Протопласты растительных клеток как объект биологического
реклама
042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 1 из 72 МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН СЕМИПАЛАТИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА Документ СМК 4 уровня УМКД УМКД 042Учебно-методический комплекс Редакция № 3 от 27.08. 14.4.04.01.20. 118/03 -2012 дисциплины 2012 г. «Биотехнология растений» взамен ред.№ 2 от 30.09 2010 г. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДИСЦИПЛИНЫ «Биотехнология растений» по специальности5В070100 – «Биотехнология» Семей 2012 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 Содержание 1. 2. 3. 4. Глоссарий Лекций Практические занятии Самостоятельная работа студентов 2012 г. 2010 г. Страница 2 из 72 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 3 из 72 Тезисы лекционных занятий (2 ч). Тема 1. Введение цели и задачи биотехнологии растений. 1. Культуры клеток. 2. История развития биотехнологии растений. 3. Питательные среды Биотехнология – новая отрасль науки и производства, основанная на использовании биологических процессов и объектов для производства экономически важных веществ и создания новых сортов растений, пород животных и штаммов микрорганизмов. Ее главная цель – выращивание клеток растительных организмов с целью ускорения получения селекционного материала для создания новых сортов культурных растений. Культурой клеток растений (обобщенно) называется выращивание отдельных клеток, тканей и органов растений на искусственной питательной среде в асептических условиях. Кусочек простерилизованной растительной ткани помещают в чашку Петри или пробирку на агаризованную питательную среду. После этого в ткани начинается интенсивное деление клеток. Клеточная масса быстро разрастается, образуя каллус. Каллус — это особый тип ткани, представляющий собой скопления недифференцированных клеток. Если затем кусочки этого каллуса периодически пересаживать на свежую питательную среду (пассировать), то они могут расти неограниченно долго. Термин «культура клеток растений» превратился в широкое и удобное понятие, охватывающее все виды работы in vitro с культурами изолированных клеток (даже части клеток — протопластов), тканей, органов, зародышей и целых растений-регенерантов. Термин in vitro (лат. — «в стекле», «в склянке») используется для описания условий протекания процессов в стерильной искусственной окружающей среде: термин in vivo (лат. — «на живом») применяют по отношению к естественным нестерильным условиям протекания процессов жизнедеятельности в организме. Термин растение-регенерант означает асептически полученное растение с развитыми корнями и побегами, сформировавшееся в культуре, то есть in vitro. Теоретически любая живая растительная клетка потенциально способна развиться в организм, из которого была изолирована и культивировалась в определенных условиях. Это свойство называется тотипотентностью Тотипотентность (от лат. totus — «весь», «целый» и potentia — «сила») - свойство клеток в полной мере реализовать присущую им генетическую информацию, обеспечивающую их дифференцировку и дальнейшее развитие до целого организма. Обычно универсальной 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 4 из 72 тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетки растений и животных. Что касается соматических клеток, тотипотентностью обладают только клетки растений, и то преимущественно в условиях in vitro. Культивируемые клетки животных лишены тотипотентности. Выращивание изолированных частей и органов растений первыми начали немецкие ученые на рубеже XIX—XX столетий. Так, К. Рехингер еще в 1883 г. пытался выращивать почки, срезы корней и стеблей на влажном песке. В некоторых опытах он наблюдал образование каллусов, но поскольку не было обеспечено питание и не соблюдались условия стерильности, то длительно растущих культур получить не удавалось. Подобные опыты проводил тогда и X. Фехтинг. Принципы культуры клеток впервые четко сформулировал Г. Габерланд в 1902 г. Он работал с отдельными клетками палисадной паренхимы ли( та ряда покрытосеменных растений и использовал в качестве питательной среды раствор Кнопа с добавлением сахарозы, аспарагина и пептола. Г. Габерландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения и пытался вырастить ткань из единственной клетки. Однако ему самому не удалось экспериментально доказать свою гениальную догадку так как он выбрал неудачные объекты: узкодифференцированные специализированные клетки, утратившие способность к активному делению и эмбриональному росту. Как стало известно позже, успешно могут культивироваться меристематические и активно функционирующие клетки молодых тканей. Между тем идея о культивировании растительных клеток вне организма увлекла в то время исследователей, занимающихся животными объектами. Впервые именно на животной клетке была доказана возможное и выращивания изолированной клетки in vitro. P. Харрисон в 1904—1907 п вырастил нейробласт лягушки в лимфатической жидкости. После этой были разработаны основы метода культуры тканей животных, благодари тому что в качестве питательной среды были использованы лимфа, кровяная плазма, зародышевая жидкость. Клетки животных в организме омываются кровью и лимфой, поэтому культивирование их в этих средах приближается к естественным условиям. Растения же в своем организме не содержат подобных богатых питательными веществами жидких сред, даже флоэмный экссудат не отвечает этим требованиям. Первые питательные среды, использовавшиеся ботаниками для выращивания изолированных частей и органов растений, были очень примитивными по своему составу, представляя собой в основном смеси минеральных солей. Определенный успех в культуре тканей растении был достигнут в 1922 г. почти одновременно В. Котте в Германии и В. Роббинсом в США. Они использовали ткани, содержащие меристем.ч тические клетки — кончики корней и почки. В. Котте успешно культивировал кончики корней гороха и кукурузы в различных питательных сре дах, содержащих 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 5 из 72 разбавленный раствор Кнопа, глюкозу, некоторые аминокислоты и пептон. В. Роббинс добавлял в питательную среду, где выращивал корни кукурузы, дрожжевой экстракт. Однако корни на этих средах выживали недолго. Спустя 10 лет Филипп Уайт в США повторилопыты В. Роббинса, но он использовал кончики корней томата, и получил хорошие результаты. Работы Ф. Уайта с кончиками корней томата и французского ученого Роже Готре с камбиальными тканями ивы и моркови в 30-е годы легли в основу современных методов культуры тканей. Ф. Уайт поддерживал непрерывную длительную культуру кончиков корней около 30 лет, еще дольше культивировались каллусные клоны, полученные Р. Готре из камбия и флоэмы корня моркови. Он ввел в питательную среду ауксин и показал его способность стимулировать деление клеток камбия. Ф. Уайт и Р. Готре внесли неоценимый вклад в становление современного метода культуры тканей растений, и с этого времени начинается интенсивное развитие этого нового направления экспериментальной биологии растений. Были разработаны составы множества питательных сред, изучено значение макрои микроэлементов, витаминов и стимуляторов роста растительного происхождения (эндосперм кокосового ореха, каштана, кукурузы, гидролизат дрожжей и т. п.). Без добавления последних — сложных органических смесей — к культурам изолированных тканей в них не удавалось вызвать деление клеток. Это наводило на мысль, что в них содержится фактор, индуцирующий клеточные деления. Особенно эффективным для роста культур было кокосовое молоко. Американский ученый Ф. Скуг с сотрудниками изучал рост почек на отрезках стебля табака, помещенных на питательную среду, содержащую минеральные соли, углеводы и витамины. Наблюдалось образование каллуса, а иногда и формирование почек. Добавление в среду ауксина задерживало формирование и рост почек. Аденин, напротив, способствовал образованию почек в культуре ткани, т. е. препятствовал проявлению тормозящего действия ауксина. Это наталкивало исследователей на мысль, что фактор роста кокосового молока включает какие-то пуринсодержа-щие вещества. Поэтому они начали прежде всего исследовать нуклеиновые кислоты. Оказалось, что ДНК спермы сельди вызывает деление клеток табака. Этот эффект обнаруживал долго хранившийся старый препарат ДНК — повидимому, ростовой фактор был продуктом разрушения ДНК. Ф. Скугу и его сотрудникам удалось выделитьиз дрожжей вещество, которое вызывало деление клеток сердцевинной паренхимы стебля табака и развитие почек в присутствии ауксина. Это ростостимулирующее вещество они назвали кинетином, а класс регуляторов роста, к которому он принадлежит — цитокининами (вещества, стимулирующие клеточное деление). Благодаря этому открытию Т. Мурасиге и Ф. Скуг в 1962 г. разработали состав своей знаменитой питательной среды для инициации и роста каллусной культуры табака. Эта среда оказалась подходящей для введения в культуру различных 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 6 из 72 тканей и органов многих видов растений, в настоящее время она широко применяется. ДОПОЛНИТЕЛЬНО Биотехнология – современная отрасль деятельности человека, основанная на использовании наук о природе и технических знаний для производства с помощью биосистем полезных продуктов. В буквальном смысле слова биотехнология – это «биологическая технология», то есть применение фундаментальных биологических знаний в практической деятельности, направленной на производство лекарственных препаратов, ферментов, белков, красителей, ароматических веществ, витаминов и целого ряда биологически активных соединений. Кроме того, речь идёт об использовании биотехнологических методов в селекции и конструировании принципиально новых организмов, ранее не существовавших в природе. Успешное развитие биотехнологии стало возможным благодаря многочисленным открытиям в биохимии, генетике, биологии клетки и молекулярной биологии, и, в первую очередь, на установлении структуры и функции определённых ферментов, их использовании в иммобилизованной форме в разнообразных производственных процессах, а также на том, что был открыт способ модификации ДНК и перенесения её из одних организмов в другие. Развитие биотехнологии коснулось и растений, хотя и позднее. Для широкомасштабного производства клонов растений используются меристемы, а культуры растительных клеток применяют для синтеза различных веществ, как самых обычных (алкалоиды и другие вторичные метаболиты), так и экзотических (идиолиты). В 1937 году Готере с успехом культивировал недифференцированную ткань моркови. Полученный при этом каллус, отделенный от родительского растения, фрагментировали и получали растительный гормон роста – ауксин. Позднее были получены культуры из отдельных растительных клеток, из которых были выделены протопласты. Слияние протопластов позволяет увеличивать число и разнообразие гибридов без применения полового размножения. В лабораториях обнаружили способность изолированных клеток некоторых видов растений закаляться. Так, если клетки без закалки еле переносят температуру —20° С, то с закалкой способны выдержать и —35° С, а клетки сибирской яблони с закалкой терпят мороз ниже 50° С. Вот только клетки теплолюбивого лимона никаким закалкам не поддаются. Появилась возможность отбора клеток с большой морозостойкостью из каллуса пшеницы и ели. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 7 из 72 Изолированные клетки сохраняют способность синтезировать вещества, присущие ей in vivo, то есть в теле живого организма, — витамины, гормоны, алкалоиды, кумарины, стероиды и так далее. Это заинтересовало биологов с точки зрения утилизации этих веществ для промышленности. В лабораториях обнаружена еще одна способность клеток: отдели одну от других или посади ее на питательную среду поодаль от сородичей, и она наотрез откажется делиться и размножаться. Экспериментаторы, естественно, предполагают, что «телепатия» клеток имеет химическую природу, однако выделить и рассмотреть «в лицо» виновника «телепатии» до сих пор не удалось. Прямо не вещество, а привидение - очень уж мала его концентрация. Киевскому соратнику Р. Г. Бутенко —Ю. Ю. Глебе все же удалось заставить клетку, «страдающую» от одиночества, делиться в мельчайшей капельке питательной среды. Чем дольше занималась лаборатория Р. Г. Бутенко культурой клеток, тем больше интересных явлений открывалось перед ее сотрудниками. Ну, хотя бы то, что клетки каллуса, имеющие единственного предка — одну прапрапра... (и так далее) клетку, оказываются через несколько поколений генетически различными. Может быть, изучив это явление, мы обнаружим, что предком обезьяны и человека был прозаический кольчатый червь. Изменения, наблюдаемые в изолированной культуре, могут возникать вследствие мутаций специфических генов и хромосомных перестроек. Частота, тип и стабильность изменчивости зависят от генотипа исходного растения и физиолого-биохимического состояния («настроения») клетки. Высказано предположение, что условия изолированной культуры приводят к глубокой клеточной дестабилизации. Широкий спектр вариантов, образующихся из культивируемого материала, является отражением дестабилизации, за которой следуют действие отбора и вторичные наследственные изменения в популяции клеток. Наблюдаемая изменчивость имеет большое значение при применении культуры клеток и тканей для улучшения сельскохозяйственных культур. Воздействие мутагенами - веществами или радиацией, вызывающими наследственные изменения, увеличивает частоту измененных клеток, а использование селективных условий (например, повышенного инфекционного фона) создает предпосылки для размножения только измененных в нужном человеку направлении клеток. Однако многие исследователи, памятуя, вероятно, строки стихотворения Федора Тютчева («Природа — сфинкс. И тем она верней своим искусом губит человека...»), отказываются от использования мутагенов, чтобы избежать добавочных нежелательных мутаций. Тем более что мутантных клеточных линий возникает вполне достаточно и без их вмешательства. В клетках каллуса часто меняется и число хромосом. Каллус растения гаплопаппус, например, через два года оказался состоящим на 95 процентов 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 8 из 72 из полиплоидных (содержащих в ядре более двух геномов) клеток с числом наборов основного (базисного) числа хромосом, равным восьми и более. В США получены полиплоидные формы табака из клеток каллуса, культивируемых вне организма, отличающиеся рядом хозяйственно ценных признаков. Выход полиплоидных форм оказался настолько значительным, что этот метод рекомендован для экспериментального получения полиплоидов. Такие же результаты получены у лимона и клевера ползучего. Да и вообще регенерировавшиеся из каллуса растения часто отличаются от своих родителей числом хромосом. Генетически идентичное воспроизведение генотипов через дифференциацию в культуре каллуса в настоящее время можно осуществить у сравнительно немногих видов. Для селекции генетическая изменчивость клеток каллуса может представить определенный интерес. На основе регенерации в культуре тканей и органов растений получены высокопродуктивные формы подсолнечника. К сожалению, у таких важнейших сельскохозяйственных культур, как зерновые и бобовые, активировать морфогенез на питательных средах пока удается редко, но есть успехи при работе и с этими «непокорными» культурами. На питательных средах при высокой интенсивности освещения ныне выращивают растения-гаплоиды из пыльцевых зерен. У них вдвое меньше хромосом, чем в обычных соматических клетках стеблей, листвы и корня родительского растения. Из них при удвоении хромосом путем обработки колхицином или закисью азота под давлением (есть и иные пути удвоения) получают дигаплоиды (или, допустим, тетрагаплоиды, если основной набор учетверен). Они гомозиготны, то есть обеспечивают проявление свойственных им признаков устойчиво на протяжении многих поколений. У них, как говорят генетики, не выщепляются новые признаки, если, конечно, не появляются мутации - внезапные новые наследственные признаки. Гомозиготные линии нередко используют в селекции на гетерозис достоверное повышение продуктивности, качества или иного показателя против родительских форм, вовлеченных в гибридизацию. Используют гаплоиды и иначе. В Китае с помощью культуры пыльников выведены короткостебельные, скороспелые и высокоурожайные сорта риса. Применение в этой стране питательных сред, включающих картофельный экстракт, привело к ранее недостижимому — получению гаплоидов у ржи, что открыло новые возможности в селекции этой перекрестноопыляющейся культуры. Получены интересные результаты у ячменя, перца, мака, люцерны, винограда, тополя, яблони и масличного рапса. У последней культуры, проведенной через культуру пыльников, несколько уменьшили и надеются уменьшить еще более содержание вредных гликозидных соединений. Всего в Китае к 1984 году из пыльцевых зерен выращено около 40 видов растений. Изучение популяций пшеницы, риса, кукурузы и табака из пыльников показало, что около 90 процентов 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 9 из 72 удвоенных гаплоидов является генетически однородными, хотя у 10 процентов все же отмечена нестабильность числа хромосом и их структуры. В России эффективный способ получения пшеницы из пыльцы в культуре пыльников разработан саратовскими учеными В. М. Сухановым, В. С. Тырновым и Н. Н. Салтыковой. Самое интересное, что иногда и гибридизацию удается провести в чашках Петри, пробирках, вообще в каких-либо сосудах, в которые помещают изолированную от растения семяпочку. На нее наносят пыльцу, преодолевая таким образом самонесовместимость — отказ растения дать семена, если его пытаются оплодотворить собственной пыльцой. В пробирке случается порой преодолеть несовместимость довольно отдаленных видов, и даже родов растений. Однако бывает и так, что скрестить растения, относящиеся к двум разным видам или родам, удается, но полученные от гибридизации семена не желают прорастать — сказывается несовместимость, допустим, зародыша с эндоспермом. Это обычное явление при скрещивании пшеницы и ржи (есть, однако, и другие факторы, препятствующие прорастанию). В таких случаях с успехом прибегают к отделению зародыша от эндосперма на ранних этапах развития зерновки и помещению зародыша на искусственную питательную среду, состоящую из многих компонентов. При выращивании молодых эмбрионов добились завязывания жизнеспособных семян у межродовых гибридов - ячмень X рожь, элимус X пшеница, трипсакум X кукуруза; томат культурный X томат перуанский, чина пурпурная X чина членистая, лядвенец тонкий X лядвенец топяной, донник желтый X донник белый, фасоль обыкновенная X фасоль остролистная (тепарн), клевер сходный X клевер гибридный (розовый), слива североамериканская X слива персидская. М. Ф.