Функциональная стимуляция ТАТ- атрофина у дистрофин -дефицитных мышей.
реклама
Функциональная стимуляция ТАТ- атрофина у дистрофин -дефицитных мышей. Введение. Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенной формой человеческой мышечной дистрофии и вызывается мутациями в дистрофине, 427 кДа белке цитоскелета, необходимого для надлежащей стабильности мембран в мышцах [1]. Несмотря на последние достижения в области клеточной, генной терапии, олигонуклеотидов определено несколько перспективных подходов к противодействию последствиям дефицита дистрофина в моделях у животных [2] - [9], в настоящее время нет эффективных методов лечения для людей с МДД. Мы решили исследовать терапевтический потенциал атрофина (УТР), аутосомного-гомолога дистрофина, который исправляет все известные фенотипы дистрофин-дефицитных мышей MDX, когда избыточно экспрессируется на достаточном уровне [10]. Домен трансдукции белка(ОЗП) ВИЧ-1 TAT был использован для осуществления вступления TAT-слитых белков и олигонуклеотидов в каждый тип ткани, в том числе мышечных клетку. Тем не менее, "несущая способность" ТАТ PTD неизвестна, и молекулярный вес полного атрофина более чем в три раза больше, чем крупнейший ТАТбелок слияния. Поэтому, мы решили сравнить меньшую конструкцию усеченного атрофина с полной длиной атрофина. Хотя усеченный белок потенциально ставит под угрозу функцию атрофина [14], Одом и соавт. недавно показали, что вирус доставил усеченный "микро" атрофин и значительно улучшил фенотип mdx/utrn-/- мышей. Таким образом, мы стремились определить, является ли TAT-опосредованная доставка полной длины или микро-атрофина является жизнеспособным вариантом для терапевтического лечения дистрофинопатий. Мы синтезировали химерные белки TAT PTD слитые с полнометражным Utr (TAT-UTR) и ΔR4-21 "микро" УТР (TAT-μUtr), а затем оценивали способность очищенного полного TAT-UTR и TAT-μUtr для предотвращения дистрофических изменений фенотипа мыши MDX. Методы TAT-UTR и TAT-μUtr 5 'кодирующая последовательность описанная ранее 16 кб мышинного атрофина бакуловирусов построена [11] субклонирована в плазмиду ПАТ (подарок от Стивена Дауди, UCSD). Экспрессия белка и очистку проводили, как описано [11].Строительство TAT-μUtr подробно описано в тексте. Очищенные белки были стерилизованы для инъекций при прохождении через фильтр 0,22 мкм и вводят внутрибрюшинно (IP) MDX мышам в концентрации от 1,0 до 3,0 мг / мл. Белки маркировки 1 мг очищенного полного TAT-Utr или TAT-μUtr разбавляют до 1,0 мг / мл в PBS и помечают IRDye 800CW - Kit (LI-COR Biosciences) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Краситель стабильно связан с свободным амином через группу NHS. Несвязанный краситель был отделен путем обессоливания колонки и концентрация меченых белков была определена. Меченые белки были стерилизованны до инъекции, как указано выше. Инфракрасные изображения Все ткани / органы и сканирование in vivo проводилось на только что убитых или анастезированных мышей с использованием Инфракрасной системы визуализации (Li-Cor Biosciences) с использованием длины волны 700 и 800 нм. Для исследования тканевой трансдукции, пять MDX мышей получали инъекции дважды, через 72 ч., либо помеченных полной TAT-UTR (20 мкг / г веса тела), TAT-μUtr (8,5 мкг / г веса тела), или равного объема стерильной PBS. Мыши гуманно убиты через 72 ч после второй инъекции и их ткани / органы сразу же были расчленены и сканированы перед замораживанием для последующего анализа белков. Для выявления времени полураспада в тканях четырем мышам вводили однократно эквимолярные количества либо полной TAT-UTR (две группы по четыре мыши) или