Неаминогликозидный состав устраняет носенс мутации.

Неаминогликозидный состав устраняет носенс мутации.
Liutao Du1, Robert Damoiseaux5, Shareef Nahas1, Kun Gao2, Hailiang Hu1, Julianne M. Pollard1, Jimena Goldstine3,
Michael E. Jung6, Susanne M. Henning2, Carmen Bertoni4, and Richard A. Gatti1,3
Author Affiliations
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2Center for Human Nutrition, 3Department of Human Genetics, and
4Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, 5Molecular Shared Screening Resources, California
NanoSystems Institute, 6Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, Los Angeles,
CA 90095
Author Notes
L. Du and R. Damoiseaux contributed equally to this paper.
CORRESPONDENCE Richard A. Gatti: [email protected] OR Liutao Du: [email protected]
Введение
Большое количество генетических нарушений вызваны носенс мутациями, для которых состав, индуцирующий
преждевременную остановку кодонов (PTC), может быть использован в качестве потенциальной стратегии лечения.
Мы успешно разработали чувствительный и количественный высокопроизводительный скрининг (HTS)
транскрипции / трансляции (PTT) белка, иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления новых PTC- соединений
с использованием атаксии-телеангиэктазии (AT), как генетической модели заболевания. Это HTS PTT-ИФА на
основе PTT который использует шаблоны, содержащие плазмиды прототипных AT (ATM) мутаций для HTS. Мы
изучили ~ 34 000 соединений и определили 12 низкомолекулярных неаимногликозидных соединения с
потенциальной PTC активностью. Из них два ведущих соединения последовательно индуцирующих
функциональные белки в ATM-дефицитных клетках, содержащих болезнетворные нонсенс-мутации. Прямые
измерения ATM белка показали восстановление ATM киназы. Эти два соединения также продемонстрировали
активность в миофибриллах MDX мышей , несущих носенс мутации, и индуцированных значительное количество
белка дистрофина.
Об окончании трансляции сигнализируют три кодона: UAA, UAG и UGA. Этот механизм хорошо сохранилися, хотя
каждый кодон имеет различную эффективность для завершения трансляции. UGA считается "дырявым" стопкодоном с высоким внутренним потенциалом для остановки кодона. UAA показывает высокую точность и малый
внутренний потенциал, в то время как UAG имеет промежуточные значения (Weiner и Вебер, 1973. Ловетт и др.,
1991). Нонсенс-мутации создают первичную преждевременную остановку кодонов (PTC) и в результате либо не
образуется белок или синтезируется усеченный белк с нарушением стабильности.
Некоторые соединения влияют на точность остановки кодона и вызывают первичную PTC, которая позволяет
транскрипцию некоторых полных белков. Во многих случаях, вызванный этим событием белок функционален,
даже если он содержит ошибочно включенные аминокислоты (Килинг и Bedwell, 2005;. Zingman и др., 2007).
Считается, что 30% человеческих болезнетворных аллелей – это нонсенс-мутации (Менделл и Dietz, 2001). Другие
типы мутаций, таких, как смещение рамки считывания и мутации сплайсинга, приводят к вторичной PTC , однако,
это не может быть мишенью для терапевтических целей. Учитывая, что> 1800 различных генетических нарушений
вызвано нонсенс-мутациями, первичная PTC имеет потенциал для лечения большого количества больных.
На сегодняшний день большинство из соединений, вызывающих PTC, которые активны в клетках млекопитающих,
принадлежали к классу аминогликозидов (Килинг и Bedwell, 2005;. Zingman и др., 2007). Некоторые виды
аминогликозидов могут помочь рибосомам прочитать мутации через вставки случайной аминокислоты.
Терапевтический потенциал аминогликозидов был оценен в лаборатории для различных генетических моделей,
таких как кистозный фиброз (Howard и др., 1996;. Bedwell и др., 1997;.. Ду и др., 2002), мышечная дистрофия
(Howard и др.. , 2000; Вагнера и др., 2001;. Дюнан и др., 2003;. Loufrani и др., 2004), Hurler синдром (Килинг и др.,
2001), цистиноз (Helip-Вули и др., 2002), спинальная мышечная... атрофия (Sossi и др., 2001)., атаксиятелеангиэктазии (AT,. Лай и др., 2004), и тип 1 синдрома Ушера (Rebibo-Саббах и др., 2007.). Клинические
исследования также показывают, что аминогликозиды могут вызывать некоторое производство функционального
белка, но терапевтический эффект остается неопределенным (Wilschanski и др., 2000;. Clancy и др., 2001;. Вагнер и
др., 2001;.. Politano и др., 2003).
Кроме того, токсичность большинства коммерческих аминогликозидам у млекопитающих значительно снижает их
потенциал для успешной терапии (Mingeot-Леклерк и Тюлькенс, 1999; Гуан и др., 2000.). Таким образом,
предпринимаются усилия по разработке производных аминогликозидов с пониженной токсичностью и повышенной
активностью (Нудельман и др., 2006;.. Rebibo-Саббах и др., 2007). В последнее время PTC Therapeutics (Южная
Plainfield, Нью-Джерси), описала более эффективное неаминогликозидное соединение PTC124, которое было
разработано синтетическим путем скрининга> 800 000 химических веществ и аналогов с помощью люциферазы на
основе высокопроизводительного скрининга (HTS) (Welch и соавт., 2007 ; Hirawat и др., 2007;. М. Ду и др.,
2008)..Фазы-I клинических исследований при муковисцидозе подтвердила, что PTC124, как правило, хорошо
переносится и, как представляется, более эффективен, чем аминогликозиды (Hirawat и соавт., 2007). Кроме того,
PTC124 не вызывает рибосомных эффектов, нормализует остановку кодонов. Фаза-II клинических испытаний
ведется в настоящее время (Керем и соавт., 2008). Однако, недавнее исследование показывает, что начальные
открытие PTC124 может быть предвзятым.
