На правах рукописи 03.03.01 – физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
advertisement
На правах рукописи МАСЛОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА РОЛЬ КИСЛОРОДА В МЕЖКЛЕТОЧНОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК IN VITRO 03.03.01 – физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медикобиологических проблем Российской академии наук. Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Романов Юрий Аскольдович кандидат биологических наук Андреева Елена Ромуальдовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией клеточной иммунопатологии и биотехнологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН Болтовская Марина Николаевна доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией протеомики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации – Института медикобиологических проблем Российской академии наук Ларина Ирина Михайловна Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук Защита диссертации состоится «____» ____________ 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации – Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации – Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу (123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а). Автореферат разослан «____» ноября 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук М.А. Левинских 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Идея ниши, как специфического микроокружения, модулирующего поведение стволовых клеток, была предложена Шофилдом в 1978 году, что дало начало бурно развивающейся сегодня области исследования – ниш стволовых клеток (Schofield et al., 1978). Судьбу гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) определяет кроветворная ниша, расположенная в костном мозге. Клеточные и неклеточные компоненты микроокружения поддерживают состояние покоя, деления, самообновления или дифференцировки ГСК. Известно, что в костном мозге более примитивные гемопоэтические клетки находятся при 1 – 2% кислорода в окружении остеобластов и клеток стромы, в то время как более зрелые предшественники расположены в сосудистой нише, где уровень кислорода выше (Parmar et al., 2007). Показано, что в условиях in vitro содержание кислорода может влиять на гемопоэтические клетки, оказывая существенный эффект на предшественников одного уровня иерархии и оставаясь индифферентным для других (Cipolleschi et al., 1993). Известно, что свойства стромальных клеток – основного клеточного компонента костномозговой ниши, также зависят от уровня кислорода. В опытах in vitro показано, что при гипоксии увеличивается их пролиферативная активность и число КОЕ-Ф, замедляется дифференцировка в остео- и адипогенном направлении, а в хондрогенном усиливается (Буравкова и др., 2009; Grayson et al., 2007; Fehrer et al., 2007; Nekanti et al., 2010). К сожалению, влиянию концентрации кислорода на взаимодействие гемопоэтических и стромальных клеток до сих пор уделяется недостаточно внимания. В нашей лаборатории впервые было показано, что при совместном культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и ГСК происходит увеличение продукции медаторов, опосредующих взаимодействие гемопоэтичеких и стромальных клеток (Жамбалова и др., 2009). В более поздних работах других авторов продемонстрировано, что, в отличие от стандартных условий культивирования, низкие концентрации кислорода способствуют поддержанию ранних гемопоэтических клеток, находящихся в состоянии покоя (Hammoud et al., 2011; Jing et al., 2012). Большая часть исследований по взаимодействию ММСК и ГСК до недавнего времени проводилась на стромальных и гемопоэтических предшественниках, выделенных из костного мозга (Arai & Suda, 2007; Valtieri & Sorrentino, 2008). В результате было показано, что ММСК, использованные в качестве фидерного подслоя, могут существенным образом влиять на сокультивируемые с ними ГСК, 3 в частности, изменяя соотношение коммитированных и малодифференцированных предшественников, обеспечивающих длительное восстановление кроветворения (Петрова и др., 2006; Moore et al., 1997; Punzel et al., 2003; McNiece et al., 2004; Freund et al., 2006; Hofmeister et al., 2007; Wagner et al., 2007). ММСК из жировой ткани человека (жтММСК), также как и ММСК из костного мозга могут поддерживать гемопоэз in vitro (Corre et al., 2006). Однако, несмотря на близкое родство, ММСК из жировой ткани с меньшей эффективностью, чем ММСК из других источников способствуют пролиферации примитивных гемопоэтических предшественников (Wagner et al., 2007). Аналогичные результаты получены и в других работах, где показано, что при сокультивировании ГСК и МСК из жировой ткани образуется меньшее количество CD34+ клеток, чем при сокультивировании с костномозговыми ММСК (Kirloy et al., 2007; de Toni et al., 2011). С другой