На правах рукописи ПЕТРОСЯН ЛИЛИТ АРСЕНОВНА ОПТИМИЗАЦИЯ ЛИМФОЦИТОИММУНОТЕРАПИИ В
реклама
На правах рукописи ПЕТРОСЯН ЛИЛИТ АРСЕНОВНА ОПТИМИЗАЦИЯ ЛИМФОЦИТОИММУНОТЕРАПИИ В ЛЕЧЕНИИ ПРИВЫЧНОЙ ПОТЕРИ БЕРЕМЕННОСТИ ПЕРВОГО ТРИМЕСТРА 14.00.01 акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова и в Федеральном Государственном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», в отделении терапии и профилактики невынашивания беременности Научные руководители: Академик РАМН, профессор В.И. КУЛАКОВ Академик РАМН, профессор Г.Т. СУХИХ Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор О.Ф. СЕРОВА (ГУЗ «МОПЦ») Доктор медицинских наук, профессор Л.В. КОВАЛЬЧУК (РГМУ) Ведущая организация: Российский университет дружбы народов. Защита диссертации состоится «____»____________2009 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи». Автореферат разослан «____»_____________2009 года. Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук Е.А. КАЛИНИНА 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Большинство привычных выкидышей ранних сроков беременности обусловлено иммунологическим отторжением плода как аллотрансплантата, чужеродного для матери вследствие экспрессии отцовских антигенов. К аллоиммунным механизмам потери беременности относят совместимость супругов по системе HLA, высокий уровень NK клеток в периферической крови, повышенный уровень провоспалительных цитокинов и отсутствие блокирующих факторов в сыворотке крови матери. Согласно мнению ряда исследователей, при совместимости супругов более чем по трем антигенам системы HLA, без проведения терапии, риск невынашивания составляет 100% в связи с недостаточной продукцией блокирующих факторов при беременности [Aplin J.D. et al., 2000]. У женщин с ранними потерями беременности наблюдается увеличение в субпопуляции цитотоксических CD16+, CD56+ и CD3−56+16+ клеток, что может способствовать ее прерыванию даже у тех пациенток, чьи абортусы имеют нормальный хромосомный набор [Clark D.A. et al., 1996, Coulam C.B. et al., 1997, Gulan G. et al., 1997, Lachapelle M.H. et al., 1996, Vassiliadou N. et al., 1996]. Еще один аллоиммунный механизм прерывания беременности основан на эмбриотоксическом влиянии цитокинов Th1-типа, таких как ИФН-γ и ФНО-α [Hill J.A. et al., 1992]. Приблизительно у 25% женщин с необъяснимым привычным выкидышем обнаружена повышенная секреция эмбриотоксических Th1 цитокинов [Hill J.A. et al., 1992, Hill J.A. et al., 1995, Yamada H. et al., 1994]. Одним из методов лечения, направленных на сохранение беременности при аллоиммунных нарушениях, является активная иммунизация аллогенными лимфоцитами. Применение лимфоцитоиммунотерапии (ЛИТ) позволяет изменить состояние иммунной системы матери в сторону преобладания Th2иммунного ответа. В целом ряде исследований показано, что ЛИТ успешно 3 применяется в системе комплексного лечения привычного невынашивания беременности [Говалло В.И., Сидельникова В.М., 1983, Мошин В.И., 1989, Beer A.E., 1985, Clark D.A. et al., 1991, Collins J. et al., 1994, Coulam C.B. et al., 1994, Frazer E.J. et al., 1993, Kwak J.Y., 1999, Mowbray J.F., 1985]. При условии отсутствия хромосомных аномалий у эмбриона, эффективность терапии составляет более 90% [Clark G.F. et al., 1996]. Однако отношение к данному методу терапии неоднозначное, помимо сторонников имеются и противники, которые не считают аллоиммунные нарушения причиной невынашивания беременности [Hill J.A., 1996, Ober C.L. et al., 1983, Reindollar R., 2000]. ЛИТ клетками мужа или донора является чрезвычайно дискутабельным методом профилактики и лечения аллоиммунных форм невынашивания беременности, однако многие аспекты применения ЛИТ остаются неясными: нет четких критериев отбора пациенток для лечения, неотработанны сроки проведения ЛИТ, нет четких данных об эффективности различных доз вводимых лимфоцитов. Все вышеизложенное позволило определить цель настоящего исследования. Цель исследования: Оптимизация метода лимфоцитоиммунотерапии и оценка ее эффективности при подготовке и в первом триместре беременности у пациенток с аллоиммунным генезом привычной потери беременности. Задачи исследования: 1. Оценить значение аллоиммунных нарушений в структуре причин привычной потери беременности на основании определения совместимости супругов по системе HLA, уровня NK клеток и сывороточного интерферона в периферической крови, показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. 2. Оценить эффективность различных доз аллогенных лимфоцитов (50 млн, 100 млн и 150 млн клеток) на основании анализа субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови и оценки функционального 4 состояния иммунной системы с помощью показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител при подготовке к беременности. 