На правах рукописи ХАЛИУЛЛИН ТИМУР ОСКАРОВИЧ ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОИЗВОДСТВА МНОГОСЛОЙНЫХ
advertisement
На правах рукописи ХАЛИУЛЛИН ТИМУР ОСКАРОВИЧ ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОИЗВОДСТВА МНОГОСЛОЙНЫХ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК С ИЗУЧЕНИЕМ МЕДИКОБИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ФАКТИЧЕСКИХ ИНГАЛЯЦИОННЫХ ЭКСПОЗИЦИЙ Специальность 14.02.01 – гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Казань – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель: Фатхутдинова Лилия Минвагизовна, доктор медицинских наук, профессор Научный консультант: Шведова Анна Александровна, доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты: Галлямов Альберт Бариевич – доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой общей гигиены с курсом радиационной гигиены Ткачева Татьяна Анатольевна – доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт медицины труда" Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией токсикологии Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится «___»________________2013 г. в ____часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России (420012 г.Казань, ул.Бутлерова, 49). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России (420012 г.Казань, ул.Бутлерова, 49б). Автореферат разослан «___»________________2013 г. И.О. ученого секретаря диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Ситдикова Ирина Дмитриевна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы и степень её разработки. Углеродная нанотрубка (УНТ) представляет собой свернутый в один или несколько слоев лист графена, который, в свою очередь, является двумерным кристаллом, состоящим из одиночного слоя атомов углерода, собранных в гексагональную решётку. В зависимости от количества структурообразующих слоев выделяют одно- и многослойные углеродные нанотрубки (ОУНТ и МУНТ). Эти наночастицы обладают уникальными физико-химическими свойствами. Они чрезвычайно устойчивы к механическим нагрузкам (Peng et al., 2008), могут являться как проводниками, так и полупроводниками, в зависимости от формы структурообразующего листа графена, обладают хорошей теплопроводностью, способны поглощать некоторые виды электромагнитных излучений. Спектр возможного применения этих наночастиц весьма широк – по прочностным характеристикам они превосходят сталь и кевлар, обладают высокой тепло- и электропроводностью. В мире наблюдается значительный рост предприятий, производящих и использующих готовые УНТ, a их мировой рынок достиг $192 миллионов в 2011 году. Динамика рынка дает основания предполагать рост до $527 миллионов долларов в 2016 году со среднегодовым темпом 22,4% (BCCresearch.com, 2011). В России существует несколько малых предприятийпроизводителей МУНТ – в Тамбове, во Владимире, Новосибирске, Казани, Калининграде, однако их количество будет увеличиваться в связи с ростом спроса на продукцию. Волокнистая структура углеродных нанотрубок может обуславливать патогенность, свойственную минеральным волокнам (Shvedova et al., 2008, Kanno et al., 2010, Kim et al., 2012, Morimoto et al., 2013). С другой стороны, обладая высокой удельной поверхностью и большей проникающей способностью, наночастицы гораздо более реактогенны, чем частицы микродиапазона и способны генерировать активные формы кислорода в больших количествах (Nel et al., 2006). 3 Вышеперечисленные обстоятельства обуславливают необходимость опережающих исследований биологических эффектов УНТ и изучения потенциально вредного для человека воздействия. Накопленные данные дают основания предположить наличие риска здоровью людей, имеющих производственный контакт с углеродными наночастицами (Shvedova et al., 2005, Donaldson et al., 2006, Poland et al., 2008, Mercer et al., 2013, Kato et al., 2013, Snyder-Talkington et al., 2013). Остро встают вопросы оценки производственных экспозиций, выбора методов оценки состояния здоровья, проведения медицинских осмотров и предотвращения потенциально вредного воздействия на здоровье. Обычные гравиметрические методики малоприменимы для исследования аэрозолей УНТ. Проблемы с методологической базой привели к тому, что сведений о реальных производственных экспозициях