Морфология, физиология, генетика и экология микроорганизмов

Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию
ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия»
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА И
ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Малый практикум для самостоятельной работы
студентов
Методическое руководство
Рекомендовано центральным координационным методическим советом
ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия»
Ижевск
2005
УДК 576.8.094.095(076.5)
ББК 28.4я 73
М 79
Составители: канд. биол.наук, ст. преп. Т.Г. Чабашвили, д-р биол. наук, проф.
В.Н.Марков.
Р е ц е н з е н т ы : зав. кафедрой биологии с экологией ГОУ ВПО ИГМА д-р мед.
наук, проф. Н.Н.Чучкова; зав. кафедрой инфекционных болезней и
эпидемиологии ГОУ ВПО ИГМА канд. мед. наук, доцент О.В. Малинин
Одобрено центральным координационным методическим советом
ГОУ ВПО « Ижевская государственная медицинская академия»
М 79
Морфология, физиология, генетика и экология микроорганизмов. Малый практикум для самостоятельной работы
студентов: Методическое руководство / Сост. Т.Г.Чабашвили;
В.Н.Марков. - Ижевск, 2005 - с.
Методическое руководство составлено в соответствии с программой
по микробиологии, вирусологии и иммунологии для студентов лечебных медикопрофилактических и педиатрических факультетов высших медицинских учебных
заведений (Москва, 2000 г.) и программой по микробиологии, вирусологии и
иммунологии с курсом микробиологии полости рта для студентов
стоматологических факультетов высших медицинских учебных заведений
(Москва, 2001г.). Представляет собой протоколы лабораторных занятий по общей
микробиологии по разделам, изучаемым студентами в 4-м семестре (морфология,
физиология, генетика, экология, асептика, антибактериальные химиопрепараты и
антибиотики).
Рекомендуется для лабораторных занятий и самостоятельной работы
студентам лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов.
УДК 576.8.094.095(076.5)
ББК 28.4я 73
© Т.Г. Чабашвили; В.Н. Марков, составление, 2005
© ГОУ ВПО «Ижевская государственная
медицинская академия», 2005
2
РАЗДЕЛ 1: МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Лабораторное занятие №1.
Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. ФОРМЫ
БАКТЕРИЙ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ.
Цель: Усвоить правила работы в бактериологической лаборатории.
Отработать технику приготовления мазков, окраски их простыми
методами и микроскопии. Научиться определять микроорганизм
по морфологическим признакам.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Правила работы в бактериологической лаборатории.
Организация рабочего места. Техника безопасности.
2. Место микробиологии в современной медицине.
Предмет и задачи микробиологии.
3. Исторические этапы развития микробиологии. Работы Л.Пастера,
Р.Коха и их значение для развития науки.
4. Роль отечественных ученых в развитии микробиологии
(И.И. Мечников, Д.И.Ивановский, Г.Н. Габричевский, Ф. Гамалея,
З.В.Ермольева, Л.И.Зильбер, А.А.Смородинцев, М.П.Чумаков,
В.М.Жданов и др.).
5. Основные принципы классификации микроорганизмов.
6. Морфологические и тинкториальные свойства бактерий.
Простые методы окраски бактерий.
7. . Методы микроскопии (световая, темнопольная, фазовоконтрастная,
люминесцентная, электронная), их особенности и возможности.
8. Техника приготовления микропрепаратов.
Методы фиксации, значение.
9. Основные формы бактерий.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Изучить и записать правила работы в бактериологической
лаборатории и технику безопасности.
2. Изучить устройство оптического микроскопа, освоить работу
с иммерсионной системой.
3. Научиться готовить микропрепараты из крови, гноя, мокроты,
чистой культуры, фиксировать и красить их.
3
4. Приготовить два мазка из различных культур микроорганизмов,
окрасить простым методом, изучить под микроскопом и зарисовать.
5. Изучить готовые микропрепараты, определить по
морфологическим признакам: стафилококка, гонококка, кишечную
палочку, бациллы антракоида. Зарисовать и подписать.
6. Изучить готовые демонстрации: лабораторную посуду, красители.
7. Уборка рабочего места.
8. Отчитаться преподавателю по протоколу.
Задание на дом: записать в протокол
особенности и возможности различных видов микроскопов.
4
Работа № 1: Правила работы в бактериологической лаборатории.
1. Вход без халата запрещен.
2. В лабораторию допускаются люди, прошедшие предварительно
инструктаж по правилам работы и технике безопасности.
3. Работа проводится в медицинских халатах, шапочках и сменной
обуви. В необходимых случаях надевают марлевую повязку.
4. Запрещается курить, хранить и принимать пищу, пользоваться
косметическими принадлежностями. Личные вещи нужно хранить в
специальном месте.
5. Во время работы с заразным материалом ограничиваются
разговоры и перемещения по лаборатории.
6. Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. После
работы с заразным материалом все принадлежности убирают на
свое место.
7. При случайном попадании заразного материала на стол или другие
поверхности, это место необходимо обработать дезинфицирующим
раствором.
8. После работы с заразным материалом руки тщательно вымыть,
при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.
По окончании работы студент должен:
1.
2.
3.
4.
Сдать дежурному полученный материал и сделанные посевы.
Привести в порядок свое рабочее место и микроскоп.
Вымыть руки 2 раза мылом или дезинфицирующим раствором.
Подать на подпись преподавателю протокол с выполненной
практической работой.
Правила техники безопасности на кафедре микробиологии:
А) при работе со спиртовым горючим - спиртовкой:
1. Перед работой проверить плотное прилежание фитиля, чтобы не
было возгорания спирта и взрыва.
2. Нельзя переносить зажженную спиртовку или зажигать одну от
другой.
3. Запрещается задувать пламя спиртовки.
4. Во избежание возгорания, волосы должны быть спрятаны под
колпак, манжеты рукавов халата плотно застегнуты.
5. Нельзя над зажженной спиртовкой передавать какие-либо предметы.
6. Нельзя оставлять без присмотра работающую спиртовку.
5
Б) при работе с электрооборудованием запрещается:
1. Проверять наличие или отсутствие напряжения руками.
2. Пользоваться неисправными розетками, лампами и другими
приборами.
3. Прикасаться руками или металлическими предметами к
токоведущим элементам.
4. Оставлять без присмотра включенные электроприборы.
В) при работе с химическими веществами:
1. Не допускать попадания их на кожу и слизистые оболочки.
2. Пользоваться химическими веществами только над кюветкой.
3. Уметь оказать первую само- и взаимопомощь.
Работа №2: Устройство оптического микроскопа.
Иммерсионная система.
В микроскопе различают механическую и оптическую части.
Механическая:–1/_____________,2/______________, 3/______________,
4/________________, 5/_________________, 6/_____________________
Оптическая – 1/_______, 2/_______, 3/осветительная система, которая
состоит из: а)_____________, б) ____________, в)__________________.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и
препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего
увеличения и иммерсионные (увеличение х90- х100). Между
фронтальной линзой такого объектива помещают иммерсионное масло
(кедровое или синтетическое). Иммерсионное масло имеет показатель
преломления как у стекла, что обеспечивает увеличение разрешающей
способности объектива.
Большинство микроорганизмов изучают в световом микроскопе с
окулярами х7 или х10 и объективом х90.
Техника иммерсионной микроскопии:
Зеркало ____________________.
Конденсор __________________.
Диафрагма конденсора ________________________
На предметный столик помещают микропрепарат, иммерсионное
масло (да, нет).
5. Под контролем зрения сбоку опускают объектив почти до упора.
6. Глядя в окуляр, медленно поворачивают ______________на себя до
появления изображения.
7 Четкость изображения устанавливают __________________.
1.
2.
3.
4.
6
Работа
№3:
Правила
приготовления
микропрепаратов.
Приготовление микропрепаратов из чистой культуры.
Мазки из крови готовят с помощью второго стекла с отшлифованным
краем. Каплю крови наносят у левого края стекла, перед каплей под
углом помещают край отшлифованного стекла и продвигают его вперед
вместе с каплей крови.
Мазки из мокроты и гноя – материал стерильной петлей наносят на
середину предметного стекла, накрывают вторым предметным стеклом
и с усилием раздвигают в стороны.
Мазки из гноя, взятого с помощью тампона – плоскостью тампона
готовят штриховой мазок по середине стекла.
Мазки-отпечатки из органов – вырезанный кусочек органа
поверхностью среза прижимают к стеклу.
Мазки из культуры бактерий, выращенной на плотной питательной
среде, готовят с помощью бактериологической петли. Правило:
бактериологическая петля стерилизуется до и после любой работы с
ней и может находиться только в штативе или в руке.
Этапы приготовления мазка:
1. Предметное стекло обезжирить мылом.
2. Петлей взять каплю стерильного физиологического раствора
и нанести ее на середину предметного стекла.
3. Плоскостью стерильной петли осторожно снять культуру с агара в
пробирке или чашке Петри и внести ее в каплю на стекле.
4. Круговыми движениями петли культуру растереть в капле, чтобы
получился равномерный мазок диаметром около 2 см.
5. Мазок высушить над парами спиртовки.
6. Зафиксировать.
7. Окрасить и снова высушить.
8. Иммерсионная микроскопия.
Значение фиксации: а) ___________________________
б)_____________________, в)_________________________.
Методы фиксации:
1. Термическая –
а) в пламени спиртовки: 3 раза медленно провести мазок через пламя;
б) несколько капель спирта поджечь на стекле (при окраске по методу
Бурри-Гинса).
2. Химическая – мазок опустить в ацетон на ___ мин., или в 95% этанол
на ____ мин., или в смесь Никифорова (1:1 спирт и эфир) – на ____ мин.
7
Простые методы окраски (принцип:____________________________)
генцианвиолет, метиленовая синь, фуксин, и др. Для окрашивания фона
в качестве краски используют черную тушь (метод Бурри).