TAT-μUtr (две группы по четыре мыши). Через 3, 24, 48 и 72 ч после инъекции, все живые мыши были сканированы и одна мышь из каждой группы была убита для анализа тканевого белка. Лечение C57Bl/10ScSn-Dmdmdx/J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) мышей лечили параллельно (независимо от пола) дозой либо 5 (0,25 × N = 2), 10 (0,5 ×; п = 3), 20 (1 × N = 5), 40 (2 × N = 3) или 100 мкг (5 × N = 3) полного TAT-Utr / г массы тела или 8,5 мкг TAT -μUtr / г массы тела (n = 8), а MDX мыши получили равные объемы инъекций стерильной PBS (n = 13). В общей сложности два раза в неделю инъекции вводили в течение 3 недель, начиная с 18 по 35 дней от роду. В 38 день сыворотка и ткани были собраны для анализа креатинкиназы, Вестерн-блот, иммунофлюоресценции, гистологического анализа. Для анализа данных, животные, получавшие PBS, были рандомизированы на две группы: одна группа (n = 7) была использована для сравнения с группой животных, получавших полную TAT-УТР, в то время как другая группа (n = 6) была использована для сравнения с TAT-μUtr обработанными животными. Экстракция белков. Ткани были извлечены из только что убитых мышей и заморожены в жидком азоте до последующего анализа. Для SDS-экстракции замороженные ткани измельчают и белок выделен как описано ранее. Для образцов, обогащенных мембранным гликопротеинов с использованием агглютининов зародышей пшеницы (WGA) аффинной хроматографии, измельчают мышцы, а не растворяют в 1:10 (W: V) 5% буфера дигитонина в течение 1 ч при 4 ° C. Затем центрифугировали при 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин и супернатант затем наносят на WGA (50 мкл на 1 мл супернатанта). Затем шарики осаждали и промывали три раза в 10% промывочного буфера дигитонина и элюировали в 0,3 М буфера элюирования NAG. Электрофорез / вестерн-блоттинга. Для разделения 4% -16% гели BN были загружены 100 мкг WGA-Элюированного белка из TAT-μUtr обработанных MDX, MDX,получавших PBS-инъекции. Электрофарез проводился в течение примерно 2 ч при 70 В, а затем увеличен до 150 В в течение 1 часа. После того, как краситель достаточно мигрировал через гель, соответствующие полосы вырезали и загружены на вершине обычных 3% -12% градиент SDS-PAGE геля. Все Вестерн-блотт анализы проводили, как описано, используя следующие первичные антитела: атрофин мАт 8A4 (1:50; Санта-Крус), анти-β-дистрогликан мАт NCL-B-DG (1:50; Novocastra), анти-α -саркогликан мАт NCL-A-SARC (1:50; Novocastra), анти-γ-саркогликан мАт NCL-G-SARC (1:50; Novocastra), анти-дистробревин (1:50; Novocastra), анти-ННО PAB Z-RNN3 (1:1000; Invitrogen), анти-актин мАТ C4 и AC-15 (1:1000; Sigma) и Anti-Flag мАт M2 (1:1000; Sigma) и ПАБ ANTI-FLAG (1:1000 , Sigma). Вторичные антитела были разбавлены (1:5000) и обнаружены инфракрасной системой визуализации (Li-Cor Biosciences) с использованием 700 и 800 нм. Гистологический и морфометрический анализ. Индивидуальные мышцы были вскрыты и быстро замораженны в жидком азоте. Криосекции 10 мкм толщиной были помещены в криостат Leica CM3050 и окрашенны гематоксилином и эозином. Изображения были полученны с помощью Zeiss Axiovert 25 микроскопа. Доля централизованно зарождающихся волокон (УНВ) и диаметры волокон были определены из одной мышцы каждой мыши. Иммунофлюоресценция Криосекции толщиной 10 мкм окрашивали первичными антителами, как описано ранее. Изображения были получены с помощью Olympus Fluoview 1000 конфокальной микроскопии в биомедицинской лаборатории обработки изображений и импортированы в CorelDRAW 10 для подготовки. Первичные моноклональные антитела были использованы идентичны тем, которые описаны для вестерн-блоттинга. Результаты