Одгаева Айса Владимировна «Влияние регуляторного пептида
реклама
На правах рукописи Одгаева Айса Владимировна ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНОГО ПЕПТИДА СЕМАКСА НА Н2О2 –ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ЖИВОТНЫХ 03.00.13 – Физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2009 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Каменский Андрей Александрович Научный консультант: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Туровецкий Валерий Борисович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Котелевцев Сергей Васильевич доктор биологических наук, доцент Кондратенко Елена Игоревна Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» Защита состоится « 6 » марта 2009 года в 14-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д.1, Инновационный Естественный институт. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Инновационного Естественного института Астраханского государственного университета. Автореферат разослан « 5 » февраля 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Ю.В. Нестеров Введение Актуальность проблемы. В настоящее время очевидна необходимость создания лекарственных препаратов, способных повышать эффективность умственного труда в сложных условиях, не обладающих негативными побочными воздействиями. В поисках таких средств исследователи обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или соединений, являющихся близкими их аналогами. В первую очередь внимание специалистов привлекают к себе регуляторные пептиды, воздействующие практически на все физиологические функции организма (Ляпина Л.А., Пастророва В.Е., 2006). Одним из перспективных направлений в этой области являются работы по созданию лекарственных адренокортикотропного аминокислотной средств гормона на (АКТГ), последовательности основе в АКТГ(4–10). аналогов частности В фрагмента фрагмента современной 4–10 клинической практике одним из самых известных клинически применяемых препаратов, созданных на основе фрагмента АКТГ в Институте молекулярной генетики РАН (Пономарева-Степная М.А. и др., 1984), является семакс. Семакс – первый российский ноотропный препарат из группы нейропептидов, имеющий ряд важных преимуществ перед известными аналогами: полное отсутствие токсических и побочных влияний, а также гормональной активности. Имеющиеся в настоящее время в литературе данные (Сафарова Э.Р., 2003; Гривенников И.А., 2006; Сторожевых Т.В., 2007) указывают на то, что высокая фармакологическая эффективность регуляторного пептида семакса в значительной степени определяется его нейропротекторным действием, в частности, его способностью повышать устойчивость мембран клеток к действию повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют активные формы кислорода (АФК), повышение уровня которых сопровождает развитие целого ряда заболеваний. В число АФК входит и перекись водорода, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую роль в реализации их действия на клетки. Одной из важных мишеней повреждающего действия Н2О2 на клетку является ее плазматическая мембрана. При этом, как полагают (Гамалей И.А., 1997), Н2О2 индуцирует в клетке развитие процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящих к нарушению целостности их плазматических мембран и, как следствие, повышению проницаемости, а в дальнейшем - клеточной гибели. Известно, что действие многих повреждающих агентов на клетки сопровождается изменением внутриклеточной концентрации ионов Н+ и свободного Са2+, что играет важную роль в формировании ответа клеток на эти воздействия и реализации их повреждающего эффекта (Литинская Л.Л. и др., 1987; Порядин Г.В., 1997). Таким образом, изучение роли рН и Са2+ в качестве модифицирующих агентов может привести нас к пониманию возможных механизмов защитного действия семакса. В заключение следует подчеркнуть, что, несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы проблема механизмов реализации молекулярных и клеточных эффектов семакса еще далека от своего окончательного разрешения. Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение влияния регуляторного пептида семакса на Н2О2–индуцированные повреждения мембран перитонеальных макрофагов и культивируемых нервных клеток. В задачи работы входило: 1.Изучение основных закономерностей повреждающего действия перекиси водорода на мембраны перитонеальных макрофагов мышей и культивируемых нервных клеток мозга крыс. 2.Изучение влияния семакса на Н2О2-индуцированное повреждение плазматических мембран иммунокомпетентных и нервных клеток. 3.Изучение влияния семакса на некоторые функционально-метаболические параметры клеток. Научная новизна. Использован комплексный подход к изучению протекторного действия семакса при повреждающем действии Н2О2. Изучено влияние ионов водорода на защитный эффект семакса при окислительном стрессе (ОС). Выявлено влияние исследуемого регуляторного пептида на функционально-метаболическую активность фагоцитарных и нервных клеток. Практическое значение. Исследование и внедрение в клиническую практику новых препаратов, созданных на основе регуляторных пептидов, является актуальной проблемой, обусловленной необходимостью лечения целого ряда заболеваний человека. Использованный в работе комплексный подход к изучению защитного действия семакса при инициации клеточных повреждений может быть использован в медико-биологических, клинических и фармакологических исследованиях новых синтетических препаратов. Апробация работы. Основные положения работы представлялись на 4-м Международном симпозиуме “4th International Workshop on Space Radiation Research and 17-th Annual NASA Space Radiation Health Investigators” (Москва – СанктПетербург, 2006); 20-й Международной конференции “Stress and Behavior” (СанктПетербург, 2007); 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007); 20-м Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова. (Москва, 2007); 13й и 14-й Международной конференции «Ломоносов», (Москва, 2006; 2007); Конференции "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга" (Москва, 2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 8 докладов в материалах российских и международных конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками. Библиография содержит 203 названия. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследований. Объектами исследований служили перитонеальные макрофаги беспородных белых мышей-самцов, а также клетки диссоциированных культур гиппокампа, септума и мозжечка головного мозга крыс. Культуры нервных клеток были любезно предоставлены сотрудником лаборатории «Структуры и функции митохондрий» НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ д.б.н. Исаевым Н.К., за что автор приносит ему искреннюю благодарность. Для получения перитонеальных макрофагов мышей их забивали с помощью цервикальной дислокации, вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса, содержавшего 10 мМ HEPES (рН 7,2) и через несколько минут извлекали перитонеальную жидкость, содержавшую макрофаги. Концентрацию полученной таким образом суспензии клеток доводили тем же раствором до величины 1,5х106 клеток в мл. Небольшие объемы суспензии (20 мкл) наносили на покровные стекла, инкубировали 45 мин во влажной камере для прикрепления клеток к субстрату, а затем промывали раствором Хенкса для удаления неприкрепившихся клеток (Туровецкий В.Б. и др., 1995). Методы исследования Определение внутриклеточного рН макрофагов проводили с использованием варианта микрофлуориметрического метода. Введение в клетки люминесцентного рН-индикатора флуоресцеина осуществляли путем их инкубации с флуоресцеиндиацетатом (ФДА) (5 мкг/мл) течение 15 мин. После отмывки от несвязавшегося красителя проводили регистрацию интенсивности флуоресценции (I) отдельных клеток в двух узких полосах спектра излучения флуоресцеина (с максимумами в области λ1=520 нм и λ2=570 нм). Для определения значения внутриклеточного рН пользовались калибровочной кривой, представляющей собой график зависимости коэффициента К, равного отношению I1 к I2, от величины рН среды (Туровецкий В.Б., 1994). Измерения проводили с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И3, оснащенного фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А с цифровым вольтметром Щ4300. Возбуждение флуоресценции клеток осуществляли с использованием галогенной лампы накаливания КГМ9-70 и комбинации стеклянных светофильтров ФС1-4 и СЗС21-2. Выявление клеток с поврежденной плазматической мембраной осуществляли с использованием одновременной окраски клеток флуорохромами ФДА (5мкг/мл) и бромистым этидием (ЭБ) (5мкг/мл) (Dankberg F., Persidsky M.D., 1976). В результате такой обработки уже через 15 мин инкубации клеток с флуорохромами в поле зрения люминесцентного микроскопа легко идентифицируются клетки с поврежденной и неповрежденной плазматической мембраной. Анализировали несколько полей зрения на каждом стекле (не менее 400 клеток) (Туровецкий В.Б. и др., 1995). Оценку содержания активных форм кислорода в макрофагах проводили с использованием НСТ-теста, в основе которого лежит восстановление в цитоплазме макрофагов красителя нитросинего тетразолия (НСТ, 0,1%-ный раствор) до нерастворимого диформазана под влиянием супероксидного аниона, который образуется в больших концентрациях при активации клетки (Кондратьева И.А., Самуилов В.Д., 2001). Оценку уровня клеточного метаболизма определяли с помощью МТТ-теста. Для оценки уровня МТТ-теста клетки инкубировали 30 мин с МТТ (0,5 мг/мл), лизировали ДМСО и определяли оптическую плотность при =570 нм c помощью сканирующего ридера Microelisa autoreader MR 580 (Dynatech Product, Germany). Экспериментальные клеточные модели Окислительный стресс, индуцированный в клетках с помощью Н2О2. ОС в перитонеальных макрофагах индуцировали при температуре 370С в течение 15 мин с помощью Н2О2, введенной в необходимых концентрациях в забуференный HEPES (10 мМ) раствор Хенкса (pH 7,2). Далее покровные стекла помещали на 45 мин в раствор Хенкса без Н2О2. Семакс и его аналог, а также исследуемые агенты добавляли в соответствующих концентрациях к клеткам сразу после окончания их инкубации с Н2О2 и отмывки от нее. ОС в культивируемых нервных клетках индуцировали в несколько иных условиях. В ходе экспериментов с культивируемыми клетками плейты с клетками содержались в СО2-инкубаторе при температуре 370С. Оценку влияния на клетки Н2О2 и семакса проводили с помощью МТТ-теста. Ультрафиолетовое облучение клеток. Объектом исследования служили перитонеальные макрофаги. В качестве источника ультрафиолетового облучения использовали лабораторный спектральный облучатель ЛОС-2. Облучение клеток проводили в дозах 4, 5, 6 и 12 Дж/см2 при интенсивности света 10 мВт/см2 через светофильтр с максимумом пропускания при λ=306 нм в комбинации со стеклянным светофильтром УФС-5 (Пирутин С.К. и др., 2002). После окончания облучения клетки инкубировали дополнительно 15 и 60 мин как в отсутствие добавок, так и в присутствии семакса (100 мкг/мл) или его аналога (100 мкг/мл). Статистическая обработка результатов экспериментов Результаты, полученные не менее чем в 5 независимых экспериментах в каждой серии, обрабатывали с помощью программы Statsoft Statistica 6.0. Данные представлены в виде средних значений исследуемых параметров и их среднеквадратических ошибок. Достоверность различий между средними значениями определяли по критерию Стьюдента. Различия между средними значениями исследуемых параметров считали достоверными при р≤0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Повреждение плазматических мембран макрофагов при действии Н2О2 Клеточная мембрана является одной из чувствительных мишеней при действии на клетку многих повреждающих факторов. Среди последних существенную роль играют АФК, повышение уровня которых сопровождает развитие целого ряда заболеваний (Капелько В.