Работа № 4: Приготовление мазков из культур с плотной
питательной среды и окраска их простым методом.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Приготовить два мазка из различных культур бактерий.
Зафиксировать в пламени спиртовки.
Окрасить фуксином или генцианвиолетом (по Синеву) 3-5 мин.
Промыть и высушить.
Изучить под микроскопом с иммерсией.
Зарисовать.
При простом методе окраски выявляется только форма микроба.
По форме выделяют 4 группы бактерий:
1. Шаровидные – кокки:
монококки,
диплококки (пневмококки,
нейсерии – менингококки, гонококки),
тетракокки,
стрептококки,
сарцины,
стафилококки.
2. Палочковидные:
а) спорообразующие – бациллы,
клостридии,
б) неспорооборазующие –
кишечная палочка,
дифтерийная палочка,
туберкулезная палочка,
вибрион холеры,
палочка чумы.
3. Извитые: кампилобактерии,
спириллы,
спирохеты - трепонемы,
лептоспиры,
бореллии.
4. Ветвящиеся: актиномицеты.
8
Стафилококк
Staphylococcus aureus
(фуксин).
Кишечная палочка
Escherichia coli.
(фуксин)
Бациллы антракоида
Bacillus antracoides.
(генцианвиолет)
Гонококк в гное
(метиленовая синь)
лейкоцит
Подпись преподавателя:_____________________
9
Вопросы для самоконтроля:
1. С трудами каких ученых связан эвристический период развития
микробиологии?
2. С трудами каких авторов связан морфологический период развития
микробиологии?
3. Какие ученые представляют физиологический период развития
микробиологии?
4. С работами каких ученых связан иммунологический период
развития
микробиологии.
5. Кто считается основоположником микробиологии?
6. Кто и когда открыл вирусы?
7. Что такое таксон?
8. Дать понятие «вида».
9. Что такое штамм?
10. Что является основной таксономической единицей бактерий?
11. Что такое чистая культура?
12. Что такое клон?
13. Что такое хемовар бактерий?
14. Какие открытия связаны с именем Л.Пастера?
15. Какие открытия связаны с именем Р.Коха?
16. Что впервые предложил Р.Кох?
17. Заслуги И.Мечникова.
18. Заслуги А.Смородинцева.
19. Заслуги Г.Габричевского.
20. Что используют в световом микроскопе для изучения бактерий?
21. Особенности микроскопии мазков в световом микроскопе.
22. Отличия в устройстве фазово-контрастного микроскопа.
23. Что используют при темнопольной микроскопии?
24. Что лежит в основе темнопольной микроскопии?
25. Устройство и принцип работы люминесцентного микроскопа.
26. Устройство и принцип работы электронного микроскопа.
27. Простые методы окраски бактерий.
28. Отличия простых методов окраски бактерий.
29. Палочковидные формы микробов.
30. Представители кокковидных форм бактерий.
10
Дополнительная информация.
11
Лабораторное занятие №2.
Тема: СТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.
СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ.
Цель: уметь выявлять различные структуры бактериальной клетки.
Освоить технику окраски сложными методами: Грама,
Гинса-Бурри, Нейссера, Циля-Нильсена, Ожешко.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Основные отличия прокариотических и эукариотических клеток.
2. Структура и химический состав бактериальной клетки.
3. Постоянные и непостоянные структуры бактерий и методы их
выявления.
4. Особенности строения Грам ( + ) и Грам ( - ) бактерий.
5. Сложные методы окраски, сущность каждого метода.
6. Методы определения подвижности микробов.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Записать отличия прокариот и эукариот.
2. Изучить и записать технику окраски по методу Грама Приготовить
мазок из смеси двух культур бактерий, окрасить методом Грама.
Изучить под микроскопом. Определить форму микробов и их
отношение к окраске по Граму. Зарисовать
3. Изучить и записать технику окраски микропрепаратов сложными
методами: 1/Нейсера, 2/Циля-Нильсена, 3/Ожешко, 4/Бурри-Гинса.
Промикроскопировать и зарисовать готовые микропрепараты в
окраске этими методами.
4. Изучить и записать методы определения подвижности микробов.
Провести темнопольную микроскопию мазка «раздавленная капля».
Описать принцип микроскопии.
5. Уборка рабочего места.
6. Отчет преподавателю по протоколу.
12
Работа №1: Отличия прокариот и эукариот:
Признак
Генетический материал
Ядерная мембрана
Гистоны
Набор хромосом
Аппарат Гольджи,
митохондрии, хлоропласты
Клеточная стенка
Размеры клеток
Тканевая дифференциация
Прокариоты
Эукариоты
Строение бактериальной клетки:
1) постоянные структуры2) непостоянные структурыРабота №2: Сложные методы окраски бактерий. Метод Грама.
Для выявления определенных структур бактерий применяют сложные
методы окраски, в основе которых лежит учет химических особенностей
этих структур и использование контрастных красителей.
Метод Грама позволяет выявить особенности строения
клеточной стенки бактерий.
1. Генцианвиолет (бумажки по Синеву) смочить водой _____мин.
2. Раствор Люголя –_______ мин.
3. Этиловый спирт –________________
4. Промывание водой
5. Фуксин Пфейффера – ____ мин.
6. Промыть водой.
При этом методе окраски одни бактерии не обесцвечиваются
спиртом и сохраняют окраску_____________ красителя, вторые
обесцвечиваются спиртом и окрашиваются _____________ красителем.
В зависимости от строения клеточной стенки все микроорганизмы
подразделяются на Грам (+) и Грам (-). Способность Грам (+) бактерий
удерживать генцианвиолет в комплексе с йодом связана со свойством
многослойного пептидогликана взаимодействовать с краской.
13
Особенности строения клеточной стенки Грам (+)и Грам (-)
бактерий.
Признак
Грам (+)
Грам (-)
Толщина КС
Пептидогликан
% ПГ от КС
Тейхоевые кислоты
Липиды
Белки-порины
Грам (+) бактерии окрашиваются в _____________________цвет,
потому, что__________________________________________________
____________________________________________________________
Грам (-) бактерии окрашиваются в ____________________цвет,
потому, что __________________________________________________
____________________________________________________________.
Смесь бактерий в окраске по Граму
Грам (+)_____________________
Грам (- )_____________________
14
Работа №3: Техника окраски другими сложными методами.
1) Метод Нейссера позволяет определить зерна волютина.
ацетат синьки Нейссера (кислый краситель)- ___ мин.
Люголь - _____ сек.
Промыть водой.
Везувин (щелочной краситель)- ____мин.
Промыть водой.
Зерна волютина, как щелочные образования, окрашиваются кислым
красителем в_____________ цвет. Цитоплазма бактериальной клетки
окрашивается щелочным красителем в_______________ цвет.
1.
2.
3.
4.
5.
Коринебактерии дифтерии
Зерна волютина
2) Метод Циля-Нильсена позволяет определить
кислотоустойчивые бактерии.
Карболовый фуксин Циля - _____ мин.
Промывание водой.
5% серная кислота –
_____ мин.
Промывание водой
Метиленовая синь ______ мин.
Промывание водой.
Кислотоустойчивые бактерии ________________________________,
поэтому окрашиваются в ______________________цвет.
Кислотонеустойчивые бактерии и структуры ______________________,
поэтому красятся в ___________________________цвет.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Туберкулезные палочки в мокроте
Волокна мокроты
Лейкоциты
15
3) Метод Ожешко позволяет окрасить споры бактерий.
1. На нефиксированный мазок 0,5% соляной кислоты - 3 мин.
с прогреванием (протрава)
2. Промывание водой (осторожно)
3. Фиксация в пламени спиртовки.
4. Окраска по Цилю-Нильсену.
Спора, как кислотоустойчивая структура красится в ______________
цвет, а цитоплазма клетки, как кислотонеустойчивая структура – в
__________________________цвет.
Споры бацилл сибирской язвы.
4/Метод Бурри-Гинса позволяет выявить капсулу бактерий
(называется негативным, так как капсула не прокрашивается).
1. В каплю черной туши, внести культуру, смешать и 2 стеклом
со шлифованным краем приготовить мазок, как из крови.
2. Высушить.
З. Зафиксировать (_________________________________)
3. Фуксин Пфейффера - __________ мин.
Капсула не воспринимает красители, поэтому окрашиваем бактерии
и окружающий фон. Фон окрашивается тушью в _________ цвет, а
возбудитель фуксином в __________ цвет, при этом капсула видна в
виде __________________ ободка вокруг бактерий.
Клебсиеллы пневмонии
капсула.
16
Капсулу можно выявить и при простом методе окраски, если
исследовать мазки-отпечатки из органов. При этом клетки органов
создают окрашенный фон, что позволяет увидеть капсулу вокруг
прокрашенных бактерий.
Бациллы сибирской язвы в мазке-отпечатке
из органа (фуксин)
капсула
клетки органов
Работа № 4: Методы определения подвижности микробов.
Темнопольная микроскопия.
Подвижность бактерий связана со жгутиками.
Методы выявления жгутиков:
1/Прямые – виден сам жгутик
(а/_____________________,б/_______________________________);
2/Косвенные – определяется подвижность бактерий
(а/______________________, б/______________________________).
Техника темнопольной микроскопии:
а) источник света__________________________
б) зеркало _______________________________
в) конденсор______________________________
г) мазок __________________________________
д) иммерсия______________________________
е) объектив_______________________________
На темном фоне видны светящиеся и подвижные микробы.
Подпись преподавателя __________________
17
Вопросы для самоконтроля:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
18
Кто относится к эукариотам?
Кто относится к прокариотам?
Что присуще только прокариотам?
Что имеют эукариоты?
Отличия эукариот от прокариот.
Чем представлен генетический аппарат бактерий?
Особенность генетического аппарата бактерий.
Особенность рибосом у прокариот.
Обязательные структурные элементы бактерий.
Непостоянные структуры бактерий.
Из чего может состоять оболочка бактериальной клетки?
В каких процессах участвует цитоплазматическая мембрана?
