Кинетические закономерности процессов культивирования микроорганизмов.

1
Лекция № 2. ТОБ.
Кинетические закономерности процессов
культивирования микроорганизмов.
План лекции
1. Общие принципы описания кинетики процессов культивирования мко.
2. Влияние субстрата и продуктов метаболизма на скорость роста мко.
3. Сложные модели роста микроорганизмов.
4. Кинетика накопления продуктов метаболизма.
5. Кинетика гибели микроорганизмов.
В. 1. Общие принципы описания кинетики процессов культивирования
микроорганизмов.
В основе количественного описания процессов культивирования мко
лежат исследования по кинетике накопления биомассы или продуктов
метаболизма.
Зависимость
концентрации
биомассы
от
времени
культивирования описывается сложной S-образной кривой.
Количественное описание всей кривой роста на практике не применяется.
Наибольший практический интерес представляет выявление зависимости
концентрации биомассы от продолжительности культивирования на 2-4 фазах
(кинетика роста) и фазе отмирания (кинетика гибели).
Наиболее простой способ описания кинетики роста основан на
получении аналитических зависимостей, отражающих внешний вид кривой
роста на 2-4 участках. Такими зависимостями являются экспоненциальные
функции различной степени сложности:
[X] =
[X]∞
K1+K2τ+К3τ²…
1+e
2
Однако, данный принцип описания кинетики накопления биомассы не
отражает закономерностей роста и развития популяций, является, по сути
дела, статистическим.
Этот
недостаток
устранен
при
разработке
так
называемой
экспоненциальной модели, основанной на следующих принципах:
1.
Увеличение численности популяции мко происходит в результате
удвоения каждой особи, происходящего через определенные интервалы
времени g (время генирации, время удвоения биомассы);
2.
Рост, развитие и деление клеток происходит независимо от
присутствия других мко;
3.
В некоторых пределах изменение концентрации компонентов
питательной среды не влияет на время удвоения клеток g.
Математическое выражение экспоненциальной модели:
[X] = [X]0 * 2τ/g;
ln[X] = ln[X0]*τ/g;
g = ln2/μ;
ln[X]/[X0] = μτ
Первый принцип соответствует в первую очередь процессу размножения
бактерий. Однако если концентрация биомассы выражена через количество
АСБ в единице объема, предложенная модель описывает увеличение
биомассы при способах размножения, отличных от деления клеток.
Второй
принцип
справедлив
для
большинства
промышленных
процессов культивирования, реализуемых в условиях асептики. Однако в ряде
случаев интерес представляет вопрос о взаимодействии клеток в процессе
роста.
В частности, еще в 19 веке Фюрхельстом была предложена модель,
учитывающая наличие внутривидовой борьбы, приводящей к гибели части
клеток. Скорость роста популяции в данном случае описывается уравнением:
3
d[X]/dτ = Kp[X] – Kг[X]2.
Большой практический интерес представляет вопрос о росте смешанных
культур. Однако, существующие модели роста учитывают лишь случаи
антагонистического взаимодействия по типу «хищник-жертва». Согласно
модели Вольтерра, гибель «жертв» Х1 происходит при непосредственном
взаимодействии с растущим «хищником» Х2, поэтому скорость гибели
пропорциональная произведению концентраций двух мко:
d[X1]/dτ = Kp[X1] – KБ[X1].[X2]
d[X2]/dτ = KБ[X1][X2] – Kг[X2].
Константы Кр, КБ и Кг характеризуют рост «жертв», межвидовую борьбу
и гибель «хищников».
Третий принцип является наименее обоснованным, поскольку именно в
экспоненциальной
фазе
происходит
наиболее
интенсивное
усвоение
субстрата культурой. В связи с этим, ряд работ по кинетике роста был
направлен на дополнение экспоненциальной модели роста зависимостями,
позволяющими выразить зависимость скорости роста от концентрации
питательных веществ.
В. 2. Влияние субстрата и продуктов метаболизма на скорость
роста микроорганизмов.
Основополагающим принципом при разработке моделей, описывающих
влияние концентрации субстрата на удельную скорость роста культуры,
является положение о существовании лимитирующего субстрата даже в
сбалансированных по составу питательных средах. Лимитирующий субстрат
– это вещество, концентрация которого определяет интенсивность протекания
ключевых реакций конструктивного метаболизма клетки и, как следствие,
скорость роста культуры.
4
Наиболее распространенная количественная модель была предложена
Моно (ввел понятие урожайности – экономического коэффициента):
μ = μmax [S] / (Ks + [S]),
Форма уравнения взята по аналогии с уравнением Михаэлиса-Ментен из
кинетики ферментативного катализа на основании концепции «узкого места»,
т.к. все реакции в клетке протекают с участием ферментов, то скорость роста
в целом будет определяться некоторой стадией метаболизма (узким местом).
