ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

На правах рукописи
РЫДЛОВСКАЯ
АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА
ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА НОВОГО
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА АРТРОФЛЕКС И АНАЛИЗ
МЕХАНИЗМА ЕГО ДЕЙСТВИЯ
14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
2007
2
Диссертационная
работа
выполнена
в
Межрегиональном
Центре
“Адаптоген”
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Макаров Валерий Геннадиевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Лесиовская Елена Евгеньевна
доктор медицинских наук, профессор Дьячук Георгий Иванович
Ведущая организация: НИИ экспериментальной медицины РАМН
Защита состоится «__»________2007 г
в __ часов на заседании
Диссертационного Совета Д 208.030.01 при Институте токсикологии ФМБА
России (193019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева 1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке по адресу: СанктПетербург, ул. Бехтерева 1
Автореферат разослан «__» _______2007г.
Ученый секретарь
Диссертационного Совета,
доктор медицинских наук
Саватеева-Любимова Т.Н.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Социальная значимость воспалительных заболеваний растет во всем
мире.
Это
определяет
необходимость
разработки
новых
противовоспалительных препаратов. Сложность разработки эффективных и в
то же время безопасных средств для лечения воспаления заключается в том, что
это поливалентный, весьма динамичный процесс с множеством альтернативных
и перекрещивающихся путей, существующих как на уровне внутриклеточных
взаимодействий сигнальных каскадов, так и на уровне регуляции продукции
медиаторов воспаления (Черешнев, 2002; Руднов, 2006). В соответствие с этим,
влияние только на одну мишень патогенеза либо не сопровождается
достаточным фармакологическим эффектом, либо вызывает ряд побочных
явлений (Schmid-Schonbein, 2006).
На основании вышесказанного современная медицинская наука
постулирует необходимость создания новых препаратов, способных
регулировать функциональную активность не одной, а многих молекул,
участвующих в воспалении (Krakauer, 2004).
Проблемой, стоящей перед фармакологами, является отсутствие на
сегодняшний день полного представления о работе всех звеньев сигнальных
каскадов, а также функционального значения многих регуляторных молекул,
обеспечивающих воспаление. Это создает трудности при выборе
потенциальных мишеней для новых синтетических субстанций (Aderem, Smith,
2004).
В связи с этим хорошие перспективы имеют препараты, созданные на
основе растительного сырья (Пастушенков, Лесиовская, 1995; Darshan,
Doreswamy, 2004). Современной науке известно не менее 1200 видов растений,
обладающих выраженной фармакологической активностью (Болотина, 2007).
Их терапевтическая ценность доказана тысячелетней историей применения и
научно обоснована результатами доклинических (Krieglstein et al., 2001;
Camacho-Barquero et al., 2007; Kurup et al., 2007) и клинических исследований
(Саратиков, Краснов, 2004; Deodhar et al., 1980; Gupta et al., 2001). Анализ
механизмов действия некоторых субстанций растительного происхождения
показал,
что фармакологическая активность
природных соединений
обусловлена их способностью воздействовать комплексно и изменять
активность многих регуляторных белков (Aggarwal et al., 2006). В соответствие
с этим определение механизмов действия компонентов растительных
препаратов может оказаться полезным не только для их грамотного
применения в клинике, но и для раскрытия ключевых регуляторных молекул
воспаления.
Однако определение фармакологических мишеней действия препаратов
растительного происхождения, как правило, сопровождается трудностями,
связанными с их фармакокинетикой и особенно метаболической
трансформацией действующих веществ в организме. В результате, изучение
механизмов действия природных субстанций in vitro зачастую не дает
4
корректных результатов и делает актуальным совершенствование
методических подходов.
В
настоящей
работе
предприняты
попытки
определения
противовоспалительных свойств и анализа механизма действия нового
оригинального растительного препарата артрофлекс. Выбор лекарственного
средства в качестве объекта исследования обусловлен несколькими
предпосылками. Во-первых, артрофлекс является
комбинированным
препаратом, включающим три широко известных в мировой фитомедицине
компонента: экстракт смолы ладанного дерева (Boswellia serrata), экстракт
корней куркумы (Curcuma longa) и экстракт семян сосны кедровой сибирской
(Pinus sibirica) (Александрова и др., 2004) Это дает основание предполагать
наличие у артрофлекса множественности механизмов действия. Во-вторых,
предварительные исследования компонентов артрофлекса выявили их высокую
фармакологическую
активность,
в
частности,
выраженные
противовоспалительные свойства (Shikov et al., 2005). В-третьих, основные
действующие вещества артрофлекса обладают выраженной гидрофобностью и
тем самым затрудняют изучение механизмов действия препарата по
общепринятым методикам in vitro.
Все эти предпосылки с одной стороны позволяют ожидать выраженную
фармакологическую активность нового препарата, с другой, говорят
о
необходимости подбора методов для изучения механизмов его действия.
Цель исследования
Оценка противовоспалительных свойств нового растительного препарата
артрофлекс и определение основных механизмов его действия.
Задачи исследования:
1. Оценить противовоспалительные свойства препарата артрофлекс на моделях
острого (каррагениновый отек), подострого (формалиновый отек) и
хронического (адьювантный артрит) воспаления у крыс.
2. Провести сравнительный анализ эффективности артрофлекса с
синтетическими препаратами стероидной (преднизолон) и нестероидной
(диклофенак, бутадион) природы.
