Экспериментальное моделирование процессов индукции

На правах рукописи
ВОЛКОВА
Татьяна Олеговна
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ
ИНДУКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И АПОПТОЗА
ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК in vitro
03.00.25. − Гистология, цитология, клеточная биология
03.00.04. – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
МОСКВА
2009
Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, биологической и
органической химии ГОУ ВПО Петрозаводский государственный университет и в группе молекулярной биологии Института биологии Карельского Научного Центра РАН.
Научный консультант:
чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор
Немова Нина Николаевна
Официальные оппоненты:
чл.-корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор
Ярыгин Константин Никитич
доктор биологических наук, профессор
Захарова Людмила Алексеевна
доктор биологических наук, профессор
Михельсон Виктор Михайлович
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет
Защита состоится “ ”
2009 г. в
часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии
наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:
119334, Москва, ул. Вавилова, 26.
http://idbras.comcor.ru; е-mail: [email protected]
Факс: (495) 135-80-12
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Автореферат разослан “
Ученый секретарь
Диссертационного совета
кандидат биологических наук
e-mail: [email protected]
”
2009 г.
Абрамова Е.Б.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биологии и
медицины является изучение регуляции важнейших клеточных функций,
таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, при нормально протекающих физиологических процессах, а также при возникновении патологических состояний, в частности, злокачественных опухолей. В настоящее время получено и охарактеризовано большое количество опухолевых линий различного гистогенетического происхождения, культивируемых in vitro. Клетки таких иммортализованных линий являются прекрасной экспериментальной моделью для всестороннего изучения биологического действия реагентов с антиопухолевой активностью. Благодаря такому подходу, в последние годы достигнуты определенные успехи в изучении патогенеза и лечении многих опухолевых заболеваний.
Известно, что цитостатики, используемые в химиотерапии, способны
индуцировать дифференцировку опухолевых клеток, в ряде случаев сопровождающуюся запуском апоптоза (Волкова и др., 2003; Robertson et
al., 1997; Terui et al., 1998). В свою очередь, апоптоз наряду с делением
клеток определяет функционирование тканей организма в условиях развития, роста, дифференцировки и при индукции патологических процессов. Последние годы ознаменовались всесторонним изучением апоптоза,
однако, несмотря на многочисленные исследования, вопрос о регуляции
механизмов процесса остается открытым. Во многих экспериментальных
системах индукция апоптоза опухолевых клеток сопряжена с рядом трудностей, поскольку возникающие генетические изменения приводят к
нарушению дифференцировки, пониженному восприятию со стороны
апоптоз-индуцирующих сигналов, как правило, прогрессирующие во времени, развитию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).
Корреляция между нарушением дифференцировки и экспрессией генов,
активируемых при развитии МЛУ, установлена во многих работах (Marks
et al., 1995; Prados et al., 1998; Ueno et al., 1998). В связи с этим, представляется весьма актуальным поиск соединений, способных усилить диффе3
ренцировку резистентных опухолевых клеток, что будет играть существенную роль в развитии новых подходов к преодолению фенотипа
МЛУ. Итогом такой дифференцировки могут стать замедление пролиферации, индукция апоптоза, а также модулирование чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису естественными клеткамикиллерами (ЕКК) и Т-лимфоцитами. Механизм лизиса клеток-мишеней
клетками-эффекторами тесно связан с особенностями их мембранного
фенотипа и с наличием ядерных и цитоплазматических белковых факторов, контролирующих индукцию и протекание как дифференцировки, так
и апоптоза. Поэтому изучение механизмов указанных клеточных функций, а также поиск и направленный синтез химических соединений, регулирующих эти процессы, представляют несомненный интерес не только в
изучении специфики развития и функционирования опухолевой клетки,
но и для ведения эффективной терапии онкологических заболеваний.
Таким образом, обозначенная проблема заключается в том, что обработка клеток (in vivo или in vitro) антиопухолевыми агентами или иными
химическими соединениями может сопровождаться запуском процессов
дифференцировки и/или апоптоза, что оказывает непосредственное влияние на чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК. Биохимические механизмы такого влияния в зависимости от используемого реагента
могут пересекаться на уровне сигнальных молекул клетки.
Цель настоящего исследования заключалась в сравнительном изучении нескольких групп структурно-различных химических реагентов индуцировать дифференцировку и/или апоптоз опухолевых (лейкозных)
клеток, а также модулировать их чувствительность к лизису ЕКК.
В качестве специфических групп химических реагентов были использованы: нуклеозиды (тимидин, цитидин, гуанозин), соли жирных кислот с
укороченной углеводородной цепью (бутират, изобутират, изовалерат
натрия), органические растворители (диметилсульфоксид – ДМСО), кортикостероиды и их синтетические производные (гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон), константные активаторы протеинкиназы С (форбол-12-миристат-13-ацетат – ФМА), известные и новосинтезированные
4
производные ряда хинолина (хинолин – Q, 2-метилхинолин – 2-MeQ, хинолин-1-оксид
–
QO,
2-метилхинолин-1-оксид
–
2-MeQO,
4-
нитрохинолин-1-оксид – 4-NQO, 2-метил-4-нитрохинолин-1-оксид – 2-Me4-NQO,
2-(4’-диметиламиностирил)хинолин-1-оксид – 2-DQO, 4-(4’диметиламино-стирил)хинолин-1-оксид
–
4-DQO,
2-(4’нитростирил)хинолин-1-оксид – 2-NSQO, 4-(4’-нитростирил)хинолин-1оксид – 4-NSQO) и пиридина (4-(4’-диметиламиностирил)пиридин-1-оксид
– DPyO), циклофосфан и новосинтезированные производные тиазофосфола.
Задачи исследования:
1. Изучить цитотоксический и антипролиферативный эффекты структурно-различных химических соединений на опухолевые клетки. Определить EC50 изучаемых реагентов;
2. Установить, на основе данных по токсичности, дифференцирующее и
апоптогенное действия исследуемых индукторов и их комбинаций на
опухолевые клетки. Определить основные маркеры эритроидного и
миелоцитарного путей дифференцировки клеток;
3. Изучить влияние химических реагентов на модуляцию активности
каспаз в опухолевых клетках как возможных участников расхождения
путей передачи сигнала от процессов дифференцировки к апоптозу;
4. Исследовать процессы биотрансформации стирильных производных
N-оксидов хинолина и пиридина микросомальными монооксигеназами и пероксидазой. Определить влияние на данные процессы митохондриального цитохрома С;
5. Изучить влияние стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина, а также производных тиазофосфола на процессы окисления и
восстановления цитохрома С как одного из основных посредников передачи сигнала апоптоза в клетке. Установить условия возможного
выхода цитохрома С из митохондрий в бесклеточной системе;
6. Выявить возможный механизм индукции апоптоза стирильными производными N-оксидов хинолина и пиридина в опухолевых клетках,
5
основываясь на результатах комплексной оценки биологического действия данных гетероциклов;
7. Определить модулирующее действие химических реагентов и их комбинаций на чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому
лизису лейкоцитами человека и крыс. Установить их ведущую роль в
модулировании процессов дифференцировки и/или апоптоза;
8. Провести сравнительный анализ биологического действия изучаемых
соединений на клетки родительской линии К562, а также К562/2-DQO,
К562/4-NQO, К562/ts-p53.
Научная новизна. В ходе работы получены новые данные по сравнительному влиянию нескольких групп структурно-различных химических
реагентов на пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, а также изменение чувствительности опухолевых клеток к литическому действию ЕКК.
Впервые изучено цитотоксическое, антипролиферативное, дифференцирующее и апоптогенное действия производных хинолина, пиридина и
тиазофосфола на опухолевые клетки К562. Установлено, что в группе хинолиновых производных имеются соединения, модулирующие только
дифференцировку, проявляющие апоптогенное действие или влияющие
на оба процесса. Среди реагентов выявлены индукторы эритроидной и
миелоцитарной дифференцировки клеток. Соединения взаимодействуют
с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот, нуклеозидами, нуклеотидами и ДНК. Наиболее сильный апоптогенный эффект проявляют индукторы, способные к наибольшему связыванию с ДНК, при этом их
дифференцирующая активность может отсутствовать.
Впервые определен возможный механизм апоптоз-индуцирующего
действия стирильных производных N-оксидов хинолина и пиридина на
опухолевые клетки. Установлено, что в реализацию программы апоптоза
вовлечены цитохром С, каспазы-9, -8 и -3. Клеточная активация гетероциклов может проходить при участии микросомальных монооксигеназ и
пероксидазы. В зависимости от преобладания в цитоплазме клеток окисленной или восстановленной форм цитохрома С, процессы биотрансфор-
6
мации ксенобиотиков замедляются или ускоряются, что может вносить
существенный вклад в реализацию апоптоза.
Впервые показано, что среди исследуемых индукторов эритроидной
дифференцировки клеток К562 только ДМСО способен блокировать
апоптоз, индуцированный хинолиновыми ксенобиотиками, через снижение активности каспаз-9 и -8.
Впервые установлено, что каспазы участвуют не только в реализации
апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток. Показано, что переключение дифференцировки с одного пути на другой, например, с эритроидного на моноцито-макрофагальный или мегакариоцитарный, влечет
за собой переключение работы каспаз и модулирование апоптоза.
Впервые экспериментально определено влияние сочетанного действия
индукторов эритроидной и миелоцитарной дифференцировки клеток К562
на их чувствительность к цитотоксическому лизису лейкоцитами периферической крови (ЛПК) человека. Установлено, что дифференцировка и
апоптоз клеток-мишеней могут вносить вклад в изменение литической
активности ЕКК. Обработка индукторами эритроидной дифференцировки
в большинстве случаев приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к лизису, однако влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки во многом определяется последовательностью модулирования указанных клеточных процессов.
При обработке опухолевых клеток комбинацией бутирата натрия,
ДМСО и ФМА, впервые показано, что каждый реагент по-разному влияет
на изменение цитотоксического индекса (ЦИ) в системе: бутират натрия
повышает чувствительность опухолевых клеток к лизису ЛПК, ДМСО
блокирует действие бутирата, ФМА способствует поддержанию ЦИ на
стабильно высоком уровне.
Впервые экспериментально получены сублинии клеток К562, резистентные к производным ряда хинолина (К562/2-DQO и К562/4-NQO), и
охарактеризованы по способности подвергаться индуцированным дифференцировке и/или апоптозу по сравнению с родительской линией. Показано, что в клетках сублиний процессы индукции эритроидной диффе7
ренцировки протекают более интенсивно, при этом наблюдается резкое
повышение экспрессии гена каспазы-3, но не каспазы-9. Апоптоз в данных условиях не индуцируется.