Терновский с сотрудниками получил межвидовой гибрид табака с новыми свойствами устойчивости благодаря культуре на искусственной питательной среде каллусов из неспособных к прорастанию гибридных семян. Таким же путем получены нормальные гибриды первого поколения от скрещивания диплоидных и тетраплоидных форм райграса. И, наконец, еще одно важное достоинство использования питательных сред. В пробирке удается слить воедино соматические клетки разных видов. Для этого, правда, их приходится беззастенчиво «раздевать» — освобождать от оболочки с помощью специальных ферментов. После этой процедуры мы имеем дело уже не с клеткой, а с протопластом. Протопласты двух видов кидают в один протопласт - гетерокариот, который через некоторое время обзаводится новой «одежкой». Так удается объединять даже животные клетки с растительными, например клетку табака с обнаженной клеткой дрозофилы. Надо сказать, что такие клетки, хотя и пытаются делиться, но впустую. К делению способны пока лишь слитые клетки видов в пределах одного рода, изредка - различных родов и семейств. Но как знать! Со 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 10 из 72 временем будет преодолена и эта несовместимость, и селекционеры получат гибриды, которые им и во сне не снились. К настоящему времени удалось совместить протопласты и получить соматические гибриды картофеля и томата, правда, с мизерным урожаем плодов и клубней. А вот соматическая гибридизация устойчивых к болезням и вредителям диких диплоидных видов картофеля (2х) с культурными диплоидными (2х) может представить практический интерес: 2х + 2х = 4х это как раз оптимальный уровень плоидности у картофеля. Неожиданны результаты канадца К. Н. Као, который получил гетерокариотические (с совмещенными ядрами) клетки из слившихся протопластов сои и табака сизого (табачного дерева), способные к делению, и линии клеток сои и табака с синхронным делением хромосом. При использовании культуры клеток и тканей удается быстро размножить новый сорт, если культуру в производстве размножают вегетативно, или линию для производства гибридных семян у овощных, декоративных и других возделываемых растении. Чаще всего размножают (клонируют) верхушки побегов (такое размножение не совсем точно называют культурой меристемы - ведь, кроме последней, в процесс включаются и другие элементы) и латеральную (боковую) меристему образовательную, интенсивно делящуюся ткань. Возрастает использование культур тканей для клонирования соцветий, цветков, боковых почек, листьев и корней, культуры каллуса и в отдельных случаях культуры клеток. У спаржи для размножения наиболее пригодны верхушки побегов, у пасленовых и краснокочанной капусты - кусочки (экспланты) листа, у цветной капусты и нарцисса - частички соцветий, у лилейных, ирисовых (касатиковых) и амариллисовых - экспланты из луковиц, клубней, ризомов (коротких мясистых корневищ), листьев, соцветий и семяпочек, у птицемлечника - экспланты из стебля, листьев, завязи, чашелистиков и даже луковичной чешуи, у глоксинии - высечки из листьев и цветоножек, у лука порея - кусочки луковицы, у герани при получении диплоидных растений экспланты пыльников. Наиболее экономически выгодно размножение в культуре тканей селекционных сортов цветов: орхидей, агав, бегоний, хризантем, цикламена, драцены, ириса, лилий, нарцисса, флокса и других. Новой областью применения клонирования в стерильной среде верхушек побегов и других эксплантов стало размножение пород кустарников, плодовых культур и ананаса. Из каллуса от зубчиков чеснока получили безвирусные растения. Экономически оправдано размножение методом стерильной культуры гетерозисных гибридных семян овощных и декоративных культур. Культура тканей растений, главным образом верхушек побегов (меристем), играет очень важную роль в освобождении семенного материала от вирусов. Цветоводы первыми обнаружили, что растения, выращенные не 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 11 из 72 из клубней или луковиц, а из делящихся клеток, помещенных в питательную среду, вирусными болезнями, как правило, не поражены и дают здоровое вегетативное потомство клубней и луковиц. Этот прием взяли на вооружение и картофелеводы-семеноводы. Получение свободных или, вернее, почти свободных от вирусов растений - обычный прием первичного семеноводства некоторых сельскохозяйственных культур: картофеля, клевера, люцерны и хмеля, овощных (хрена, ревеня, шампиньона, цветной капусты), плодовых культур (малины, красной и черной смородины, яблони, сливы), а также декоративных растений (хризантемы, гвоздики, пеларгонии, фрезии, цимбидиума, гортензии, нарцисса, лилии, гиацинта, ириса, тюльпана, гладиолуса). Кроме того, оказалось, что клетки растений, растущие в культуре, синтезируют вещества, которые не обнаруживаются в целом растении, что расширяет возможность получения специфических гормонов, ферментов, алкалоидов и других веществ. Тема 2. Культивирование клеток в жидкой среде (2ч). 1. Условия культивирования клеток. 2. Получение каллуса и его культивирование. 3. Получение суспензионной культуры Успех в культивировании клеток, тканей и органов растений определяется не только составом среды, но и условиями культивирования. К сожалению, их влияние на рост и развитие клеток in vitro изучено слабо и требует специальных исследований. Подтверждением сказанному является общепринятое представление о том, что для успешного культивирования клеток необходима постоянная температура в пределах 25±2°С. Однако этот традиционный подход обусловлен ограниченностью сведений. Так, оптимальный рост каллусной культуры табака наблюдается при 32°С, гармалы обыкновенной — при 30°С, суспензионной культуры ипомеи — при 30-32°С. Температура влияет на все процессы первичного и вторичного метаболизма растений. Очевидно, что подбор температурного оптимума должен осуществляться эмпирически для каждой культуры в зависимости от целей эксперимента. Однако постановка таких опытов — трудоемкая и длительная работа, поэтому обычно исследователи выращивают клетки при температуре около 25°С. К внешним факторам, влияющим на культивирование клеток, относится также свет. До настоящего времени фотоавтотрофные культуры описаны только для 16 видов растений. Все остальные культуры не способны 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 12 из 72 к фотоавтотрофному росту, поэтому их выращивают в темноте или на рассеянном свету. Действие света на ткани, лишенные хлорофилла, повидимому, обусловлено фитохромной системой. В тех экспериментах, в которых культура клеток используется для получения вторичных соединений, четко установлено влияние качества, интенсивности света и фотопериода. Подбор условий освещения культуры является одной из задач при разработке клеточных технологий. Важное значение для успешного выращивания клеток имеет аэрация. Суспензионная культура без аэрации вообще не может существовать. Что касается влияния компонентов газовой фазы (кислород, азот, двуокись углерода) на культуру клеток, то оно почти не изучено. При разработке состава сред и выращивании клеток следует также учитывать влияние такого физического фактора, как осмотическое давление. Получение каллуса и его культивирование. Каллус — ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток. Пролиферация — это новообразование клеток и ткани путем размножения уже существующих. Каллус (от лат. callus — живая кожа», «мозоль») — особый тип ткани, образующийся на целом растении в результате его ранения. Он защищает место травмы, накапливаются питательные вещества и способствует регенерации специального защитного слоя или утраченного органа. Подобные клетки возникают и в культуре клеток и тканей. Образование и рост каллуса in vitro регулируется ауксинами и цитокининами. Эти гормоны индуцируют образование каллус.а и у тех тканей растения, которые его не образуют в ответ на ранение. Процесс получения первичного каллуса и дальнейшее его культивирование требуют стерильности. Предварительно тщательно вымытый растительный материал подвергается затем стерилизации различными вещесвами, содержащими активный хлор (гипохлориты натрия и кальция, хлорамин, хлорная известь), ртуть (сулема, диоцид), а также диоксидом водорода, этанолом. Реже используют для этих целей бром, серную кислотy, фенол и в особых случаях антибиотики. Вид стерилизующего средства, его концентрация и длительность воздействия зависят от растительного объекта, подвергаемого стерилизации. Правильный выбор стерилизующего вещества заключается в том, чтобы оно губительно действовало на все микроорганизмы и в то же время минимально повреждало растительные ткани. Кроме того, стерилизующее вещество должно легко удаляться при промывании водой, в противном случае произойдет отравление тканей и это отрицательно скажется на результатах эксперимента при культивировании. Обычно используют известные методики стерилизации либо разрабатывают их экспериментально для каждого конкретного объекта. Фрагмент ткани или органа, так называемый эксплант, помещенный на подходящую по составу стерильную питательную среду, через некоторое время начинает расти и превращается в массу 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 13 из 72 недифференцированных клеток — каллус. Этот процесс называется каллусообразованием, или каллусогенезом. Культивирование клеток в жидкой среде. Культуру клеток растений, выращиваемую в жидкой среде, называют суспензионной культурой. Для поддержания клеток во взвешенном состоянии при глубинном культивировании их перемешивают разными аппаратами. Аэрация клеток обеспечивается либо путем непрерывного вращения или качания среды, либо путем продувания жидкой среды стерильным воздухом. В отдельных экспериментах инкубируемые клетки не бывают погружены в питательную среду постоянно, а попеременно контактируют с жидкой средой и воздухом. В этом случае газообмен существенно улучшается. Состав питательной среды, в принципе, тот же, что и при поверхностном культивировании клеток. Клетки в суспензии имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками, выращиваемыми статическим способом на агаризованной поверхности клетки популяции находятся в однородных условиях питания, аэрации и удаления токсических метаболитов клеточного окружения; у них легче про следить влияние на рост и метаболизм различных экзогенных факторов они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических исследований; на них реальнее возможность получения стабильной клеточной популяции. Получение суспензионной культуры Обычно для получения суспензионной культуры клеток используется каллусная ткань. Возможно получение суспензионной культуры из эксплантов, помещенных в жидкую среду (например, пыльников). Возникающие на поверхности экспланта каллусные клетки могут отрываться и переходить в среду, давая начало суспензии. Но это длительный и малоэффективный процесс. Для некоторых исследований культуру клеток получают путем ферментативной мацерации, например, из мезофилла листа, но такую суспензию невозможно поддерживать в течение длительного времени. Основным способом получения суспензионных культур является культивирование рыхлого недифференцированного каллуса в жидкой среде на качалке. При этом каллус легко распадается на отдельные клетки и клеточные агрегаты. Рыхлый оводненный каллус выращивают специально для°этих целей на среде с 2.4-Д и с уменьшенным содержанием или даже с исключением цитокининов. Хороший эффект на дезагрегацию каллуса оказывает также исключение из питательной среды Са поскольку вследствие этого меньше образуется пектината кальция — основного связывающего материала растительных клеток, Пектинат кальция можно удалить, воздействуя на каллус пектиназой. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 14 из 72 Часть каллусной ткани в жидкой среде при ее перемешивании распадается на клетки и небольшие клеточные агрегаты, образуя первичную суспензию. Для избавления от крупных плотных остатков каллуса, от больших клеточных агрегатов ее фильтруют через 1—2 слоя марли, нейлон либо отбирают одиночные клетки и мелкие агрегаты путем осаждения крупных агрегатов при отстаивании суспензии в течение нескольких минут. Кроме того, долю одиночных клеток и мелких агрегатов увеличивают частые пересевы легких фракций суспензии. На степень диссоциации клеток оказывает влияние также состав питательной среды, способы аэрации и перемешивания суспензии. Несмотря на все усилия, суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только из одиночных клеток. В лучшем случае последние составляют 50—60% остальное приходится на долю групп из 2—10 клеток и многоклеточные агрегаты. Тема 3. Биология культивируемых клеток (3ч). 1. Дедифференциация и каллусообразование. 2. Гетерогенность культивируемых клеток. Любая живая растительная ткань, помещенная на подходящую питательную среду, переходит к делению и образует массу недифференцированных клеток — каллус. Это означает, что дифференцированные клетки тканей, которые давно перестали делиться, вновь приступают к делению. Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации связан с их дедифференциацией, другими словами — утратой специализации. В основе этого процесса, как и при дифференциации клеток в интактном растении, лежит дифференциальная активность генов. Структура и функции клеток определяются активностью генов, и если клетки различаются по своей структуре и функциям, то это обусловлено различиями в экспрессии их генов, то есть специализация обеспечивается включением разных генов в разных клетках. Обычно активна небольшая часть (5%) всего пула генов, свойственных данному виду. В этот состав активных IOHOB входят, кроме видоспецифичных и обязательных для поддержания клеточного метаболизма, гены, активные только в данном органе, ткани, клетке, а также гены, активные лишь в определенном возрасте или начавшие работать только под влиянием изменившихся внешних условий. Возникновение физиологических и структурных различий между клетками и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие дифференциация отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре и функции, начинают развиваться различными путями, создавая 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 15 из 72 ткани разных органов. Как это осуществляется — один из труднейших вопросов клеточной биологии. Гетерогенность культивируемых клеток Основным типом культивируемых клеток являются каллусные. В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, т. е. приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки, стареют и гибнут. Дифференцированные каллусные клетки специализируются на синтезе видоспецифических вторичных соединений. Эти клетки подобны паренхимным клеткам растения. В растущем каллусе делению подвергаются не все клетки, это функция меристемоподобных клеток с густой плотной цитоплазмой и без вакуолей. В зависимости от условий культивирования соотношение определенных клеток в популяции будет меняться. Так, при частых пересадках на свежую питательную среду в культуре могут постоянно преобладать активно делящиеся мелкие клетки. Таким образом, каллусные клетки отличаются не только по морфологии, но и по биохимическим свойствам, по физиологическому состоянию и генетически. Каллусные клетки отличаются от клеток исходной ткани и между собой размерами и формой, в них варьирует число и форма ядер. Старые каллусные клетки достигают очень больших размеров (500—1000 мкм), тогда как молодые клетки — мелкие (15—30 мкм). К увеличению размеров клетки зачастую приводит отсутствие кинетина в среде. Чаще всего изменения формы и размеров клеток, а также их ядер, связаны с увеличением плоидности. Доказано, что при длительном культивировании плоидность культивируемых клеток неуклонно возрастает. Полиморфизм культивируемых клеток можно объяснить видовыми и возрастными особенностями, уровнем плоидности, влиянием состава пи1ательной среды и условий культивирования, отсутствием коррелятивных связей. Последний фактор, ведущий к нарушению жесткой регуляции, существовавшей в целом растении, видимо, является основной причиной спонтанной изменчивости клеток in vitro. Любой фрагмент растения представляет собой мозаику различных тканей, и в зависимости от того, какая ткань даст начало каллусу, возникшие даже из одинаковых эксплантов каллусы будут гетерогенными и отличающимися друг от друга. Одинаковых, в полном смысле, эксплантов в природе быть не может, следовательно, неоднородность исходного материала (видовая, возрастная, физиологическая) предопределяет разнокачественность клеток в культуре. Физиологическая гетерогенность состоит в том, что клетки в популяции находятся в разном физиологическом состоянии, т. е. делятся, растут, стареют, погибают. Такая культура называется асинхронной. Заставить популяцию клеток высших растений проходить фазы клеточного 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 16 из 72 цикла одновременно, т. е. синхронизировать их, почти невозможно. Потому что та часть клеток, которая способна в данный момент к делению, составляет 24%. Неблагоприятные условия (низкая температура, исключение важных компонентов питания), задерживающие деление, в какой-то степени способствуют накоплению числа клеток, готовых к делению. Более эффективны некоторые химические вещества, блокирующие определенные стадии подготовки к делению. В лучших случаях синхронизация может быть достигнута у 10—30% клеток, но при последующих делениях популяция опять быстро утрачивает синхронность. Гетерогенность культивируемых клеток обусловлена генетической, эпигенетической и модификационной изменчивостью. Генетические, или мутационные, изменения приводят к изменению генотипа, которое может быть унаследовано. Мутации (изменения количества или структуры ДНК) происходят на генном, хромосомном и геномном уровнях. Генная, или точечная, мутация означает изменение структуры ДНК в одном локусе. Генные мутации приводят к сильным или слабым изменениям морфологических, биохимических и физиологических свойств клетки. Мутации, возникающие в результате изменения макроструктуры хромосом, называются хромосомными мутациями, или хромосомными аберрациями (перестройками). Структурные перестройки хромосом возникают в результате инверсии, делеции, дупликации, транслокации и транспозиции. Геномные мутации связаны с изменением числа хромосом в ядре, т. е. с изменениями в кариотипе. Все виды названных генетических изменений имеют место у клеток in vitro. Наиболее подробно исследована хромосомная изменчивость клеток in vitro. Даже клетки одной и той же ткани, выращиваемые в одном сосуде, могут значительно различаться между собой по хромосомным наборам (диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные). Причины генетической изменчивости многообразны: 1) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения, т. е. отсутствие организменного контроля; 2) действие компонентов среды; 3) влияние продуктов метаболизма, накапливающихся в среде; 4) гетерогенность исходного материала и селекция клеток определенного типа. Хромосомная изменчивость является результатом нарушений митоза, называемых эндомитозом и эндоредупликацией. При эндомитозе происходит спирализация хромосом и начинается митоз, но нарушается веретено деления, сохраняется оболочка ядра, хромосомы не расходятся и деспирализуются внутри ядерной оболочки. Это приводит к возрастанию числа хромосом, увеличению размеров ядра и клеток. Эндоредупликация не сопровождается образованием хромосом и делением ядра, хотя содержание ДНК в ядре тоже увеличивается. К образованию полиплоидных и анеуплоидных клеток также приводят нарушения в митозе, связанные с неправильным распределением хромосом. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 17 из 72 Клетки различного уровня плоидности различаются по скорости деления и роста, по устойчивости к неблагоприятным воздействиям, начинают конкурировать, и одни из них начинают преобладать. Такой процесс возрастающего доминирования в популяции клеток определенного типа называется клеточной селекцией. Доминирование может быть вызвано преимущественной пролиферацией одних клеток или успешной элиминацией (удалением) других. Такую селекцию правильнее называть автоселекцией, потому что она протекает спонтанно, без специального воздействия какимилибо стрессовыми факторами. В процессе автоселекции формируется наиболее приспособленный к данным условиям кариотип. Вероятно, клетки приспосабливаются к новым условиям существования путем отбора более жизнеспособных полиплоидных клеток. Интересно, что изменение условий выращивания меняет направление отбора. Показано, например, что высокие концентрации 2,4-Д и кинетина увеличивают возможность полиплоидизации. Тема 4. Использование культуры клеток в биосинтетической промышленности (2ч). 1. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения. 2. Перспективы клеточных технологий. 