исследование механизмов передачи митогенных сигналов

Исследование механизмов передачи митогенных сигналов факторов
роста - основа создания новых противоопухолевых препаратов
Н.Е.Кушлинский
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Известно, что в основе противоопухолевого эффекта большинства химиопрепаратов
лежит подавление по тому или иному механизму процессов синтеза предшественников и
репликации ДНК. Однако многие опухоли со временем приобретают устойчивость к
большинству подобных препаратов, для преодоления которой необходим поиск новых
мишеней и разработка новых подходов к лекарственному лечению резистентных
новообразований.
В последнее время одним из перспективных направлений в этой области считается
создание препаратов, воздействующих на процессы регуляции пролиферации и передачи
митогенных сигналов в опухолевых клетках. Условно первым из выше указанных видов
терапии можно считать эндокринное лечение вообще и использование антигормонов в
частности. Однако перспективы эндокринной терапии ограничены, в основном, лечением
гормонозависимых опухолей репродуктивной системы. Причем в данном случае речь идет
о подавлении эффекта внешних регуляторных стимулов. В то же время характерной
особенностью высоко злокачественных опухолей является утрата ими зависимости от
внешних
центральных
регуляторов
и,
как
следствие,
автономный
"самоподдерживающийся" рост, регулируемый локально продуцирующимися факторами.
К числу важных локальных (ауто- и паракринных) регуляторов пролиферации опухолевых
клеток относятся так называемые факторы роста - пептиды и белки, продуцируемые
опухолевой
клеткой
или
окружающей
ее
стромой
и
взаимодействующие
с
соответствующим рецептором на мембране самой клетки-продуцента, либо на мембране
соседней клетки. К настоящему времени уже известен не один десяток факторов роста,
имеющих множественные изоформы и взаимодействующих с различными рецепторами,
однако предметом нашего внимания является только одна группа небольших
полипептидов с молекулярной массой около 6000 дальтон, взаимодействующих с общим
мембранным рецептором, называемым по наиболее известному из своих лигандов
рецептором эпидермального фактора роста (РЭФР).
Помимо собственно эпидермального фактора роста (ЭФР), специфическими лигандами
РЭФР являются a-трансформирующий фактор роста (a-ТФР), фактор роста вируса
коровьей оспы и некоторых других вирусов группы оспы, а также открытые относительно
недавно пептиды - амфирегулин, cripto, бетацеллюлин, связывающий гепарин ЭФРподобный фактор. Они имеют между собой 24-40% гомологии по первичной структуре, но
сходны
по
пространственному
строению
благодаря
наличию
консервативных
последовательностей в областях 3-х дисульфидных мостиков, определяющих и
стабилизирующих
конформацию
молекул.
Эти
пептиды
оказывают
сходные
биологические эффекты на чувствительные клетки, а также способны перекрестно
индуцировать синтез друг друга. До недавнего времени ЭФР рассматривался как наиболее
важный регулятор РЭФР-зависимого пути пролиферации в нормальных тканях взрослого
организма, а a-ТФР - как регулятор эмбрионального развития, играющий также
существенную роль при злокачественной трансформации клеток.
РЭФР, крупный трансмембранный гликопротеин с мол. массой 170000 дальтон, является
продуктом одного из онкогенов семейства erb - c-erbB1, относится к числу рецепторных
тирозинкиназ (РТК), важных регуляторов клеточной пролиферации и злокачественной
трансформации, принципиальной особенностью которых является трансмембранная
локализация и необходимость во взаимодействии с соответствующим полипептидным
лигандом для реализации киназной активности.
Молекула РЭФР, как и молекулы всех рецепторных тирозинкиназ, состоит из 3-х
основных
доменов:
внеклеточного
N-концевого
гликолизированного
лиганд-
связывающего участка, составляющего около 50% всей молекулы (621 из 1173
аминокислотных остатков) и обеспечивающего специфичность восприятия сигнала;
собственно
гидрофобных
трансмембранного
аминокислот,
и
a-спирального
участка,
внутриклеточного
состоящего
тирозинкиназного
всего
из
домена
23
(542
аминокислоты), наиболее консервативного участка.