В попытке открыть для себя новые соединения, мы разработали чувствительный и количественный независимый
анализ HTS транскрипции / трансляции белка (PTT). PTT-ИФА была разработана для автоматизированной 384-а
платформы и используется для скрининга ~ 34 000 соединений. Мы сосредоточили усилия на последующих 12
низкомолекулярных неаминогликозидных соединенях. Оттуда, мы определили два соединения, индуцирующих
низкий уровень полного функционального белка во всю длинну в клетках, несущих AT нонсенс-мутации, как
показали прямые измерения ATM белка с использованием ATM-ИФА, ATM-Ser1981 аутофосфорилирования,
транс-фосфорилирования структур хромосомы (SMC) 1-Ser966 и анализа выживания колонии. Оба соединения
также показали активность в отношении миофибрилл MDX мышей, несущих носенс-мутации, и индуцировали
значительное количество белка дистрофина.
В совокупности эти исследования дают первые надежные подтверждения надежности независимого HTS анализа
для выявления таких соединений и доказывают принцип PTC для неаминогликозидных соединений. Они также
устанавливают, что расширение возможностей PTC можно рассматривать как терапевтическую стратегию для
исправления нонсенс-мутации при многих генетических заболеваниях.
Результаты
Разработка и утверждение HTS анализа
In vitro PTT был первоначально разработан для обнаружения мутаций (Roest и др., 1993;.. Telatar и др., 1996). ИФА
использовалось в сочетании PTT чтобы улучшить пропускную способность для выявления этих мутаций (Gite и др.,
2003;.. L. Du и др., 2008). В предыдущем исследовании мы использовали PTT- в геле для оценки различных
аминогликозидов по воздействию на нонсенс-мутации (Lai и соавт., 2004). Тем не менее, анализа PTT в геле
занимал много времени и связан с использованием радиоактивных материалов, поэтому было сложно
автоматизировать его для высокой пропускной способности. При этом, мы разработали плазмиды для PTT-ИФА
для скрининга большого числа соединений PTC. Анализ использует шаблоны, содержащие плазмиды прототипных
мутаций AT, по образцу конкретных болезнетворных мутаций AT. Так как требовалась работа в клетках
млекопитающих, были выбраны ретикулоциты кролика для управления реакцией PTT. Различные фрагменты
мутировавших аллелей из клеток больных АТ были клонированы в плазмиды с N-и С-терминальной меткой
эпитопов myc и V5, соответственно. Anti- myc антитела использовались для получения перевода белка на пластины
ELISA. Если соединения вызывают PTC в анализе, в полнометражных ATM фрагмент включался V5, которая
обнаруживается антителами анти-V5-пероксидазой хрена (HRP) (рис. 1).
Мы построили три мутантные плазмиды, содержащие прототипные мутации в АТ гене от трех разных больных АТ.
Плазмиды используются для предварительного отбора, плазмиды TAT51, содержит ATM области 5 фрагмент
(кодонов 1403-1886) и таит в себе носенс- мутацию (c.5623C → T), что приводит к остановке кодона TGA. Вторая
плазмиды AT153LA содержит тот же стоп-кодон TGA, но на другой позиции внутри гена (c.8977C → T) в области 8
(кодонов 2550-3050). Она была использована для мониторинга влияния окружающей последовательности на PTC
способности. Третья мутантная плазмида AT185LA, содержит различные стоп-кодоны, TAA G,
в результате нонсенс мутации (c.3673C → T) в области 4 (кодонов 1041-1531). Плазмиды,
содержащие те же фрагменты, но без мутаций были построены в пробирке мутагенезом производных
комплементарной ДНК пациентов и были использованы в качестве дикого типа контроля.
Сначала мы оценивали специфичность и чувствительность PTT-ИФА для определения в пробирке трансляции
полнометражного фрагмента белка. Все три мутантные плазмиды дали только фоновый сигнал, в то время как
сопоставимые плазмиды дикого типа показали сигналы больщее ~ 200 раз по сравнению с фоном (рис. 1, б, вверху),
что указывает на специальность фрагментов белка. Затем мы использовали TAT51 плазмиду дикого типа для
оценки чувствительности анализа. TAT51 дикий тип плазмиды серийно разбавляют TAT51 мутантной плазмидой и
используется для управления PTT реакцией. Образцы, содержащеие 1,2% дикого типа плазмид (2/158 нг) дали
сигнал, который был вдвое выше, чем у мутантных плазмид (рис. 1, б, внизу), установив чувствительность теста ~
1%.Чувствительность анализа HTS особенно важная для скрининга РTC , потому что все RTC на сегодняшний день
были только слабыми PTC индукторами, и новые классы RTC должны быть определены высоко чувствительным
скринингом.
Далее, мы использовали два известных RTC, G418 и гентамицин, чтобы проверить эффективность PTT-ИФА. Оба
соединения показали значительную PTC деятельность с TAT51 мутантной плазмидой (TGA C) в широком
диапазоне доз (40 нм-10 мкм;. Рис. 1 в). Кроме того, G418 показал очевидную токсичность в реакции PTT при
концентрации> 2,5 мкм, в то время как токсичность гентамицина не наблюдалось до 12.5 мкм. Эти результаты
согласуются с нашими ранее опубликованными данными S35-PTT в геле (Lai и соавт., 2004) и показали, что PTTИФА легко идентифицирует соединения с РTC активностью.
Далее проверки анализа для использования в полностью автоматизированной 384-а платформы, с помощью
плазмиды-TAT51 (TGA C) в качестве шаблона и 1 мкМ G418 в качестве положительного контроля. Чтобы еще
больше снизить затраты на анализ, мы оптимизировали уменьшение объема PTT реакции с 25 до 5 мкл. Как
показано на рис. 1 D, G418 показали значительные различные сигналы (фактор Z '> 0,8) по сравнению с контролем.