3. Изучить механизмы противовоспалительного действия препарата
артрофлекс.
a. Разработать метод корректной пробоподготовки препарата с целью
тестирования его активности в культуре клеток.
b. Определить
влияние
на
ЛПС-индуцированную
продукцию
провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей-α (TNFα),
интерлейкина-1β (IL-1β) и интерлейкина-6 (IL-6) in vitro.
c. Подтвердить влияние на ЛПС-индуцированную продукцию TNFα и
простагландина Е2 (ex vivo) в крови крыс при однократном пероральном
введении препарата (300 мг/кг) животным c оценкой динамики
проявления противовоспалительного действия.
d. Определить влияние на TNFα-индуцированную активацию ядерного
5
фактора kB и ЛПС-индуцированную активацию митоген-активированных
(МАР) протеинкиназ (p38, JNK1/2, ERK1/2) in vitro.
e. Адаптировать метод оценки активации МАР-киназ p38, JNK1/2, ERK1/2 в
органах животных для определения механизма действия растительного
препарата in vivo. Изучить влияние артрофлекса (300 мг/кг; in vivo) на
изменение уровня ЛПС-индуцированной активации МАР-киназ p38,
JNK1/2, ERK1/2 в легком, селезенке и костном мозге, а также продукцию
TNFα в крови крыс.
4. Определить возможность проявления побочного (ульцерогенного и
иммуносупрессорного) действия артрофлекса.
5. Подготовить материалы по изучению противовоспалительных свойств
препарата артрофлекс для представления в фармакологический комитет с
целью получения разрешения на проведение клинических испытаний.
Научная новизна исследования
С использованием современных методов фармакологии и молекулярной
биологии впервые проведено комплексное изучение противовоспалительных
свойств нового отечественного растительного препарата артрофлекс в
сравнении с известными синтетическими средствами стероидной и
нестероидной
природы.
Установлено,
что
артрофлекс
оказывает
антиэксудативное, анальгетическое и жаропонижающее действие при остром и
подостром воспалениях, а также предотвращает деструкцию хрящевой и
костной тканей сустава при хроническом воспалении.
Впервые установлено, что противовоспалительное действие проявляется
через 0.5 и 4-8 часов после перорального введения препарата крысам.
Впервые проведена оценка побочных действий. Показано наличие
слабовыраженного
ульцерогенного
эффекта
и
отсутствие
иммуносупрессорного действия, что позволяет говорить о преимуществе
исследуемого препарата перед синтетическими противовоспалительными
средствами.
Впервые проведен анализ механизмов противовоспалительного действия
артрофлекса. Учитывая высокую гидрофобность действующих веществ,
разработан метод по подготовке препарата для тестирования его активности в
культуре клеток. Метод оценки активации МАР-киназ p38, JNK1/2, ERK1/2 в
органах
животных
адаптирован
для
определения
механизма
противовоспалительного действия растительного препарата.
В результате исследований in vitro и in vivo получены данные о том, что
противовоспалительное действие артрофлекса связано с подавлением
индуцированной продукции TNFα, IL-6, IL-1β и PGE2, ингибированием
транскрипционной активности ядерного фактора kB и снижением активации
МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2.
6
Научно-практическая значимость
Проведены
доклинические
испытания,
выявившие
противовоспалительные свойства и раскрывающие механизм действия нового
отечественного препарата растительного происхождения артрофлекс.
Результаты настоящего исследования послужили основанием для
подготовки и предоставления материалов по новому отечественному препарату
артрофлекс для регистрации в ФГУ “НЦЭСМП” Росздравнадзора МЗ и СР РФ.
Модифицированный и апробированный нами метод определения влияния
препаратов природного происхождения на ЛПС-индуцированную активацию
МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 в органах крыс при их пероральном введении
используется при изучении механизмов действия целого ряда других
фармакологических субстанций.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Артрофлекс оказывает выраженное противовоспалительное действие в
дозе 250-300 мг/кг у крыс. По эффективности противовоспалительное
действие артрофлекса сопоставимо с таковым синтетических стероидных
(преднизолон, 10 мг/кг) и нестероидных (бутадион (56 мг/кг), диклофенак
натрия (8 мг/кг)) противовоспалительных препаратов. При этом он
оказывает менее выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет
иммуносупрессорного действия.
2. В исследованиях in vitro, ex vivo и in vivo показано, что механизм
противовоспалительного действия артрофлекса связан с ингибированием
ЛПС-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов TNFα,
IL-6 и IL-1β и метаболита арахидоновой кислоты PGE2.
3. Противовоспалительное действие артрофлекса реализуется через
регуляцию активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2, а также
ядерного фактора kB.
Апробация работы
Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на
международной конференции «Биологические мишени для действия
лекарственных препаратов нового поколения. Перспективы интеграции
российских ученых в международную кооперацию» (Химки, 2006); X
Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных
препаратов
природного
происхождения»
(Санкт-Петербург,
2006);
Всероссийской конференции молодых ученых, посвященных памяти
профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к
клинике» (Пермь, 2006); 54th annual congress on medical plant research (Helsinki,
Finland, 2006); Oxygen club of California «Oxidants and antioxidants in biology»
(Santa Barbara, California, 2006); «Политехническом симпозиуме: Молодые
ученые – промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург,
2006); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная
сигнализация» (Пущино, 2007); Nordic Natural Products Conference (Sankt
7
Helene, Denmark, 2007); VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии,
иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследования, пяти глав, содержащих
результаты экспериментальных исследований и их обсуждение, заключение,
выводов, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 157
страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами, схемами и
рисунками. Список литературы включает 225 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные
исследования
по
определению
противовоспалительных свойств артрофлекса in vivo.
Оценка противовоспалительного действия препарата артрофлекс
производилась на моделях острого (каррагениновый отек), подострого
(формалиновый отек) и хронического (адьювантный артрит) воспалений.
Исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар (массой 180-200 г)
по 10 штук в группе.