Впервые изучено влияние комбинаций химических реагентов на модулирование эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток К562/ts-р53.
Показано, что указанные процессы в сублинии протекают более выражено
по сравнению с родительскими К562. Установлено, что каспаза-3 участвует в индукции эритроидной дифференцировки клеток.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Выполненная работа является фундаментальным исследованием, результаты которого представляют интерес как для клеточной биологии,
биохимии, так и медицины. Полученные данные о включении исследуемых химических соединений в процессы дифференцировки и апоптоза
опухолевых клеток открывают возможности для дальнейшего изучения
молекулярных механизмов их модулирующего действия и поиска новых,
более перспективных структурных аналогов этих соединений.
Предложены новые подходы для создания модуляторов, способных
вызывать дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток, усиливать их
чувствительность к лизису ЕКК, что может повысить эффективность используемых в настоящее время методов противоопухолевой терапии.
Полученные данные свидетельствуют, что индукторы эритроидной
дифференцировки повышают чувствительность опухолевых клеток к лизису ЕКК, тогда как влияние индукторов миелоцитарной дифференцировки и/или апоптоза зависит от процесса, первично модулируемого в клетках. При использовании комбинаций соединений каждое из них поразному влияет на изменение цитотоксического индекса. Поэтому при
выборе схем химиотерапии при лейкозах рекомендуется оценивать in vitro
дифференцировочный статус клеток лейкозной популяции, цитотоксический индекс и резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам у
каждого отдельного больного.
Кроме того, показано, что индукторы эритроидной дифференцировки
модулируют уровень мутантного по Val 135 р53 белка в опухолевых клет8
ках, что приводит к резкому повышению их дифференцировки и апоптоза.
Поскольку способность цитостатиков регулировать активность белка во
многом определяется типом химиотерапии, при выборе схем лечения онкологических заболеваний необходимо учитывать также их свойства.
По полученным данным индукция миелоцитарной дифференцировки
опухолевых клеток, сопровождающаяся снижением их чувствительности
к лизису ЕКК, протекает при участии каспазы-6. Результаты этих исследований следует учитывать при создании лекарств нового поколения,
направленных на подавление экспрессии каспазы-6.
Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах по
клеточной и молекулярной биологии, биохимии, для написания учебных и
методических пособий, а также монографической литературы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Опухолевые (лейкозные) клетки способны подвергаться химически
индуцированным дифференцировке и апоптозу in vitro, при этом
их пролиферативная активность замедляется или полностью блокируется.
2. Каспазы являются ключевыми ферментами не только процессов
апоптоза, но и дифференцировки опухолевых клеток.
3. В группах структурно-родственных химических реагентов выявлены
соединения с разнонаправленными дифференцирующими и апоптогенными эффектами на лейкозные клетки. Подобная биологическая
активность связана с особенностями их метаболической активации и
разными внутриклеточными мишенями действия.
4. Дифференцировка и апоптоз вносят вклад в изменение чувствительности опухолевых клеток к лизису ЕКК, которое может являться следствием индукции только одного, либо двух указанных процессов.
5. Индуцированная в опухолевых клетках устойчивость к химическим
соединениям оказывает влияние на протекание процессов дифференцировки и апоптоза. Дифференцировка протекает более интенсивно,
при этом клетки остаются апоптоз-резистентными.
9
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конференциях, съездах и симпозиумах: Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998), Proceeding of
the International young research school (Petrozavodsk, 1998), Всероссийских
симпозиумах «Структура и функции клеточного ядра» (С.-Петербург,
1999, 2001, 2002), II съезде ВОГиС (С.-Петербург, 2000), Всероссийском
симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (C.-Петербург,
2000), VIII Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С.Петербург, 2001), International conference «The Chemistry and Biological
Activity of Nitrogen-Containing Heterocycles and Alkaloids» (Moskow, 2001),
6-ой Санкт-Петербургской Ассамблее молодых ученых и специалистов
(С.-Петербург, 2001), XII Международной конференции молодых ученых
«Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы» (С.-Петербург,
2001), Международной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2002), V, VI
Международных симпозиумах «Химия протеолитических ферментов»
(Москва, 2002, 2007), 6-, 7-, 8-, 12-ой Пущинских школах-конференциях
молодых ученых «Биология – наука 21го века» (Пущино, 2002, 2003, 2004,
2008), III Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия» (Москва,
2002), Научной конференции «Карелия и РФФИ» (Петрозаводск, 2002), V
Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии
и иммунофармакологии» (Москва, 2002), I , II Съездах Общества клеточных биологов (С.-Петербург, 2003, 2007), Конгрессе ревматологов России
(Саратов, 2003), III Научно-практической конференции с Международным
участием «Болезнь Ходжкина» (Петрозаводск, 2004), Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XI Всероссийской конференции «Человек и его здоровье») (С.-Петербург, 2008), IV Съезде рос10
сийских биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). Результаты работы обсуждены на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии Петрозаводского государственного университета 1 октября 2008 г. и апробированы на объединенном семинаре в
Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 15 декабря 2008 г.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 16 статей, 34 тезиса
докладов и 1 монография.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4
разделов, включающих 5 глав обзора литературы, описание материалов и
методов исследований, 3 главы результатов собственных исследований и
обсуждение результатов, общего заключения, выводов, списка цитированной литературы, приложения. Представлен список публикаций автора
по теме диссертации. Общий объем работы составляет 505 страниц,
включая 46 таблиц и 79 рисунков. Список цитированной литературы содержит 840 источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы. Состоит из 5 глав, содержащих сведения об основных особенностях структурной и функциональной организации лейкозных клеток, механизмах индукции дифференцировки и апоптоза клеток, влиянии химических реагентов на указанные процессы. Представлены данные по механизмам модулирования литической активности ЕКК на
опухолевые клетки, а также механизмам развития МЛУ.
Материалы и методы исследования.
В работе были использованы клетки эритромиелолейкозной линии человека К562 (Всероссийский банк клеточных культур, Институт цитологии РАН, С.-Петербург). Клетки сублиний К562/2-DQO и К562/4-NQO
получены путем ступенчатой селекции в присутствии возрастающих концентраций 2-DQО и 4-NQO. Сублиния клеток, трансфецированных температурочувствительным мышиным геном р53, мутантным по Val 135
(К562/ts-p53), любезно предоставлена д.б.н., профессором Б.П. Копниным
(Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН).
11
Для реализации поставленных задач использованы следующие методы
исследования:
- клеточно-биологические (культивирование клеток, оценка пролиферации, численности и жизнеспособности клеток, определение ЕС50 клеток,
получение резистентных к химическим реагентам клонов клеток и оценка их устойчивости к действию агентов группы МЛУ, фенотипирование
маркеров дифференцировки клеток);
- биохимические (определение внутриклеточной концентрации гемоглобина, активности ферментов (δ-аминолевулинатсинтазы, гемоксигеназы,
каспаз), суммарной внутриклеточной концентрации никотинамидных
коферментов, анализ биотрансформации ксенобиотиков под действием
микросомальных монооксигеназ и пероксидазы, выделение интактных
митохондрий клеток и изучение условий выхода цитохрома С из внутреннего пространства органелл во внешнюю среду);
- молекулярно-генетические (определение характера повреждений ДНК с
помощью ДНК-тропных красителей, ПЦР в режиме реального времени);
- иммунологические (оценка фагоцитирующей способности клеток, определение чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису ЛПК человека и клетками селезенки крыс).
2-NSQO, 4-NSQO и производные тиазофосфола любезно предоставлены к.х.н., ст.н.с. Института органической и физической химии им. А.Е.
Арбузова Казанского НЦ РАН Хайловой Н.А. в 2001 г.; другие производные хинолина – д.х.н., профессором кафедры молекулярной биологии,
биологической и органической химии ПетрГУ Андреевым В.П. в 1999 г.
Состав и строение полученных соединений подтверждены данными элементного анализа, масс-, ИК-, ЯМР-спектроскопиями (1H, 13C, 15N).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Биологическая активность структурно-различных химических реагентов на клетки родительской линии К562
1.1. Влияние нуклеозидов на пролиферацию, дифференцировку и
апоптоз клеток. Биологическое действие нуклеозидов основано на спо12
собности вступать в конкурентные отношения с клеточными метаболитами, в частности, с предшественниками нуклеиновых кислот, что приводит к нарушению их синтеза и далее жизнедеятельности клеток. Нами
изучено изменение процессов пролиферации, дифференцировки и
апоптоза клеток К562 при обработке цитидином, тимидином и гуанозином.
Обработка клеток возрастающими концентрациями (1–3 мМ) нуклеозидов в течение 1–4 суток приводила к дозо- и время-зависимому снижению пролиферации. Так, численность клеток на 2-е сутки составила
138,330,39 тыс./лунку при обработке 2 мМ тимидина и 95,330,47
тыс./лунку в условиях инкубации с 1 мМ гуанозина. Численность клеток,
обработанных 2 мМ цитидина, стабилизировалась к 3-м суткам и в течение последующего времени не изменялась. Уровень пролиферации необработанных клеток достигал 229,330,31, 410,421,05 и 723,580,97 тыс./
лунку на 2-е, 3-и и 4-е сутки, соответственно.
Исследуемые нуклеозиды индуцировали синтез гемоглобина (одного
из основных маркеров эритроидной дифференцировки) в клетках К562
(рис. 1), причем наиболее сильным индуктором выступал гуанозин. В
клетках также имело место повышение активности каспазы-9 и каспаз-3,
-7, -10 (рис. 2).
Рис. 1. Концентрация гемоглобина в клетках К562, инкубированных в присутствии нуклеозидов в течение 2-х и 4-х суток
К – необработанные индукторами клетки (контроль); Ц – клетки, культивируемые с цитидином; Т – с тимидином; Г – с гуанозином. Концентрация цитидина
13
и тимидина – 2 мМ, гуанозина – 1 мМ; * достоверное отличие от контроля
(р<0,05); ** достоверное отличие от контроля (р<0,01)
Рис. 2. Изменение активности каспазы-9 (а) и каспаз-3, -7, -10 (б) в клетках
К562, обработанных нуклеозидами в течение 2-х суток
1 – базовый уровень активности каспаз для нестимулированных клеток (контроль); 2 – активность каспаз в клетках, обработанных цитидином; 3 – тимидином; 4 – гуанозином. Концентрация цитидина и тимидина – 2 мМ, гуанозина – 1
мМ. По оси ординат: изменение поглощения отщепленного 7-амино-4трифлуорометилкумарина (AFC), определенное на СФ-46 при  395 нм
Нами выделены варианты, в которых индукция эритроидной дифференцировки и увеличение активности каспаз могли не сопровождаться
фрагментацией ДНК опухолевых клеток (например, обработка 2 мМ тимидина в течение 2-х суток или 2 мМ цитидина в течение 4-х суток).
