На правах рукописи АТРОШКИН Кирилл Андреевич
реклама
На правах рукописи АТРОШКИН Кирилл Андреевич Изучение механизмов сочетанного влияния гестагенов и доксорубицина на клетки опухолевых линий HeLa и MCF-7 14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2009 г. Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Шимановский Николай Львович Официальные оппоненты: Д.м.н., профессор Козлов Иван Генрихович, Д.м.н., профессор Яворский Александр Николаевич Ведущая организация: Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН Защита состоится «12» мая 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул.Островитянова, д.1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, г. Москва, ул.Островитянова, д.1 Автореферат разослан «27» марта 2009 года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Джанашия Платон Харитонович 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. В настоящее время химиотерапия становится важнейшим, а в некоторых случаях основным методом лечения при злокачественных новообразованиях. В лечении злокачественных новообразований используют как цитостатические средства, так и гормонотерапию, и выбор между ними не всегда очевиден. Применение химиотерапевтических средств сопряжено с развитием побочных эффектов, в некоторых случаях требующих снижения дозы или полной отмены препарата. Побочные эффекты системной химиотерапии существенно снижают качество жизни пациентов, зачастую становясь причиной прекращения курса терапии. Токсическое действие цитостатических агентов на организм проявляется в первую очередь воздействиями на костномозговое кроветворение, клетки иммунной системы и функции желудочно-кишечного тракта, а также, в некоторых случаях, вторичной канцерогенностью. Снижение дозы препарата, в свою очередь, может приводить к неэффективности лечения. Однако, несмотря на то, что раковые клетки отличает менее дифференцированная морфология, известно, что большая часть новообразований, проистекающих из гормонозависимых тканей, сохраняет рецепторный аппарат, а в некоторых случаях количество рецепторов в опухолевой ткани даже увеличивается. Этот факт может быть использован для разработки новых схем лечения пациентов с гормонзависимыми опухолями с использованием гормонов [Hassett et al., 2005]. Важность исследования новых синтетических гестагенов как потенциальных химиосенсибилизаторов связана с тем, что гестагенные препараты могут применяться и как самостоятельные препараты в лечении гормонзависимых опухолей. В научной литературе представлены данные, отражающие потенциальную способность гестагенов к сенсибилизации опухолевых клеток в отношении некоторых химиотерапевтических средств. Тем не менее, механизмы этого процесса в настоящее время изучены недостаточно. Предполагается, что сенсибилизирующий эффект может достигаться за счет действия гестагенов на экспрессию факторов, регулирующих пролиферацию, апоптоз и дифференцировку клеток [BritonJones et al., 2006; Li X, 2003]. В современной клинической практике для лечения рака матки, рака молочной железы и яичников в качестве дополнительной или паллиативной терапии используются 17-оксипрогестерона капронат, медроксипрогестерона ацетат (МПА) и другие, по химической структуре являющиеся производным прогестерона. В настоящее время в России активно ведется поиск новых эффективных гестагенов, в частности, В.М. Ржезниковым с сотр., ФГУ Эндокринологический научный центр РАМН синтезирован новый 3 оригинальный отечественный гестаген АБМП (17-альфа-ацетокси-3-бетабутаноилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он) [Сергеев П.В. и соавт., 2007]. В проведенных ранее исследованиях обнаружена высокая специфическая гестагенная активность, химическая стабильность, отсутствие значимой андрогенной и эстрогенной активности АБМП. АБМП не вызывает гибели животных даже при использовании в дозах, превышающих эффективные в сотни раз. Низкая токсичность препарата в высоких дозах служит основанием для их клинического изучения как противоопухолевых и химиосенсибилизирующих средств. Настоящая работа посвящена исследованию АБМП в сравнении с прогестероном, МПА и левоноргестрелом (ЛНГ), как потенциальных противоопухолевых и химиосенсибилизирующих веществ, а также изучению молекулярных механизмов действия перечисленных гестагенов на клеткимишени. Цель исследования: исследование свойств гестагенов как цитостатических средств и модуляторов сенсибилизации опухолевых клеток к химиотерапии, а также выявление молекулярных механизмов действия гестагенов на пролиферацию клеток-мишеней. Задачи исследования: 1). Исследовать дозовую и временную зависимость действия гестагенов на апоптоз клеток-мишеней в клеточной культуре непосредственно и в сочетании с доксорубицином. 