Работа 2.

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ ДЛЯ СТУДЕНТОВ
ФАКУЛЬТЕТА ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ
ПО КУРСУ: "БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ"
Методические указания по курсу: "Биологическая химия" предназначены
для использования при выполнении лабораторных работ и самостоятельной
подготовки студентов факультета ветеринарной медицины по направлениям
«Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза»
Ставрополь, 2013 г.
ВВЕДЕНИЕ
Биохимия животных изучает химический состав организма животного,
обмен веществ и энергии в нем. Успехи биохимии превратили ее из науки
описательной в науку преобразующую.
Знание биохимических процессов поможет специалисту направленно
влиять на обмен веществ с целью повышения продуктивности животных,
диагностики заболеваний и организации лечебных мероприятий,
эффективного использования кормов и добавок биологически активных
веществ.
В биохимических отделах и лабораториях для контроля за состоянием
обмена веществ у животных используют современные биохимические и
биофизические
методы
–
электрофорез,
фотоколориметрию,
спектрофотометрию, хроматографию, полярографию и др.
Задачей биологической химии является изучение теоретических основ и
обучение студентов практическим навыкам для проведения таких
исследований и анализа полученных результатов. Студенты, получив на
лекциях в кратком виде основы теоретических знаний, самостоятельно
проработав учебный материал и конспекты, на лабораторных занятиях путем
беседы с преподавателем показывают, как они разобрались в этих разделах
дисциплины и что требуют дополнительной проработки.
Лабораторный практикум позволит студентам освоить основные
методики биохимических исследований с использованием таких приборов,
как рН-метр, рефрактометр, фотоколориметр, аппарат для электрофореза, и на
основании теоретических знаний, расшифровать полученные результаты.
ПРАВИЛА ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ
В ХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Приступая к работе в лаборатории, необходимо внимательно изучить
возможные причины несчастных случаев и меры их предупреждения.
В химической лаборатории разрешается работать только в халатах.
В помещении лаборатории необходимо поддерживать порядок и чистоту,
соблюдать тишину. Запрещается пить воду, принимать пищу, курить,
пробовать на вкус химические вещества.
По окончании пользования газом, водой и электричеством немедленно
закрыть краны и выключить электроприборы.
Перед тем, как набрать какой-либо химический реактив, внимательно
прочтите надпись на этикетке.
Крышки и пробки от банок и флаконов нужно класть на стол
поверхностью, не соприкасающейся с реактивом, а по окончанию пользования
реактивом закрыть флаконы той же пробкой.
Определяя запах вещества, нужно направлять струю воздуха в сторону
носа легкими движениями кисти руки над отверстием пробирки.
Избегать контакта с любыми неорганическими и органическими
реактивами.
Неиспользованные химические реактивы нельзя возвращать в ту же
склянку.
Порезы рук стеклом часто происходят при закрывании пробирки пробкой
с газоотводной трубкой. Следует запомнить, что нужно прилагать лишь
небольшие усилия, держась за резиновую пробку, но не за трубку. В случае
пореза ранку промывают водой, очищают от осколков стекла и смазывают
спиртовым раствором иода.
При термическом ожоге нужно обожженное место смочить 5% раствором
танина в 40% этиловом спирте. При ожоге крепкими кислотами следует
немедленно промыть обожженный участок большим количеством воды, затем
наложить компресс из ваты, смоченной 1% раствором содой. При ожоге
щелочами – действия те же, но компресс 1% раствор уксусной кислоты.
При попадании кислоты или щелочи в глаза, их обильно промывают
водой, а затем 2% раствором борной кислоты (для нейтрализации щелочи),
либо 2% раствором гидрокарбоната натрия (для нейтрализации кислоты).
При небольших ожогах фенолом пораженный участок кожи смазывают
глицерином.
Причина выброса – нагревание жидкости выше температуры кипения.
Вероятность перегрева увеличивается при нагревании пробирки на открытом
пламени, особенно при наличии в жидкости осадка. Для предотвращения
выброса реакционной смеси необходимо:
– перед нагреванием в реакционную смесь добавить кипятильный
камешек;
– пробирку нагревать в наклонном положении, а не вертикально;
– при нагревании вращать пробирку вдоль оси, иногда осторожно
встряхивая; отверстие пробирки направлять в сторону от себя и от соседа.