На моделях каррагенинового и формалинового отеков введение
артрофлекса per os (125, 250 и 500 мг/кг) проводилось по профилактической и
лечебно-профилактической схемам, соответственно. Препараты сравнения
бутадион (56 мг/кг) и диклофенак натрия (8 мг/кг) вводили аналогично. Оценка
действия артрофлекса производилась в динамике каждые 3-5 дней и включала
противоотечную,
анальгезирующую
и
гипотермическую
активности
(Руководство…,
2005).
Унифицированными
биохимическими
и
гематологическими методами оценивались СОЭ и содержание лейкоцитов, а
также уровни лейкотриена B4 и простагландина Е2 (на модели формалинового
отека) в крови опытных животных (Лаборат…, 1987; Справ…, 1970).
На модели адьювантного артрита введение артрофлекса per os (100, 300 и
900 мг/кг) проводилось по лечебной схеме. Препаратом сравнения служил
преднизолон (10 мг/кг). Определяли влияние препарата на патологические
изменения костной и хрящевой тканей сустава пораженной конечности
животных, а также наличие побочного действия в отношении слизистой
оболочки желудочно-кишечного тракта и морфо-функционального состояния
центрального (тимус) и периферического (селезенка) органов лимфоидной
системы (Cai et al., 2005).
8
Для
проведения
исследования
фармакологической
активности
артрофлекса in vitro был разработан метод по подготовке препарата с целью
увеличения его биодоступности в культуре клеток. Определение влияния
артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию IL-1β, IL-6 и TNFα
проводили на человеческой моноцитарно/макрофагальной клеточной линии
THP1 (ACCT).
Клетки инкубировали с артрофлексом в изучаемых
концентрациях и через 4 часа стимулировали ЛПС (10 нг/мл) в течение 24
часов. Все инкубации проводились при 37°С с 5% СО2. Концентрация
цитокинов определялась методом твердофазного иммуноферментного анализа
(ИФА). Анализ проводился в соответствии с инструкцией производителя тестсистем (ООО “Цитокин”, Россия).
Подтверждение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную
продукцию TNFα, а также PGE2 при его пероральном введении животным
проводилось на крысах линии Вистар. Животных выдерживали без пищи сутки
и однократно перорально вводили артрофлекс или кукурузное масло (плацебо)
в дозе 300 мг/кг. Через 0.5, 1, 2, 4 и 8 часов животных подвергали эвтаназии и
отбирали кровь. Кровь разводили культуральной средой RPMI-1640 (SigmaAldrich) в соотношении 1:5 и инкубировали с ЛПС в течение 24 часов.
Концентрацию TNFα и PGE2 в культуральных супернатантах определяли
методом ИФА с использованием тест-систем (BD Biosciences, USA; Сayman
Chemical, USA).
Определение влияния артрофлекса на транскрипционную активность NFkB проводилось на клеточной линии HEK293 (привезенной из Каролинского
Института, Стокгольм, Швеция) методом репортерного гена люциферазы.
Репортерный ген люциферазы, находящийся под контролем промотора NF-kB
(pNF-kB-LUC; Stratagene, USA) с использованием реагента TransFast (Promega,
США) трансфецировали в клетки HEK293. Для определения количества
трансфецированных клеток параллельно проводили трансфекцию плазмиды
pSV-β-galactosidase control vector (Promega, USA). Индуктором активации NFkB служил TNFα (100 нг/мл). По уровню экспрессии гена люциферазы судили о
функциональной активности NF-kB.
Уровень экспрессии гена люциферазы измеряли на люминометре
(DLReady™) при добавлении в клеточный лизат раствора субстрата Steady-Glo
Luciferase Assay System (Promega). Уровень экспрессии гена β-галактозидазы
определяли по ферментативной активности β-галактозидазы при добавлении к
лизату субстрата о-нитрофенил-β-D-галактозида (Sigma). Интенсивность
реакции определяли на спектрофотометре и активность β-галактоидазы
вычисляли по формуле OD420 – 1.75xOD550. Полученный результат (в
оптических единицах) принимался за условную активность β-галактоидазы.
Окончательным количественным результатом определения уровня активности
NF-kB являлось отношение уровня активности люциферазы к условной
активности β-галактоидазы.
Определение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную активацию
МАР-киназ проводилось in vitro и in vivo.
9
Активация МАР-киназ оценивалась методом иммуноблота по количеству
фосфорилированных форм белков. Для этого использовали поликлональные
кроличьи антитела против фосфорилированных по триптофану и тирозину
(Thr202/Tyr204) ERK1/2, (Thr183/Tyr185) SAPK/JNK, (Thr180/Tyr182) p38 (Cell
Signaling Technology, США). В качестве вторичных антител применяли козьи
антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные
с пероксидазой хрена (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США).
Исследования in vitro проводились на перевиваемой клеточной линии
моноцитов человека U937, полученной из Российской коллекции клеточных
культур Института Цитологии РАН. Клетки инкубировали с препаратом в
течение 16 часов и обрабатывали ЛПС (1 мкг/мл; 1 час).
Исследование in vivo проводилось на крысах линии Вистар и учитывало
активацию МАР-киназ в легком, селезенке и костном мозге бедренной кости, а
также продукцию TNFα в крови животных. Артрофлекс (300 мг/кг) вводили
крысам перорально за 49, 25 и 1 час до инъекции ЛПС. ЛПС (4 мг/кг) вводили в
хвостовую вену голодавшим в течение 12 часов животным. Через 1 и 4 часа
после введения ЛПС осуществлялась эвтаназия животных в СО2-камере, забор
крови и отбор биоптатов исследуемых органов.