крайне мало, а по российским производствам этих данных совсем нет. Относительная закрытость новой отрасли, отсутствие информации об адекватных биомаркерах ограничивают исследования медико-биологических эффектов рамками лабораторных экспериментов in vitro и in vivo. Таким образом, актуальность исследования определяется ростом рынка МУНТ, в связи с чем увеличивается популяция лиц, подверженных производственной экспозиции; отсутствием унифицированных подходов к гигиенической оценке экспозиции к МУНТ; недостатком информации о медико-биологическом действии МУНТ на человека, что не позволяет разрабатывать эффективные профилактические программы для сохранения здоровья работников. Цель исследования: гигиеническая оценка экспозиции к промышленным многослойным углеродным нанотрубкам с установлением медико-биологических эффектов фактических ингаляционных экспозиций. В соответствии с целью ставились следующие задачи: 1. Гигиеническая оценка рабочих мест на предприятиях-производителях МУНТ и инструментальная оценка экспозиции к МУНТ на рабочих местах. 2. Изучение биологических эффектов легочной экспозиции к промышленным МУНТ в аспирационном эксперименте на мышах в дозах, соответствующих экспозиционному сценарию на рабочих местах. 4 3. Определение биологических механизмов действия промышленных МУНТ в культурах клеток макрофагов и бронхиального эпителия. 4. Оценка воздействия аэрозолей МУНТ на здоровье работников в ходе панельного исследования с применением биомаркеров, отобранных на основе предшествующего эксперимента in vivo. 5. Разработка гигиенических рекомендаций по охране здоровья лиц, занятых в производстве и применении МУНТ. Научная новизна исследования. Изучены экспозиционные сценарии на рабочих местах предприятий-производителей МУНТ, доказано присутствие агломератов МУНТ в воздухе рабочей зоны, определены максимальные разовые и среднесменные концентрации аэрозоля МУНТ. Установлено, что нативные (неочищенные) МУНТ в дозах, релевантных реальной производственной экспозиции, вызвали развитие локального воспаления, индукцию оксидативного стресса и разрастание соединительной ткани (фиброз) в легких мышей. Выявлен профиброгенный эффект МУНТ в группе экспонированных работников. Предложены биомаркеры (TGF-β, KL-6) и биологические среды (кровь, индуцированная мокрота) для осуществления медицинского наблюдения за лицами, работающими в контакте с аэрозолем МУНТ. Практическая и научная значимость результатов исследования По результатам исследования разработаны «Методические рекомендации по контролю содержания УНТ в воздухе рабочей зоны» (утверждены Научным Советом РАМН 45 по медико-экологическим проблемам здоровья работающих в 2013 г). Результаты исследования способствуют выполнению актуальной гигиенической задачи сохранения здоровья трудоспособного населения и могут быть использованы для планирования, подготовки и проведения гигиенических, токсикологических экспериментов, а также эпидемиологических исследований среди работников предприятий, имеющих контакт с МУНТ. 5 Внедрение результатов исследования На предприятии ООО «Нанотехцентр», г.Тамбов внедрена система контроля содержания МУНТ в воздухе рабочей зоны и биомониторинга работников. (акт внедрения от 18.09.2013). Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах общей гигиены и гигиены, медицины труда ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» Минздрава России (акты внедрения от 6.09.2013 и от 23.10.2013). Личный вклад автора. Автором составлен план исследования, проанализированы литературные источники по проблеме, проведена гигиеническая оценка и отобраны пробы воздуха на рабочих местах предприятий-производителей МУНТ. Термооптический анализ и просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) проводились в лаборатории Национального института охраны и медицины труда (г.Цинциннати, США)1. Автором самостоятельно выполнены эксперименты in vivo и in vitro2, проведено анкетирование работников предприятийпроизводителей, организован отбор биологических проб3, выполнены ИФА и проточная флоуцитометрия образцов4, проведен статистический анализ в среде R5. Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на VIII Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (25-27 ноября 2009 г., г.