Скрининг химических соединений
Около 34000 соединений были исследованы, чтобы открыть новые RTC. Плазмида-TAT51 (TGA C) была
использована для первоначальной проверки. Каждое соединение был в конечной концентрации 10 мкМ в анализе
смеси. Для каждого исследования, мы брали как положительные (с 1 мкМ G418) так и отрицательные (с ДМСО)
образцы контроля качества. Наш первоначальный скрининг дал 12 низкомолекулярных RTC с заметной
активностью. Все 12 соединений были подтверждены ручной PTT-ИФА на разных концентрациях (химические
названия приведены в таблице S1). Все из них были неаминогликозидными и ни о ком из них не сообщалось ранее.
Химические названия и структуры двух ведущих соединений, RTC № 13 и № 14, представлены на рис. 2, названия и
структуры для оставшихся 10 RTC приведены на рис. S1 и таблицы S1.
EC50 из пяти соединений (RTC # 4, # 11, # 13, # 14 и # 16) было <10 мкм (рис. 2, б, RTC № 13 и № 14), подразумевая,
терапевтический потенциал этих соединений. Примечательно, что в этих первых клетках без экспериментов,
максимальный эффект в пробирке для нового соединения не был столь благоприятным, как и у G418 или
гентамицина. Например, максимальная активность № 13 и № 14, обнаружены в клетках PTT-ИФА, составила ~
10% от максимальной активности G418 и гентамицина в том же тесте (рис. 1в по сравнению с рис 2. б). Это может
быть связано с растворимостью, проницаемостью, или токсичностью соединений. В отличие от
этого, RTC # 13 и # 14 были EC50 <10 мкм, они менее токсичны, и они не показывают
очевидного торможения PTT при высокой концентрации (> 50 мкм), в отличие от G418 и гентамицина (рис. 1С ).
Эффективность этих соединений была также протестирована на двух других стоп-кодонах, TGA и ТАА G. Для
TGA, все 12 соединений показали, различную степень деятельности (неопубликованные данные). Для ТАА G, и
шести соединений (RTC # 10, # 11, # 13, # 14, # 16 и # 17) показали заметную активность (неопубликованные
данные). Данные для RTC № 13 и № 14 на рис. 2 с.
RTC -индуцированный AT белок и ATM-Ser1981 фосфорилирование в AT лимфобластоных клеточных
линиях (LCLS)
Чтобы проверить возможность вновь выявленных соединений вызвать синтез ATM белка в клетках с AT
мутациями PTC, мы обработали AT LCLS каждым соединением в течение 4 дней до уборки клеток. Вестерн-блотт
анализ ядерных лизатов в целом недостаточно чувствителен для мониторинга ATM белка (Lai и др., 2004.),
Поэтому мы использовали ATM-ИФА метод измерения внутриядерных белков в клетках (Butch и др., 2004). .
Концентрации отдельных RTC, используемых для лечения AT153LA LCL с гомозиготной TGA мутацией были
основаны на их цитотоксическом профиле (рис. S2, RTC № 13 и № 14). Клетки обрабатывали высокими
концентрациями RTC, > 70% жизнеспособности по сравнению с необработанными клетками. RTC # 13 и # 14
последовательно индуцировали низкий, но заметный уровнь ATM белка в AT LCLS (рис. 3). Восстановленная ATM
белка составило ≤ 5% от дикого типа LCLS. Гентамицин и G418 также индуцирует небольшое количество белка
ATM (рис. 3). Мы были воодушевлены этими результатами, потому что у некоторых пациентов с остаточным
синтезом белка может произойти существенное увеличение активности киназы ATM, и это связано с поздним
началом и медленным прогрессированием симптомов (Гилад и др., 1998;.. Чун и др. 2003). Таким образом, мы
считаем, что даже незначительное повышение белка обладают терапевтическим потенциалом.
Для оценки функции RTC -индуцированного белка ATM, мы измеряли вызванные облучением очаги (IRIF) ATMSer1981 в тех же AT153LA клетках (TGA). В клетках не образуются очаги после ионизирующего излучения (ИИ)
ATM-Ser1981, потому что белки либо отсутствуют, либо функционально нарушены (обычно бывшей). Мы
обнаружили, что RTC # 13 и # 14 индуцировали значительное количество Ser1981 IRIFs в AT клетках TGA, тогда
как только фоновый уровень IRIF наблюдался в необработанных контрольных образцах (рис. 3 б). В то же время, ~
51% от дикого типа клеток показали, различные очаги. Максимальная индукция IRIF достигнута в AT клетках 10
мкм RTC # 13 было ~ 40% дикого уровня. В качестве положительного контроля, 144 мкМ G418 (100 мкг / мл) был
использован для лечения клеток. Наши предыдущие исследования показали, что при такой концентрации, G418
вызывали максимальный уровень ATM1981 IRIF (Lai и соавт., 2004). Как и ожидалось, значительная IRIF была
вызвана в G418-обработанных клетках. Уровень в AT клетках составляет примерно половину от клеткок дикого
типа. Соединения были также протестированы в другой AT клеточной линии, AT229LA, с гомозиготной TAG
мутацией, и оба RTC # 13 и # 14 индуцировали значительное число Ser1981 IRIF, по сравнению с необработанными
AT клетками (рис. 3с).