Сложные методы окраски.
Методы окраски с использованием кислоты?
Для чего используется метод окраски по Цилю-Нильсену?
Чем представлена клеточная стенка прокариот?
Чем представлена клеточная стенка эукариот?
Какие бактерии полностью утратили клеточную стенку?
Что такое протопласты, сферопласты и L-формы бактерий?
Метод окраски для выявления клеточной стенки бактерий?
Из чего состоит клеточная стенка Грам (-) бактерий?
Из чего состоит клеточная стенка Грам (+) бактерий?
Отличия клеточной стенки у Грам (+) и Грам (-) бактерий.
Какие микробы являются Грам (-)?
Какие кокки являются Грам (-)?
Какие микроорганизмы являются Грам (+)?
В какой цвет красятся Грам (-) бактерии и почему?
Грам (-) прокариоты.
Почему Грам (+) бактерии красятся в фиолетовый цвет?
Структура и функции капсулы бактерий.
Как можно выявить капсулу бактерий?
Какие микроорганизмы обладают подвижностью?
Что используют для окраски по Граму?
Что обеспечивает кислотоустойчивость бактерий?
Метод окраски кислотоустойчивых бактерий?
В какой цвет красятся кислотоустойчивые бактерии и почему?
Какие факторы обеспечивают окраску кислотоустойчивых бактерий?
Что применяют для окраски по Цилю-Нильсену?
Что такое зерна волютина и метод их окраски?
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
Роль спорообразования у бактерий.
С чем связана устойчивость спор во внешней среде?
Спорообразующие бактерии.
Метод окраски спор у бактерий.
В какой цвет окрашивается спора и почему?
Что необходимо использовать для окраски спор?
Что представляют жгутики бактерий?
Названия бактерий с различным расположением жгутиков.
Прямые и косвенные методы обнаружения жгутиков.
Строение и функции пилей у бактерий
.Что изучают в темнопольном микроскопе?
Дополнительная информация.
19
Лабораторное занятие №3.
Тема: ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП
МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ ИХ ИЗУЧЕНИЯ.
Цель: усвоить основные отличия различных групп микроорганизмов.
Изучить окраску по методу Романовского - Гимзе.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Морфология и ультраструктура спирохет. Классификация.
Патогенные виды. Методы изучения.
2. Морфология и ультраструктура микоплазм. Патогенные для
человека виды.
3. Морфология и ультраструктура риккетсий и хламидий. Патогенные
виды и методы изучения.
4. Морфология актиномицетов. Патогенные для человека виды.
5. Морфология грибов. Принципы классификации.
Патогенные виды.
6. Морфология простейших, принципы их классификации.
Патогенные представители
7. Особенности биологии вирусов. Принципы классификации.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. По таблицам и микропрепаратам изучить и зарисовать:
а) спирохеты в окраске по Романовскому-Гимзе, описать метод
окраски, б) риккетсии в окраске по Здродовскому,
в) актиномицеты в окраске по Граму, г) нитевидные грибы,
д) дрожжевые грибы, е) токсоплазмы, ж) структуру вирусов.
2. Приготовить мазок из грибов рода Кандида, окрасить по Граму,
изучить под микроскопом и зарисовать.
3. Уборка рабочего места.
4. Отчет преподавателю по протоколу.
20
Работа № 1: Морфология различных групп микроорганизмов.
А) Спирохеты в окраске по Романовскому-Гимзе
Техника окраски:
1. мазки фиксировать в смеси Никифорова ____ мин.
2. опустить в краску Гимзе (___________________________) - ___мин.
Трепонемы
окрашиваются
в
____________________цвет,
лептоспиры – _______________, боррелии – в ______________цвет.
Трепонемы
Боррелии
Лептоспиры
Б) Риккетсии в окраске по Здродовскому:
Эукариотическая клетка
риккетсии
В) Актиномицеты в окраске по Граму
Чистая культура
Грам (+)
21
Г) Плесневые грибы при малом увеличении. Различаются характером
мицелия и расположением спор.
Мукор
Аспергилл
Д) Дрожжевые грибы в окраске простым методом.
Е) Морфология микоплазм и хламидий
Ж) Токсоплазмы в окраске по Романовскому-Гимзе
токсоплазмы
эритроциты
лейкоциты
22
Пеницилл
З) Структура вируса гриппа (электронная микроскопия)
Нуклеиновая кислота (РНК)
суперкапсид
капсид
шипы суперкапсида
Работа № 2: Мазок грибов рода Кандида в окраске
по Граму.
Candida albicans
Грам (+)
псевдомицелий
Подпись преподавателя:_____________________
23
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
24
Вопросы для самоконтроля:
Особенности строения спирохет.
Методы окраски спирохет?
Методы изучения спирохет в нативном состоянии.
В чем сходство спирохет с простейшими?
Применение метода окраски по Романовскому-Гимзе.
Бактерии, не имеющие клеточной стенки?
Таксономия и морфология микоплазм.
Отличительные признаки микоплазм.
Чем представлена оболочка у микоплазм?
Таксономия риккетсий.
Морфология риккетсий.
С кем имеют сходство риккетсии?
Каким методом окрашивают риккетсии?
Признаки, сходные у риккетсий и вирусов.
Таксономия хламидий.
Особенности морфологии хламидий.
Внутриклеточные формы хламидий.
В каком виде хламидии находятся вне клетки?
Отличия хламидий от риккетсий.
Таксономия актиномицет.
Особенности строения актиномицетов.
С кем имеют сходство актиномицеты?
Каким методом окрашивают актиномицеты?
Какие микроорганизмы образуют споры?
Таксономическое положение грибов.
Характерные признаки грибов.
Морфологические отличия грибов.
Кто относится к низшим грибам?
Какие грибы имеют септированный мицелий?
Какие грибы образуют псевдомицелий?
Нитчатые грибы.
Особенности морфологии грибов рода Кандида.
Таксономическое положение простейших?
Кто относится к простейшим?
Отличия в строении простейших.
Характеристика вирусов.
Геном вирусов.
Отличия вирусов от про- и эукариотов.
Структурные элементы вирусов.
Методы определения размеров вирусов.
Дополнительная информация.
25
Лабораторное занятие № 4.
Тема: КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ: «МОРФОЛОГИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ».
Цель: оценить степень усвоения практических навыков по методам
исследования морфологических свойств микроорганизмов
и теоретических знаний по пройденной теме.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
Теоретические вопросы и вопросы для самоподготовки к занятиям 1-3.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Ответить на 20 вопросов тест-контроля.
2. Каждый студент готовит мазок с неизвестной чистой культуры,
красит по Граму, микроскопирует и определяет культуру по ее
морфологическим и тинкториальным свойствам.
3. Каждый студент готовит микропрепарат и определяет неизвестный
микроорганизм и метод его окраски (стафилококки, гонококки,
кишечная палочка, бациллы антракоида, туберкулезная палочка,
грибы рода Кандида, споровые и капсульные бактерии, смесь
бактерий в окраске простыми и сложными методами).
4. Уборка рабочего места.
26
РАЗДЕЛ 2. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Лабораторное занятие № 5
Тема: ПИТАНИЕ, ДЫХАНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ
КУЛЬТУРЫ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ.
Цель: отработать методику посева микроорганизмов на жидкие
и плотные питательные среды, усвоить принцип выделения
чистой культуры аэробов.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
Л. Пастер. Способы получения энергии бактериями.
Типы и механизмы питания бактерий.
Р. Кох. Основные принципы культивирования бактерий.
Рост и размножение бактерий. Фазы размножения
Искусственные питательные среды, их классификация,
требования к ним.
6. Принципы и методы выделения чистых культур аэробов.
1.
2.
3.
4.
5.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Описать способы получения чистых культур.
2. Записать основные требования к питательным средам.
3. Познакомиться с жидкими и плотными питательными средами
(МПБ, МПА, Ру и др.).
4. Изучить методы разобщения бактерий. Научиться делать посевы
петлей на плотные и жидкие среды.
5. Разобрать и записать в протоколе этапы выделения чистой
культуры аэробных бактерий
6. Изучить и зарисовать характер роста на жидких средах кишечной
палочки, стафилококка, стрептококка, холерного вибриона,
сибиреязвенной палочки.
7. Описать культуральные свойства отдельной колонии на чашке
Петри с агаром (паспорт колонии).
8. С одной части колонии сделать мазок, окрасить по Граму, изучить и
зарисовать; другую часть колонии отсеять на скошенный МПА,
подписать и убрать в термостат.
9. Уборка рабочего места
10. Отчет по протоколу.
27
Работа № 1: Способы получения чистых культур бактерий.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Работа № 2: Основные требования к питательным средам
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
_____________________________________________________
_____________________________________________________
Работа № 3: Жидкие и плотные питательные среды.
Консистенция среды зависит от содержания агар-агара.
Жидкие среды не содержат его, в полужидкие он добавлен в ___%,
в плотных средах агара до ___%.
Среды по назначению подразделяют на:
Универсальные –
мясопептонный бульон – МПБ (__________________________),
сахарный бульон СБ (________________),
мясопептонный агар МПА (_____________________________________).
Дифференциально-диагностические кровяной
агар
КА
(__________________)
для
выявления
гемолитических свойств; среда Эндо – для дифференциации
энтеробактерий по сахаролитическим свойствам; желточно-солевой
агар ЖСА - для дифференциации патогенных стафилококков от
непатогенных.
28
Элективные среды – только для одного вида бактерий:
ЖСА -10% NaCl выдерживают только стафилококки;
щелочной пептонный агар ЩПА – для холерного вибриона,
среда Ру (__________________________) –- для дифтерийной палочки.
Специальные среды -
Среда Ру
Среда Левенштейна
Йенсена
Работа № 4: Методы механического разобщения бактерий.
Техника посева бактерий бак.петлей.