Статистический анализ результатов проводили с помощью пакетов
программ Excel`97 и SPSS 12. Для статистической обработки и определения
различий между независимыми группами нормально распределенных данных
использовали t критерий Стьюдента. Во всех экспериментах различие между
контролем и опытом считалось статистически достоверным только при р<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Оценка противовоспалительного действия препарата артрофлекс
проводилось на моделях каррагенинового и формалинового отеков лапы крыс,
характеризующих острое и подострое воспаления, соответственно.
Проведенное исследование позволило установить, что прием артрофлекса
оказывает выраженное превентивное и лечебное действие в отношении острого
и подострого воспалений у крыс. На модели каррагенинового отека в дозах 125
и 500 мг/кг артрофлекс оказывал антиэксудативное, анальгетическое и
антипирогенное действия по силе сопоставимые с таковыми диклофенака Na (8
мг/кг) и бутадиона (56 мг/кг), а в дозе 250 мг/кг превосходил их. В частности
через 3 часа после введения каррагенина артрофлекс (250 мг/кг) снижал объем
и температуру воспаленной конечности животных на 56% и 72%, а порог
болевой чувствительности увеличивал на 259%, соответственно. На сроке 12 ч
индукции воспаления действие артрофлекса усилилось, на сроке 24 ч
оцениваемые показатели под влиянием препарата достигли значений нормы
(рис. 1).
Объем воспаленной конечности
(см3 x10)
10
40
35
Рис.
30
1.
Показатели
25
активности
20
15
воспалительного
процесса в динамике течения
10
каррагенинового отека у крыс
5
0
1
2
3
4
5
6
7
на
фоне
применения
O
конечности (C )
Температура воспаленной
препаратов.
Здесь и далее:
44
43
42
41
40
39
38
37
36
35
34
33
32
Белые столбцы – 3 ч после
введения каррагенина;
Серые столбцы – 12 ч после
введения каррагенина;
Черные столбцы – 24 ч после
введения каррагенина.
1
2
3
4
5
6
7
Цифрами
1-7
обозначены
Время развития болевого сигнала
(сек )
экспериментальные группы:
1 – интактные;
70
60
2 – плацебо;
50
40
3 – бутадион, 56 мг/кг;
30
4 – диклофенак, 8 мг/кг;
20
5 – артрофлекс, 125 мг/кг;
10
6 – артрофлекс, 250 мг/кг;
0
1
2
3
4
5
6
7
7 – артрофлекс, 500 мг/кг.
Анализ переферической крови животных подтвердил выраженное
противовоспалительное действие артрофлекса в дозе 250 мг/кг. Уже через 3
часа после введения каррагенина крысам, артрофлекс снижал повышенные
СОЭ и содержание лейкоцитов в крови на 69% и 68%, соответсвенно (рис. 2).
11
40
Рис.
2.
Показатели
крови,
характеризующие
воспалительный процесс в
динамике
течения
каррагенинового отека у крыс
на
фоне
применения
препаратов.
35
СОЭ (мм/час)
30
25
20
15
10
5
Содержание лейкоцитов в крови
(млн/см3)
0
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Примечания:
Белые, серые, черные столбцы –
3, 12, 24 ч после введения
каррагенина.
Цифрами
1-7
обозначены
экспериментальные группы:
1 – интактные;
2 – плацебо;
3 – бутадион, 56 мг/кг;
4 – диклофенак, 8 мг/кг;
5 – артрофлекс, 125 мг/кг;
6 – артрофлекс, 250 мг/кг;
7 – артрофлекс, 500 мг/кг.
Результаты исследования на модели формалинового отека подтвердили
выраженное противовоспалительное действие артрофлекса и его наибольшую
эффективность в дозе 250 мг/кг. На 4-ые сутки развития воспаления артрофлекс
(250 мг/кг) снижал объем и температуру воспаленной конечности на 67 и 70%,
соответственно, а порог болевой чувствительности увеличивал на 104%. На 8ые сутки развития воспаления артрофлекс изменял указанные параметры на 89,
83 и 38%, соответственно. При этом по эффективности артрофлекс (250 мг/кг)
значительно превосходил действие бутадиона (56 мг/кг) и соответствовал
таковому диклофенака (8 мг/кг).
Измерение уровней простагландина Е2 (PG-E2) и лейкотриена В4 (LTB4) в
крови экспериментальных животных на 4 и 8 сутки после введения формалина
показало, что в отличие от классического неспецифического ингибитора
циклооксиганазы-1/2 диклофенака Na, действие которого в основном было
направлено на продукцию PGE2 (снижал на 63.3-68.4%) и лишь незначительно
отражалось на продукции LTB4 (снижал на 11.5-35.4%), артрофлекс (250 мг/кг)
эффективно подавлял продукцию обоих метаболитов арахидоновой кислоты
(на 76.3-76.4% и 42.3-54.2%, соответственно) (табл. 1).
Полученные результаты, а также подтверждающие их литературные
данные о механизмах действия куркумина (Hong et al., 2004) и ацетил-11-кетоβ-босвелиевой кислоты (Sailer, 1998),
позволили предположить, что
артрофлекс влияет на оба (на циклоксигеназный и липоксигеназный) пути
12
метаболизма арахидоновой кислоты, что дает преимущество природному
препарату перед синтетическими НПВП.