И., 2003). В число АФК входит и Н2О2, которая в силу ряда особенностей претендует на ведущую роль в реализации их действия на клетки. Температура и время инкубации клеток с Н2О2 в разных концентрациях Данные, представленные на рисунке 1, показывают, что инкубация перитонеальных макрофагов с Н2О2 сопровождалась повышением относительного содержания в популяции клеток с поврежденной плазматической мембраной. Выраженность эффекта возрастала при повышении концентрации перекиси от 0,1 до 10 мМ. Эти результаты находятся в хорошем соответствии с литературными данными (Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993; Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996) о том что, что при действии на клетки Н2О2 в концентрации 0,1-2,5 мМ происходит комплекс событий, приводящий, в конечном счете, к ее гибели. Из рисунка 1 также видно, что существенное увеличение числа поврежденных клеток наблюдалось нами также при повышении температуры инкубации от 200 до 370С, что, по-видимому, объясняется усилением ПОЛ с ростом температуры (Владимиров Ю.А., 2000). Анализ временной зависимости развития эффекта Н 2О2 (1мМ) на макрофаги показывает, что возрастание времени воздействия приводило к постепенному повышению процентного содержания поврежденных клеток, достигавшего 90% к 60-ой мин инкубации. Существенно при этом отметить, что развитие повреждения продолжалось и после переноса клеток в среду без Н2О2. Так, Содержание поврежденных клеток, % Рис.1. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей при действии Н2О2. По оси абсцисс - концентрация Н2О2, мМ; по оси ординат - относительное содержание в популяции макрофагов клеток с поврежденной плазматической мембраной, %. Инкубацию клеток с Н2О2 проводили в течение 30 мин при температуре 200С ( ) и 370С ( ). Здесь и далее: *-различия между средними значениями исследованного параметра считали достоверными при р ≤0,05. 120 * 100 80 * 60 40 * 20 0 0,1 1,0 10,0 Концентрация Н2О2, мМ после инкубации клеток с Н2О2 в течение 15 или 30 мин дополнительная их инкубация уже в отсутствие перекиси в течение 45 или 30 мин приводила к возрастанию содержания в популяции поврежденных клеток, примерно, в 4,5 и 1,7 раза, соответственно. Все данные хорошо укладываются в рамки существующей на сегодняшний день теории, согласно которой ключевым моментом в процессе повреждения мембран во время ОС является ПОЛ мембран и, как следствие, нарушение целостности бислоя в результате формирования гидрофильных пор (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993; Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996; Владимиров Ю.А., 2000). Таким образом, полученные нами данные показали, что действие Н2О2 перитонеальные макрофаги мышей in vitro сопровождается зависящим на от температуры, времени инкубации и концентрации агента нарушением целостности их плазматических мембран. Ионы Са+2 Как видно из данных, представленных на рисунке 2, инкубация клеток в присутствии ионов Са2+ (2мМ) или Са+2-ионофора А23187 (0,5 нг/мл) в течение 60 мин приводила к небольшому повышению (около 20%) содержания в популяции макрофагов клеток с поврежденной мембраной. Добавление Са2+ или А23187 к клеткам, подвергнутым предварительному повреждающему воздействию Н2О2 также приводило лишь к небольшому дополнительному возрастанию повреждения клеток (на 20% и 10%, соответственно). Полученные данные указывают, по-видимому, на независимость механизмов повреждающего действия Н2О2 и вышеуказанных агентов. Возможным объяснением увеличения степени повреждения клеток при 60 мин инкубации клеток на фоне повышенной концентрации Са+2 может являться то, что 140 Содержание поврежденных клеток, % 120 100 80 * 60 Рис.2. Влияние ионов Са+2 на способность семакса защищать макрофаги от повреждающего действия Н2О2. Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после окислительного стресса, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсутствие 2 * 40 * 20 0 К СаСl2 А23187 Семакс СаСl2 А23187 (2мM) и А23187 (0,5 нг/мл) добавляли к клеткам сразу после их отмывки от Н2О2 либо по-отдельности ( ), либо в сочетаниях семакса с СаСl2 или А23187 ( ). В ряде экспериментов инкубацию клеток с СаСl2 или А23187 осуществляли в течение 60 мин без предварительной инкубации с Н2О2 ( ). увеличение содержания ионов кальция внутри клетки вследствие их проникновения через мембрану из внеклеточной среды способствует снижению активности протеинкиназы С, фосфорилирующей многие белки, активации фосфолипаз и ферментов, инициирующие процессы ПОЛ (Nicholls D.G., 2004). Кроме того, множество ферментов в клетке и в митохондриях являются кальций зависимыми. Аккумуляция ионов Са+2 в матриксе митохондрий приводит к падению их мембранного потенциала митохондрий (Mattson M.P. et al., 1993). Значительное падение мембранного потенциала приводит к реверсу АТФ-синтетазы и истощению запаса АТФ в клетках (Brustovetsky N. et al., 2000). Излишнее поступление ионов Са+2 в митохондрии приводит к образованию поры неспецифической проницаемости и набуханию, что стимулирует активность компонентов дыхательной цепи (Belous A. et al., 2004), а это, в свою очередь, ведет к увеличению продукции АФК (Batandier C. et al., 2004; Budd S.L. et al., 1996). 