Для дальнейшего сравнения деятельности RTC № 13 и № 14 с гентамицином и G418, мы использовали проточную
цитометрию (FC) на основе анализа ATM-Ser1981 фосфорилирования для оценки активности в клетках AT229LA
(TAG;. Рис. 4). Оба RTC # 13 и # 14 индуцировали увеличение ATM-Ser1981 аутофосфорилирования, о чем
свидетельствует сдвиг вправо интенсивности флуоресценции (FI). Это согласуется с предыдущими ATM IRIF
данными (рис. 3в). Обнадеживает тот факт, что ATM-Ser1981 фосфорилирование
индуцированных RTC # 13 и # 14 было аналогично тем, индуцированным одними и теми же
концентрациями гентамицина и G418 в одной клеточной линии (рис. 4). Ни одно из двух соединений не дает
зеленой флуоресценции (изотипа контроля;. Рис. 4, правая верхняя гистограмма). Подобные эффекты наблюдались
также в клетках AT153LA (TGA) с помощью цитометрии на основе анализа ATM-Ser1981 фосфорилирования
(неопубликованные данные).
РТС-индуцированние восстановление SMC1-Ser966 фосфорилирования в AT LCLS
В качестве альтернативы тесту для оценки функции киназы ATM, мы использовали недавно разработанную FC на
основе анализа для оценки транс-фосфорилирования SMC1 в AT LCLS (рис. 5,. Нахас и др., 2009). ATM
фосфорилирует SMC1 в Ser966 и Ser957 после IR -индуцированных двунитевых разрывов (Язди и др., 2002;..
Китагава и др., 2004) и IR -индуцированное SMC1 фосфорилирование снижено в AT клетках. В необработанных
клетках AT153LA (TGA) мы не наблюдали фосфорилирования SMC1 (рис. 5, сверху, слева). После лечения RTC #
13 или # 14 в FI наблюдалось восстановление АТМ киназы. И G418 и гентамицин индуцировали SMC1
фосфорилирование в клетках AT на том же уровне. Мы также протестировали соединения на TAG мутации с
использованием AT229LA клеток. У всех обнаружено индуцированние SMC1 фосфорилирования (рис. 5 б).
RTC -индуцированное восстановления АТМ киназы в AT фибробластах.
Чтобы определить, являются ли два RTC также активны и в других типах клеток, мы проверили их на линии AT
фибробластов GM02052, которые содержали гомозиготные TGA G мутации (около 103C → T).
RTC-обработанные клетки показали небольшое увеличение IR-индуцированного SMC1-Ser966
(рис. 6) и ATM-Ser1981 фосфорилирования (рис. 6 б), по сравнению с необработанными клетками. В качестве
положительного контроля использовались гентамицин и G418 в схожих концентрациях.
RTC-индуцированная коррекция клеточной выживаемости в А-T LCL.
Затем мы проверили, действительно ли RTC № 13 и № 14 может отменить AT радиочувствительность клеток.
AT153LA клетки (TGA) лечили соединением 4 дня и затем провели оценку жизнеспособности колоний (CSA).
Один дикий тип клеточной линии был использован в качестве контроля качества анализа. Как и ожидалось, дикий
тип и клетки после лечения показали 49 и 11% выживаемости, соответственно. Это было в пределах нормы (> 36%)
и (<21%) диапазона радиочувствительности, соответственно (рис. 7). Необработанные клетки AT153LA показали
13,5% выживания (рис. 7, левая панель). Обнадеживает то, что мы обнаружили, что оба RTC № 13 и № 14 (на 10 и
20 мкм) снизили радиочувствительность AT153LA клетки. G418 также снизил радиочувствительность, в то время
как гентамицин не показывает существенного влияния на результаты анализа в проверенных концентрациях (10 и
20 мкм).Определение спектра CSA использовалось ранее в нашей лаборатории, и используется для клинической
диагностики AT (см. Материалы и методы).
RTC индуцированный MDX PTC в мышечных клетках мыши.
Для исследования возможности RTC № 13 и № 14 исправления мутации в генах, кроме АТМ, мы использовали
миофибриллы MDX мышей. Мыши MDX были широко использованы в качестве модели для мышечной дистрофии
Дюшенна. Она несет замещение C на T в экзоне 23 гена дистрофина, который создает преждевременный стопкодон (ТАА), и в результате отсутствие белка дистрофина (Sicinski и соавт., 1989). Поскольку гентамицин, как
было показано, вызывает исправление мутации MDX и восстанавливает экспрессию дистрофина у MDX мышей,
как в пробирке и в живом организме (Barton-Davis и соавт., 1999), мы использовали его в качестве положительного
контроля в экспериментах . Мышцы клеток-предшественников, выделенных из мышей MDX были вынуждены
дифференцировать в течение 24 часов перед добавлением гентамицина или соединения RTC № 13 и № 14.
Культуры миофибрилл подвергались обработке соединением в течение 72 часов, а затем проанализированы на
наличие дистрофина при помощи вестерн блоттинга. Дистрофин во всю длинну явно обнаруживается в клетках,
обработанных RTC # 13 и # 14 в концентрациях от 10 до 20 мкм, но не в культурах, обработанных гентамицином в
концентрации 20 мкМ (неопубликованные данные). Затем мы использовали
иммунопреципитацию для повышения чувствительности анализа (рис. 8). Экспрессия
дистрофина присутствует в клетках, обработанных гентамицином в концентрациях от 20 до 100 мкм. Оба наших
соединения показали активность, вызывая образование значительного количества белка дистрофина.
Обсуждение
Мы считаем, что HTS может выявить новые неаминогликозидные RTC с терапевтическим потенциалом. В этом
исследовании мы использовали в качестве модели заболевания для выявления новых РУЦ. Атаксиютелеангиоэктазию, прогрессивное аутосомно-рецессивное нейродегенеративное расстройство в результате мутации
в гене ATM (Перлман и др., 2003;. Чун и Гатти, 2004). АТ белок играет очень важную роль в клеточном цикле,
репарации ДНК, окислительном стресс-ответе, и апоптозе (Шило, 2006). В спектре мутаций ATM, основная
нонсенс-мутация составляет ~ 15% уникальных мутаций обнаруженных у больных АТ (www.LOVD.nl / ATM).