Выражение и характеристика рекомбинантного TAT-Fusion белка. Полные TAT-UTR и TAT-μUtr были выражены в инфицированных клетках и очищены с использованием анти-FLAG аффинной хроматографии (рис. 1А и S1A). Как и следовало ожидать от биохимических исследований, которые отображают актин-связывающий атрофин [14], удаление спектрин-подобных повторов в области стержней привело к 5 - до 10-кратному снижению сродства актина для TAT-μUtr (рис. S1B). Рисунок 1. TAT-μUtr стабильность в естественных условиях. Трансдукция TAT белка и стабильность Для того чтобы оценить трансдукцию TAT-μUtr и полного TAT-Utr в естественных условиях, мы пометили каждый белок инфракрасным флуоресцентным красителем и вводят две инъекции меченого белка в эквимолярной концентрации (TAT-μUtr, 8,5 мкг / г веса тела; полный TAT-UTR, 20 мкг / г веса тела) на 72 ч. Мыши были убиты через 72 ч после второй инъекции и их ткани / органы подготовлены к флуоресцентному анализу. Оба инфракрасных сканирования и Вестерн-блоттинг с помощью FLAG эпитоп-специфических антител определили TAT-μUtr в каждой ткани / органе мышей (рис. S2A). Инфракрасное сканирование тканей мышей, которым вводили меченый белок, показало повсеместную флюоресценцию и TAT-μUtr и полных TAT-UTR (рис. S2B) и на макроскопическом уровне во всех тканях проанализированы (рис. S2C и S2D ). Тем не менее, степень трансдукции TATμUtr и полных TAT-Utr зависит от ткани как интенсивность флуоресценции различных тканей и органов радикально изменилась (рис. S2E). Хотя некоторые различия можно объяснить близостью ткани / органа к месту инъекции, то непонятно, почему другие ткани / органы были преимущественно трансдуцированны в то время как соседние ткани / органы не были. Более того, полный TAT-Utr был ниже, чем TAT-μUTR по интенсивности флуоресценции (рис. S2E) и Вестерн-блот анализа (рис. S2F), предполагая, что TAT-μUTR либо трансдуцировал ткани более эффективно или был более стабильным в естественных условиях. Для оценки стабильности TAT-атрофина в естественных условиях, мы вводили одну инъекцию флуоресцентно отмеченных TAT-μUtr или полного TAT-UTR (TAT-μUtr, 8,5 мкг / г веса тела; полный TAT-UTR, 20 мкг / г веса тела) и измеряем интенсивность флуоресценции через 3, 24, 48 и 72 ч после инъекции (рис. 1С и S3A). В каждый момент времени одно животное было убито и его ткани проанализированы SDS- PAGE/Вестерн блот анализом для определения флуоресценции (рис. 1D). Хотя TAT-μUtr уровни наиболее быстро распадаются в печени (рис. 1С и 1D), флуоресценция и печени и четырехглавой мышцы параллельны флуоресценции всего тела и дошли до базового уровня через 72 ч после инъекции (рис. 1E). Таким образом, флуоресценция всего тела служила надежным отсчетом для стабильности TAT-μUtr белка в естественных условиях. 5-кратный молярный выход TAT-μUtr после экспрессии и очистки (неопубликованные данные) в сочетании с повышенной эффективностью трансдукции (рис. 1 и 2) заставило нас сосредоточиться на терапевтическом потенциале TAT-μUtr. Мы вводили два раза в неделю инъекции основываясь на открытии, что фракция белка остается стабильным в течение по крайней мере трех дней после инъекции (рис. 1D). Временные рамки нашей инъекции повлияли на уровень экспрессии трансгенного атрофина, необходимого для улучшения MDX фенотипа. Таким образом, MDX мыши получили шесть инъекций два раза в неделю TATμUtr (8,5 мкг / г веса тела), начиная с 18 дня после родов (рис. 1F). Рисунок 2. TAT-μUtr преобразовывает MDX ткани. TAT-μUtr формы μUGC В общей сложности восемь мышей MDX (каждая случайно выбрана) получили шесть инъекций, в то время как другой группе MDX вводили равные объемы стерильного