стороны, ММСК из жировой ткани способствуют дифференцировке ГСК и более эффективно поддерживают дифференцированные гемопоэтические предшественники (Nakao et al., 2010). Как альтернативу гемопоэтическим клеткам костного мозга все чаще используют мононуклеары пуповинной крови (пкМНК) (Maniani et al., 1998). Несмотря на то, что это перспективный и легкодоступный источник ГСК, существенным недостатком применения является ограниченное количество стволовых клеток. С целью обогащения ранними гемопоэтическими предшественниками используют различные варианты культивирования клеток пуповинной крови (Bridell et al., 1997, Mayani et al., 1998, McNiece et al., 2004). Основное внимание исследователей при этом сосредоточено на подборе компонентов ростовых сред и методов изоляции малодифференцированных клеток. Между тем, в большинстве существующих моделей культивирования ГСК из пуповинной крови остается недооцененной роль локального микроокружения: взаимодействия со стромальными элементами, паракринной регуляции и концентрации кислорода. Несмотря на проведение большого количества исследований, направленных на изучение межклеточных взаимодействий в тканевой нише гемопоэтических клеток, конкретные пути реализации влияния ниши на стволовые клетки до сих пор остаются нераскрытыми. Изучение особенностей взаимодействия гемопоэтических и стромальных клеток в условиях тканевых концентраций кислорода позволит расширить представления о влиянии факторов микроокружения на регуляцию гемопоэза, а также может использоваться в дальнейшем при разработке методик обогащения стволовыми и прогениторными клетками трансплантатов кроветворной ткани. 4 Цель и задачи исследования Целью данной работы являлось сравнительное изучение особенностей межклеточного взаимодействия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и гемопоэтических стволовых клеток в условиях различного содержания кислорода. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи: 1) разработать экспериментальную модель для получения адгезирующих малодифференцированных предшественников пкМНК с использованием жтММСК; 2) оценить влияние сокультивирования с жтММСК при различном содержании кислорода на адгезирующую и суспензионную фракции пкМНК; 3) охарактеризовать функциональные и фенотипические особенности гемопоэтических клеток, образующихся из адгезирующей к жтММСК фракции пкМНК; 4) оценить влияние сокультивирования с жтММСК и различных концентраций кислорода на продукцию паракринных медиаторов пкМНК и полученными из них малодифференцированными гемопоэтическими предшественниками. Научная новизна Разработана и апробирована модель совместного культивирования жтММСК и пкМНК, в которой способность адгезирующей фракции пкМНК к экспансии оценивается при культивировании в отсутствие суспензионной фракции. Впервые показано, что жтММСК в диапазоне концентраций кислорода 1-5-20% в среде при совместном культивировании могут эффективно поддерживать жизнеспособность пкМНК, в том числе малодифференцированных предшественников. Впервые показано, что адгезирующая к жтММСК фракция пкМНК способна генерировать популяцию клеток, обогащенную гемопоэтическими предшественниками разной степени коммитированности. Установлено, что в условиях пониженного содержания кислорода из пкМНК образуется большее количество гемопоэтических колоний, а также изменяется соотношение колониеобразующих единиц (КОЕ): увеличивается доля унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшается доля мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ). После кратковременного сокультивирования пкМНК с жтММСК этот эффект более выражен. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что при сокультивировании пкМНК и жтММСК происходит изменение профиля продуцируемых хемокинов IL-8, MIP-1b 5 и МСР-1, опосредующих взаимодействие клеток. Показано, что степень этого изменения может зависеть от уровня кислорода в среде культивирования. Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты вносят значительный вклад в существующие представления о влиянии факторов микроокружения на гемопоэтические клетки. Было показано, что жтММСК эффективно поддерживают экспансию гемопоэтических предшественников из пкМНК различной степени коммитированности в пределах 1%–20% кислорода. При тканевых концентрациях кислорода среди пкМНК выявлялось больше КОЕ и изменялся их субпопуляционный состав, что приводило к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕМ) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ). Впервые для исследования роли кислорода во взаимодействии гемопоэтических и стромальных клеток сокультивировании был пкМНК использован и методический жтММСК. Проведенное подход, основанный исследование на позволило продемонстрировать, что использование жтММСК в качестве стромального подслоя и варьирование содержания кислорода в среде культивирования пкМНК могут быть использованы как факторы, модулирующие свойства гемопоэтических клеток, получаемых при экспансии. Заявка на патент №2013112801 от 22.03.2013 «Способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (ММСК)». Положения, выносимые на защиту 1. Разработан методический подход, в котором адгезировавшие к жтММСК пкМНК в отсутствие суспензионной фракции способны генерировать популяцию предшественников разной степени коммитированности. 