Метод Коха –______________________________________________
Метод Дригальского –_______________________________________
Посев бак.петлей. Материал, взятый петлей, втирают круговыми
движениями в поверхность агара у края чашки, затем агар
прокалывают петлей, снимая избыток материала, и производят
зигзагообразные штрихи без отрыва по всей поверхности агара.
Работа № 5: Схема выделения чистой культуры
аэробных бактерий (зарисовать)
I этап Изучение исследуемого материала
1) микроскопия
2) посев на жидкие или плотные элективные или дифференциальнодиагностические среды.
II этап. Изучение культуральных свойств и выделение чистой
культуры
а) на жидких средах – ______________________________________
б) на плотных средах – _____________________________________
 описание колонии (паспорт колонии)
 микроскопия части колонии
 отсев на скошенный агар для накопления.
29
III этап. Изучение чистой культуры ( ее свойства)
1)морфологические и тинкториальные – ________________________
2) биохимические – ________________________________________
3) антигенные - ___________________________________________
4) вирулентные - __________________________________________
5) токсигенные - __________________________________________
6) чувствительность к антибиотикам _________________________
7) чувствительность к фагам –_______________________________
IV этап. Учет результатов. Заключение о виде.
Работа № 6: Характер роста бактерий на жидких питательных
средах
_____________________
________________
большинство бактерий
(стафилококк, кишечная
палочка и др.)
холерный вибрион
_____________________
_________________
палочка чумы
30
патогенные грибы
___________________
_____________________
стрептококк пиогенный
Бациллы сибирской язвы
Работа №7: Описание полонии (паспорт колонии).
1. Исследование в проходящем свете –
1) Форма колонии: -правильная, -неправильная, -амебовидная,
-ризоидная.
2) Величина колонии:- карликовая (до 1мм), -мелкая (1-2 мм),
- средняя (2-4 мм), -крупная (5 мм).
3) Степень прозрачности: - прозрачная, -полупрозрачная,
-непрозрачная.
2. Исследование в отраженном свете –
1) Цвет: -бесцветная, -мутная, -молочная, -пигментированная
(фарфоровая, кремовая, желтая, синяя и т.д.)
2) Поверхность: -матовая, -блестящая, -влажная, -сухая,
-бородавчатая, -шагреневая, -складчатая.
3) Рельеф:- плоская, -плосковыпуклая, -каплеобразная,
-с вдавленным центром, -с приподнятым центром,
-с валиком по периферии.
3. Исследование под малым увеличением –
1)Характер контура края: -ровный, -неровный (фестончатый,
бахромчатый, расплывчатый)
2) Поверхность: -матовая, -блестящая, -влажная, -сухая,
-шагреневая, -бородавчатая
3) Структура: -гиалиновая, волокнистая, -зернистая
(мелко- или грубозернистая).
4. Исследование бактериальной петлей 1) Консистенция: -пастообразная, -вязкая, -слизистая, -плотная,
кожистая, -сухая, -хрупкая, -в виде пленки, -прилипающаяся,
тянущаяся за петлей, -рассыпающаяся при прикосновении.
Работа №8: Микроскопия колонии в окраске по Граму.
Грам ( ) _____________________
Подпись преподавателя________________
31
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
32
Вопросы для самоконтроля:
Чем сопровождается рост бактерий?
Что такое размножение бактерий?
Как происходит размножение у фирмикутес и грациликутес?
Основной способ размножения бактерий.
Способы размножения спирохет, хламидий, грибов.
Какие микроорганизмы размножаются спорами?
У каких видов происходит размножение фрагментацией?
Какой процесс характеризует время генерации?
Транспорт питательных веществ у бактерий.
Отличительные признаки процессов питания у бактерий.
Поступление питательных веществ в клетку без затраты энергии.
Поступление питательных веществ в клетку с затратой энергии.
Как культивируют большинство бактерий?
Какое требование для питательных сред необязательное?
Естественные питательные среды.
Плотные питательные среды.
Дифференциально-диагностические среды.
Элективные среды.
Элективный компонент ЩПВ.
Элективный компонент среды ЖСА.
Дифференциальный компонент ЖСА.
Универсальные среды.
Способы получения чистых культур.
На какой среде выделяют чистую культуру аэробов?
Что проводят на первом этапе выделения чистой культуры
аэробов?
Второй этап выделения чистой культуры аэробов.
Третий этап выделения чистой культуры аэробов.
Классификация бактерий по источнику энергии.
Как делят бактерии по источнику углерода?
Как подразделяют бактерии по источнику азота?
Какие бактерии называют гетеротрофами?
Какие бактерии относятся к автотрофам?
Какие бактерии называют ауксотрофами?
Бактерии, усваивающие углерод из СО2.
Бактерии, усваивающие углерод из органических соединений.
Классификация бактерий по донорам электронов.
Факторы роста.
Бактерии, нуждающиеся в факторах роста.
Бактерии, не нуждающиеся в факторах роста.
Облигатные аэробы.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
Бактерии, растущие в присутствии кислорода.
При каких условиях растут факультативные анаэробы?
Что представляет энергетический обмен у облигатных аэробов?
При каких процессах акцептором электронов выступает кислород?
Характер роста различных бактерий на жидких питательных средах.
Характер роста бактерий на плотных питательных средах.
Методы получения изолированных колоний аэробов.
В проходящем свете у бактерий описывают…?
Какие свойства описывают у колоний в отраженном свете?
Какие свойства колоний описывают при малом увеличении?
Дополнительная информация.
33
Лабораторное занятие № 6.
Тема: БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ.
МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ
ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ.
Цель: научиться учитывать результаты и оценивать биохимические
свойства бактерий. Усвоить методы выращивания и схему
выделения чистой культуры анаэробов.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Ферменты бактерий, их виды. Идентификация бактерий
по ферментативной активности.
2. Ферменты патогенности, их определение.
3. Методы культивирования анаэробов. Питательные среды.
4. Схема выделения чистой культуры анаэробов.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Описать состав и принцип работы сред: Гисса, Раппопорта, Эндо,
Левина, Плоскирева, Олькеницкогои др. Зарисовать их.
2. Записать состав и принцип работы сред, входящих в «пестрый ряд».
Зарисовать готовый «пестрый ряд» кишечной палочки, сделать
заключение.
3. Изучить и зарисовать определение факторов патогенности
стафилококка при посеве на кровяной агар (КА), желточно-солевой
агар (ЖСА), плазму.
4. Изучить и зарисовать способы создания анаэробных условий:
Фортнера,
Горовец-Власовой,
Перетца,
Вейон-Виньяля,
выращивание в микроанаэростате, эксикаторе.
5. Записать состав и принцип работы сред для выращивания
анаэробов: Цейсслера, Китта-Тароцци, Вильсона-Блера. Зарисовать
исходные среды и с ростом анаэробных бактерий.
6. Разобрать и записать этапы выделения чистой культуры анаэробов
по схеме .
7. Изучить посев почвенной болтушки на молоко, приготовить мазок,
окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать споровые
палочки
8. III Этап изучения чистой культуры. Приготовить мазок с выделенной
чистой культуры, окрасить по Граму, определить микроб и зарисовать
9. Защита протокола. Уборка рабочего места.
34
Работа №1: Среды для определения сахаролитических свойств
бактерий.
Жидкие среды.
1)Среда Гисса (___________________________________________)
исходная
до К
до КГ
2) Среда Раппопорта (_______________________________________).
Элективная для сальмонелл. Разливается в бутылки или колбы.
Среда Раппопорта
Исходная
до К
до КГ
Плотные среды
1)Эндо, Левина, Плоскирева – среды на выявление энтеробактерий
(МПА + ____________+ щелочной индикатор: в Эндо –___________, в
Левина–___________________________,
в
Плоскирева
–
______________________, последняя еще имеет соли желчных кислот и
бриллиантовую зелень, которые подавляют рост кишечной палочки).
Эндо
Лак (+)
Левина
Лак (+)
Плоскирева
Лак(+)
Лак (-)
Лак (-)
Лак (-)
Бактерии, расщепляющие лактозу -lac(+), дают окрашенные колонии,
потому, что___________________________________________________.
Бактерии, не расщепляющие лактозу – lac(-) дают бесцветные колонии.
35
Среда Олькеницкого (__________________________________________
____________________________________). Среда разливается в виде
скоса, используется для выделения чистой культуры энтеробактерий.
Лактоза
до КГ
Глюкоза
до КГ
исходная
с посевом
Среды для определения протеолитических свойств бактерий
1. МПБ с индикаторными бумажками:
а) на индол
б) на сероводород
в) на аммиак
2.желатин
3. Молоко
Работа № 2: «Пестрый ряд» кишечной палочки
«Пестрый ряд» состоит из набора сред Гиса и МПБ с индикаторными
бумажками на определение конечных продуктов расщепления белков.
Лактоза
Глюкоза
Манит
Мальтоза
Сахароза
МПБ
H2S
индол
Результат: кишечная палочка ферментирует ____________________
__________________________________________________________
__________________________________________________________
36
Работа № 3: Факторы патогенности стафилококка
1. Лецитовиттелаза (лецитиназа) – разрушает лецитин клеточных
стенок, выявляется при посеве на ЖСА (МПА + желточная взвесь + 10%
хлорид натрия).
ЖСА
lec (+)
lec (-)
2. Плазмокоагулаза – сворачивает плазму.
Посев проводят в 0,5 мл плазмы крови кролика.
исходная
сгусток
3. Гемолизин – токсин, расщепляющий эритроциты.
Определяется на кровяном агаре (КА)
КА
гем (+)
гем (-)
4. Фибринолизин – токсин, расплавляющий фибрин.
Определяется посевом в свернутую кровь.
сгусток крови
лизис сгустка
37
Работа № 4: Способы создания анаэробных условий.