LCLS полученные от пациентов с мутациями, позволяют исследовать влияние неаминогликозидных RTC на
различную первичную преждевременную остановку кодонов. Ранее мы уже использовали аминогликозиды и
антисмысловые олигонуклеотиды для исправления носенс и мутации сплайсинга ATM, соответственно, для
восстановления функциональных белков АТМ в AT LCLS (Lai и др., 2004;.. Ду и др., 2007). Эти исследования
показывают, что терапевтический эффект может быть достигнут, если даже незначительное повышение
функционального уровня белка могут быть вызваны.
При этом, мы успешно разработали чувствительные люциферазы для независимого анализа HTS по связи PTT и
ИФА. PTT-ИФА демонстрирует высокую специфичность для обнаружения продуктов и, таким образом,
минимизирует число ложных срабатываний в начальной крупномасштабной части скрининга. Анализ также очень
чувствителен, минимальный порог обнаружения составляет ~ 1%, что обеспечивает его эффективность.
Эффективность PTT-ИФА в дальнейшем оценивается с помощью двух известных RTC, G418 и гентамицина. Анализ
был в состоянии обнаружить их активность в очень больших концентрациях (G418, 40 нм-10 мкл, гентамицин, 40
нм-100 мкл). Кроме того, РТТ-ИФА была утверждена для полностью автоматизированной платформы. 384-а формат
значительно сократит нагрузку на скрининг тысячи соединений, а также экономит время и реагенты. По этим
причинам мы считаем, что PTT-ИФА HTS анализ дает новый мощный инструмент для выявления новых RTC.
Из списка ~ 34 000 соединений, мы определили 12 низкомолекулярных соединений массой (от ~ 300 до 450
дальтон), с активностью PTC. Ни одно из этих новых соединений не было аминогликозидом. Несколько соединений
показали EC50 значения <10 мкМ, что означает наличие у них потенциала для дальнейшего развития. Для
дальнейшей оценки этих веществ в клеточных системах, мы протестировали их деятельность в AT LCLS с
различными нонсенс-мутации. Мы использовали ATM-ИФА для непосредственного обнаружения АТМ белка в
клетках. Впоследствии, более чувствительные клетки на основе анализов, таких, как FC на основе SMC1-Ser966,
ATM-Ser1981 фосфорилирования, и ATM-Ser1981-IRIF, были использованы для оценки восстановления АТМ
киназы. Среди 12 соединений, RTC № 13 и № 14 показали, PTC деятельность в клетках , как в LCLS, так и
фибробластов, о чем свидетельствует ATM-ИФА, ATM киназы (аутофосфорилирование ATM и трансфосфорилирования SMC1) и CSA. Для определения того, могут ли эти соединения воздействовать на мутации в
других генах, мы выбрали клетки мыши MDX и проверили их способность вызывать схожие эффекты у другого
вида, другого типа клеток (неделящихся мышечных клеток), а также различные преждевременные стоп-кодоны
(ТАА ). В других исследованиях, TAA кодон оказался самым трудным для прочтения(Kimura и др., 2005;.. Уэлч и
др., 2007). Оба RTC # 13 и # 14 индуцировали образование у мыши MDX дистрофина.
В совокупности наши данные показали, что оба RTC # 13 и # 14 были сопоставимы по деятельности на основе
анализов, хотя их деятельность в бесклеточных PTT-ИФА были намного ниже, чем у гентамицина и G418. Это
может быть связано с различиями в клетках обмена веществ, растворимости и проницаемости для этих соединений.
Для оценки воздействия этих соединений на остановку нормальных кодонов других белков, мы провели
двумерный гель-электрофорез. Ни одно из соединений существенно не мешает экспрессии белка (рис. S4),
подразумевая, что эти соединения имеют потенциал для дальнейшего развития. Тем не менее, мы ожидаем, что
значительный терапевтический эффект, возможно, будет не заметн у AT пациентов, если RTC -индуцированной
ATM уровень будет <15% от нормы, а это весьма вероятно, относится и к другим генетическим нарушениям. Таким
образом, будет необходимы дальнейшие структурные изменения для улучшения фармакодинамики. Структурная
оптимизация улучшит деятельность и снизить токсичность аминогликозидов (Нудельман и др., 2006;.. RebiboСаббах и др., 2007).
Основные механизмы деятельности RTC для этих вновь выявленных соединений остаются неизвестными. Было
показано, что все известные RTC влияют на рибосомный синтез . Конечно, аминогликозиды взаимодействовуют с
декодирующим центром рибосомальной субъединицы 16S и вызвают мисинкорпорацию из аминокислот на сайте
РТС, который позволяет продолжить трансляцию (Килинг и Bedwell, 2005; Zingman и др., 2007.). PTC124 Считается
также, что они действовуют в другом месте на рибосоме (Linde и Керем, 2008). Будет
интересно узнать, взаимодействуют ли RTC # 13 и # 14 с рибосомой.
A-T атаксия-телеангиоэктазия
ATM A-T мутация
CSA оценка жизнеспособности колоний
FC проточная цитометрия
FI интенсивность флюоресценции
HRP пероксидаза хрена
HTS высокочувствительный скрининг
IR ионизирующее излучение
IRIF очаги, вызванные облучением
LCL лимфобластная линия клеток
мРНК матричная РНК
NMD нонсенс опосредованный распад мРНК
PTC преждевременная остановка кодона
PTT транскрипция/ трансляция протеина
RTC соединения для PTC
SMC структура хромосом
Ссылки
↵ Auld, D.S., N. Thorne, W.F. Maguire, J. Inglese. 2009. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of
nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106:3585–3590. doi:10.1073/pnas.0813345106 Abstract/FREE
Full Text
↵ Barton-Davis, E.R., L. Cordier, D.I. Shoturma, S.E. Leland, H.L. Sweeney. 1999. Aminoglycoside antibiotics restore
dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice. J. Clin. Invest. 104:375–381. doi:10.1172/JCI7866 Medline
↵ Bedwell, D.M., A. Kaenjak, D.J. Benos, Z. Bebok, J.K. Bubien, J. Hong, A. Tousson, J.P. Clancy, E.J. Sorscher. 1997.