Модель Моно дополняет экспоненциальную модель роста, устанавливая
взаимосвязь между текущими значениями концентрации биомассы и
субстрата:
d[X]/dτ = μ [X] = μmax [X][S] / (Ks + [S]),
Большинство существующих в настоящее время моделей данного типа
основываются на уравнении Моно и направлены на его уточнение по двум
направлениям:
1). Учет торможения роста культуры избытком субстрата:
μ = μmax [S] / (Ks + [S] + S2/Ki),
2). Уточнение физического смысла константы Ks :
- зависимость величины Ks от концентрации субстрата или биомассы:
μ =
μmax [S]
μ = μmax [S] / (Ks*[X]+ [S]),
;
Ks ([S0] – [S])+ [S]
- зависимость величины Ks от возраста культуры:
μ = μmax [S] / (В*Ks + [S]),
Существует ряд моделей, альтернативных рассмотренным выше:
1).
Модели,
основанные
на
представлениях
об
«эндогенном»
метаболизме, в результате которого лишь часть субстрата расходуется на
образование
биомассы,
метаболизма клетки:
а
остальные
используются
на
поддержание
5
-d[S] / dτ = (-d[S] / dτ)рост + (-d[S] / dτ)энд.
2). Модели, основанные на представлениях о росте и размножении
культуры как о результате необратимого взаимодействия клеток и молекул
субстрата по схеме:
X+S
S
2X + P;
d[X] / dτ = K*[X]*[S].
В ряде случаев практический интерес представляет рассмотрение
зависимости скорости роста от концентрации продуктов метаболизма
(кинетика торможения, рост культур в периодических условиях) независимо от
концентрации субстрата или совместно с последней. Наиболее простой
является модель Хиншельвуда, основанная на представлениях о тормозящем
действии продуктов на скорость роста клеток в экспоненциальной фазе:
d[X] / dτ = Kр*[X]*(1 – Кт [P]).
Известны
случаи
(например,
при
направленном
синтезе
антибиотиков),когда процесс роста биомассы описывается комбинированными
моделями, включающими и уравнение Моно, и скорость гибели клеток:
d[X] / dτ = Kр*[X]*(1 – Кт [P]).
Современные представления о кинетических закономерностях роста
микроорганизмов в присутствии продуктов метаболизма, основаны на работах
Н.Д.Иерусалимского, обосновавшего зависимость удельной скорости от
концентрации
продуктов
с
использованием
принципа
«узкого
места»
метаболизма.
Уравнение Иерусалимского аналогично по форме уравнению МихаэлисаМентон:
μ = μо Кр / (Kр + [Р]),
Поскольку ограничиться действием продукта без учета концентрации
субстрата практически невозможно, чаще используется уравнение МоноИерусалимского:
μ = μо Кр*[S] / (Ks + [S])*(Кр + [P]),
6
Существуют модели, основанные на представлениях о кинетике
торможения роста микроорганизмов продуктами метаболизма по типу полного
или неполного конкурентного ингибирования:
К1
-Х + Р
К-1
ХР;
К1
-Х + Р
К-1
К2
ХР;
ХР + S
К-2
К1
PXS
К-1
XS + P.
В. 3. Сложные модели роста микроорганизмов.
Рассмотренные выше модели не охватывают в полном объеме принципы
количественного
описания
ростовых
процессов
при
культивировании
микроорганизмов. Существующие в настоящее время сложные модели условно
можно подразделить на 4 группы:
1.
Модели,
учитывающие
совместное
влияние
концентрации
субстрата и продуктов метаболизма. Как правило, представляют собой
модификации уравнения Моно-Иерусалимского.
2.
Модели активаторного типа. Основаны на предположении об
активирующем влиянии на развитие культуры факторов роста, вносимых в
среду или выделяемых самими клетками, в условиях, когда отсутствует
торможение продуктами метаболизма. В результате взаимодействия с
фактором F часть клеток, активируется:
[X*] = Kакт [Х] [F].
Образующиеся ассоциации активированных клеток и субстрата [X*]S
быстрее подвергаются дальнейшим превращениям, чем комплексы субстрата
с неактивированными клетками.
XS К2.0 2X + P;
X*S К2
где: К2 = К2.0. + Какт.[F].
2X + P,
7
В результате, удельная скорость роста линейно возрастает с увеличением
концентрации фактора F:
μ = (К2.0.+ Какт. [F]) [S] / (Ks + [S]),
3.
Модели,
основанные
на
представлениях
о
возможности
лимитирования несколькими компонентами среды – множественном, в
простейшем случае, двойном лимитировании. Эти модели представляют
практический интерес при наличии в питательной среде двух и более
источников углерода одинаковой или различной природы. Одновременное
присутствие двух и более источников углерода, особенно, если одним из них
является глюкоза, приводит к диауксии – постадийному поглощению
субстратов, первым из которых является глюкоза (глюкозный эффект). В
общем случае, потребление индивидуальных субстратов происходит в
последовательности, определяемой скоростью роста культуры, чем она выше
при росте на данном субстрате, тем раньше происходит его потребление из
смеси.