3. Разработать оптимальные режимы применения ЛИТ во время беременности на основании исследования субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови, показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. 4. Оценить течение и исходы беременностей после применения ЛИТ при подготовке и в первом триместре беременности у пациенток с привычными потерями ранних сроков в анамнезе. Научная новизна Установлено, что в генезе ранних потерь привычного невынашивания беременности, помимо совместимости супругов более чем по 3 антигенам системы HLA, значимую роль играют: высокий уровень NK клеток с маркером CD3−56+16+, повышенный уровень провоспалительных цитокинов, в частности сывороточного интерферона в периферической крови, отсутствие адекватной реакции на стимуляцию аллогенными лимфоцитами in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. Впервые разработана рациональная тактика лимфоцитоиммунотерапии (сроки проведения, кратность и доза), повышающая эффективность и безопасность применения проводимой терапии при подготовке и в первом триместре беременности у женщин с привычным невынашиванием аллоиммунного генеза. При выявлении совместимости супругов по 3 антигенам системы HLA и незначительном повышении (до 20%) уровня CD3−56+16+ клеток в периферической крови, применяется ЛИТ в дозе 50 млн клеток; при выявлении совместимости супругов по 4–5 антигенам системы HLA и повышенного уровня CD3−56+16+ клеток в периферической крови от 20 – 23%, целесообразно проведение ЛИТ в дозе 100 млн клеток; при выявлении совместимости супругов по более чем 5 антигенам системы HLA и 5 повышенного уровня CD3−56+16+ клеток в периферической крови более 23%, необходимо применение ЛИТ в дозе 150 млн клеток. В работе подтверждена высокая эффективность применения лимфоцитоиммунотерапии в профилактике и лечении привычной потери беременности аллоиммунного генеза. Практическая значимость На основании проведенных исследований определена группа пациентов повышенного риска ранних потерь беременности, у которых необходимо проведение иммуногенетического обследования, определение в периферической крови уровня CD3−56+16+ клеток, уровня сывороточного интерферона, показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. На основании полученных результатов обследования разработаны показания для применения различных доз лимфоцитов в количестве 50 млн, 100 млн и 150 млн клеток с целью достижения оптимальной эффективности. Определены иммунологические показатели оценки эффективности проведения ЛИТ при подготовке и в первом триместре беременности у женщин с привычным невынашиванием аллоиммунного генеза. Разработан алгоритм подготовки к беременности и ведения беременности у пациенток с аллоиммунными нарушениями, и показана высокая эффективность метода ЛИТ по сохранению беременности у этого контингента больных. Положения диссертации, выносимые на защиту 1. В структуре ранних потерь беременности аллоиммунные нарушения играют существенную роль и составляют 24,6%. Факторами, повышающими риск ранних потерь беременности, являются: совместимость супругов более чем по 3 антигенам системы HLA, гомозиготный генотип у женщин по локусу DQA1 генотип 0301/0301 и по локусу DQB1 генотип 0501/0501, наличие аллеля 0201 по локусу DQA1 и/или по локусу DQB1 у мужчин. 6 2. Эффективным методом предгравидарной подготовки женщин с привычным невынашиванием беременности аллоиммунного генеза является ЛИТ. Оптимальным количеством вводимых лимфоцитов для исследуемой группы пациенток является 100 млн и 150 млн клеток, при этом наблюдается статистически достоверное снижение уровня CD3−56+16+ клеток, повышение уровня CD8+ клеток и IgM, снижение пролиферативного ответа женских лимфоцитов на ФГА, и повышение уровня блокирующих факторов и антиотцовских антилейкоцитарных антител. Вводимая доза клеток зависит от числа совместимых антигенов HLA у супругов и уровня CD3−56+16+ клеток в периферической крови матери. 