Работу с ядовитыми веществами и концентрированными кислотами,
щелочами следует проводить в вытяжном шкафу, предварительно включив
тягу, при этом не вводить голову внутрь шкафа.
Растворы сильных кислот и щелочей, а также ядовитых веществ
отмеривать только цилиндрами, а не пипетками.
При работе с кислотами надо твердо помнить правило смешивание
крепкой серной кислоты с водой – кислоту вливать в воду небольшими
порциями, а не наоборот.
ЗАДАНИЕ 8
ТЕМА: ОБМЕН БЕЛКОВ.
Работа 1. Исследование действия пепсина.
Ход работы: Взять 5 пробирок и в четыре из них отмерить по 2 мл 0,1 %
раствора пепсина в 0,2 % растворе HCl или по 1 мл желудочного сока. Кислое
содержимое второй пробирки нейтрализовать по лакмусу 1 % раствора
Nа2СО3. Содержимое третьей пробирки подщелачивают 0,4 % раствором
NaOH, а содержимое четвертой пробирки кипятят в течение 2-3 минут. В
пятую пробирку отмерить только 1 мл 0,2 % HCl.
Во все пять пробирок добавить одинаковые кусочки измельченного
фибрина и поместить их в термостат при 38° на 30 минут. Затем пробирки
вынимают из термостата и отмечают изменения, происшедшие в них.
Отфильтровать содержимое всех пробирок и с фильтратом проделать
биуретовую пробу. Сделать выводы.
Работа 2. Количественное определение мочевины в сыворотке крови по
цветной реакции с диацетилмонооксимом.
Мочевина является основным конечным продуктом обмена белков. У
млекопитающих синтез мочевины протекает из аммиака и углекислого газа в
клетках печени. Более 50 % небелкового азота крови приходится на долю
мочевины. Выводится мочевина почками с мочой и суточное количество ее
зависит от характера кормления.
Принцип метода: в основе метода лежит реакция образования
окрашенных комплексных соединений диацетилмонооксима с мочевиной в
присутствии тисемикарбазида и трехвалентного железа в кислой среде.
Интенсивность окрашивания пропорциональна содержанию мочевины в
исследуемой жидкости.
Приборы и реактивы. Фотоэлектроколориметр, пипетки на 1,0 и 5,0 мл,
пробирки, штатив, водяная баня, фольга, рабочий раствор, калибровочный
раствор мочевины, сыворотка крови.
Приготовление реактивов.
Реактив 1. Растворить смесь диацетилмонооксима (1 г) и
тиосемикарбозида (0,175 г) в горячей воде (около 100 мл) мерной колбе
объемом 1000 мл, добавить 10 мл раствора соли трехвалентного железа (5
ммоль/л) и довести объем до 1000мл.
Реактив 2. В мерную колбу внести около 500 мл дистиллированной воды
и при постоянном помешивании и охлаждении постепенно добавить 100 мл
концентрированной серной кислоты. По охлаждении довести объем до 1000
мл.
Рабочий раствор (готовится непосредственно перед определением) к
одной части реактива 1 добавить одну часть реактива 2.
Ход работы. В пробирки вносят реагенты по схеме:
Реагент
Опытная проба
Сыворотка крови, мл
Калибровочный раствор, мл
Вода дистиллированная, мл
Рабочий раствор, мл
0,05
–
0,45
5,0
Калибровочная Холостая
проба
проба
–
–
0,05
–
0,45
0,5
5,0
5,0
Тщательно перемешивают, закрывают пробирки пробками из фольги и
кипятят на водяной бане 15 минут, затем охлаждают под током водопроводной
воды. Измерение провести непозднее, чем через 15 минут после охлаждения
на фотоэлектроколориметре против холостой пробы при длине волны 540 нм
(зеленый светофильтр), в кюветах толщиной слоя 10 мм.
Расчет провести по формуле:
С
Еоп
 8,33 ммоль / л ,
Ек
где С – концентрация мочевины
Еоп – оптическая плотность опытной пробы
Ек – оптическая плотность калибровочной пробы
8,33 ммоль/л – концентрация мочевины в калибровочной пробе.