Suppression of a CFTR premature stop mutation in a bronchial epithelial cell line. Nat. Med. 3:1280–1284.
doi:10.1038/nm1197-1280 CrossRef
Medline
↵ Bertoni, C., T.A. Rando. 2002. Dystrophin gene repair in mdx muscle precursor cells in vitro and in vivo mediated by
RNA-DNA chimeric oligonucleotides. Hum. Gene Ther. 13:707–718. doi:10.1089/104303402317322276 CrossRef
Medline
↵ Butch, A.W., H.H. Chun, S.A. Nahas, R.A. Gatti. 2004. Immunoassay to measure ataxia-telangiectasia mutated protein in
cellular lysates. Clin. Chem. 50:2302–2308. doi:10.1373/clinchem.2004.039461 Abstract/FREE Full Text
↵ Chun, H.H., R.A. Gatti. 2004. Ataxia-telangiectasia, an evolving phenotype. DNA Repair (Amst.). 3:1187–1196.
doi:10.1016/j.dnarep.2004.04.010 CrossRef
Medline
↵ Chun, H.H., X. Sun, S.A. Nahas, S. Teraoka, C.H. Lai, P. Concannon, R.A. Gatti. 2003. Improved diagnostic testing for
ataxia-telangiectasia by immunoblotting of nuclear lysates for ATM protein expression. Mol. Genet. Metab. 80:437–443.
doi:10.1016/j.ymgme.2003.09.008 CrossRef
Medline
↵ Chun, H.H., R.B. Cary, F. Lansigan, J. Whitelegge, D.J. Rawlings, R.A. Gatti. 2004. ATM protein purified from vaccinia
virus expression system: DNA binding requirements for kinase activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322:74–81.
doi:10.1016/j.bbrc.2004.07.085 CrossRef
Medline
↵ Clancy, J.P., Z. Bebök, F. Ruiz, C. King, J. Jones, L. Walker, H. Greer, J. Hong, L. Wing, M. Macaluso, et al. 2001.
Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit.
Care Med. 163:1683–1692. Abstract/FREE Full Text
↵ Du, L., J.M. Pollard, R.A. Gatti. 2007. Correction of prototypic ATM splicing mutations and aberrant ATM function with
antisense morpholino oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104:6007–6012. doi:10.1073/pnas.0608616104
Abstract/FREE Full Text
↵ Du, L., C.H. Lai, P. Concannon, R.A. Gatti. 2008. Rapid screen for truncating ATM mutations by PTT-ELISA. Mutat.
Res. 640:139–144. Medline
↵ Du, M., J.R. Jones, J. Lanier, K.M. Keeling, J.R. Lindsey, A. Tousson, Z. Bebök, J.A. Whitsett, C.R. Dey, W.H. Colledge,
et al. 2002. Aminoglycoside suppression of a premature stop mutation in a Cftr−/− mouse carrying a human CFTR-G542X
transgene. J. Mol. Med. 80:595–604. doi:10.1007/s00109-002-0363-1 CrossRef
Medline
↵ Du, M., X. Liu, E.M. Welch, S. Hirawat, S.W. Peltz, D.M. Bedwell. 2008. PTC124 is an orally bioavailable compound
that promotes suppression of the human CFTR-G542X nonsense allele in a CF mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
105:2064–2069. doi:10.1073/pnas.0711795105 Abstract/FREE Full Text
↵ Dunant, P., M.C. Walter, G. Karpati, H. Lochmüller. 2003. Gentamicin fails to increase dystrophin expression in
dystrophin-deficient muscle. Muscle Nerve. 27:624–627. doi:10.1002/mus.10341 CrossRef
Medline
↵ Gilad, S., L. Chessa, R. Khosravi, P. Russell, Y. Galanty, M. Piane, R.A. Gatti, T.J. Jorgensen, Y. Shiloh, A. Bar-Shira.
1998. Genotype-phenotype relationships in ataxia-telangiectasia and variants. Am. J. Hum. Genet. 62:551–561.
doi:10.1086/301755 CrossRef
Medline
↵ Gite, S., M. Lim, R. Carlson, J. Olejnik, B. Zehnbauer, K. Rothschild. 2003. A high-throughput nonisotopic protein
truncation test. Nat. Biotechnol. 21:194–197. doi:10.1038/nbt779 CrossRef
Medline
↵ Guan, M.X., N. Fischel-Ghodsian, G. Attardi. 2000. A biochemical basis for the inherited susceptibility to aminoglycoside
ototoxicity. Hum. Mol. Genet. 9:1787–1793. doi:10.1093/hmg/9.12.1787 Abstract/FREE Full Text
↵ Helip-Wooley, A., M.A. Park, R.M. Lemons, J.G. Thoene. 2002. Expression of CTNS alleles: subcellular localization and
aminoglycoside correction in vitro. Mol. Genet. Metab. 75:128–133. doi:10.1006/mgme.2001.3272 CrossRef
Medline
↵ Hirawat, S., E.M. Welch, G.L. Elfring, V.J. Northcutt, S. Paushkin, S. Hwang, E.M. Leonard, N.G. Almstead, W. Ju, S.W.