Апоптоз в этих вариантах регистрировался позднее – на 3-и и 5-е сутки,
соответственно. Поэтому мы предположили, что активация каспаз в данном случае необходима не только для успешного протекания апоптоза, но
также для индукции и реализации эритроидной дифференцировки клеток.
Использование ингибиторов ферментов экспериментально подтвердило
наше предположение.
1.2. Влияние солей жирных кислот на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.
Известно, что масляная кислота и ее натриевая соль подавляют пролиферацию и индуцируют дифференцировку и апоптоз целого ряда линий,
включая клетки миелоидного и лимфоидного происхождения (Hoessly et
al., 1989, Bernhardt et al., 1999). В основе механизма внутриклеточного
14
действия реагентов лежат ингибирование активности гистоновых деацетилаз (McCue et al., 1984), устойчивая активация JAK/STAT-пути и ингибирование серин-треонин-протеинфосфатазы (Park et al., 2001). Результаты по влиянию бутирата, изобутирата и изовалерата натрия на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток К562 представлены в таблице
1. Из результатов следует, что эритроидная дифференцировка, индуцированная в клетках натриевыми солями жирных кислот, как и в случае с использованием нуклеозидов, требует активации определенных групп каспаз, в частности, каспаз-3, -7, -10. Апоптотических изменений при этом
может не регистрироваться (см. варианты обработки 2 мМ и 3 мМ изобутирата). Бутират натрия, как более реакционно-способный реагент, сильнее активировал каспазы, индуцировал апоптоз. Данный эффект имел место только при использовании 2 мМ и 3 мМ соединения. Пролиферация
клеток во всех вариантах была достоверно блокирована.
+
++
++
―
++
++
+
+
+
―
―
―
―
+
+
―
―
―
Снижение
[NAD++NADH]i
+
++
++
―
+
+
БЭ
―
+
++
―
―
―
Усиление
флуоресценции
ДАФИ
Индукция
эритроидной
дифференцировки
Подавление
пролиферации
++
++
++
+
+
+
Каспазы 3, -7, -10
ИЗОБУТИРАТ
НАТРИЯ
1 мМ
2 мМ
3 мМ
1 мМ
2 мМ
3 мМ
Повышение
активности
каспаз
Каспаза-9
БУТИРАТ
НАТРИЯ
Концентрация
Реагенты
Таблица 1
Биологическое действие солей жирных кислот с укороченной
углеводородной цепью на клетки К562
―
+
+
―
―
―
Примечание – В таблице приведены показатели клеток, обработанных солями
жирных кислот в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные реагентами, сравнивали с необработанными К562; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно
(р<0,01); “–” изменение исследуемого показателя отсутствует. Биологические
эффекты изовалерата натрия аналогичны таковым изобутирата натрия
15
1.3. Влияние диметилсульфоксида и его комбинаций с эритроидными
индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.
В ряде работ по изучению дифференцирующего действия ДМСО на
клетки опухолевых линий концентрация реагента составляет 1,9–2,5 %
(Baliga et al., 1993; Nathan et al., 1998). ДМСО, используемый в высоких
концентрациях (порядка 2,5 % и выше), способен инициировать фрагментацию ДНК клеток (Marthyn et al., 1998). Нами было изучено модулирование пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток К562, обработанных ДМСО (0,1 %, 0,5 %, 1,5 %) на фоне тимидина (2 мМ) и бутирата
натрия (2 мМ). Полученные результаты представлены в таблице 2.
Каспазы
3, -7, - 10
ДАФИ
БЭ
Снижение
++
+
―
+
―
―
―
0,5 %
1,5 %
2 мМ
2 мМ+
0,1 %
2 мМ
++
++
++
―
+
++
++
+
―
+
+
+
+
++
++
―
―
+
+
+
―
+
+
―
―
++
+
―
++
++
+
++
+
+
+
2 мМ+
0,1 %
―
―
+
―
+
+
+
Повышение
активности
каспаз
Усиление
флуоресценции
[NAD++NADH]i
Каспаза-9
БУТИРАТ
НАТРИЯ
БУТИРАТ
НАТРИЯ + ДМСО
Индукция
эритроидной
дифференцировки
ТИМИДИН
ТИМИДИН +
ДМСО
Подавление
пролиферации
ДМСО
0,1 %
Концентрация
Реагенты
Таблица 2
Биологическое действие ДМСО и его комбинаций с тимидином
и бутиратом натрия на клетки К562
Примечание – В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами
в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные одиночными реагентами, сравнивали с необработанными К562; при оценке влияния на процессы комбинаций реагентов сравнение проводили по отношению к первому составляющему комбинации; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “–” изменение исследуемого
показателя отсутствует
16
Исследуемые соединения (одиночно и в сочетании) обладали выраженным антипролиферативным эффектом на клетки К562. При обработке
клеток ДМСО наблюдалось дозо-зависимое повышение синтеза гемоглобина. Эритроидная дифференцировка и увеличение активности каспаз-3,
-7, -10 могли не сопровождаться фрагментацией ДНК (см. варианты обработки 0,1 % и 0,5 % ДМСО). Апоптоз в этих вариантах регистрировался
на 5–6-е сутки. В культурах, обработанных 1,5 % ДМСО или комбинацией
ДМСО с тимидином (бутиратом натрия), индукция эритроидной дифференцировки сопровождалась почти одновременным запуском апоптотических процессов, при этом активировалась каспаза-9. Возможно, в данном
случае запуск апоптоза связан с возросшим токсическим эффектом сочетанного действия реагентов на клетки. Следует отметить, что при обработке клеток комбинацией тимидин+ДМСО наблюдался более интенсивный синтез гемоглобина по сравнению с тимидин-обработанными клетками. При замене тимидина на бутират подобного эффекта не регистрировалось.
Таким образом, рассмотренные группы химических реагентов индуцировали дозо- и время-зависимую эритроидную дифференцировку и/или
апоптоз клеток К562. При инкубации клеток с комбинациями соединений
в модулировании процессов имели место синергический или антагонистический эффекты. Наиболее выраженным дифференцирующим действием обладала комбинация тимидин+ДМСО, апоптоз-индуцирующим –
бутират натрия+ДМСО.
1.4. Влияние кортикостероидов и их комбинаций с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.
В ряде работ показано, что используемые в терапии лейкозов кортикостероиды (глюкокортикоиды) способны индуцировать дифференцировку
и апоптоз опухолевых клеток (Анисимов и др., 2001; Nakamaki et al., 1989;
Yuksel et al., 2002). Реагенты имеют внутриклеточный рецептор связывания, ассоциированный с гетерогенными ядерными РНП, который, являясь
лиганд-зависимым транскрипционным фактором, способен изменять ак17
тивность генов, связываясь с их респонсивными элементами, либо взаимодействуя с другими транскрипционными факторами или белкамикоактиваторами (Eggert et al., 1997). Кроме того, реагенты способны модулировать активность Ca2+-зависимых ферментов (Куцый и др., 1999).
Нами проведены исследования по влиянию на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток К562 гидрокортизона, преднизолона, дексаметазона и их комбинаций с эритроидными индукторами.
Рис. 3. Концентрация гемоглобина в клетках К562, обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток
1 – необработанные индукторами клетки (контроль); 2 – клетки, культивируемые с гидрокортизоном; 3 – с преднизолоном; 4 – с дексметазоном; концентрация реагентов – 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05)
Из результатов следует, что гидрокортизон и преднизолон не модулировали эритроидную дифференцировку и апоптоз клеток (рис. 3, табл. 4).
Напротив, дексаметазон подавлял синтез гемоглобина, стимулировал экспрессию CD11b, CD14 и CD41-антигенов (табл. 3) и фрагментацию ДНК
клеток (табл. 4). При одновременном внесении в среду 5 мкМ дексаметазона и 2 мМ тимидина (или бутирата) параметры флуоресценции БЭ и
ДАФИ при связывании с ДНК резко возрастали, активировались каспазы-3, -7, -9, -10. Аналогичный эффект имел место также при замене дексаметазона на преднизолон или гидрокортизон.
Таким образом, кортикостероиды способны индуцировать миелоцитарную дифференцировку клеток К562. Повышенная активация каспаз-9 и
-3, -7, -10, а также выраженная фрагментация ДНК клеток, обработанных
18
Таблица 3
Процент клеток К562, экспрессирующих CD11b, CD14 и CD41-антигены,
после инкубации с кортикостероидами в течение 4-х суток
РЕАГЕНТ
Контроль
Гидрокортизон
Преднизолон
Дексаметазон
CD11b+-клетки, %
CD14+-клетки, %
CD41+-клетки, %
24,4±1,3
25,7±1,9
29,2±1,6*
34,7±1,8*
36,31,9
38,11,7
38,92,1
45,81,7*
11,71,8
11,91,5
14,82,7
19,81,6*
Примечание – Концентрация реагентов – 10 мкМ; * достоверное отличие от контроля (р<0,05)
Таблица 4
Параметры ДАФИ и БЭ флуоресценции нуклеоидов клеток К562,
обработанных кортикостероидами в течение 4-х суток
РЕАГЕНТ
Контроль
Дексаметазон (10 мкМ)
Преднизолон (10 мкМ)
Гидрокортизон (10 мкМ)
ДАФИ
БЭ
36,900,07
48,070,08*
37,020,12
36,920,13
6,200,10
9,280,02*
6,530,09
6,400,08
Примечание – Клетки инкубировали в 96-луночных микропланшетах по 0,02 млн.
клеток/лунку; показатели ДАФИ и БЭ для тимоцитов, обработанных 5 мкМ
дексаметазона в течение 6 час: 47,860,34* и 9,140,18* (необработанные клетки:
40,810,22 и 6,830,34, соответственно); * достоверное отличие от контроля
(р<0,05)
комбинациями реагентов с тимидином или бутиратом натрия, усиленные
по сравнению с обработкой только эритроидными агентами, свидетельствуют об участии этих каспаз в индукции апоптоза опухолевых клеток.