2). Оценить влияние гестагенов на уровень экспрессии фактора bcl-2 как ключевого фактора, участвующего в регуляции роста и апоптоза. 3). Отобрать наиболее эффективные соединения и сочетания соединений на основании полученных данных. Научная новизна работы. Впервые с помощью современных молекулярнобиологических методов изучены молекулярные механизмы синергизма в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина (химиосенсибилизации) на модели клеточной культуры рака молочной железы человека MCF-7 и аденокарциномы шейки матки HeLa. Показано, что возможные механизмы, обусловливающие синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина в клетках MCF-7 и HeLa связаны с изменением активности каспазы 3 при отсутсвии значимого влияния на уровень фактора bcl-2. Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты обосновывают целесообразность клинического изучения новых отечественных гестагенов в качестве противоопухолевых средств и химиосенсибилизаторов для использования в комбинации с химиотерапевтическими средствами. 4 Внедрение в практику. Результаты исследования и ряд примененных в работе методов внедрены в процесс обучения студентов на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ РГМУ. Положения, выносимые на защиту. 1. Прогестагены являются модуляторами цитостатического эффекта химиотерапевтических средств, способствуя значительному усилению эффекта последних при применении in vitro. 2. Комбинация прогестагенов и широко используемых химиотерапевтических средств (таких, как антрациклиновые антибиотики), с более высокой результативностью обеспечивает подавление роста опухолевых клеток культур гормонозависимых опухолей (рака молочной железы и рака шейки матки), чем применение каждого из этих веществ в отдельности. 3. При использовании комбинации гестагенов и химиотерапевтических средств наблюдается активация системы каспаз, ответственных за реализацию клеточного апоптоза. Апробация работы. Официальная апробация работы состоялась на совместной конференции сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и кафедры экспериментальной и теоретической физики медикобиологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Материалы диссертации представлены на IX Пироговской студенческой научной конференции молодых ученых (2005), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию методов исследования, изложению результатов работы и их обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 124 источника. Работа изложена на 126 страницах, иллюстрирована 20 рисунками, 10 таблицами и 3 схемами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования. В исследованиях использовали клеточные культуры HеLа (эпителиоидный рак шейки матки человека), MCF-7 (рак молочной железы человека). Культивирование клеток осуществлялось в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). Клетки инкубировали при 37º С в условиях 5% СО2 при относительной влажности воздуха 95%. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотика гентамицина сульфата концентрации 40 мкг/мл. 5 Влияние гестагенов: прогестерона ("Sigma", США), левоноргестрела ("Sigma", США), медроксипрогестерона ацетата ("Sigma", США), а также нового прогестагена 17-α-ацетокси-3-β-бутаноилокси-6-метилпрегна-4,6-диен-20-она (АБМП, синтезирован в ЭНЦ и ОНЦ РАМН Ржезниковым В.М. с сотр. [Сергеев П.В, и соавт, 2005])и доксорубицина (Верофарм, Россия) на жизнеспособность чувствительных и резистентных опухолевых клеток оценивалось методом МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5дифенилтетразолий бромистый) – теста. Метод МТТ позволяет оценить жизнеспособность клеток по их метаболической активности, так как только дегидрогеназы живых и метаболически активных клеток способны превращать бледно-желтый водорастворимый МТТ в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде [Mealey et al., 2002]. Оценку экспрессии онкобелка bcl-2 в клетках осуществляли методом иммуногистохимического окрашивания. Метод иммуногистохимического окрашивания образцов основан на связывании первичных моноклональных антител с онкобелком bcl-2 и последующим присоединением вторичных антител, меченых флуоресцеином. Количество онкопротеина в образце оценивали на флуоресцентном микроскопе методом флуориметрии с использованием программного обеспечения ImageProPlus 5.0 (MediaCybernetics, США). Оценку апоптоза на основании активности специфических ферментов проводили методом колориметрического измерения активности каспазы-3 при помощи набора реагентов (Promega, США), по методике изготовителя. Измерение активности каспазы-3 основано на расщеплении субстрата, меченого хромофором, под действием активной каспазы-3 и высвобождении хромофора, который окрашивает среду в желтый цвет. Окрашивание