3. Факторы, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растений. В растениях содержится огромное разнообразие веществ вторичного происхождения. Несмотря на такое название, они играют важную роль в обмене веществ растений. Многие из них широко используются в медицине и технике, пищевой и парфюмерной промышленности, сельском хозяйстве. Первыми среди вторичных веществ в культуре ткани привлекли внимание исследователей алкалоиды. Анализ каллусных культур барвинка розового, раувольфии змеиной, белены черной, дурмана и др. показал, что они содержат алкалоиды. Благодаря усилиям многих ученых накоплено немало ценной информации о способности каллусных тканей синтезировать и другие биологически активные вещества. Культивируемые клетки растений сохраняют присущую исходному виду растения способность синтезировать широкий спектр веществ вторичного метаболизма: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, необычные пептиды и специализированные белки, натуральные красители, стероиды, пряности, инсектициды, воски, витамины. Промышленное выращивание клеток и тканей — продуцентов экономически важных веществ — новое направление биотехнологии. Если традиционные биотехнологии для получения ценных биологически активных веществ использовали целые организмы: микроорганизмы, растения, 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 18 из 72 животных, то современная биотехнология нацелена на клеточные технологии, основанные на культивировании свободных и иммобилизованных клеток. Доказана возможность культуры клеток осуществлять биотрансформацию, то есть синтезировать некоторые биологически активные вещества из дешевых и доступных их предшественников. Эти «полупродукты» вторичных веществ не могут быть преобразованы химическим или микробиологическим путем, и только благодаря ферментам клеток в культуре происходит их химическое превращение в ценный конечный продукт. Изменение состава питательной среды и других параметров культивирования приводит к изменению не только количественного, но и качественного состава продуктов биосинтеза, в результате чего могут быть получены совершенно новые соединения с другим типом действия. Японские исследователи добились успехов в получении in vitro таких новых биологически активных веществ, как необычные пептиды, антиканцерогенные соединения, убихинон-10 и др. Следующим шагом в клеточной биотехнологии станет использование иммобилизованных растительных клеток. 2. Культура клеток, для того чтобы стать объектом промышленного выращивания, должна выдержать конкуренцию с дикорастущими и культурными лекарственными, техническими растениями, а также с микробиологическим производством и химическим синтезом. По сравнению с традиционным растительным сырьем клеточные культуры обладают следующими преимуществами: 1) независимость от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, погода, почвенные условия, вредители); 2) более высокий выход и качество продукта благодаря оптимизации и стандартизации условий выращивания; 3) экономия посевных площадей. Учитывая, что только растения являются источником многих экономически важных веществ, а запасы растительного сырья в природе истощаются, нетрудно представить место клеточных технологий в будущем. Перевод от научных разработок к промышленному получению продуктов с использованием клеточных культур только начинается. Ограничением в создании высокорентабельных технологий является недостаточность фундаментальных знаний о генетической, биохимической, физиологической регуляции вторичного метаболизма в растительной клетке. Возможные функции вторичных веществ в интактном растении до конца не изучены, но для большинства из них основной функцией является защита растений от различных стрессовых факторов, то есть они играют регуляторную роль, обеспечивая жизнедеятельность организма. Клетки in vitro — это новая, экспериментально созданная биологическая система, особенности которой, в том числе и функции 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 19 из 72 вторичных соединений, еще мало изучены. Показано., что иногда у культивируемых клеток и специализированном обмене проявляются особенности, характерные для филогенетически ранних групп растений или ювенильной стадии развития растения. Недостаток фундаментальных знаний очень тормозит развитие юхнологии культивируемых клеток. Популяция клеток in vitro проходит определенный онтогенез: размножение (деление) — растяжение — дифференцировка — старение — смерть клеток. Соотношение клеток, находящихся на разных стадиях развития, меняется в зависимости от того, какой процесс преобладает. При изменении условий культивирования равновесие смещается в ту или иную сторону. Дифференцировка каллусной клетки, вышедшей из цикла деления, заключается в ее специализации на синтезе видоспецифичных вторичных соединений. Данные о контроле биосинтеза вторичных метаболитов клеточной дифференциацией неоднозначны. Если в ряде случаев синтез вторичных веществ начинается с появлением в культуре морфогенных структур, то в других опытах высокий выход искомых веществ наблюдался в недифференцированной каллусной ткани. Факторы, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растений. Генотип родительского растения, то есть донора экспланта для введения в культуру, существенно влияет на биосинтетический потенциал культивируемых клеток. М. Ценк с сотрудниками для получения культуры барвинки розового собрал 184 образца семян из различных мест произрастания. Из проростков этих семян были отобраны несколько наиболее богатых гипотензивными индольными алкалоидами серпентином и ай-малицином (более 0,7% на сухую массу), из которых были получены каллусные культуры, содержавшие искомых алкалоидов в 4—5 раз больше, чем каллусы, полученные из низкопродуктивных растений. Однако У. Реллер не обнаружил подобной зависимости в образовании серпентина каллусными культурами, полученными из разных растений барвинка розового. Японские исследователи также не наблюдали корреляции между содержанием алкалоида берберина в интактных растениях и каллусных культурах василистника (Thalictrum minus). Возможно, эти противоречивые результаты объясняются тем, что оценка исходного генотипа определялась только по фенотипу. З.Б. Шамина с сотрудниками использовали для получения клеточных культур изогенную линию мака снотворного (Papaver somniferum). Апикальные меристемы, изолированные одновременно из разных, но одновозрастных растений, культивировались на одинаковых средах. Полученные каллусы существенно различались как по ростовым характеристикам, так и по синтезу алкалоидов. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 20 из 72 А. Киннесли и Д. Дугэлл исследовали синтез никотина в каллусных культyрах, полученных от двух различных пар растений табака, которые отличались по содержанию никотина и были изогенны по трем другим локусам. Высокий выход никотина дали культуры, инициированные из высокопродуктивных растений. Хотя приведенные данные и противоречивы, но большинство исследователей традиционно учитывают генетическую характеристику ткани. Однако это вовсе не значит, что в качестве экспланта используется только ткань, богатая искомым веществом, поскольку высокая концентрация вещества может отражать накопление его в ткани путем направленного транспорта, а не как продукт синтеза по месту локализации. Поэтому выбор органа растения для введения его в культуру имеет немаловажное значение. Так, например, содержание стероида диосгенина в культуре клеток диоскореи, полученной из клубня, было на порядок выше, чем в культуре клеток из побега. Но зачастую клетки in vitro тотипотентны в отношении синтеза вторичных соединений, то есть любая клетка при создании соответствующих условий культивирования может продуцировать вещества, характерные для исходного растения. Следует подчеркнуть, что гены, ответственные за регуляцию биосинтеза вторичных метаболитов, присутствуют и в других клетках, обычно их не продуцирующих. В некоторых случаях биосинтетические способности культуры клеток восстанавливались при регенерации растений. Например, культура клеток наперстянки при длительном культивировании утрачивала способность к синтезу гликозидов, а растения, регенерировавшие из этой культуры, восстанавливали их биосинтез. Таким образом, генетическая информация в клетках сохраняется, но для ее реализации требуются специфические условия. Предполагается, что культивируемые клетки, изолированные из высокопродуктивных растений и тканей, содержат необходимую генетическую информацию для биосинтеза этих метаболитов. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Новые экспериментальные системы для изучения синтеза вторичных метаболитов с использованием культуры тканей растений Системы культивирования иммобилизованных клеток Существует 2 типа систем культивирования иммобилизованных клеток: 1. Система культуры с плоской основой, клетки выращиваются в горизонтально расположенном сосуде. 2. Система колоночной культуры, где клетки выращиваются в вертикальном сосуде. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 21 из 72 В обеих системах жидкая среда циркулирует вокруг физически неподвижных клеток. Система культуры с плоской основой (рис. 13) Рис. 13. Система культуры с плоской основой Питательная среда капает под действием силы тяжести из цилиндрического сосуда объемом 70 мл (1) в стеклянный сосуд для культивирования (3) объемом 350 мл, где находятся клетки (40 – 50 г сырой массы), посаженные на субстрат – подстилку из нетоксичной полипропиленовой ткани. Питательная среда проникает сквозь ткань под действием капиллярных сил, снабжая клетки. После этого использованная питательная среда откачивается из сосуда для культивирования с помощью перистальтического насоса (2) обратно в резервуар и используется повторно. Исследования, проведенные с этой системой, показали, что клетки Solanum niger, культивируемые на плоской основе (среда Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4-Д и кинетина) способны потреблять питательные вещества и быстро реагируют на недостаток ортофосфата. Увеличение сырой массы идет гораздо медленнее, чем в суспензионных культурах. Количество жизнеспособных клеток такое же и достигает 70 – 80%. Количество алкалоидов через 7 суток культивирования достигает 12 мг/г сухой массы, в суспензии же через 18 дней культивирования оно составляет 10 мг/г сухой массы. В местах, где питательная среда капает прямо на клетки, через 3 – 4 дня культивируемая ткань становится темной и отличается от остальной, которая у S. niger окрашена в светло-бежевый цвет. Клетки в зонах капания часто бывают более компактны, содержат больше алкалоидов. Если клетки изолировать из зон капания и поместить в чашки Петри с агаром, содержание 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 22 из 72 алкалоидов падает, при возвращении в прежние условия культивирования вновь аккумулируются высокие количества метаболитов. Кроме того, в клетки вводились предшественники вторичных метаболитов. Отмечено, что синтез капсацина клетками Capsicum frutencens увеличивается в тысячи раз при добавлении в среду 5 мл изокаприновой кислоты. При этом капсацин не накапливается внутри клеток, а секретируется в питательную среду. Установлено, что клетки, иммобилизованные на плоской основе, способны потреблять питательные вещества из среды, в том числе и кислород, имеют низкую скорость роста, каллусоподобное расположение, способны к тесному межклеточному контакту. В целом, они имеют более высокий уровень синтеза вторичных метаболитов. Несмотря на эти преимущества, промышленное культивирование имеет существенный недостаток: горизонтальная конструкция аппарата создает неудобства при работе и требует большой площади. Эти недостатки устраняются в другой системе. Система колоночной культуры (рис. 14) Рис. 14. Система культуры в колонке В такой системе возрастает число клеток, на которые капает среда, что увеличивает “зону капания”, где происходит накопление больших количеств вторичных метаболитов. Сосуд для культивирования из горизонтального превращается в вертикальный. В сосуде с питательной средой (1) 50 мл жидкой среды, которая под действием силы тяжести капает в вертикальную стеклянную колонку, содержащую иммобилизованные клетки (3). Среду собирают со дна колонки и вновь используют в цикле, перекачивая с помощью перистальтического насоса в резервуар со средой. Как разместить клетки внутри колонки, чтобы капающая среда не спрессовала их в плотную массу на дне колонки? Закрепить в нейлоновую сеть, корзиночки, используя инертный, проницаемый и стабильный гель. Между корзиночками образуется воздушное пространство, сеточка структурирует гель, а клетки могут прорастать через корзиночки, контактируя друг с другом. Подходящим материалом для размещения клеток оказались нейлоновые мочалки. Материал нетоксичен, легко режется, выдерживает 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 23 из 72 автоклавирование. В качестве субстратов для погружения клеток используют агар и альгинат кальция. Агар традиционно используется в работе с культурами клеток и тканей. 2% (масса к объему) раствор агара в дистиллированной воде автоклавируют при 1 атмосфере в течение 20 минут и охлаждают на водяной бане до 35 – 40оС. Клетки суспензионной культуры в стационарной фазе роста пропускают через сито с диаметром пор 1 мм и смешивают в пропорции 1:1 (V:V) с незастывшим агаром. Стерильные кусочки мочалки 2-3 * 1 * 1 см с помощью стерильного пинцета опускают в смесь клеток с агаром, а когда агар начинает застывать, помещают в стерильные колонки с внутренним диаметром 15 * 2,5 см. В каждую колонку помещают примерно 10 сеточек, таким образом, на колонку приходится 5 – 7 г сырой массы клеток. Аналогично иммобилизуют клетки с использованием альгината кальция. В этом инертном субстрате, например, успешно были иммобилизованы А. Альферманном с сотрудниками клетки наперстянки шерстистой (Digitalis lanata). 2% раствор альгината натрия автоклавируют, охлаждают до комнатной температуры, смешивают с клетками и переносят в стерильный раствор 0,05 М CaCl2 в дистиллированной воде на 10 минут, чтобы образовывающийся альгинат кальция затвердел внутри и вокруг кусочков мочалки, обволакивая клетки. Молекулы альгината поперечно сшиваются катионами кальция, при этом происходит его стабилизация. Затвердевший материал трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и вносят в стеклянные колонки. Как показали дальнейшие исследования, рост клеток в альгинате был лучшим, чем в агаре, что связано, вероятно, с негативным действием расплавленного агара, температура которого составляет около 40оС, на клетки в процессе иммобилизации. Поэтому эксперименты по изменению условий окружающей среды проводились в колонках, где клетки Datura innoxia и Capsicum frutencens были иммобилизованы в альгинате кальция. Скорость потребления ортофосфата, нитратов, аммония и сахарозы в клетках колоночной культуры ниже, чем в горизонтальной системе. Жизнеспособность клеток, по сравнению с суспензионными культурами, заметно не снижается (60 – 65%), содержание алкалоидов через 8 – 10 суток составляет 12 – 13 мг/г сухой массы клеток, алкалоиды в питательную среду не выделяются, а рН среды после 8 суток культивирования снижается на 0,4 единицы, до 5,4. Определение скорости потребления кислорода показывает предположительную нехватку его на 4 – 8 сутки культивирования. Культуры, освещаемые люминесцентными лампами, потребляют питательные вещества интенсивнее, рост клеток лучше также в освещенных культурах. В светокультуре повышается жизнеспособность клеток и содержание алкалоидов. Так как клетки не зеленеют, для поддержания 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 24 из 72 нормального клеточного метаболизма необходимы и другие световые эффекты. Добавление предшественников не всегда однозначно влияет на рост, потребление питательных веществ и синтез метаболитов. Например, действие орнитина на клетки Datura innoxia скорее отрицательно, а изокаприновой кислоты на клетки Capsicum frutencens – скорее положительно, так как сырая масса увеличивается, но выход капсомицина остается прежним. В обоих случаях синтез метаболитов не ингибируется альгинатным гелем. Полученные результаты свидетельствуют о сохранении жизнеспособности клеток многих видов растений при иммобилизации. Иммобилизованные клетки, полученные из рыхлых, быстро растущих суспензионных культур, замедляют рост и приобретают сходство с клетками каллусной культуры. Эти клетки более взаимосвязаны, чем в жидкой культуре, что ведет к возникновению определенного физического и химического градиентов. Иммобилизованные клетки аккумулируют больше алкалоидов, чем в жидкой культуре, что ведет к возникновению определенных физических и химических градиентов. Это способствует переходу клеток в стационарную фазу, что приводит к ускорению образования алкалоидов и других веществ вторичного происхождения. Общие рекомендации к культивированию клеток на основе полученных результатов. 1. Клетки должны выращиваться физически стационарно, в тесном контакте друг с другом, чтобы стимулировалось развитие физических и химических градиентов и обеспечивалась частичная дифференцировка культуры. Некоторые виды растений необходимо культивировать при освещении и индуцировать образование хлоропластов, чтобы обеспечить уровень метаболизма, близкий к происходящему в клетках интактного растения. 2. Состав питательной среды и уровень кислорода необходимо регулировать для замедления роста культуры. Рекомендуется использовать регуляторы роста для имитации процессов дифференциации, происходящих in vivo. 3. Клетки необходимо снабжать предшественниками, но в низких концентрациях. Предшественники должны быть максимально близки в цепочке превращений к исходному продукту. 4. Желательно использовать клетки, которые секретируют необходимые метаболиты в питательную среду или клетки, у которых такую секрецию можно индуцировать. Протопласты растительных клеток как объект биологического 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 25 из 72 конструирования Способы получения и культивирования протопластов Выделение протопластов Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений: невысокая производительность, можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом, трудоемкость и длительность. Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом. Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим: одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток), клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу, клетки не повреждаются, метод сравнительно быстрый. Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток. Выделение протопластов проводят в три этапа: 1. обработка ферментами, 2. выделение протопластов из клеточных стенок, 3. отделение интактных протопластов от клеточных осколков. Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum: Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут в 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 26 из 72 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев. Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры. Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта. Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация. При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования. Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно. Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 27 из 72 Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк). Способы культивирования протопластов Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г. Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост. Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами. На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора: видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения, способ и условия выделения протопластов, плотность высева протопластов, состав питательной среды. Выделение протопластов Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 28 из 72 плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений: невысокая производительность, можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом, трудоемкость и длительность. Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом. Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим: одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток), клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу, клетки не повреждаются, метод сравнительно быстрый. Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток. Выделение протопластов проводят в три этапа: 1. обработка ферментами, 2. выделение протопластов из клеточных стенок, 3. отделение интактных протопластов от клеточных осколков. Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum: Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут в 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 29 из 72 Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры. Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта. Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация. При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования. Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно. Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны. Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 30 из 72 витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк). Способы культивирования протопластов Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г. Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост. Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами. На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора: видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения, способ и условия выделения протопластов, плотность высева протопластов, состав питательной среды. Тема 5. Системы культивирования клеток (2ч). 1. Суспензионные культуры клеток. 2. Иммобилизованные клетки. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 31 из 72 3. Этапы работ для получения вторичных метаболитов. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. Биотехнологическое производство вторичных метаболитов растений основано преимущественно на суспензионной культуре. В лабораториях при исследовании вторичного метаболизма in vitro суспензия обычно культивируется в колбах в небольших объемах (40—200 мл) и перемешивается на круговых качалках. Скорость вращения сосудов (обычно 90—120 об/мин) может значительно влиять на рост и накопление метаболитов. Так, у клеток красавки и клена субоптимальные скорости качания снижали их рост, тогда как у клеток табака скорость вращения не влияла на рост, а высокие скорости даже увеличивали выход никотина. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость. Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования. Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток. Для культуры клеток женьшеня отрицательное влияние механического стресса при выращивании в ферментере с турбинными мешалками сказывалось на жизнеспособности клеток уже при скоростях мешалок свыше 100—350 об/мин, это отрицательно влияло на синтез ими антрахинонов. Устойчивость штамма к механическому стрессу является важным требованием к культуре и трудной задачей для исследователей. Мягкое перемешивание и аэрацию обеспечивает пневматический способ перемешивания потоком сжатого стерильного воздуха, подаваемого в ферментер с восходящим током воздуха. К сожалению, и этот способ имеет свой недостаток, потому что в культуральной среде возникает избыток воздуха, приводящий к кислородному голоданию. От концентрации кислорода в среде зависят рост и вторичный метаболизм клеток. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 32 из 72 В микробиологических системах изучена взаимозависимость роста биомассы, выхода искомого продукта и снабжения кислородом. Для растений 1аких данных нет. На рост клеток, кроме кислорода, могут влиять и другие i азы. Высокая степень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекислый газ и летучие соединения. Клетки растений in vitro по сравнению с микроорганизмами имеют низкую интенсивность дыхания, что тоже должно учитываться при конструировании сосуда для культивирования. Сравнивали рост и образование метаболитов клетками в ферментерах разных типов. Клетки моринды лимонолистной, культивируемые в ферментeрax с продувкой воздуха, содержали антрахинона на 30% больше, чем в перемешиваемых колбах, и в два раза больше, чем в ферментерах других систем. Выход биомассы клеток не менялся в зависимости от типа биореактора. Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, сопровождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии. Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения. В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели. Клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время генерации (интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями) растительной клетки в 60—100 раз превосходит время генерации микробИммобилизованные клетки Каллусные культуры при поверхностном культивировании накапливают вторичных метаболитов больше, чем клетки, растущие в жидкой среде. Показано, что у многих видов растений компактные, медленно растущие каллусные ткани на агаризованной среде накапливают алкалоидов больше, чем рыхлые и быстро растущие культуры, т. е. для нормального метаболизма необходима какая-то пространственная организация клеток. Положение клетки внутри организма является одним из факторов, определяющим степень и тип ее дифференциации. Клетки, растущие изолированно друг от друга и в виде агрегатов, имеют совершенно различные условия окружения и, как следствие этого, различные пути метаболизма. Можно предположить, что чем ближе клетка или группа клеток 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 33 из 72 по уровню организации к целому растению, тем более вероятно, что в них будут реализовываться метаболические пути, характерные для целого организма. Имеющиеся в литературе данные о положительной корреляции между накоплением вторичных метаболитов и степенью дифференцировки в культурах клеток подтверждают это. В связи с этим в последнее время усилился интерес к иммобилизованным клеткам. Иммобилизация (создание неподвижности) клеток обеспечивает условия, приводящие к дифференциации, и способствует увеличению выхода вторичных веществ. Метод иммобилизации позволяет клеткам расти в тесном физическом контакте друг с другом. Когда клетки контактируют между собой, в их массе, как в интактном организме, устанавливаются определенные химические и физические градиенты, регулирующие метаболизм и процессы дифференциации. Это градиенты регуляторов роста, питательных веществ, кислорода, углекислоты. Клетки могут быть иммобилизованы 4 способами: 1) иммобилизация в инертном субстрате, т. е. обволакивание клеток одной из различных цементирующих сред (альгинат, агар, полиакриламид, коллаген или комбинация гелей); 2) адсорбция клеток на инертный субстрат; 3) адсорбция клеток на инертный субстрат с помощью биологических макромолекул (пектины). И ковалентное связывание клеток с каким-либо инертным субстратом типа карбоксиметилцеллюлозы. Чаще применяются первые два способа. Клетки, прикрепленные к биологически инертному субстрату, сохраняют жизнеспособность. Вокруг физически неподвижных иммобилизованных клеток могут циркулировать большие объемы питательной среды, регулируя состав которой, замедляют рост теток и тем самым повышают выход вторичных продуктов. Иммобилизованные клетки необходимо снабжать в большом количестве предшественниками, но в низких концентрациях. Эти предшественники должны быть как можно ближе к искомому продукту в цепи биосинтезов. Поскольку клетки в иммобилизованном виде культивируются длительное время, то для этого используются клетки, которые сами, естественным путем, секретируют необходимые метаболиты в питательную среду или могут быть индуцированы к такой секреции какимилибо приемами, например воздействием низких температур и растворителей. Клетки, которые накапливают искомый продукт внутри, например в вакуолях или пластидах, непригодны для иммобилизации. Извлечение продукта из омывающего клетки раствора — тоже нелегкая проблема с точки зрения экономичности производства. Если иммобилизованные клетки предназначаются для промышленного использования, важную роль играет выбор типа биореактора, в котором они будут культивироваться. По-видимому, более удобной будет колоночная культура, поскольку при этом экономится пространство и облегчается контроль за током питательных веществ через 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 34 из 72 клетки, в случае надобности улучшается освещенность культуры. Клетки некоторых видов растений, как было отмечено выше, для обеспечения уровня метаболизма, близкого к происходящему в клетках интактного растения, требуют света. Иммобилизованные клетки могут быть использованы не только для синтеза, но и для биотрансформации различных соединений. Их преимущество состоит в том, что благодаря увеличению срока функционирования клеток в иммобилизованном состоянии удешевляется процесс биокатализа. А. Альферманн с сотрудниками провели следующий опыт. Они культивировали клетки наперстянки шерстистой, окутанные альгинатным гелем (50 шариков диаметром 4—5 мм), в 100-миллилитровых колбах Эрленмейера в 25 мл среды. Среду с субстратом меняли каждые три Дня. В качестве субстрата добавлялся р-метилдигитоксин, который трансформировался клетками в (3-метилдигоксин. В таких условиях культивирования клетки осуществляли биотрансформацию субстрата в продукт с постоянной скоростью в течение 170 суток. Сердечный гликозид дигоксин обладает большим терапевтическим эффектом по сравнению с дигитоксином, которого в растениях содержится значительно больше. Дигоксин отличается от дигитоксина лишь по дополнительной гидроксильной группе на двенадцатом атоме углерода. Недифференцированные культуры клеток наперстянки шерстистой не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять определенные реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Итак, следует подчеркнуть те преимущества, которые имеют иммобилизованные клеток по сравнению с суспензионными культурами: — многократное использование биомассы путем сохранения клеток в биореакторе и выделения продукта из среды; — физическое отделение клеток от среды; — культивирование большого количества биомассы в сосудах небольшого объема; — длительность культивирования; — возможность эффективной биотрансформации веществ. Этапы работ для получения вторичных метаболитов. 1. Экономически обоснованный выбор объекта. Растения, выбранные для введения в культуру, должны содержать значительное количество ценных, экономически важных вторичных соединений. Особенно это относится к редким и исчезающим видам растений. 2. Первичное введение тканей в культуру. Для этих целей отбираются отдельные растения, обладающие наибольшим содержанием искомого вещества. Обычно вначале получают каллусы на твердой среде. 3. Химическое изучение биомассы по количественному и качественному составу вторичных метаболитов. Пролиферирующие каллусные клетки растений за редким исключением содержат вторичных 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 35 из 72 соединений меньше, чем органы целого растения. Это говорит о том, что в интактном растении синтез вторичных веществ находится под контролем цитодифференцировки. Подавление дифференциации клеток в культуре ведет к снижению их биосинтетического потенциала в отношении вторичных соединений. Неполная реализация генетических возможностей клетки может быть связана и с другими причинами, например с нарушениями автотрофности питания при переходе к гетеротрофному типу питания. Кроме того, под воздействием различных факторов может изменяться качественный состав продуктов. У некоторых растений переход к биосинтезу веществ вторичного метаболизма наступает при замедлении роста, для них применяют двухступенчатые режимы культивирования: вначале создают условия для интенсивного роста клеточной массы, а затем — для биосинтеза веществ. Для эффективного химического контроля за биомассой нужны экспресс-методы оценки веществ. Тема 6. Клональное микроразмножение растений (2ч) 1. Преимущества клонального микроразмножения 2. Методы клонального микроразмножения. 3. Индукция пазушных меристем. Живые клетки самых различных специализированных тканей, помещенные на питательную среду в стерильных условиях, могут реализовать свою тотипотентность и дать начало целому растению. Способность отдельных клеток восстановить целый организм, обладающий всеми признаками исходного растения, успешно используется для клонального размножения. Клон(от греч. clon — отпрыск, ветвь) — растение, полученное путем бесполого, т. е. вегетативного размножения. Клоны идентичны материнскому растению и между собой. Клональное микроразмножение — это массовое бесполое размножение в культуре тканей и клеток, при котором возникшие растения генетически идентичны исходному экземпляру. Клональное микроразмножение имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными методами вегетативного размножения: 1. Высокий коэффициент размножения. Так, из одного растения герберы, земляники, хризантемы, розы при размножении их посредством культуры тканей можно получить в год свыше 1 млн. растений. Из одной почки яблони за 8 месяцев культуры можно получить до 60 тыс. побегов. При культивировании меристемы куста малины in vitro удается получить до 50 тыс. растений в год. Культура меристемы персикового миндаля, который служит подвоем для прививок и с большим трудом размножается при использовании традиционных методов, позволяет получить 1 млн растений в год. Таким образом, коэффициент микроразмножения в несколько тысяч раз 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 36 из 72 больше, чем при использовании обычных методов вегетативного размножения. 2. Одновременно с микроразмножением происходит оздоровление растения от вирусов и патогенных микроорганизмов. 3. Ускорение селекционного процесса. Сроки получения товарной продукции новых сортов сокращаются до 2—3 лет вместо 10—12. 4. Методом культуры тканей возможно размножение растений, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, например пальмы, методом клонального микроразмножения в промышленных масштабах размножается масличная пальма. 5. Экономичность. При микроразмножении экономятся площади теплицы 6. Получение молодых растений (омоложение старых особей). 7. Можно поддерживать рост круглый год, что важно для растений, имеющих в цикле развития периоды покоя. Методы клонального микроразмножения. Существуют различные методы клонального микроразмножения, которые разные авторы классифицируют в зависимости от характера морфогенетических процессов, реализуемых эксплантами в культуре тканей. Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко предлагают принципиально новую классификацию методов, которая отличается от других тем, что в ее основу положены различия между растениями, образовавшимися в культуре из предсуществовавших и вновь возникших инициалей.(рис1) Первый тип растений получается в результате активации существовавший в интактном растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля). Эти растения, возникшие из меристем, генетически полностью идентичны родительским формам, так как апексы в условиях культуры большинстве случаев генетически стабильны. Второй тип растений получается в результате индукции возникновения почек или эмбриоидов. Эти растения, полученные из специализированных каллусных клеток, характеризующихся генетической изменчивостью в культуре, могут несколько отличаться от родительских. Таким образом, этот метод можно применять только к тем растениям, у которых каллус отличается генетической стабильностью или вариабельность между растениямирегенерантами не превышает уровня естественной изменчивости. Почки или эмбриоиды могут возникать: 1) непосредственно из специализированных тканей экспланта (тканей репродуктивных органов, эпидермальных, субэпидермальных тканей, мезофилла листа и т. д.); 2) из первичного каллуса, образованного клетками экспланта; 3) из пересадочной каллусной ткани или клеток, растущих в суспензионной культуре. Рассмотрим конкретные морфогенетические реакции, вследствие которого образуются растения. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 37 из 72 Индукция развития пазушных меристем Активация роста пазушных почек и использование пазушных побегов — наиболее распространенный способ микроразмножения растения. На целом растении рост пазушных почек тормозится (апикальное доминирование. Рост пазушных меристем стимулируется удалением верхушки стебля либо обработкой цитокининами. Введение в питательную среду цитокининов пробуждает боковые почки индуцирует развитие многочисленных пазушных побегов. Образуется быстро растущий пучок побегов, который можно разделить на более мелкие пучки с общей корневой системой или на отдельные побеги, способно образовывать при выращивании на свежей среде такие же пучки побегов. Однако не у всех появившихся побегов одновременно образуются корни, так как цитокинины почти всегда ингибируют их образование. При перенoсе на среду, не содержащую цитокинин, образование корней происходит спонтанно, особенно у однодольных. Для индукции пазушных почек очень важно правильно подобрать концентрацию фитогормонов в среде. Большие количества цитокининов быстрее способствуют развитию пазушных побегов, но в то же время могут изменять морфологию растения, приводя к появлению уродливых форм. В результате токсического действия высоких концентраций цитокининов экспланты даже погибают. Избыточное количество ауксина в среде может индуцировать развитие каллуса. Каллус подавляет рост меристематической ткани или способствует развитию добавочных стеблевых апексов, генетически отличающихся от исходного растения. В таких случаях исключают ауксин из среды или сводят его содержание к минимуму. Таким образом, культивируя ткани стебля с пазушными почками на пита тельной среде, можно получить нормальный побег, который, будучи перенесен на среду для укоренения, даст целое растение. Для ускорения размножения первый побег после формирования 5—7 листьев можно расчеренковать так, чтобы каждый черенок был высотой 1—1,5 см и имел один лист, и рассадить в пробирки с аналогичной питательной средой. Метод микрочеренкования разработан для винограда, картофеля и других культур. Показано, что большое число циклов размножения без укоренения нежелательно, следует чередовать два-три цикла размножения с циклом укоренения. Методом индукции пазушных почек в культуре ткани размножают плодово-ягодные и декоративные культуры, капусту, картофель и многие другие. Следует подчеркнуть, что микроразмножение путем индукции пролиферации меристем гарантирует максимальную генетическую однородность растений-регенерантов. Организованные меристемы генетически наиболее стабильны, и побеги, развивающиеся из них, обладают значительной генетической устойчивостью. Однако следует заметить, что Т. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 38 из 72 Мурасиге считает размножение растений пазушными побегами самым медленным путем из всех известных типов органогенеза. Образование придаточных побегов непосредственно из культивируемых эксплантов У многих растений наблюдается возникновение побегов непосредственно из специализированных тканей экспланта. Отдельные клетки изолированных из растений тканей могут дедифференцироваться изза нарушения корреляционных взаимоотношений и образовывать меристематические очаги, в которых затем закладываются стеблевые почки. Укоренение таких адвентивных побегов ведет к образованию целых растений. Этот метод регенерации растений особенно пригоден для травянистых растений при использовании листьев, луковиц, клубнелуковиц, стеблей, корневищ и клубней. Эксплант помещают на питательную среду, содержащую небольшие количества ауксинов и цитокининов, Образующийся пучок побегов расщепляют и высаживают в отдельные сосуды для получения такого же пучка побегов. Многие виды луковичных растений в природе размножаются очень медленно. Метод культуры тканей позволяет значительно увеличить коэффициент их размножения путем индуцирования придаточных побегов из различных тканей луковицы. Используя очень маленькие экспланты, из одной луковицы можно получить множество однородных растенийрегенерантов. Таким способом в культуре тканей размножают целый ряд растений: финку, фрезию, амариллис, лилию, петунию, цикорий, каланхое, цикламен др. Развитие адвентивных побегов может осуществляться также за счет иковых и интеркалярных меристем. Благодаря меристематическому прохождению эти растения генетически идентичны родительским формам. Кроме того, в тканях экспланта в возникших при культивировании меистематических очагах процесс дифференциации может пойти по пути формирования эмбриоидов. Правда, это явление наблюдается редко. Можно заключить, что не только каждому виду растения, но даже отдельным тканям присуща своя конкретная морфогенетическая реакция, которая используется для клонального микроразмножения в культуре тканей. При этом метод должен обеспечивать генетическую стабильность в рамках нормальной мутабельности растений. Регенерация растений из каллуса Другим распространенным методом микроразмножения является индукция органогенеза или соматического эмбриогенеза в недифференцированной каллусной ткани или суспензионной культуре клеток. Переход к морфогенезу контролируется соотношением 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 39 из 72 фитогормонов в питательной среде. Модельную систему регенерации растений через органогенез представляет табак.