PBS. Чтобы оценить, достигнул ли введенный TAT-μUtr системной трансдукции, мы сначала проанализировали несколько экстрактов ткани путем Вестерн-блота и наблюдается сильная иммунореактивность, соответствующая TAT-μUtr только в образцах от мышей, получавших лечение (рис. 2A). Относительный уровень TAT-μUtr в тканях у мышей, получавших шесть инъекций, был больше, чем у мышей, получавших две инъекции, и экстракты поперечнополосатых мышц имели высокие уровни TAT-μUtr иммунореактивности после шести инъекций по сравнению с немышечными тканями (сравните рисунки 2А и S2A). Хотя механизм, приводящий к этой находке неизвестен, возможно, это связано с различиями в присущей стабильности TAT-μUtr в мышцах по сравнению с другими тканями (рис. 1D и 1E). Важно отметить, что вестерн-блотт с атрофина-специфическими антителами показал, что количество эндогенного полного атрофина не изменился в тканях мышей, которым вводили TAT-μUtr (рис. 2В), указывая, что любое влияние TAT-μUtr на дистрофический фенотип не был связан с изменениями в экспрессии эндогенного атрофина. Для оценки внутриклеточной локализации TAT-μUtr, мы окрашивали криосекции четырехглавой мышцы с первичными антителами против атрофина и наблюдали интенсивное окрашивание по периферии мышечных клеток мышей (рис. 2С). Окрашивание контроля на наличие TAT-μUtr согласуется с расположением дистрофина в клетках дикого типа мышц. Взятые вместе, Вестерн-блот и иммунофлюоресценция, данные на рисунке 2, показывают стабильное системное преобразование и внутриклеточная локализации ТАТ-μUtr. Поскольку потеря экспрессии дистрофина приводит к дестабилизации и сопутствующим потерям других компонентов дистрофин-гликопротеинового комплекса (ДГК) из мембраны мышечных клеток [1], мы рассмотрели как TAT-μUtr восстанавливал ДГК сарколеммы и улучшал стабильность мембран. Иммунофлуоресценция с использованием антител к гликопротеинам α-дистрогликану, β-дистрогликану, α-саркогликану, и γ-саркогликану показала лишь слабый или отсутствующий сигнал на криосекций от мышей, которым вводили PBS, в то время как каждый зонд показал интенсивное окрашивание по периферии клетки у мышей, получавших TAT-μUtr (рис. 3А). Кроме того, внутриклеточные компоненты дистробревина и NO синтазы (ННО) также были локализованы на периферии клетки очищенных мышц, предполагая, что введение TAT-μUtr помогало правильно взаимодействовать с эндогенным дистрофин / атрофин связывающих компонентов (рис. 3А). В соответствии с данным иммунофлюоресценции на рисунке 3А, TAT-μUtr и все ДГК компоненты были обогащены, в то время как уровень эндогенного атрофина остался неизменным (рис. 3В). Эти данные позволяют предположить, что биохимически стабильный "микро" атрофин-гликопротеиновый комплекс (μUGC), образован дополнением к эндогенным АГК у дистрофин-дефицитных мышц. Для дальнейшей проверки устойчивости связи между TAT-μUtr и гликопротеиновым комплексом, мы провели двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D BN-PAGE) на WGA обогащенный экстрактами мышц у PBS и TAT-μUtr мышей [20 ]. Вестерн блот образцов от мышей, получавших PBS, исследовали с антителами к атрофину показали, что эндогенный (FLAG-менее) ~ 400 кДа атрофин конъюгированный с β-дистрогликаном в белковом комплексе ~ 1 × 106 кДа (рис. 3C, S4A, и S4B), в доказательство того, что 2D BN-PAGE экстракт WGA мышц для правильного синтеза эндогенного АГК. Важно отметить, что вестерн блот образцы TAT-μUtr мышей исследовали на атрофин и показали, что оба эндогенных (FLAG-менее) Utr и FLAGреактивный TAT-μUtr конъюгированый с β-DG (рис. 3 и рис S4C). Чтобы окончательно проверить, является ли Utr / FLAG-реактивные группы в