Благодаря исследованиям последних лет структура РЭФР описана весьма детально, и в
каждом из главных доменов теперь также выделяются различные функционально важные
участки. Так, в лиганд-связывающем домене выделяют 2 цистеин-богатых участка,
стабилизирующих вторичную структуру домена, и 2 глобулярных, богатых глицином,
фрагмента, которые и ответственны, по-видимому, за узнавание специфических лигандов.
Непосредственно к трансмембранной спирали с внутриклеточной стороны примыкает
небольшой, так называемый околомембранный регуляторный фрагмент, затем следуют
собственно киназный, АТФ-связывающий участок, еще один "шарнирный" (hinge)
регуляторный фрагмент и, наконец, аутофосфорилируемый С-концевой субдомен. В
регуляторных фрагментах находятся остатки треонина и серина, которые могут
фосфорилироваться внутриклеточными протеинкиназами, такими как протеинкиназа С
(ПКС) или митоген-активируемая протеинкиназа (МАП киназа) или киназа МАП киназы.
Предполагается, что фосфорилирование Тре654 в околомембранном фрагменте под
действием ПКС и, возможно, некоторых других протеинкиназ аллостерически регулирует
сродство рецептора к лиганду и активность киназного домена, а фосфорилирование Тре 669
и Сер671, а также нескольких сериновых остатков в "шарнирном" участке МАП киназой
регулирует скорость ЭФР-зависимой интернализации рецептора. В С-концевом участке
молекулы РЭФР находится по крайней мере 4 остатка тирозина (Тир1068, Тир1086, Тир1148 и
Тир1173), которые аутофосфорилируются внутренней РТК. Именно эти фрагменты
молекулы РЭФР распознаются эффекторными или адаптерными белками и обеспечивают
передачу регуляторных сигналов и реализацию эффектов факторов роста.
Эксперименты по связыванию меченых лигандов с РЭФР свидетельствуют о том, что
взаимодействие происходит в стехиометрическом соотношении 1:1, однако анализ
методом Скэтчарда указывает на возможность существования в одной и той же клетке
двух типов РЭФР с высоким (Кd = (1-3)х10-10 М) и низким (Кd = (2-15)х10-9 М) сродством к
лигандам. Функциональное значение каждого из этих типов РЭФР пока четко не
разграничено. После связывания лиганда происходит димеризация рецептора, активация
внутренней тирозинкиназы, аутофосфорилирование и изменение конформации рецептора,
способствующее связыванию и фосфорилированию экзогенных субстратов.
Оба основных функциональных участка молекулы РЭФР могут стать мишенью действия
соответствующих блокаторов. Взаимодействие связывающего участка с лигандом может
быть подавлено неспецифическими (типа сурамина) и специфическими (в первую
очередь,
моноклональными
антителами
к
рецептору)
агентами,
а
активность
тирозинкиназы - различными ингибиторами, которых в настоящее время разработано уже
много, и некоторые из которых достаточно специфичны для тирозинкиназы РЭФР.
Установлено также, что моноклональные антитела к РЭФР подавляют рост опухолей
только в том случае, если происходит торможение аутофосфорилирования РЭФР.
Связывающий участок РЭФР может быть мишенью и еще для одного класса
противоопухолевых препаратов - гибридных белков, содержащих конъюгаты факторов
роста и бактериальных токсинов или других цито-токсических агентов. В данном случае,
РЭФР выступает уже в качестве направленного переносчика токсического агента в
опухолевую клетку.
Известно, что некоторые мутации в молекуле РЭФР приводят к стабилизации его
димерного состояния, постоянной активации тирозинкиназы в отсутствии лиганда или к
ингибированию процесса интернализации рецепторов. Все они способствуют сохранению
трансформированного фенотипа и делают клетку устойчивой к действию агентов,
подавляющих связывание лиганда с рецептором. В опухолях с такими мутантными
рецепторами, наряду с ингибиторами тирозинкиназы, важную роль приобретают и
препараты, блокирующие последующие этапы реализации митогенных сигналов факторов
роста.
Важнейшие внутриклеточные сигнальные системы, в регуляции которых участвует РЭФР,
- это метаболизм фосфатидилинозитола и система гена ras, включающая целый каскад
митоген-активируемых протеинкиназ.
Метаболизм фосфатидилинозитола (PI) - это один из первых процессов, для которых было
доказано
регуляторное
действие
ЭФР-рецепторной
системы.
