено в группе с применением Селанка.
17
Результаты МРТ исследования головного мозга животных выявили интересный
аспект действия изучаемых пептидов. Так, из восьми животных, у которых отмечена
ранняя прогрессия гематомы, только одно (13%) было из группы Селанк, 2 (25%) – в
группе МИФ, а 5 (62%) – в контрольной группе. Статистический анализ,
проведенный при помощи точного критерия Фишера, показал достоверное
уменьшение числа животных с ранней прогрессией гематомы в группе с
применением
Селанка,
по
сравнению
с
контрольной
группой
(p<0,05).
Статистический анализ объема гематомы обнаружил отсутствие достоверных
различий (р>0,05) между экспериментальными группами на первые сутки, через 72
час., на 10-е и 21-е сутки после создания экспериментального ВМК (Н= 0,491; 1,465;
0,799; 2,598 соответственно) (табл.4).
Таблица
4.
Показатели
данных
МРТ-исследования
животных
экспериментальных групп при интраназальном введении нейропетидов
Показатель
Объем
гематомы
Объем
отека
X±95%ДО, мм3
Время
операции
Контроль
Миф
Селанк
24 час.
72 час.
10-сут.
21-е сут.
24 час.
72 час.
10-е сут.
21-е сут.
68,5±47,5
82,9±52,4
33,8±10,1
20,35±7,5
166,4±50,4
146,5±40,1
126,7±40,1
101,0±46,0
47,3±32,7
62,7±49,2
36,6±28,2
37,6±22,98
168,3±43,4
127,1±46,1
114,2±46,4
120,4±8,6
45,4±16,1
41,6±18,8
26,5±9,1
17,3±5,5
234±107,8
201,9±99,4
149±55,5
138,6±52,7
H
p
0,280
1,731
1,3
3,482
1,071
1,747
1
0,884
0,869
0,421
0,522
0,175
0,585
0,418
0,607
0,643
Примечание: X±95%ДО – выборочное среднее±95% доверительный интервал; H – критерий
Крускалла-Уоллиса; р – вероятность справедливости нулевой гипотезы; Q1 – критерий Данна при
сравнении групп контроль и МИФ; Q2 – критерий Данна при сравнении групп контроль и Селанк; Q3 –
критерий Данна при сравнении групп МИФ и Селанк; *p<0,05.
На 21-е сутки наблюдения у всех животных выявлено достоверное уменьшение
объема гематомы, по сравнению с исследованием через 72 час. после формирования
экспериментальной гематомы (р<0,05).
В группе с применением Селанка
достоверное уменьшение объема гематомы на 21-е сутки наблюдения (р<0,05)
зафиксировано также, по сравнению с первым исследованием, что может отражать
более выраженное уменьшение объема гематомы за период наблюдения. Также
18
показано, что в группе с применением Селанка уменьшение гематомы происходило
на более ранние сроки, по сравнению с двумя другими группами (достоверное
снижение объема гематомы, по сравнению с первым исследованием, отмечено уже
на 10-е сутки наблюдения, p<0,05) (табл.5).
Таблица 5. Показатели анализа динамики гематомы и перифокального
отека в экспериментальных группах
Показатель
Объем
гематомы
Объем
отека
Группа
КФ
p
q1
q2
q3
q4
q5
q6
Контроль
11,1
<0,05
1,549
-
3,486*
2,711
4,260*
-
МИФ
7
<0,05
-
-
-
-
3,578
-
Селанк
11,1
<0,05
-
2,711
-
4,260* 3,486*
Контроль
12
<0,05
-
3,098
-
4,648
3,098
-
МИФ
9
<0,05
-
2,683
-
4,025
2,683
-
Селанк
12
<0,05
1,732
3,464
1,732
5,196
3,464
1,732
1,549
Примечание: КФ – критерий Фридмана; q1 – критерий Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 24
час. и 10-х суток; q2 – критерий Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 24 час. и 72 час.; q3 – критерий
Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 72 час. и 10-х суток; q4 – критерий Ньюмена-Кейсла при
сравнении данных 24 час. и 21-х суток; q5 – критерий Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 48 час. и 21х суток; q6 – критерий Ньюмена-Кейсла при сравнении данных 10-х и 21-х суток; р – вероятность
справедливости нулевой гипотезы; *р <0,05.