Peltz, L.L. Miller. 2007. Safety, tolerability, and pharmacokinetics of PTC124, a nonaminoglycoside nonsense mutation
suppressor, following single- and multiple-dose administration to healthy male and female adult volunteers. J. Clin.
Pharmacol. 47:430–444. doi:10.1177/0091270006297140 Abstract/FREE Full Text
↵ Holbrook, J.A., G. Neu-Yilik, M.W. Hentze, A.E. Kulozik. 2004. Nonsense-mediated decay approaches the clinic. Nat.
Genet. 36:801–808. doi:10.1038/ng1403 CrossRef
Medline
↵ Honda, M., M. Takagi, L. Chessa, T. Morio, S. Mizuatni. 2009. Rapid diagnosis of ataxia-telangiectasia by flow
cytometric monitoring of DNA damage-dependent ATM phosphorylation. Leukemia. 23:409–414. doi:10.1038/leu.2008.195
CrossRef
Medline
↵ Howard, M., R.A. Frizzell, D.M. Bedwell. 1996. Aminoglycoside antibiotics restore CFTR function by overcoming
premature stop mutations. Nat. Med. 2:467–469. doi:10.1038/nm0496-467 CrossRef
Medline
↵ Howard, M.T., B.H. Shirts, L.M. Petros, K.M. Flanigan, R.F. Gesteland, J.F. Atkins. 2000. Sequence specificity of
aminoglycoside-induced stop condon readthrough: potential implications for treatment of Duchenne muscular dystrophy.
Ann. Neurol. 48:164–169. doi:10.1002/1531-8249(200008)48:2<164::AID-ANA5>3.0.CO;2-B CrossRef
Medline
↵ Keeling, K.M., D.M. Bedwell. 2005. Pharmacological suppression of premature stop mutations that cause genetic diseases.
Current Pharmacogenomics. 3:259–269. doi:10.2174/157016005774913149 CrossRef
↵ Keeling, K.M., D.A. Brooks, J.J. Hopwood, P. Li, J.N. Thompson, D.M. Bedwell. 2001. Gentamicin-mediated suppression
of Hurler syndrome stop mutations restores a low level of alpha-L-iduronidase activity and reduces lysosomal
glycosaminoglycan accumulation. Hum. Mol. Genet. 10:291–299. doi:10.1093/hmg/10.3.291 Abstract/FREE Full Text
↵ Kerem, E., S. Hirawat, S. Armoni, Y. Yaakov, D. Shoseyov, M. Cohen, M. Nissim-Rafinia, H. Blau, J. Rivlin, M. Aviram,
et al. 2008. Effectiveness of PTC124 treatment of cystic fibrosis caused by nonsense mutations: a prospective phase II trial.
Lancet. 372:719–727. doi:10.1016/S0140-6736(08)61168-X CrossRef
Medline
↵ Kimura, S., K. Ito, T. Miyagi, T. Hiranuma, K. Yoshioka, S. Ozasa, M. Matsukura, M. Ikezawa, M. Matsuo, Y.
Takeshima, T. Miike. 2005. A novel approach to identify Duchenne muscular dystrophy patients for aminoglycoside
antibiotics therapy. Brain Dev. 27:400–405. doi:10.1016/j.braindev.2004.09.014 CrossRef
Medline
↵ Kitagawa, R., C.J. Bakkenist, P.J. McKinnon, M.B. Kastan. 2004. Phosphorylation of SMC1 is a critical downstream event
in the ATM-NBS1-BRCA1 pathway. Genes Dev. 18:1423–1438. doi:10.1101/gad.1200304 Abstract/FREE Full Text
↵ Lai, C.H., H.H. Chun, S.A. Nahas, M. Mitui, K.M. Gamo, L. Du, R.A. Gatti. 2004. Correction of ATM gene function by
aminoglycoside-induced read-through of premature termination codons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101:15676–15681.
doi:10.1073/pnas.0405155101 Abstract/FREE Full Text
↵ Linde, L., B. Kerem. 2008. Introducing sense into nonsense in treatments of human genetic diseases. Trends Genet.
24:552–563. doi:10.1016/j.tig.2008.08.010 CrossRef
Medline
↵ Linde, L., S. Boelz, M. Nissim-Rafinia, Y.S. Oren, M. Wilschanski, Y. Yaacov, D. Virgilis, G. Neu-Yilik, A.E. Kulozik,
E. Kerem, B. Kerem. 2007. Nonsense-mediated mRNA decay affects nonsense transcript levels and governs response of
cystic fibrosis patients to gentamicin. J. Clin. Invest. 117:683–692. doi:10.1172/JCI28523 CrossRef
Medline
↵ Loufrani, L., C. Dubroca, D. You, Z. Li, B. Levy, D. Paulin, D. Henrion. 2004. Absence of dystrophin in mice reduces
NO-dependent vascular function and vascular density: total recovery after a treatment with the aminoglycoside gentamicin.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24:671–676. doi:10.1161/01.ATV.0000118683.99628.42
Abstract/FREE Full Text
↵ Lovett, P.S., N.P. Ambulos Jr., W. Mulbry, N. Noguchi, E.J. Rogers. 1991. UGA can be decoded as tryptophan at low
efficiency in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173:1810–1812. Abstract/FREE Full Text
↵ Mendell, J.T., H.C. Dietz. 2001. When the message goes awry: disease-producing mutations that influence mRNA content
and performance. Cell. 107:411–414. doi:10.1016/S0092-8674(01)00583-9 CrossRef
Medline
↵ Mingeot-Leclercq, M.P., P.M. Tulkens. 1999. Aminoglycosides: nephrotoxicity. Antimicrob. Agents Chemother. 43:1003–
1012. FREE Full Text
↵ Nahas, S.A., A.W. Butch, L. Du, R.A. Gatti. 2009. Rapid flow cytometry-based structural maintenance of chromosomes 1
(SMC1) phosphorylation assay for identification of ataxia-telangiectasia homozygotes and heterozygotes. Clin. Chem.