1.5. Влияние ФМА и его комбинаций с эритроидными индукторами на
пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.
Нефизиологические активаторы протеинкиназы С (ПКС) форболовые
эфиры способны индуцировать мегакариоцитарную и/или моноцитомакрофагальную дифференцировку лейкозных и нормальных клеток крови (Rosson, O’Brien, 1998). ПКС участвует в активации мегакариоцитарных промоторов
посредством функциональной кооперации с GATA-1
19
(Racke et al., 2001). В некоторые модели клеточной дифференцировки вовлечен ERK/MAPK-киназный каскад (Dass et al., 2000; Kim et al., 2001;
Dorsey et al., 2002). Из полученных нами результатов следует, что ФМА
оказывал выраженное антипролиферативное и цитотоксическое действие
на клетки К562. Одиночная или сочетанная с эритроидными индукторами
обработка клеток ФМА, как в случае дексаметазона, приводила к подавлению синтеза гемоглобина, повышению экспрессии CD11b, CD14 и
CD41-антигенов, увеличению фагоцитарной активности клеток. Нами
установлено, что каспаза-9 является одной из ключевых каспаз, участвующих в апоптозе, индуцированном нуклеозидами или солями жирных
кислот (см. выше). При добавлении к реагентам ФМА активность каспазы-9 снижалась (рис. 4б), ингибировался апоптоз (табл. 5). Активация
каспазы-6 (рис. 4в) наблюдалась при индукции моноцито-макрофагальной
и ингибировании эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток (табл.
5), т. е. в присутствии ФMA. Каспаза-3 (рис. 4а) в зависимости от условий
участвовала как в протекании дифференцировки, так и в апоптозе клеток.
Таким образом, не исключено, что именно с подобным перераспределением функций клеточных каспаз связано ингибирование форболовым эфиром нуклеозид- и бутират-индуцированного апоптоза.
Таблица 5
Параметры ДАФИ и БЭ нуклеоидов клеток К562, обработанных ФМА,
тимидином, бутиратом натрия, а также комбинациями реагентов
в течение 2-х суток
РЕАГЕНТЫ
Необработанные клетки
ФМА (100 нМ)
Тимидин (3 мМ)
Бутират натрия (3 мМ)
Тимидин (3 мМ) + ФМА (100 нМ)
Бутират натрия (3 мМ) + ФМА (100 нМ)
ДАФИ
36,050,14
35,820,29
41,040,21**
40,960,18**
37,000,09*
36,880,17*
БЭ
6,020,11
6,220,60
7,180,08*
8,020,18*
6,320,11*
6,200,18
Примечание – Условия опыта см. в примечании к табл. 4; * достоверное отличие
от контроля (р<0,05); ** достоверное отличие от контроля (р<0,01); различия достоверны в парах: необработанные клетки К562 и клетки, инкубированные с тимидином или бутиратом натрия; клетки, обработанные комбинациями тимидин +
20
ФМА или бутират натрия + ФМА и клетки, растущие в присутствии только тимидина или бутирата, соответственно
Рис. 4. Изменение активности каспазы-3 (а), каспазы-9 (б) и каспазы-6 (в) в
клетках К562, обработанных ФМА, тимидином и комбинацией реагентов в течение 2-х суток
1 – базовый уровень активности каспаз для нестимулированных клеток; 2 – активность каспаз в клетках, обработанных тимидином; 3 – ФМА; 4 – тимидином +
ФМА. Концентрация тимидина – 3 мМ, ФМА – 100 нМ. По оси ординат: изменение поглощения отщепленного 7-амино-4-трифлуорометилкумарина (AFC), определенное на СФ-46 при  395 нм
1.6. Влияние хинолина и его N-оксидированных производных в комбинациях с эритроидными индукторами на пролиферацию, дифференцировку
и апоптоз клеток.
21
Среди большого спектра реагентов, применяемых в онкологической
практике, особую группу составляют производные N-содержащих гетероциклов. Реагенты являются конкурентными структурными аналогами
ключевых молекул клетки (азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов, различных коферментов и т. д.) и высокоэффективны для лечения
опухолей различного гистогенетического происхождения и локализации.
Широкое применение многих из них ограничивается повышенной токсичностью. Поэтому поиск соединений, обладающих высокой противоопухолевой активностью и низкими побочными эффектами представляет
несомненный интерес. Нами было изучено биологическое действие комбинаций производных хинолина с эритроидными агентами на клетки
К562. Результаты показали, что только N-оксидированные производные
ингибировали эритроидную и индуцировали миелоцитарную дифференцировку клеток.
+
―
―
―
―
―
―
―
―
―
+
+
―
―
―
―
―
++
+
―
+
↓
+
↓
―
―
―
+
Снижение
―
―
[NAD++NADH]i
Каспаза-8
―
―
БЭ
Каспаза-3
+
+
ДАФИ
Каспаза-9
ДМСО + 4-NQO
Усиление
флуоресценции
Ингибирование
эритроидной
дифференцировки
ДМСО + QO
0,1 %
0,1%+
0,3 мкМ
0,1%+
10 мкМ
0,1% +
1нМ
Изменение
активности
каспаз
Подавление
пролиферации
ДМСО
ДМСО + Q
Концентрация
Реагенты
Таблица 6
Биологическое действие хинолина и его производных в комбинации
с индукторами эритроидной дифференцировки на клетки К562
Примечание – В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами
в течение 2-х суток, изменение эритроидной дифференцировки регистрировалось
после 4-х суточной обработки; клетки К562, обработанные ДМСО, сравнивали с
необработанными К562; при оценке влияния на процессы комбинаций реагентов
сравнение проводили по отношению к первому составляющему комбинации; “+”
изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение иссле-
22
дуемого показателя достоверно (р<0,01); “+++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,001); “–” изменение исследуемого показателя отсутствует;
↓ – определяемый показатель по сравнению с контролем снижается
4-NQO и 2-Me-4-NQO проявляли выраженное апоптоз-индуцирующее
действие, которое блокировалось добавлением ДМСО (табл. 6). В пробах
ингибировались активность каспаз-9, -8 и флуоресценция БЭ и ДАФИ,
снижалась активность каспазы-3. С тимидином и бутиратом натрия подобного эффекта не обнаружено.
1.7. Влияние стирильных N-оксидированных производных хинолина,
пиридина и производных тиазофосфола на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток.
Данная группа ксенобиотиков включает новосинтезированные соединения, поэтому биологическую активность стирильных производных хинолина и пиридина сравнивали с предыдущей группой реагентов, а производных тиазофосфола – с широко используемым цитостатиком циклофосфаном. Нами показано, что при попадании в клетку данные гетероциклы биотрансформируются под действием цитохрома Р-450 и пероксидазы. Интересно то, что спектр внутриклеточных метаболитов соединений
неодинаков, а их биологическая активность в десятки раз может превышать таковую вещества-родоначальника. Результаты по биологическому
действию реагентов на клетки К562 представлены в таблицах 7 и 8.
Индукция эритроидной дифференцировки регистрировалась в условиях обработки 2-NSQO, 4-NSQO (2 суток), DPyO (4 суток; в табл. 8 2суточные данные), циклофосфаном и третбутиламиновым производным
тиазофосфола. При этом наблюдалось повышение активности каспаз,
флуоресценции ДАФИ, БЭ, снижение концентрации никотинамидных
коферментов (в клетках индуцировался апоптоз). При инкубации с DPyO,
2-DQO, 4-DQO признаки апоптоза регистрировались раньше достоверного увеличения маркеров дифференцировки. Индукция моноцитомакрофагальной дифференцировки клеток отмечена с анилиновым производным тиазофосфола (4 суток) и 2-DQO (к концу 5-х суток). В результате достаточно убедительно можно сделать заключение, что каспаза-8 не
23
задействована в протекании эритроидной дифференцировки, а участвует в
апоптозе, индуцированном реагентами.
4-DQO
1 мкМ
DPyO
1 мкМ
+
+
―
―
2-NSQO
1 мкМ
+
+
4-NSQO
1 мкМ
+
+
Каспазы-3,-7,10
БЭ
―
ДАФИ
+
Каспаза-8
1 мкМ
Повышение
флуоресценции
Каспаза-9
2-DQO
Повышение
активности
каспаз
Моноцито-макрофагальная,
мегакариоцитарная
Индукция
эритроидной
[Hb]i
Подавление
пролиферации
Реагенты
Концентрация
Дифференцировка
Снижение
[NAD++NADH]i
Таблица 7
Биологическое действие стирильных N-оксидированных производных
хинолина и пиридина на клетки К562
―
+
++
+
++
+
++
―
+
+
++
++
+
+
+
+
+
―
+
+
+
++
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
не определяли
не определяли
не определяли
Примечание – В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами
в течение 2-х суток, изменение активности каспазы-9 регистрировали после 1-х
суток; клетки К562, обработанные реагентами, сравнивали с необработанными
К562; “+” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “–” изменение исследуемого показателя отсутствует
В настоящее время известно, что выход цитохрома С из митохондрий
в цитоплазму клетки является очень важным этапом в активации каскадов
каспаз и запуске апоптоза. Изучаемые ксенобиотики модулируют процессы окисления и восстановления цитохрома С, влияя на его функциональную активность в электрон-транспортной цепи митохондрий или после
выхода в цитоплазму клеток. На рисунке 5 представлен график восстановления цитохрома С микросомами без и в присутствии 2-NSQO. Добав-
24
ление 2-NSQO в среду инкубации вызывало снижение скорости восстановления, которое со временем прогрессировало.
Прединкубация микросом с 2-NSQO не изменяла скорости восстановления белка по сравнению с предыдущим вариантом. После полного по-
ДАФИ
Снижение
[NAD++NADH]i
Каспаза-8
30мкМ
++
+
не определяли
+
++
―
++
+
+
30мкМ
++
+
не определяли
++
++
+
++
+
+
30мкМ
++
―
±
++
+
+
++
+
+
БЭ
Каспаза-3
Повышение
флуоресценции
Каспаза-9
Подавление
пролиферации
Повышение
активности
каспаз
Моноцито-макрофагальная,
мегакариоцитарная
ТРЕТБУТИЛАМИНОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ
АНИЛИНОВОЕ ПРОИЗВОДНОЕ
Дифференцировка
Индукция
эритроидной
[Hb]i
ЦИКЛОФОСФАН
Концентрация
Реагенты
Таблица 8
Биологическое действие циклофосфана и производных тиазофосфола
на клетки К562
Примечание – В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами
в течение 4-х суток; клетки К562, обработанные реагентами, сравнивали с необработанными К562; “+” изменение исследуемого показателя достоверно
(р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя достоверно (р<0,01); “–”
изменение исследуемого показателя отсутствует
давления NADPH-цитохром С-редуктазной активности добавление в среду NADH (но не NADPH и/или цитохрома С) частично возобновляло восстановление цитохрома С. При использовании 4-NSQO наблюдалась аналогичная закономерность, однако подавление вышеуказанной активности
микросом происходило медленнее, и добавление в среду NADH полностью возобновляло восстановление белка. Окисление цитохрома С данные реагенты ингибировали в одинаковой степени. Обнаруженная нами
биологическая активность производных хинолина может вносить существенный вклад в протекание апоптоза опухолевых клеток.