Статистический анализ объема отека головного мозга показал отсутствие
достоверных
различий между группами (p>0,05) во всех временных точках
(H=1,414; 2,388; 1,414 и 2,394 на первые сутки, через 72 час., на 10-е и 21-е сутки
после операции соответственно) (табл.4). При этом максимальный объем отека
зафиксирован при первом МРТ-исследовании головного мозга животных. Далее
отмечено снижение объема отека до минимальных значений. На 21-е сутки
наблюдения у всех животных зафиксировано достоверное (p<0,05) уменьшение
перифокального отека (табл.5). Обращает на себя внимание отсутствие нарастания
отека на третьи сутки наблюдения, что отличается от данных, полученных на
первом этапе эксперимента. Объяснить этот факт можно тем, что на втором этапе
работы первое МРТ головного мозга животным проводили через 2 – 4 часа после
формирования гематомы, а не через 24 часа, как на первом этапе. Возможно,
зафиксировано
изменение
ткани,
окружающей
19
гематому,
обусловленное
экстравазацией белков плазмы или изменения локальной гемодинамики в первые
несколько часов кровоизлияния, что согласуется с литературными данными.
Достоверное уменьшение отека окружающих гематому тканей (p<0,05) показано на
21-е сутки после операции у всех животных (табл.5). У животных в группе
с
применением Селанка дополнительно выявлено достоверное (p<0,05) снижение
выраженности перифокального отека также на 10-е сутки после операции, что
указывает на ускорение процессов регресса перифокального отека в указанной
группе.
Таким образом, можно отметить, что интраназальное введение нейропептидов
МИФ
и
Селанк
в
условиях
экспериментального
ГИ
у
крыс
улучшает
неврологическое восстановление животных, позитивно влияет на динамику
гематомы и перифокального отека, а также повышает способность животных к
адаптации и уменьшает их уровень тревоги. При этом положительные свойства
больше проявляются у регуляторного пептида Селанк.
Предположительно, объяснить более выраженный нейропротекторный эффект
Селанка можно, исходя из его структурных особенностей – наличия в структуре
гептапептида трипептида Pro-Gly-Pro. Экспериментальные работы Института
молекулярной генетики РАН на модели глобальной ишемии у крыс позволяют
говорить о
мощных
самостоятельных
нейропротекторных
свойствах
этого
трипептида, воздействии его на выработку нейротрофических цитокинов и
процессы
нейрогенеза.
Возможно,
именно
действие
Pro-Gly-Pro,
высвобождающегося при энзиматической деградации Селанка в ткани мозга, и
усиливает позитивное действие препарата.
Вышеизложенные заключения являются основанием для дальнейшего изучения
действия дериватов тафтсина, в частности Селанка, при геморрагическом инсульте.
Результаты исследования являются предпосылкой для рассмотрения нового
нейропротекторного препарата как кандидата для лечения больных со спонтанным
20
ВМК,
потенциально
способного
улучшить
восстановление
нарушенных
неврологических функций.
ВЫВОДЫ
1.
Применение модели двухэтапного введения аутологичной крови в
подкорковые ядра животного у крыс позволяет воспроизвести сопоставимые по
размеру и локализации внутримозговые кровоизлияния, ассоциированные с
развитием локального неврологического дефекта.
2.
Системное (внутрибрюшинное) введение регуляторных пептидов МИФ
и Селанк в условиях экспериментального внутримозгового кровоизлияния у крыс
ассоциировано с ускорением функционального восстановления крыс при отсутствии
воздействия на процессы формирования гематомы и выраженность перифокального
отека мозга.
3.
Интраназальное введение регуляторного пептида Селанк в условиях
экспериментального внутримозгового кровоизлияния у крыс связано с достоверным
(p<0,05) уменьшением случаев ранней прогрессии гематомы, по сравнению с
контрольной группой.
4.
Применение нейропептида Селанк интраназально ассоциировано с
ускоренным уменьшением объема экспериментальной внутримозговой гематомы и
перифокального
отека
в
условиях
экспериментального
внутримозгового
кровоизлияния у крыс.