Работа 3. Гидролиз мочевины.
Уреаза относится к классу гидролаз, катализирует гидролиз мочевины до
аммиака и угольной кислоты. Этот фермент находится в животных тканях и
содержится в некоторых растениях, например в сое.
Ход работы: Налить в пробирку 2 - 3 мл воды, растворить в ней несколько
кристаллов мочевины, добавить 2-3 капли фенолфталеина и 0,5 г соевой муки,
содержащей уреазу. Пробирку поставить в водяную баню при 38ºС на 20 мин
или нагревать в руке.
Вскоре появляется малиновая окраска, что указывает на сдвиг рН в
щелочную сторону в результате образования и накопления аммиака.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ.
1. Роль белков в животном организме Биологическая полноценность
белков и белковый минимум. Что такое азотистый баланс?
2. Какие аминокислоты относятся к незаменимым и почему? Написать их
названия.
3. Какие известны типы дезаминирования аминокислот? Написать
реакцию окислительного дезаминирования аланина.
4. Написать схему орнитинового цикла синтеза мочевины.
5. Что такое переаминирование и какую роль в этом процессе играет
фосфопиридоксаль?
Написать
реакцию
переаминирования
между
глютаминовой и пировиноградной кислотами.
6. Что такое декарбоксилирование аминокислот? Написать реакции
декарбоксилирования гистидина, триптофана, тирозина.
7. Где и в результате каких превращений образуются токсичные
продукты: фенол, крезол, индол, скатол и др.? Каким образом и где
происходит их обезвреживание в организме?
ЗАДАНИЕ 9
ТЕМА: ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.
Работа 1. Количественное определение мочевой кислоты в моче (по
методу Май Л.А.)
Аминопурины (аденин, гуанин), образуются в тканях при гидролизе
сложных белков-нуклеопротеидов, содержащих ДНК и РНК. Они под
влиянием дезаминаз подвергаются гидролитическому дезаминированию с
образованием гипоксантина и ксантина, а последние под влиянием
окислительных ферментов, окисляются в мочевую кислоту.
Принцип метода. Мочевая кислота в щелочной среде восстанавливает
фосфорновольфрамовый реактив с развитием синего окрашивания. При
обработке этого соединения раствором К4[Fe(CN6)] она окисляется и синий
цвет исчезает. Количество израсходованного на окисление К4[Fe(CN6)]
эквивалентно количеству исходной мочевой кислоты.
Ход работы: К 5 мл свежей мочи прибавить 5 мл 20 % раствора NaOH
(осторожно!) и 5 мл фосфорновольфрамового реактива. Развивается темносинее окрашивание. Его титруют раствором К4[Fe(CN6)] до исчезновения
синего окрашивания.
5 мл стандартного раствора мочевой кислоты обрабатывают так же, как и
пробу мочи, прибавляя 5 мл раствора NaOH и 5 мл фосфорновольфрамового
реактива, а затем титруют синюю смесь феррицианидом до исчезновения
синего окрашивания.
Расчет. Так как берут одинаковые объемы мочи и стандартного раствора,
то концентрацию мочевой кислоты в моче можно рассчитать по концентрации
ее в стандартном растворе по формуле : Х = (0,0025 ∙ А ∙ 20)/В,
где: А - количество К4[Fe(CN6)], пошедшее на титрование мочи.
Х - содержание мочевой кислоты, г
В - количество К4[Fe(CN6)], пошедшее на титрование стандартного
раствора мочевой кислоты.
0,0025 - количество г мочевой кислоты в 5 мл стандартного раствора.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ.
1. Охарактеризуйте основные этапы биосинтеза белка в клетке,
2. Какую роль в синтезе белка выполняет ДНК и РНК?
3. Какие соединения являются конечными продуктами белкового обмена?
Написать их формулы.
4. Какие ферменты осуществляют биосинтез РНК и ДНК?
5. Напишите схему окисления пуриновых оснований до мочевой кислоты
и аллантоина.
6. Биохимия гена и перенос генетической информации. Основные этапы
образования трансгенов (генной инженерии).
КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ:
ОБМЕН БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.
ЗАДАНИЕ 10
ТЕМА: ОБМЕН УГЛЕВОДОВ.
Работа 1. Переваривание крахмала пищеварительными соками.