Этот
фосфолипид,
составляющий относительно небольшую фракцию липидов клеточной мембраны,
является тем не менее важным вторичным мессенджером и играет центральную роль во
многих внутриклеточных сигнальных системах. Действие ЭФР на клетки, содержащие
соответствующие
фосфоинозитидов.
рецепторы,
вызывает
Наиболее
быстрое
существенной
увеличение
частью
скорости
сложного
обмена
метаболизма
фосфоинозитола (рис.2) является фосфорилирование и дефосфорилирование различных
участков инозитольного кольца, а ключевой реакцией, в регуляции которой участвует
активированный
ЭФР-рецепторный
комплекс,
является
превращение
одного
из
промежуточных продуктов метаболизма PI - PI-4,5-бифосфата (PIР2) - под действием
фосфолипазы С (ФЛС) в инозитол-1,4,5-трифосфат (IР3) и диацилглицерол (ДАГ). Каждое
из этих веществ само по себе служит важным вторичным мессенджером: IР3 мобилизует
свободный внутриклеточный Са2+, а ДАГ активирует протеинкиназу С - ключевой
фермент регуляции пролиферации, транскрипции, промоции опухолей. ПКС в свою
очередь активирует фосфолипазу D, стимулируя тем самым гидролиз другого важного
фосфолипида - фосфатидилхолина.
Участие ЭФР в регуляции этих процессов осуществляется, по-видимому, в результате
того, что активированный РЭФР связывает и затем фосфорилирует одну из форм ФЛС ФЛСy-1, переводя ее в активное состояние. Активированный РЭФР связывает и,
возможно, фосфорилирует также еще ряд ферментов метаболизма фосфоинозитола киназы PI 3, PI 4 и PIР 5. При этом если роль двух последних ферментов достаточно
очевидна и заключается в осуществлении последовательного превращения PI -> PIР ->
PIР2 с образованием субстрата ФЛС, то значение активации PI 3, превращающей PI, PIР и
PIР2 в соответствующие производные, содержащие фосфатную группу в положении D3
инозитольного кольца и не гидролизуемые ни одной из форм ФЛС, остается пока не
вполне ясным. Исследования последних лет показали, однако, что активация PI 3 киназы,
происходящая непосредственно под действием фосфорилированного РЭФР, является
пусковым механизмом, обеспечивающим ras-независимую стимуляцию некоторых
важных регуляторных киназ, таких как pp70 S6, Akt/Rac, а также ras-зависимую
стимуляцию JNK-киназы.
Другой важнейшей системой, регулируемой с участием активированного РЭФР, является
система гена ras. Продукт гена ras, белок р21ras, представляет собой регуляторный
трансмембранный G белок (белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды). Так же, как
другие G белки, р21ras активен в ГТФ-связанном состоянии и неактивен в ГДФ-связанной
форме. G белки участвуют в передаче внеклеточных регуляторных сигналов гормонов,
факторов роста, нейромедиаторов к системе внутриклеточных вторичных мессенджеров.
Непосредственной мишенью действия активированного р21ras является внутриклеточная
серин-треониновая протеинкиназа raf (белок р74c-raf), гомологичная белкам семейства
РКС. Raf-киназа, в свою очередь, активирует целый каскад внутриклеточных киназ МАП
киназ
и
собственно
МАП
киназ.
В
результате
этой
активации
происходит
фосфорилирование протоонкогена с-jun, являющегося транскрипционным фактором, и
индукция транскрипции онкогенов с-fos, c-myc и других генов, инициирующих митоз.
Raf-киназа
может
также
непосредственно
фосфорилировать
и,
соответственно,
активировать находящийся в цитоплазме неактивный c-myc, в результате чего он
возвращается в ядро и связывается со специфическими участками хроматина, инициируя
экспрессию с-fos, с-jun и с-ras.
Таким образом, можно более или менее детально представить процесс передачи
регуляторного сигнала ЭФР (и др. лигандов РЭФР) от клеточной мембраны к ядру.
