На правах рукописи ДЕГТЯРЕВА ЛИДИЯ АНДРЕЕВНА «РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ
реклама
1 На правах рукописи ДЕГТЯРЕВА ЛИДИЯ АНДРЕЕВНА «РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ПЕРИНАТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ДНК БАКТЕРИЙ, КОЛОНИЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО» 14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика 03.02.03 - микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА – 2010 2 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук Кафарская Л.И. Шкопоров А.Н. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Сухоруков В. С. Афанасьев С.С. Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет Защита диссертации состоится «31» мая 2010г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.08 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1 С авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1 Автореферат разослан «30» апреля 2010г. Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор Рылова А.К. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Одной из наиболее актуальных и сложных проблем в современной перинатологии являются инфекционные заболевания (Самсыгина Г.А., 1985; Флеминг П. и соавт., 1993; Гельфанд Б.Р. и соавт., 2006). Ключевыми бактериальными являются патогенами, Escherichia coli, вызывающими Klebsiella spp., неонатальные инфекции Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Lysteria monocytogenes. (Angus D.C. et al, 2001; Антонов А.Г. и соавт., 2005). Успешное разрешение проблемы перинатальных инфекций, как в их предупреждении, так и в патогенетически оправданном и своевременном лечении зависит от использования эффективных диагностических и лечебных технологий. В связи с чрезвычайно высокой скоростью развития инфекционного процесса у новорожденного ребенка, особую значимость в неонатальной клинике приобретают методы микробиологической экспрессдиагностики. В настоящее время спектр диагностических возможностей для выявления перинатальных инфекций значительно расширился. В частности, в существующих программах по раннему выявлению инфекций у новорожденных, большое значение придается серологической диагностике, прежде всего для выявления вирусных инфекций (Гриноу А. и соавт.,2000). В то же время существующие методы не всегда оказываются достаточно чувствительными для выявления патогенных микроорганизмов. В большей степени это относится к бактериальным патогенам, для обнаружения которых в основном используются традиционные микробиологические методы, характеризующиеся длительным временем получения результата, высокой трудоемкостью и высокой зависимостью интерпретации результатов от квалификации лабораторного персонала (Барашнев Ю.И., 2001). В связи с этим в последние годы отдается предпочтение методам, основанным на эффектах ДНК-гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Прежде всего, речь идет о методах, в основе которых лежит 4 полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, позволяют обнаруживать присутствие микроорганизмов в микроколичествах исследуемого материала за короткое время (Виноградская Г.Р. и соавт., 1991; Ведяков А.М. и соавт., 1998; Fowlie P.W., Schmidt B., 1998). В качестве объекта исследования может быть использован любой биологический материал. Современные модификации этого метода, в первую очередь мультипраймерная ПЦР в режиме реального времени, позволяют проводить не только одновременное качественное определение присутствия нескольких патогенных микроорганизмов в исследуемом материале, но и устанавливать их количественное содержание (Carvalho G.S. et al, 2007). В настоящее время в России не представлено ни одной тест-системы для одновременного определения методом мультипраймерной ПЦР в режиме реального времени бактерий S. agalactiae, E. coli, Klebsiella spp., являющихся основными патогенами в неонатологической практике. Разработка и внедрение в практику подобной тест-системы позволит существенно сократить время постановки диагноза новорожденных и назначения этиотропной антибактериальной терапии в отделениях интенсивной терапии и реанимации. Цель исследования: Разработать одновременную диагностическую экспресс-диагностику тест-систему, обеспечивающую инфекционных заболеваний, вызванных Streptococcus agalactiae, Escherichia coli и Klebsiella spp., у плодов и новорожденных детей, путем количественной детекции геномной ДНК указанных возбудителей методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦРРВ). 