5.
Применение
экспериментального
нейропептида
внутримозгового
Селанк
интраназально
кровоизлияния
у
крыс
в
условиях
приводит
к
достоверному (p<0,05) уменьшению неврологического дефицита у крыс, по
сравнению с контрольной группой, причем статистически значимые различия
выявляются уже через 24 часа после формирования внутримозговой гематомы и
сохраняются в течение трех недель наблюдения.
6.
условиях
Результаты тестирования изменения поведенческих реакций крыс в
экспериментального
геморрагического
инсульта
указывают,
что
интраназальное введение регуляторных пептидов МИФ и Селанк у крыс приводит к
21
повышению способности животных к адаптации и уменьшению реакции тревоги,
что более выражено при применении Селанка.
7.
отсутствие
Данные проведенного экспериментального исследования обнаруживают
каких-либо
нейропептидов
МИФ
нежелательных
и
Селанк
при
побочных
эффектов
экспериментальном
применения
внутримозговом
кровоизлиянии у крыс.
8.
Положительное воздействие нейропептидов МИФ и Селанк на динамику
функционального восстановления и параметры очага поражения вещества мозга при
экспериментальном геморрагическом инсульте выявляются преимущественно при
интраназальном введении препаратов.
Практические рекомендации
1.
С учетом наличия разрешения к клиническому использованию
препарата Селанк у больных с тревожными и другими невротическими
расстройствами, отсутствия у него побочных и нежелательных эффектов, хорошей
его переносимости, а также на основе полученных экспериментальных данных об
эффективности Селанка при экспериментальном ГИ, целесообразно спланировать
проведение клинических испытаний препарата у больных со спонтанным ВМК.
2.
При проведении клинических испытаний Селанка у больных с
геморрагическим инсультом необходимо включить комплекс неврологических и
психологических тестов, динамическое МРТ-наблюдение.
22
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1.
В.И.Скворцова,
Л.В.Стаховская,
Т.В.Творогова,
А.И.Дубина,
Л.В.Губский, Д.В. Буренчев, О.В. Поварова. Действие нейропептидов производных
тафцина (MIF, Селанк) при экспериментальном геморрагическом инсульте. //
Материалы
международной
конференции
II
Российский
конгресс
"Цереброваскулярная патология и инсульт", г.Санкт-Петербург, 17-20 сентября 2007
г.
2.
В.И.Скворцова,
Д.В.Буренчев,
Т.В.Творогова,
О.И.Гусева,
А.В.
Прохоров, А.М.Смирнов, Д.А.Куприянов, Ю.А.Пирогов. Оценка сопоставимости
МР-семиотики
острейших
внутримозговых
гематом
при
низко-
и
сверхвысокопольной МРТ. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.
№9, 2009г, стр. 45-50.
3.
В.И.Скворцова, Т.В.Творогова, А.И.Дубина, Д.В.Буренчев, Л.В.Губский,
Л.В.Стаховская, О.В.Поварова Экспериментальный геморрагический инсульт:
исследование нейропептидов (МИФ, Селанк) при внутрибрюшинном введении. //
Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова №12, 2009г, стр. 22-28.
4.
В.И.Скворцова, Д.В.Буренчев, Т.В.Творогова, О.И.Гусева, Л.В.Губский,
Д.А.Куприянов, Ю.А.Пирогов. Изучение особенностей мр-семиотики острых
внутримозговых гематом. Эксперимент. // Журнал неврологии и психиатрии им.
С.С. Корсакова. №12, 2009г, стр. 63-67.
5.
В.В.Ставчанский,
В.И.Скворцова,
Л.В.Дергунова,
С.А.Лимборская.
Исследование
А.Ю.Боцина,
Т.В.Творогова,
нейропротекторных
свойств
препаратов Семакс и PGP в условиях экспериментальной глобальной ишемии
головного мозга крыс. // Тезисы стендовых сообщений III Российского симпозиума
«Белки и пептиды», Пущино, 2007, стр. 93.
6.