регистрировали с помощью спектрофотометра (Shimadsu, Япония) при длине волны λ=405 нм. Количество свободного красителя, и, соответственно, интенсивность окрашивания пропорциональны активности каспазы в исследуемом образце. Повышение активности каспазы свидетельствует об индукции процесса апоптоза в исследуемых клетках. Выделение ДНК из образца проводили по методике экстракции смесью фенол-хлороформ [Maniatis T, 1989], для получения экстракта ДНК, пригодного для электрофоретического исследования. Для оценки апоптоза в культуре клеток использовали электрофорез экстракта геномной ДНК культуры клеток в агарозном геле и флуориметрическую оценку соотношения фрагментированной/ высокомолекулярной ДНК [Daniel et al, 1999]. Электрофорез ДНК в агарозном геле проводили по стандартной методике (Maniatis T, 1989). Регистрацию флуоресценции проводили на установке “Vilber Lourmat”, США с использованием оптической системы производства “Nikon”, Германия. Последующую оценку электрофореграммы проводили с использованием программного обеспечения Image Pro Plus, (“Media Cybernetics”, США). В качестве первично измеряемого параметра в работе использовали интенсивность флуоресценции бромистого этидия при 6 возбуждении УФ-излучением с λmax=254нм. В качестве оценочного параметра для определения степени апоптоза в культуре использовали коэффициент, отображающий соотношение областей нормализованной по площади и по средней величине интенсивности флуоресценции сильно и слабо фрагментированной ДНК. Статистическую достоверность результатов оценивали с помощью непараметрического рангового критерия Т – критерия Уилкоксона (Манна-Уитни) для уровня значимости = 5% и Т – критерия Стьюдента для уровня значимости = 0,1 -5%. Различия считались достоверными при уровне статистической значимости p<0,05. Результаты исследования и их обсуждение. При исследовании влияния АБМП и веществ сравнения (левоноргестрел, МПА, прогестерон) на жизнеспособность опухолевых клеток гормончувствительных клеточных культур MCF-7 и HeLa был выявлен их цитостатический эффект - подавление жизнеспособности клеток. При инкубации в течение 7 суток для всех изучаемых гестагенов наблюдали выраженную концентрационную зависимость цитостатического действия на опухолевые клетки. АБМП в концентрации 10-6М демонстрировал более выраженное подавление жизнеспособности клеток по сравнению с прогестероном (р<0.05). Полученные результаты согласуются и дополняют результаты, полученные ранее на нашей кафедре [Т. Федотчева и соавт., 2003 г.]. Для изучения механизмов цитостатической активности было исследовано влияние АБМП и веществ сравнения на жизнеспособность клеток, оцененную по методике МТТ-теста. Кроме того, было исследовано действие гестагенов на жизнеспособность клеток в комбинации с антрациклиновым антибиотиком (доксорубицин). Жизнеспособность клеток рака молочной железы линии MCF-7 при инкубации с гестагенами оценивали с помощью МТТ теста. Для проведения опыта клетки аденокарциномы шейки матки линии MCF-7 инкубировали с гестагенами в течение 72 часов. В качестве контроля использовали клетки той же линии, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствие исследуемых соединений. Табл. 1. Подавление жизнеспособности клеток культуры MCF-7 при инкубации с гестагенами в течение 72 часов. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0. Результаты представлены в виде М±SD, где M – среднее значение, SD – стандартная ошибка среднего. 7 Соединение Концентрация 10-4М 10-5М 10-6М 10-8М АБМП 49,67±17,7* 25,1±7,2 24,30±5,3* 10,33±4,1 МПА 33,09±3,8* 10,45±4,1 10,1±0,8 10,05±1,0 ЛГ 28,85±3,1* 11,1±3,8 12,09±0,4 8,85±0,8 ПГ 45,77±10,7* 42,32±5,5* 21,82±1,9* 9,41±5,7 Примечание: *- достоверные отличия от контроля, р<0.05. Согласно полученным данным, АБМП подавлял рост клеток в культуре MCF-7, причем для концентрации 10-4 М этот эффект был более выражен для АБМП, нежели для веществ сравнения. В концентрации 10-4 моль/л подавление жизнеспособности при инкубации с АБМП в течение 72 часов составило около 50%, 45% для прогестерона, 33% для МПА и менее 30% для левоноргестрела. Подавление жизнеспособности клеток линии аденокарциномы шейки матки HeLa при инкубации с гестагенами оценивали с помощью МТТ теста. Для проведения опыта клетки линии аденокарциномы шейки матки HeLa инкубировали с гестагенами в течение 72 часов. В качестве контроля использовали клетки той же линии, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствие исследуемых соединений (табл.2). Табл. 2. Подавление жизнеспособности клеток линии HeLa при инкубации с гестагенами в течение 72 часов. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. Результаты представлены в виде М± SD, где M – среднее значение выборки, SD – стандартная ошибка среднего. Соединение Концентрация 10-6М 10-8М АБМП 35,58±1,8** 27,1±4,3* МПА 31,18±1,02* 18,8±0,8 ЛГ 50,18±5,5* 18,4±2,3 Примечание: *- достоверные отличия от контроля, р<0.05. **достоверные отличия от контроля, р<0.001. 8 Было показано, что АБМП не уступает по цитотоксической активности МПА Подавление жизнеспособности клеток рака молочной железы линии MCF-7 при инкубации с доксорубицином и гестагенами также оценивали с помощью МТТ теста. Концентрация доксорубицина была одинаковой и составляла 10-5М, время инкубации с цитостатиком составляло 24 часа, поскольку при данной дозе и времени действия доксорубицин в отдельности достоверно не подавляет жизнеспособность клеток исследованных опухолевых линий. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствии как цитостатика, так и гестагенов. Полученные данные представлены в таблице 3. Табл. 3. Подавление жизнеспособности клеток линии MCF-7 при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов при добавлении доксорубицина в последние 24 часа инкубации. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. Результаты представлены в виде М±SD, где M – среднее значение выборки, SD – стандартная ошибка среднего. Соединение Концентрация соединений - - АБМП 10-4М 10-6М 10-4М 10-6М 10-8М 10-4М 10-6М 10-8М МПА ЛГ Доксорубицин 10-5М 18,79+2,3* 52,48+4,0* 40,72+4,3* 52,35+6,9* 35,78+2,5* 30,26+1,7* 39,86+5,7* 34,66+1,7* 27,68+3,0* Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05. Показано, что сочетание АБМП с доксорубицином в значительно большей степени приводило к угнетению пролиферации клеток линии рака молочной железы линии MCF-7 по сравнению с доксорубицином, а также и при сочетании доксорубицина с другими гестагенами. Так, при сочетании АБМП в концентрации 10-6М и доксорубицина в концентрации 10 -5М подавление жизнеспособности составляло более 40%, а при инкубации клеток только с цитостатиком в той же концентрации - не более 20 %. 9 Таким образом, сочетание АБМП с доксорубицином приводило к более эффективному угнетению пролиферации клеток этой линии. При проведении аналогичных экспериментов с клетками HeLa в присутствии доксорубицина и гестагенов были получены данные, представленные в таблице 4. Табл. 4. Подавление жизнеспособности клеток линии HeLa при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов. Значения в клетках таблицы – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. Результаты представлены в виде М±SD, где M – среднее значение выборки, SD – стандартная ошибка среднего. Соединение Концентрация Доксорубицин 10-5М - - 18,00±4,8 АБМП 10-6М 57,31±8,4* 10-8М 50,45±10,5* 10-6М 35,94±13,5 10-8М 27,78±3,1 10-6М 42,85±10,9* 10-8М 27,1±6,3 МПА ЛГ Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05. На основании полученных данных были построены следующие диаграммы (рис. 1,2): Рис. 1. Подавление жизнеспособности клеток линии MCF-7 при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов. Значения по оси ординат – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. 10 * 45 40 * * 35 * 30 * * 10-5М Доксорубицин 10-6М 10-8М * 25 * 20 15 10 5 Д ок ox ox D ЛГ + П А + А Б М М П со ру + би D н ци П Г ЛГ П А М А Б D ox 0 М П Подавление жизнеспособности, % по отношению к контролю 50 Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05. 70 ** 60 ♦* * 50 * * 40 * * 10-5М Доксорубицин 10-6М 10-8М * 30 20 10 ox D + + А М П ЛГ D ox ox D + Д А ок с БМ П ор уб иц и н ЛГ М П БМ А А 0 П Подавление жизнеспособности, % по отношению к контролю Рис. 2. Подавление жизнеспособности клеток линии HeLa при инкубации с доксорубицином и гестагенами в течение 72 часов. Значения по оси ординат – уровень подавления жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста, значения для контрольных образцов приняты за 0%. Примечание: *- достоверные отличия от контроля, р<0.05. **- достоверные отличия от контроля, р<0.001. ♦ - достоверные отличия по отношению к веществам сравнения, р<0.05. 11 Подавление жизнеспособности в целом было более выражено в случае клеток линии HeLa, по сравнению с клетками линии MCF-7. Приведенные данные показывают, что сочетание АБМП и доксорубицина, даже при концентрации гестагена 10-8М приводило к угнетению жизнеспособности клеток линии HeLa более чем на 50%. Cочетание того же цитостатика с другими прогестинами обладало меньшим антипролиферативным эффектом и приводило к подавлению жизнеспособности на 27,7% и 27,1% при инкубации с ЛГ и МПА в концентрации 10-6М соответственно. Таким образом, АБМП, в сравнении с другими гестагенами (МПА, левоноргестрел) продемонстрировал выраженную антипролиферативную активность в отношении клеток рака шейки матки линии HeLa. Также сочетание АБМП с доксорубицином приводило к более эффективному угнетению пролиферации