Таблица 1
Уровни медиаторов воспаления в крови экспериментальных животных в
динамике течения адъювантного артрита на фоне применения препаратов на 4 и
8 сутки, пг/мл (Mm)
Экспериментальная
группа
Интактная
Плацебо
Бутадион, 56 мг/кг
Диклофенак, 8 мг/кг
Артрофлекс, 500 мг/кг
Артрофлекс, 250 мг/кг
Артрофлекс, 125 мг/кг
PG-E2
4 день
LTB4
8 день
500±40
520±60
3800±150 2750±200
2500±240* 1100±180*
1200±300* 1010±260*
1100±120* 900±100*
900±70*
650±50*
900±60*
700±70*
4 день
8 день
900±70
5200±400
3600±250*
4600±450*
3200±200*
3000±150*
3200±200*
910±60
4800±300
2900±160*
3100±170*
3000±180*
2200±200*
2500±250*
* - достоверные отличия от группы плацебо (р < 0.05)
Следующей моделью, поставленной для оценки эффективности нового
препарата
при развитии хронического иммунного воспаления, служил
“адьювантный артрит” у крыс. Артрофлекс вводили в дозах 100, 300 и 900 мг/кг
по лечебной схеме.
Учитывая, что наиболее информативными показателями развития
адьювантного артрита являются патологические изменения хрящевой и костной
ткани пораженной конечности животных, характеристике этих тканей мы
уделили особое внимание. Результаты рентгенологического исследования
показали, что введение артрофлекса крысам выражено снижает развитие
патологических изменений костной ткани (утолщение и разволокнение
кортикальных слоев плюсневых костей (рис. 3)). В частности, среди животных,
получавших артрофлекс, большая часть не имела патологических изменений и
только у 20-40% были отмечены слабовыраженные изменений. Тогда как среди
крыс, получавших плацебо и преднизолон, большая часть имела утолщение и
разволокнение кортикальных слоев плюсневых костей, причем не только
слабо-, но и сильновыраженные (табл. 2). Морфометрическое исследование
хрящевой ткани сустава пораженной конечности позволило установить, что
артрофлекс предотвращает резорбцию гиалинового хряща, причем делает это
эффективнее препарата сравнения преднизолона.
13
А
Б
В
Рис. 3. Рентгеновский снимок
конечностей крысы (адьювантный
артрит, 24-е сутки).
А) патологические изменения
отсутствуют; Б) патологические
изменения слабо выражены;
В) патологические изменения сильно
выражены.
Стрелка указывает на утолщение и
разволокнение кортикальных слоев
плюсневых костей.
Т а б л ица 2
Состояние костной и хрящевой тканей пораженной конечности крыс на фоне
адьювантного артрита и применения исследуемых препаратов
Изменения костной ткани (n=10)
Толщина
суставного
хряща (n=6)
Значение
Отсутствуют
(М±m, мкм)
91.3±7.4
10
37.4±6.1*
3
Интактная
Сильно
выражены
0
Слабо
выражены
0
Плацебо
3
4
Преднизолон, 10 мг/кг
1
6
3
49.8±6.2*
Артрофлекс, 100 мг/кг
0
3
7
57.2±3.6***
Артрофлекс, 300 мг/кг
0
2
8
61.2±8.5***
Артрофлекс, 900 мг/кг
0
4
6
57.3±3.8***
Группа
- различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (р<0.05)
** - различия статистически значимы по сравнению с группой плацебо (р<0.05)
*
Учитывая возможность проявления побочных эффектов артрофлекса, на
модели адъювантного артрита мы оценили наличие иммуносупрессорного и
ульцерогенного действия препарата.
Исследование показало, что в отличие от преднизолона природный
препарат не оказывает иммуносупрессорного действия. В частности, не
снижает вес тимуса и толщину его коркового слоя. Более того, в дозе 300 мг/кг
артрофлекс предотвращал стресс-индуцированную инволюцию коркового
вещества тимуса, что подтвердило выраженные противовоспалительные
свойства изучаемого препарата (табл. 3).
14
Таблица 3
Состояние первичных и вторичных лимфоидных органов у крыс на фоне
адьювантного артрита и применения исследуемых препаратов
Состояние первичных и вторичных лимфоидных органов
Группа
Интактная
Относительный
вес селезенки
(мг/100 г. крысы)
(n=10)
402.5±21.8
Относительный вес
тимуса (мг/100 г.
крысы)
(n=10)
152.0±11.4
Толщина
коркового слоя
тимуса (мкм)
(n=6)
386.0±7.0
437.9±29.8
130.9±9.9
203.4±11.9*
398.6±18.8
69.8±5.7***
74.7±7.4***
467.8±27.3
116.4±6.8*
279.4±16.7***
471.3±30.0
126.9±11.3
319.6±7.3***
471.8±27.7
122.9±9.6
359.7±10.6**
Плацебо
Преднизолон,
10 мг/кг
Артрофлекс,
100 мг/кг
Артрофлекс,
300 мг/кг
Артрофлекс,
900 мг/кг
— различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (р<0.05)
**— различия статистически значимы по сравнению с группой плацебо (р<0.05)
*
Вскрытие желудков крыс и визуальный осмотр их слизистой оболочки
показал, что и артрофлекс и преднизолон оказывают ульцерогенное действие.
Однако если в случае приема артрофлекса повреждения слизистой носили
слабовыраженный характер в виде кровоизлияний и проявлялись только у 40%
животных, то при введении крысам преднизолона нарушения морфологии
слизистой оболочки желудка наблюдались у всех вошедших в исследование
крыс и включали не только кровоизлияния, но и наличие множественных язв
(рис. 4)
20%
10%
40%
100%
Интактные
100%
Плацебо
60%
Артрофлекс,
300 мг/кг
70%
Преднизолон,
10 мг/кг
Рис. 4. Состояние слизистой оболочки крыс на фоне адьювантного артрита и
применения препаратов.
Примечание: белый сектор – отсутствие патологических изменений; светло-серый
сектор – гиперемия; темно-серый сектор – кровоизлияния; черный сектор – язвы.