Дальнейшие исследования показали, что активированные РТК оказывают влияние на ras
не непосредственно, а через сложную цепь адаптерных и эффекторных белков. С одной
стороны, молекула rasGAP содержит аминокислотную последовательность SH2 (src
homology 2) - белковый домен размером около 100 аминокислот, наличие которого, повидимому, является отличительным признаком всех субстратов РТК, так как именно они
узнают фосфорилированные последовательности активированных РТК (SH2 домены
присутствуют, в частности, в структуре ФЛС*, PI 3 киназы и других субстратов РТК.
Таким образом, rasGAP может непосредственно фосфорилироваться киназой РЭФР. С
другой стороны, расшифрована цепочка молекул, передающих активирующий сигнал от
РТК к факторам обмена нуклеотидов, в частности, к белку, получившему название SOS
из-за своей гомологии с регуляторным белком дрозофилы "son of sevenless".
Непосредственным переносчиком сигнала от фосфорилированного рецептора к SOS
служит так называемый белок GRB2 (Growth Factor Receptor Bound 2), имеющий в своем
составе как один узнаваемый РТК SH2 домен, так и два домена SH3 (src homology 3) небольшие последовательности примерно из 50 аминокислот, способные узнавать богатые
пролином участки в некоторых белковых молекулах. В передаче сигнала может
участвовать также еще один небольшой белок (small connector protein - shc; 42 - 66 kDa),
который содержит SH2, но не SH3 домен, фосфорилируется РЭФР и взаимодействует с
GRB2.
По последним данным, путь РЭФР- shc - GRB2 - SOS более важен для активации ras, чем
прямое взаимодействие РЭФР с GRB2. Показано также, что весь процесс активации ras
происходит на клеточной мембране, куда транслоцируются соответствующие белки после
аутофосфорилирования РЭФР, в результате чего регуляторный белок SOS оказывается в
непосредственной близости от эффекторного белка р21ras. В связи с этим важную роль в
процессе передачи митогенного сигнала ЭФР через систему ras играет реакция
фарнезилирования
белка
р21ras
-
присоединения
к
его
С-концевому
участку
специфического липидного фрагмента, обеспечивающего прикрепление этого белка к
клеточной мембране. С-фарнезилирование, обеспечивающее прикрепление белка к
мембране, важно также и для активации PI-3-киназы. В этой связи ингибиторы
фарнезилирования считаются в настоящее время одним из перспективных новых классов
противоопухолевых агентов.
Hsuan предложил теоретическую схему, согласно которой могут взаимодействовать
между собой два главных пути передачи митогенных сигналов факторов роста (активация
обмена фосфатидилинозитола и активация системы ras). Представленная им модель
предполагает возможность образования на клеточной мембране вокруг активированной
РТК
(в
частности,
РЭФР)
олигомолекулярного
комплекса
высокого
порядка,
включающего всю совокупность РТК-регулируемых киназ, адаптерных и эффекторных
молекул и обеспечивающего передачу регуляторных сигналов и взаимодействие между
различными внутриклеточными сигнальными системами. Некоторые теоретические
предположения уже нашли свое подтверждение в экспериментальных исследованиях.
Описанная выше достаточно сложная схема механизма действия факторов роста,
опосредуемого их специфическими рецепторами, является тем не менее достаточно
упрощенной и не охватывает всех возможных эффектов активированных РТК, которые
могут включать взаимодействие с белками цитоскелета, регуляцию активности
протеинфосфатаз, а также прямое фосфорилирование транскрипционных факторов. Кроме
того, эта схема предполагает наличие только мембранно-цитоплазматических эффектов,
однако в последнее время появились исследования, свидетельствующие о том, что ЭФРрецепторные комплексы могут также транслоцироваться в ядро клетки.
Блокирование любого из этапов передачи митогенного сигнала факторов роста может, в
принципе, привести к нарушению регуляции пролиферации опухолевых клеток и,
потенциально, к торможению роста опухоли. В эксперименте уже исследовано достаточно
большое
количество
специфические
и
препаратов,
неспецифические
влияющих
блокаторы
на
вышеперечисленные
связывания
РЭФР
с
процессы:
лигандами,
ингибиторы тирозинкиназы и МАП-киназ, блокаторы связывания SH2 доменов
эффекторных
белков
с
активированным
рецептором,
соединения,
подавляющие
активацию гена ras, в том числе, ингибиторы фарнезилирования, и др. Большинство из
них находятся на стадии предклинического изучения, хотя ряд препаратов (в частности,
моноклональные антитела к РЭФР) уже прошли I фазу клинических испытаний и
показали себя достаточно эффективными при некоторых видах опухолей. Данные об
основных классах препаратов, влияющих на РЭФР-зависимые процессы, суммированы в
таблице, а результаты их экспериментального и клинического изучения подробно
рассмотрены в наших обзорах. Показано также, что компоненты ЭФР-зависимой цепочки
передачи митогенного сигнала могут стать мишенью действия и таких достаточно активно
использующихся препаратов, как тамоксифен, аналогов люлиберина и аналогов
соматостатина.