25
Поскольку в нашей системе инкубация клеток с реагентами приводила
к модуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза, далее изучили
изменение чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому лизису ЕКК в наиболее значимых вариантах.
Рис. 5. Восстановление цитохрома С микросомами клеток К562 без (1) и в
присутствии 10 мкМ 2-NSQO (2–5)
Цитохром С и NADPH добавляли сразу после введения в суспензию микросом
2-NSQO (2) или после 5 мин преинкубации микросом с указанным реагентом (3).
На 10 мин регистрации в систему 2 были добавлены NADH (50 мкМ) (4) или
NADPH (50 мкМ) (5)
1.8. Изменение чувствительности клеток к лизису ЕКК периферической крови человека и селезенки крыс при обработке химическими реагентами.
Анализ влияния реагентов на процессы дифференцировки, апоптоза и
чувствительность клеток К562 к лизису ЛПК человека показал следующее
(табл. 9).
При обработке клеток эритроидными индукторами чувствительность к
лизису ЛПК повышали: бутират натрия, 2-NSQO, 4-NSQO (на 2-е сутки),
DPyO, третбутиламиновое производное тиазофосфола (на 4-е сутки). Увеличение чувствительности к лизису сопровождалось повышением дифференцировочного статуса клеток и индукцией апоптоза. С бутиратом индуцировалась только эритроидная дифференцировка. С тимидином и циклофосфаном наблюдалась тенденция к повышению чувствительности клеток к лизису, хотя в вариантах индуцировались эритроидная дифференцировка и апоптоз клеток. ДМСО не изменял величину ЦИ в системе.
26
При обработке клеток индукторами миелоцитарной дифференцировки:
дексаметазоном, ФМА, QO, 4-NQO, анилиновым производным тиазофосфола, два первых соединения на 4-е сутки понижали чувствительность
Модулирование
чувствительности
к лизису ЛПК
4 суток
↑
0
↑*
0
↑
0
↓
↓
↑
↓
↑
не опре- не определяли
деляли
↑
↑
↑
↑
0 (тим.)
0 (декс.)
0 (тим.)
↑ (декс.)
↓
↓
↑
↑
0
0
0
↓
Тимидин +
ФМА
Бутират
натрия
ДМСО
↓
↑
↑
↓
↑
↑
↓
0
↑
0 (тим.)
0 (ФМА)
↑
↑
0
0
0
0
Бутират
+ ДМСО
Бутират
+ ФМА
ДМСО
+ ФМА
Бутират
+ ДМСО
+ ФМА
↑
0
↓
↑
↓
↑
↓
0
↓
↓
↑
↓
↑
↓
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
↓
0
0
↑
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
0
0
0
0
0
0
↑
↑
↑
↓
0
0
0
↑
↑
0
↑
↑
↑
0
↑
↑
0
0
0
↑
↓
↓
↓
↑
0
↑
↑
↑
0
↑
↑
↑
↓ (бут.)
0 (ДМСО)
0 (бут.)
↑ (ФМА)
0 (ДМСО)
0 (ФМА)
↑ (бут +
ДМСО)
0 (бут.+
ФМА)
↑ (ДМСО+
ФМА)
0
↑
↑ (тим.)
↑ (QO)
↓ (бут.)
0 (ДМСО)
0 (бут.)
↑ (ФМА)
0 (ДМСО)
↑* (ФМА)
↑ (бут.+
ДМСО)
0 (бут.+
ФМА)
↑ (ДМСО+
ФМА)
0
↑
↑ (тим.)
↑ (QO)
4 суток
↑
↓
не опре- не определяли
деляли
0
↑
2 суток
2 суток
4 суток
миелоцитарной
4 суток
эритроидной
Модулирование
апоптоза
Тимидин
↑
↑
Дексаметазон
Тимидин +
дексаметазон
ФМА
0
QO
4-NQO
Тимидин +
QO
0
↑
0
↑
не опре- не определяли
деляли
27
2 суток
Модулирование
дифференцировки
2 суток
Комбинации
реагентов
Таблица 9
Влияние химических реагентов на процессы дифференцировки, апоптоза
и чувствительность клеток К562 к лизису ЛПК человека
0 (тим.)
↑* (ФМА)
↑
Тимидин +
4-NQO
Бутират
+QO
Бутират
+ 4-NQO
0
↑
0
↑
0
↑
↓
↑
↓
↑
↓
↑
не опре- не определяли
деляли
не опре- не определяли
деляли
не опре- не определяли
деляли
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑ (тим.)
0 (4-NQO)
0 (бут.)
↑ (QO)
↑ (бут.)
0 (4-NQO)
↑ (тим.)
0 (4-NQO)
↑ (бут.)
↑ (QO)
↑ (бут.)
0 (4-NQO)
ДМСО+QO
0
↑
0
↑
0
0
↓
↑
↓
↑
0
↑
0
0
↑
↓
↑
↑
0 (ДМСО)
0 (QO)
↑ (ДМСО)
↓ (4-NQO)
0
0
0 (ДМСО)
0 (QO)
↑ (ДМСО)
↓ (4-NQO)
0
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
0
↑
0
↑
0
↑*
Третбутиламиновое
производное
тиазофосфола
Анилиновое
производное
тиазофосфола
0
↑
не определяли
не определяли
↑*
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
0
0
0
↓
↑
0
2-NSQO,
4-NSQO
Циклофосфан
не определяли
не определяли
0
не определяли
не определяли
не определяли
не определяли
0
↑
0
↑
0
↓
0
↑
0
↑
0
0
ДМСО
+ 4-NQO
2-DQO, 4-DQO
DPyO
Примечание – Концентрации реагентов указаны в тексте и подписях к рисункам;
при характеристике биологического действия комбинаций соединений в каждом
случае представлены две строки: верхняя характеризует модулирование процессов
по отношению к первому составляющему комбинации, нижняя – по отношению ко
второму составляющему; модулирующее действие на процессы одиночных реагентов оценено по отношению к необработанным клеткам; ↑ – процесс индуцируется, ↓
– процесс ингибируется, 0 – влияние на процесс отсутствует, * – в модулировании
процесса имеет место тенденция (0,05<p<0,1)
клеток к литическому действию ЛПК. Дексаметазон также индуцировал
апоптоз клеток. 4-NQO на 2-е сутки проявлял апоптоз-индуцирующее
действие и повышал чувствительность клеток к лизису. Дифференцирующий эффект реагента проявлялся к 4-м суткам. 2-DQO и 4-DQO первично индуцировали апоптоз, однако, чувствительность клеток к лизису не
модулировали. Подобный эффект отмечен для QO и анилинового производного тиазофосфола, вместе с тем наблюдалось повышение дифференцировочного статуса клеток, а в случае производного тиазофосфола ин28
дукция апоптоза. При использовании комбинаций соединений, когда
наблюдалось снижение индуцированной эритроидной дифференцировки
(тимидин +дексаметазон, ФМА, QO или 4-NQO; бутират натрия + дексаметазон, ФМА, QO или 4-NQO; ДМСО+ФМА, QO или 4-NQO), имела
место неоднотипность действия реагентов на чувствительность клеток к
лизису ЛПК. В комбинациях с тимидином повышение чувствительности
клеток к лизису регистрировалось с QO или 4-NQO. В этих условиях индуцировался апоптоз, дифференцировка ингибировалась к 4-м суткам.
Замена производного хинолина на дексаметазон или ФМА приводила к
усилению апоптоза в вариантах с дексаметазоном и ингибированию процесса в вариантах с ФМА, чувствительность клеток к лизису ЛПК по
сравнению с тимидином не менялась. Если сравнивать с клетками, обработанными дексаметазоном (или ФМА), то величина ЦИ в опытных пробах к 4-м суткам возрастала, однако, была сопоставима с уровнем необработанных клеток. В результате, в данных комбинациях основной вклад в
повышение чувствительности опухолевых клеток к лизису ЛПК вносил
тимидин. В вариантах тимидин+QO имел место эффект синергизма действий реагентов. Для комбинации тимидин+4-NQO подобного не обнаружено. Аналогичная закономерность прослеживалась при замене тимидина на бутират натрия. В культурах с бутиратом+ФМА величина ЦИ не
отличалась от проб, инкубируемых только с бутиратом, хотя регистрировалось ингибирование апоптоза. Апоптоз ингибировался и в клетках, обработанных ДМСО+4-NQO, величина ЦИ тоже снижалась. В результате,
ДМСО – единственный эритроидный агент, который при совместном внесении с 4-NQO, способен снизить его стимулирующее действие на чувствительность клеток К562 к литическому действию ЛПК.
При использовании комбинации, когда введение второго реагента приводило к увеличению дифференцировочного статуса клеток (бутират
натрия+ДМСО) по сравнению с культурами, обработанными бутиратом,
регистрировалось снижение их чувствительности к лизису ЛПК. Увеличение апоптоза имело место к 4-м суткам. В данном варианте, также как в
предыдущем, ДМСО отрицательно влиял на изменение ЦИ в системе.
29
Наиболее сложной комбинацией соединений в модулировании чувствительности клеток К562 к лизису являлась бутират+ДМСО+ФМА.
Нами установлено, что каждый реагент по-разному влиял на изменение
ЦИ: бутират натрия повышал чувствительность клеток к лизису ЛПК,
ДМСО блокировал его действие, ФМА в составе комбинации способствовал поддержанию ЦИ на достаточно высоком уровне.
Использование в качестве эффекторов клеток селезенки крыс в большинстве случаев не привело к изменению чувствительности клеток К562
к лизису. Увеличение ЦИ отмечено при обработке бутиратом+ФМА, снижение при обработке тимидином+дексаметазон (или ФМА). Подобный
эффект связан с видовыми различиями рецепторных структур взаимодействующих клеток.