15
Изучение
механизмов
противовоспалительного
действия
фитопрепарата артрофлекс начали с определения влияния препарата на ЛПСиндуцированную продукцию ключевых провоспалительных цитокинов IL-1β,
IL-6 и TNFα. Исследование проводилось на перевиваемой культуре моноцитов
человека линии THP-1 и выявило ингибирующее влияние артрофлекса в
отношении продукции всех оцениваемых белков. Наиболее выраженно
препарат снижал продукцию IL-6 (максимально на 76%), менее выраженно продукцию TNFα (максимально на 32%), самое слабое действие оказывал в
отношении продукции IL-1β (максимум ингибирования составил 8.6%) (рис. 5).
IL-1b
120
IL-6
TNFa
Продукция цитокинов
(% от контроля)
100
*
*
80
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
60
40
*
*
20
0
0
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
0.13
1.25
12.5
125
Артрофлекс (мкг/мл)
Рис. 5. Влияние артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию
провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и TNFα в культуре моноцитов
человека линии THP-1.
Примечание: * - р<0.05 при сравнении с контролем.
Однако результаты, полученные in vitro, не всегда отражают реальную
активность препарата in vivo, особенно, когда речь идет о комплексном
препарате, который назначается перорально.
Чтобы убедиться в корректности полученных данных мы предложили
модель, позволяющую оценить механизм действия препарата ex vivo. Модель
построена на том, что после перорального введения препарата, его
биологически активные компоненты (как в нативном виде, так и их
метаболиты) поступают в кровь и оказывают свое действие. В соответствии с
этим последовательный (повременный) забор крови у животного и индукция в
ней реакции воспаления позволяет установить силу и время биологического
действия препарата. Оценку воспаления мы проводили по определению в крови
уровня продукции фактора некроза опухолей α и простагландина Е2.
16
Результаты определения влияния перорального введения артрофлекса
крысам на ЛПС-индуцированную продукцию TNFα и PGE2 в крови животных
подтвердили, что противовоспалительное действие препарата связано с
подавлением ЛПС-индуцированной продукции провоспалительного цитокина
TNFα и показали, что препарат также ингибирует ЛПС-индуцированную
продукцию метаболита арахидоновой кислоты PGE2 (рис. 6).
Измерение продукции факторов воспаления клетками крови в динамике
после введения артрофлекса крысам позволило установить, что препарат
оказывает выраженное противовоспалительное действие через 30 минут
(продукция TNFα снизилась на 61%), а также через 4 (продукция TNFα и PGE2
снизилась на 65 и 82%, соответсвенно) и 8 часов (продукция TNFα снизилась
на 49%) после введения в организм. Временные сроки проявления
артрофлексом противовоспалительного действия совпадали с достижением
максимальной концентрации в плазме крови метаболита 1 куркумина и ацетил11-кето-β-босвелиевой кислоты (через 30 мин и 4 часа после введения
препарата крысам, соответственно) (Карлина и соавт., 2007), что дало
основание предполагать связь эффекта с определенными соединениями (рис. 6).
140
3
Уровень TNFa и PGE2
(% от контроля)
2,5
100
2
80
60
Концентрация компонентов
артрофлекса (мкг/мл)
TNFa
120
*
*
1,5
* *
1
40
0,5
20
0
PGE2
Метаболит
куркумина 1
ацетил-11кето-β-босв.
кислота
0
0.5ч
1ч
2ч
4ч
8ч
Время забора крови
Рис. 6. Влияние артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию TNFα
и PGE2 в крови крыс при введении препарата per os. Сравнительный анализ
сроков проявления противовоспалительного действия артрофлекса с
концентрацией метаболитов и компонентов артрофлекса в крови крыс.
Примечание: * - р<0.05 при сравнении с контролем.
Наличие сходного влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную
продукцию IL-6, TNFα и IL-1β in vitro позволило предположить единый
механизм действия препарата на продукцию цитокинов. На основании того,
что главным регулятором при запуске синтеза IL-6, TNF-α и IL-1β является
17
Активность NF-kB
(% от контроля)
ядерный транскрипционный фактор kB (NF-kB), было проведено определение
влияния артрофлекса на TNFα-индуцированную активацию данного фактора.
Результаты исследования показали, что артрофлекс способен подавлять
TNFα-индуцированную активность NF-kB in vitro (на 20-23% в дозах 0.01-0.1
мкг/мл и на 65% в дозе 125 мкг/мл) (рис. 7). Однако экстремальный характер
зависимости “доза препарата – эффект” дали основание предполагать, что
артрофлекс действует не на сам ядерный фактор kB, а на другие регуляторные
молекулы, напрямую или косвенно влияющие на его активацию.
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
0
0,01
0,1
1,3
12,5
Артрофлекс (мкг/мл)
125
Рис. 7. Влияние препарата артрофлекс на TNFα-индуцированную
активность NF-kB.
Примечание: * - p<0.05 при сравнении контролем.
В качестве возможных мишеней действия артрофлекса были предложены
митоген-активированные (МАР) протеинкиназы p38, JNK1/2 и ERK1/2. По
данным многочисленных исследований МАР-киназы JNK1/2, p38 и ERK1/2
играют одну из ключевых ролей в развитии воспаления. Во-первых, они
фосфорилируют и, таким образом, активируют многие факторы транскрипции,
в числе которых NF-kB (Kyriakis et al., 2001; Saklatvala et al., 2004), во-вторых,
МАР-киназы обеспечивают посттранскрипционную регуляцию синтеза
некоторых провоспалительных цитокинов: повышают стабильность мРНК
(Ming et al., 1998; Winzen et al., 1999) и регулируют ее транспорт из ядра в
цитоплазму (Dumitru et al., 2000).