Москва), Республиканской научно-практической конференции «Идель» (24-26 февраля 2010 г., г.Казань), XV-XVIII Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (г.Казань, 2010-2013), XI международной Диссертант выражает благодарность доктору Э.М.Бирч за выполненные лабораторные исследования. 2 Диссертант выражает благодарность Е.Р. Кисиной, Э. Мюррэй, к.м.н. А.В. Ткачу, доктору В. Кастранове (Национальный институт охраны и медицины труда, г.Моргантаун, США) за оказанную поддержку в ходе проведения исследования в рамках стажировки по гранту МОиН РТ «Алгарыш» в 2011-2012 гг. 3 Пробы отбирались обученным средним медицинским персоналом (И.И.Мухаметшина). 4 Диссертант выражает благодарность д.м.н., проф. И.Г. Мустафину и д.м.н., с.н.с. И.Х.Валеевой (ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» Минздрава России) за оказанную поддержку в ходе проведения исследования. 5 Диссертант выражает благодарность д.б.н., проф. В.К. Шитикову (Российская академия наук. Институт экологии Волжского бассейна, г.Тольятти) и д.б.н., проф. Савельеву А.А. (Институт экологии ГБОУ ВПО «Казанский (Поволжский) федеральный университет» Минобрнауки РФ) за консультативную помощь. 1 6 научно-практической конференции «Нанотехнологии в промышленности» (8–9 декабря 2010 года, г. Казань), Международной конференции Nanomaterials and Worker Health: Medical Surveillance, Exposure Registries, and Epidemiologic Research. (21-23 Июля 2010 г., г.Кистоун США), Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Связь заболеваний с профессией» (19-20 мая 2011 г., г.Казань), 5-й международной конференции «NanoEHS 2011» (9-12 августа 2011 г., г.Бостон, США), 51-й конференции Американского Общества Токсикологов «SOT 2012 Meeting» (11-15 марта 2012 г., г.Сан-Франциско, США), 6-й Международной конференции по нанотоксикологии «Nanotoxicology 2012» (4–7 сентября, Пекин, Китай), Международном конгрессе по безопасности искусственных наночастиц «SENN2012» (28-31 октября 2012 г., г.Хельсинки, Финляндия), IV Международном Казанском инновационном нанотехнологическом форуме NANOTECH‘2012 (27-29 ноября 2012 г.), II Международной школе-конференции «ANNT 2013» (15-19 августа 2013 г., г.Листвянка, Иркутская область), Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики» (23-26 сентября 2013 г., г.Казань) Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 27 рисунков, 1 схему и состоит из введения, литературного обзора, методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и внедрения, списка литературы, содержащего 142 источника (в том числе 22 отечественных и 120 зарубежных авторов), 4 приложений. Положения, выносимые на защиту: 1. МУНТ обнаруживаются в воздухе рабочих зон предприятия-производителя на основных этапах технологического процесса и в нерабочее время. Максимальная разовая концентрация МУНТ в воздухе рабочей зоны достигает 157,77 мкг/м3. Рассчитанные индивидуальные средневзвешенные концентрации респирабельной фракции – 4,58-6,96 мкг/м3. 2. Легочная экспозиция к МУНТ может повышать риск развития фиброгенных эффектов у человека. 7 3. Выявлены биомаркеры, которые могут быть использованы для оценки токсических эффектов МУНТ при легочной экспозиции у человека: TGF-b в сыворотке крови, KL-6 в индуцированной мокроте. Оценка цитокинового профиля (IL-1β и цитокины группы Th2) в различных биологических средах (кровь, индуцированная мокрота) является перспективным направлением дальнейших исследований. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Методология основана на комплексном применении гигиенических, токсикологических и эпидемиологических подходов. Для изучения биологических эффектов и воздействия на здоровье работников многослойных углеродных нанотрубок были выполнены гигиенические исследования на предприятиях, производящих МУНТ, токсикологические исследования in vivo на мышах и in vitrо с культурами клеток, а также панельное исследование (исследование на малом числе лиц с применением высокоточных методов и повторяющимися во времени измерениями) среди работников предприятий-производителей. В ходе анкетирования и интервьюирования специалистов различных предприятий отрасли наноиндустрии выявлялись производства и рабочие места, на которых возможен контакт с аэрозолем МУНТ. На двух