5 Задачи исследования: Подобрать 1. нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов для детекции S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. Сравнить эффективность различных методов выделения ДНК из 2. бактериальных культур S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. Выбрать наиболее адекватный метод, пригодный для выделения ДНК из различных видов клинического материала. Создать 3. систему калибровочных образцов ДНК и ДНК внутреннего контроля для использования в создаваемой мультипраймерной тест-системе. Оптимизировать условия протекания ПЦР-РВ для детекции S. 4. agalactiae, E. coli и Klebsiella включая spp, концентрации компонентов реакции подбор оптимальной и температурных режимов ее проведения. Оценить 5. чувствительность, специфичность и достоверность качественной и количественной детекции ДНК S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. с использованием полученной мультипраймерной тестсистемы. Научная новизна исследования. В ходе исследования была создана мультипраймерная тест-система позволяющая проводить одновременную детекцию методом ПЦР-РВ трех основных возбудителей неонатальных инфекций. Был произведен дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов комплементарных фрагментам генов uid A E. coli, cfb S. agalactiae, консервативному участку 16S рибосомальной РНК Klebsiella spp., а также проверена специфичность и чувствительность этих праймеров на коллекции лабораторных штаммов и клинических образцах. Кроме того был предложена модификация метода выделения геномной ДНК 6 улучшающая выход геномной ДНК, выделяемой из бактерий рода Streptococcus. Практическая значимость работы. Применение разработанной тест-системы должно обеспечить раннее, в том числе доклиническое, выявление наиболее значимых перинатальных инфекций; широкий возможностей при спектр сходстве дифференциально-диагностических клинической картины заболевания у новорожденных; количественную оценку бактериальной обсемененности исследуемого материала, а также высокую чувствительность и специфичность. Внедрение результатов работы в практику. В настоящее время полученная тест-система используется в научноисследовательской работе кафедр микробиологии и вирусологии, клинической лабораторной диагностики, а также кафедры неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Результаты исследования включены в материалы лекционного курса для студентов, врачей интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Положения, выносимые на защиту: 1. В ходе исследования была разработана мультипраймерная тест- система для выявления ДНК E. coli, S. agalactiae, Klebsiella spp. в образцах клинического материала методом ПЦР-РВ 2. Протокол выделения бактериальной ДНК из клинического материала, разработанный в ходе настоящего исследования, существенно повышает эффективность экстракции ДНК из бактерий рода Streptococcus. 3. Полученная диагностическая тест система характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью детекции ДНК трех 7 основных возбудителей неонатальных инфекций в различных видах клинического материала. Апробация работы. Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и кафедры неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, протокол №1 от 25 февраля 2010 года. Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых ВАК научных журналах. Объем и структура диссертации. Работа изложена на русском языке, на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 180 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 9 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. С целью решения поставленных задач нами был проведен дизайн олигонуклеотидных олигонуклеотидных праймеров зондов. и Нуклеотидные флуоресцентно-меченных последовательности генов- мишеней для ПЦР были получены из баз данных NCBI GenBank и Ribosomal Database Project II. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием сетевой программы ClustalW. Дизайн олигонуклеотидов для использования в качестве праймеров зондов Taqman осуществлялся с использованием приложения PerlPrimer. 8 Уникальность ПЦР-праймеров проверялась посредством поиска их последовательностей в базе данных GenBank при помощи алгоритма BlastN. Олигонуклеотиды были синтезированы амидофосфитным методом и очищены при помощи препаративного электрофореза в ПААГ. Зонды Taqman на этапе синтеза были конъюгированы с флуоресцентными красителями на 5'-концах(FAM, R6G, ROX, Cy5), а также с тушителями флуоресценции (RTQ1 либо RTQ2) на 3'-концах или по внутреннему остатку тимина (зонд cfb-TP1). В случае зонда cfb-TP1 3'-концевая гидроксильная группа была блокирована сложноэфирной связью с остатком фосфорной кислоты. Таблица 1. Олигонуклеотидные использованные в ходе исследования. праймеры Название Нуклеотидная последовательность праймера (зонда) и зонды Температура плавления, 0С Taqman, Размер ПЦРпродукта, п.