клеток этой линии. На основании полученных данных были сформированы ряды эффективности исследуемых соединений. Ряд эффективности исследуемых гестагенов в комбинации с доксорубицином в отношении подавления жизнеспособности опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 можно представить следующим образом (построен в порядке убывания цитостатической активности соединений, на основе тенденции подавления жизнеспособности клеток. Отличия от контроля являются статистически достоверными для всех веществ (при концентрации 10-6 М, р<0.05). «Докс.» доксорубицин: Докс. + АБМП Докс. + МПА Докс. + ЛНГ Докс. Ряд эффективности исследуемых соединений в комбинации с доксорубицином в отношении подавления жизнеспособности опухолевых клеток аденокарциномы шейки матки человека линии HeLa может быть представлен следующим образом (построен в порядке убывания цитостатической активности соединений). Отличия между веществами достоверны для комбинации «АБМП+доксорубицин» по отношению к другим комбинациям (р<0,05). Отличия от контроля являются статистически достоверными для всех веществ (при концентрации 10-6 М, р<0.05). «Докс.» доксорубицин: Докс. + АБМП Докс. + МПА Докс. + ЛНГ Для изучения возможного механизма антипролиферативного действия гестагенов мы оценили их влияние на апоптоз культивируемых опухолевых клеток MCF-7 с помощью флуориметрического анализа электрофореграмм экстракта геномной ДНК исследуемых клеток. 12 В опыте клетки аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 инкубировали с гестагенами в течение 72 часов. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствии соединений. Данные исследования приведены в таблице 5. Табл. 5. Деградация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с АБМП и прогестероном в течение 72 часов. Соединение 10-6 Коэффициент отношения фрагментированной ДНК к высокомолекулярной, % 20±2 10-8 24±3 10-6 20±2 10-8 22±2 - 22±3 Концентрация соединений, моль/л АБМП Прогестерон Контроль Таким бразом, не было показано статичтичеки значимых различий в изменении фрагментации ДНК при действии различных гестагенов. С целью выявления концентрационной зависимости индукции апоптоза при воздействии доксорубицина на исследуемые клетки (положительный контроль) было проведено исследование дозовой и временной зависимости действия доксорубицина на фрагментацию ДНК клеток культуры MCF-7. Для проведения исследования были установленные следующие контрольные точки: время инкубации составило 24, 48 или 72 часа, концентрации доксорубицина составили 5*10-5, 5*10-6, 5*10-7М. Контрольную группу образцов инкубировали в тех же условиях в отсутствие доксорубицина. Данные исследования представлены в таблице 6. Табл. 6. Фрагментация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с доксорубицином. Соединение Доксорубицин 5*10-5 М Время Время Время инкубации инкубации инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 41±4* 51±8*, L 64±8* 13 Контроль 24±3 Доксорубицин 5*10-6 М 25±5 38±4* 52±7*, L Доксорубицин 5*10-7 М 18±6 28±4 31±7 Примечание: * - достоверные отличия от контроля при р<0.05. L – присутствовала визуализация специфической фрагментации ДНК («лестница ДНК») на электрофореграммах образцов. Для оценки индукции апоптоза при совместном действии гестагенов и доксорубицина инкубацию клеток с исследуемыми веществами проводили в течение 72 часов, контрольную группу образцов инкубировали в тех же условиях в отсутствие веществ. В последние 24 часа инкубации в культуру клеток вносили доксорубицин в концентрации 5*10 -6 М. Одну из контрольных групп также инкубировали с доксорубицином в течение 24 часов. Данные исследования представлены в таблице 7. Табл. 7. Фрагментация ДНК в клетках культуры MCF-7 при инкубации с АБМП и прогестероном в течение 3 суток с добавлением доксорубицина в концентрации 5*10-6 М в последние 24 часа инкубации. Соединение Концентрация веществ, моль/л Отношение фрагментированной ДНК к высокомолекулярной, % 17±2 АБМП 10 -6 + 10 -7 20±3 Доксорубицин 10 -8 21±3 Прогестерон 10 -6 21±2 + 10 -7 18±3 Доксорубицин 10 -8 17±2 Доксорубицин 5·10-6 21±2 Контроль 17±3 На основании приведенных данных можно заключить, что при сроке инкубации 72 часа с гестагенами и 24 часа с доксорубицином в концентрации 5*10-6М выраженность апоптоза при воздействии гестагенов в комбинации с доксорубицином на культуру клеток не имеет достоверных отличий от контроля при уровне значимости p<0,05. Изменения эффекта при совместной инкубации с доксорубицином не наблюдается, не отмечено также и проявления цитостатического эффекта непосредственно доксорубицина при 14 данных условиях инкубации. Отсутствие корреляции эффекта снижения жизнеспособности по данным МТТ-теста и эффекта индукции апоптоза при совместном действии