Определение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную активацию
МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 в перевиваемой клеточной культуре
моноцитов человека U937 не дало значимых результатов, за исключением
установленного действия препарата в отношении активации JNK1/2. В
результате этого нами была предложена модель, позволяющая определить
влияние препарата на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ p38,
JNK1/2 и ERK1/2 в тканях животных. Предложенный метод включал
внутривенное введение крысам ЛПС, забор крови и отбор биоптатов легкого,
селезенки и костного мозга бедренной кости. В крови определяли уровень
18
Активация МАР-киназ (% от интактных)
провоспалительного цитокина TNFα, в органах – активацию МАР-киназ
JNK1/2, p38 и ERK1/2.
Реализованная модель являлась инновационной. Анализ отечественной
научной литературы не выявил наличие подобных исследований в России, а
обзор мировой литературы показал, что число опубликованных работ,
использовавших данный подход, не превышает 20.
Проведенное исследование показало, что пероральное введение
препарата крысам ингибирует ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ
р38, JNK1/2 и ERK1/2 в селезенке, а также р38 и ERK1/2 в легком и костном
мозге на сроках 1 и/или 4 часа индукции воспаления (рис. 8-9). Таким образом,
на основании полученных данных можно сделать вывод, что одним из
механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является
ингибирование активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2.
Отсутствие влияния артрофлекса на активацию JNK1/2 в легком и
костном мозге может быть связано с проявлением действия препарата в другие,
отличные от 1 и 4 часов, сроки индукции воспаления и особенностями его
фармакокинетики. К тому же артрофлекс подавлял активацию JNK1/2 in vitro.
Важно отметить, что во всех исследуемых органах артрофлекс снижал
количество фосфорилированных форм МАР-киназы р38 до уровня интактных
животных или более. Учитывая, что р38 является стрессорной МАР-киназой, в
норме неактивной, полученные результаты можно объяснить проявлением
действия артрофлекса не только в процессе развития воспаления у животных,
но и при заборе биоптатов тканей. То есть, предполагается, что препарат
способен подавлять передачу сигнала, как от факторов воспаления, так и от
стрессов окружающей среды.
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Селезенка
Плацебо
*
Артрофлекс
*
*
*
*
1ч ЛПС 4ч ЛПС 1ч ЛПС 4ч ЛПС 1ч ЛПС 4ч ЛПС
JNK1/2
p38
ERK1/2
Рис. 8. Влияние препарата артрофлекс (300 мг/кг, per os) на активацию МАРкиназ JNK1/2, p38 и ERK1/2 в селезенке крыс через 1 и 4 часа после
внутривенного введения им ЛПС. * - p<0.05 при сравнении с контролем (плацебо)
19
Легкое
Активация МАР-киназ (% от интактных)
500
400
Плацебо
Артрофлекс
300
*
200
*
*
100
1ч ЛПС
4ч ЛПС
1ч ЛПС
JNK1/2
0
4ч ЛПС
p38
1ч ЛПС
4ч ЛПС
ERK1/2
Костный мозг
Активация МАР-киназ (% от интактных)
300
Плацебо
Артрофлекс
200
100
1ч ЛПС
4ч ЛПС
1ч ЛПС
JNK1/2
0
4ч ЛПС
p38
*
1ч ЛПС
4ч ЛПС
ERK1/2
*
*
Рис. 9. Влияние препарата артрофлекс (300 мг/кг, per os) на активацию МАРкиназ JNK1/2, p38 и ERK1/2 в легком и костном мозге крыс через 1 и 4 часа
после внутривенного введения им ЛПС.
Примечание: * - p<0.05 при сравнении с контролем (плацебо)
Определение влияния перорального введения артрофлекса крысам на
ЛПС-индуцированное повышение уровня TNFα в крови животных доказало
20
способность препарата ингибировать продукцию провоспалительного цитокина
in vivo. На сроке 1 час индукции воспаления артрофлекс снижал концентрацию
TNFα в плазме крови до <5%, на сроке 4 часа – до 42% от таковой животных из
группы плацебо (табл. 4).
Таблица 4
Уровень TNFα в плазме крови крыс на фоне внутривенного введения ЛПС и
перорального приема препарата артрофлекс (300 мг/кг)
Уровень TNFα в плазме крови крыс (пг/мл)
Группа (n=7)
через 1 ч
через 4 ч
после введения ЛПС
после введения ЛПС
Интактные
<31
<31
Плацебо
608.8±202.1*
1243.2±205.9*
Артрофлекс (300 мг/кг)
<31***
510.4±78.9***
- различия статистически значимы (р<0.05) по сравнению с группой интактных животных;
** - различия статистически значимы (р<0.05) по сравнению с группой плацебо.
*
Полученные данные позволяют заключить, что установленная ранее
способность артрофлекса ингибировать ЛПС-индуцированную продукцию
ключевого провоспалительного цитокина TNFα в условиях in vitro и ex vivo
подтвердилась на уровне in vivo при пероральном введении препарата
животным. На основании этого можно утверждать, что одним из механизмов
противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование им
продукции фактора некроза опухолей-α.
Суммируя результаты изучения специфической фармакологической
активности препарата артрофлекс, можно заключить, что препарат оказывает
выраженное противовоспалительное действие по силе не уступающее
синтетическим стероидным и нестероидным лекарственным средствам.
Артрофлекс обладает противоотечной, анальгезирующей и антипиретической
активностями, предотвращает индуцированные хроническим воспалением
деструкцию хряща и патологические изменения костной ткани.
Механизм действия артрофлекса выражается в снижении повышенной
продукции провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-1β, а также
метаболитов арахидоновой кислоты простагландина E2 и лейкотриена В4.
Оказываемое действие проявляется за счет регулирования активации МАРкиназ (p38, JNK1/2, ERK1/2) и ядерного транскрипционного фактора kB.