н. kleb-F1 GCCTTCGGGTTGTAAAGC 61,33 kleb-R1 GTCAATCGATRAGGTTATTAACCTC 61,42 kleb-TP1 ROX-CTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATRTQ2 71,08 cfb-F1 CAGTTGAATCCAAATGTTACGG 60,17 cfb-R1 TAATGCTGTTTGAAGTGCTG 59,05 cfb-TP1 R6G-CAACAAGTTGAT-(RTQ1)CAAGAGATTGTAACATTACAAGCA-P 67,73 uidA-F2 CTCTTTAGGCATTGGTTTCG 59,2 uidA-R2 TTGCTGAGTTTCCCCGTT 61,77 uidA-TP2 FAM-CTTTCGGCTTGTTGCCCGCTT-RTQ1 69,04 GFP-F3 GTGAACTTCAAGATCCGCC 61,03 GFP-R3 GTGTTCTGCTGGTAGTGGT 61,82 GFP-TP1 Cy5-ATCGAGGACGGCAGCGTGCA-RTQ2 67 78 82 71 71,67 Постановку реакций мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием смеси 4 пар праймеров, 4 зондов и 2,5Х 9 реакционной смеси, содержащей Taq-полимеразу с горячим стартом (Pfaffl,M.W., 2001). Для проведения ПЦР использовали стандартную двухфазную температурную программу: первоначальная денатурация 95 оС 5 мин, денатурация 94оС 15 с, отжиг и элонгация 60оС 60 с. Длительность программы составляла 40 циклов. Для получения калибраторных плазмидных ДНК ПЦР-продукты, полученные при помощи мультиплексной ПЦР, были клонированы в вектор pTRKH2. Клонирующий вектор pTRKH2 расщепляли рестриктазой SmaI и лигировали с очищенными вставочными ДНК. Скрининг рекомбинантных плазмид проводили при помощи теста на экспрессию β-галактозидазы. Трансформацию штаммов кишечной палочки проводили при помощи электропорации (Maniatis T., 1982). Плазмиды из трансформированных клонов бактерий выделяли при помощи общепринятых методов. В качестве ДНК внутреннего контроля была получена рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент гена GFP Aequorea victoria Геномную ДНК из образцов бактериальных культур и клинического материала выделяли с использованием модифицированного метода Бума (Boom et al., 1990) с предварительным разрушением клеточных стенок бактерий путем последовательной обработки лизоцимом и протеиназой К в буфере оптимального состава. Помимо этого было проведено изучение влияния предварительной обработки лизоцимом и протеиназой К вместе и по отдельности на эффективность выделения геномной ДНК из клеток S. agalactiae и Klebsiella pneumoniae и сравнение с методами выделения ДНК использованными в коммерчески доступных наборах «Экстраген», «Реамикс» (Гентех, Россия) и «Рибосорб» (Интерлабсервис, Россия) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Специфичность разработанной тест системы изучали с использованием препаратов ДНК, выделенных из 45 штаммов бактерий различных видов. Для определения достоверности количественной детекции ДНК, эффективности протекания ПЦР-реакций и аналитической чувствительности 10 разработанной мультипраймерной тест-системы были проведены серии реакций с использованием в качестве матрицы серийных десятикратных разведений смеси геномных ДНК выделенных из культур E. coli BA5, K. pneumoniae EK1 и S. agalactiae N4, находившихся в экспоненциальной фазе роста. Достоверность построения количественной калибровочных кривых детекции и определяли определения путем коэффициентов корреляции. Эффективность амплификации рассчитывали на основании крутизны калибровочной прямой построенной через экспериментальные точки в полулогарифмической системе координат. Для изучения диагностической специфичности и чувствительности разработанной тест-системы для мультипраймерной ПЦР-РВ было проведено ее тестирование на препаратах ДНК, выделенных из 117 клинических образцов. Из них 103 клинических образца были получены от новорожденных детей, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии, 14 были симулированы в лаборатории, путем добавления чистых культур бактерий различных видов к различным биологическим жидкостям, взятым у здоровых взрослых добровольцев. Исследование 14 симулированных клинических образцов проводилось слепым методом в количественном и качественном варианте. В этом случае непосредственный исполнитель не был информирован, в каких образцах содержались культуры S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp., а какие содержали культуры других видов. Использованные в работе штаммы бактерий культивировали на элективных питательных средах, с учетом их физиологических особенностей. Для определения количества жизнеспособных бактерий в культурах, находящихся в экспоненциальной фазе роста, использовали метод посева серийных десятикратных разведений на плотную питательную среду BHI с последующим подсчетом числа колоний. Бактериологический посев клинического материала и идентификация возбудителей проводились с использованием стандартных методов (Murray P.R. et al, 2003). 