очищенных экстрактах мышц объединенными TAT-μUtr, которые мигрировали и совпадают с эндогенным АГК. Последующий Вестерн-блотт четко отличит "свободные" TAT-μUtr от TAT-μUtr в комплексе с β-DG (рис. 3D). ΜUGC также смягчит дефекты устойчивости мембраны мышей MDX, как показали значительное снижение в сыворотке крови уровня креатинкиназы (Рис. 3E). Рисунок 3. Формирование μUGC. TAT-μUtr улучшает мышечную функцию MDX В соответствии с восстановлением функциональной μUGC у мышей MDX, гистологическое исследование TAT-μUtr обработанных мышц показали заметное улучшение общего состояния здоровья лечених мышц. Окрашивание гематоксилином-эозином криосекции от TAT-μUtr обработанных мышей мышц показало общее единообразие размеров клеток и появление через несколько отдельных мышц, в то время как контрольная группа мышей отображает обширную мононуклеарную клеточную инфильтрацию и мелкие регенерирующие волокна (рис. 4А и 4В). Наблюдаемое увеличение диаметра волокна в TATμUtr обработанных образцах (рис. 4D), вероятно, в связи с сокращением количества мелких регенерирующих волокон, обычно встречаются в MDX мышцах. Все три параметра указывают, что TAT-μUtr лечение значительно сократило гибель мышечных клеток в отсутствие дистрофина. Рисунок 4. Морфология TAT-μUtr мышцы. Дефицит дистрофина также характеризуется дефицитом сократительной силы. Длинный разгибатель пальцев (EDL) от TAT-μUtr-обработанных мышей показал значительное улучшение бывших естественных функциональных характеристик (рис. 5). В то время как мышцы обычно демонстрируют снижение на 25% конкретных производственных сил по сравнению с диким типом мышц [23], TAT-μUtr обработанные MDX мышцы генерируют сопоставимую максимальную силу (рис. 5), на ~ 25% больше, нормированной удельной силы (рис. 5B), чем мышцы с PBS-инъекциями. Кроме того, MDX мышцы обычно теряют около 75% своей мощности по истечении пяти удлинений (эксцентрических) по сравнению с ~ 20% дикого типа мышц [1]. Эти результаты показывают, что лечение TAT-μUtr значительно улучшилает сократительную производительность дистрофин-дефицитных MDX мышц. Рисунок 5. Сократительные свойства TAT-μUtr леченых мышц. Чтобы проверить эффективность полнометражного TAT-UTR, мы рассматривали шесть мышей MDX, как указано выше, получавших инъекции полного TAT-Utr с разнообразными молярными соотношениями (0,25 ×, 0.5 ×, 2 ×, и 5 ×) в дозировке описанные для TAT-μUtr. Как TAT-μUtr, полные TAT-Utr трансдуцировали все исследованные ткани на 1 × дозы (рис. S4B и S5A) и были должным образом локализованы на периферии клетки (рис. S5C). Как и в TAT-μUtr, полные TAT-Utr значительно сократили дегенерацию мышц (рис. S6A-S6D) и улучшили стабильность мембраны (рис. S6E). Однако, мышечная сократительная производительность существенно не улучшились при полной длине TAT-Utr даже при тестировании в 5-кратных более высоких дозах (рис. S6F). Мы пришли к выводу, что повышение трансдукции белка получено за счет снижения молекулярной массы атрофина, которое преодолевает любые потери биологической функции TAT-μUtr, и предложить TATμUtr в качестве потенциальной терапии для дистрофинопатии. Обсуждение. Наши эксперименты, насколько нам известно, впервые показали целесообразность и эффективность прямой замены белка в борьбе с последствиями дефицита дистрофина у мышей MDX. Инъекции TAT-μUtr , проникающие в клетки, восстанавливают белковый комплекс мембраны, для стабилизации целостности мембраны, ослабляя гистологические признаки дистрофии. Первоначальные исследования, в которых недостаток дистрофина был устранен путем реинтродукции экспрессии либо дистрофина [24] или атрофина [10], которое является эффективным