отобранных предприятиях ООО «Нанотехцентр» (г. Тамбов) и лаборатории создания наноматериалов Владимирского государственного технологического университета (г. Владимир), использующих один тип реактора, была проведена гигиеническая оценка рабочих мест с определением участков технологического процесса, на которых возможна экспозиция к аэрозолю МУНТ. Производился одномоментный отбор проб воздуха6 на два типа фильтров (кварцевые фильтры и фильтры из смешанных эфиров целлюлозы) в точках предполагаемого контакта с аэрозолем МУНТ (по 16 проб, включая чистую комнату и отбор проб в нерабочее время) с циклоном и без него. Количество МУНТ в воздухе рабочей зоны определялось методом термооптического анализа (Birch et al., 2001) содержания элементного углерода в пробах. Исследования проводились на базе Испытательного лабораторного центра КГМУ, Аттестат аккредитации POCC RU.0001.515053, действителен до 19.10.2014 6 8 Визуализация МУНТ проводилась с помощью просвечивающей электронной микроскопии (на базе лаборатории NIOSH, г. Цинциннати, США). С помощью прибора Aerotrak 9000 в каждой из 8 точек были проведены замеры удельной площади поверхности частиц в воздухе рабочей зоны. Изучение биологических эффектов воздействия образцов МУНТ проводилось на мышах линии C57BL/6, а также в культурах клеток макрофагов RAW 264.7, клеток бронхиального эпителия BEAS-2B. Опыты проводились на базе лаборатории HELD Национального института охраны и медицины труда (г. Моргантаун, США) Для эксперимента было взято 160 животных, составивших 1 контрольную и 3 опытных группы (20, 40, 80 мкг/мышь). Затравка осуществлялась методом фарингеальной аспирации. Мыши подвергались эвтаназии на 1, 7, 28 и 56 дни. В бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) оценивались локальное воспаление (количество полиморфноядерных нейтрофилов, IL-6, MCP-1, TNF-α), маркеры повреждения тканей легкого (лактатдегидрогеназа (ЛДГ), общий белок). В сыворотке крови измерялось содержание биомаркеров фиброза (TGF-β, остеопонтин), микроскопически в срезах легких выявлялись гистопатологические изменения. Для проведения in vitro исследования были взяты две линии клеток: трансформированные мышиные макрофаги RAW 264.7 и иммортализованные клетки нормального человеческого бронхиального эпителия BEAS-2B. МУНТ вносились в культуры клеток в концентрациях 0.02, 0.2, 2.4 и 24 мкг на см2 поверхности монослоя (0.1, 1, 10, 100 мкг/мл среды). Жизнеспособность клеток оценивалась методом флюоресценции, в культурах непосредственно в среде измерялись уровни ЛДГ, а в лизатах – содержание внутриклеточного глутатиона. Для изучения воздействия аэрозолей МУНТ на здоровье работников было организовано панельное исследование. 11 человек, имевших стаж работы в контакте с аэрозолем МУНТ более 1 года, составили экспозиционную группу; в контрольную группу вошло 14 человек. 2 раза с интервалом в 1 год отбирались пробы крови, назального лаважа, единожды – индуцированной мокроты, в которых затем оценивалось содержание маркеров фиброза TGF-1, KL-6 и остеопонтина, а также 9 цитокиновый профиль. Выбор биомаркеров и биологических сред опирался на данные предшествующего in vivo исследования. Статистический анализ результатов проводился с использованием статистической среды R. Данные экспериментов in vivo и in vitro обрабатывался с использованием t-теста для парных и непарных случаев. В панельном исследовании для оценки связи между фактором «наличие/отсутствие экспозиции» и уровнем биомаркеров (возраст, пол, курение рассматривались в качестве кофаундеров) среди работников создавались обобщенные линейные модели второго уровня, включавшие главные эффекты и попарные взаимодействия; модели выбирались методами последовательного исключения с оценкой критерия информации Акайке (AIC) и полного перебора, а также бутстреп-анализа (Шитиков и соавт., 2013). Построенные модели верифицировались методами теста отношения правдоподобия и дисперсионного анализа. Результаты исследования Настоящее исследование фактически является первым, в котором приводятся данные реальных экспозиций к МУНТ на рабочих местах. Предыдущими авторами изучались концентрации ОУНТ и углеродных нановолокон. В отличие от более ранних исследований, в нашем эксперименте на мышах использовались