11 Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общепринятых статистических методов на персональном компьютере с применением программы «Microsoft Excel». Для проведения статистического анализа полученные результаты представляли lg колониеобразующих единиц или геном-эквивалентов бактерий на 1 мл исследуемого материала. Для каждой таксономической группы микроорганизмов рассчитывали частоту встречаемости, среднее значение и стандартное отклонение концентрации. Для выявления связи между данными, полученными бактериологическим методом и ПЦР-РВ с использованием мультиплекс-системы, проводился корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции R2, а также анализ таблиц сопряженности с использованием критерия χ2.(Гланц С.,1998). Результаты собственных исследований. 1. Дизайн праймеров и олигонуклеотидных зондов. В качестве генов мишеней для разработки диагностической тестсистемы для детекции патогенов E. coli и S. agalactiae были избраны гены uidA и cfb соответственно. Ген uidA кодирует синтез фермента βглюкуронидазы, а ген cfb отвечает за образование CAMP-фактора у стрептококков группы В, биологическая активность которого заключается в расширении зоны гемолиза, вызванного β-гемолизином золотистого стафилококка. Ген uidA кишечной палочки, а также ген cfb стрептококков Streptococcus agalactiae представляют собой уникальные для данных видов гены, не встречающиеся у эволюционно родственных видов и родов микроорганизмов и не имеющие близких гомологов в геномах бактерий других родов В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей 10 штаммов E. coli и 10 S. agalactiae было выявлено несколько протяженных районов 100%-ной идентичности нуклеотидной последовательности между 12 всеми штаммами, которые и были избраны в качестве мишеней для отжига праймеров и проб (Таблица 1). В настоящее время у бактерий рода Klebsiella не описаны уникальные гены, характерные строго для этого рода. В этой связи задача создания родоспецифичной тест-системы для детекции бактерий Klebsiella spp. решалась путем поиска консервативных районов в гене 16S-рРНК, отличающихся у бактерий рода Klebsiella от последовательностей бактерий других родов семейства Enterobacteriaceae. В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей генов 16S-рРНК (rrn) 3 штаммов K. pneumoniae и 3 штаммов K. oxytoca с соответствующими нуклеотидными последовательностями из 20 штаммов различных видов бактерий был обнаружен ряд районов с выраженной родовой специфичностью в отношении Klebsiella spp. Один из таких участков был выбран в качестве мишени для разработки родоспецифичных диагностических ПЦР-праймеров и зонда для детекции патогенов рода Klebsiella (Рис. 1). Дизайн праймеров, комплементарных данному участку осуществлялся таким субтерминальные образом, нуклеотидные чтобы остатки 3’-терминальные были и/или комплементарны родоспецифичным остаткам в последовательностях 16S-рРНК. Для создания внутреннего контроля качества выделения ДНК и протекания ПЦР была создана пара праймеров и зонд, комплементарные фрагменту гена GFP. 13 Рис. 1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей генов 16S-рРНК бактерий семейства Enterobacteriaceae в районе отжига родоспецифичных праймеров и зонда для детекции Klebsiella spp. 14 2. Оценка специфичности, аналитической чувствительности тест-системы, а также достоверности количественной детекции ДНК. В результате тестирования полученной мультипраймерной тест-системы на препаратах ДНК, выделенных из 45 штаммов бактерий разных видов было показано, что накопление флуоресцентного сигнала на соответствующих каналах происходило лишь при использовании в качестве матриц ДНК, выделенных из бактерий E. coli, S. agalactiae, K. pneumoniae, K. oxytoca. Постановка ПЦР с бактериями других видов, в т.ч. эволюционно близких (Citrobacter sp., Enterobacter sp., Proteus sp., Streptococcus anginosus, S. lactis, S. pyogenes, Enterococcus sp.) давала отрицательный результат. При анализе достоверности количественной детекции ДНК была выявлена высокая эффективность амплификации (E = 2; 2; 1,81; 1,91 для uidA, cfb, rrn и GFP соответственно) и сильная корреляционная связь ( R2 = 1; 1; 0,99; 0,99 для uidA, cfb, rrn и GFP соответственно) концентрации калибровочных образцов ДНК и определяемого значения порогового цикла (Рис. 2). Аналитическая чувствительность полученной тест системы была не ниже 300 геном экв. для детекции генов uidA, cfb, rrn. 15 Рис. 2. Определение достоверности количественной детекции ДНК и эффективности протекания ПЦР-реакций в разработанной 16 