Ход работы: В три пробирки отмеривают по 3 мл 0,5% раствора крахмала,
В первую прибавляют 1 мл слюны (предварительно разведенной водой 1:10),
во вторую - 1 мл желудочного сока и в третью - 1 мл вытяжки из
поджелудочной железы (100 мг высушенной поджелудочной железы
тщательно растереть в ступке с 5 мл воды, профильтровать через марлю). Из
всех пробирок взять по 1 капле на предметное стекло и проделать йодную
пробу, а затем, через каждые 5 минут повторять йодную пробу, записывая
окраску.
Через 45 минут с содержимым всех трех пробирок проделать реакцию с
реактивом Феллинга. Результаты работы занести в таблицу:
№
Кол-во р-ра
п/п
Пищеварительный
крахмала,
сок.
мл
Время проведения йодной пробы,
минуты
5
1
2
3
10
15
30
35
40
Реакция
реактиво
м
Феллинга
45
Слюна (1:10)
Желудочный сок.
Вытяжка
из
поджелудочной
железы.
Сделать выводы.
3
3
3
Работа 2. Определение глюкозы (сахара) в крови с пикриновой кислотой.
Ход работы: В пробирку № 1, содержащую 1,8 мл воды, отмеривают 0,2
мл крови и 1 мл 1,2 % раствора пикриновой кислоты, смесь встряхивают и
фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный водой.
Содержимое пробирки № 2 (стандарт) обрабатывают, так же как и
первую, только вместо крови берут 0,2 мл стандартного раствора глюкозы.
Отфильтровать.
Пробирка № 3 - контроль. К 2 мл дистиллированной воды прибавляют 1
мл 1,2 % раствора пикриновой кислоты и фильтруют. Содержимое этой
пробирки используют для колориметрии, вместо кюветы с водой.
По 2 мл фильтрата переносят в чистые пронумерованные пробирки,
добавляют по. 0,2 мл 20 % раствора NаOH . После этого пробирки закрывают
пробкой и помещают на 5 минут в кипящую водяную баню. За это время
глюкоза крови восстанавливает пикриновую кислоту в оранжевое соединение.
Затем пробирки охлаждают и через 20 минут приступают к измерению
оптической плотности на фотоколориметре при синем светофильтре (№ 3),
кювете толщиной 5 мм. Расчет ведут по формуле:
Х = (а ∙ 100)/в ,
где: Х - содержание глюкозы в крови, мг %
а - экстинкция опытного раствора,
в - экстинкция стандартного раствора,
100 - концентрация стандартного раствора глюкозы, в мг %.
Работа 3. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови
глюкозооксидантным методом.
Приборы и реактивы. Фотоэлектроколориметр, пипетки на 1,0 и 5,0 мл,
пробирки, штатив, рабочий раствор (содержимое одного пакета ферментнохромогенной смеси растворяют в 100 мл дистиллированной воды, раствор
хранится в холодильнике при температуре 4–6 0С в течение недели),
калибровочный раствор глюкозы, сыворотка крови.
Ход работы. В пробирки вносят реагенты по схеме:
Реагент
Сыворотка крови, мл
Калибровочный раствор, мл
Вода дистиллированная, мл
Рабочий раствор, мл
Опытная
проба
0,04
–
–
2,0
Калибровочная Холостая
проба
проба
–
–
0,04
–
–
0,04
2,0
2,0
Растворы тщательно перемешивают, инкубируют 15 минут при 37 ºС или
30 минут при комнатной температуре, затем измеряют оптическую плотность
опытной и калибровочной проб против холостой пробы при длине волны 500
нм (зеленый светофильтр) в кюветах толщиной слоя 5 мм. При использовании
кювет толщиной слоя 10 мм необходимо использовать соотношение
исследуемая проба: рабочий реактив – 1:100 (например, 0,02 мл сыворотки и
2,0 мл рабочего раствора).
Расчет провести по формуле:
С
Еоп
10, 0 ммоль / л ,
Ек
где С – концентрация глюкозы
Еоп – оптическая плотность опытной пробы
Ек – оптическая плотность калибровочной пробы
10,0 ммоль/л – концентрация глюкозы в калибровочной пробе
Работа 4. Проба на спиртовое брожение.