гестагенов и доксорубицина можно объяснить следующим образом: можно предположить, что ингибирование роста клеток в присутствии гестагенов обусловлено замедлением репликативных процессов. Возможно, клетки переходят в секреторную фазу или фазу дифференцировки, запускается каскад ферментативных реакций, приводящий с течением времени к гибели клеток. На это указывает и тот факт, что цитостатическое действие гестагенов развивается при длительной инкубации (более 3 суток). Так, время удвоения ДНК для клеток MCF-7 = 22 часа, для клеток HeLa = 18 часов. Доксорубицин в концентрации 5*10-6М вызывает торможение роста клеток более чем на 50% уже при инкубации в течение 48 ч, как это было показано на клетках линии MCF-7. Следовательно, для осуществления цитостатического эффекта доксорубицина должно пройти около 2-х клеточных циклов. Такой быстрый эффект доксорубицина связан с прямым воздействием на ДНК делящейся опухолевой клетки (ДНК-алкилирующее действие). В частности, по данным литературы (Thuneke и соавт., 2000), МПА оказывает на клетки линии рака молочной железы человека T-47D двухфазное действие: при инкубации в течение 24 и 48 часов – стимулирует пролиферацию, а при времени инкубации 72 ч – ингибирует. Продолжая изучение роли апоптоза в механизме действия гестагенов, мы исследовали экспрессию антиапоптотического белка bcl-2, методом иммуногистохимического окрашивания. Клетки культуры MCF-7 и HeLa инкубировали в течение 72 часов в присутствии исследуемых веществ. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях, но в отсутствие исследуемых соединений. С помощью флуоресцентного микроскопа “Axiostar” были получены изображения клеток в спектре видимого света, а также комбинированные изображения при возбуждении флюоресценции маркера вторичных антител УФ-излучением. Как в опыте, так и в контроле оценивали соотношение количества флуоресцирующих клеток к общему количеству клеток в поле зрения, а также интегральную площадь, соответствующую значениям флуоресценции выше фоновых (программа Image Pro Plus 5.0). Результаты, полученные в результате проведения обработки первичных данных, представлены в таблице 8. Табл. 8. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к Bcl-2 в культуре клеток MCF-7. Соединение Концентрация, Соотношение* S окрашивания 0,234±0,09 15,9 моль/л АБМП 10-4 15 ЛНГ Доксорубицин 10-6 0,211±0,18 31,1 Контроль 1 0,294±0,07 30,5 10-4 0,301±0,12 17,1 10-6 0,272±0,16 26,8 Контроль 2 0,213±0,08 42,1 10-5 0,182±0,10 3,9 10-6 0,231±0,08 10,2 Контроль 3 0,215±0,22 29,0 Примечание: Соотношение* - отношение количества флуоресцирующих клеток к общему количеству клеток в поле зрения; S окрашивания – интегральная площадь, соответствующая значениям флуоресценции выше фоновых, вычисленная в процентах по отношению к фону, отражает плотность монослоя клеток. Полученные данные показывают, что отношение флуоресцирующих клеток к общему количеству клеток в поле зрения при уровне значимости p<0,05 достоверно не отличается от контроля ни в одном из образцов. Таким образом, при анализе экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 в культуре клеток MCF-7 при инкубации с гестагенами и доксорубицином с помощью иммуноокрашивания не было выявлено достоверных отличий от контроля при времени инкубации 72 часа. Это позволяет говорить об отсутствии значимого влияния исследуемых веществ на экспрессию фактора Bcl-2 в данных условиях. . Для оценки активности каспазы-3 как ключевого компонента каскада апоптотических реакций использовали культуру клеток HeLa. Клетки культуры MCF-7 не использовали, так как данная линия клеток несет мутацию в гене каспазы-3, инактивирующую фермент. Для изучения активности каспазы-3 под действием гестагенов клетки инкубировали с исследуемыми соединениями в течение 72 часов. Клетки контрольной группы инкубировали в тех же условиях в отсутствие соединений. В качестве первичного оценочного параметра использовали величину оптической плотности образцов при длине волны поглощения субстрата λ=405нм, измеренную в условных единицах Полученные данные представлены в таблице 9. Табл. 9. Активность каспазы-3 в культуре клеток HeLa при инкубации с гестагенами. Соединение Концентрация вещества, моль/л 16 Активность каспазы-3, усл. ед. МПА ЛНГ АБМП Контроль 10-6 10-6 10-6 - 0,16±0,03 0,24±0,07 0,3±0,04 0,25±0,07 Показано, что при сроке инкубации 72 часа активность каспазы-3 при инкубации с АБМП превышает таковую при инкубации с другими гестагенами и в контрольной группе, однако на уровне значимости p<0,05 данные отличия не являются достоверными. Аналогичный опыт был проведен с использованием сочетания гестагенов с доксорубицином. Клетки инкубировали с исследуемыми соединениями и их комбинациями в течение 72 часов, время