(рис3) Варьируя концентрации регуляторов роста в питательной среде, можно вырастить побеги из каллуса или непосредственно из экспланта. Таким путем, например, удалось получить растения от скрещивания несовместимых видов табака Nicotians tabacum и N. occidentalis. Обычно из семян, по лученных от такого скрещивания, развивались нежизнеспособные проростки Из проросших семян была получена каллусная ткань, в которой затем были индуцировано образование стеблевых почек и корней. Так были выращены и размножены ценные гибридные растения табака. К сожалению, закономерность, установленная Скугом и Миллером, не всегда распространяется на такие важнейшие сельскохозяйственные культуры, как зерновые и бобовые, и некоторые другие растения. Следовательно, выявляется влияние генотипа на регенерационную активность каллуса. На морфогенетический потенциал каллусной ткани оказывают влияние и другие факторы: возраст и физиологическое состояние растения, из которого изолирован эксплант, происхождение экспланта, возраст каллусной ткани и условия ее культивирования. Идеальный для микроразмножения каллус должен содержать генетически стабильные диплоидные меристемоподобные клетки, аналогичные клеткам стеблевого апекса и обладать способностью постоянно размножаться и образовывать большое кол-во регенерантов.. Тема 7. Оздоровление растений (2ч). 1. Культура апикальной меристемы. Многие полезные растения настолько инфицированы вирусными, бактериальными и грибными болезнями, что это приводит ежегодно к резкому снижению урожая и ухудшению качества продукции. Клональное микроразмножение растений, осуществляемое стерильными эксплантами в асептических условиях, приводит к оздоровлению от бактериальных и грибных патогенов, однако от вирусной инфекции поверхностной стерилизацией материала освободиться нельзя. Бороться с вирусными болезнями привычными химическими методами невозможно, так как жизнедеятельность вирусов тесно связана с метаболизмом клетки растения-хозяина. Фитопатогенные вирусы, которых сейчас описано более 600, не опасны для человека, но, поражая все культурные растения, они наносят большой ущерб сельскому хозяйству. Например, потери урожая от вирусных заболеваний картофеля составляет 25—88%, у винограда — до 60%, у вишни — до 35—96%, у сливы — 5— 95%. у яблони — 66% и т. д. Причем продуктивность и качество урожая могут снижаться и без внешних симптомов заболевания, что в конце концов 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 40 из 72 приводит к вырождению сорта. Так, ценный сорт картофеля Бель-де-Фонтенэ во Франции практически исчез в результате заражения вирусом и был возрожден из здоровой меристемы, выделенной из зараженного растения и культивируемой in vitro. Культура апикальной меристемы. Основной путь борьбы с вирусными болезнями — получение здорового посадочного материала. В последнее время для получения безвирусных растений картофеля и многих других вегетативно размножаемых культур успешно применяется метод культуры апикальных меристем в сочетании с термообработкой, хемотерапией и тестированием на наличие вирусов. Метод культуры апикальных меристем принципиально отличается от традиционных методов очистки растений от вирусов, потому что при культивировании здоровых растений-регенерантов в стерильных условиях исключается опасность повторной инфекции. Основанием для использования апексов с целью получения здоровых растений послужили эксперименты П. Лимассе и П. Корнуе. Они в 1949 году установили, что концентрация вирусов табачной мозаики в листьях табака снижалась по мере приближения к верхушке. У половины верхушек побегов, или апикальных меристем, вирус не был обнаружен. Применение метода апикальной меристемы на практике для оздоровления вегетативно размножаемых культур от вирусных болезней началось благодаря работам Г. Мореля и к Мартина в 1952 году. Они использовали этот метод для оздоровления тонтина от пирусэ мозаики. Нет единого мнения о причинах слабой репродукции вирусов в меристемных тканях. Одни исследователи объясняют отсутствие вирусов в меристеме более медленным их распространением от клетки к клетке из-за того, что в верхушечной меристеме нет проводящей системы, а передвижение вирусов от клетки к клетке затруднено из-за слишком малого размера плазмодесм. Другие пытаются объяснить этот факт особым метаболизмом меристематических клеток, ингибирующим синтез вирусного нуклеопротеида. При тепловой обработке размножение вирусов в развивающейся верхушке побегов так сильно тормозится, что при дифференциации меристемы возможно появление клеток, свободных от вирусов. Для успеха тепловой обработки необходимо выдерживать донорные растения при высокой температуре (34-40°С) в оптимальном для роста состоянии как можно дольше, чтобы получить прирост, свободный от вирусов. Однако не все растения выдерживают длительную тепловую обработку, что приводит к отставанию в росте и другим нарушениям у меристемных растений. У полевых и плодоовощных культур оздоровление проводится при комплексном применении термообработки, культуры меристемы и отбора на основе вирусных тестов. Диагностика заражения растений 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 41 из 72 Поскольку не всегда удается получать безвирусный материал тепловой обработкой и культурой меристемы, важное место в этой работе принадлежит эффективному тестированию. Применяются разные методы оценки на наличие вирусов: растения-индикаторы, серологические методы, электронно-микроскопический и иммуноферментный анализ. В основе метода растений-индикаторов лежит способность растений отдельных видов отвечать специфической реакцией при нанесении на них сока из тканей больного растения. Это трудоемкий и длительный метод. Требуются специальные растения, условия и площади для их выращивания. Кроме того, чувствительность метода зависит от многих факторов, ответная реакция проявляется через длительное время. Одним словом, этот метод диагностики не годится для быстрой и эффективной оценки на наличие вирусов при массовых обследованиях в промышленных масштабах. То же самое можно сказать и в отношении трудоемкого и дорогостоящего электронно-микроскопического метода, который используется при фундаментальных исследованиях, например при контроле во время препаративного выделения вирусов, при первичной идентификации новых вирусных заболеваний. В сельскохозяйственной практике обычно применяются серологические методы, основанные на реакции антигенов с антителами вне организма. При капельном методе серодиагностика капля неочищенного сока растения смешивается с каплей антисыворотки на предметном стекле. Вирусные частицы, адсорбированные на клеточных органоидах, вовлекают их в серологическую реакцию, образуя заметный агглютинат. Однако этот метод обладает слабой чувствительностью и может применяться только для выявления вирусов, накапливающихся в листьях в высокой концентрации. Даже в этом случае метод ограничен тестированием вирусов только в листьях взрослых растений, тогда как эффективная система оздоровления растений предполагает диагностирование именно миниатюрных растенийрегенерантов, полученных из апикальной меристемы, так называемых мериклонов. В них вирусы присутствуют в концентрациях, лежащих за пределами чувствительности серологического метода. Наиболее чувствительным методом тестирования является метод иммуноферментного анализа в различных вариантах. Помимо высокой чувствительности и быстроты анализа, преимуществом метода является то, что для индикации требуется минимальное количество растительного материала из любых органов растений. Однако повсеместное применение метода у нас ограничивается недостатком иммунодиагностических наборов для обнаружения различных вирусов. В настоящее время разработан неиммунологический метод диагностики вирусов на основе применения молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Этот метод в будущем, видимо, заменит иммуноферментный метод диагностики вирусов. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 42 из 72 Широкое внедрение системы безвирусного растениеводства в практику предполагает тестирование на зараженность разными вирусами миллионов растений различных культур, для этого требуются не только экспресс-методы диагностики, но и автоматические приборы для их проведения. Получение безвирусного посадочного материала картофеля. Технология производства безвирусного картофеля начинается с термообработки клубней. По общепринятой гипотезе размножение вирусов при температуре 34—40°С тормозится вследствие перестройки обмена веществ. Тепловая обработка может длиться от 7 дней до 7 недель в зависимости от типа вируса. Клубни также обрабатываются ингибиторами вирусов и стимуляторами роста растений. Для вычленения меристем используют этиолированные или светло-зеленые ростки длиной 3—5 см. После поверхностной стерилизации и промывки ростков в стерильном боксе из них вычленяют верхушечные меристемы. Изоляция меристем размером 50—100 мкм практически невозможна, поэтому вместе с ней изолируют первые листовые примордии и тогда ее размеры достигают 500 и более мкм. Из-за этого снижается надежность получения безвирусного экспланта, но зато повышается степень его дифференциации. Апексы, помещенные на агаризованную питательную среду, развиваются и образуют проростки длиной 0,3—0,5 см. Затем их пересаживают на свежую питательную среду для стимуляции корнеобразования и роста стебля. После появления 5—7 листьев эти растеньица расчеренковывают и каждый черенок сажают в пробирку с питательной средой того же состава. Один черенок используют для проверки на наличие вирусов. Здоровые растения становятся родоначальниками безвирусных линий. Ускорение размножения здоровых линий достигается методом последовательного микрочеренкования. Растения из черенков развиваются значительно быстрее, чем из меристемы, дают более сильную корневую систему и большее количество листьев. Метод черенкования растений в пробирках позволяет получить до 2—3 тыс. растений за 2—3 месяца. Далее эти миниатюрные растеньица (суперсуперэлита) либо депонируются, либо пересаживаются в почву теплиц. Надо отметить, что этот этап работы очень важный и требует большого внимания. В благоприятных условиях для оздоровления сорта в среднем достаточно вычленить 40 меристем и можно in vitro за 7—8 месяцев от них получить 30—40 тыс. клубней. Эффективность оздоровления в большей мере зависит от сортовых особенностей, исходной зараженности вирусами, сезонных влияний и т. д. Растения, размноженные в изолированных условиях — в теплице, являются суперэлитой и размножаются затем в суперэлитных маточниках. Полученные элитные растения размножаются в производственных питомниках, и полученные от них клубни (семенной 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 43 из 72 материал) передаются в хозяйства для промышленного производства оздоровленного посадочного материала Нужно учесть, что через 5—6 лет сорт вновь заражается и требуется новый оздоровленный посадочный материал. В целях более эффективного использования меристемных растений раз работана технология ускоренного размножения картофеля микроклубнями. Растения черенкуют, и черенки высаживают на среду, способствующую образованию клубней. Для стимуляции их образования растения подвергают воздействию низких температур (10—15°С). При этом микроклубни зачастую образуются в пазухах листьев. Микроклубни лучше хранятся и очень удобны для последующего размножения, тогда как высаживание в грунт пробирочных растений сопровождается потерями. В последнее время пытаются для оздоровления картофеля использовали каллусную ткань. В процессе пассирования каллуса происходит освобождение его клеток от вирусов, и в результате спонтанного или индуцированного морфогенеза получаются здоровые растениярегенеранты; и даже доказано, что для некоторых сортов метод каллусных культур более эффективен, чем метод апикальных меристем. Более активный морфогенез наблюдается в каллусе, полученном из верхних частей растений. Степень успеха в получении свободного от вирусов материала зависит от следующих предпосылок: 1) возможность термической обработки мате риала; 2) возможность культуры меристемы; 3) наличие отработанного тес-м с высокой точностью выявления вирусов; 4) высокий коэффициент размножения здорового растения; 5) организация размножения оздоровленного исходного материала в условиях полной изоляции, чтобы избежать повторного заражения; 6) объем культуры, который позволит обеспечить возможность ежегодного обновления исходного материала. Эти предпосылки неодинаково выполнимы у различных культур. В настоящее время ним методом оздоровлены почти все ценные сорта картофеля, но, к сожалению, у нас в стране он слишком медленно внедряется в практику первичного семеноводства. Тема 8. Гаплоидная технология (2ч). 1. Получение гаплоидов в культуре пыльников и пыльцы. 2. Развитие микроспор in vitro и регенерация растений Гаплоиды — организмы, в соматических клетках которых содержится одинарный набор хромосом (n), представляющий половину полного набора (2n), свойственного виду. Экспериментальное получение гаплоидов традиционными методами селекции (внутривидовое и межвидовое опыление, облучение рентгеновскими лучами и воздействие другими стрессовыми 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 44 из 72 факторами) малоэффективно и требует много времени. Использование таких приемов, как культивирование in vitro мужского и женского гаметофита, намного ускоряет получение гаплоидов и облегчает селекционный процесс. Экспериментальную гаплоидию можно рассматривать как форму апомиксиса. Апомиксис — размножение организмов, не сопровождающееся половым процессом. Индуцирование гаплоидов в культуре мужского гаметофита (пыльники, пыльца) называется андрогенезом, а в культуре женского гаметофита (семяпочки) — гиногенезом. Кроме того, гаплоиды можно вырастить культивируя гибридный зародыш, в котором происходит элиминация хромосом одного из родителей. Иногда гаплоидное растение образуется в процессе псевдогамии — ложного оплодотворения, в результате чего зародыш развивается из неоплодотворенной яйцеклетки. Получение гаплоидов в культуре пыльников и пыльцы. Впервые гаплоидные растения при культивировании пыльников дурмана были получены С. Гуха и С. Махешвари в Индии в 1964 году. Затем эти опыты повторил на табаке французский ученый К. Нич в 1957 году. С тех пор этим способом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля, рапса и других сельскохозяйственных культур. Возникновение in vitro гаплоидного спорофита из мужского гаметофита — процесс сложный и слабоизученный. Микроспоры проходят очень сложный путь, формируя либо каллус, либо эмбриоиды и далее растения-регенеранты. Как индуцируется и регулируется этот процесс, пока неизвестно. Нормальное развитие микроспор in vivo складывается из следующих стадий: 1) мейоз, в результате которого из материнской клетки пыльцы образуются тетрады микроспор; 2) освобождение микроспор из утолщенной стенки тетрады; 3) развитие микроспоры с последующим образованием зрелого пыльцевого зерна, сопровождаемое двумя митозами. В культуре отклонение от нормального развития может идти на любой стадии развития микроспоры. Развитие микроспор in vitro и регенерация растений Микроспоры (незрелая пыльца) in vitro ведут себя по-разному. Единицы из них переходят с гаметофитного пути развития на спорофитный и формируют эмбриоид. Другие дедифференцируются и образуют каллус. Часть из них может продолжать микроспорогенез и гаметогенез, а какая-то часть вообще деградирует и погибает. Н. Сандерланд исследовал первые этапы развития изолированных микроспор дурмана в культуре и показал, что они отличаются от нормального развития микроспор. Микроспора in vitro может разделиться на две «равные» клетки, т. е. не происходит дифференцирующего деления с образованием вегетативной и генеративной клетки. Такой переход с гаметофитного на спорофитный путь развития характерен для Datura innoxia, Nicotiana tabacum. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 45 из 72 Одноядерная микроспора в результате первого неравного деления образует вегетативную и генеративную клетки. Генеративная клетка после первого митотического деления дегенерирует и все последующее развитие микроспоры идет по зиготическому пути через многократное деление вегетативной клетки. Этот путь развития наблюдается у Nicotiana tabacum, Datura metel, Hordeum vulgare, Triticum aestivum и др. В других случаях может делиться только генеративная клетка. Возможно, что обе клетки (вегетативная и генеративная) делятся и участвуют в образовании спорофита. Описанные пути развития микроспоры in vitro приводят к образованию гаплоидной многоклеточной структуры, из которой в дальнейшем сформируется гаплоидное растение-регенерант. В случае же слияния вегетативного ядра с генеративным, спорофит, развившийся из диплоидной клетки, будет диплоидным. Кроме того, диплоиды могут возникать из нередуцированных микроспор, которые имели аномалии в развитии (нарушения в мейозе), а также в результате эндополиплоидии на последующих стадиях формирования спорофита. Трудно сказать, что является индуктором переключения программы развития микроспоры с гаметофитного на спорофитный путь, участвуют в этом процессе нормальные или аномальные микроспоры. Поведение микроспор определяется многими факторами, в том числе их естественным полиморфизмом, причиной которого могут быть аномалии в развитии, позиционное положение веретена деления в спорах. Процесс перехода микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития определяется на генетическом уровне, но реализуется в зависимости от конкретных физиологических условий и различных по действию индуцирующих факторов. Направление развития микроспор прежде всего определяется стадией, на которой были изолированы пыльники, а также гормональным составом питательной среды. Образовавшаяся из микроспоры многоклеточная структура далее может развиться в каллусную ткань. Образование гаплоидных растений из эмбриоидов называется прямым андрогенезом, из каллуса — косвенным. Из тысяч микроспор, содержащихся в пыльнике, только из единиц развиваются эмбриоиды. Возможно, способность к эмбриоидогенезу генетически обусловлена. Экспериментально установлено увеличение частоты эмбриогенных микроспор под действием стрессовых воздействий, например низких и высоких температур, ионизирующих излучений. Для прямого андрогенеза имеет значение физиологическое состояние донора, стадия развития пыльцы в момент введения пыльника в культуру, состав питательной среды и условия культивирования. Для многих растений наиболее благоприятной стадией развития является одноядерная микроспора. Не все растения, регенерировавшие из каллусов, являются гаплоидными, 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 46 из 72 поэтому для массового получения гаплоидов стараются индуцировать пыльцевой эмбриоидогенез. В. Ананд с сотрудниками, культивируя пыльники одного из сортов виргинского табака Nicotiana tabacum, наблюдали образование эмбриоидов трех типов: путем деления вегетативной клетки, генеративной и обеих клеток. Из этих эмбриоидов они получили растения и выращивали их далее в почве до цветения. Морфологический анализ листьев и цветков показал, что эти растения также подразделялись на три типа. Установлено, что в культуре пыльников и микроспор образуется два типа каллусов: каллусы, содержащие неорганизованную массу гетерогенных клеток, и каллусы, состоящие частично из меристематических клеток. Процесс регенерации связан со вторым типом каллусов, у которых образование побегов происходит из меристематических очагов путем последующей дифференциации. Тема 9. Клеточная инженерия (2ч). 