Таким образом, обработка опухолевых клеток агентами, индуцирующими дифференцировку, в зависимости от концентрации, времени инкубации и способности клеток подвергаться дифференцировке и/или
апоптозу, может усилить или ослабить их чувствительность к лизису
ЕКК. Изменение чувствительности во многом определяется типом используемого индуктора и связано с процессом, затронутым в опухолевых
клетках в первую очередь. Поэтому при клиническом использовании комбинаций антиопухолевых препаратов необходимо учитывать изменения в
процессах дифференцировки и апоптоза, возникающие под действием или
на фоне каждого составляющего комбинации.
2. Биологическая активность структурно-различных химических реагентов на клетки сублиний К562/4-NQO и К562/2-DQO
Одной из главных причин неудачного использования цитостатиков в
клинике является индукция у опухолевых клеток фенотипа МЛУ (Krishna,
Mayer, 2000). В настоящее время представляется актуальным поиск соединений, способных усилить дифференцировку резистентных опухолевых клеток, что рассматривается в качестве одного из терапевтических
подходов при лечении опухолей (Prados et al., 1998). Итогом такой диф-
30
ференцировки могут стать замедление или полное прекращение пролиферации, индукция апоптоза, модуляция чувствительности опухолевых клеток к лизису ЕКК. Нами были получены сублинии клеток К562, резистентные к 2-DQO и 4-NQO, и охарактеризованы по способности подвергаться дифференцировке и апоптозу по сравнению с клетками родительской линии.
Клетки сублиний были протестированы на чувствительность к ДНКинтеркалирующему агенту БЭ, ингибитору сборки микротрубочек колхицину, 2-DQO и 4-NQO. Результаты представлены в таблице 10. Клетки
К562/4-NQO оказались высокоустойчивыми к БЭ и 2-DQO, но были чувствительны к колхицину. Клетки К562/2-DQO показали одновременно
высокую устойчивость ко всем реагентам, однако их устойчивость к БЭ
была ниже по сравнению с клетками К562/4-NQO.
Таблица 10
Чувствительность клеток К562/4-NQO и К562/2-DQO
к цитостатическим агентам
Линия клеток
К562
К562/4-NQO
К562/2-DQO
Бромистый этидий
2,5
39,8
7,9
ЕС50, мкМ
Колхицин
0,002
0,0004
0,120
4-NQO
1,06
―
79,0
2-DQO
79,7
398
―
Далее нами показано, что в клетках К562/4-NQO, и особенно К562/2DQO, процессы эритроидной дифференцировки протекали более интенсивно по сравнению с родительской линией. Причем обнаруженный эффект имел место только при обработке тимидином (рис. 6), но не бутиратом натрия или ДМСО. Резкое увеличение содержания гемоглобина в
клетках сублиний обусловлено повышением синтеза белка (в частности,
β-глобина, рис. 7), а не увеличением численности клеток в культурах.
В условиях индуцированной тимидином дифференцировки клеток
К562/2-DQO наблюдалось резкое повышение экспрессии гена каспазы-3,
но не каспазы-9 (рис. 8). Для клеток К562/4-NQO подобного эффекта не
отмечено. Экспрессия генов каспаз в необработанных клетках К562/431
NQO и К562/2-DQO снижена. Снижение экспрессии также имело место
при обработке тимидином+дексаметазон. При этом в отличие от родительских, в клетках сублиний апоптоз не индуцировался.
Рис. 6. Влияние обработки клеток К562, К562/4-NQO и К562/2-DQO тимидином на содержание гемоглобина за 2 (а) и 4 (б) суток
1 – необработанные клетки К562 (контроль); 2, 3, 4 – клетки К562, обработанные 1, 2 и 3 мМ тимидина, соответственно; 5 – необработанные клетки К562/4NQO; 6, 7, 8 – клетки К562/4-NQO, обработанные 1, 2 и 3 мМ тимидина, соответственно; 9 – необработанные клетки К562/2-DQO; 10, 11, 12 – клетки К562/2-DQO,
обработанные 1, 2 и 3 мМ тимидина, соответственно. Различия достоверны
(p<0,05; p<0,01) в парах: 2-6, 2-10; 3-7, 3-11; 4-8, 4-12
Рис. 7. Электрофореграмма ПЦР-продуктов гена β-глобина клеток родительской линии К562 и сублиний К562/2-DQO, К562/4-NQO
1 – маркер длин фрагментов pUC19/Msp I (0,5 мкг/мкл, 501-67 bp); 2 – клетки
К562, обработанные тимидином; 3 – необработанные клетки К562; 4 – необработанные клетки К562/4-NQO (сублиния, резистентная к 1,0×10-6 М 4-NQO); 5 –
32
необработанные клетки К562/4-NQO (сублиния, резистентная к 1,0×10-7 М 4NQO); 6 – необработанные клетки К562/2-DQO (сублиния, резистентная к 7,6×105 М 2-DQO); 7 – клетки К562/2-DQO, обработанные тимидином. Концентрация
тимидина – 2 мМ, время обработки – 2 суток
Рис. 8. Относительная экспрессия генов каспазы-9 (а) и каспазы-3 (б) в клетках родительской линии К562 и сублиний К562/2-DQO, К562/4-NQO
1 – необработанные клетки К562; 2 – клетки К562, обработанные тимидином;
3 – необработанные клетки К562/2-DQO; 4 – клетки К562/2-DQO, обработанные
тимидином; 5 – необработанные клетки К562/4-NQO; 6 – клетки К562/4-NQO,
обработанные тимидином. Концентрация тимидина – 2 мМ, время обработки – 2
суток. Относительная экспрессия гена (ΔСt) в опыте определялась исходя из экспрессии гена в контроле, которая принималась за единицу: ΔСt=2Сt(контроля)– Сt(опыта)
Различия достоверны (p<0,05) в парах: 1-3, 1-5, 2-4 (на рис. а и б); 1-2, 3-4, 5-6 (на
рис. б)
Таким образом, в клетках К562, резистентных к 2-DQO и 4-NQO,
наблюдается более выраженная индукция дифференцировки и сниженная
чувствительность к индукции апоптоза по сравнению с родительской ли33
нией. Подобные изменения в сублиниях связаны с развитием устойчивости к 4-NQO, 2-DQO и другим соединениям (агентам группы МЛУ).
3. Биологическая активность структурно-различных химических реагентов на клетки К562/ts-p53
Клетки К562 дефектны по гену р53, который является важнейшим
элементом ответа на стрессорные воздействия, в том числе на воздействие
химиотерапевтических препаратов. Изменения в гене приводят к нарушению способности клеток вступать в апоптоз, останавливаться в контрольных точках клеточного цикла в ответ на повреждение и к развитию МЛУ
(Ставровская, 2000). Чаще всего в гене обнаруживаются миссенс-мутации,
приводящие к замене одного из аминокислотных остатков в ДНКсвязывающем домене белка, что отражается на особенностях влияния мутантных форм р53 на фенотип опухолевых клеток. Нами было изучено
влияние мышиного р53 белка, мутантного по Val 135, на дифференцировку и апоптоз клеток К562/ts-p53 после их обработки N-оксидированными
производными хинолина в комбинации с эритроидными индукторами.
При 37оС этот белок имеет типичные характеристики мутантного белка, а
при 32оС приобретает конформацию и свойства белка дикого типа. В качестве контроля были использованы клетки с введенным пустым ретровирусным вектором pPS/neo (К562/neo).
Из результатов следует (табл. 12), что в клетках К562/ts-р53 процессы
эритроидной дифференцировки и апоптоза протекали более интенсивно
по сравнению с клетками К562/neo и клетками родительской линии. Тимидин, бутират натрия и ДМСО повышали синтез гемоглобина в клетках
K562/ts-p53. Полученные данные подтверждают ранее обнаруженную
способность опухолевого супрессора усиливать эритроидную дифференцировку клеток (Chylicki et al., 2000a; Chylicki et al., 2000b; Yao et al.,
2004). Ингибирование синтеза гемоглобина и индукция апоптоза наблюдались при обработке QO. Установлено, что в индукции эритроидной
дифференцировки клеток участвует каспаза-3, поскольку добавление ингибитора фермента приводило к снижению синтеза гемоглобина. QO не
34
активировал каспазу-3. Обработка клеток тимидином или бутиратом приводила к повышению активности каспазы-9 и индукции апоптоза. При
добавлении в культуры QO наблюдалось резкое возрастание активности
фермента и выраженный апоптоз. Эффект отсутствовал при обработке
ДМСО или ДМСО+QO. Вероятно, ДМСО способствует инактивации р53,
что отражается на развитии апоптоза, индуцированного QO.
Особенности клеток K562/ts-p53 объясняются способностью мутантного р53 белка в определенных условиях сохранять некоторые активности белка дикого типа: связываться с р53-респонсивными элементами и
увеличивать транскрипцию репортерных генов, участвующих в процессах
дифференцировки или апоптоза.