1.Физические
2. Химические
3. Биологические
Метод Перетца
Метод Фортнера
аэроб
Трубки Вейон-Виньяля
Принцип:
______________________
______________________
Принцип:
_____________________
_____________________
анаэроб
Принцип:
_____________________
_____________________
Работа 5: Среды для выращивания анаэробов
1. Среда Цейсслера (глюкозо – кровяной агар) в чашке Петри
Принцип:
___________________________
___________________________
38
2. Среда Китта-Тароцци (сахарный бульон, кусочки паренхиматозных
органов, высокий столбик, слой вазелинового масла).
Принцип:
______________________
______________________
исходная
с ростом
3. Среда Вильсона-Блера - железосульфитный агар ( 3% МПА + 1%
глюкозы+ 20% сульфит натрия + 8% хлорид железа) разливают
высоким столбиком, сверху вазелиновое масло. Позволяет выявить
сероводородную активность
Принцип:
______________________
______________________
исходная
с ростом.
4. Тиогликолевая среда – используется как жидкая, так и полужидкая
и плотная.
5. Молоко по Тукаеву (1% пептонная вода + 5% обезжиренного
молока) используется для выявления протеолитической активности
бактерий.
Работа 6: Рост анаэробов при посеве на молоко.
Большинство анаэробов вызывают створаживание молока.
Для приготовления мазка стерильной бактериологической петлей берут
содержимое пробирки со дна пробирки. Окрашивают
по Граму.
Клостридии
представляют
крупные
Грам
(+)
палочки
с
непрокрашенными терминальными или субтерминальными спорами.
Клостридии Грам (+)
39
Работа № 7: Схема выделения чистой культуры анаэробов.
I этап. Изучение исследуемого материала: а) микроскопия, б) посев в 5
пробирок со средой Китта-Тароцци (сразу после ее прогревания на
водяной бане при t 80 0С 15-20 мин и быстрым охлаждением).
II этап. Изучение культуральных свойств (характер изменения среды
Китта-Тароцци) и получение изолированных колоний по методу
Вейнберга (разведения в расплавленном сахарном агаре с
последующим помещением в трубки Вейон-Виньяля) .
или по методу Цейсслера (посев с разобщением на глюкозо –
кровяной агар)
III этап. Изучение колоний. Отсев на среду Китта-Тароцци для
накопления чистой культуры.
IV этап. Изучение чистой культуры
а) морфологические и тинкториальные свойства - мазок в окраске по
Граму, Гинсу, Ожешко;
б) биохимические – «пестрый» ряд, посев в молоко, на среду ВильсонаБлера и др.,
в) антигенные и токсигенные свойства - на лабораторных животных.
V этап. Учет результатов Заключение о виде.
40
Работа № 8: Изучение выделенной чистой культуры.
1. Культуральные свойства:
2. Морфологические и тинкториальные свойства в окраске по Граму:
_________________
Грам ( )
Подпись преподавателя_____________________
Дополнительная информация.
41
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
42
Вопросы для самоконтроля:
Факторы агрессии.
Ферменты, зависящие от субстрата в среде.
Классификация ферментов по направленности действия.
Использование ферментов микробов.
Среды для выявления факторов патогенности.
Состав и назначение среды ЖСА.
Методы получения изолированных колоний анаэробов.
Принципы создания анаэробных условий в среде Китта-Тороцци.
Что такое брожение?
Способ получения энергии у облигатных анаэробов.
Методы создания анаэробных условий.
Жидкие среды для культивирования анаэробов.
Среда Вильсона-Блера.
Химические методы создания анаэробных условий.
На каких средах получают изолированные колонии анаэробов?
Как создаются анаэробные условия в микроанаэростате?
Конечные продукты расщепления белков.
Как выявляют образование сероводорода, индола, аммиака?
Реактивы на выявление сероводорода, индола, аммиака.
Среды для изучения сахаролитических свойств бактерий.
Среды, содержащие лактозу.
Как выглядят лак (+) колонии на среде Эндо, Левина, Плоскирева?
Конечные продукты расщепления углеводов.
Состав и назначение среды Раппопорта.
Дифференцирующий компонент среды Раппопорта.
Среды для изучения протеолитических свойств.
Свойства облигатных анаэробов.
Биологические методы создания анаэробных условий.
II этап выделения чистой культуры анаэробов.
Среды для выращивания анаэробов (жидкие и плотные).
Химические методы создания анаэробных условий.
Назначение и принцип работы трубок Вейон-Виньяля.
Какие бактерии могут существовать без кислорода?
Среды для выращивания анаэробов.
Как создаются анаэробные условия в эксикаторе?
Состав и применение кровяного агара.
III этап выделения чистой культуры анаэробов.
Состав и назначение среды Цейсслера.
Как создаются анаэробные условия в методе Фортнера.
Принципы создания анаэробных условий в среде Китта-Тороцци.
Лабораторное занятие № 7
Тема: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ.
БАКТЕРИОФАГИ.
Цель: усвоить методы культивирования и индикации вирусов,
методы получения и титрования бактериофагов и их
практическое использование.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Значение открытия Д.И. Ивановского. Этапы развития вирусологии,
роль отечественных ученых в развитии вирусологии.
2. Структура и химический состав вирусов и бактериофагов.
3. Типы взаимодействия вируса с клеткой, стадии репродукции,
исходы.
4. Методы культивирования вирусов. Индикация вирусов.
5. Бактериофаги. Взаимодействие фага с клеткой. Умеренные и
вирулентные фаги. Лизогения.
6. Получение и титрование фагов. Применение фагов в медицине,
микробиологии и биотехнологии.
7. Внутривидовая идентификация бактерий (биовары, серовары,
фаговары и т.д.). Эпидемическое маркирование.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Провести овоскопию куриного эмбриона, заразить его
вируссодержащим
материалом.
Провести
вскрытие
ранее
зараженного эмбриона, визуально оценить состояние оболочек.
2. Описать типы культур клеток, их отличия.
3. Изучить питательные среды для культур клеток: Хенкса, Игла, 199.
4. Изучить и зарисовать методы индикации вирусов:
а) цитопатическое действие - промикроскопировать и зарисовать
культуры фибробластов в норме и с ЦПД;
б) реакция гемагглютинации – поставить РГА для индикации вируса
в исследуемом материале, оценить и зарисовать;
в) реакция гемадсорбции – зарисовать с таблицы;
г) включения в пораженных клетках – зарисовать с таблиц тельца
Бабеша-Негри при бешенстве, тельца Гварниери при натуральной
оспе, внутриядерные включения при аденовирусной инфекции;
д) реакция бляшкообразования – с таблицы;
е) «цветная проба» - зарисовать и оценить готовую реакцию.
43
5. Разобрать особенности строения и зарисовать структуру
бактериофага.
6. Описать способ получения бактериофага.
7. Учесть и зарисовать результаты титрования фага по Аппельману
и по Грациа.
8. Учесть и зарисовать готовые результаты фагодиагностики: реакции
фаголизиса и фаготипирования.
9. Описать препараты фагов, используемые для диагностики, лечения
и профилактики заболеваний.
10. Уборка рабочего места.
11. Защита протокола.
Работа № 1: Техника овоскопии, заражения и вскрытия куриного
эмбриона.
Овоскопия: поместить эмбрион на овоскоп и карандашом отметить
границу воздушной полости.
Строение 12-дневного куриного эмбриона
воздушная
полость
хорион - аллантоисная
оболочка (ХАО)
эмбрион
аллантоисная полость
амниотическая
полость
желточный мешок
белок
Заражение: скорлупу над воздушной полостью протирают спиртом,
обжигают на огне, смазывают 2% настойкой йода, снова протирают
спиртом и обжигают. Для заражения на ХАО изогнутыми ножницами
срезают скорлупу над воздушной полостью, пинцетом снимают часть
подскорлупной оболочки, исследуемый материал в объеме ________
наносят на ХАО (конец иглы не должен быть ниже границы воздушной
полости). Отверстие в скорлупе закрывают покровным стеклом и
заливают воском или парафином.
Для заражения в аллантоисную полость через прокол в скорлупе
вводят иглу шприца так, чтобы конец иглы был ниже уровня воздушной
полости на ______. Отверстие в скорлупе заливают воском.
44
Вскрытие куриных эмбрионов проводят с соблюдением правил
асептики. Скорлупу над воздушной полостью обрабатывают так же, как
при заражении, и срезают ножницами чуть выше границы прикрепления
хорион-аллантоисной оболочки. Визуально оценивают состояние ХАО
(помутнение, наличие бляшин и т.д.). Аллантоисную жидкость
насасывают пипеткой после прокола ХАО в месте, лишенном крупных
кровеносных сосудов. Затем ХАО разрезают ножницами и через
отверстие выливают все содержимое в чашку Петри. Амниотический
мешок так же разрезают, освобождают от эмбриона, просматривают на
наличие поражений.
Работа №2: Культуры клеток для культивирования вирусов.
Свойства
Первичные
Полуперевиваемые
Перевиваемые
Отличия от исходной
ткани
Набор хромосом
Продолжительность
жизни
Время генерации
(дни)
Признаки
озлокачествления
Линии клеток
Работа №3: Питательные среды для культур клеток:
1. Сбалансированные солевые растворы - раствор Эрла, Хенкса
2. Ростовые среды:
а) естественные – среда Эндерса:_______________________________
б) гидролизаты – _____________________________________________
в) синтетические – среда Игла:__________________________________
среда 199:___________________________________
_______________________________________________
Перед использованием ко всем средам добавляется________________
_____________________. Большинство сред содержат индикатор –
феноловый красный, чтобы оценивать состояние культур клеток (если
его нет, то необходимо внести в среду).
45
Работа №4: Методы индикации вирусов
а) цитопатическое действие (ЦПД)- культуры клеток изучают под
малым увеличением микроскопа в исходном состоянии или после
окраски анилиновыми красителями. Нормальные клетки фибробластов
располагаются на стекле в виде монослоя и имеют четко выраженную
структуру. Вирусы при размножении в клетках вызывают их
дегенерацию.
нормальные
фибробласты
ЦПД дегенерация
б) реакция гемагглютинации – РГА:
Компоненты:
1) смыв из носа - вируссодержащий материал
2) 1% взвесь куриных эритроцитов.