В.В.Ставчанский,
Л.В.Дергунова,
А.Ю.Боцина,
Т.В.Творогова,
В.И.Скворцова, С.А.Лимборская. Семакс и PGP изменяют экспрессию мРНК генов
нейротрофинов и их рецепторов в гиппокампе крыс при глобальной ишемии мозга.
23
// IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая
2008 г., Новосибирск, № 183, стр. 117.
7.
L.Dergunova,
V.Stavchanskii,
A.Botsina,
I.Platonova,
T.Tvorogova,
E.Shaykhutdinova, V.Skvortsova , S.Limborska. Analysis of BDNF expression in rats
treated with Semax and PGP under the brain experimental ischemia. // The American
Journal of Human Genetics, 2004, v. 75, poster NO: 1267.
8.
V.V.Stavchansky,
L.V.Dergunova,
A.Y.Botsina,
I.A.Platonova,
T.V.Tvorogova, E.F.Shaykhutdinova, E.L.Voloshenyuk., V.I.Skvortsova, S.A .Limborska.
Semax increases BDNF expression in ischemized rat brain. // European Journal of Human
Genetics, 2005, v. 13, p. 364.
9.
I.A.Platonova,
L.V.Dergunova,
E.F.Shaykhutdinova,
V.V.Stavchansky,
T.V.Tvorogova, A.Y.Botsina, E.L.Voloshenyuk, V.I.Skvortsova, S.A. Limborska Semax
and PGP increases BDNF expression in ischemized “rats brain”. // Cerebrovascular
Diseases. 2005, v. 19 (supplement 2), p. 23.
10.
V.G.Dmitrieva,
L.V.Dergunova,
A.Y.Botsina,
I.A.Platonova,
T.V.Tvorogova, E.F.Shaykhutdinova, E.V.Torshina, V.I.Skvortsova, Limborska S.A.
Analysis of iNOS expression in rats under brain experimental ischemia. // European
Journal of Human Genetics . 2005, v. 13, p. 365.
11.
V.G.Dmitrieva,
E.V.Torshina,
L.V.Dergunova.,
T.V.Tvorogova,
V.I.Skvortsova, S.A.Limborska. Analysis of MOB (TMEM 23) expression in rats under
brain experimental ischemia. // European Journal of Human Genetics. 2006, V.14, suppl.,
P. 364.
12.
V.V.Stavchansky,
L.V.Dergunova,
V.V.Yuzhakov,
T.V.Tvorogova,
V.I.Skvortsova, S.A.Limborska . Semax exerts vasotropic and neuropritective effects in
experimental brain ischemia. // European Journal of Human Genetics, 2007, V.15, suppl.1,
P. 183.
13.
V.V.Stavchansky,
L.V.Dergunova,
A.B.Botsina,
T.V.Tvorogova,
V.I.Skvortsova, S.A.Limborska. Neurotrophins and their receptors: mRNA expression in
ischemic brain under the treatment with neuropeptides Semax and its C-terminal tripeptide
24
PGP. // Аnnual meeting of The American Society of Human Genetics, 2007, San Diego,
California. Abstractbook, P. 517, abstract 2769.
14.
V.V.Stavchansky,
L.V.Dergunova,.
A.Y.Botsina,
T.V.Tvorogova,
V.I.Skvortsova, S.A. Limborska. «Effect of Semax treatment on expression of the
neurotrophins and their receptors in ischemic rat hippocampus». // European Journal of
Human Genetics, 2008, poster NO: 105.
15.
V.V.Stavchansky,
L.V.Dergunova.
M.Maksimov,
A.Y.Botsina,
T.V.Tvorogova, V.I.Skvortsova, S.A.Limborska. «Effect of Semax
and PGP on
expression of Vegf the in ischemic rat brain». // European Journal of Human Genetics,
2009, V 17, suppl. 2, poster NO: 11.122, P 307.
16.
V.V.Stavchansky,
L.V.Dergunova,
A.Y.Botsina,
T.V.Tvorogova,
V.I.Skvortsova, S.A.Limborska. Neurotrophins and their receptors: mRNA expression in
ischemic brain under the treatment with neuropeptides Semax and its C-terminal tripeptide
PGP. // Аnnual meeting of The American Society of Human Genetics, 2007, San Diego,
California. Abstractbook, P. 517, abstract 2769.
25