Еще одним из активно развивающихся в последнее время подходов к лечению
злокачественных опухолей путем воздействия на процессы передачи митогенных
сигналов является использование антисмысловых РНК (или олигонуклеотидов) к
различным
компонентам
этой
системы,
которые
будут
подавлять
биосинтез
соответствующих белков. Сейчас уже сконструированы такие РНК для РЭФР, a-ТФР и
некоторых других регуляторных молекул.
Существует несколько путей повышения эффективности разработки и использования
подобных препаратов, а именно: изучение структурных особенностей молекул-мишеней
для создания наиболее специфичных блокаторов, детальная расшифровка механизма
передачи митогенного сигнала для выявления новых потенциальных мишеней, уточнение
механизмов действия созданных препаратов в условиях in vitro и изучение их
фармакодинамики и фармакокинетики у экспериментальных животных. Но кроме этого,
для успешного и целенаправленного использования всех вышеперечисленных препаратов
в
клинике
необходимо
не
только
углубленное
предклиническое
изучение
их
эффективности, но и выявление спектра потенциально наиболее чувствительных
опухолей, основанное на исследовании соотношения экспрессии РЭФР и их лигандов с
активностью и экспрессией ЭФР- регулируемых ферментов и процессов в опухолях
человека. Для оценки возможности избирательного действия препарата на опухолевые
клетки важно также сравнительное изучение экспрессии белков-мишеней или активности
ингибируемых процессов в опухоли и в окружающей ее гистологически неизмененной
ткани.
В лаборатории клинической биохимии РОНЦ РАМН уже несколько лет проводится
исследование содержания рецепторов эпидермального фактора роста и их лигандов в
различных опухолях человека - функциональной активности РЭФР по критерию влияния
ЭФР на скорость обмена фосфолипидов в изолированных опухолевых клетках in vitro. В
этих
исследованиях мы
используем
радиолигандные,
радиоиммунологические
и
радиорецепторные методы. Одной из задач этого скрининга является выявление спектра
опухолей, потенциально чувствительных к препаратам, блокирующим различные этапы
ЭФР-зависимой стимуляции пролиферации.
В настоящее время уже исследовано более 500 образцов опухолей различных локализаций
у взрослых больных и у детей: это опухоли женской репродуктивной системы, опухоли
костей, рак легкого, рак пищевода у взрослых; некоторые наиболее часто встречающиеся
солидные опухоли детей. Самый большой материал нами собран при раке молочной
железы (291 опухоль), однако чаще всего РЭФР выявлялись при раке легкого и
злокачественных опухолях костей. Как правило, частота выявления лигандов (ЭФР-
подобных пептидов) такая же или даже больше, чем частота выявления рецепторов, что
позволило нам высказать предположение о том, что именно наличие РЭФР является
лимитирующим фактором при определении чувствительности опухоли к данному типу
ауто/паракринной регуляции.
Для каждой локализации опухоли проводится детальный анализ взаимосвязи экспрессии
РЭФР и их лигандов с основными клинико-морфологическими факторами прогноза, а
также ретроспективный анализ влияния их экспрессии на безрецидивную и общую
выживаемость больных. Недавно завершен ретроспективный анализ влияния экспрессии
РЭФР на 5-летнюю безрецидивную и общую выживаемость больных ранними стадиями
рака молочной железы. Сравнение кривых безрецидивной выживаемости больных без
метастазов в лимфатических узлах с условно "эндокринным" рецепторным фенотипом
опухоли (РЭФР*РЭ+РП+) и больных с условно "ауто/паракринным" фенотипом
(РЭФР+РЭ*РП*) выявило значительное и достоверное увеличение выживаемости в
первой группе по сравнению со второй. Эта разница была наиболее выражена в ранние
сроки после операции, сглаживалась при более длительном наблюдении и полностью
исчезала к 5-му году после операции.