методом лечения и скоро будет реализовано. Несмотря на последовательный прогресс, достигнутый за прошедшие годы, препятствия на пути генной терапии, лечением олигонуклеотидами, или небольшими молекулами к регулированию соответствующих белков, все еще существуют и до сих пор не являются эффективным терапевтическим вмешательством у пациентов. Наше развитие TAT-μUtr и демонстрация его благотворного влияния на дистрофические мышцы без влияния эндогенных уровней атрофина или функции, мы прогнозируем, что новый терапевтический подход будет работать взаимодополняемо и синергично с другими стратегиями, в частности теми, которые направлены на ко-регулирующую эндогенную экспрессию атрофина. Благотворное влияние сочетания таких методов лечения теоретически предсказывает, что совокупного увеличения уровня атрофина будет достаточно, чтобы существенно предотвратить или отсрочить развитие фенотипа, связанного с дефицитом дистрофина. Наше доказательство правильности концепции предлагает первое свидетельство, насколько мы знаем, что экзогенные белки терапии замены эффективны. Помимо очевидных примеров мышечной дистрофии Дюшенна, мы заинтригованы возможностью того, что TATμUtr может также быть в состоянии компенсировать потери дистрофина при генетической или острых формах кардиомиопатии. Ссылки Blake DJ, Weir A, Newey SE, Davies KE (2002) Function and genetics of dystrophin and dystrophinrelated proteins in muscle. Physiol Rev 82: 291–329. Find this article online Sampaolesi M, Blot S, D'Antona G, Granger N, Tonlorenzi R, et al. (2006) Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature 444: 574–579. Find this article online Gregorevic P, Allen JM, Minami E, Blankinship MJ, Haraguchi M, et al. (2006) rAAV6microdystrophin preserves muscle function and extends lifespan in severely dystrophic mice. Nat Med 12: 787–789. Find this article online Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, Leturcq F, Kaplan JC, et al. (2004) Rescue of dystrophic muscle through U7 snRNA-mediated exon skipping. Science 306: 1796–1799. Find this article online Minetti GC, Colussi C, Adami R, Serra C, Mozzetta C, et al. (2006) Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors. Nat Med 12: 1147– 1150. Find this article online Cohn RD, van Erp C, Habashi JP, Soleimani AA, Klein EC, et al. (2007) Angiotensin II type 1 receptor blockade attenuates TGF-beta-induced failure of muscle regeneration in multiple myopathic states. Nat Med 13: 204–210. Find this article online Yasuda S, Townsend D, Michele DE, Favre EG, Day SM, et al. (2005) Dystrophic heart failure blocked by membrane sealant poloxamer. Nature 436: 1025–1029. Find this article online Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, et al. (2002) Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420: 418–421. Find this article online Yin H, Lu Q, Wood M (2008) Effective exon skipping and restoration of dystrophin expression by peptide nucleic acid antisense oligonucleotides in mdx mice. Mol Ther 16: 38–45. Find this article online Tinsley J, Deconinck N, Fisher R, Kahn D, Phelps S, et al. (1998) Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med 4: 1441–1444. Find this article online Rybakova IN, Patel JR, Davies KE, Yurchenco PD, Ervasti JM (2002) Utrophin binds laterally along actin filaments and can couple costameric actin with the sarcolemma when overexpressed in dystrophin-deficient muscle. Mol Biol Cell 13: 1512–1521. Find this article online Schwarze SR, Ho A, Vocero-Akbani A, Dowdy SF (1999) In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 285: 1569–1572. Find this article online Haase H, Dobbernack