2. При пониженном содержании кислорода (1% и 5%) в сокультуре пкМНК и жтММСК увеличивается общее количество КОЕ и изменяется их субпопуляционный состав, приводя к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ). 6 Апробация работы Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), the 7th Fraunhofer Life Science Symposium (Germany, Leipzig, 2012), XI и XII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва, 2012, 2013), XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвящённой 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ, 1 статья в сборнике «Стволовые клетки и регенеративная медицина», 7 тезисов докладов. Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук» 16.10.2013 г. Связь работы с научными программами Работа выполнена при поддержке программ ОБН РАН и РФФИ №10-04-01158-а, 13-0400791. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 126 страницах, содержит 29 рисунков и 10 таблиц. Список литературы состоит из 202 цитируемых источников, из которых 18 - на русском и 184 - на иностранном языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Мезенхимальные клетки (жтММСК) выделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека по стандартной методике (Zuk P. et al. 2001) с нашими модификациями (Буравкова Л. Б. и др., 2009) и культивировали в среде α-MEM (Gibco, США), с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, HyClone, США) и 1% 7 пенициллина/стрептомицина (Gibco, США) в условиях 5% СО2, 37оС, 100% влажности при 1%, 5% и 20% кислорода. Для экспериментов использовали клетки 3-4 пассажей. Перед проведением эксперимента клетки инкубировали ночь в присутствии митомицина С (1.5 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США) с целью остановки деления, а затем проводили пересев с плотностью, позволяющей получить 70-80% монослой. Криоконсервированные образцы мононуклеаров пуповинной крови (пкМНК) были предоставлены Банком стволовых клеток «КриоЦентр» (Москва). В день эксперимента клетки размораживали на водяной бане при +37 ºС и отмывали от криопротектора в избытке среды культивирования RPMI 1640 (Gibco, США), содержащей 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия), 10% ЭТС и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco, США). После оценки жизнеспособности в тесте с трипановым синим концентрацию клеток доводили до 1.52.5х106 клеток/мл и использовали в течение 30 минут. Исх. пкМНК Удаление неадгезированных клеток жтММСК 0 день Образование суспензии клеток Культура 1 Культура 2 72 часа 7 день Рис. 1. Схема эксперимента. Суспензию пкМНК добавляли к жтММСК в концентрации 1.5-2.5х106 клеток/мл и культивировали совместно в условиях 1%, 5% и 20% кислорода (+37С, 5% СО2, влажная атмосфера) в течение 72 часов. После этого суспензию клеток отбирали, а адгезировавшую фракцию культивировали в течение 96 часов. За это время происходило образование суспензии клеток. Сокультура полной популяции пкМНК и жтММСК была обозначена как культура 1, адгезирующая фракция пкМНК и вновь образованная популяция клеток – культура 2. Схема эксперимента представлена на рис. 1. В культурах 1 и 2 был проведен сравнительный анализ влияния 1%, 5% и 20% О2 на ряд параметров, определяющих фенотипические и функциональные особенности гемопоэтических предшественники. Жизнеспособность и количество адгезированных клеток определяли с помощью одновременного окрашивания флуоресцеин-диацетатом (Sigma, США) и пропидий-йодидом 8 (Invitrogen, США). Живые клетки выявляли по наличию свечения флуоресцеина, а мертвые – по окрашиванию пропидий-йодидом. Анализировали не менее 5 рандомически выбранных полей зрения площадью 0,6 мм2. Анализ изображений проводили в программах NIS-elements (Япония) и Sigma Scan (США). Мазки или стекла с клетками фиксировали ледяным метанолом в течение 5 минут и окрашивали по Гимзе в соответствии с инструкцией производителя. После окрашивания и высушивания стекла заключали в среду Poly-Mount. Для идентификации гемопоэтических клеток использовали гематологический атлас (Абрамов М.