Принцип метода. В анаэробных условиях глюкоза под действием
ферментов дрожжей превращается в спирт и углекислый газ.
Ход работы: Растереть в ступке 1,0 г дрожжей с 15 мл 5 % раствора
глюкозы. Полученную взвесь налить в бродильный приборчик так, чтобы
запаянное колено было заполнено целиком, а расширенная часть только
наполовину. Поставить приборчик на 45 – 60 мин в термостат при температуре
37°С. По истечении времени наблюдать выделение CO2, (газ собирается в
запаянном конце бродильной трубки).
Затем в приборчик добавить 1-2 мл 10% раствора NaОН, закрыть его
большим пальцем руки и перемешать. В результате поглощения углекислого
газа щелочью образуется вакуум и приборчик присасывается к пальцу.
Для обнаружения спирта 2-3 мл этой жидкости отфильтровать. К
прозрачному фильтрату прибавить несколько капель раствора йода, нагреть.
Появляется запах йодоформа.
Работа 5. Количественное определение пировиноградной кислоту в моче.
Пировиноградная кислота (ПВК) образуется в процессе окисления
глюкозы в качестве промежуточного продукта. В норме в плазме крови
содержится 0,8-1,5 мг% ПВК и за сутки с мочой выделяется до 200 мг ПВК.
При авитаминозе и гиповитаминозе В1 в крови и в других тканях, особенно в
мозге, ПВК накапливается в большом количестве.
Принцип метода. Количественное определение ПВК основано на
способности ее образовывать в кислой среде соединения с гидросульфитом
(NаHSO3 или KHSO3). Избыток добавленного гидросульфита затем связывают
йодом (при этом одновременно окисляются органические соединения мочи).
NaHSO3 + I2 + H2O → NaHSO4 + 2HI
После этого разрушают гидросульфитное соединение пировиноградной
кислоты в щелочной среде добавкой гидрокарбоната NаНСО3 Количество
освободившегося при этом гидросульфита эквивалентно ПВК. Гидросульфит
оттитровывают йодом. По количеству пошедшего на титрование йода
рассчитывают содержание пировиноградной кислоты.
Ход работы: В колбочку вносят: 1 мл мочи, 1 мл 0,1 N раствора щавелевой
кислоты, 9 мл воды дистиллированной (для осаждения кальция мочи), 10
капель свежеприготовленного раствора гидросульфита и все перемешивают.
Ставят в темное место на 15 минут для удаления избытка гидросульфита,
затем добавляют 2-3 капли раствора крахмала и 0,1 N раствора йода до синего
окрашивания.
Избыток йода удаляют, добавляя по каплям 0,1 N раствор тиосульфата
натрия до обесцвечивания.
Избыток тиосульфата удаляют, добавляя по каплям 0,01 N раствор йода
до появления синего окрашивания от одной избыточной капли раствора йода.
После этого приливают 10 капель насыщенного раствора гидрокарбоната
натрия (синяя краска при этом исчезает).
Содержимое колбочки оттитровывают 0,01 N раствором йода до
появления синего окрашивания, не исчезающего в течение 20-30 сек.
Количество 0,01 N раствора йода, пошедшее на титрование, эквивалентно
количеству пировиноградной кислоты.
Расчет: Количество ПВК в мг за сутки вычисляют по формуле:
(а ∙ б ∙ в ∙ 0,01)/1,0 ,
где: а- моль/л пировиноградной кислоты
б - количество мл 0,01 N раствора йода, пошедшее на титрование
в - суточное количество мочи
0,01 - нормальность раствора йода
1,0 -количество мл мочи, взятое для анализа.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ.
1. Перечислите углеводы животных и растительных организмов и их
функции. Напишите структурные формулы глюкозы, фруктозы,
галактозы, рибозы.
2.
Охарактеризуйте
основные
физико-химические
свойства
моносахаридов.
3. Мукополисахариды. Напишите их схемы строения и функции в
животном организме.
4. Перечислите ферменты пищеварительного тракта участвующие в переваривании углеводов?
5.Особенности переваривания углеводов у жвачных животных?
Напишите схему гидролиза целлюлозы и формулы летучих жирных
кислот.