45-минутная инкубация клеток в присутствие кальциевого ионофора А23187 и СаСl2 после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ), приводит к незначительному увеличению содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (рис.2). Можно предположить, что небольшое возрастание количества поврежденных клеток в результате ОС на фоне повышенного содержания ионов Са 2+ связано с тем, что Н2О2 –индуцированные процессы сами по себе инициируют ПОЛ, следствием которого является увеличение проницаемости мембран, в том числе и для ионов кальция. Добавление к среде инкубации СаCl2 или А23187 после инкубации с Н2О2 уже не вызывает достоверных изменений величины повреждения. Ионы Н+ Помимо того, что ионы Н+ играют важную роль в процессах внутриклеточной регуляции и реализации действия различных факторов (Литинская Л.Л., и др., 1987; Busa W.B., Nuccitelli R., 1984), изменение рН способствует также изменению физикохимических свойств мембран (Котык А., Яначек К., 1980; Пирутин С.К. и др., 2002). Дополнительным подтверждением этому служат и наши данные (рис.3), показывающие, что при изменении внеклеточного уровня рН и, как следствие – внутриклеточного, происходят выраженные изменения чувствительности перитонеальных макрофагов к повреждающему действию Н2О2. Было выявлено, что снижение рН инкубационной среды от величины 7,2 (в контроле) до величины 6,9 приводит к достоверному снижению повреждающего действия на макрофаги Н2О2 (около 20%). При этом повышение внеклеточного рН до величины 7,5 не сопровождается достоверным изменением Н2О2-индуцированного повреждения клеток. Следует отметить, что при снижении внеклеточного рН до 6,9 имело место постепенное уменьшение рНi, достигавшее к 25 мин инкубации величины около 0,3 ед. рН (рис.4). Подкисление внутриклеточного содержимого сопровождалось достоверным снижением повреждения, в то время как подщелачивание увеличивало его выраженность. Рис.3. Влияние изменения внутрии внеклеточного pH перитонеальных макрофагов на выраженность повреждающего действия на них Н2О2. Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в Содержание поврежденных клеток,% 120 100 * 80 60 40 20 0 К рН 6,9 рН 7,5 инкубации составляла 370. Смену стандартной среды инкубации (рН 7,2) на среду с рН 6,9 ( ) или 7,5 ( ) осуществляли сразу после их отмывки от Н2О2. Рис. 4. Влияние снижения рН среды инкубации на внутриклеточный рН макрофагов мышей По оси абсцисс - время от момента смены стандартной среды инкубации (рН 7.2) на таковую с рН 6.9, мин; по оси ординат изменение величины внутриклеточного рН макрофагов по сравнению с контролем (до смены среды) (ΔрНi). Инкубацию клеток проводили при 220С. Время , мин 0 5 25 -0,05 ΔрНi -0,1 -0,15 -0,2 -0,25 -0,3 * -0,35 Судя по имеющимся в литературе данным (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993; Penttila А., 1976), значительную роль в реализации этого явления может играть связанный со снижением рН переход структуры мембраны в состояние, более устойчивое к действию ПОЛ. Таким образом, внутриклеточный рН является важным фактором, несомненно, участвующим в реализации ответов клеток на действие различных агентов. Лекарственный препарат мексидол Добавление в среду инкубации клеток лекарственного препарата мексидола, приводит к снижению Н2О2–индуцированного повреждения примерно на 10% (1 мкг/мл) и 40% (10 мкг/мл). Судя по полученным результатам, величина наблюдаемого эффекта зависит от концентрации препарата и достоверно отличается от контроля лишь при его концентрации не менее 10 мкг/мл. Анализируя собственные данные и результаты других авторов (Дюмаев К.М. и др., 1995; Девяткина Т.А. и др., 1999), можно сделать предположение о том, что протекторное действие мексидола в условиях ОС может быть обусловлено его мембраностабилизирующим действием, являющимся мембран, изменением их фосфолипидного результатом угнетения ПОЛ состава и нормализацией функционирования мембраносвязанных ферментов. Защитное действие семакса при Н2О2-индуцированном повреждении плазматических мембран клеток Концентрация семакса Представленные на концентрационнозависимым рисунке образом 5 данные показывают, способен снижать что семакс выраженность повреждающего действия Н2О2 на перитонеальные макрофаги мышей. Защитный эффект пептида существенно возрастал при увеличении его концентрации от 0,1 до 10,0 мкг/мл, но уже не изменяется при переходе к концентрации 100 мкг/мл. Существенно, что при использовании вместо семакса его аналога защитное действие пептида практически исчезает. Это указывает на специфичность действия семакса, возможно, обусловленную реализацией его действия через связывание с соответствующим рецептором. Специфичность действия семакса была выявлена нами и при изучении действия Н2О2 на клетки-зерна мозжечка крыс. 120 Содержание поврежденных клеток, % * 110 100 * 90 80 * * 70 60 50 К 0,1 1 10 100 Концентрация пептида, мкг/мл Рис.5. Влияние семакса и его аналога на выраженность повреждающего действия Н2О2 на перитонеальные макрофаги мышей. По оси абсцисс - концентрация семакса ( ) и его аналога ( ), мкг/мл; по оси ординат – относительное содержание поврежденных клеток в популяции макрофагов через 45 мин после ОС, вызванного их 15-минутной инкубацией с Н2О2 (1мМ). За 100% принята величина исследуемого параметра в отсу соответствующих концентрациях добавляли к клеткам сразу после окончания их инкубации с Н2О2 и отмывки от нее. Поскольку наличие рецептора к семаксу на мембране макрофага пока не доказано, модель нерецепторного взаимодействия с клеткой представляется нам также интересной. Возможно, что исследуемый гептапептид реализует свои протекторные свойства за счет изменения физико-химических свойств плазматической мембраны как это способны делать его аналоги, фрагменты АКТГ (Hershkowitz M. et al., 1982; Verhallen P.F. et al., 1984; Van der Zee C.E. et al., 1989; Roux M. et al., 1997). Известно, что аналогичным эффектом обладают и сдвиги рН, инициирующие трансформацию мембран за счет изменения физико-химического состояния липидов (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993). В этой связи мы можем сделать предположение о том, что защитный эффект семакса