В., 1985). Препараты анализировали на микроскопе Nikon Eclipse TiU (Nikon, Япония). Субпопуляционный состав, активацию и жизнеспособность пкМНК до и после сокультивирования с жтММСК определяли с помощью проточной цитометрии на приборе EPICS XL (Beckman Coulter, США). В работе использовали ФИТЦ-, фикоэритрин- и PerCPконъюгированные антитела к СD45, СD34, СD133, СD90, СD105, CD3, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19, CD3/CD(16+56), CD3/CD25, CD3/HLA-DR, CD3/CD69 (BD Pharmingen, США; Miltenyi Biotec, Германия) и набор AnnexinV-FITC/PI (Immunotec, Франция) в концентрации, рекомендованной изготовителем. Наличие колониеобразующих единиц (КОЕ) оценивали по образованию колоний в полужидкой среде MethoCult H4034 Optimum (STEMCELL Technologies, Канада), содержащей коктейль цитокинов и факторов роста. Суспензию клеток вносили в среду согласно инструкции производителя, число и состав колоний оценивали на 14 сутки. Наличие клеток, образующих области булыжника (КООБ), регистрировали по появлению в культуре «областей булыжной мостовой», которые обнаруживались с помощью фазово-контрастной микроскопии и визуально представляли плотные скопления клеток, располагающиеся под слоем ММСК. Содержание хемокинов в среде культивирования оценивали на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованим набора FlowCytomix human 6-plex (Bender Medsystems, Австрия), который позволяет выявлять в образцах содержание 6 хемокинов (IL8, MIP-1b, МСР-1, MIP-1a, G-CSF и MIG) одновременно. Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни в программах «Microsoft Excel 2000» и «Statistica 7.0». Различия считали достоверными при р<0.05. 9 Результаты исследования и их обсуждение Анализ исходной популяции пкМНК В данной работе была использована криоконсервированная популяция пкМНК, не подвергшаяся селекции. В исходной популяции пкМНК ГСК с фенотипом CD45+/CD34+ обладали высокой жизнеспособностью, однако их количество составляло менее 0,5%. Согласно как полученным нами, так и литературным данным (de Wynter et al., 1998), большая часть гемопоэтических клеток популяции пкМНК представлена поздними предшественниками с фенотипом CD34+CD133-, в меньшей степени средними - CD34+CD133+ и совсем небольшой долей ранних CD34-CD133+. Результаты анализа субпопуляционного состава и жизнеспособности исходной популяции пкМНК представлены в табл. 1. Таблица 1. Характеристика пкМНК после выделения и криогенного хранения (n=10, M±m) Популяция лимфоциты моноциты гранулоциты ГСК (CD45+/CD34+) в том числе (% от всех ГСК): поздние (CD45+/CD34+/CD133-) средние (CD45+/CD34+/CD133+) ранние (CD45+/CD34-/CD133+) Доля, % 27.6+5.2 9.1+0.5 44.2+5.3 0.48+0.21 Жизнеспособность, % После выделения 99.8+0.4 99.8+0.1 98.9+1.1 99.8+0.2 После размораживания 98.2+1.3 98.5+1.2 80.1+8.5 97.1+1.8 80.7+4.5 14.3+3.8 3.8+2.3 - - Морфологический анализ показал присутствие в исходной популяции пкМНК гемопоэтических предшественников, способных к делению: промиелоцитов, миелоцитов, базофильных и полихроматофильных эритробластов, а также зрелых форменных элементов (рис. 2). Помимо этого выявлялись незрелые формы клеток: оксифильные эритробласты, метамиелоциты и палочкоядерные гранулоциты, а также клетки, относящиеся к лимфоидному и моноцитарному росткам, степень зрелости которых невозможно установить с помощью световой микроскопии (рис. 2). 10 Рис. 2. Мононуклеары пуповинной крови. А – базофильный эритробласт; Б – полихроматофильный эритробласт; В – A Б В Г оксифильный эритробласт; Г – моноцит; Д – нейтрофильный промиелоцит; Е – нейтрофильный миелоцит; Ж – палочкоядерные Д Е Ж З гранулоциты; З – базофильный гранулоцит (Окрашивание по Гимзе, масштабный отрезок 1 мкм). Монокультура пкМНК Прикрепившиеся к поверхности культуральной чашки мононуклеары морфологически были сходны с клетками моноцитарного ряда и на более поздних сроках культивирования – с макрофагами (рис. 3). В монокультуре пкМНК без стромального подслоя жизнеспособность и пролиферация гемопоэтических клеток не поддерживались, что свидетельствует о недостатке поддерживающего влияния клеток микроокружения. A Б В Г Рис. 3. Мононуклеары пуповинной крови. А – 11 суток культивирования (стрелкой отмечена метафазная пластинка); Б – иммуноцитохимическое выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) (черные стрелки указывают на окрашенные ядра, красные – на неокрашенные ядра); В, Г – выявление маркеров моноцитов/макрофагов CD14 и CD9, соответственно (А – окрашивание по Гимзе, масштабный отрезок 50 мкм). Взаимодействие пкМНК с жтММСК при концентрациях кислорода, близких к тканевым Модель совместного культивирования гемопоэтических и стромальных клеток была предложена еще в 1977 году в работах Декстера и соавторов (Dexter et al., 1977). Было 11 показано, что в совместных культурах гемопоэтических и стромальных клеток часть клеток прикрепляется к подложке, а часть – находятся в суспензии. Позднее две независимые группы исследователей продемонстрировали, что гемопоэтические клетки адгезирующей фракции являются наиболее пролиферативно активными (Wagner et al., 2007; Jing et al., 2010). Мы использовали этот факт в данной работе, для того чтобы оценить влияние кислорода на адгезировавшие к жтММСК пролиферативно активные пкМНК. После 72 часов сокультивирования в условиях различного содержания кислорода часть пкМНК адгезировала к жтММСК, а часть оставалась в суспензии над ними (рис. 4). Рис. 4. Количество клеток суспензионной и адгезируюшей фракций пкМНК в культуре 1 (M±m, n=4). 