3. Индивидуализированная предгестационная подготовка и применение ЛИТ при подготовке и в течение первого триместра беременности позволили получить успешный результат. Рождение жизнеспособных детей отмечено у 95,9% женщин, из них 93,6% оценены по шкале Апгар на 8–9 баллов. Наличие совпадений супругов по антигенам системы HLA создает условия для гомозиготности их новорожденных. Реализация полученных результатов Результаты проведенных исследований и основные рекомендации, вытекающие из них, используются в акушерских отделениях ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» при обследовании и лечении супружеских пар с привычными потерями беременности ранних сроков. По теме диссертации опубликовано 3 работы в отечественной печати. Апробация работы Основные межклинической положения диссертации конференции отделения доложены терапии и и обсуждены на профилактики невынашивания беременности 07 июля 2008 года и на совместном заседании апробационной комиссии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и 7 перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной гинекологии, медицинской перинатологии и помощи» и кафедры акушерства, репродуктологии ФППОВ Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова 14 июля 2008 года. Структура и объем диссертации Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 4 диаграммами. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический указатель включает 166 литературных источников, из них 34 отечественных и 132 зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В соответствии с поставленными задачами в процессе работы нами было проведено клинико-лабораторное обследование 260 супружеских пар с привычным невынашиванием беременности ранних сроков, обратившихся в научно – поликлиническое отделение Центра за период 2005-2007 годы. В ходе работы проводился подробный клинико-анамнестический анализ, общий осмотр, гинекологическое бимануальное исследование. Все пациенты были обследованы по схеме, разработанной и принятой в отделении терапии и профилактики невынашивания беременности. Специальные методы исследования включали: Иммуногенетическое типирование: Исследование антигенов HLA I класса проводилось на лимфоцитах периферической крови, путем использования стандартного метода цитотоксичности», разработанного «комплементзависимой П. Терасаки (1991). Определение антигенов HLA II класса проводилось методом полимеразной цепной реакции. 8 Иммунологические методы исследования Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводился методом проточной цитофлюориметрии на приборе «Bio Rad» (США), с использованием моноклональных антител («Becton Dickinson»), определение концентрации иммуноглобулинов класса G, M, A методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Оценка интерферонового статуса (определение уровня сывороточного интерферона и уровня индуцированной продукции ИФН- и ИФН- лейкоцитами периферической крови in vitro) проводилась биологическим методом (Григорян С.С., Ершова Ф.И., 1989). Оценку функционального состояния иммунной системы женщины проводили по трем направлениям: 1) оценка реакции женских лимфоцитов на стандартный митоген (ФГА) в культуре in vitro (оценка пролиферативной активности); 2) определение блокирующих свойств женской сыворотки; 3) определение антиотцовских антилейкоцитарных антител. После проведенного обследования из 260 пар были отобраны 64 (24,6%) женщины репродуктивного возраста, которые отвечали следующим критериям: привычное невынашивание беременности (в анамнезе 2 и более самопроизвольных выкидышей в первом триместре); совместимость антигенов системы HLA у супругов (3 и более идентичных антигенов); повышенное содержание NK клеток и сывороточного интерферона в периферической крови; отсутствие изменений в показателях аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител; исключение анатомических и аутоиммунных причин невынашивания беременности; отсутствие хронических инфекционных заболеваний и поливалентной формы аллергии. Больные с привычным невынашиванием беременности аллоиммунного генеза были произвольно разделены на 3 группы. 9 Для оценки эффективности различных доз вводимых лимфоцитов проводилась подготовка к беременности супружеских пар с аллоиммунными причинами привычного невынашивания беременности с использованием различных доз (50 млн, 100 млн и 150 млн клеток) лимфоцитов от доноров. Пациенткам I группы (26 пациенток) проводили ЛИТ в количестве 50 млн клеток (от одного донора). Во II группе (18 пациенток) проводили ЛИТ в количестве 100 млн клеток (от двух доноров). В III группу входили 20 женщин, которым проводили ЛИТ в количестве 150 млн клеток (от трех доноров). Оценку функционального состояния иммунной системы проводили через 3 недели после каждого введения донорских лимфоцитов с помощью анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, контроля показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. При наступлении беременностей наблюдали за их течением и исходами родов. Статистическая обработка полученных результатов и диаграммы выполнены на компьютере Pentium-200 с использованием пакета прикладных программ для статистической обработки “Exel” версия 7,0 раздел программы «Анализ данных». Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05, р<0,01, р<0,001. Клиническая часть работы выполнена в отделении профилактики и терапии невынашивания беременности Центра (руководитель – профессор В.М. Сидельникова). Родоразрешение пациенток проводилось в I (руководитель – профессор Е.А. Чернуха) и II (руководитель – профессор Н.В. Орджоникидзе) акушерских отделениях, наблюдение и терапия детей в неонатологических отделениях Центра (руководители – профессор А.Г. Антонов, профессор Н.И. Кудашов). Лабораторные методы исследования осуществлялись в следующих подразделениях Центра: лаборатория клинической иммунологии (руководитель 10 – академик РАМН, профессор Г.Т. Сухих); лаборатория эндокринологии (руководитель – профессор Н.Д. Фанченко); лаборатория микробиологии (руководитель – профессор А.С. Анкирская); лаборатория генетики (руководитель – профессор В.А. Бахарев); лаборатория функциональной диагностики (руководитель – профессор В.Н. Демидов). Обследование доноров и заготовка компонентов крови производилась в отделении гравитационной хирургии крови (руководитель – профессор Т.А. Федорова) в соответствии с Приказом №364 Минздрава РФ от 14.09.2001г. «Об утверждении порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В соответствии с поставленными задачами, нами был проведен анализ анамнестических данных, инструментального результатов обследования у клинического 64 пациенток и лабораторнос привычным невынашиванием беременности первого триместра. Возраст обследованных женщин колебался от 20 до 42 лет и составил в среднем 30,8±0,61 лет. По данным инфекционной заболеваемости у наблюдаемых женщин в детском возрасте и периоде полового созревания отмечается высокий инфекционный индекс – 4,6±0,3. При этом необходимо отметить повышенную заболеваемость в критические периоды становления центральных механизмов регуляции генеративной функции – формирование функциональных связей гипоталамо – гипофизарно – яичниковой оси. Известно, что в структуре гинекологических заболеваний хронические воспалительные заболевания женских половых органов составляют 60-65% и являются одной из ведущих причин привычного невынашивания беременности [Земляная А.А., 1993; Лозовская Л.С. с соавт., 1996]. При анализе структуры гинекологической патологии воспалительные заболевания половых органов были представлены хроническим эндометритом (25%) и хроническим 11 сальпингоофоритом (15,6%). Однако все пациентки были пролечены и на момент начала исследования не имели инфекционных осложнений. У обследованных женщин установлен высокий процент (100%) ранних потерь беременностей. Среди ранних выкидышей превалировали прерывания в сроках 5-7 недель (54,1% от числа всех беременностей). Анализ данных цитогенетического обследования показал, что у 79,7% женщин и у 89,1% мужчин выявлен нормальный кариотип (46, ХХ и 46, ХY); «варианты кариотипа» отмечены у 23,4% женщин и у 10,9% мужчин; сочетания особенностей кариотипа супругов отмечалось в 6,3% случаев. По данным литературы, частота «вариантов кариотипа» у супружеских пар с привычным невынашиванием в анамнезе составляет 21,7%. «Варианты кариотипа» не являются причинными факторами в прерывании беременности, но могут нести хромосомный груз и требуют проведения пренатальной диагностики [Каретникова Н.А., 1998]. В соответствии с поставленными задачами исследования проводилось определение антигенов системы HLA у супружеских пар с ранними потерями беременности в анамнезе, которое включало определение антигенов HLA I и II класса; анализ частоты совпадений аллелей I и II классов у супружеской пары; исследование частоты встречаемости аллелей и гомозигот системы HLA; анализ особенностей системы HLA у супругов. При анализе антигенов системы HLA I класса и сопоставлении полученных результатов с популяционными данными было выявлено статистически достоверное снижение частоты антигена А2 у женщин и мужчин исследуемой группы (p<0,05 и p<0,01). Отмечено статистически достоверное снижение антигенов А11 (p<0,01) и Cw4 (p<0,01) у женщин данной группы. Также, статистически значимым было повышение частоты встречаемости антигена В16 у женщин (p<0,05), антигенов А24 (p<0,01) и В12 (p<0,001) у мужчин. 