4.
Модели, учитывающие влияние условий культивирования на
скорость роста микроорганизмов. Наибольшее распространение получили
модели, рассматривающие влияние температуры на удельную скорость роста.
Они основываются на аналогии с уравнением Аррениуса из химической
кинетики:
μ = μо е-Е/RT
где: Е – константа, аналогичная энергии активации химических реакций,
имеющая величину 35-50 кДж/моль.
В.4. Кинетика накопления продуктов метаболизма.
Накопление
продуктов
метаболизма
является
целью
многих
микробиологических производств. Изучение кинетики накопления продуктов
является
важной
задачей
при
оптимизации
подобных
процессов.
8
Кинетические
закономерности,
описывающие
биосинтез
метаболитов,
позволяют оценить влияние параметров процесса культивирования на выход
целевого продукта.
Методы описания кинетики образования целевых продуктов существенно
отличаются для первичных и вторичных метаболитов. Кинетические
зависимости накопления продуктов, синтез которых связан с ростом
культуры, принято коррелировать с концентрацией микроорганизмов в среде.
С этой целью введено понятие удельной скорости образования продукта
клетками λ, которая принимается постоянной:
d[P]/dτ = λ [X].
Данное уравнение позволяет связать процессы накопления биомассы и
первичных метаболитов:
[X] =
1
λ
d[P]
dτ
=
1
μ
μ d[P] = λ d[X] ;
d[X]
dτ
[P] = [P]0 + λ/μ([X] – [X]0).
Полученные зависимости позволяют установить взаимосвязь между
коэффициентом выхода продукта и экономическим коэффициентом:
α = d[P] / d[S] ;
Для
описания
Y = d[X] / d[S];
зависимости
α/Y = d[P] / d[X] = λ/ μ.
скорости
образования
продукта
от
концентрации субстрата используется уравнение, аналогичное модели Моно:
λ = λ0 [S] /(Kλ + [S]).
Это уравнение позволяет связать выход продукта с экономическим
коэффициентом и концентрацией субстрата:
α = λY/ μ = Y* λ0/ μмах *(Кs + [S])/(Kλ + [S]).
Таким образом, скорость образования и выход продукта не зависят от
концентрации субстрата только при Кs = Кλ, т.е. при одинаковых удельных
скоростях роста культуры и образования продукта.
9
Накопление
биохимическим
вторичных
метаболитов
закономерностям
и
в
ряде
подчиняется
случаев
не
сложным
поддается
количественному описанию общепринятыми методами. Для продуктов,
синтез которых начинается в экспоненциальной фазе роста и продолжается
после его прекращения (некоторые антибиотики, аминокислоты) используют
модели, основанные на уравнении Моно и учитывающие каталитическое
воздействие на синтез метаболита торможения роста культуры:
λ=
λ0 [S]
+ λ1[P]
(Kλ + [S])
В общем случае, удельная скорость биосинтеза λР рассматривается как
функция среднего возраста культуры τср. Взаимосвязь этих величин может
быть найдена только эмперическим путем из серии экспериментов.
В ряде процессов накопление продуктов связано не только с
метаболизмом микроорганизмов, но и с действием ферментов, секретируемых
клетками во внешнюю среду (экзоферментов).
В.5. Кинетика гибели микроорганизмов.
При стерилизации жидких и твердых питательных сред, оборудования,
вспомогательных материалов целью процесса является гибель клеток
микроорганизмов. В основе расчетов технологических режимов процесса и
оборудования для стерилизации сред лежат исследования по кинетике гибели
мко. Гибель мко происходит со скоростью, пропорциональной концентрации
жизнеспособных к данному моменту времени клеток или спор:
-d[X]/dτ = K[X];
ln
[X]0
= Кτ
[X]
где: К – удельная скорость гибели;
[X]0 - критерий стерилизации.
ln [X]
10
Практически важной величиной является время, за которое концентрация
клеток снижается в 10 раз:
τ10 = 2,303/К
При стерилизации жидких питательных сред обычно задается величина
критерия стерилизации и по известной скорости гибели при определенной
температуре рассчитывается необходимая продолжительность процесса.
Удельная скорость гибели резко возрастает при повышении температуры (в
интервале 100-140о С в 104-105 раз).
Температурную зависимость К описывают уравнением Аррениуса:
К = К0 е(-Е/RT) ;
где: Е – энергия активации процесса гибели клеток.
Важной
особенностью
стерилизации
реальных
сред
является
необходимость уничтожения одновременно нескольких типов мко, каждый
имеет индивидуальную скорость гибели. Т.о., кривая гибели не может быть
описана одной экспоненциальной зависимостью, а представляет собой сумму
экспонент с различными константами К.
На практике в ряде случаев используют эмперические зависимости,
удовлетворительно описывающие опытные данные и пригодные для расчетов
при переходе к крупномасштабной аппаратуре.