ДАФИ
БЭ
Усиление
флуоресценции
Каспаза-3
Концентрация
Реагенты
Повышение
активности
каспаз
Каспаза-9
K562/ts-p53
Линия клеток
Индукция
эритроидной
дифференцировки
Снижение
[NAD++NADH]i
Таблица 12
Биологическое действие индукторов эритроидной дифференцировки и их
комбинаций с QO на клетки K562/ts-p53
ТИМИДИН
2 мМ
++
+
+
+
―
―
ТИМИДИН + QO
2 мМ+
10 мкМ
2 мМ
+
+
+
+
+
++
++
+
+
+
―
+
+
+
+
+
+
++
++
―
―
―
+
―
+
+
―
―
―
―
―
+
―
+
+
―
БУТИРАТ
НАТРИЯ
БУТИРАТ
НАТРИЯ + QО
ДМСО
ДМСО + QO
QO
2 мМ+
10 мкМ
0,1 %
0,1%+
10 мкМ
10 мкМ
Примечание – В таблице приведены показатели клеток, обработанных реагентами
в течение 2-х суток при 320С; сравнение результатов действия реагентов проводили в парах К562/neo — K562/ts-p53; достоверных различий между клетками
К562/neo и родительскими К562 не обнаружено; пролиферация клеток в представленных вариантах была блокирована; “+” изменение исследуемого показателя
35
достоверно (р<0,05); “++” изменение исследуемого показателя
(р<0,01); “–” изменение исследуемого показателя отсутствует
достоверно
Таким образом, в настоящей работе нами показано, что клетки эритромиелолейкозной линии человека К562 в зависимости от условий способны подвергаться химически индуцированным дифференцировке и
апоптозу, продемонстрированы основные различия в индукции этих процессов в клетках родительской линии К562, резистентных сублиний
(К562/4-NQO, К562/2-DQO) и клетках-трансфектантах (K562/ts-p53). Несмотря на структурное различие используемых реагентов, итоговый биохимический эффект их действия на клетки может быть совершенно одинаков. В частности, нуклеозиды, натриевые соли жирных кислот с укороченной углеводородной цепью, ДМСО, некоторые N-оксиды (2-NSQO, 4NSQO и DPyO), циклофосфан, третбутиламиновое производное тиазофосфола стимулируют эритроидную дифференцировку и/или апоптоз в
опухолевых клетках. Напротив, системные кортикостероиды, ФМА, QO,
4-NQO подавляют индуцированную эритроидную дифференцировку и
стимулируют созревание клеток моноцито-макрофагального или мегакариоцитарного ряда. При этом ФМА и ДМСО способны блокировать
апоптоз клеток. В связи с этим, в реализации конкретной клеточной
функции принимают участие различные сигнальные пути, воздействуя на
которые можно определенным образом регулировать протекание клеточного процесса в том или ином направлении. Одни и те же участники сигнальных путей клетки могут выполнять роль ключевых звеньев модуляции различных клеточных функций, например, дифференцировки и
апоптоза. Нами показано, что одними из таких ключевых участников процессов являются клеточные каспазы. Функциональная активность каспаз
и других протеиназ во многом определяет чувствительность опухолевых
клеток к лизису ЕКК и цитотоксических Т-лимфоцитов организма.
ВЫВОДЫ
1. Исследованные химические соединения обладают различным цитотоксическим и антипролиферативным действием на клетки эритромиело36
лейкозной линии человека К562, что объясняется их структурными особенностями и механизмом внутриклеточного действия. Жизнеспособность клеток в зависимости от условий обработки варьирует от 25% до
95%, пролиферативная активность частично или полностью подавляется.
2. Эритроидная дифференцировка опухолевых клеток К562 индуцируется нуклеозидами, солями жирных кислот с укороченной углеводородной цепью, ДМСО, 2-NSQO, 4-NSQO, DPyO, циклофосфаном и 2третбутиламино-4-тиоксо-4-хлорметил-1,3,4-тиазофосфол-2-ином.
В
клетках увеличивается активность δ-аминолевулинатсинтазы, каспазы-3,
повышается синтез гемоглобина. Сочетанное действие двух различных
индукторов эритроидной дифференцировки вызывает либо синергический, либо антагонистический эффекты.
3. Миелоцитарная дифференцировка опухолевых клеток сопровождается экспрессией на их поверхности моноцито-макрофагальных – CD11b,
CD14, и мегакариоцитарного – CD41, маркеров, а также активацией гемоксигеназы и индуцируется преднизолоном, дексаметазоном, ФМА, QO,
2-MeQO, 4-NQO, 2-Me-4-NQO, 2-DQO, 4-DQO, 2-анилино-4-тиоксо-4хлорметил-1,3,4-тиазофосфол-2-ином.
4. Переключение процессов клеточной дифференцировки с эритроидного на моноцито-макрофагальный или мегакариоцитарный влечет за собой переключение функциональной активности каспаз и модуляцию процессов апоптоза. Апоптоз, индуцированный в клетках эритроидными индукторами, реализуется с участием каспазы-9. ФМА подавляет эритроидную, индуцирует моноцито-макрофагальную дифференцировку, блокирует активность каспазы-9 и апоптоз клеток К562, при этом активируется
каспаза-6. Каспаза-3 в зависимости от условий участвует как в процессах
дифференцировки, так и апоптоза опухолевых клеток.
5. Апоптоз опухолевых клеток К562, индуцированный стирильными
производными N-оксидов хинолина и пиридина, а также производными
тиазофосфола, осуществляется при участии митохондриального цитохрома С, каспаз-3, -8 и -9. Реагенты оказывают влияние на процессы окисления–восстановления цитохрома С, модулируют набухание–сжатие мито37
хондрий и способствуют выходу данного белка в цитоплазму. Преобладание в цитоплазме клеток окисленной или восстановленной форм цитохрома С отражается на реализации программы апоптоза.
6. Изменение чувствительности клеток К562 к лизису естественными
клетками-киллерами лейкоцитов периферической крови человека зависит
от типа химического соединения, концентрации, времени воздействия,
исходного состояния клеток, способных подвергаться дифференцировке
и/или апоптозу. Обработка клеток индукторами эритроидной дифференцировки повышает их чувствительность к лизису. Влияние индукторов
миелоцитарной дифференцировки и/или апоптоза зависит от процесса,
первично индуцируемого в опухолевых клетках. Чувствительность клеток
к лизису снижается, если первично индуцируется дифференцировка и повышается, если индуцируются апоптоз и дифференцировка.
7. Эритроидная дифференцировка в клетках резистентных сублиний
К562/4-NQO, и особенно К562/2-DQO, протекает более интенсивно по
сравнению с родительскими К562, при этом регистрируется резкое повышение экспрессии генов β-глобина и каспазы-3. Экспрессия гена каспазы9 не изменяется. Сублинии являются устойчивыми к апоптоз-индуцирующему действию исследуемых ксенобиотиков.
8. Процессы эритроидной дифференцировки и апоптоза в клетках
К562/ts-р53, обработанных индукторами при 320С, протекают более интенсивно по сравнению с родительской линией К562. В индукции эритроидной дифференцировки клеток участвует каспаза-3.
9. Стирильные производные N-оксидов хинолина, пиридина и производные тиазофосфола являются наиболее перспективными реагентами для
создания на их основе препаратов нового типа, использование которых
может повысить эффективность лечения онкологических заболеваний.
Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов Фонда Президента Российской Федерации «Поддержка ведущих научных школ РФ» (НШ894.2003.4, НШ-4310.2006.4), РФФИ (гранты 99-04-49442, 01-04-06530, 02-04-
38
49999, 02-04-06427), С.-Петербургского КЦФЕ (МО1-2.6П-783, диплом АСП
№ 301106) и Целевой программы РАН «Поддержка молодых ученых».
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Монография:
1.Волкова Т.О., Немова Н.Н. Молекулярные механизмы апоптоза лейкозной
клетки: Отв. ред. д.м.н., проф. А.И. Шевченко. – М.: Наука, 2006. – 208 с.
Статьи:
2.Анисимов А.Г., Болотников И.А., Волкова Т.О. Влияние тимидина и
форбол-12-миристат-13-ацетата на эритроидную дифференцировку клеток К562
и чувствительность их к неспецифическому лизису спленоцитами крыс //
Бюл. эксперим. биол. и медицины, 1999. – Т. 128. – № 11. – С. 521-524.
3.Анисимов А.Г., Болотников И.А., Волкова Т.О. Изменение чувствительности клеток К562 к неспецифическому лизису лейкоцитами человека и крысы под
влиянием бутирата натрия, диметилсульфоксида и форбол-12-миристат-13-ацетата
// Онтогенез, 2000. – Т. 31. – № 1. – С. 47-52.
4.Анисимов А.Г., Болотников И.А., Чекмасова А.А., Волкова Т.О. Взаимосвязь индуцированной in vitro дифференцировки клеток опухолевых линий и
чувствительности их к неспецифическому лизису ЕКК. Возможные механизмы //
Цитология, 2000. – Т. 42. – № 10. – С. 923-936.
5.Анисимов А.Г., Чекмасова А.А., Волкова Т.О., Немова Н.Н. Обработка
клеток К562 тимидином на фоне дексаметазона повышает чувствительность
опухолевых клеток к литическому действию лейкоцитами человека // Цитология, 2001. – T. 43. – № 1. – C. 76-81.
6.Волкова Т.О., Немова Н.Н. Биологические эффекты in vitro стирильных производных ряда хинолина и пиридина на примере клеток опухолевых линий: В
книге «Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений»/ Под ред. д.х.н. В.Г. Карцева и акад. Г.Н. Толстикова. – М.: ИРИДИУМПРЕСС, 2001. – С. 254-257.
7.Анисимов А. Г., Волкова Т. О., Чекмасова А. А, Немова Н. Н. Форбол-12миристат-13-ацетат отменяет ингибирующее действие А23187 на эритроидную
дифференцировку клеток К562, индуцированную диметилсульфоксидом // Известия РАН. Серия биол., 2002. – № 2. – С. 142-148.
8.Анисимов А.Г., Волкова Т.О., Чекмасова А.А., Немова Н.Н. Химическииндуцированная дифференцировка клеток опухолевых линий // Онтогенез, 2002. –
Т. 33. – № 5. – С. 325-341.
9.Волкова Т.О., Малышева И.Е. Модуляция процессов дифференцировки и
апоптоза клеток промиелоцитарной линии человека К562 стирильными производными ряда хинолина и пиридина // Вестник молодых ученых. Серия «Науки о
жизни», 2002. – вып. 4. – С. 58-63.
10. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Сравнительный анализ дифференцирующего и апоптогенного действий цитидина, тимидина и гуанозина на
39
клетки эритромиелолейкозной линии человека К562 // Вопросы мед. химии, 2002.
– Т. 48. – № 6. – С. 586-593.
11. Анисимов А. Г., Чекмасова А. А.,. Волкова Т. О, Немова Н. Н. Эритроидная
дифференцировка сублиний клеток К562, резистентных к 2-(4’-диметиламиностирил)хинолин-1-оксиду или 4-нитрохинолин-1-оксиду, значительно усиливается при обработке тимидином // Известия РАН. Серия биол., 2003. – № 1. –
С. 37-46.
12. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Зыкина Н.С. Модуляция активности каспаз
в клетках К562 в условиях обработки бутиратом, изобутиратом и изовалератом
натрия // Вестник молодых ученых. Серия «Науки о жизни»,2004– вып.1.–С.72-76.
13. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Форбол-12-миристат-13-ацетат
ингибирует апоптоз в эритролейкемических клетках К562, индуцированный рядом нуклеозидов // Онтогенез, 2005. – Т. 36, № 1. – С. 18-25.
14. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Рябков В.А., Волкова Т.О., Кручек М.М. Активность программированной клеточной гибели лимфоцитов при ревматоидном
артрите // Терапевтический архив, 2006. – № 6. – С. 14-19.