ВЫВОДЫ
1.
В ходе комплексного исследования с использованием трех
экспериментальных моделей острого, подострого и хронического воспалений у
крыс установлено, что новый отечественный препарат растительного
21
происхождения артрофлекс обладает выраженными противовоспалительными
свойствами в дозе 250-300 мг/кг.
2.
При остром и подостром воспалениях артрофлекс оказывает
антиэксудативное,
анальгезирующее и жаропонижающее действие,
нормализует СОЭ и лейкоцитоз, а также снижает уровень простагландина Е2 и
лейкотриена В4 в периферической крови экспериментальных животных. При
хроническом воспалении суставов артрофлекс предотвращает деструкцию
хряща и патологические изменения костной ткани.
3.
По эффективности противовоспалительного действия артрофлекс
(250-300 мг/кг) соответствует или превосходит стероидные (преднизолон (10
мг/кг)) и нестероидные (бутадион (56 мг/кг), диклофенак Na (8 мг/кг))
противовоспалительные препараты, при этом оказывает значительно менее
выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет иммуносупрессорных
свойств.
4.
С использованием современных методов молекулярной биологии,
адаптированных для изучения препаратов растительного происхождения,
проведен анализ ряда механизмов противовоспалительного действия
артрофлекса. В частности, установлено, что артрофлекс подавляет ЛПСиндуцированную продукцию факторов воспаления: TNFα, IL-6, IL-1β и PGE2.
5.
Адаптирован метод определения влияния растительного препарата
на активацию МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 в органах крыс при его
пероральном введении животным. Установлено, что одним из механизмов
противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование
активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 и снижение транскрипционной
активности ядерного фактора kB.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Rydlovskaya A.V., Makarova M.N., Makarov V.G., Tikhonov V.P.
Investigation of anti-inflammatory activity of complex herbal oil extract in vitro
and in vivo// Abstr. Book of Oxygen club of California «Oxidants and
antioxidants in biology», 15-18 March 2006. – Santa Barbara, California, 2006. P. 107.
2. Рыдловская А.В., Макаров В.Г. К механизмам противовоспалительного
действия босвеллиевых кислот // Материалы X междунар. Съезда
«Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов
природного происхождения», 22-25 июня 2006. – СПб, Россия, 2006. –
С.754-759.
3. Рыдловская
А.В.,
Макарова
М.Н.,
Макаров
В.Г.
Оценка
противовоспалительного действия комбинированного фитопрепарата
артрофлекс и его компонентов на модели адьювантного артрита у крыс //
Материалы X междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых
22
лекарственных препаратов природного происхождения», 22-25 июня 2006.
– СПб, Россия, 2006. – С. 754-759.
4. Rydlovskaya A., Makarov V., Makarova M., Pozharitskaya O., Tikhonov V.
Investigation of anti-inflammatory activity of complex herbal oil extract in vitro
and in vivo// J. Planta Medica (54th annual congress on medical plant research;
29 August – 2 September, Helsinki, Finland, 2006). – 2006. – Vol. 72. – P.
1007-1008.
5. Рыдловская А.В., Макаров В.Г. Механизмы противовоспалительного и
иммуномодулирующего действий диферулоилметана// Вестник Уральской
медицинской академии наук. – 2006. – Т.3, №1. – С.208-210.
6. Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Тесакова С.В., Столащук Н.В., Макаров
В.Г.
Оценка
эффективности
нового
нестероидного
противовоспалительного препарата растительного происхождения//
«Политехнический симпозиум: Молодые ученые – промышленности
Северо-Западного региона», 8 декабря 2006. – СПб, Россия, 2006. – С.202.
7. Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Иванова С.А.,
Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Оценка противовоспалительного действия
комбинированного препарата артрофлекс на модели каррагенинового отека
у крыс линии Вистар// Вестник Санкт-Петербургской государственной
медицинской академии им. И.И. Мечникова. – 2006. - №3(7). – C.138-141.
8. Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Тесакова С.В., Иванова
С.А., Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Противовоспалительная активность
и механизм действия препарата “Артро-актив”// Фармация. – 2007. - №1. –
С. 38-41.
9. Рыдловская А.В., Гончар И.В., Тесакова С.В., Столащук Н.В., Гущин В.А.,
Макаров
В.Г.
Определение
влияния
противовоспалительного
комбинированного растительного препарата артрофлекс на сигналинг
МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 и ядерного фактора kB// Международная
конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 5-7 июня 2007.
– Пущино, Россия, 2007. – C.333-335.
10.Rydlovskaya A.V., Gonchar I.V., Gushсhin V.A., Tesakova S.V., Stolashuk
N.V., Makarov V.G., Tikhonov V.P. Study of mechanisms of action of a new
non-steroidal anti-inflammatory remedy of plant origin// Abstr. Book of Nordic
Natural Products Conference, - June 13-15 2007. - Sankt Helene, Denmark,
2007. – P. 57.
11. Рыдловская А.В., Гончар И.В., Гущин В.А., Тесакова С.В., Столащук Н.В.,
Макаров В.Г. Влияние нового нестероидного противовоспалительного
препарата растительного происхождения на ЛПС-индуцированную
продукцию TNFα и активацию МАР-киназ JNK1/2, p38 и ERK1/2 in vivo//
Российский аллергологический журнал (VIII Конгресс "Современные
проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии”, 27-29
июня. – Москва, Россия, 2007). – 2007. - №3, приложение 1. - С. 34.
12.Макаров В.Г., Макарова М.Н., Рыдловская А.В., Тесакова С.В.
Нутриметаболомика с позиций системной оценки функционирования
метаболических комплексов// Ж. вопросы питания. – 2007. - №3. – С. 4-10.