6. Как осуществляется синтез и распад гликогена.
7. Напишите суммарные реакции гликолиза и гликогенолиза. Что
понимают под «эффектом Пастера»?
8. Напишите основную сопряженную реакцию гликолиза и подпишите
под формулами названия этих соединений.
9. Напишите схему окисления активной уксусной кислоты в цикле
трикарбоновых кислот.
10. Напишите схему пентозофосфатного пути окисления глюкозы
(пентозного цикла).
КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ: ОБМЕН УГЛЕВОДОВ.
ЗАДАНИЕ 11
ТЕМА: ОБМЕН ЛИПИДОВ.
Работа 1. Определение кислотного числа жира.
Кислотностью жира, или кислотным числом жира называется число мг
КОН, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот в
одном грамме жира.
Ход работы: В коническую колбочку отвешивают 1,0 г жира, прибавляют
5 мл спирта, нейтрализованного по фенолфталеину, колбочку слегка
нагревают до растворения жира и титруют 0,1 N раствором КОН до
появления розового окрашивания.
Расчет: 1,0 мл 0,1 N раствора КОН соответствует 5,6 мг КОН. Количество
КOH в мг, которое пошло на титрование свободных жирных кислот в 1,0
г жира рассчитывается по формуле:
С = А ∙ f ∙ 5,6 .
где: С - кислотное число жира, в мг КОН
А - количество 0,1 N раствора КОН, затраченное на титрование пробы, мл
f - коэффициент поправки на титр 0,1 N раствора КОН.
Работа 2. Эмульгирование жиров
Жиры не растворимы в воде. Чтобы подвергнуться действию липаз, они
должны предварительно эмульгироваться. Основным эмульгатором жиров в
пищеварительном тракте являются поверхностно-активные желчные кислоты,
которые с желчью поступают в двенадцатиперстную кишку, обволакивают
капельки жира и препятствуют их слиянию.
Белки,
мыла,
соли
угольной
кислоты,
содержащиеся
в
двенадцатиперстной кишке, также эмульгируют жир. Взбалтывая жир с водой,
можно наблюдать образование быстро расслаивающейся, нестойкой
эмульсии, а добавляя поверхностно-активные вещества, можно получить
стойкую эмульсию. Эмульгаторы легко адсорбируются на поверхности
раздела двух фаз, образуя тончайшую пленку, которая препятствует слиянию
капелек эмульсии.
Ход работы: В 5 пробирок наливают по 3 капли растительного масла.
Добавляют в первую пробирку 20 капель дистиллированной воды, во вторую
- 20 капель раствора желчи, в третью - 20 капель 1 % раствора яичного белка,
в четвертую - 20 капель 1 % раствора мыла, в пятую - 20 капель 1 % раствора
Na2СО3. Пробирки встряхивать две минуты и поставить в штатив.
Результата опыта заносят в таблицу, отмечая степень дисперсности
эмульсии знаком плюс или минус.
Эмульгатор
Мыло Желчь Вода
Белок
Название
жира
Работа 3. Проба на ненасыщенные жирные кислоты.
Сода
Ход работы: К 1 мл растительного масла и 1 мл воды в пробирке добавить
2 капли спиртового раствора йода. После продолжительного встряхивания
содержимое пробирки не дает синего окрашивания при добавлении 1-2 капель
раствора крахмала, т.е. не обнаруживается присутствие свободного йода (йод
присоединяется к ненасыщенным жирным кислотам по месту двойной связи).
Работа 4. Переваривание жиров липазой.
Принцип метода. О скорости ферментативного распада жира можно
судить по нарастанию количества свободных жирных кислот, что может быть
определено путем титрования их щелочью. В качестве источника липазы
могут быть использованы препараты поджелудочной железы.
Ход работы: В три конические колбочки наливают по 20 мл молока, затем
в первую колбочку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, а во вторую и
третью - по 0,5 мл разведенного в пять раз раствора желчи. Во все пробы
добавляют по 2 - 3 капли 1% раствора фенолфталеина и оттитровывают
щелочью свободные кислоты, присутствующие в молоке, добавляя вначале,
чтобы не разводить сильно молоко 2 капли 1 N раствора NaОН. Затем
добавляют 0,05 N раствора NaOH до бледно-розовой окраски на
фенолфталеин.