300 200 3 X10 кл/см 2 Культура 1 100 0 В 1% 5% Сусп. кл. Адгез. кл. суспензионной жизнеспособностью, предшественники 20% и адгезирующей среди гранулоцитов, фракциях адгезированных а также клетки пкМНК клетки, обладали были относящиеся высокой преимущественно к моноцитарному, лимфоидному и эритроидному росткам (рис. 5). В суспензионной фракции клеток состав был аналогичен. Моноцит Нейтрофильные гранулоциты Эозинофильные гранулоциты Лимфоциты/ бластные клетки (?) 1%O2 5%O2 20%O2 Рис. 5. пкМНК, адгезирующие к ММСК, в культуре 1 (окрашивание по Гимзе, масштабный отрезок 50 мкм). 12 Популяционный состав лимфоцитов среди неадгезирующих пкМНК после 72 часов сокультивирования с жтММСК изменился за счет двукратного уменьшения доли В- и ЕКклеток (рис. 6). Среди Т-клеток значительно уменьшилась доля Т-ЕК-клеток (рис. 6). При оценке экспрессии молекул, характеризующих активацию Т-клеток (CD69, CD25 и НLA-DR) оказалось, что доля CD69+ и CD25+ уменьшалась, а НLA-DR – не изменилась (рис. 6), что свидетельствует об отсутствии активации зрелых иммуноцитов при взаимодействии с аллогенными жтММСК. Субпопуляции Т-клеток пуповинной крови Популяционный состав лимфоцитов пуповинной крови * * 45 % % 75 50 15 25 * 0 Т-клетки * 0 Т-хелперы В-клетки ЕК-клетки 6 4 2 0 CD3+/HLA-DR+ CD3+/CD25+ цитотоксические Тклетки Т-ЕК-клетки Рис. 6. Иммунофенотип пкМНК: белые столбцы – исходные пкМНК; серые столбцы – культура 1 при 5% О2; черные столбцы культура 1 при 20% О2 (M ± m, n=5, * достоверное отличие от значения исх. пкМНК, p<0,05). Экспрессия маркеров активации Т-клетками пуповинной крови % 30 Для функциональной характеристики CD3+/CD69+ пкМНК был использован тест на способность образовывать колонии в полужидкой среде MethoCult H4034. Клетки культивировали в полужидкой среде, используя концентрацию кислорода, при которой проводили сокультивирование с жтММСК. При той же концентрации кислорода определяли число КОЕ среди исходных пкМНК. Исходные пкМНК, культивируемые в полужидкой среде при 1% и 5% кислорода образовывали большее количество колоний, чем при 20% О2. После сокультивирования этот эффект сохранялся, но был менее выражен (рис. 7). Культура 1 Кратность отл., отн. ед. Кратность отл., отн. ед. Исх. пкМНК 2,0 1,5 * 1,0 0,5 0,0 1% 5% 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 20% 1% 5% 20% Рис. 7. Выявление КОЕ среди пкМНК при различном содержании кислорода (Данные представлены как кратность отличий от значения при 20% О2; M±m, n=3-7, * - достоверное отличие от 20% О2, p<0,05). В зависимости от концентрации кислорода изменялось соотношение КОЕ различных кроветворных ростков: увеличивалось содержание 13 более коммитированных предшественников – КОЕ-Г и КОЕ-М, а мульти- и бипотентных – КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ – уменьшалось (табл. 2). После сокультивирования пкМНК с жтММСК этот эффект более выражен (табл. 2). Таблица 2. Количество гемопоэтических колоний различного типа среди исходных пкМНК и суспензии клеток культуры 1 при различном содержании кислорода % от общего количества КОЕ КОЕ-ГЭММ КОЕ-Г КОЕ-М КОЕ-ГМ БОЕ-Э 1% О2 5% О2 Исходные пкМНК 1,2±0,6 2,1±0,7 16,6±6,1 18,7±4,5 7,5±1,8 ↑20,1±4,2* 4,6±1,7 5,1±0,7 57,5±5,6 66,7±4,8 Культура 1 КОЕ-ГЭММ 1,0±1,0 2,9±0,6 КОЕ-Г 30,0±9,5 ↑24,9±5,0* КОЕ-М 9,1±2,4 ↑17,5±2,4* КОЕ-ГМ ↓2,3±0,7* ↓3,4±1,0* БОЕ-Э 49,2±10,4 59,7±7,5 * - достоверное отличие от значения при 20% О2, p<0,05, M ± m, n=3-7. 20% О2 4,1±1,5 18,3±2,7 8,3±2,9 8,0±2,0 61,4±2,8 2,4±0,8 11,6±3,2 6,5±2,1 7,0±1,2 72,5±4,3 Доля БОЕ-Э достоверно не отличалась, однако, было отмечено, что при понижении содержания кислорода размер клона в поликлональных колониях уменьшался (рис. 8). Рис. 8. Колонии бурстобразующих единиц пкМНК в зависимости от концентрации кислорода. Таким образом, после сокультивирования пкМНК с жтММСК при пониженной концентрации кислорода было выявлено большее количество КОЕ и наблюдалось изменение содержания колоний различных гемопоэтических ростков, по сравнению с сокультурой при 20% кислорода. Наличие этого эффекта, возможно, объясняется уменьшением окислительного повреждения и увеличением восприимчивости к ростовым факторам, таким как Epo и M-CSF, при низких значениях концентрации кислорода (Noll et al., 2002). 