может реализоваться через снижение им внутриклеточного рН макрофагов, влияющее на конформацию плазматических мембран клеток, увеличивая при этом их устойчивость к процессам ПОЛ. Иммуномодулирующий пептид тафцин Как оказалось, регуляторный пептид тафцин, имеющий в отличие от семакса иммуномодулирующую направленность действия и соответствующие рецепторы на поверхности макрофагов (Lipton J.M., 1997; Getting S.J. et al., 1999) также обладал способностью защищать эти клетки от Н2О2 – индуцированного повреждения. При этом аналог пептида (2ТФ-LPA) не только не обладал подобным защитным действием, но даже вызывал возрастание числа поврежденных клеток в популяции. Принимая во внимание наличие специфических центров связывания тафцина на плазматических мембранах макрофагов мышей (Lipton J.M., 1997; Getting S.J. et al., 1999), можно предположить, имммуномодулятор реализует что свои именно за защитные счет свойства связывания с исследуемый собственными рецепторами. Заслуживает внимание тот факт, что фрагмент Lys-Pro-Arg, трипептид, входящий в структуру тафцина, содержится также в таких высокоактивных нейропептидах, как субстанция Р, нейротензин, оказывающих разностороннее воздействие на регуляцию центральных функции (Gainer Ed.H., 1977). Гривенников и соавторы (1999) предполагают, что во взрослом организме тафцин способен выполнять функции нейротрофического фактора «общего» характера, например, при повреждении мозга и развитии компенсаторно-восстановительных процессов, так как иммуноглобулины G присутствуют не только в крови, но и в спинномозговой жидкости. Полученные в данной работе результаты позволяют предполагать, что один из возможных механизмов протекторного действия тафцина в условиях ОС включает связывание с находящимися на поверхности перитонеальных макрофагов рецепторами. Последовательность введения к клеткам Н2О2 и семакса Проведенные нами эксперименты показали что, 45-минутная инкубация культивируемых клеток гиппокампа в растворе Хенкса после окончания 15-минутной инкубации с Н2О2 (0,5 мМ) приводила к накоплению в культуре до 50% поврежденных клеток. В аналогичных условиях в культуре клеток септума накапливалось до 70% поврежденных клеток, указывая на большую чувствительность последних к Н2О2 по сравнению с гиппокампальными культурами. Использование Н2О2 в концентрации 1мМ приводило к повреждению до 90% клеток септума. Добавление семакса (10 мкг/мл) к культурам гиппокампа и септума сразу после окончания инкубации с Н2О2 незначительно увеличивало жизнеспособность клеток. Как оказалось однократное внесение семакса (10 мкг/мл) в среду культивирования за 24 часа до ОС существенно снижало количество поврежденных клеток, как в популяции культивированных клеток гиппокампа так и в популяции культивированных клеток септума. Сопоставление данных представленных на рис. 6 20 15 10 % Защитный эффект, % 25 5 0 после ОС до ОС Рис.6. Выраженность защитного действия семакса при различной последовательности введения пептида и Н2О2 к клеткам. Данные представлены в виде разницы между величиной МТТ-теста в клетках, подвергнутых действию Н2О2 в присутствии и отсутствии семакса (10 мкг/мл), (защитный эффект семакса, Δ%). Семакс добавляли к культивируемым клеткам гиппокампа ( ) и септума ( ) либо на 45 мин после ОС, вызванного 15-минутной инкубацией с Н2О2, либо за 24 часа до ОС. показывает, что защитное действие семакса от Н2О2-индуцированного повреждения мембран клеток гиппокампа и септума оказывается несколько более выраженным при его введении к клеткам за 24 часа до инициирования ОС. Можно предположить, что Н2О2-индуцированное повреждение клеток может быть опосредовано образованием NO, влекущее за собой усиление входа ионов Са+2 и последующую активацию NOсинтетаз, вызывающие деградацию клеток (Snyder et al., 1992). Взаимодействуя с супероксидом, NO образует пероксинитриты, разрушающие липиды клетки. В работе Шадриной М.И. (2001) показано, что семакс достоверно снижает уровень NO в коре мозга крысы при неполной глобальной ишемии. Данный факт может указывать на способность семакса влиять на ОС, опосредуемый NO. Мы попытались также сопоставить выраженность защитного эффекта семакса от Н2О2–индуцированного повреждения на культивируемых клетках септума и гиппокампа. Как показали результаты, между ними не наблюдалось существенных различий в величине исследуемого параметра. При этом эффект защиты был достоверно более выражен (р<0.05) при предварительном (за 24 ч до ОС) введении пептида к культурам септума и гиппокампа (при введении Н2О2 0,5мМ 36 и 17,54%, соответственно). Основываясь на данных Гривенникова И.А. и Долотова О.В. (2004) можно предположить, что наблюдавшийся нами защитный эффект семакса может быть обусловлен также увеличением уровня экспрессии таких нейротрофических факторов как NGF, BDNF имеющих выраженные нейропротекторные свойства. Возможно, что суточная инкубация семакса (10 мкг/мл) с культивируемыми клетками септума и гиппокампа способствует образованию более высокого уровня нейротрофинов, чем при 45 мин инкубации нервных культур с пептидом. Соответственно, защитный эффект при суточной инкубации с семаксом оказался более выраженным, чем при его 45 мин инкубации. В работе Сторожевых Т.П. и соавторов (2007) было показано, что семакс увеличивает выживаемость культивируемых зернистых клеток мозжечка, замедляя при этом развитие кальциевой дизрегуляции и изменяя митохондриальный потенциал. Основываясь на приведенных данных, можно сделать еще одно предположение о нейропротекторном действии семакса. Вероятно, одно из возможных объяснений нейропротекторного действия семакса в может заключаться в способности гептапептида оказывать влияние на кальциевый гомеостаз и функциональное состояние митохондрий. Ионы Са2+ Внесение семакса после 15 мин инкубации с Н2О2 приводило к снижению уровня повреждения ~на 30% (рис.2). Несколько менее выраженное уменьшение повреждения наблюдалось при одновременном введении к клеткам А23187 и семакса (на 18%), тогда как не наблюдалось достоверного снижения повреждения при введении пептида в присутствии Са+2. Основываясь на этих данных, можно предположить, защитный эффект семакса от повреждающего действия Н2О2 может быть связан с переходом клеточной мембраны к более стабильному состоянию за счет снижения мембранного потенциала, в то время как ПОЛ способствует его росту (Пучкова Т.