В первые две пробы добавляют по 1 мл вытяжки из поджелудочной
железы. Содержимое колб перемешивают и ставят в термостат при 38 0С. В
процессе гидролитического расщепления жира происходит образование
жирных кислот, которые и оттитровываются затем 0,05 N раствором NаОН.
Результаты титрования записывают, а оттитрованые пробы оставляют
еще на 15 минут. После этого снова оттитровывают жирные кислоты,
образовавшиеся в процессе дальнейшего гидролиза жира. Процесс
расщепления жира наблюдают в течение 2 часов. Полученные результаты
занести в прилагаемою схему опыта, причем количество 0,05 N NaОН,
пошедшее на титрование, записывают нарастающим итогом
№
пробы
Добавленное вещество
Моло Фенолф Фермен
ко, мл талеин тный
(кап.)
препар.
1 10
2-3
1 мл
2 10
2-3
1 мл
3 10
2-3
-
Вода, Желчь,
мл
мл
5
10,5
-
Израсходовано
0,05 N NаОН, мл
Продолжительность опыта,
в минутах
30
45
60
Всего
0,5
0,5
Работа 4. Выделение лецитина из яичного желтка.
Ход работы: К 1 г измельченного яичного желтка добавить 3 мл спирта,
нагреть в водяной бане (осторожно!) до кипения, отфильтровать в сухую
пробирку через бумажный фильтр, смоченный спиртом. Добавить 3 мл
дистиллированной воды - образуется эмульсия лецитина.
Работа 5. Выделение холестерина из мозга овец.
Ход работы: Измельчить 0,5-1,0 г высушенного мозга и поместить в
сухую пробирку. Прилить 5 мл хлороформа и встряхивать 5 минут. Затем
отфильтровать в сухую пробирку через бумажный фильтр, смоченный
хлороформом. К фильтрату прибавить 6 капель уксусного ангидрида и 2
капли концентрированной серной кислоты (осторожно!). В присутствии
холестерина появляется красная, синяя, зеленая окраска
.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ.
1. Как классифицируются липиды? Каковы их функции?
2. Перечислите физико-химические константы жиров и дайте их
определение?
3. Напишите формулы триглицеридов: трипальмитина, триолеина.
Показать их гидролиз при участии липазы.
4. Какова роль желчи в переваривании и всасывании жиров?
5. Особенности переваривания жиров у жвачных
6. Напишите бета-окисление жирных кислот на примере масляной
кислоты.
7. Напишите схему биосинтеза жирных кислот.
8. Напишите структурную формулу лецитина.
9. Напишите схему биосинтеза триглицерида (жира).
10. Из чего синтезируется в животном организме холестерин и в какие
биологически важные вещества он превращается? Напишите формулы
холестерина, кальциферола, тестостерона, альдостерона, холевой кислоты
КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО ТЕМЕ: ОБМЕН ЛИПИДОВ
ЗАДАНИЕ 12
ТЕМА: ВОДНО - МИНЕРАЛЬНЫЙ ОБМЕН
Работа 1. Количественное определение кальция в сыворотке крови.
Принцип метода. Основан на титровании кальция растворами
комплексонов. В качестве комплексона при определении кальция применяют
натриевую соль этилендиаминтетраацетата (NаЭДТА, трилон Б).
Индикатором является мурексид. В присутствии ионов кальция раствор
мурексида окрашен в розовый цвет, а после того как весь кальций оттитрован
- сине-фиолетовый.
Ход работы: В одну колбочку отмеривают 9,4 мл дистиллированной вода,
0,4 мл 1,8 N NаОН и 5 капель (точно!) индикатора мурексида. Появляется
фиолетовая окраска (контроль).
В другую колбочку отмеривают 9,0 мл воды, 0,4 мл 1,8 N NаОН и 0,4 мл
сыворотки крови, 5 капель индикатора мурексида (точно!). Раствор
окрашивается в светло-розовый цвет. Опытную колбу ставят рядом с
контрольной и титруют по каплям раствором трилона Б до одинакового цвета
растворов в контрольной и опытной колбах.