мультипраймерной тест-системе. А – праймеры специфичные к S. agalactiae, Б – праймеры специфичные к Klebsiella spp., В – праймеры специфичные к GFP. 3. Получение рекомбинантных плазмидных ДНК для использования в качестве калибраторов и внутреннего контроля ПЦР В качестве ДНК положительного контроля, калибраторных образцов и ДНК внутреннего контроля в настоящей работе были созданы рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие клонированные фрагменты генов-мишеней для ПЦР. Полученные плазмиды были использованы для создания серии растворов смесей калибраторных ДНК и ДНК внутреннего контроля, соответствующих по концентрации 3х107 3х106 3х105 3х104 и 3х103 копий/мл целевых генов (cfb, uidA, rrn и gfp). Рис. 3. Структура челночного клонирующего вектора pTRKH2. lacZ’ - α-фрагмент гена β-галактозидазы E. coli; EmR – ген резистентности к эритромицину; ori p15A и ori pAM β – ориджины репликации активные в кишечной палочке и грамположительных бактериях соответственно. 4. Сравнение различных методов выделения ДНК В результате сравнения различных методов выделения геномной ДНК из штаммов бактерий S. agalactiae и K. pneumoniae нами было показано, что, 17 несмотря на хороший выход при выделении ДНК из культуры K. pneumoniae c использованием наборов «Экстраген», «Реамикс» и «Рибосорб», данные комплекты реактивов оказались абсолютно неэффективны для выделения ДНК из культуры S. agalactiae. Это обусловлено резистентностью массивной клеточной стенки грамположительных бактерий к лизису хаотропными солями и детергентами. Наилучшие результаты как для S. agalactiae, так и для K. pneumoniae предложенной нами были продемонстрированы комбинации метода Бума при с использовании предварительным разрушением клеточной стенки бактерий гидролитическими ферментами (Рис. 4). Рис. 4. Сравнение различных методов выделения ДНК из культур K. pneumonia и S. agalactiae. Дорожки 1-5: выделение геномной ДНК из культуры K. pneumoniae. Дорожки 6-10 выделение геномной ДНК из культуры S. agalactiae. Дорожки 1 и 6 – метод Бума в сочетании с обработкой протеиназой К и лизоцимом; 2 и 7 – метод Бума в сочетании с обработкой лизоцимом; 3 и 8 – метод Бума в сочетании с обработкой протеиназой К; 4 и 9 – базовая процедура метода Бума; 5 и 10 – набор Ускоренная пробоподготовка. На основе полученных данных об эффективности выделения ДНК различными методами был создан лабораторный образец диагностической тест системы, включающий в себя следующие компоненты: 1) Буфер для выделения ДНК 2Х, (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2мМ ЭДТА, 10 мг/мл лизоцим, 5нг/мл ДНК внутреннего контроля); 2) Раствор протеиназы К 18 20 мг/мл; 3) Лизирующий буфер (6M гуанидин изотиоцианат, 20mM ЭДТА, 40 г/л Triton X-100 and 10 г/л DTT); 4) микроколонки со стекловолоконными мембранами; 5) Отмывочный буфер (50mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH 7.5, 2.5 mM ЭДТА 50% этанол); 6) Элюирующий буфер (10мМ Tris-HCl pH 8.0, 1мМ ЭДТА); 7) Реакционная смесь 2,5Х; 8) Смесь праймеров и зондов 5Х; 9) Растворы калибраторных плазмидных ДНК (6 шт.); 10) Форма расчета результатов для пакета Microsoft Excel (компакт-диск); 11) Инструкция по применению тест-ситемы. 5. Оценка диагностической чувствительности и специфичности разработанной тест системы Диагностические характеристики разработанной тест-системы изучали в сравнении с классическим бактериологическим методом, подразумевающим выделение чистых культур бактерий из исследуемого материала с использованием элективных питательных среды и последующую морфологическую и биохимическую (либо серологическую) идентификацию выделенных культур. Всего было исследовано 117 клинических образцов, среди которых 103 клинических образца представляли собой материал (моча, стул, мазки из зева и ануса, аспират из трахеи, аспират из желудка), полученный от новорожденных, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии, а 14 были симулированы в лаборатории путем добавления чистых культур определяемых возбудителей в образцы биологических жидкостей (слюна, моча, цельная кровь с консервантом ЭДТА), взятых у здоровых взрослых добровольцев. При изучении слепым методом симулированных образцов данные по качественному и количественному присутствию S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp., полученные методом ПЦР-РВ с использованием разработанной мультипраймерной системы, полностью соответствовали результатам бактериологического исследования. 19 При изучении клинических образцов полученных из отделения реанимации новорожденных метод ПЦР-РВ проявил большую чувствительность по сравнению с классическим бактериологическим методом. Так, методом ПЦР-РВ S. agalactiae, Klebsiella spp.