G, Tunnemann G, Karczewski P, Cardoso C, et al. (2006) Minigenes encoding N-terminal domains of human cardiac myosin light chain-1 improve heart function of transgenic rats. FASEB J 20: 865–873. Find this article online Rybakova IN, Ervasti JM (2005) Identification of spectrin-like repeats required for high affinity utrophin-actin interaction. J Biol Chem 280: 23018–23023. Find this article online Odom GL, Gregorevic P, Allen JM, Finn E, Chamberlain JS (2008) Microutrophin delivery through rAAV6 increases lifespan and improves muscle function in dystrophic dystrophin/utrophindeficient mice. Mol Ther 16: 1539–1545. Find this article online Sonnemann KJ, Fitzsimons DP, Patel JR, Liu Y, Schneider MF, et al. (2006) Cytoplasmic γ-actin is not required for skeletal muscle development but its absence leads to a progressive myopathy. Dev Cell 11: 387–397. Find this article online Rybakova IN, Humston JM, Sonnemann KJ, Ervasti JM (2006) Dystrophin and utrophin bind actin filaments through distinct modes of contact. J Biol Chem 281: 9996–10001. Find this article online Warner LE, DelloRusso C, Crawford RW, Rybakova IN, Patel JR, et al. (2002) Expression of Dp260 in muscle tethers the actin cytoskeleton to the dystrophin-glycoprotein complex. Hum Mol Genet 11: 1095–1105. Find this article online Squire S, Raymackers JM, Vandebrouck C, Potter A, Tinsley J, et al. (2002) Prevention of pathology in mdx mice by expression of utrophin: analysis using an inducible transgenic expression system. Hum Mol Genet 11: 3333–3344. Find this article online Swamy M, Siegers GM, Minguet S, Wollscheid B, Schamel WW (2006) Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE 2006: l4. Find this article online Petrof BJ, Shrager JB, Stedman HH, Kelly AM, Sweeney HL (1993) Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 3710–3714. Find this article online Moens P, Baatsen PH, Marechal G (1993) Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. J Muscle Res Cell Motil 14: 446–451. Find this article online Lowe DA, Williams BO, Thomas DD, Grange RW (2006) Molecular and cellular contractile dysfunction of dystrophic muscle from young mice. Muscle Nerve 34: 92–100. Find this article online Cox GA, Cole NM, Matsumura K, Phelps SF, Hauschka SD, et al. (1993) Overexpression of dystrophin in transgenic mdx mice eliminates dystrophic symptoms without toxicity. Nature 364: 725–729. Find this article online Khurana TS, Davies KE (2003) Pharmacological strategies for muscular dystrophy. Nat Rev Drug Discov 2: 379–390. Find this article online Krag TO, Bogdanovich S, Jensen CJ, Fischer MD, Hansen-Schwartz J, et al. (2004) Heregulin ameliorates the dystrophic phenotype in mdx mice. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 13856–13860. Find this article online Towbin JA, Hejtmancik JF, Brink P, Gelb B, Zhu XM, et al. (1993) X-linked dilated cardiomyopathy: Molecular genetic evidence of linkage to the Duchenne muscular dystrophy (dystrophin) gene at the Xp21 locus. Circulation 87: 1854–1865. Find this article online Badorff C, Lee G-H, Lamphear BJ, Martone ME, Campbell KP, et al. (1999) Enteroviral protease 2A cleaves dystrophin: Evidence of cytoskeletal disruption in an acquired cardiomyopathy. Nat Med 5: 320–326. Find this article online Kramarcy NR, Vidal A, Froehner SC, Sealock R (1994) Association of utrophin and multiple dystrophin short forms with the mammalian Mr 58,000 dystrophin-associated protein (syntrophin). J Biol Chem 269: 2870–2876. Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org/ Оригинал http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000083 статьи