инкубации с доксорубицином составляло 24 часа, концентрация доксорубицина, которую использовали в исследовании – 5*106 М. Контрольную группу клеток инкубировали в тех же условиях в отсутствие соединений. Полученные результаты представлены в таблице 10. Табл. 10. Активность каспазы-3 в культуре клеток HeLa при инкубации с гестагенами и доксорубицином. Соединения МПА+ Dox ЛНГ+ Dox АБМП + Dox Доксорубицин Контроль Концентрация веществ, моль/л 10-6 10-6 10-6 5·10-6 - Активность каспазы-3, усл. ед. 0,22±0,04 0,24±0,08 0,41±0,09* 0,27±0,06 0,23±0,06 Примечание: *- достоверные отличия от контроля при р<0.05. Показано, что наибольшей величины уровень активности каспазы-3 достигает при инкубации клеток с АБМП в комбинации с доксорубицином. Так же необходимо отметить, что активность каспаз при инкубации с МПА (0,16 ед.) и ЛГ (0,21 ед.) была значительно ниже, чем при инкубации с АБМП (0,3 ед.), и при этом отличалась от контрольной группы незначительно (0,25 ед.), данные отличия не были достоверными. Значение активности каспазы-3 при воздействии на клетки доксорубицина совместно с АБМП превышало активность фермента в группе контроля, данное отличие было статистически значимо (р<0.05). На основании полученных результатов можно сделать следующий вывод: при совместном действии доксорубицина и АБМП наблюдается повышение активности каспазы-3, достоверно превышающее таковую в контроле. Это позволяет предположить, что при данной дозе и времени действия наблюдается активация системы апоптоза с участием каспаз, и 17 данный эффект превышает таковой при воздействии цитостатического препарата доксорубицина и гестагена АБМП отдельно друг от друга. Согласно поставленной цели – поиску эффективных комбинаций для использования в химиотерапии опухолей с использованием новых синтетических гестагенов как потенциальных противоопухолевых средств и веществ, повышающих эффективность цитостатиков, проведение данной экспериментальной работы позволило детально исследовать влияние гестагенов на жизнеспособность опухолевых клеток гормончувствительных клеточных культур MCF-7 и HeLa, в том числе АБМП как самостоятельного вещества и в комбинации с доксорубицином, в сравнении с используемыми в клинической практике гестагенами. АБМП как самостоятельное вещество обладает выраженной цитостатической активностью в отношении клеточных культур MCF-7 и HeLa. Показано, что АБМП дозозависимо тормозит рост опухолевых клеток при использовании в комбинации с доксорубицином, причем этот эффект реализуется в условиях краткосрочного воздействия гормонального вещества (72 часа) и цитостатика (24 часа на фоне воздействия гормона). Максимально действующая концентрация – 10-6М. Таким образом, комбинация АБМП и доксорубицина обладает выраженной цитостатической активностью в отношении клеточных культур MCF-7 и HeLa при инкубации в течение 72 часов. Возможные механизмы, обусловливающие синергизм в цитостатическом действии гестагенов и доксорубицина, по-видимому, связаны с изменением метаболизма опухолевых клеток, 1) не затрагивающими при коротких сроках инкубации экспрессию фактора bcl-2; 2) не приводящими к индукции апоптоза при условии применения гестагена как самостоятельного средства; и 3) приводящими к активации внутриклеточных систем, участвующих в реализации клеточной гибели посредством апоптоза. В случае применения комбинации синтетический гестаген (АБМП) + антрациклиновый антибиотик (доксорубицин) этот эффект активации апоптоза достигал максимума. В то же время, эффект активации сигнальных систем (каспазы-3) не является определяющим в апоптозе клеток некоторых клеточных популяций (в частности, линии клеток MCF-7), что позволяет предполагать реализацию цитостатического действия гестагенов в комбинации с цитостатиками через изменения на уровне различных внутриклеточных путей метаболизма. Этот эффект может быть реализован, со стороны гестагенов – через быстрые эффекты, опосредуемые мембранными рецепторами, влияющими на градиенты биологически активных веществ в клетке, и, со стороны цитостатика – его перераспределением (усилением аккумуляции вследствие ингибирования системы транспорта ксенобиотиков из клетки) под влиянием гестагенов. Полученные данные свидетельствуют о цитостатической активности нового оригинального отечественного гестагена. В работе обоснована 18 целесообразность комбинированного применения гестагена АБМП с цитостатиками. Новый гестаген, АБМП, обладает химиосенсибилизирующей активностью и может быть рекомендован для последующего изучения с перспективой использования в клинической практике в качестве универсального модулятора эффекта химиотерапевтических средств. Таким образом, действие гестагенов на клетки-мишени можно представить в виде следующей схемы, построенной на основании данных литературы, а также данных, полученных в проведенном исследовании (рис. 3.) Рис. 3. Механизмы регуляции пролиферативной активности клетокмишеней гестагенами. 