1. Выделение протопластов. 2. Получение жизнеспособных протопластов. Клеточная инженерия — это метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции. При гибридизации искусственно объединяют клетки с образованием гибридного генома. Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используют не половые клетки (гаметы), а клетки тела растения, из которых изолируют протопласты. При определенном экспериментальном воздействии протопласты заставляют сливаться друг с другом. Из полученных гибридных клеток в дальнейшем регенерируют целые растения-гибриды. Для обозначения процесса гибридизации с помощью слияния протопластов используются несколько терминов-синонимов: парасексуальная гибридизация, соматическая гибридизация, неполовая гибридизация. Однако значительно чаще используется термин «соматическая гибридизация», т. е. гибридизация в обход полового скрещивания, когда в качестве родительских клеток используются протопласты — соматические клетки, лишенные клеточной стенки. Растения-регенеранты, возникающие in vitro из гибридных клеток, называются соматическими гибридами. Клеточная реконструкция — это создание жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток (ядра, цитоплазмы, митохондрий, хлоропластов, хромосом). В результате таких манипуляций могут быть созданы клетки с необычными сочетаниями ядерных и цитоплазматических генов. Еще больший интерес представляет возможность переноса индивидуальных хромосом и создание анеуплоидных линий. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 47 из 72 Протопласт является идеальным реципиентом для чужеродной ДНК, которая часто представляет собой плазмиды. Такая трансформация, обеспечивая проникновение и последующую экспрессию этой ДНК, может приводить к образованию генетически модифицированных растений. Таким образом, выделение, культивирование, слияние протопластов и перенос в них клеточных органелл, отдельных хромосом, ДНК позволит генетикам и селекционерам расширить разнообразие получаемых гибридных растений. Выделение протопластов. Протопласт — клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом. Массовое получение «голых» клеток стало возможным благодаря Э. Кокингу, который в начале 60-х годов разработал способ разрушения клеточной оболочки, не повреждающий живое содержимое клетки, и изолировал отдельные протопласты высших растений. Он обрабатывал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов и впервые получил изолированные протопласты энзиматическим путем. В нативной клетке протопласт прижат к клеточной стенке давлением, создаваемым центральной вакуолью, или тургорным давлением. Через клеточную стенку проходят протоплазматические тяжи — плазмодесмы, соединяющие цитоплазму данной клетки с цитоплазмой всех соседних клеток. Клеточная стенка с протопластом составляет единый структурнофункциональный комплекс. Чтобы не повредить содержимое клетки при растворении клеточной стенки, клетку подвергают плазмолизу. В качестве осмотика используются сахароза, маннит, сорбит. Под действием гипертонических растворов этих веществ клетка обезвоживается, протопласт сжимается и отстает от целлюлозно-пектиновой оболочки. Кроме того, высокое осмотическое давление среды выделения протопластом предохраняет их от осмотического шока, поскольку протопласты осмотически нестабильны. Иногда, если клетка вытянутая, протопласт при плазмолизе разбивается на части. В этом случае часть, в которую не попало ядро, называется цитопластом, это безъядерный субпротопласт В 1968 г. японский ученый Такебе разработал эффективный метод по лучения больших количеств активных протопластов из клеток мезофилла табака. Лист табака сначала быстро стерилизуют в 70% этаноле, затем 15— 20 мин. в 10% растворе гипохлорита кальция и отмывают в стерильной дистиллированной воде. После удаления нижнего эпидермиса лист разрезается на небольшие кусочки и помещается сначала в раствор пектиназы, которая, растворяя срединные клеточные пластинки, осуществляет маце рацию ткани, а затем — в раствор целлюлазы, окончательно разрушающей целлюлозные клеточные стенки. Ферменты готовились на растворе осмотика. Затем этим методом стали выделять протопласты из самых разных тканей различных видов растений. Сейчас для 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 48 из 72 получения протопластов применяют смеси ферментов, что позволяет сократить время работы. Для удаления клеточной стенки используются ферменты трех типов пектиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, действие которых направлено на,разрушение основных компонентов клеточной стенки. Источниками этих ферментов служат некоторые бактерии и грибы, которые выделяют ферменты в культуральную среду, а также пищеварительный сок виноградной улитки. Сейчас существует большой выбор стандартных ферментов пектолического и целлюлитического действия, имеющих различные фирменные названия: Все ферментные растворы стерилизуют фильтрованием через бактериальные фильтры. Комбинации ферментов и их соотношения специфичны для каждого 1ипа клеток, потому что они отличаются по структуре и составу стенок. Для каждой ткани подбираются состав ферментов, их концентрация и соотношение, а также время воздействия. Выделяющиеся протопласты должны находиться в ферментном растворе минимальное время и затем тщательно отмываются от него. Важным фактором при получении протопластов является хорошая аэрация, которую обеспечивают различные перемешивающие устройства, или ко ткани инкубируют в чашках Петри, в которых ферментный раствор покрывает только дно. Выделение протопластов проводят на рассеянном свету или в темноте. Время инкубации в зависимости от сочетания ферментов, рН растворов и температуры может колебаться от 1—2 до 15—16 часов. Оптимальную температуру и время инкубации необходимо подбирать для каждой конкретной ткани. Температурные условия могут варьироваться в широких пределах. Так, например, для пшеницы это 14°С, для томатов 27°С. Получение жизнеспособных протопластов. Успешное выделение протоях Тастов зависит от многих факторов: типа ткани (лист, семядоля, корень, пыльцевые зерна, каллусная ткань, клеточная суспензия), вида растения и сорта, физиологического состояния растения, состава ферментов, их качества, рН среды и вида осмотика Однако проблема жизнеспособности протопластов возникает не только после их выделения, но и после различных манипуляций с ними. Качество суспензии протопластов определяется процентом жизнеспособных протопластов. Подсчет протопластов проводят в камере Фукса — Розенталя. Плотность протопластов (количество в 1 мл суспензии) — важная характеристика, определяющая их начальный выход и необходимая для всех последующих манипуляций с ними. Хорошим выходом протопластов считается получение от 1x106 до 5x106 жизнеспособных протопластов из 1 г сырой массы ткани растения или культивируемых клеток. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 49 из 72 Видовая специфичность, возраст и физиологическое состояние растения, то есть его генетическая и эпигенетическая характеристика, влияют на конечный выход и жизнеспособность протопластов Для стабильного получения больших количеств протопластов необходимы стандартные условия выращивания растений, определение оптимального для выделения протопластов возраста и органа растения. Лучше всего использовать молодые растения. Например, у петунии растения с бутонами для выделение протопластов вообще непригодны. Выделение протопластов из культуры клеток и тканей имеет ряд преимуществ (стерильность, приспособленность к росту в культуре). Однако измененный химический состав и увеличенная толщина клеточной стенки затрудняют ее гидролиз ферментами. Выход интактных протопластов пропорционален доле меристематических клеток в культуре, а это достигается частым пассированием клеточной суспензии (каждые 2—3 суток) на свежую питательную среду. Для получения протопластов из суспензионных культур наилучшей является поздняя стадия логарифмической фазы роста. В этот период клеточные стенки легко поддаются энзиматическому разрушению, освобождая жизнеспособные протопласты. Условия и способы изолирования протопластов влияют на их жизнеспособность. Сама процедура обезвоживания и разрушения клеточной стенки вызывает состояние шока. Это выражается в увеличении вакуолизации цитоплазмы, уменьшении числа полисом, появлении многочисленных липидных капель, конденсации содержимого ядра и хлоропластов. Качество ферментного препарата влияет не только на выход, но и на свойства изолированных протопластов. В коммерческих препаратах пектолитических и целлюлитических ферментов присутствуют протеазы, липазы, нуклеазы и другие ферменты, фенольные соединения, соли, которые могут изменять свойства плазмалеммы. С целью удаления токсических зеществ и увеличения выхода жизнеспособных протопластов ферменты рекомендуется очищать, но лишь частично, поскольку высокоочищенные ферменты менее эффективны при получении больших количеств протопластов. В некоторых случаях в ферментные растворы вводят такие вещества-протекторы, как, например, 0,5-процентный раствор декстрана или сульфата калия, которые взаимодействуют с загрязняющими коммерческие препараты протеинами и снижают повреждаемость протопластов. Присутствие в инкубационной среде ионов, прежде всего кальция и магния, увеличивает стабильность плазмалеммы и существенно улучшает качество выделяемых протопластов. Изолированные протопласты чувствительны к механическому и осмотическому стрессу, они осмотически стабильны только в гипертоническом растворе непроникающего осмотического стабилизатора. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 50 из 72 Отмытые от ферментного раствора жизнеспособные протопласты выходят из состояния шока, в них наблюдается репарация поврежденных структур и начинается подготовка к регенерации стенки. Тема 10. Соматическая гибридизация (3ч). 1. Принципы соматической гибридизации 2. Принципы соматической гибридизации Первые соматические гибридные клетки были получены в эксперименте с животными клетками в начале 60-х годов, когда был усовершенствован метод культуры клеток. У растений это стало возможно позже, когда были разработаны методы выделения и слияния протопластов. Метод гибридизации соматических клеток животных позволяет решать многие теоретические проблемы биологии и медицины. Гибридные клетки широко применяются в биотехнологии, например использование гибридом для получения многоклональных антител. Гибридома — это клеточный гибрид, полученный слиянием антителообразующей клетки (Влимфоцита) с опухолевой клеткой. Опухолевые клетки придают лимфоцитам способность к неограниченному росту вне организма с сохранением их способности продуцировать и секретировать в культуральную среду антитела. Слияние протопластов соматических клеток растений благодаря их тотипотентности приводит к получению гибридного организма. Поэтому этот метод является инструментом не только генетического анализа, но и генетического улучшения растений. С древнейших времен селекция культурных растений была основана на половом скрещивании и последующем отборе нужных генотипов. Однако половое скрещивание — это очень ограниченная и строго регламентированная система гибридизации, где в качестве родительских форм можно использовать лишь определенные организмы в определенных сочетаниях. Результатом такой гибридизации являются потомки, имеющие вполне определенные наборы генов. Половым путем невозможно передать только один ценный признак от дикого вида культурному растению, накладывается масса балластных и даже вредных признаков, потому что половой процесс симметричен. Гаметы обоих родителей привносят в зиготы одинаковые гаплоидные наборы ядерного генетического материала. Каждое отдельное растение-потомок несет равные количества генов от обоих родителей. Для удаления большей части генов дикого вида приходится проводить многократные возвратные скрещивания полученного гибрида с исходной культурной родительской формой. Эта работа занимает многие годы. Для выведения сорта необходимо провести десять и более последовательных скрещиваний. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 51 из 72 Внеядерная генетическая информация, находящаяся в хлоропластах и митохондриях, у большинства высших растений в половом процессе наследуется строго однородительски и по материнской линии. Половая гибридизация ограничена физиологически близкими комбинациями видов растений. Только путем постоянного расширения генетического базиса можно обеспечить эффективность селекции в будущем. Расширение генетического базиса культурных растений возможно через получение межвидовых и межродовых гибридов. Особенно важна для передачи генов от диких растений культурным межвидовая гибридизация. Соматическая гибридизация является новым способом гибридизации, позволяющим преодолевать ограничения полового процесса и искусственно конструировать новые растения. Соматическая гибридизация позволяет: 1) скрещивать филогенетически отдаленные виды растений (организмов), которые невозможно скрестить обычным половым путем; 2) получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами (или несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого; 3) создать систему гибридизации, включающую одновременное слияние трех и более родительских клеток; 4) получать гибриды, представляющие собой в генетическом смысле сумму идиотипов родителей; 5) получать растения, гетерозиготные по внеядерным генам; 6) преодолевать ограничения, налагаемые генеративными системами несовместимости; 7) скрещивать формы, которые невозможно гибридизовать половым путем из-за аномалий в морфогенезе или гаметогенезе родителей; 8) гибридизовать клетки, несущие различные эпигенетические программы. Таким образом, соматическая, или парасек-суальная, гибридизация является уникальным методом переноса ядерных и цитоплазматических геномов, позволяющим обойти проблему половой несовместимости у растений. При слиянии двух протопластов истинная гибридная клетка (ядерный гибрид) образуется, если сливаются ядра. Клетка, в которой слияние ядер не произошло, называется гетерокарионом. Интересны возможности реконструкции растительной клетки путем такой гибридизации, когда в качестве одного или обоих родителей используются субпротопласты Субпротопласт — это часть протопласта, окруженная цитоллазматической мембраной и несущая некоторые из органоидов клетки: ядро-нуклеопласт, протопласт без ядра — цитопласт, ядро и часть протоплазмы — мини-протопласты. Для пересадки пластид и митохондрий от одного вида другому могут использоваться цитопласты. Гибрид, несущий гены ядра только одного родителя наряду с цитоплазматическими (внеядерными) генами от обоих либо от одного из родителей, называется цитоплазматическим (цибрид). Цитогеты — цитоплазматические гетерозиготы — гибриды, несущие альтернативные цитоплазматические гены от обоих родителей. С учетом наличия в клетках, 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 52 из 72 как минимум, двух цитоплазматических генофоров (митохондрии и хлоропласты) и сегрегации некоторых ядерных и внеядерных генов при соматической гибридизации возможно получение до 27 различных вариантов продуктов слияния. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и частицы. По-видимому, это происходит либо вследствие естественного эндоцитоза, либо путем пассивного проникновения через разрывы плазмалеммы, которые всегда имеются на поверхности свежеизолированных протопластов. Культура гибридных клеток с получением каллусной ткани и индукцией в ней органогенеза дает возможность получить гибридное растение-регенерант. Первым гибридом высших растений, полученным методом соматической гибридизации П. Карлсоном с сотрудниками в 1972 г., был межвидовой гибрид Nicotians glauca и N. langsdorfii. Из гибридных клеток был получен каллус, индукция органогенеза у которого дала проростки, из этих проростков были выращены гибридные растения, которые цвели. Эти гибриды были идентичны амфидиплоидным (по одному диплоидному набору хромосом от каждого родителя) половым гибридам по морфологии, числу хромосом, изозимному составу пероксидазы. В 1974 г. Г. Мелхерс и Г. Лабиб осуществили слияние гаплоидных протопластов двух сортов Nicotiana tabacum, которые отличались дефектными светочувствительными хлоропластами. В результате было получено гибридное растение с нормальными хлоропластами, такие же хлоропласты имели и половые гибриды этих сортов. Д. Пауэр с сотрудниками в 1976 г. получил соматический межвидовой гибрид Petunia hybrida и P. parodii, Д. Дудил в 1977 г. — межвидовой соматический гибрид моркови Daucus carota и D. capillifolius. Эти авторы доказали гибридность полученных соматических гибридов и их идентичность по фенотипу половым гибридам, полученным при скрещивании тех же родительских форм. Таким образом, выделение, культивирование, слияние протопластов, а также перенос в них отдельных клеточных органелл позволит генетикам и селекционерам расширить разнообразие получаемых гибридных растений. Тема 11. Клеточная селекция (2ч). Клеточная селекция — это процесс возрастающего доминирования в культуре клеток определенного типа. Так как каждая клетка потенциально может регенерировать растение, то путем клеточной селекции можно быстро создать новые формы растений. Эти формы в генетическом отношении могут быть идентичными с исходной клеткой, из 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 53 из 72 которой они возникли. Если эта клетка была устойчивой к какому-либо патогену или какому-то экстремальному фактору, то и растение, которому она дала начало, также будет устойчивым. Клеточная селекция имеет свои преимущества перед традиционными методами ведения селекционного процесса: исключает сезонность в работе, экономятся посевные площади. Кроме того, если рассматривать каждую клетку популяции как индивидуальный организм, то в одном опыте можно экспериментировать с миллионами особей. Селекционер, работающий в полевых условиях традиционными методами, в лучшем случае имеет дело с тысячами растений. Большим препятствием в этих исследованиях является отсутствие знаний о связи между событиями, происходящими на молекулярном и хромосомных уровнях в клетках, с изменчивостью признаков на уровне организма. Методы клеточной селекции Для проведения направленной селекции, то есть выделения из общей массы культивируемых клеток отдельных клеток с определенными мутантными изменениями, создают селективные условия, способствующие росту только мутантных клеток. В культурах клеток растений используют такие селективные системы, как устойчивость к аналогам аминокислот и аналогам нуклеотидов, патотоксинам, антибиотикам, гербицидам, высоким концентрациям солей и тяжелых металлов, низким значениям рН и другим стрессовым факторам. Используют также системы прототрофности и ауксотрофности по фитогормонам, витаминам, аминокислотам, то есть отбирают клетки, способные или, наоборот, неспособные расти на среде с этими веществами. Если проводят отбор клеток на устойчивость к какому-либо веществу, то клетки высевают на среду, содержащую это вещество. Когда проводят отбор применительно к какому-либо стрессовому фактору (низкие или высокие температуры, гипоксия и др.), культуральные сосуды помещают в соответствующие условия. Через некоторое время большая часть клеток погибает, выживают лишь те, которые оказались устойчивыми к селективному фактору благодаря мутации или эпигенетическому изменению. Такой метод называют прямой селекцией. Этот подход, например, широко применяется для выделения клеток — сверхпродуцентов некоторых метаболитов, в частности аминокислот. Культуру выращивают в присутствии ингибитора (аналог аминокислоты), в результате чего отбираются мутанты, преодолевающие нарушения метаболизма за счет образования избытка желаемого соединения. Непрямая, или негативная, селекция основана на создании таких условий, когда делятся только клетки дикого типа, включая при этом и ДНК специально добавленный в среду аналог тимидина, и затем погиба ют (метод «летального роста»), а мутантные клетки теряют способность размножаться, 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 54 из 72 но остаются живыми. Другими словами, создаются особые условия, при которых мутанты с нужными свойствами не растут. Затем их помещают на питательные среды, обеспечивающие нормальную жизнедеятельность, и получают устойчивые линии. Методы клеточной селекции целесообразно использовать в тех случаях, когда экологический и культуральный факторы совпадают или различаются минимально, только в этих случаях можно ожидать, что формы, отселектированные в стрессовых условиях в культуре клеток, окажутся устойчивыми к экологическому фактору. Концентрация ингибитора (селективного агента), используемого при отборе клеток, зависит от чувствительности данной линии клеток. Поэтому для каждого селективного фактора необходимо построить кривую роста клетки в зависимости от концентрации, то есть, используя широкий диапазон концентраций, надо определить минимальную и максимальную концентрацию вещества, при которой останавливается рост. В культуре клеток получены мутанты с повышенным синтезом специфических аминокислот при отборе на устойчивость к токсическим концентрациям этих аминокислот и их аналогов. Клетки, устойчивые к аминокислотам и их аналогам, характеризуются сверхпродукцией нормальной аминокислоты, что снижает степень включения аналога. Так, были отобраны штаммы клеток моркови и табака, устойчивые к 5метилтриптофану, синтезирующие в 20—30 раз больше свободного триптофана по сравнению с исходными родительскими культурами. Этим методом получен целый ряд клеточных линий картофеля, моркови, риса, дурмана и других растений, способных к сверхсинтезу лизина, метионина, пролина, фенилаланина, глицина. Токсичность некоторых аминокислот, добавленных в среду, может быть обусловлена двумя причинами: 1) угнетение какого-либо фермента биосинтеза ведет к блокированию синтеза другой подобной аминокислоты, имеющей с ней общие биосинтетические пути; 2) избыток аминокислоты приводит к подавлению ассимиляции нитрата или аммония. Аминокислотные аналоги, кроме того, могут включаться в состав белков, что приводит к образованию нефункциональных протеинов. Мутантные клетки с повышенным содержанием отдельных аминокислот могут дать растения-регенеранты с увеличенным содержанием незаменимых аминокислот. Это реальный путь создания растений с повышенным содержанием аминокислот, особенно незаменимых. Используя различные селективные системы, можно вести направленную селекцию клеток по различным хозяйственно ценным признакам, как-то: устойчивость к болезням, гербицидам, к различным стрессовым воздействиям (засоление, тяжелые металлы, кислотность почв, низкие и высокие температуры и др.). 