и E. coli были выявлены в 31 образце (30,09%), в то время как с использованием бактериологического метода бактериальную обсемененность выявляли в 29 образцах (28,1%). При оценке частоты встречаемости трех детектируемых возбудителей в клиническом материале новорожденных было показано, что наиболее часто в образцах обнаруживались бактерии рода Klebsiella (19,38% случаев при бактериологическом исследовании и 15,3% при исследовании методом ПЦРРВ). Более высокая частота выявления бактерий этого рода с использованием традиционного бактериологического метода может быть обусловлена ошибочной биохимической идентификацией некоторых штаммов, в действительности не относившихся к роду Klebsiella. Таким образом, без учета возможных ошибок в бактериологическом методе диагностическая чувствительность метода ПЦР-РВ по сравнению с посевом составила 77,3%, а диагностическая специфичность равнялась 98,8%. Частота детекции E. coli в клинических образцах был несколько меньше, чем таковая для Klebsiella spp. и равнялась при использовании обоих методов диагностики 10,2%. Значения чувствительности и специфичности разработанного нами метода детекции E. coli в сравнении с бактериологическим составили 100% и 98,9% соответственно. Бактерии вида S.agalactae не были выделены с помощью бактериологического метода ни в одном из клинических образцов. Возможно, это связано с назначение антибактериальной терапии новорожденным детям в первые часы жизни. Поэтому в образцах, полученных от детей отделения реанимации и интенсивной терапии, присутствовали либо погибшие S.agalactae, либо их некультивируемые формы, ДНК которых и определялась методом ПЦР-РВ в 7,14% случаев. В этой связи показатели чувствительности и специфичности ПЦР-РВ для 20 детекции стрептококков группы В по сравнению с бактериологическим методом составили 100% и 93% соответственно (Рис. 5). Рис. 5. Частота встречаемости возбудителей в клинических образцах, полученных от новорожденных отделения реанимации и интенсивной терапии, выявленная бактериологическим методом и методом ПЦР-РВ. Изучение уровня бактериальной обсемененности различных видов клинического материала, полученного из отделения реанимации новорожденных выявило наиболее высокую обсемененность аспирата трахеи новорожденных. Из 21 образца аспирата из трахеи при бактериологическом исследовании в 9 случаях (42,9%) был выявлен роста S. agalactiae, Klebsiella spp., E. coli в ходе бактериологического исследования. При использовании метода ПЦР-РВ положительный результат был отмечен в 10 образцах (48%). При исследовании 27 мазков из зева присутствие в материале S. agalactiae, Klebsiella spp. и E. coli отмечалось в 9 (33,3%) случаях при использовании бактериологического метода и в 11 случаях (40,8%) при применении ПЦРРВ. В мазках из ануса, аспирате из желудка и испражнениях S. agalactiae, Klebsiella spp.и E. coli встречались реже. Из 41 образцов в 8 (19,5%) при бактериологическом исследовании и в 7 (17,07%) методом ПЦР-РВ были 21 выявлены Klebsiella spp.и E.coli. В моче бактериологическим и ПЦР-РВ методами три основных возбудителя неонатальных инфекций были детектированы в 22% случаев. Желудочно-кишечный и мочеполовой тракты у новорожденных чаще остаются стерильными в первые дни жизни, поэтому S. agalactiae, Klebsiella sp., E.coli присутствовали в материале из этих органов реже, чем в других. Также было проведено сравнение количественной оценки обсемененности образцов бактериями S. agalactiae, Klebsiella spp. и E. coli при использовании двух методов диагностики. Наибольшая концентрация среди детектируемых видов микроорганизмов в клинических образцах была характерна для E. coli. Среднее значение ее для бактериологического метода составило 6,538 lg КОЕ и 6,853 lg геномэкв для метода ПЦР-РВ. Среднее значение концентрации Klebsiella spp определялось как 5,068 lg КОЕ для бактериологического метода и как 5,701 lg геномэкв для ПЦР-РВ. Концентрация S. agalactiae в клиническом материале была практически одинаковой с таковой для Klebsiella spp, ее среднее значение 5,254 lg геномэкв. Таким образом, можно также судить о том, что концентрация микроорганизмов родов Escherichia и Klebsiella в клиническом материале, выявленная методом ПЦР-РВ с использованием разработанной диагностической системы была практически эквивалентна таковой при бактериологическом исследовании (Рис. 6). 