нативные промышленные МУНТ, взятые непосредственно у предприятияпроизводителя, а выбор затравочных доз основывался на расчете депонированных доз с учетом фактических ингаляционных экспозиций на рабочих местах. В ходе гигиенической оценки рабочих мест были выявлены основные участки производственного процесса, на которых имелась возможность контакта работников с аэрозолированными МУНТ: выгрузка/сбор синтезированных МУНТ из реактора; механическая дезинтеграция на электромельнице; упаковка и фасовка готового продукта; работа с МУНТ в условиях лаборатории. Максимальная разовая концентрация аэрозоля в воздухе рабочей зоны на различных участках технологического процесса достигала 157 мкг/м3. Рассчитанные средневзвешенные индивидуальные концентрации респирабельной фракции аэрозоля в зоне дыхания работника достигали 6,95 мкг/м3 (специалист участка нанотехнологий). Принимая во внимание рекомендованный NIOSH уровень воз10 действия – 1 мкг/м3 (NIOSH Current intelligence bulletin №65, 2013), следует признать неэффективность инженерно-технических решений на предприятии. Это свидетельствует о возможном риске здоровью в ходе длительного контакта с аэрозолем МУНТ. Просвечивающая электронная микроскопия показала наличие агломератов МУНТ с размерами от 0,5 до 10 мкм во всех в отобранных пробах (рис.1). Отдельных нанотрубок обнаружено не было. В отобранных в нерабочее время (выходной день) при выключенном оборудовании пробах воздуха также обнаруживались агломераты МУНТ Рис. 1 Агломерат МУНТ в воздухе рабочей зоны. Проба воздуха, отобранная в ходе сбора продукта из реактора. ПЭМ-изображение, увеличение в 200 тыс. раз В эксперименте in vivo у мышей через 24 часа после экспозиции наблюдалось значительное увеличение (p<0,05), по сравнению с контролем, количества нейтрофилов в БАЛ с повышением уровней ЛДГ, общего белка и ряда воспалительных цитокинов – IL-6, MCP-1, TNF-. С течением времени воспалительный ответ стих, но остаточные явления наблюдались вплоть до выхода из эксперимента. На 7-й день и во все последующие временные точки содержание общего белка, IL-6 и MCP-1 лишь незначительно превышало контрольные уровни. Количество нейтрофилов снижалось на протяжении эксперимента, достигнув на 56-й день в экспонированных группах 24% от общего числа клеток в БАЛ. Концентрации ЛДГ и TNF- немного снизи11 лись, но оставались достоверно выше контрольных значений в опытных группах (p<0,05). Уровень TGF- в сыворотке крови у всех экспонированных мышей увеличился спустя 24 часа и оставался повышенным вплоть до конца эксперимента, причем наблюдался прямой дозозависимый эффект – чем выше доза МУНТ, тем выше концентрация TGF-в сыворотке крови (рис.2А). Концентрация остеопонтина значительно повысилась в сыворотке экспонированных мышей к 28-му дню, но через 56 дней снизилась до контрольных значений (рис.2Б). А Б Рис. 2. А - содержание TGF-b в сыворотке крови мышей, пкг/мл. Б - содержание остеопонтина в сыворотке крови мышей, % от контрольного уровня. * - p<0,05 vs. контроль. На 28-й и 56-й дни гистологическая картина в легких характеризовалась наличием гранулем, в центре которых определялись агломерированные МУНТ, многочисленные альвеолярные макрофаги, гигантские клетки и фибробласты (рис.3). Окраска срезов легких трихромом по Массону выявила увеличение коли12 чества коллагеновых волокон с течением времени во всех опытных группах, такая же временная зависимость была обнаружена при колориметрическом определении коллагена в высушенных легких. Рис. 3. Окраска гистологического среза легкого трихромом по Массону, 40 мкг, 28 дней после экспозиции В лаважной жидкости через 2 месяца после затравки все еще наблюдались макрофаги с хорошо заметными включениями нанотрубок, что позволяет предполагать длительное депонирование и фиброгенный потенциал исследуемых МУНТ. Внесение МУНТ в культуры клеток RAW 264.7 привело к повреждению клеточных мембран, возникновению оксидативного стресса, что сопровождалось снижением уровня тиолов и белковых сульфгидрильных групп. В то же время в изучаемых границах доз однослойные УНТ вызвали гибель намного большего числа клеток, чем МУНТ в тех же концентрациях. Клетки бронхиального эпителия (BEAS-2B) оказались менее чувствительны к воздействию различных типов УНТ, чем