Расчет ведут по формуле:
Х = (П ∙ Т ∙ Х ∙ 100)/(0,4 ∙ 1000) = П ∙ 25 = мг % Са,
где: X - содержание кальция, мг %,
П - количество трилон Б, пошедшее на титрование мл ,
Т - количество кальция, эквивалентное 1 мл трилон Б (100 мкг).
100 - коэффициент для расчета в %,
1000 – коэффициент для перевода мкг в мг.
Работа 2. Определение содержания неорганического фосфора в
сыворотке крови.
Принцип метода. Молибденовокислый аммоний в кислой среде
присоединяет фосфорную кислоту с образованием фосфорнокислого
аммония, который после восстановления дает продукты, окрашенные в синий
цвет
(молибденовая
синь).
Интенсивность
полученной
окраски
пропорциональна содержанию фосфора в исследуемой пробе.
Ход работы: В сухую пробирку отмеривают 3 мл сыворотки крови, 9 мл
дистиллированной воды и 3 мл 20 % раствора трихлоруксусной кислоты.
Содержимое пробирки тщательно перемешивают и через 5 минут фильтруют
через бумажный фильтр, который предварительно смачивают водой.
Совершенно прозрачный фильтрат (если имеется хотя бы незначительная
мутность раствора, то фильтрат еще раз пропускают через фильтр) используют
для определения неорганического фосфора.
Берут 5 мл фильтрата (что соответствует 1 мл сыворотки крови) и
переносят в мерную колбочку. В другую мерную колбочку наливают 1 мл
стандартного раствора фосфорнокислого калия, содержащего 0,04 мг фосфора
в 1 мл.
В обе колбочки одновременно добавляют по 1 мл концентрированного
раствора молибденовокислого аммония и по 0,5 мл концентрированного
раствора аскорбиновой кислоты, затем содержимое колб доводят водой до
метки и ставят в затемненное место на 10 минут. Колориметрируют в
фотоэлектроколориметре при красном светофильтре и кювете толщиной 5 мм.
Расчет проводят по формуле : Х = (а ∙ 0,04 ∙ 100)/(в ∙ I) = мг %,
где: Х - содержание фосфора, мг %
а - экстинкция опытного раствора,
в - экстинкция стандартного раствора,
0,04 - количество фосфора в мг в 1 мл стандартного раствора,
I - количество сыворотки в мл,
100 - число для расчета в процентах.
Работа 3. Определение содержания АТФ в сыворотке крови.
Принцип метода. В безбелковом фильтрате АТФ подвергается гидролизу
при кипячении в течение 7 минут с 1 N НCl
АТФ + H2O  АДФ + Н3РО4
Неорганический фосфор определяется колориметрически и представляет
собой сумму свободных фосфатов и образовавшихся после гидролиза АТФ
(фосфор общий, Робщ.)
Ход работы: В мерную колбу отмеривают 5 мл безбелкового фильтрата
из предыдущей работы. Добавляют 1 мл 1 N HCI и колба помещается на 7
минут (точно!) в кипящую водяную баню.
Через 7 минут колба охлаждается под краном, добавляется одна капля
фенолфталеина и содержимое нейтрализуется 10 % раствором NаОН или КОН
до слабо розовой окраски, затем добавляют 1 мл 20 % раствора
трихлоруксусной кислоты, 1 мл молибденовокислого аммония и 0,5 мл
аскорбиновой кислоты, затем помещают колбу в темное место на 10 минут.
После этого содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой и
колориметрируют.
Расчет делают, так же как и в предыдущей работе. Разность между
количеством фосфора, полученного после гидролиза АТФ и до гидролиза
умножают на 8,18, т.е. (Робщ - Рнеорг) ∙ 8,18 Получают количество мг % АТФ.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ.
1. Каково значение воды и минеральных солей для организма животных?
В каких видах вода находится в тканях?
2. Какие нарушения в обмене воды и минеральных веществ наблюдаются
при сахарном диабете, эндемическом зобе, рахите, анемии?
3. В составе, каких соединений содержится фосфор в тканях? Какую роль
играет фосфор в углеводном обмене? Какую роль играет АТФ в организме?
В составе, каких веществ поступает в организм фосфор и сера. В виде,
каких соединений фосфор и сера выводятся из организма?
5. Перечислите основные микроэлементы и их функции?