Результаты многофакторного регрессионного анализа безрецидивной выживаемости
больных,
получавших
адъювантную
гормоно-
или
химиогормонотерапию,
свидетельствуют о том, что риск рецидивирования и/или метастазирования в наибольшей
степени увеличивается при наличии в опухоли РЭФР, а влияние экспрессии РЭ и РП на
риск возврата заболевания значительно меньше. Наилучшая безрецидивная выживаемость
ожидается у больных с РЭФР*РЭ+ опухолями, а наихудшая - у больных с РЭФР+РЭ*
опухолями. В то же время, безрецидивная выживаемость двух других групп больных
определяется скорее статусом РЭФР, чем статусом РЭ: безрецидивная выживаемость
больных с РЭФР*РЭ* опухолями лучше, чем у больных с РЭФР+РЭ+ опухолями.
Таким образом, больные с РЭФР+РЭ*РП* опухолями даже на ранних стадиях заболевания
относятся к группе повышенного риска рецидивирования и/или метастазирования, они
относительно
устойчивы
к
эндокринной
терапии,
но
вполне
могут
оказаться
чувствительными к препаратам, влияющим на РЭФР-зависимые процессы.
Интересные закономерности выявлены нами для больных остеосаркомой: при содержании
РЭФР в опухоли от 10 до 150 фмоль/мг белка мембран безрецидивная выживаемость
больных остеосаркомой оказалась достоверно меньшей, чем при содержании РЭФР более
150 или менее 10 фмоль/мг белка. Можно предположить, что при этом злокачественном
новообразовании существует лишь определенный диапазон концентраций РЭФР, при
котором их экспрессия оказывает неблагоприятное влияние на прогноз заболевания, и, повидимому, именно при таких уровнях экспрессии рецепторов в опухоли использование
РЭФР-блокирующих препаратов может оказаться наиболее эффективным.
При немелкоклеточном раке легкого значимым для предсказания прогноза заболевания и
для выбора группы больных, потенциально чувствительных к анти-РЭФР-направленным
препаратам, оказалось одновременное исследование РЭФР и ЭФР-подобных пептидов: к
прогностически неблагоприятной группе были отнесены больные, опухоли которых
одновременно экспрессировали и рецепторы, и их лиганды.
Таким образом, приведенные выше примеры свидетельствуют о том, что набор
показателей и количественные критерии, используемые для оценки потенциальной
чувствительности опухолей к препаратам, влияющим на РЭФР-зависимые процессы,
могут существенно отличаться для больных опухолями различных локализаций, поэтому
необходимо проводить специальные исследования при каждой из нозологий.
В последнее время продолжаем исследования по новой схеме - в опухолях молочной
железы и гомологичной гистологически неизмененной ткани изучаем два ключевых
фермента, участвующих в реализации эффектов активированных РЭФР - МАП-киназу
р42/р44, так называемую ERK - конечное звено каскада киназ, осуществляющего передачу
сигнала активированного ras к ядерным структурам, - и фосфатидилинозитол-3-киназу,
один из компонентов фосфолипидного цикла, непосредственно фосфорилируемый и
активируемый тирозинкиназой РЭФР и запускающий активацию еще одного каскада
протеинкиназ. Активность МАП-киназы определяем радиоизотопным методом по
фосфорилированию специфического субстрата с последующим его осаждением на
фильтрах. Кроме того, проводится определение количества иммунореактивного белка PI3-киназы и МАП-киназы методом Western blot анализа. Все эти исследования находятся
на начальном этапе, однако есть некоторые интересные предварительные данные. В
частности, удалось показать, что количество иммунореактивного белка PI-3-киназы в
опухолях значительно выше, чем в окружающей ткани молочной железы, что является
обнадеживающим в плане избирательности действия соответствующих ингибиторов на
опухолевую ткань.
Полагаем, что характеристика соотношения и активности различных компонентов
сигнальной цепочки, активируемой под действием ауто/паракринных факторов роста, в
опухолях человека должно обязательно проводиться параллельно с разработкой новых
препаратов, воздействующих на эту систему регуляции, для того чтобы их клинические
испытания и возможное применение были максимально эффективными.