макрофаги (RAW 264.7). Полученные по итогам панельного исследования данные позволяют предположить, что контакт с аэрозолем МУНТ на рабочих местах может приводить к изменению содержания некоторых маркеров фиброза в биологических средах. В 13 частности, содержание TGF- в сыворотке крови оказалось достоверно зависимым от экспозиции в условиях наилучшей модели7 ( = 10,47; 95%BCa = 1.18 – 51.75). Содержание KL-6 в сыворотке лиц экспозиционной и контрольной групп достоверно не отличалось, однако в мокроте были выявлены значительные различия. У экспонированных лиц содержание KL-6 в образцах мокроты было выше, чем в контрольной группе (β = 235,9; 95% BCa = 21,2-482). Экспрессия KL-6 часто наблюдается при различных заболеваниях легочной системы, в том числе сопровождающихся интерстициальными нарушениями и утолщением альвеолярных стенок. Остеопонтин не проявил себя в качестве информативного показателя. В пробах сыворотки крови, отобранных с интервалом в один год, цитокиновые профили экспонированной и контрольной групп достоверно не отличались друг от друга. Вариативность данных в двух временных точках может свидетельствовать об отсутствии системного воспалительного ответа в условиях имеющейся производственной экспозиции к МУНТ. В то же время, в образцах индуцированной мокроты достоверные различия обнаружились в содержании IL-1, который вовлечен во множество различных процессов, включая воспаление, клеточную дифференциацию, пролиферацию, апоптоз, миграцию фибробластов и образование гранулем. У экспонированных работников этот показатель оказался выше, чем в контрольной группе (=1030,9; 95% BCa = 19-1585). Эти результаты согласуются с данными Palomaki et al. (2013), которые показали, что иммунный ответ на введение МУНТ и асбеста в культуру макрофагов реализуется через NLRP3 инфламмосомы и секрецию IL-1, что может привести к развитию персистирующего локального воспаления и повреждение клеток, дополнительному рекрутингу макрофагов и нейтрофилов. Другой особенностью стала наблюдаемая тенденция повышенного содержания Th2 цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6) у экспонированной группы в ходе изучения локального ответа (назальный лаваж, индуцированная мокрота), что соотносится с недавними выводами, к которым пришли Ilves et al. (2013). Последние представили первые результаты ингаляционного эксперимента по изучению био7 Модель также включала в себя возраст и сочетанный эффект возраста и экспозиции. 14 логического действия ригидных МУНТ на мышах, включая значительное увеличение экспрессии Th2-цитокинов в тканях легких и аллергический ответ по типу бронхиальной астмы. В свете полученных результатов перспективным видится применение методов транскриптомики – идентификации матричных РНК и определение закономерностей экспрессии генов, кодирующих те или иные цитокины в клетках крови вместо прямой оценки содержания цитокинов, которое зачастую подвержено колебаниям, связанным с изменениями параметров окружающей среды. В настоящем исследовании были выявлены лишь изменения в биохимических профилях, без клинических и функциональных нарушений. Однако, принимая во внимание полученные данные, можно говорить о существовании риска негативных эффектов воздействия на здоровье экспонированных работников. Разработанные подходы могут использоваться для организации биомониторинга работников. ВЫВОДЫ 1. Производство МУНТ сопровождается образованием в воздухе аэрозоля МУНТ, на различных участках технологического процесса. Наиболее значимыми с точки зрения количественных характеристик аэрозоля являются: сбор продукта из реактора, упаковка продукта в мешки и контейнеры, механическая обработка готового продукта и лабораторные испытания. Частицы аэрозоля представляют собой в основном агломераты размерами 0,5 – 10 мкм, индивидуальных УНТ обнаружено не было. Для различных рабочих зон диапазон среднесменных концентраций респирабельной фракции аэрозоля МУНТ составил 0,54-6,11 мкг/м3, а индивидуальные средневзвешенные концентрации респирабельной фракции 4,586,96 мкг/м3. Кроме того, частицы МУНТ обнаруживались в воздухе рабочих помещений даже в нерабочее время, при выключенном оборудовании. 