Механизм реакции:___________________________________________
___________________________________________________________
____________________________________________________________
Результат:
Заключение: в исследуемом материале содержится вирус, потому что
___________________________________________________________
___________________________________________________________
46
в) реакция гемадсорбции – РГадс проводится на ХАО куриного
эмбриона или на культуре клеток после внесения на них исследуемого
материала. Если в исследуемом материале есть вирус, то после
добавлении взвеси куриных эритроцитов, эритроциты приклеиваются –
адсорбируются на клетках. Изучают РГадс на ХАО – невооруженным
глазом, на культуре клеток – под малым увеличением микроскопа.
г) включения в пораженных клетках
цитоплазматические тельца Бабеша-Негри
при бешенстве
тельца Гварниери
при натуральной оспе
внутриядерные при аденовирусной
инфекции
47
д) реакция бляшкообразования
На монослое культуры клеток во флаконах Кареля под агаровым
покрытием образуются ограниченные участки разрушенных вирусом
клеток - бляшки или негативные колонии, которые отличаются по форме
и размерам.
е) «цветная проба» - учесть результат готовой реакции
Культура клеток
Среда 199
культура клеток
исследуемый материал
Среда 199
Результат: в исследуемом материале содержится вирус, потому что
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_
Работа №5: Строение бактериофага.
48
головка
нуклеиновая кислота
отросток
чехол
шипики
базальная пластинка
Работа № 6: Получение бактериофагов.
1._____________________________________________________
2._____________________________________________________
3._____________________________________________________
4. _____________________________________________________
5. _____________________________________________________
6. _____________________________________________________
Работа № 7: Методы титрования фагов.
1. Титрование по методу Аппельмана.
Полученный фаг разводится ___________________________________
_______________________ В каждое разведение вносится ___________
количество культуры бактерий. Инкубация в термостате.
10 -1
10 -2
10 -3
10 -4
10 -5
10 -6
10 -7
10 -8
КК
КФ
Механизм реакции:_____________________________________________
_____________________________________________________________
Титр фага (ТФ) – то __________________разведение, при котором еще
________________________________________.
Результат: Титр фага =____________________
2. Титрование по методу Грациа
Из разведения 10 -6
количество негативных колоний -_______
Титр фага по Грациа – количество фаговых частиц на 1 мл.
Результат: титр фага по Грациа =______________________
49
Работа №8: Методы фагодиагностики:
1. Реакция фаголизиса. Исследуемый материал засевается на чашке
газоном, наносится капля индикаторного фага, чашка располагается
под наклоном и инкубируется. Если есть соответствующий возбудитель,
то _______________________________.
бактериофаг
стерильная дорожка
Заключение:_________________________________________
__________________________________________________________
2. Реакция фаготипирования стафилококков – проводится с чистой
культурой на III этапе исследования для определения фаговара.
Стафилококки засевают на плотную среду газоном, дно чашки Петри
предварительно расчерчено на сектора, соответственно количеству
типовых фагов. В каждый сектор вносят по капле типового фага.
Инкубируют. Фаготип культуры определяют по месту фаголизиса.
фаг 29
фаг 52
фаг 47
фаг 80
Заключение: ___________________________________________
Реакция
фаготипирования
стафилококков
установления источника инфекции.
50
используется
для
Работа № 9: Диагностические и лечебно-профилактические фаги.
Диагностические фаги:
1)___________________________для_____________________________;
2)______________________________для__________________________
___________________________________
Лечебно-профилактические:
1)__________________________________
2)__________________________________
Вопросы для самоконтроля:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
Что такое провирус и профаг?
Что такое фаги?
Виды бактериофагов.
Микроскопические методы индикации вирусов.
Определение количества фага.
Исходы взаимодействия вируса с клеткой.
Что представляют собой однослойные культуры клеток?
Какие бывают культуры клеток?
Что такое вирогения и лизогения?
Типы взаимодействия вируса с клеткой.
Как культивируют вирусы?
Основная форма и структура фагов.
Что принимают за титр фага по Аппельману?
Какая стадия взаимодействия отсутствует у фагов?
Питательные среды, используемые в вирусологии.
Для чего в вирусологии используются питательные среды?
Первичные, перевиваемые и полуперевиваемые культуры клеток.
Методы индикации вирусов.
Что означает фагодиагностика?
Как выходят из клетки простые и сложные вирусы?
Компоненты РГА и РГадс.
Индикация вирусов с применением культур клеток.
Что такое эпидемическое маркирование?
Как проникают фаги в клетку?
Методы титрования фага.
Чем заканчивается интегративный тип взаимодействия вируса?
Как можно определить количество вирусов?
Как культивируют бактериофаги?
.Что представляют собой однослойные культуры клеток?
Как проникают вирусы в клетку?
51
Дополнительная информация.
52
Лабораторное занятие №8.
Тема: КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ: «ФИЗИОЛОГИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ». УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ
РАБОТА СТУДЕНТОВ - УИРС.
Цель: контроль усвоения теоретического материала и практических
навыков по разделу: «Физиология микроорганизмов».
УИРС 1 этап.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
Теоретические вопросы и вопросы для самоподготовки
к занятиям №№ 5-7.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Ответить на 20 вопросов ЭВМ-контроля или по теме.
2. Каждому студенту рассказать о препарате, предложенном
преподавателем:
состав, принцип работы и применение питательных сред - Ру,
Левенштейна-Йенсена, Эндо, Левина, Плоскирева, Олькеницкого,
Раппопорта, Китта-Тароцци, Вильсона-Блера, Игла, 199;
характер роста бактерий на жидких и плотных средах, «пестрый ряд»;
применение, постановка и учет методов Фортнера, Горовец-Власовой,
Перетца, Аппельмана, Грациа, использование трубок Вейон-Виньяля,
культур клеток - фибробластов, HeLa;
оценить методы индикации вирусов - РГА, ЦПД, «цветная проба»,
включения;
применение, постановка и учет реакций фаголизиса и фаготипирования,
получение и применение бактериофагов.
3. УИРС - I этап:
1) – посев-отпечаток большого пальца на среду Эндо,
2)– посеять волос на МПА,
3)– посев тампоном мазка из носа на ЖСА.
У всех посевов подписать свой номер и поместить в термостат.
53
РАЗДЕЛ 3. ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Лабораторное занятие № 9.
Тема: МИКРОФЛОРА ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА. САНИТАРНАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ. УИРС II ЭТАП.
Цель: усвоить основные принципы исследования микрофлоры тела
человека и внешней среды. Провести II этап УИРС.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Нормальная микрофлора тела человека, значение. Микробиоценоз
различных биотопов тела.
2. Дисбиозы, характеристика, причины возникновения. Препараты для
восстановления нормальной микрофлоры: пробиотики.
3. Учение о санитарно-показательных микроорганизмах. Микрофлора
воздуха и методы ее исследования и оценки. Инфекции,
передающиеся через воздух.
4. Методы санитарно-бактериологического исследования воды,
показатели ее качества. Заболевания, передающиеся через воду.
5. Вирусы, циркулирующие в сточной воде, методы индикации.
6. Санитарно-микробиологическое исследование почвы. Почва, как
фактор передачи инфекционных заболеваний.
7. Санитарно-микробиологическое
исследование
предметов
окружающей среды (рук, инвентаря, оборудования). Контроль
хирургического и перевязочного материала на стерильность.
8. Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов
(мясо, молоко, консервы).
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Приготовить мазок из зубного налета, окрасить по Граму,
промикроскопировать, зарисовать и подписать представителей
резидентной и транзиторной микрофлоры ротовой полости.
2. Изучить методику исследования испражнений на дисбиоз. Записать
основных представителей нормальной микрофлоры кишечника.
3. Описать состав и применение пробиотиков.
4. Описать методы изучения воздушной микрофлоры. Вычислить ОМЧ
воздуха в готовых посевах. Записать и оценить результат.
54
5. Подсчитать БГКП воды при исследовании методом мембранных
фильтров. Зарисовать, дать заключение.
6. Учесть и оценить результат посева водопроводной воды на висмутсульфитный агар.
7. УИРС: II этап работы
8. Уборка рабочего места.
9. Защита протокола.
Работа № 1: Мазок из зубного налета в окраске по Граму.
В ротовой полости выделяют более 100 видов бактерий: бактероиды,
бифидобактерии,
эубактерии,
фузобактерии,
лактобактерии,
актиномицеты, гемофильные палочки, лептотрихии, нейссерии,
спирохеты, стрептококки, стафилококки, вейлонеллы и др. Обнаруживаются
также грибы рода Candida и простейшие. Микрооранизмы нормальной
микрофлоры и продукты их жизнедеятельности образуют зубной налет.
Резидентная флора:
1.__________________
2.__________________
3._________________
4.__________________
5._________________
6.__________________
7.___________________
_
Транзиторная флора:
1._____________________
2._____________________
3._____________________
4._____________________
5._____________________
6._____________________
7._____________________
Работа №2: Методика исследования фекалий на дисбиоз.
Для анализа на дисбиоз 1 гр. испражнений разводят стерильным
физ.раствором 10-кратно до 10-12 степени. Из разных разведений
проводят высев на элективные и дифференциально-диагностические
среды: из разведения 10-1 по 0,1 мл высевают на селенитовый бульон
для _____________, среду Плоскирева – для______________________.
Из 10-3 – по 0,1 мл на среду Эндо для____________________ ЖСА –
для_________________, кровяной агар – для ____________________
_______, агар Сабуро – для_____________________, 10-1 и 10-3 – посев
по Щукевичу для____________________, на
МРС (молочнорастительная среда) для___________________________. 10-7 – 10-11 на
жидкую тиогликолевую среду для ___________________________.
55
Учет результатов в зависимости от скорости роста различных бактерий:
большинство микробов дают рост через сутки, стафилококки, грибы
родаCandida –через ____суток, лактобактрии – до ______ суток,
бифидобактерии – до ______ суток.