В. и др., 1983; Сторожевых Т.В., 2007). Снижение защитного эффекта семакса в присутствие Са2+ или ионофора А23187 может быть связано с нарушением механизмов, лежащих в основе формирования протекторного действия семакса, а именно с его способностью влиять на кальциевый гомеостаз, митохондриальный потенциал клеток (Сторожевых Т.В., 2007) и на структуру плазматических мембран клеток. Повреждение клеточных мембран, вызванное ультрафиолетовым облучением Данные, представленные на рис.7 (1) показывают, что через 15 мин после окончания УФ-облучения в популяции макрофагов наблюдалось дозозависимое возрастание относительного содержания клеток с поврежденной плазматической мембраной, достигавшего при 12 Дж/см2 величины 90%. Увеличение времени инкубации клеток после облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 от 15 до 60 мин приводило к значительному возрастанию (в 2-3 раза) числа поврежденных клеток (рис. 7, 2). Величина этого эффекта существенно снижалась при введении в среду инкубации клеток сразу после окончания облучения семакса в концентрации 100 мкг/мл (рис. 7, 3). В тоже время, его аналог в тех же условиях практически не снижал выраженности повреждающего действия (рис. 7, 4). Существенное возрастание числа поврежденных клеток в ходе 60-минутной инкубации макрофагов уже после окончания облучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 обусловлено развитием в этих «темновых» условиях перекисных процессов, инициированных в период освещения. Отсутствие этого эффекта после облучения клеток в дозе 4 Дж/см2 связано, вероятно, с недостаточностью для развития процессов цепного перекисного окисления содержания липидных перекисей и достаточно высокой активностью систем антиоксидантной защиты в макрофагах. Отсутствие развития повреждений после облучения клеток в дозе 12 Дж/см 2 обусловлено тем, что в этих условиях уже через 15 мин после окончания облучения практически все клетки в препарате макрофагов оказываются поврежденными. Отсутствие защитного эффекта семакса после облучения клеток в дозе 12 Дж/см 2 позволяет предположить, что его протекторное действие в период после УФоблучения в дозах 5 и 6 Дж/см2 связано со способностью пептида предотвращать развитие мембранных повреждений (но не восстанавливать уже поврежденные мембраны), наиболее вероятно, за счет снижения активности процессов ПОЛ. Не исключено также участие в этих событиях ферментных систем антиоксидантной защиты макрофагов, а также изменений в Са2+-обменных реакциях клеток-фагоцитов, обнаруженных при действии семакса (Асташкин Е.И. и др., 2000). Полученные нами Содержание поврежденных клеток, % 120 100 80 15 мин 4 60 семакс 2 40 60 мин (контроль) аналог семакса 3 20 1 0 4,0 5,0 6,0 12,0 доза УФ-излучения, Дж/см2 Рис. 7. Влияние регуляторного пептида семакса и его аналога на выраженность повреждающего действия УФ-излучения на перитонеальные макрофаги мышей. По оси абсцисс – дозы УФ-излучения (Дж/см2); по оси ординат – относительное содержание клеток с поврежденной плазматической мембраной (%). Подсчет числа поврежденных клеток в препаратах проводили через 15 мин после окончания их облучения (1), а также через 60 мин после окончания облучения как в отсутствие добавок (2), так и в присутствии семакса (3) или его аналога (4). данные показали также, что защитный эффект семакса был специфичен, поскольку он не наблюдался при использовании в тех же условиях его аналога. Реализация уф-излучения связана с процессами ПОЛ. Результаты наших экспериментов (рис.5, 7,) показали, что семакс способен влиять на развитие ПОЛ, снижая при этом количество поврежденных клеток в популяции. Основываясь на сведениях из литературных источников и собственных результатах, можно предположить, что протекторные эффекты семакса могут быть реализованы за счет нерецепторного взаимодействия с клеткой, а именно, за счет его способности напрямую влиять на химический состав мембран, изменяя при этом их физикохимические свойства. Влияние семакса на некоторые функционально–метаболические параметры клеток. Внутриклеточный рН Как известно (Литинская Л.Л. и др., 1987; Busa W.B., Nuccitelli R., 1984) внутриклеточный рН играет существенную роль в регуляции клеточных функций и, следовательно, в формировании ответа клетки на действие биологически активных факторов внешней среды. При этом в литературе имеются указания на то, что увеличение концентрации ионов водорода может повышать устойчивость плазматических мембран к действию ряда повреждающих агентов (Пирутин С.К. и др., 2002). Важно отметить, что сдвиги рН инициируют трансформацию мембран за счет изменения физико-химического состояния липидов (Рощупкин Д.И., Мурина М.