2. Эксперимент in vivo показал, что острая легочная экспозиция к промыш- ленным МУНТ в дозах, отражающих фактическую производственную экспозицию (20, 40, 80 мкг/мышь), вызывает дозо- и времязависимые повреждения и изменения в легких лабораторных животных, включающие развитие локального воспаления, развитие соединительной ткани (фиброз), а также индукцию оксида15 тивного стресса. Биомаркеры фибротических изменений (TGF-, остеопонтин), выявленные в сыворотке крови и в бронхоальвеолярном лаваже мышей в значительных количествах, могут быть использованы для оценки токсических эффектов МУНТ при легочной экспозиции у человека. 3. МУНТ, в отличие от ОУНТ, не приводят к гибели клеток, но вызывают по- вреждение клеточных мембран в эксперименте in vitro. RAW 264.7 макрофаги оказались более чувствительны к эффектам МУНТ, в сравнении с клетками бронхиального эпителия (BEAS-2b). 4. Контакт с МУНТ в производственных условиях может приводить к увели- чению содержания маркеров фиброза: TGF- в крови (=10,5; 95% BCa= 1,2– 51,7), KL-6 в индуцированной мокроте (=235,9; 95% BCa = 21,2-482), а также к повышению содержания цитокина IL-1 в образцах индуцированной мокроты (=1030,9; 95% BCa= 19-1585) и цитокинов группы Th2 в назальном лаваже. 5. Система профилактических мероприятий по предотвращению возможного вреда здоровью работников предприятий-производителей УНТ должна основываться на принципах разумной предосторожности в обращении с УНТ. Важными компонентами системы профилактики вредного воздействия являются: выбор закрытых технологических процессов на этапе проектирования, санитарнотехнические мероприятия, применение средств индивидуальной защиты, биомониторинг и медицинские осмотры работников. Необходимо осуществлять контроль содержания МУНТ в воздухе рабочей зоны с поддержанием концентраций наночастиц в воздухе на возможно низком достижимом уровне с учётом технологических и экономических факторов. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. С целью снижения риска здоровью работников в результате контакта с аэрозолем МУНТ на различных этапах технологического процесса необходим контроль содержания многослойных углеродных нанотрубок в воздухе на рабочих местах персонала предприятий-производителей. 2. Идентификацию и характеризацию углеродных нанотрубок в составе проб воздуха следует проводить методом ПЭМ. Массовую оценку (в мкг/м3) реко16 мендуется осуществлять в пробе, отобранной на кварцевый фильтр, методом термооптического анализа содержания элементного углерода в случае подтверждения наличия МУНТ в параллельной пробе (согласно данным ПЭМ). Превышение в воздухе рабочей зоны среднесменной концентрации элементного углерода в 1 мкг/м3 свидетельствует о неблагоприятных условиях труда на данном участке и требует принятия мер для снижения концентрации аэрозоля МУНТ. 3. Для ограничения контакта с аэрозолем МУНТ необходимо предусмотреть уменьшение количества операций с готовым продуктом, требующих непосредственного участия работника, автоматизацию операций технологического процесса, герметизацию оборудования, используемого для обработки, фасовки продукта, соблюдение принципа поточности в ходе производства и недопущение пересечения путей транспортировки материала, применение принципа санпропускника при проектировании производственных помещений. 4. В помещениях, где имеется выделение аэрозоля МУНТ в воздух рабочих зон, рекомендуется применение общеобменной приточно-вытяжной вентиляции с HEPA-фильтрацией и локальных вытяжных устройств с HEPA-фильтрами. 5. Работников предприятия необходимо обеспечить средствами защиты кожи, глаз и дыхательной системы. Для защиты органов дыхания необходимо использовать противоаэрозольные респираторы класса защиты FFP3 по классификации ЕС и РФ или 95/100 по американской классификации. 6. В Перечень вредных и (или) опасных производственных факторов, при наличии которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры, необходимо включить пункт «Углеродные нанотрубки» с периодичностью 1 раз в год, участием оториноларинголога, дерматовенеролога, онколога, аллерголога, проведением спирометрии, рентгенографии и биохимических анализов содержания маркеров фиброза (TGF-, остеопонтин) в сыворотке крови и индуцированной мокроте. 7. На предприятиях, производящих и применяющих МУНТ, рекомендуется проводить периодическое обучение рабочих и специалистов по вопросам охраны труда при работе в условиях контакта с аэрозолем углеродных нанотрубок. 