1 2 3 4 Медиаторы биологического сигнала: протеазы (в т.ч. каспаза-3), цАМФ, ионы Ca2+, цитохромы)5 1 – Антиапоптотические факторы В проведенном исследовании показано отсутствие влияния гестагенов на экспрессию фактора bcl-2. 2 – Факторы роста (EGF – эпидермальный фактор роста, IGF – инсулиноподобный фактор роста) По данным литературы, гестагены могут усиливать пролиферативный эффект факторов роста, влияя на внутриклеточные пути проведения сигнала [Carvajal et al., 2005; Wang et al., 2006] 3 – Подавление факторов мультилекарственной резистентности По данным литературы, наблюдается более выраженное накопление цитостатических веществ в клетках-мишенях в присутствии гестагенов, 19 а также усиление эффекта цитостатических средств в отношении резистентных к ним клеток [Т. Федотчева и соавт., 2003 г.] 4 – Проапоптотические факторы (bax, bcl-XS) Активность проапоптотических факторов возрастает при действии гестагенов [Liszewska et al., 2005; Choksuchat et al., 2009] 5 – Медиаторы биологического сигнала В проведенном исследовании было показано, что активность каспазы-3 возрастает при действии гестагенов на клетки-мишени линий HeLa и MCF-7. ВЫВОДЫ. 1. АБМП и вещества сравнения: ЛНГ, МПА, прогестерон обладают цитостатической активностью в отношении опухолевых клеток рака молочной железы человека MCF-7 и рака шейки матки человека HeLa. 2. Снижение жизнеспособности клеток опухолевых линий HeLa и MCF-7 возрастает с увеличением дозы и времени действия исследуемых веществ. 3. В цитостатическом действии сочетания гестагенов и доксорубицина выявлен синергизм, наиболее выраженный в случае АБМП в клетках MCF-7 и в клетках HeLa. Комбинация АБМП и доксорубицина обладает выраженной цитостатической активностью в отношении клеточных культур MCF-7 и HeLa при инкубации в течение 72 часов с добавлением доксорубицина в последние 24 часа инкубации. 4. АБМП и другие гестагены не оказывают статистически значимого влияния на экспрессию антиапоптотического фактора bcl-2 в клеткахмишенях при инкубации в течение 72 часов. Это позволяет сделать вывод о том, что реализация цитостатического действия гестагенов при коротких сроках инкубации осуществляется без влияния на экспрессию фактора bcl-2. 5. Сочетанное использование АБМП (в отличие от препаратов сравнения ЛНГ и МПА) и доксорубицина приводит к достоверной активации каспазы-3. Таким образом, при совместном действии АБМП и доксорубицина происходит активация систем, участвующих в реализации апоптоза клеток. В данном случае показано превосходство АБМП по отношению к препаратам сравнения. 20 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 1. Прогестагены могут быть рекомендованы для применения в клинической практике в комбинированной терапии в сочетании с доксорубицином при лечении гормонозависимых опухолей женской репродуктивной системы. 2. Рекомендовано дальнейшее исследование свойств АБМП как нового прогестагена с противоопухолевой активностью для внедрения в клиническую практику. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Семейкин А.В., Атрошкин К.А. «Влияние гестагенов на апоптоз клеток культуры HeLa и MCF-7». Тезисы. Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», c. 246 2. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Семейкин А.В., Атрошкин К.А. "Влияние гестагенов на жизнеспособность клеток культуры HeLa и экспрессию фактора Bcl-2 при изолированном применении и в сочетании с цитостатическими средствами». Тезисы. Российский терапевтический журнал, №1/2008? c. 22-28 3. Сергеев П. В., Федотчева Т. А., Ржезников В. М., Гриненко Г. С., Семейкин А. В., Ветчинкина В. Б., Атрошкин К. А., Шимановский Н. Л. «Новый отечественный гестаген с противоопухолевой активностью». Вестник РАМН, №5/2007:27-32. 4. П. В. Сергеев, К. А. Атрошкин, А. В. Семейкин, Н. Л. Шимановский,Т. А. Федотчева, М. А. Секирина. «Регуляция гестагенами пролиферативной активности клеток-мишеней». Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 19, №1/2008, с. 22-28 5. П.В.Сергеев, К.А.Атрошкин, Н.Л.Шимановский, А.В.Семейкин. Влияние нового отечественного гестагена с противоопухолевой активностью на апоптоз опухолевых клеток культуры HELA и MCF-7. III съезд фармакологов России, С.-П. сентябрь, 2007. Ж. «Психофармакология и биологическая наркология» т.7, спец. Выпуск, ч.1, с. 1936-1937. 6. К.А. Атрошкин, Н.Л. Шимановский, А.В. Семейкин, В.М. Ржезников, М.А. Секирина, Е.А. Кирсанова, Т.А. Федотчева. Сочетанное действие гестагенов и доксорубицина на клетки культур опухолевых линий HeLa и MCF-7. Вестник РГМУ, 2009, №1, с. 20-24 22