А., 1993). В этой связи мы рассмотрели предположение о том, что защитный эффект семакса может реализоваться через снижение им внутриклеточного рН макрофагов. Действительно, инкубация перитонеальных макрофагов (рис.8) и нервных клеток с семаксом, в условиях, при которых наблюдается снижение им повреждающего действия Н2О2 на мембраны клеток, сопровождается снижением их внутриклеточного рН. Повышение устойчивости клеток к повреждающему действию ОС мы наблюдали также и при снижении рН в среде инкубации клеток, которое также приводило к снижению их внутриклеточного рН. При подщелачивании подобный эффект не наблюдался. Следует обратить внимание также и на отсутствие эффекта снижения рНi при инкубации обоих типов клеток с аналогом семакса, который не обладал также и защитным эффектом при Н2О2-индуцированном повреждении клеточных мембран. Это является дополнительным указанием на роль ионов Н+ в клеточных эффектах семакса. Полученные нами данные позволяют предположить возможность участия ионов водорода в реализации защитного действия семакса на клетки. Кроме того, эффект снижения рНi при действии пептида является, по-видимому, общим для разных типов клеток (по крайней мере, для макрофагов, клеток септума и клеток-зерен мозжечка), а также специфичным, поскольку аналог пептида не вызывал внутриклеточного подкисления. Как видно из данных представленных на рисунке 8, 20-минутная инкубация перитонеальных макрофагов с семаксом приводит к подкислению их внутриклеточного содержимого. При этом увеличение концентрации пептида от 0,1 0,05 0 0,1 1 10 100 -0,05 ΔpHi -0,1 -0,15 -0,2 * -0,25 * -0,3 Концентрация пептида, мкг /мл Рис.8. Концентрационная зависимость влияния семакса и его аналога на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей. По оси абсцисс - концентрация семакса ( ) и его аналога ( ), мкг/мл; по оси ординат – изменение величины внутриклеточного рН макрофагов по сравнению с контролем (до введения пептида), ΔрНi. Инкубацию клеток с агентом проводили при температуре 220C в течение 20 мин. до 100 мкг/мл приводит к существенному уменьшению рНi. Изменение рНi не наблюдалось при замене семакса на его аналог, что указывает на специфичность наблюдаемого эффекта. Сходным образом действовали семакс и его аналог (10 мкг/мл) и на клетки септума и клетки-зерена мозжечка крыс (рис.9). 20-минутная инкубация клеток с пептидом приводила к подкислению их внутриклеточного содержимого. В то же время, аналог семакса либо не вызывал достоверных изменений рНi (в случае клеток септума), либо даже увеличивал его (в случае клеток0,3 0,2 0,1 ΔрНi 0 -0,1 -0,2 -0,3 семакс аналог семакса -0,4 Рис.9. Влияние семакса и его неактивного аналога на внутриклеточный рН культивируемых клеток септума и клетокзерен мозжечка. Данные представлены в виде изменения величины внутриклеточного рН культивируемых клетокклеток септума ( ) по сравнению с контролем (до введения пептида), (ΔрНi). Инкубацию с семаксом или его неактивным аналогом (10 мкг/мл) проводили при температуре 220C в течение 20 мин. зерен мозжечка) по сравнению с контролем. Базируясь на данных о наличии у семакса в концентрации 10 мкг/мл выраженной способности защищать макрофаги от повреждающего действия Н2О2, мы изучили временную зависимость изменения рНi перитонеальных макрофагов мышей при действии пептида в этой концентрации. Было выявлено, что уже через 5 мин инкубации клеток с пептидом наблюдается достаточно выраженное уменьшение величины внутриклеточного рН (на 0,13±0,01 ед.рН). Снижение рНi продолжается, достигая к 25-ой мин величины 0,18±0,01 ед.рН. Таким образом, основываясь на вышеперечисленных фактах, мы можем сделать предположение, что протекторные свойства семакса могут реализовываться за счет снижения уровня внутриклеточного рН. Образование в макрофагах активных форм кислорода Полученные данные о влиянии семакса на образование активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах были сопоставлены с их реакцией на классический иммуномодулирующий регуляторный пептид тафцин, обладающим выраженным фагоцитстимулирующим действием. Было показано, что действие обоих пептидов приводит к возрастанию величины НСТ-теста, причем, ответ клеток на действие семакса оказывается несколько более выраженным. При этом эффективность совместного действия тафцина и семакса практически не отличается от такового одного семакса, что, по-видимому, можно рассматривать как указание на то, что реализация наблюдаемого эффекта у обоих пептидов идет по сходному пути. Полученные результаты можно расценить как указание на повышение внутриклеточных метаболических процессов в клетках фагоцитах при действии исследованных регуляторных пептидов. Дегидрогеназная активность митохондрий в клетке В наших экспериментальных условиях МТТ-тест можно, по-видимому, рассматривать и как параметр, позволяющий оценить уровень дегидрогеназной активности клеток. Это связано с тем, что используемые в опытах культуры клеток септума и гиппокампа содержали очень небольшое количество глиальных клеток и находились в бессывороточной нейробазальной среде с добавкой В-27 в течение опытов, что исключало возможность индукции процессов пролиферации клеток. Известно также, что семакс не увеличивает пролиферацию нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы (Сафарова Э.Р. и др., 2003). В этом случае полученные результаты указывают на то, что действие семакса на клетки приводит к возрастанию их дегидрогеназной активности примерно в одинаковой степени для обоих типов клеток. Выявлено, что повышение дегидрогеназной активности при действии семакса оказывается более выраженным при его введении за 24 ч до ОС примерно на 18 и 36%, соответственно (рис.10). Рис.10. Влияние семакса на уровень дегидрогеназной активности культивируемых клеток гиппокампа и септума. По оси абсцисс – время инкубации 40 30 20 10 0 % Оптическая плотность, Δ % 50 -10 -20 45 мин 24 часа септума ( ) с семаксом (10 мкг/мл). По оси ординат – разница между величиной МТТтеста в клетках, инкубировавшихся с семаксом и без него (Δ%). Судя по полученным нами результатам при 24 часовой инкубации обоих типов клеток с семаксом (10 мкг/мл) происходит достоверное возрастание дегидрогеназной активности клеток по сравнению с контролем, достоверно более выраженное для клеток септума. В то же время подобный эффект не наблюдался при 45 минутной инкубации клеток. Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы Долотова О.