22 Рис. 6. Сравнение концентрации возбудителей в клинических образцах, определенной методом ПЦР-РВ и бактериологическим методом. Для сравнительного анализа качественной детекции возбудителей в исследуемом материале с использованием двух различных методов был проведен анализ таблиц сопряженности с использованием критерия χ2. Значения P составили 1,0 для E.coli и 0,087 для S.agalactiae и 0,041 для Klebsiella spp, что свидетельствует об отсутствии различий в выявляемости обсемененности образцов E. coli с использованием обоих методов. В то же время, низкие значения P для S.agalactiae и Klebsiella spp. свидетельствуют о статистически достоверной разнице в эффективности выявления данных возбудителей с использованием двух методов. Это может быть обусловлено ложноположительными Klebsiella spp., идентификацией результатами связанными с выделяемых бактериологической недостаточно точной чистых культур, детекции биохимической а также ложноотрицательными результатами при бактериологической детекции стрептококков группы В. Для сравнительного анализа количественных значений концентрации микроорганизмов в клиническом материале определяемых с использованием 23 мультипраймерной ПЦР-РВ тест-системы и классического бактериологического метода были рассчитаны коэффициенты корреляции R 2. Была выявлена сильная прямая корреляционная связь значений концентраций определенных с использованием двух методов. Коэффициент R2 составил: 0,9 для S.agalactiae, 0,83 для E.coli и 0,71 для Klebsiella spp (Рис. 7 и 8). Рис 7. Корреляция значений концентрации E.coli. в клинических образцах, определяемых с использованием мультипраймерной ПЦР-РВ (ось ординат) и бактериологического метода (ось абсцисс). Рис 8. Корреляция значений концентрации E.coli. в клинических образцах, определяемых с использованием мультипраймерной ПЦР-РВ (ось ординат) и бактериологического метода (ось абсцисс) 24 Выводы 1. В ходе высокоспецифичные проведенного исследования олигонуклеотидные праймеры были и разработаны флуоресцентно- меченных олигонуклеотидные зонды комплементарные фрагментам генов cfb S. agalactiae, uidA E. coli и консервативному участку 16S-рРНК Klebsiella spp., позволяющие осуществлять детекцию ДНК указанных бактерий методом ПЦР в режиме реального времени. 2. Разработанный в ходе исследования протокол экстракции геномной ДНК обеспечивает адекватное выделение ДНК из бактерий S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. 3. Созданный лабораторный образец диагностической тест системы позволяет проводить достоверную количественную детекцию бактериальных патогенов S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. методом ПЦР-РВ в различных видах клинического материала. 4. Полученная мультипраймерная тест-система характеризуется высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, а также достоверностью качественной и количественной детекции ДНК S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. 25 5. Использование разработанной мультипраймерной тест-системы позволяет сократить время исследования до 150 минут. Практические рекомендации Разработанная в ходе проведенного исследования мультипраймерная диагностическая ПЦР-РВ тест-система после проведения дополнительных клинических испытаний и сертификации может быть использована в диагностике неонатальных бактериальных инфекций для обнаружения S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. в различных видах клинического материала. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Володин Н.Н., Дегтярева Л.А., Кафарская Л.И., Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В., Шуникова М.Л., Чаплин А.Н., Ефимов Б.А.. Использование молекулярно-генетических технологий, основанных на ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний у новорожденных // Вопросы практической педиатрии. – 2010. - т. 5. - №3. - С.8-11. 2. Дегтярева Л.А., Хохлова Е.В., Кулагина Е.В., Шкопоров А.Н. Разработка диагностической тест-системы для детекции Escherichia coli, Klebsiella sp. и Streptococcus agalactia методом ПЦР-РВ // Инфекционные болезни.-2010. –т.8.- №2.- С.10-13 3. Хромова С.С. Хамаганова И.В., Тарабрина Н.П., Дегтярева Л.А., Ахмедов Х.Б., Кафарская Л.И. Микробиологические и иммунные аспекты развития инфекций урогенитального тракта//Стерилизация и госпитальная инфекция. – 2009. - №.1. – С.14-18 26 Список сокращений СГВ – стрептококк группы В ВПГ - вирус простого герпеса; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ); ИФА - иммуноферментный анализ; НК – нуклеиновые кислоты; ОТ – обратная транскриптаза; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени; РНК - рибонуклеиновая кислота; ЦМВ – цитомегаловирус; ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция ДПРПО - дородовый преждевременный разрыв плодных оболочек LAL - Limulus amebocyte lysate