17 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Фатхутдинова Л.М. Токсичность искусственных наночастиц. / Л.М. Фатхутдинова, Т.О. Халиуллин, Р.Р. Залялов // Казанский медицинский журнал. – 2009. – Т.XC. - №4. – С.578-584. 2. Халиуллин Т.О. «Проблемы гигиенической оценки аэрозолей наночастиц » / Т.О. Халиуллин, Р.Р. Залялов, Л.М. Фатхутдинова // Материалы VIII Всероссийского конгресса «Профессия и здоровье». – Москва, 2009. – С. 112 3. Фатхутдинова Л.М. Справочно-информационная система по безопасности нанотехнологий / Л.М. Фатхутдинова, Р.Р. Залялов, Т.О. Халиуллин // Novus Trend. – 2010. – №1. – C.76-77 4. Fatkhutdinova L.M. 2-stage epidemiological study in nanoindustry workers: plans and expectations. / L.M. Fatkhutdinova, T.O. Khaliullin, R.R. Zalyalov. // Book of abstracts, Nanomaterials and Worker Health: Medical Surveillance, Exposure Registries, and Epidemiologic Research. – Keystone, CO, USA, 2010. – P.36-37. 5. Халиуллин Т.О. Оценка провоспалительных свойств аэрозолей искусственных наночастиц. / Т.О. Халиуллин, Р.Р. Залялов // Сборник материалов XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». – Казань, 2011. – С. 109 6. Халиуллин Т.О. 2-этапное эпидемиологическое исследование среди работников наноиндустрии. / Т.О. Халиуллин, Л.М. Фатхутдинова, Р.Р. Залялов // Материалы всероссийской конференции «Связь заболевания с профессией с позиций доказательной медицины». – Казань, 2011. – С. 87-89 7. Васильева О.Л. Применение метода индуцированной мокроты для изучения реакции бронхолегочной системы у работников, имеющих контакт с аэрозолем углеродных нанотрубок. / О.Л. Васильева, Т.О. Халиуллин, Т.В. Николаева // Сборник материалов XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». – Казань, 2012. – С. 94 8. Халиуллин Т.О. Оценка легочных эффектов многослойных углеродных нанотрубок in vivo. / Т.О. Халиуллин // Сборник материалов XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине».– Казань, 2012.– С.99 18 9. Kagan V. Biomarkers of occupational exposures to carbon nanotubes in humans. / V. Kagan, T.O. Khaliullin, L.M. Fatkhutdinova, R.R. Zalyalov, A.V. Tkach, E.R. Murray, E.R. Kisin, A.A. Shvedova // Book of abstracts, 2012 Society of Toxicology Annual Meeting. – San Francisco, 2012. – P.54 10.Fatkhutdinova L.M. Biological markers of multi-walled carbon nanotubes exposure in humans. / L.M. Fatkhutdinova, T.O. Khaliullin, R.R. Zalyalov, I.K. Valeeeva, I.G. Mustafin, O.L. Vasilyeva, E.R. Kisin, A.A. Shvedova. // Book of abstracts, 6 th International Conference on Nanotoxicology. – Beijing, 2012. – P.67 11.Fatkhutdinova L.M. Biological markers relevant to realistic occupational exposures to multi-walled carbon nanotubes / L.M. Fatkhutdinova, T.O. Khaliullin, R.R. Zalyalov, I.K. Valeeeva, I.G. Mustafin, E.M. Birch, E.R. Kisin, A.A. Shvedova. // Book of abstracts, International Congress on Safety of Engineered Nanoparticles. – Helsinki, 2012. – P.58 12.Shvedova A.A. Carbon nanotubes enhance metastatic growth of lung carcinoma via up-regulation of myeloid-derived suppressor cells. / Shvedova AA, A.V. Tkach, E.R. Kisin, T. Khaliullin, S. Stanley, D.W. Gutkin, A. Star, Y. Chen, G.V. Shurin, V.E. Kagan, M.R. Shurin // Small. – 2013. – №9. – P.1691–95. 13.Khaliullin T.O. MWCNT exposure assessment in occupational settings. / T.O. Khaliullin, L.M. Fatkhutdinova, R.R. Zalyalov, A.A. Shvedova, E.M. Birch // Book of abstracts, II International School-Conference “Applied Nanotechnology& Nanotoxicology”. – Novosibirsk, 2013. – P.23-24 14.Халиуллин Т.О. Биологические эффекты многослойных углеродных нанотрубок при легочной экспозиции in vivo / Т.О. Халиуллин, Е.Р. Кисин, Р.Р. Залялов, А.А. Шведова, Л.М. Фатхутдинова // Токсикологический вестник. – 2013. - №4. – С. 17-21 15.Фатхутдинова Л.М. Пилотное кросс-секционное исследование по оценке потенциального фиброгенного риска в условиях реальных экспозиций к аэрозолю многослойных углеродных нанотрубок на рабочих местах ./ Л.М. Фатхутдинова, Т.О. Халиуллин, О.Л. Васильева, Р.Р. Залялов, И.Х. Валеева, И.Г. Мустафин, А.А. Шведова // Казанский медицинский журнал. – 2013. - №5. – С. 770-774 19