На плотных средах подсчитывают количество колоний одного вида,
делают перерасчет на 1 г, на жидких средах - степень разведения, при
котором еще растут бактерии. Полученные результаты сравнивают с
существующими нормами.
Бланк анализа при исследовании фекалий на дисбиоз
Бактерии
бифидобактерии
лактобактерии
эшерихии Lac+
эшерихии Lac ± и Lac эшерихии Hem +
протеи
клебсиеллы
прочие энтерорбактерии
стафилококк золотистый
другие виды стафилококков
энтерококки
грибы Candida
грибы плесневые
Норма
Количество в 1г
Работа №3: Пробиотики, пребиотики, синбиотики
1.
2.
3.
4.
5
6.
7.
8.
9.
10.
Механизм действия
Область применения
56
Работа №4: Методы изучения санитарного состояния воздуха:
Определение ОМЧ воздуха в готовых посевах.
1.Седиментационный – метод Коха
2. Аспирационный – с помощью аппаратов
Определение ОМЧ воздуха при использовании аппарата Кротова.
Среда:
Время работы аппарата:
Скорость работы аппарата:
Количество колоний:
Учет: ОМЧ воздуха бак.лаборатории =
Заключение:
ГОСТ для воздуха
Работа №5: Определение БГКП воды при исследовании методом
мембранных фильтров.
Объем воды
фильтр
Количество Lac+ колоний:
Эндо
Учет: 1 БГКП содержится в
воды.
Заключение:
ГОСТ Р 512332-98 для воды
57
Работа №6: Результат посева водопроводной воды на висмутсульфитный агар.
ВСА – это среда для
Заключение:
потому, что
Работа №7: УИРС II этап
Результаты посева:
А) волоса на МПА: - нет роста, есть рост (ОМЧ).
Колонии одного вида (величина, форма, цвет), несколько видов.
Приготовить мазки, окрасить по Граму, промикроскопировать,
зарисовать.
Б) отпечатка пальца на Эндо - нет роста, есть рост (ОМЧ).
Колонии одного вида (величина, форма, цвет), несколько видов.
Количество Лак + колоний
Приготовить мазки, окрасить по Граму,
промикроскопировать, зарисовать.
В) посева мазка из носа на ЖСА. - нет роста, есть рост (ОМЧ).
Количество лецитиназо(+) колоний. С них приготовить мазок по
Граму, промикроскопировать, зарисовать.
Поставить антибиотикограмму. Для этого приготовить взвесь данной
культуры в 0,5 мл физ.раствора и вылить ее на чашку с МПА. Пинцетом
наложить диски с антибиотиками, подписать свой номер. Сдать в
термостат.
Мазки в окраске по Граму со среды:
МПА
Эндо
ЖСА
Подпись преподавателя
58
Вопросы для самоконтроля:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Что такое экосистема?
Что такое микробиоценоз?
Что лежит в основе антагонизма бактерий?
Что такое комменсализм?
Что такое дисбиоз?
Причины развития дисбиозов?
Препараты, для лечения и профилактики дисбиоза кишечника.
Какие препараты относятся к пробиотикам?
Представители резидентной и транзиторной микрофлоры кожи.
Микрофлора полости рта: резидентная и транзиторная.
Микрофлора дыхательных путей.
Микрофлора толстого кишечника: резидентная и транзиторная.
По каким показателям оценивают санитарное состояние воздуха?
По каким показателям оценивают санитарное состояние
хирургического материала?
Санитарно-показательные микроорганизмы воды, методы их
определения.
Санитарно-показательные микроорганизмы почвы, методы их
определения.
Методы определения общего микробного числа (ОМЧ) воздуха,
воды, почвы, пищевых продуктов.
Методы и среды для определения БГКП в воде, молоке, мясе,
почве.
ГОСТы для воздуха различных помещений, питьевой воды,
молочных продуктов.
Заболевания, передающиеся через воздух, воду, пищевые
продукты, почву, предметы обихода.
59
Дополнительная информация.
60
Лабораторное занятие № 10
Тема: ВЛИЯНИЕ НА МИКРООРГАНИЗМЫ ФИЗИЧЕСКИХ
И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ. АНТИБИОТИКИ И ХИМИОПРЕПАРАТЫ.
Цель: усвоить получение и применение химиотерапевтических
веществ, дезинфектантов, антисептиков и антибиотиков.
Уметь определять чувствительность бактерий к антибиотикам.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы.
Асептика и антисептика.
2. Понятие о стерилизации и дезинфекции. Способы стерилизации,
аппаратура.
3. Понятие о химиотерапии и химиотерапевтических препаратах.
История их открытия.
4. А. Флеминг, Г. Флори, Э. Чейн, З. Ермольева. Антибиотики:
классификация по источнику и способу получения.
5. Классификация антибиотиков по химической природе, механизму и
спектру действия.
6. Осложнения антибиотикотерапии. Их предупреждение.
7. Механизмы лекарственной устойчивости бактерий, пути ее
преодоления.
8. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
9. Принципы рациональной антибиотикотерапии.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Познакомиться с правилами подготовки посуды к стерилизации, с
устройством и режимом работы автоклава, сухожарового шкафа,
другой аппаратуры.
2. Усвоить принцип работы и применение фильтра Зейтца, свечей
Шамберлана и Беркефельда.
3. Дать заключение о действии фитонцидов чеснока на рост
микроорганизмов.
4. УИРС 3 этап: оценить результаты антибиотикограммы - дать
заключение о чувствительности стафилококков к антибиотикам,
зарисовать.
5. Оценить чувствительность бактерий к антибиотикам методом
серийных разведений, определить МИК, зарисовать.
6. Уборка рабочего места.
7. Отчет по протоколу.
61
Работа №1: Правила подготовки посуды к стерилизации.
Устройство и режим работы автоклава и сухожарового шкафа.
1. Подготовка посуды к стерилизации.
Посуда должна быть тщательно вымыта и просушена.
1. Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми
пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки (кроме
пробирок). Резиновые, корковые, стеклянные пробки стерилизуют
отдельно.
2. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1-5 штук.
3. Пипетки заворачивают в бумагу по 5-15 штук, предварительно
поместив в верхнюю часть предохранительную вату.
2.Устройство и режим работы автоклава.
В
автоклаве
производят
стерилизацию
с
помощью
_____________________________________________________
Автоклав состоит из 2 котлов, вставленных один в другой, кожуха и
крышки (или двери). Наружный котел – водопаровая камера,
внутренний – стерилизационная камера. Крышка (дверь) герметически
привинчивается к кожуху.
Снаружи имеются манометр, предохранительный клапан, воздушный и
конденсационный краны. Манометр служит для определения давления,
создаваемого паром. Работать с автоклавом может только специально
обученный специалист.
Режим автоклавирования
Стерилизуемый материал
62
давление
температура
время
(кратность)
3. Устройство и режим работы сухожарового шкафа
(печи Пастера).
Шкаф с двойными стенками, изготовленный из термостойких
материалов: металла и асбеста. Для контроля температуры имеется
термометр, вставленный в отверстие верхней стенки шкафа.
Стерилизуемый материал располагают на полках шкафа так, чтобы он
не соприкасался со стенками. Началом стерилизации считается подъем
до нужной температуры.
Режим стерилизации зависит от
стерилизуемого материала и выбранной температуры, например при
. Материал вынимают только после полного охлаждения
шкафа. Сухим жаром стерилизуют:
.
Работа №2: Принцип работы и применение бактериальных
фильтров (Зейтца, Шамберлана, Беркефельда).
Фильтры Зейтца пластинки толщиной 3-5 мм. Перед
употреблением их монтируют в прибор Зейтца и вместе с ним
стерилизуют в автоклаве. Используются однократно.
Мембранные фильтры из
толщиной 0,1мм с
различной величиной пор (0,3-1,2 мкм). Стерилизуются кипячением и
помещают в аппарат перед работой.
Фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда представляют
собой полые цилиндры, закрытые с одного конца. 1-й изготовлен из
2-й – из
.
Фильтры закрепляют
вставляют в колбу Бунзена.
в
специальном
держателе,
который
Работа №3: Дать заключение о действии фитонцидов чеснока на
рост микроорганизмов.
патогенный стафилококк
долька чеснока
зона задержки роста=
Заключение: фитонциды относятся к
63
Работа №4: УИРС 3 этап: Результаты антибиотикограммы
патогенного стафилококка.
Заключение: Для лечения рекомендуются антибиотики _____________
____________________________________________________________
Работа №5: Определение чувствительности бактерий к
антибиотикам методом серийных разведений (определение МИК).
Метод серийных разведений позволяет по минимальной
ингибирующей концентрации (МИК) рассчитать терапевтическую дозу.
В 2- кратные разведения антибиотика в МПБ с 256 мкг/мл
(ЕД/мл) и далее добавляют по 1 мл культуры микроба, инкубируют 20
часов в термостате.
256
178
89
44,5
22,25
11,13
КА
КК
Минимальная ингибирующая концентрация данного антибиотика – то
наибольшее разведение, при котором
Заключение: МИК данного антибиотика для данной культуры =
Подпись преподавателя
64
Вопросы для самоконтроля:
1. Понятие об асептике, антисептиеа, дезинфекции, стерилизации?
2. Характер воздействия на бактерии лучистой энергии: УФО,
Рентгена, микроволновых лучей и др.
3. Что стерилизуют действием лучистой энергии?
4. Механические способы стерилизации.
5. Какие существуют фильтры и что с их помощью стерилизуют?
6. Термические способы стерилизации, конкретное применение.
7. Методы дробной стерилизации и когда они применяются?
8. Принцип работы печи Пастера, режим, стерилизуемый материал.
9. Принцип работы автоклава, режимы для различного материала.
10. Пастеризация, тиндализация, режимы, стерилизуемый материал.
11. Химические способы стерилизации.