14 Паракринная регуляция представляет собой один из основных механизмов, определяющих развитие клеток крови. Гемопоэтические клетки в костном мозге постоянно подвергаются действию стимулирующих или подавляющих их активность биологически активных молекул. В исследованиях in vitro показано, что стромальные клетки костного мозга спонтанно или индуцированно продуцируют целый ряд медиаторов, которые участвуют в регуляции гемопоэза (Haynesworth et al., 1996; Majumdar et al., 1998; Majumdar et al., 2000). В кондиционированной среде жтММСК нами были обнаружены IL-8 и МСР-1. Эти хемокины, но в количестве на порядок большем, а также MIP-1b продуцировали пкМНК из всех образцов, использованных в работе. Сокультивирование приводило к изменению продукции хемокинов в зависимости от уровня кислорода. Так, в сравнении с монокультурой пкМНК в сокультуре происходило увеличение содержания MCP-1 при 1% и 5% кислорода, уменьшение содержания IL-8 при 1% и 20% кислорода и снижение MIP-1b при всех вариантах содержания кислорода (рис. 9). MCP-1 MIP-1b * * 20000 400 пкг/мл пкг/мл 15000 10000 200 5000 * * 0 0 1% 5% 20% 1% 5% 20% IL-8 4500 * * пкг/мл 3000 1500 Рис. 9. Концентрация хемокинов в кондиционированной среде монокультур пкМНК и жтММСК и культуры 1 (M±m, n=3-4, * достоверное отличие от значения монокультуры пкМНК, p<0,05). Белые столбцы – жтММСК; серые столбцы – пкМНК; черные столбцы культура 1. 0 1% 5% 20% Таким образом, совместное культивирование с ММСК влияло на продукцию хемокинов пкМНК, при этом, в большинстве случаев степень этого воздействия определялась содержанием кислорода. Экспансия гемопоэтических клеток пуповинной крови на подслое из жтММСК в условия тканевых концентраций кислорода 15 Культура 2 состояла из адгезирующей фракции пкМНК и образованной ими популяции клеток (рис. 10). Рис. 10. Суспензия клеток культуры 2 (масштабный отрезок 50 мкм). В культуре 2 было меньше адгезированных пкМНК в сравнении с культурой 1, жизнеспособность уменьшалась незначительно. Морфология клеток и клеточный состав существенно не менялись. Клеток в суспензионной фракции было больше, чем адгезированных пкМНК (рис. 11). Культура 2 Рис. 11. Количество клеток суспензионной и адгезируюшей фракций пкМНК в культуре 2 (M±m, n=4). 3 X10 кл/см 2 45 30 15 0 1% Сусп. кл. Для анализа 5% 20% Адгез. кл. полученной популяции, в качестве маркеров для выявления малодифференцированных клеток были выбраны: CD34 – наиболее часто используемый маркер в клинической практике для характеристики кроветворных трансплантатов, и CD133 – маркер наиболее ранних гемопоэтических клеток. Доля CD34+ клеток суспензионной фракции клеток культуры 2 была в 170-250 раз выше, чем среди исходных пкМНК, при этом наибольший процент этих клеток был при 5% кислорода. Также были обнаружены CD133+ клетки, что свидетельствует о присутствии ранних ГСК (рис. 12). 16 Гемопоэтические предшественники % от общего кол-ва кл. 100 80 60 40 20 0 CD34 1% CD133 5% 20% Рис. 12. Иммунофенотипический профиль клеток суспензионной фракции культуры 2 (M±m, n=4). Полученные данные наглядно подтверждают возможность существенного увеличения доли малодифференцированных гемопоэтических предшественников по сравнению с исходной популяцией пкМНК при выбранном нами способе экспансии. Пуповинная кровь содержит гетерогенную популяцию гемопоэтических клеток, для оценки свойств которой нельзя использовать только данные иммунофенотипирования, а необходимо проведение тестов, позволяющих выявить функциональный потенциал. В данной работе кроме идентификации ранних предшественников суспезионной фракции культуры 2, также были проведены функциональные тесты по выявлению КОЕ и КООБ, позволяющие обнаружить прогениторные клетки разной степени зрелости, что является важным критерием для оценки эффектов факторов микроокружения на гемопоэтические клетки. Было показано, что количество КОЕ среди суспензии клеток культуры 2 при тканевых Кратность отл., отн. ед. значениях содержания кислорода было больше, чем при 20% (рис. 13). Культура 2 * 2,0 Рис. 13. Количество КОЕ в суспензии пкМНК культуры 2 (Данные представлены как кратность отличий от значения при 20% О2; M±m, n=3-5, * достоверное отличие от 20% О2, p<0,05). * 1,5 1,0 0,5 0,0 1% 5% 20% Данные о содержании КОЕ различных гемопоэтических ростков представлены в табл. 3. В условиях 20% О2 доля КОЕ-ГМ в 1,5–2 раза превышала значение, полученное при тканевых концентрациях кислорода. Доля смешанных колоний (КОЕ-ГЕММ) в культуре 2, наоборот, была выше при пониженной концентрации кислорода, однако эти отличия в 17 субпопуляционном составе колоний в зависимости от концентрации кислорода в среде культивирования имели характер тенденции и были статистически незначимыми. Таблица 3. Доля КОЕ различных гемопоэтических ростков в суспензии клеток культуры 2 (M±m, n=3-5) % от общего количества КОЕ КОЕ-ГЭММ КОЕ-Г КОЕ-М КОЕ-ГМ БОЕ-Э 1% О2 3,6±1,9 25,3±3,7 11,7±5,4 3,7±1,8 55,7±9,1 5% О2 2,1±1,0 22,1±6,0 8,0±1,2 3,4±1,7 64,3±7,6 20% О2 1,7±0,7 18,3±4,6 18,6±6,4 6,0±1,4 