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 55 из 72 Методом клеточной селекции получены линии кукурузы, устойчивые к гельминтоспориозу початков, стеблей и листьев, линии картофеля, резистентные к фитофторе, растения табака, устойчивые к вирусу табачной мозаики, и др. Этим методом получены сорта пшеницы, ячменя, риса, томата, огурца, отличающиеся высокой устойчивостью к гербицидам, засолению почвы и действию промышленных загрязнений (тяжелые металлы). Например, в Японии создан сорт риса, выдерживающий полив морской водой. В Институте молекулярной биологии и биохимии НАН РК М.К. Карабаевым с сотрудниками проведена клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу. Септориоз является одним из широко распространенных инфекционных заболеваний пшеницы и других зерновых культур, вызываемым грибами рода Septoria. Было исследовано влияние различных концентраций двух наиболее активных фитотоксинов гриба Septoria nodum на суспензионные культуры различных генотипов пшеницы. Далее на основе специально подобранной схемы были проведены эксперименты по клеточной селекции, и удалось выделить устойчивую к токсину септориоза клеточную линию пшеницы. Доказательством генетической природы изменений у полученных клеточных линий являются наследуемость признака устойчивости в последующих клеточных поколениях в присутствии токсина, а также сохранение признака в отсутствие селективного давления. Кроме того, исследователями получены данные о повышении устойчивости клеток к патотоксину после пребывания в космосе, а также о значительном ускорении процесса выделения устойчивой линии при непосредственном контакте клеток с токсином в космосе. Космическая клеточная селекция — это практическая сторона использования уникальных факторов космоса для биотехнологии, которая, возможно, в будущем определит новое направление — космическую биотехнологию. Тема 12. Генная инженерия (3ч). В Биологическом энциклопедическом словаре дается следующее определение генетической инженерии. Генетическая, или генная, инженерия — это область молекулярной и клеточной генетики, связанная с целенаправленным созданием in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке-хозяине и синтезировать конечные продукты обмена. Этим методом можно перестраивать геном организмов по намеченному плану, изменяя содержащуюся в них генетическую информацию. Генетическая инженерия — это конструирование функционально активных генетических структур в виде рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК. Суть генетической инженерии состоит в переносе отдельных 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 56 из 72 генов из одного организма в другой. Это стало возможно после открытия ферментов рестриктаз и лигаз. Рестриктазы рассекают молекулу ДНК по строго определенным местам. Сейчас обнаружено более 500 рестриктаз, расщепляющих специфические нуклеотидные последовательности в ДНК. Полученные фрагменты ДНК имеют комплементарные, или липкие, концы и могут быть сшиты в единое целое ферментами ДНК-лигазами. С помощью этих ферментов из набора рестриктазных фрагментов ДНК, содержащих нужный ген, собирается рекомбинантная ДНК, которая затем различными способами вводится в клетку. Новая генетическая информация экспрессируется, и клетка начинает синтезировать продукт, кодируемый введенным геном. Таким образом, вводя в клетку новую генетическую информацию в виде гибридных молекул ДНК, можно получить организм с новым признаком. Такой организм называется трансгенным, или трансформированным. Впервые рекомбинантная ДНК была получена в 1972 г. в лаборатории П. Берга в Станфордском университете в США, в ней были соединены фрагменты ДНК фага лямбда, кишечной палочки и полный геном онкогенного обезьяньего вируса 40. Первые работы по генетической инженерии растений начались в 1980 г. на основе культуры клеток. В 1983 г. был получен каллус, а затем и химерное растение санбин (от английских слов sunflower — «подсолнечник» и been — «бобы»), представляющее собой подсолнечник, в геноме которого работали гены, кодирующие запасной белок бобов фазеолин. Генетическая инженерия как способ переноса генов обещает стать эффективным инструментом в селекции культурных растений. В настоящее время генетическая инженерия растений только зарождается. Этим методом еще не созданы сорта растений с ценными признаками, однако эксперименты подтверждают возможность переноса рекомбинантной ДНК в растительную клетку и ее дальнейшую экспрессию, т. е. генетическую трансформацию клетки. Методической основой генной инженерии является культура изолированных протопластов, полученных либо из клеток мезофилла листа, либо из каллусной ткани. Протопласт, получивший новую генетическую информацию, может быть клонирован по схеме: протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение. Помимо соматических клеток, для генетической трансформации могут быть использованы пыльца, яйцеклетка или только что оплодотворенная яйцеклетка. Таким образом, применяя методы генетической инженерии в культуре клеток, можно конструировать принципиально новые формы растений с ценными качествами. Генноинженерные работы с растениями складываются из следующих этапов: 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 57 из 72 — получение структурного гена, предназначенного для переноса в другой организм; — включение его в вектор, то есть создание рекомбинантной ДНК; — перенос рекомбинантной ДНК в клетки растений; — анализ экспрессии чужеродной ДНК в растительных тканях; — регенерация полноценных растений из отдельных клеток с измененным геномом. Получение генов, предназначенных для переноса в другой организм. Для каждого типа полипептидных цепей, то есть белков, в клетке существует структурный ген, определяющий последовательность аминокислотных остатков в них. Целью генной инженерии является введение индивидуального структурного гена от одного растения в уже имеющиеся ценные сорта для их улучшения. В настоящее время благодаря достижениям молекулярной биологии выделение структурных генов в чистом виде и в достаточном количестве, в принципе, возможно. Однако проведение такой работы с растениями затрудняется тем, что геном растений очень сложен, он включает более 150 тысяч генов, тогда как кодирующую функцию несут только 5— 10% уникальной ДНК, что соответствует 15—25 тысячам структурных генов. Геном растения населен огромным числом повторяющихся элементов ДНК (90— 95%), функция которых неизвестна. Идентификация отдельных растительных генов, кодирующих определенный признак, является очень трудоемкой работой. Кроме того, ряд важнейших признаков кодируется множественными генами. Например, такие признаки, как урожайность, скороспелость, азотфиксация, устойчивость к неблагоприятным факторам среды, имеют полигенную природу, а их биохимические основы неясны. Помимо этого, клетки растений содержат много полисахаридов, которые ингибируют стандартные ферментативные реакции. Целью генноинженерных работ пока являются простые гены, кодирующие определенный признак растений, например гены некоторых запасных белков, устойчивости к гербицидам и пестицидам. Для выделения структурных генов растений используются методы генной инженерии. Наибольшее число геномных копий генов было выделено через этап синтеза комплементарной цепи ДНК (кДНК) на матричной РИК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы). С его помощью можно синтезировать любой индивидуальный ген в присутствии соответствующих иРНК (методы выделения последних достаточно хорошо разработаны). Кроме того, структурные гены могут быть получены путем химико-биологического синтеза благодаря совершенствованию методов изучения первичной структуры белков, кодируемых синтезируемым геном, а также методов прямого определения последовательности нуклеотидных остатков ДНК (секвенирования). К настоящему времени выделены и 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 58 из 72 детально охарактеризованы около 100 структурных генов у различных видов растений. К ним относятся гены запасных белков, гены различных ферментов, гены, активность которых индуцируется тепловым или Холодовым шоком, анаэробными условиями или патогенными микроорганизмами. Часть структурных генов растений представлена различными по составу мультигенными семействами, например гены актинов, гистонов, леггемоглобинов, гены отдельных запасных белков бобовых и злаковых. У запасных белков имеется значительный межлинейный полиморфизм по молекулярному весу и числу компонентов, сохраняющийся и на уровне ДНК. Возможно, этот полиморфизм определяется мобильными элементами — транспозонами. Таким образом, трудности выделения генов, кодирующих желаемый признак, могут быть обусловлены тем, что это могут быть уникальные последовательности, разбросанные в геноме, либо это кластеры (блоки) генов или даже семейства генов, расположенные в разных частях хромосомы. Векторы для переноса генов. Структурные гены содержат только кодированную запись конечного продукта (белка, РНК), они полностью лишены регуляторных участков и потому не способны самостоятельно функционировать ни в клетке-хозяине, ни in vitro. Сигналы репликации и транскрипции, управляющие действием генов в клетке, придает им вектор. Векторы — это специфические в отношении клетки-хозяина и способные к репликации структуры, которые могут присоединять к себе те или иные гены и переносить их в другие клетки. Вектор — это нуклеотидная последовательность, способная включаться в ДНК, не нарушая ее целостности. Вектор должен отвечать следующим требованиям: а) должен автономно реплицироваться; б) иметь маркеры, по которым легко обнаружить трансформированные клетки (например, устойчивость к антибиотику); в) введение чужеродного гена не должно нарушать функций вектора; г) небольшие размеры. Плазмиды бактерий и создание рекомбинантной ДНК Большая часть векторов получена из плазмид кишечной палочки Е. coli и других бактерий. Помимо главной хромосомы, бактерии содержат большое количество очень маленьких кольцевых молекул ДНК, которые состоят из нескольких тысяч пар оснований и называются плазмидами. Это автономно реплицирующиеся молекулы ДНК (генетические элементы), они не сцеплены с главной хромосомой и несут гены устойчивости к антибиотикам, таким, как тетрациклин или канамицин. Плазмиды легко отделить от хромосомной ДНК и получить в чистом виде. Сочетание структурного гена и вектора дает рекомбинантную (гибридную) ДНК. Плазмиду и фрагмент ДНК, содержащий нужный ген, переводят в линейную 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 59 из 72 форму, расщепляя их какой-либо рестриктазой (рестриктирующей эндонуклеазой), образуются м.олекулы со свободными концами, которые могут быть либо одноцепочечными, либо тупыми. Тупые концы, а также короткие одноцепочечные удлиняют с помощью трансферазы, присоединяя к ним либо А, либо Т, что дает возможность получить желаемую комбинацию обеих гетерологичных молекул. Липкие концы затем сшиваются ДНКлигазой, и образуется гибридная ДНК, которую можно ввести в бактериальные клетки. Плазмиды обладают свойством легко проникать в бактериальные клетки. Оказавшись внутри бактериальной клетки, они начинают реплицироваться. При этом чужеродная ДНК не только транскрибируется, но и транслируется, и в клетке начинается синтез белка, кодируемого чужеродным геном, то есть происходит трансформация клетки. В клетке Е. coli можно осуществить экспрессию любого эукариотического гена. Для отбора бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК с нужным геном, в среду вводят антибиотик (тетрациклин или канамицин), поскольку плазмиды содержат ген устойчивости к ним. Бактериальные клетки без плазмиды в этих условиях погибают. Таким образом, плазмиды служат векторами для клонирования чужеродных генов. Тема 13. Сохранение in vitro генофонда (3ч). Современное растениеводство основано на регулярной смене сортов. Это связано с утратой сортом ценных признаков, появлением новых популяций вредителей и возбудителей болезней, изменением климата, почвы и множеством других причин. Средний срок жизни сорта пшеницы и других зерновых культур обычно 5—10 лет. Для выведения новых сортов и улучшения старых требуется разнообразный генетический материал. В целях сохранения генофонда редких и исчезающих видов, ценных селекционных объектов и штаммов — продуцентов экономически важных веществ разрабатываются методы создания коллекций и банков генов in vitro. Основным источником генов являются семена, но в последнее время, по мере развития биотехнологических методов и их применения в селекции, растет потребность в генетическом материале в виде культуры клеток и тканей. Более того, хранение in vitro удобно для тех видов растений, семена которых не могут храниться в обычных условиях и быстро теряют всхожесть, для вегетативно размножаемых видов и особенно для видов, исчезающих из природы. Для создания новых клеточных линий, синтезирующих ценные продукты, необходимо хранение коллекции клеток, то есть эталонов клетокпродуцентов, обладающих определенными характеристиками. Для исследования физиологических и биохимических процессов в культивируемых клетках возникает необходимость длительного сохранения 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 60 из 72 исходных стандартных линий клеток. Таким образом, для решения как теоретических, так и практических задач требуются надежные методы хранения культуры клеток. В течение многих лет для поддержания исходных культур использовалось постоянное их выращивание при оптимальных условиях. Однако это чревато генетическими изменениями в культивируемых клетках, кроме того, это трудоемкая и дорогостоящая работа. Для решения проблемы "хранения культуры клеток есть два подхода: либо максимально замедлить ее рост, либо хранить в замороженном состоянии — криосохранение (от греч. kryos — «мороз», «лед»). Замедление роста клеток. Задача состоит в том, чтобы изменить кинетику роста культуры и увеличить время между пересадками. Это позволило бы пересаживать культуры раз в 3-4 месяца, год и даже реже. В настоящее время замедлим роста под влиянием факторов, ограничивающих рост, достигнуто лишь для культур побегов и растений-регенерантов. Наиболее действенный путь замедления роста состоит в снижении температуры культивирования в сочетании с пониженным освещением выбор температуры определяется холодостойкостью вида растения. Так, дли депонирования коллекций картофеля использовалась температура 10"С, а яблони 1°С. Рекомендуют для культур, нормально растущих при 20— 25°С, использовать 4—10°С, а для культур, обычно растущих при температуре около 30°С, — плюс 15—20°С. Рост растения можно также замедлить добавлением к питательной среде осмотиков — маннита и сорбита, повышением концентрации сахарозы или внесением в питательную среду веществ, тормозящих рост. В качестве последних были использованы гидразид малеиновой кислоты, 2,2метилгидразид янтарной кислоты, хлорхолинхлорид, абсцизовая кислота, nдиметилсукцинаминовая кислота. В крайне редких случаях для замедления роста используют снижение содержания кислорода — гипоксию. Условия гипоксии создают применяя смесь 90% азота и 10% кислорода. Иногда уменьшают концентрацию кислорода и одновременно снижают атмосферное давление. Во избежание истощения питательных веществ и обезвоживания объем агаризованной среды для медленно растущих культур увеличивают. Если используется жидкая питательная среда, ее время от времени доливают, поскольку она активнее испаряется. Хотя большинство культур обладает низкой скоростью роста и удалось значительно увеличить время между пересадками, оказалось невозможным сократить скорость роста до нуля. Современные знания не позволяют перевести культуры в состояние покоя, наблюдаемое в обычных семенах. Пока еще для полного прекращения роста тканей высших растений известно только криосохранение. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 61 из 72 КРИОСОХРАНЕНИЕ КЛЕТОК Криосохранение — это глубокое замораживание и хранение при сверхнизких температурах, например при температуре жидкого азота (— 196°С). Это гарантирует стабильное сохранение генетических характеристик объектов практически в течение любого срока. Этот метод позволяет хранить самый разнообразный материал — от изолированных протопластов до зародышей и семян. В настоящее время глубокое замораживание клеток, тканей и органов получило широкое распространение в медицине и животноводстве. Иначе обстоит дело с растительным материалом. Главные трудности связаны со спецификой растительных клеток и с самим процессом глубокого замораживания. Растительные клетки, имеющие большие размеры, большие вакуоли и много воды, сильнее повреждаются при замораживании и последующем оттаивании. Повреждение клеток связано с образованием льда как внутри клеток, так и снаружи. Лед обычно образуется сначала во внешнем растворе вокруг клеток. Точка замерзания цитоплазмы минус 1°С, но клетки остаются не замерзшими до 10—15°С, так как до этого плазмалемма еще предотвращает проникновение внутрь кристаллов льда, растущих во внешнем растворе, Рост кристаллов льда внутри клетки разрушает ее мембраны. Если температура снижается медленно, то клетка успевает потерять часть свободной воды, которая выходит из нее и замерзает на поверхности медленно растущих кристаллов во внешнем растворе. Очень быстрое замораживание не сопровождается дегидратацией и приводит к возникновению кристаллов льда в цитоплазме. Медленное замораживание может полностью исключить кристаллизацию воды в клетке, но при этом неизбежно происходит значительная дегидратация и сжатие протоплазмы. Обезвоживание клетки происходит вследствие концентрирования внешнего раствора из-за образования в нем льда. Чрезмерный плазмолиз и вызванный им осмотический стресс (особенно при последующем деплазмолизе) приводит клетку к гибели. Таким образом, причиной гибели клеток при замораживании является образование льда внутри клетки и механическое повреждение ее мембран, а также осмотический стресс, обусловленный сильным обезвоживанием клетки. Следовательно, все приемы, используемые в криосохранении, направлены на определенную сбалансированность обоих повреждающих факторов. Выживание клеток растений зависит от целого ряда условий: генетических и морфофизиологических их особенностей и способности к холодовому закаливанию, состава и количества природных или искусственно добавляемых криопротекторов, уровня проницаемости этих веществ и воды, скорости снижения температуры и условий оттаивания. Работа по криосохранению культуры клеток состоит из следующих этапов: — подготовка культуры клеток, 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 62 из 72 — добавление криопротектора, — программное замораживание, — хранение в жидком азоте, — быстрое оттаивание, — удаление криопротектора, — рекультивирование и регенерация растений. Подготовка культуры Экспериментально показана возможность хранения при сверхнизких температурах культивируемых клеток, изолированных меристем, кончиков побегов, зародышей, пыльцы. Однако для криосохранения столь различающихся между собой объектов, конечно, требуются различные подходы и условия начиная с самого начального этапа работы. Лучше всего методы криосохранения разработаны для суспензионных культур. Мелкие меристемоидные клетки более устойчивы к замораживанию, чем крупные вакуолизированные клетки. То же касается мелкодисперсных суспензий с рыхлыми агрегатами клеток по сравнению с большими плотными массами клеток. Клетки тропических видов растений могут оказаться менее устойчивыми, чем клетки растений умеренной зоны. Для более сложно организованных структур, таких, как меристемы, зародыши, эмбриоиды, требуется оптимизация условий каждого этапа. Особое значение имеет специальная подготовка культуры, целью которой является обогащение ее клетками меристематического типа. Длительное культивирование в осмотике, синхронизация деления клеток, сокращение сроков пересадки способствуют уменьшению размеров клетки и увеличивают их выживаемость. На отдельные культуры положительное влияние на жизнеспособность клеток оказывает предварительное культивирование с некоторыми аминокислотами, благодаря увеличению уровня эндогенных Сахаров в клетках. Для суспензионных культур важным моментом подготовки является концентрирование. Так, на клетках моркови показано, что увеличение плотности культуры в 2—3 раза значительна повышает выживаемость клеток. Требования к подготовке клеток к замораживанию часто оказываются различными не только для разных видов и культуральных систем, но и для разных штаммов клеток, поэтому эти условия подбираются эмпирически. Криопротекторы Криопротекторы — это вещества, которые снижают точку замерзания, связывают внутриклеточную воду и защищают клетки от механического и осмотического стресса. К ним относятся диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, пролин и сахароза, которая является для растений естественным криопротектором. Сами криопротекторы тоже могут вызвать осмотический стресс, поэтому подбираются их оптимальные концентрации и сочетания. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 63 из 72 ДМСО обладает уникальной проникающей способностью, это особенно важно для крупных плотных организованных структур, например меристем. Для них этап подготовки заключается, главным образом, в предварительном культивировании с добавлением в среду 5% ДМСО. Это обеспечивает создание эффективных криозащитных концентраций по всему апексу, размер которого около 0,3—0,5 мм, Так, например, хорошие результаты были получены в опытах с меристемой ромашки аптечной, которая предварительно культивировалась на среде с ДСМО, а для защиты применялась смесь ДСМО, глицерина и сахарозы. А.С. Попов, давно исследующий проблему криосохранения клеток в Институте физиологии растений им. Тимирязева (ИФР) в Москве, показал, что для защиты суспензионных культур целого ряда растений эффективно использование смесей криопротекторов, а также криопротекторов и осмотиков (сорбит, маннит) в различных концентрациях и сочетаниях. Замораживание и хранение Наряду с выбором криопротекторов, причем именно для данных клеток, очень важно найти оптимальную программу замораживания. Различают медленное постепенное замораживание, быстрое и сверхбыстрое. При медленном постепенном замораживании температура в интервале от 0° до -40° снижается со скоростью 0,5—1° в мин. При быстром замораживании объект в ампуле с криопротектором погружается сразу в жидкий азот. При сверхбыстром замораживании сам объект непосредственно вводится в жидкий азот. Пыльцу можно замораживать в сухом виде, запечатанную в специальные пластмассовые ампулы, погружая их в жидкий азот. Данные, полученные криобанком ИФР в Москве, показывают, что более успешные результаты дает программированное замораживание. Для этого требуются специальные конструкции с рабочей камерой, охлаждаемой с запрограммированной скоростью введением паров жидкого азота. В другом типе замораживателей образцы охлаждаются путем погружения в камеру, заполненную жидкостью с низкой температурой плавления, которая охлаждается с помощью электрической холодильной установки. Установка может быть термостатирована на определенную конечную температуру, достижение которой происходит со скоростью, зависящей от объема камеры, заполненной жидкостью. Кроме того, температура может регулироваться с помощью программного устройства. Еще проще устроены аппараты, в которых используются сосуды Дьюара или коробки из пенопласта. Возможно также суспендирование образцов в парах жидкого азота или погружение в охлажденную баню, проводимые при одной определенной отрицательной температуре. Лабораторные морозильники (—20°С) и камеры с сухим льдом (—78°С) для хранения материала непригодны, особенно морозильники, в которых невозможно контролировать внутриклеточное замораживание. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 64 из 72 Темы лабораторных занятий. Тема 1. Краткая история выращивания растительных клеток. Методы выращивания растительных клеток in vitro (1ч). Цель занятия: ознакомление с историей и методами выращивания растительных клеток in vitro. Задания. 1. Тотипотентность растительной клетки. 2. Каллус. 3. Клеточная суспензия. Вопросы для контроля. 1. Биотехнология растений как наука. История развития. 2. Культуры клеток. 3. Методы выращивания растительных клеток in vitro. 4. Получение каллуса. Тема 2 Приготовление питательных сред. Выращивание растительных клеток на жидких питательных средах (1ч). Цель занятия: изучение условий выращивания клеток, ознакомление с видами питательных сред. Рассматриваемые вопросы. 1. Среда Мурасиге-Скуга. 2. Среда Уайта. 3. Среда Шенка-Хильдебрандта. 4. Среда В5, среды Хеллера и Лисмайера-Скуга. Вопросы для контроля. 1. Какие условия необходимы для выращивания клеток? 2. Какие вещества входят в состав питательных сред? 3. С помощью каких веществ стерилизуют растения? Темы 3 Условия необходимые для выращивания клеток (1ч). Цель занятия: Ознакомление с условиями нужными для выращивания культуры клеток. Стерилизация посуды. Знакомство с факторостатическим помещением. Вопросы для рассмотрения. 1. Бокс. 2. Автоклав. 3. Виды фитогормонов. 4. Температура. 5. Свет и аэрация. Вопросы для контроля. 1. Какие условия необходимы для культивирования клеток? 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 65 из 72 2. Стерилизующие вещества? 3. Что регулирует образование и рост каллуса? Тема 4. Использование культуры выращиваемых клеток для решения теоретических вопросов биотехнологии растений(1ч). Цель занятия. Изучение использования культуры клеток для решения вопросов биотехнологии растений. Вопросы для рассмотрения. 1. Преимущества использования культуры клеток. 2. Роль культуры клеток в изучении метаболизма клеток, его регуляции, управление функциями ферментов. 3. Значение протопластов в изучении биологии клеточной культуры. Вопросы для контроля. 1. Какие задачи физиологии растений можно решать, используя культуру клеток? 2. Какие задачи биохимии можно изучать, используя культуру клеток? 3. Какие недостатки имеют культивируемые клетки в качестве модели? Тема 5 Системы культивирования клеток(1ч). Цель занятия: Ознакомления с системами выращивания клеток. Вопросы для рассмотрения. 1. Клеточные суспензии. 2. Иммобилизованные клетки. 3. Этапы работы по созданию клеточных технологий для получения вторичных веществ. Вопросы для закрепления7 1. Какие экономически важные вещества получают из культуры выращиваемых клеток? 2. Что представляют собой иммобилизованные клетки, какие преимущества дает этот метод? 3. Назовите этапы разработки клеточных технологий для получения вторичных метаболитов? Темы 6. Клональное микроразмножение растений(1ч). Цель занятия: Ознакомление с методом клонального микроразмножения растений и его этапы. Вопросы для рассмотрения. 1. Индукция развития пазушных почек. 2. Образование придаточных побегов непосредственно из культивируемых эксплантов. 3. Регенерация растений из каллуса. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 66 из 72 4. Этапы микроразмножения растений. 5. Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения растений. 6. Применение клонального микроразмножения растений и его перспективы. Вопросы для контроля. 1. Каковы преимущества клонального микроразмножения? 2. Что такое «искусственные семена»? 3. В каких случаях целесообразно применение клонального микроразмножения растений? Темы 7. Оздоровление растений(1ч). Цель занятия: Ознакомление с методами оздоровления растений Вопросы для рассмотрения: 1. Культура апикальной меристемы. 2. Диагностика заражения растений. 3. Получение безвирусного посадочного материала картофеля. Вопросы для закрепления. 1. Методы определения вирусных заболеваний растений? 2. Почему проводят тепловую обработку зараженных растений? 3. Как размножают безвирусный посадочный материал? Преодоление in vitro прогамной несовместимости. Цель занятия: изучение методов преодоления прогамной несовместимости. Рассматриваемые вопросы: 1. Прогамная несовместимость 2. Оплодотворение in vitro. 3. Выращивание in vitro зародышей. Вопросы для закрепления: 1. В чем причина прогамной несовместимости и как она преодолевается? 2. В чем причина постгамной несовместимости и как она преодолевается? 3. В каких целях используется эмбриокультура? Преодоление in vitro постгамной несовместимости. Цель занятия: Изучение методов постгамной несовместимости. Рассматриваемые вопросы: 1. Постгамная несовместимость. 2. Оплодотворение in vitro. 3. Выращивание эмбриокультуры in vitro. 4. Выращивание эндосперма in vitro. Вопросы для закрепления: 1. В чем причина постгамной несовместимости и как ее преодолеть? 2. В каких целях используется эмбриокультура. 3. Для чего выращивают эндосперм? 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 67 из 72 Тема 8. Получение гаплоидов методом селективной элиминации хромосом в гибридном зародыше(1ч). Цель занятия: Ознакомление с методами гаплоидной технологии. Вопросы для рассмотрения: 1. получение гаплоидов в культуре пыльников и пыльцы. 2. Факторы, влияющие на андрогенез in vitro. 3. Значение гаплоидов в селекции растений. Вопросы на закрепление: 1. Как развиваются микроспоры in vivo? 2. Как развивается женский гаметофит in vivo? 3. В чем состоит ценность гаплоидных клеток и растений? 4. Как используются гаплоидные растения на практике и в науке? Получение гаплоидных растений в культуре женского гаметофита. Цель занятия: Ознакомление с задачами гаплоидной технологии. Рассматриваемые вопросы: 1. Выращивание цветочной пыльцы in vitro. 2. Факторы, влияющие на развитие женского гаметофита in vitro. 3. Значение гаплоидной селекции. Вопросы для закрепления: 1. Как развиваются микроспоры in vivo? 2. Как развивается женский гаметофит in vivo? 3. В чем состоит ценность гаплоидных клеток и растений? 4. Как используются гаплоидные растения на практике и в науке? Тема 9. Клеточная инженерия (1ч). Получение жизнеспособных протопластов. Цель занятия: Ознакомление с методами клеточной инженерии. Вопросы для рассмотрения: 1. Выделение протопластов. 2. Получение жизнеспособных протопластов. 3. Культивирование протопластов in vitro. 4. Регенерация растений в культуре протопластов. 5. Слияние протопластов. Вопросы на закрепление: 1. Что такое клеточная инженерия? 2. Какова методика выделения протопластов? 3. Как выращивают протопласты? Тема 10. Основы соматической гибридизации (1ч). Цель занятия: Ознакомление с методами соматической гибридизации. Рассматриваемые вопросы: 1. Принципы соматической гибридизации. 2. Генетические основы соматической гибридизации. 3. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 68 из 72 Вопросы на закрепление: 1. Что происходит с ядерным геномом при соматической гибридизации? 2. В чем преимущества соматической гибридизации по сравнению с половой? 3. Как осуществляется отбор гибридных клеток и растений? Методы селекции соматических гибридов. Цель занятия: Ознакомление с методами соматической гибридизации. Рассматриваемые вопросы: 1. Методы селекции соматических гибридов. 2. Методы анализа гибридных растений. 3. Практическое применение соматической гибридизации. Вопросы на закрепление: 1. Биохимические методы анализа соматических гибридов? 2. В каких целях используется соматическая гибридизация? 3. Что ограничивает применение соматической гибридизации? Тема 11. Методы клеточной селекции (1ч). Цель занятия: Ознакомление с методами клеточной селекции. Рассматриваемые вопросы: 1. Методы клеточной селекции. 2. Отбор устойчивых клеток. 3. Стабильность признака устойчивости. 4. Индуцированный мутагенез. 5. Сомаклональные варианты. 6. Причины сомаклональной изменчивости. 7. Факторы, влияющие на сомаклональную изменчивость. Вопросы на закрепление: 1. Что такое клеточная селекция и в чем ее преимущества? 2. Методы клеточной селекции. 3. Как отбираются клетки с требуемыми признаками? 4. Как можно индуцировать мутагенез клеток? Сомаклональные варианты. Цель занятия: Ознакомление с сомаклональными вариантами. Рассматриваемые вопросы: 1. Сомаклональные варианты. 2. Причины сомаклональной изменчивости. 3. Факторы, влияющие на сомаклональную изменчивость. Вопросы на закрепление: 1. Что такое сомаклональные варианты? 2. Методы клеточной селекции? 3. Пути использования сомаклональных вариантов. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 69 из 72 Тема 12. Генетическая инженерия растений (2ч). Цель занятия: Ознакомление с принципами генетической инженерии. Рассматриваемые вопросы: 1. Получение генов, предназначенных для переноса в другой организм. 2. Векторы для переноса генов. 3. Плазмиды бактерий и создание рекомбинантной ДНК. Вопросы для закрепления: 1. Что представляет собой генетическая инженерия? 2. Как осуществляется генетическая инженерия? 3. Как создают рекомбинантную ДНК? Генетическая инженерия. Цель занятия: Ознакомление с методами генетической инженерии. Рассматриваемые вопросы: 1. Плазмиды агробактерий в качестве вектора у растений. 2. Хлоропластная и митохондриальная ДНК в качестве вектора. 3. Мобильные генетические элементы. 4. Вирусы. Вопросы для закрепления: 1. Что такое вектор, какие требования к нему предъявляются? 2. Какие структуры могут быть векторами? 3. Почему Плазмиды агробактерий могут быть хорошими векторами? Генетическая инженерия. Цель занятия: Ознакомление с принципами и методами генетической инженерии. Рассматриваемые вопросы: 1. Методы переноса генов в растения. 2. Возможности и перспективы развития генетической инженерии. Вопросы для закрепления: 1. Какими способами переносят гены в растения? 2. Какие достижения имеет генетическая инженерия растений? 3. Каковы перспективы генетической инженерии растений? Тема 13.Сохранение генофонда in vitro (2ч). Цель занятия: Ознакомление с методами сохранения генофонда in vitro. Рассматриваемые вопросы: 1. Банк генов. 2. Замедление роста клеток. 3. Криосохранение клеток. 4. Подготовка культуры. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 70 из 72 5. Криопротекторы. 6. Оттаивание и удаление криопротектора. 7. Рекультивирование клеток и их оценка. Вопросы на закрепление: 1. Методы сохранения генофонда in vitro? 2. В чем преимущества криосохранения клеток? 3. Что такое криопротектор? 4. Как проводят замораживание и оттаивание клеток? Самостоятельная работа студентов Биологические объекты и процессы Получение экспланта Проведение работ по обеззароживанию. Гистогенез, Органогенез. Химические факторы влияющие на клетку Достижение биотехнологии Фитогормоны. Культивирование растительных клеток в жидкой среде Роль питательной среды в микроклональной технологии Пути определения растений зараженные вирусом Факторы, влияющие на гиногенез In vitro Слияние протопластов Соматическая гибридизация отдаленных растений Отбор устойчивых клеток Открытая проточная система Плазмиды агробактерий в качестве вектора у растений Хлоропластная ДНК Замедление роста клеток. Эмбриогенез Ризогенез. Получение гаплоидов Создание гербицидоустойчивых растений Недостатки тепловой обработки растений Факторы, влияющие на андрогенез In vitro Осмотические вещества Ауксотрофты Получение растений устойчивых к патогенным и вредителям Требования к векторам Рестриктазы Достижение генной инженерии Экзаменационные билеты по дисциплине «Биотехнология растений» 1. 2. 3. 1. Биотехнология растений. Цели и задачи. Оплодотворение in vitro. Питательные среды. Отрасли биотехнологии. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 71 из 72 Выращивание эндосперма in vitro. Создание гербицидоустойчивых растений. Краткая история культивирования растительных клеток. Гаплоидная технология. Сохранение генофонда in vitro. Методы выращивания растительных клеток в условиях in vitro. Получение гаплоидов в культуре пыльников и пыльцы. Достижения биотехнологии растений и ее будущее. Условия необходимые для выращивания клеток. Значение гаплоидов в селекции растений. Векторы для переноса генов. Получение каллуса и его культивирование. Клеточная инженерия. Методы иммобилизации клеток. Выращивание клеток в жидких питательных средах. Выделение протопластов. Создание растений устойчивых к патогенам и вредителям. Суспензионные культуры клеток. Культивирование in vitro протопластов. Использование мобильных генетических элементов в качестве векторов. Методы выращивания суспензионных культур. Регенерация растений в культуре протопластов. Плазмиды агробактерий в качестве вектора у растений. Дедифференциация и каллусообразование. Соматическая гибридизация. возможности и перспективы развития клеточной инженерии. Гетерогенность культивируемых клеток. Дифференцировка, морфогенез и регенерация. Улучшение качества белков. Выращивание культуры апикальной меристемы. Практическое применение соматической гибридизации. Возможности и перспективы развития генной инженерии. Использование в биотехнологии культуры клеток in vitro. Клеточная селекция. Вирусы в качестве векторов. Использование клеток в биосинтетической промышленности. методы клеточной селекции. Рестриктазы. Факторы влияющие на накопление вторичных метаболитов. Генотип растения. Отбор устойчивых клеток. Требования предъявляемые к векторам. 042-14.4.04.01.20.118/03 2012 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3. Редакция № 3 от ___ взамен ред.№ 2 от 30.09 2012 г. 2010 г. Страница 72 из 72 Системы культивирования клеток. Иммобилизованные клетки. Индуцированный мутагенез. Создание рекомбинантной ДНК. Клональное микроразмножение растений. Сомаклональные варианты. Тотипотентность. Значение клонального микроразмножения растений. Генная инженерия. Постгамная несовместимость. Методы клонального микроразмножения. Получение генов, предназначенных для переноса в другой организм. Прогамная несовместимость. Этапы микроразмножения. Векторы для переноса генов. Диагностика заражения растений вирусами.