В., (2004), в которой семакс максимально увеличивал экспрессию нейротрофинов мРНК NGF и BDNF в несколько раз через 40-60 мин в культивируемых клетках гиппокампа, базальных ядрах переднего мозга и в их глие. Увеличение на 40% по сравнению с контролем наблюдалось через сутки в гиппокампе. Возможно также, что семакс реализует свои протекторные свойства за счет влияния на кальциевый гомеостаз и митохондриальный потенциал (Сторожевых Т.В., 2007). Анализ литературных данных, а также наши собственные результаты, позволяют с известной долей осторожности сделать вывод о том, что семакс может повышать энергетический уровень и функционально-метаболическую активность клеток, подвергнутых воздействию ОС. Заключение Полученные в данной работе результаты позволяют предполагать, что один из возможных механизмов реализации протекторного действия семакса может осуществляться за счет изменения физико-химических свойств плазматической мембраны через снижение им внутриклеточного рН перитонеальных макрофагов мышей, культивируемых клеток септума, гиппокампа, а также клеток-зерен мозжечка, влияющего на конформацию плазматических мембран клеток, увеличивая при этом их устойчивость к процессам ПОЛ. Кроме того, вероятно, что другое из возможных объяснений нейропротекторного действия семакса может заключаться в способности гептапептида оказывать влияние на кальциевый гомеостаз и функциональное состояние митохондрий. Наши собственные результаты, позволяют с известной долей осторожности сделать вывод о том, что семакс может повышать энергетический уровень и функционально-метаболическую активность клеток, а именно - увеличивать устойчивость митохондрий к окислительному и кальциевому стрессу. В связи с этим мы считаем, что полученные в работе данные могут быть использованы для дальнейшего изучения протекторых свойств семакса. Основные выводы: 1. Инкубация клеток с Н2О2 в концентрациях, превышающих 100 мкМ вызывает увеличение содержания в популяции макрофагов клеток с поврежденной плазматической мембраной. 2. Снижение рН инкубационной среды от величины 7,2 (в контроле) до величины 6,9 приводит к достоверному снижению выраженности повреждающего действия на макрофаги Н2О2. 3. Семакс дозозависимым образом способен снижать выраженность повреждающего действия Н2О2 на перитонеальные макрофаги мышей и нервные клетки крыс (культивируемые клетки септума, гиппокампа и клеток-зерен мозжечка). 4. Семакс (в отличие от его аналога) способен защищать изолированные перитонеальные макрофаги мышей от развития повреждения в их плазматических мембанах в результате часовой инкубации клеток после УФ-облучения. 5. Инкубация семакса с перитонеальными макрофагами, культивируемыми клетками септума и клетками-зернами мозжечка крыс приводила к подкислению их внутриклеточного содержимого. 6. Семакс способен повышать уровень функционально-метаболической активности перитонеальных макрофагов и культивируемых нервных клеток. Список публикаций: 1) Odgaeva A.V., Pirutin S.K., Turovetsky V.B., Kamensky A.A. Effect of semax peptide on survival of murine peritoneal macrophages during exposure to middle-wave ultraviolet radiation.//4-th International Workshop on Space Radiation Research and 17-th Annual NASA Space Radiation Health Investigators’ Workshop. Moscow – St. - Petersburg, 2006, P.90. 2) Odgaeva A.V., Pirutin S.K., Turovetsky V.B., Kamensky A.A. Effect of neuropeptide drug semax on intracellular pH of cultured cerebellar granule cells. // Workshop on 10-th Jubilee Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry “Stress and Behavior”. St. Petersburg, Russia 2007, P.77-78. 3) Одгаева А.В. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов при действии разных доз гептапептида семакс при окислительном стрессе. // Сб. тезисов Х Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная и клиническая медицина». Санкт-Петербург, 2007, С.322 4) Одгаева А.В., Туровецкий В.Б., Каменский А.А. Влияние семакса на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов. // Сб. тезисов ХХ Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007, С.360. 5) Одгаева А.В., Туровецкий В.Б., Каменский А.А. Влияние тафцина на выживаемость перитонеальных макрофагов мышей при окислительном стрессе. // Сб. тезисов ХХ Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007, С.360. 6) Одгаева А.В. Влияние рН среды инкубации на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей и их выживаемость при окислительном стрессе.// Сб. тезисов Международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 2007, С.188. 7) Одгаева А.В., Туровецкий В.Б., Каменский А.А. Повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей при действии Н2О2. // Вестник МГУ серия 16. биология. 2007, №4, C. 20-21. 8) Одгаева А.В. Влияние гептапептида семакс на выживаемость перитонеальных макрофагов мышей при окислительном стрессе. // Сб. тезисов Международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2006». Москва, 2006, С. 173. 9) Одгаева А.В., Исаев Н.К., Туровецкий В.Б., Каменский А.А. Нейропротекторное действие гептапептида семакс при Н2О2-индуцированном повреждении клеток в культурах гиппокампа и септума крыс линии Вистар. // Сб. статей конференции "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга". Москва, 2007, C. 458-462. 10) Пирутин С.К., Туровецкий В.Б., Одгаева А.В., Каменский А.А. Влияние пептида семакса на индуцированное уф-излучением повреждение плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей.// Вестник МГУ серия 16. биология. – 2007, №3, C. 3-7. 11) Одгаева А.В. Действие семакса и его аналога на культуру клеток-зерен мозжечка крыс линии Вистар при окислительном стрессе. // Сб. тезисов Х Всероссийской медикобиологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная и клиническая медицина». Санкт-Петербург, 2007, С.324.