55,4±9,0 Клетки адгезирующей фракции культуры 2 содержали на два порядка меньше КОЕ, и колонии, образованные этими клетками, были меньшего размера и плотности (рис. 14). КОЕ/см2 1800 * 1200 600 0 Суспензионные Адгезирующие клетки клетки Рис. 14. Гемопоэтические колонии, образованные клетками адгезирующей фракции пкМНК культуры 2. Белые столбцы – 1% О2; серые столбцы – 5% О2; черные столбцы – 20% О2 (M±m, n=3-5, * - достоверное отличие от значения при 20% О2, p<0,05). В культуре 2 на 7-11 сутки от начала эксперимента вне зависимости от концентрации кислорода формировались области «булыжной мостовой», что свидетельствовало о наличии КООБ (рис. 15). Рис. 15. Области «булыжной мостовой» в культуре 2 (масштабный отрезок 50 мкм). Выявление этих клеток в гемопоэтических культурах – распространенная методика, позволяющая оценить содержание активно пролиферирующих ранних гемопоэтических 18 предшественников in vitro. По пролиферативной активности КООБ, формирующие области «булыжной мостовой» в культуре через 7-11 дней, соответствуют КОЕ-С 12, образующие колонии в селезенке через 12-14 дней после трансплантации облученным мышам (Ploemacher et al., 1989). Интересно, что при пересеве на новую подложку клеток суспензионной фракции культуры 2 эти области можно было обнаружить уже после 3 суток субкультивирования. Как было отмечено, формирование областей «булыжной мостовой» не зависело от содержания кислорода в среде культивирования. Это наблюдение совпадает с данными, полученными Andrade и соавторами при изучении методом предельных разведений экспансии пкМНК на подслое ММСК из костного мозга (Andrade et al., 2013). Было показано, что количество областей «булыжной мостовой», образованных в условиях 2%, 5%, 10%, 20% О2, существенно не отличалось. Зависимость количества КОЕ от содержания кислорода в среде культивирования и отсутствие эффекта на КООБ, подтверждают ранее полученные данные о том, что кислород может влиять на гемопоэтические предшественники одного из уровней иерархии, тогда как клетки другого – будут к нему индифферентны (Cipolleschi et al., 1993). Содержание хемокинов в культуре 2 зависело от концентрации кислорода. При ее понижении происходило уменьшение концентрации хемокинов MCP-1, IL-8 и увеличение MIP-1b (рис. 16). MIP-1b MCP-1 250 20000 15000 150 пкг/мл пкг/мл 200 100 10000 5000 50 0 0 1% 5% 20% 4000 3000 2000 1000 0 1% 5% 20% Рис. 16. Концентрация хемокинов в кондиционированной среде культур 1 и 2 в условиях различного содержания кислорода (M±m, n=3-4). Белые столбцы – культура 1; черные столбцы – культура 2. IL-8 5000 пкг/мл 1% 5% 20% 19 Несмотря на то, что в культуре 2 количество гемопоэтических клеток было на порядок меньше, чем в культуре 1, уровень продукции хемокинов MIP-1b, MCP-1 и IL-8 был практически таким же, как и в исходной сокультуре (рис. 16), что указывает на высокую паракринную активность клеток культуры 2. Таким образом, в настоящей работе для исследования роли кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток in vitro был разработан методический подход, где жтММСК использовались как компонент, соответствующий стромальным клеткам микроокружения костного мозга, а содержание кислорода соответствовало тканевым значениям. ММСК из жировой ткани эффективно поддерживали экспансию гемопоэтических предшественников различной степени коммитированности вне зависимости от содержания кислорода. При тканевых концентрациях кислорода среди пкМНК выявлялось больше КОЕ и изменялся их субпопуляционный состав, приводя к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ). Концентрация кислорода определяла продукцию хемокинов пкМНК, а также степень ее изменения при сокультивировании. Важной особенностью явилось то, что в культуре, образованной адгезирующей фракцией пкМНК, клетки имели высокий уровень паракринной активности. Полученные в настоящей работе данные позволяют значительно расширить представления о влиянии факторов микроокружения на гемопоэтические клетки и могут быть использованными в дальнейших экспериментальных и клинических исследованиях. ВЫВОДЫ 1. Разработан методический подход на основе использования жтММСК и пкМНК, в котором адгезировавшие гемопоэтические клетки в отсутствие суспензионной фракции способны генерировать популяции предшественников разной степени коммитированности. 2. жтММСК способны поддерживать жизнеспособность пкМНК, в том числе малодифференцированных гемопоэтических предшественников, при различном содержании кислорода (1%, 5% и 20%). 3. Гемопоэтические предшественники, адгезирующие из пкМНК на жтММСК, способны образовывать популяцию, где доля CD34+ клеток в 170-250 раз выше, чем в исходных пкМНК. Наибольший процент этих клеток обнаружен при 5% кислорода. 