12. Классификация химических веществ по действию на белок.
13. Основные дезинфектанты, механизм их действия.
14. Основные антисептики, механизм их действия.
15. Какие химические вещества являются окислителями белков?
16. Основные группы лекарственных химиопрепаратов, представители.
17. Какие препараты относятся к антиметаболитам?
18. Механизм действия сульфаниламидов и хинолонов.
19. Противоопухолевые химиопрепараты, механизм действия.
20. Основы классификации антибиотиков.
21. Характеристика антибиотиков.
22. Антибиотики, продуцируемые грибами, актиномицетами,
бактериями.
23. Беталактамы, тетрациклины, макролиды, аминогликозиды,
полиеновые, ароматические и другие группы антибиотиков:
механизмы их действия.
24. Антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки.
25. Антибиотики, нарушающие функции мембран (ЦПМ) бактерий.
26. Антибиотики, ингибирующие синтез белка бактерий.
27. Осложнения антибиотикотерапии.
28. Методы борьбы с антибиотикорезистентностью бактерий.
29. Методы рациональной антибиотикотерапии.
30. Методы определение чувствительности бактерий к антибиотикам.
65
Дополнительная информация.
66
РАЗДЕЛ 4. ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ.
Лабораторное занятие № 11.
Тема: ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ И ВИРУСОВ. МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛАМ: «ЭКОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА
БАКТЕРИЙ».
Цель: усвоить основные принципы генетики микроорганизмов, ее
практическое использование, получение и применение
вакцинных штаммов микроорганизмов. Оценить степень
усвоения теоретического и практического материала по
пройденным разделам.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
1. Геном бактерий. Генотип и фенотип. Виды изменчивости.
2. Плазмиды бактерий, их функции и свойства. Использование
плазмид в генной инженерии.
3. Передача наследственного материала у бактерий. Подвижные
генетические элементы: транспозоны и IS- элементы, их роль в
эволюции бактерий.
4. Молекулярно- биологические методы, используемые в диагностике
инфекционных заболеваний: ПЦР, рестрикционный анализ и др.
5. Медицинская биотехнология, ее задачи и достижения.
6. Генетика вирусов.
7. Теоретические и практические вопросы, занятий №№ 9 -11.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
1. Изучить влияние фенола на фенотип протея, зарисовать и дать
заключение.
2. По готовой демонстрации описать свойства R и S –формы колоний.
3. Зарисовать схему постановки и результаты опытов по генетическим
рекомбинациям: трансформации, трансдукции и конъюгации.
4. Оценить и
зарисовать
результат действия акридинового
оранжевого на антибиотико-резистентность культуры..
5. Описать методы получения вакцин: БЦЖ, антирабической,
сибиреязвенной, энджерикс В.
6. Изучить и записать принцип постановки и учета полимеразноцепной реакции (ПЦР).
7. Ответить на 20 вопросов ЭВМ - тестирования, включающих
теоретические и практические аспекты раздела.
8. Уборка рабочего места.
67
Работа №1: Влияние фенола на фенотип протея
(посев по Шукевичу)
МПА
Результат:
Заключение:
с фенолом
МПА
Работа №2: Cвойства S и R –форм колоний.
Свойства
Форма
S-колонии
R-колонии
Жгутики
Капсула
Биохимические
Антигенные
Вирулентные
Работа №3: Генетические рекомбинации:
схемы постановки опытов и учет результатов.
Трансформация –это
донор
реципиент
смесь
Селективная среда
Заключение:
68
Трансдукция- это
донор
реципиент
смесь
Селективная среда
Заключение
Конъюгация – это
донор
реципиент
смесь
Селективная среда
.
Заключение:
69
Работа №4: Действие акридинового оранжевого
на резистентность культуры к антибиотикам
Исходная культура
культура, обработанная
акридиновым оранжевым
Результат: по результатам антибиотикограммы исходная культура
обладает
.
После
обработки
культуры
акридиновым
оранжевым
антибиотикограмма показала
что говорит о
.
Заключение: Множественная лекарственная устойчивость культуры
была связана с
, потому, что
.
Работа 5:Генетические основы получения вакцин:
противотуберкулезной, антирабической, против гепатита В.
1. Вакцина БЦЖ (BCG)
3. Антирабическая вакцина
3. Вакцина Энджерикс В
70
Работа 6:Полимеразно-цепная реакция (ПЦР)
и рестрикционный анализ.
ПЦР в основе имеет 3 этапа:
а)
б)
в)
Основной этап –
проводится в аппарате
, где
имеются комплементарные праймеры, полимеразы и нуклеотиды, а
также задается определенный температурный и временной режим. Цикл
может задаваться
раз, в результате чего образуются миллионы
копий исходной ДНК.
Последний этап проводится с помощью
Рестрикционный анализ основан на
Сравнивая полученные нуклеотиды изучаемой ДНК с нуклеотидами
контрольной ДНК (известного возбудителя), можно говорить об
идентичности или различии возбудителей.
Работа №7: Коллоквиум по пройденным разделам.
Ответить на 20 вопросов, включающих теоретические знания и
практические навыки.
Подпись преподавателя
71
Вопросы для самоконтроля:
1. Отличительные особенности генотипа бактерий.
2. Внехромосомные факторы наследственности.
3. Что такое плазмиды, их функции и роль. Виды плазмид.
4. За что отвечают R - , F -, Col-, Tox-, Hem- плазмиды?
5. Отличия транспозонов от IS- элементов.
6. Что такое модификационная изменчивость, виды?
7. Что лежит в основе адаптационных реакций бактерий?
8. Особенности фенотипической изменчивости бактерий?
9. Что такое мутационная изменчивость, виды?
10. Особенности генотипической изменчивости бактерий?
11. Что такое рекомбинационная изменчивость, виды?
12. Что лежит в основе трансдукции, трансформации, конъюгации?
13. Что используют для постановки опытов трансдукции,
трансформации, конъюгации?
14. Что такое репарация, механизм, виды, значение.
15. Виды фенотипической изменчивости вирусов.
16. Примеры генотипической изменчивости вирусов.
17. Что такое диссоциация, ее значение?
18. Материальная основа наследственности вирусов.
19. Основные этапы полимеразной цепной реакции (ПЦР).
20. Что представляет собой амплификация?
21. Принцип постановки и назначение рестрикционного анализа.
22. Основные задачи современной биотехнологии.
23. Основные принципы генной инженерии, применение.
24. Что лежало в основе получения противотуберкулезной вакцины?
25. Вакцины, полученные методом генной инженерии.
72
Дополнительная информация.
73
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА:
1. Борисов, Л.Б.Медицинская микробиология, вирусология, иммунология:
учебник / Л.Б.Борисов. - М.: ООО «Медицинское информационное
агентство», 2002. -736 с.
2. Букринская, А. Г. Вирусология /А.Г.Букринская.- М.: Медицина, 1986. 336 с.
3. Букринская, А.Г. Молекулярные основы патогенности вирусов / А.Г.
Букринская,. В.М.- Жданов. - М.: Медицина, 1991. -235 с.
4. Вирусология: в 3-х т. /под ред Б. Филда, Д.Найна. – М.: Мир, 1989.
5. Медицинская
микробиология
/
под
ред.
В.И.Покровского,
О.К.Поздеева. - М.:ГОЭТАР МЕДИЦИНА, 1999.-1200 с.
6. Медицинская микробиология: учеб. Пособие / под. ред. А.М.Королюка
и В.Б.Сбойчакова. - СПб.,1999. - 272 с.
7. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: учебник.
/ под ред Л.Б.Борисова, А.М.Смирновой. - М.: Медицина, 1994. - 528с.
8. Микробиология: учебник./ А..А.Воробьев [и др.]; под ред.
А..А.Воробьева. - М.:Медицина, 1998. - 336 с.
9. Руководство
к
лабораторным
занятиям
по
медицинской
микробиологии, вирусологии, иммунологии / под ред. Л.Б.Борисова. М.:Медицина,1993.-240 с.
10. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам
исследования / под. ред. М.О.Биргера. - М.:Медицина, 1982. - 462 с.
74
СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
Раздел 1. Морфология микроорганизмов.
Лабораторное занятие №1:
Микробиологическая лаборатория.Формы бактерий. Простые методы
окраски.
............
3
Лабораторное занятие №2:
Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски
11
Лабораторное занятие №3:
Особенности строения различных групп микроорганизмов.
Методы их изучения.
. . . . . . . . . . . . . 19
Лабораторное занятие №4: Коллоквиум по разделу
«Морфология микроорганизмов» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
Раздел 2. Физиология микроорганизмов
Лабораторное занятие №5:
Питание, дыхание рост и размножение бактерий.
Культивирование и выделение чистой культуры аэробов . . . . . . . . . 26
Лабораторное занятие № 6:
Биохимические свойства бактерий. Методы культивирования и схема
выделения чистой культуры анаэробов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .33
Лабораторное занятие №7:
Культивирование и индикация вирусов. Бактериофаги . .. . . . . . . . . . . 42
Лабораторное занятие №8:
«Коллоквиум по разделу «Физиология микроорганизмов».
Учебно-исследовательская работа студентов . . . . . . . . . . . . . 52
Раздел 3: Экология микроорганизмов . . .
Лабораторное занятие №9:
Микрофлора тела человека. Санитарная микробиология.
УИРС II этап
. . . . . . . . . . . . . . . . 53
75
Лабораторное занятие № 10: Влияние на микроорганизмы физических и
химических факторов. Антибиотики и химиопрепараты . . . . . . . .
. . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . 60
Раздел 4. Генетика микроорганизмов . . . . . . . . . . . . . . . . .66
Лабораторное занятие №11:
Генетика бактерий и вирусов. Молекулярно-биологические
методы диагностики инфекционных заболеваний. Коллоквиум по
разделам «Экология и генетика микроорганизмов» . . . . . . . . . . . . . . .66
5. Рекомендуемая литература . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . .74
76