15. Волкова Т.О., Зыкина Н.С., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Клеточные механизмы индукции апоптоза в эритромиелолейкозной линии человека К562 при
обработке производными хинолин-N-оксида // Биомедицинская химия, 2006. – Т.
52, № 2. – С. 180-187.
16. Volkova T.O., Zykina N.C., Malycheva I.E., Nemova N.N. Cell mechanisms for
apoptosis induction in K562 human erythroleukemia cell line treated with quinoline-Noxides derivatives // Biochemistry (Supplement Series B: Biomedical chemistry), 2007.
– Vol. 1 (1). – P. 82-86 (англ. вар. 15).
17. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Функциональное перераспределение активностей каспаз в клетках К562, индуцированных к дифференцировке и апоптозу производными тиазофосфола // Биомедицинская химия, 2008. – Т. 54., № 6. –
С.643-648.
Тезисы конференций:
18. Болотников И.А., Волкова Т.О., Анисимов А.Г. Модуляция эритроидной
дифференцировки и чувствительности к неспецифическому лизису клеток человеческой эритромиелолейкозной линии К562 в условиях обработки рядом метаболических ингибиторов / Международная конф. «Рецепция и внутриклеточная
сигнализация». – Пущино, 1998. – С. 68-71.
19. Volkova T.O., Anisimov A.G. Change of number and viability of cells K562 in
conditions of treatment by a number of chemical reagents / Proceeding of the International young research school. – Petrozavodsk, 1998. – Vol. 1. – P. 59-68.
20. Болотников И.А., Волкова Т.О., Анисимов А.Г. Влияние индукторов
дифференцировки клеток К562 на чувствительность их к лизирующему действию
ЕКК-содержащих лейкоцитов человека и крыс // Цитология, 1999. – Т. 41. – №
3/4. – С. 262.
21. Волкова Т.О., Чекмасова А.А., Анисимов А.Г. Биологическая активность
некоторых производных хинолина на клетки К562 / II Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. – С.-Петербург, 2000. – Т. 2. – С. 151.
40
22. Анисимов А.Г., Волкова Т.О., Чекмасова А.А., Андреев В.П. Взаимосвязь
между апоптогенной активностью ряда производных хинолина и пиридина и
их способностью ингибировать эритроидную дифференцировку клеток линии
К562 // Цитология, 2000. – Т. 42. – № 3. – С. 258.
23. Волкова Т.О., Чекмасова А.А., Анисимов А.Г. Форбол-12-миристат-13ацетат восстанавливает дифференцирующее действие диметилсульфоксида на
клетки К562, подавленное предобработкой клеток кальциевым ионофором А23187
// Цитология, 2001. – Т. 43. – № 4. – С. 328.
24. Volkova T.O., Nemova N.N. Styryl derivatives of quinolines and pyridine: biological action on the cells of tumor lines in vitro / International conference “The Chemistry and Biological Activity of Nitrogen-Containing Heterocycles and Alkaloids. – Moskow, 2001. – Vol. 1. – P. 553-556.
25. Волкова Т.О., Черномордая Ю.П., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Модулирующее действие N-оксидированных производных хинолина на индуцированную
эритроидную дифференцировку клеток К562 зависит от типа эритроидного индуктора и последовательности обработки опухолевых клеток реагентами // Цитология, 2001. – Т. 43. – № 9. – С. 846.
26. Волкова Т.О. Цитотоксическое и апоптогенное действие индукторов дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий / 6ая Санкт-Петербургская
Ассамблея молодых ученых и специалистов. – СПб.: Изд-во СПбГУ, 2001. – С. 41.
27. Волкова Т.О. Индукция программированной гибели в клетках миелоидных
опухолевых линий человека. Особенности. Механизмы / XII Международная
конф. молодых ученых «Человек. Природа. Общество. Актуальные проблемы». –
С.-Петербург, 2001. – С. 619-623.
28. Малышева И.Е., Волкова Т.О., Немова Н.Н. Клетки крови эритроидного
ряда человека: особенности дифференцировки в условиях холодового стресса /
Международная конф. «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере». – Сургут, 2002. – С. 60-62.
29. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Участие каспаз в проведении
сигнала апоптоза в опухолевых клетках человека / V Международный симпозиум
«Химия протеолитических ферментов». – Москва, 2002 – C. 35.
30. Волкова Т.О., Малышева И.Е. Модуляция биологической активности цитохрома С в условиях обработки рядом метаболических ингибиторов / 6ая Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология – наука 21го века». Секция «Молекулярная биология и биохимия» – Пущино, 2002. – Т. 1. – С. 229.
31. Волкова Т.О., Сак Н.С., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Поиск новых модуляторов электронтранспортной функции белков системы цитохромов в эритролейкемических клетках человека К562 / III съезд Биохимического Общества. – С.Петербург, 2002. – С. 65-66.
32. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Индукция апоптоза в клетках
миелоидных опухолевых линий человека. Возможные участники и модуляция их
биологической активности / Всероссийская конф. «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия». – Москва, 2002. – С. 55.
33. Волкова Т.О. Экспериментальное моделирование процессов индуцированной дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий in vitro и модуля-
41
ции их чувствительности к неспецифическому лизису лейкоцитами человека и
крыс / Научная конф. «Карелия и РФФИ». – Петрозаводск, 2002. – С. 20.
34. Волкова Т.О., Малышева И.Е. Эффекторное влияние индуцированной дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий на модуляцию активности
внутриклеточных цистеиновых протеиназ и чувствительность клеток к неспецифическому лизису лейкоцитами человека / Научная конф. «Карелия и РФФИ». –
Петрозаводск, 2002. – С. 21.
35. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Диметилсульфоксид ингибирует апоптоз в эритролейкемических клетках К562, индуцированный кальциевым
ионофором А23187 // Цитология, 2002. – Т. 44. – № 9. – С. 866-867.
36. Волкова Т.О., Малышева И.Е. Модуляция чувствительности эритролейкемических клеток К562 к неспецифическому лизису лейкоцитами человека в условиях обработки антиопухолевыми агентами / 5ый Конгресс РААКИ «Современные
проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». – Москва, 2002. –
Т.2. – С. 37.
37. Волкова Т.О., Сак Н.С., Малышева И.Е. Взаимосвязь цитохромов С и Р-450
в реакциях метаболизма N-содержащих гетероциклических соединений / 7ая Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология – наука 21го века». Секция «Молекулярная биология и биохимия» – Пущино, 2003. – С. 41.
38. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Везикова Н.Н., Марусенко И.М., Волкова Т.О.
Программированная клеточная гибель лимфоцитов при раннем ревматоидном
артрите // Научно-практическая ревматология (приложение к журналу), 2003. –
№ 2. – С. 21.
39. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Влияние форбол-12-миристат13-ацетата на модуляцию апоптоза в эритролейкемических клетках человека К562
при обработке рядом химических реагентов // Цитология, 2003. – Т. 45. – № 9. –
С. 858-859.
40. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Немова Н.Н. Процессы индукции эритроидной дифференцировки и апоптоза клеток К562 в условиях обработки 2-(4’нитростирил)хинолин-1-оксидом и 4-(4’-нитростирил)хинолин-1-оксидом // Цитология, 2003. – Т. 45. – № 9. – С. 859.
41. Волкова Т.О., Малышева И.Е., Зыкина Н.С., Кожевникова М.Н. Влияние
N-оксидированных производных хинолина на активность микросомальных
NADPH-оксидоредуктаз и концентрацию никотинамидных коферментов в клетках
линии К562 / 8ая Пущинская школа-конф. молодых ученых «Биология – наука 21го
века». Секция «Общая и функциональная биохимия» – Пущино, 2004. – С. 72.
42. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при системной красной волчанке // Научнопрактическая ревматология (приложение к журналу), 2004. – № 4. – С. 7.
43. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов как критерий активности и эффективности терапии при системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите / III
Международная научно-практическая конф. “Болезнь Ходжкина” – Петрозаводск, 2004. – С. 132-134.
44. Варга О.Ю., Игнатьев В.К., Хейфец Л.М., Везикова Н.Н., Марусенко
И.М., Волкова Т.О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при рев-
42
матоидном артрите, системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите / Материалы IV конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа. – Великий Новгород, 2004. – С. 36-38.
45. Волкова Т.О. Индукция апоптоза в эритролейкемических клетках человека
К562 при обработке системными кортикостероидами // Вестник молодых ученых.
Серия «Науки о жизни» (приложение к журналу), 2005. – С. 45.
46. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Участие каспаз в индукции дифференцировки и
апоптоза клеток миелоидных опухолевых линий человека / VI Международный
симпозиум «Химия протеолитических ферментов». – Москва, 2007.
47. Волкова Т.О., Зыкина Н.С., Немова Н.Н. Участие опухолевого супрессора
р53 в индукции эритроидной дифференцировки клеток линии К562 // Цитология,
2007. – Т. 49, № 9. – С. 727-728.
48. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Влияние нитростирильных производных хинолин-1-оксида на чувствительность эритролейкемических клеток К562 к неспецифическому лизису лейкоцитами человека // Цитология,2007. – Т. 49, № 9. – С. 728.
49. Волкова Т.О. Опухолевый супрессор р53 индуцирует эритроидную дифференцировку клеток линии К562 / Всероссийская медико-биологическая научная
конф. молодых учёных "Фундаментальная наука и клиническая медицина" (XI
Всероссийская конф. «Человек и его здоровье»). – С.-Петербург, 2008. – С. 71-72.
50. Волкова Т.О., Немова Н.Н. Апоптоз-индуцирующее действие комбинаций
системных кортикостероидов и солей жирных кислот с укороченной цепью на
эритролейкемические клетки К562 / IV Съезд российских биохимиков и молекулярных биологов. – Новосибирск: Изд-во «Арта», 2008. – С. 223.
51. Волкова Т.О., Гуров Э.В. Новые ингибиторы электронтранспортной функции цитохрома С в опухолевых клетках / 12ая Пущинская школа-конф. молодых
ученых «Биология – наука 21го века». Секция «Общая и функциональная биохимия» – Пущино, 2008. – С. 77.
Другие работы:
52. Волкова Т.О. Эффекторное влияние индуцированной дифференцировки клеток миелоидных опухолевых линий на модуляцию активности внутриклеточных
цистеиновых протеиназ и чувствительность клеток к неспецифическому лизису
лейкоцитами человека: ВНТИЦентр; № ГР 01. 200.210712; Инв. № 0220.0 502160.
– М., 2005. – 56 с.
43