20 4. В условиях 1% и 5% кислорода, в сравнении с 20%, среди пкМНК выявляется большее количество гемопоэтических колоний и изменяется соотношение КОЕ различных кроветворных ростков: увеличивается содержание более коммитированных предшественников – КОЕ-Г и КОЕ-М, а мульти- и бипотентных – КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ – уменьшается. После сокультивирования пкМНК с жтММСК этот эффект более выражен. 5. Формирование «областей булыжной мостовой» при сокультивировании пкМНК с жтММСК происходит на 7-11-е сутки, а при субкультивировании гемопоэтических предшественников, образованных адгезирующей фракцией пкМНК, – на 3-и сутки. 6. В монокультуре пкМНК продукция хемокинов MCP-1, MIP1-β и IL-8 выше при атмосферной концентрации кислорода. Сокультивирование приводит к еще большему увеличению MCP-1 при 1% и 5% кислорода, снижению IL-8 при 1% и 20% кислорода, а также уменьшению содержания MIP1-β при всех исследуемых концентрациях кислорода. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Е.Р.Андреева, И.В. Андрианова, П.И. Бобылева, Л.Б. Буравкова, Е.В. Маслова, Ю.А. Романов. Взаимодействие стромальных клеток и мононуклеарных клеток человека в условиях измененной газовой среды. Ч. II. Гемопоэз-поддерживающие свойства // Технологии живых систем, 2012 г., т.9, №2, стр. 19-24. 2. Маслова Е.В., Андреева Е.Р., Андрианова И.В., Бобылева П.И., Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Балашова Е.Е., Ряскина С.С., Дугина Т.Н., Буравкова Л.Б. Обогащение мононуклеаров пуповинной крови гемопоэтическими клетками-предшественниками в совместной культуре с мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2013, №4, стр. 238-243. 3. Бобылева П.И., Андрианова Е.В., Горностаева А.Н., Маслова Е.В., Андреева Е.Р. Взаимодействие ММСК из жировой ткани и мононуклеаров из пуповинной крови при пониженном содержании О2 в среде культивирования // Стволовые клетки и регенеративная медицина: Сб статей/ под ред. В.А. Ткачука. – М.: МАКС Пресс, 2012, стр. 48-61. 21 4. Е.В.Маслова, Е.Р.Андреева, Ю.А.Романов, Л.Б. Буравкова. Культивирование прогениторных клеток пуповинной крови на стромальном подслое в условиях различного содержания кислорода // Цитология, 2012, том 54, №9, стр. 692-693. 5. Maslova EV, Bobyleva PI, Andrianova IV, Andreeva ER, Buravkova LB. CFC activity of cord blood hematopoietic cells is modified after expansion on multipotient mesenchymal stromal cells under hypoxia // Abstracts of the 7th Fraunhofer Life Science Symposium, 2930 November, 2012, Leipzig, Germany, P.71-72. 6. Маслова Е.В. Экспансия прогениторных клеток пуповинной крови при различном содержании кислорода в среде культивирования // XI Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2012, стр. 34-35. 7. Маслова Е.В. Обогащение недифференцированными мононуклеаров гемопоэтическими пуповинной крови клетками-предшественниками с использованием мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани человека при гипоксии // Сборник тезисов XII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики, Москва, 16 апреля 2013, стр. 34-35. 8. Е.В. Маслова, П.И. Бобылева, Е.Р. Андреева, Л.Б. Буравкова. Влияние физиологических факторов микроокружения на экспансию гемопоэтических клеток in vitro // XXII Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Волгоград, 2013, стр. 334-335. 9. Маслова Е.В., Андреева Е.Р., Романов Ю.А., Буравкова Л.Б. Особенности экспансии мононуклеаров пуповинной крови при гипоксии с использованием мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани // Авиационная и космическая медицина, 2013, том 47, № 4, стр. 21-22. 10. Бобылева П.И., Андрианова Е.В., Маслова Е.В., Андреева Е.Р. Буравкова Л.Б. Жизнеспособность и экспрессия молекул адгезии ММСК на ранних этапах взаимодействия с мононуклеарами пуповинной крови in vitro// Авиационная и космическая медицина, 2013, том 47, № 4, стр. 96-97. Список используемых сокращений: CD – cluster of differentiation – кластер дифференцировки G-CSF – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор IL-8 – интерлейкин 8; αМЕМ – минимальная среда Игла (альфа модификация) MIG – монокин, индуцированный интерфероном-γ 22 MIP-1a – макрофагальный белок воспаления MIP-1b – макрофагальный белок воспаления МСР-1 – моноцитарный хемотаксический фактор-1 PCNA – ядерный антиген пролиферирующих клеток БОЕ-Э – бурстобразующая единица эритроцитов ГСК – гемопоэтические стволовые клетки жтММСК – мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из стромально-васкулярной фракции жировой ткани КОЕ – колониеобразующая единица КОЕ-Г – КОЕ гранулоцитов КОЕ-ГМ – КОЕ гранулоцитов и моноцитов/макрофатов КОЕ-ГЭММ – КОЕ гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов/макрофатов и мегакариоцитов КОЕ-М – КОЕ моноцитов/макрофатов КООБ – клетка, образующая области булыжника пкМНК – мононуклеары пуповинной крови человека ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка 23