55:463–472. doi:10.1373/clinchem.2008.107128 Abstract/FREE Full Text
↵ Nudelman, I., A. Rebibo-Sabbah, D. Shallom-Shezifi, M. Hainrichson, I. Stahl, T. Ben-Yosef, T. Baasov. 2006. Redesign
of aminoglycosides for treatment of human genetic diseases caused by premature stop mutations. Bioorg. Med. Chem. Lett.
16:6310–6315. doi:10.1016/j.bmcl.2006.09.013 CrossRef
Medline
↵ Perlman, S., S. Becker-Catania, R.A. Gatti. 2003. Ataxia-telangiectasia: diagnosis and treatment. Semin. Pediatr. Neurol.
10:173–182. doi:10.1016/S1071-9091(03)00026-3 CrossRef
Medline
↵ Politano, L., G. Nigro, V. Nigro, G. Piluso, S. Papparella, O. Paciello, L.I. Comi. 2003. Gentamicin administration in
Duchenne patients with premature stop codon. Preliminary results. Acta Myol. 22:15–21. Medline
↵ Rebibo-Sabbah, A., I. Nudelman, Z.M. Ahmed, T. Baasov, T. Ben-Yosef. 2007. In vitro and ex vivo suppression by
aminoglycosides of PCDH15 nonsense mutations underlying type 1 Usher syndrome. Hum. Genet. 122:373–381.
doi:10.1007/s00439-007-0410-7 CrossRef
Medline
↵ Roest, P.A., R.G. Roberts, S. Sugino, G.J. van Ommen, J.T. den Dunnen. 1993. Protein truncation test (PTT) for rapid
detection of translation-terminating mutations. Hum. Mol. Genet. 2:1719–1721. doi:10.1093/hmg/2.10.1719 Abstract/FREE
Full Text
↵ Shiloh, Y. 2006. The ATM-mediated DNA-damage response: taking shape. Trends Biochem. Sci. 31:402–410.
doi:10.1016/j.tibs.2006.05.004 CrossRef
Medline
↵ Sicinski, P., Y. Geng, A.S. Ryder-Cook, E.A. Barnard, M.G. Darlison, P.J. Barnard. 1989. The molecular basis of
muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244:1578–1580. doi:10.1126/science.2662404
Abstract/FREE Full Text
↵ Sossi, V., A. Giuli, T. Vitali, F. Tiziano, M. Mirabella, A. Antonelli, G. Neri, C. Brahe. 2001. Premature termination
mutations in exon 3 of the SMN1 gene are associated with exon skipping and a relatively mild SMA phenotype. Eur. J. Hum.
Genet. 9:113–120. doi:10.1038/sj.ejhg.5200599 CrossRef
Medline
↵ Sun, X., S.G. Becker-Catania, H.H. Chun, M.J. Hwang, Y. Huo, Z. Wang, M. Mitui, O. Sanal, L. Chessa, B. Crandall,
R.A. Gatti. 2002. Early diagnosis of ataxia-telangiectasia using radiosensitivity testing. J. Pediatr. 140:724–731.
doi:10.1067/mpd.2002.123879 CrossRef
Medline
↵ Telatar, M., Z. Wang, N. Udar, T. Liang, E. Bernatowska-Matuszkiewicz, M. Lavin, Y. Shiloh, P. Concannon, R.A. Good,
R.A. Gatti. 1996. Ataxia-telangiectasia: mutations in ATM cDNA detected by protein-truncation screening. Am. J. Hum.
Genet. 59:40–44. Medline
↵ Wagner, K.R., S. Hamed, D.W. Hadley, A.L. Gropman, A.H. Burstein, D.M. Escolar, E.P. Hoffman, K.H. Fischbeck.
2001. Gentamicin treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy due to nonsense mutations. Ann. Neurol. 49:706–
711. doi:10.1002/ana.1023 CrossRef
Medline
↵ Weiner, A.M., K. Weber. 1973. A single UGA codon functions as a natural termination signal in the coliphage q beta coat
protein cistron. J. Mol. Biol. 80:837–855. doi:10.1016/0022-2836(73)90213-1 CrossRef
Medline
↵ Welch, E.M., E.R. Barton, J. Zhuo, Y. Tomizawa, W.J. Friesen, P. Trifillis, S. Paushkin, M. Patel, C.R. Trotta, S. Hwang,
et al. 2007. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature. 447:87–91. doi:10.1038/nature05756
CrossRef
Medline
↵ Wilkinson, M.F., A.B. Shyu. 2002. RNA surveillance by nuclear scanning?Nat. Cell Biol. 4:E144–E147.
doi:10.1038/ncb0602-e144 CrossRef
Medline
↵ Wilschanski, M., C. Famini, H. Blau, J. Rivlin, A. Augarten, A. Avital, B. Kerem, E. Kerem. 2000. A pilot study of the
effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in cystic fibrosis patients carrying stop mutations. Am. J.
Respir. Crit. Care Med. 161:860–865. Abstract/FREE Full Text
↵ Yazdi, P.T., Y. Wang, S. Zhao, N. Patel, E.Y. Lee, J. Qin. 2002. SMC1 is a downstream effector in the ATM/NBS1 branch
of the human S-phase checkpoint. Genes Dev. 16:571–582. doi:10.1101/gad.970702 Abstract/FREE Full Text
↵ Zingman, L.V., S. Park, T.M. Olson, A.E. Alekseev, A. Terzic. 2007. Aminoglycoside-induced translational read-through
in disease: overcoming nonsense mutations by pharmacogenetic therapy. Clin. Pharmacol. Ther. 81:99–103.
doi:10.1038/sj.clpt.6100012 CrossRef
Medline