12 Выявление антигенов в локусах, ответственных за развитие различной патологии, имеет важное значение в плане своевременного проведения соответствующих лечебно-диагностических мероприятий. Анализ I класса HLA у обследованных супружеских пар не выявил каких-либо различий с популяционными данными. При анализе антигенов HLA II класса и сравнении с популяционными данными было выявлено, что аллель 11 по локусу DRB1 как у женщин, так и у мужчин встречается достоверно чаще, чем в популяции (p<0,01 и p<0,001), также у мужчин достоверно чаще выявлен аллель 0102 (p<0,001) по локусу DQA1. Достоверно реже, чем в популяции встречались следующие аллели: по локусу DRB1 у женщин встречался аллель 16 (p<0,05), а у мужчин – аллель 04 (p<0,01) и 13 (p<0,001), по локусу DQA1 аллель 0103 (p<0,01) у мужчин. Среди супружеских пар с ранними потерями беременности в анамнезе преобладали пары, имеющие совместимость по 3 аллелям системы HLA II класса – 51,6%. В 48,5% наблюдений имели место совпадения более чем по 3 аллелям. По данным литературы, у женщин с ранними потерями беременности, совпадающих с мужем по аллелям локуса DQA1 повышена цитотоксичность и уровень CD3−56+16+ клеток, что приводит к развитию некроза в области децидуальной оболочки и трофобласта и раннему прерыванию беременности [Kwak J.Y. et al., 1997]. При анализе генотипов системы HLA II класса и сопоставлении их с популяционными данными было установлено, что у женщин достоверно чаще, чем в популяции по локусу DQA1 встречался генотип 0301/0301 (p<0,05) и по локусу DQB1 – генотип 0501/0501 (p<0,01) (рис. 1). 13 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 ** * 0301/0301 DQA1 Женщины 0501/0501 DQB1 Мужчины Популяционные данные *p<0,05; **p<0,01 Рис. 1. Частота встречаемости гомозиготных генотипов по локусам DQA1, DQB1 у женщин и мужчин в сопоставлении с популяционными данными При количественном анализе встречаемости аллелей 0201 по локусам DQA1 и DQB1 выявлено, что аллель 0201 наблюдается у женщин по локусу DQA1 в 29,7% случаев, по локусу DQB1 в 35,9% случаев, у мужчин по локусу DQA1 в 31,3% случаев, по локусу DQB1 в 37,5% случаев. Анализ сопоставления частоты встречаемости аллелей 0201 по локусам DQA1 и DQB1 у обследуемых супружеских пар с популяционными данными не выявил каких-либо различий. Однако, анализ исходов предыдущих беременностей выявил, что подавляющее число анэмбрионий (72,7%) было у пар, в которых мужчина имел аллели 0201 по локусам DQA1 и/или DQB1. По данным A.E. Beer (2000), при оплодотворении яйцеклетки сперматозоидом, несущим гены DQA1 0201 и DQB1 0201, происходит гибель зиготы в 50%. Когда такой генотип попадает к эмбриону от матери, то эмбрион развивается нормально. Если только DQA1 или DQB1 имеет 0201, вероятность образования такой зиготы в 2 раза меньше. 14 При исследовании интерферонового статуса у женщин исследуемой группы был выявлен дисбаланс системы интерферона. Средний уровень сывороточного интерферона у исследуемых женщин составил 16,4±1,2 Е/мл, что достоверно выше физиологических значений. При анализе спонтанной интерфероновой реакции лейкоцитов титры интерферона были в пределах нормы. Продукция ИФН-α в ответ на индукцию вирусом болезни Ньюкасла была резко снижена и средний титр составил 13,5±2,3 Е/мл. Продукция ИФН-γ при индукции лейкоцитов крови также была резко снижена и средний титр составил 9,6±1,4 Е/мл. В связи с высоким уровнем цитотоксических NK клеток и сывороточного интерферона в периферической крови подготовку к беременности начинали с проведения лечения индукторами интерферона, поскольку на фоне изменений в иммунном и интерфероновом статусах реакция на введение аллогенных лимфоцитов могла быть не адекватной. Наиболее часто (59,4%) пациентки имели выраженную чувствительность к имунофану. К галавиту были чувствительны 23,4% пациенток, у 17,2% женщин чувствительность была к иммуномаксу. Через 3 недели, после проведенной иммуномодулирующей терапии с целью оценки ее эффективности проводилось исследование параметров интерферонового статуса. У женщин исследуемой группы наблюдалось значительное снижение уровня сывороточного интерферона и повышение уровня ИФН-α и -γ в ответ на стимуляцию. Учитывая совместимость и особенности супругов по системе HLA, высокий уровень CD3−56+16+ клеток в качестве заключительного этапа подготовки к беременности была проведена ЛИТ лимфоцитами доноров, с оценкой функционального состояния иммунной системы женщины. В нашей стране первые работы по проведению ЛИТ принадлежат В.И. Говалло и В.М. Сидельниковой (1983). В результате проведения ЛИТ было получено уменьшение клинических 15 проявлений угрозы прерывания беременности, повышение уровня ХГ, эстрогенов, прогестерона и трофобластического β-глобулина. Предполагают, что применение ЛИТ оказывает модулирующее воздействие на механизмы специфической иммунологической толерантности. Иммунизация матери аллогенными лимфоцитами вызывает активацию иммунокомпетентных клеток материнского организма, что способствует синтезу регуляторных цитокинов, факторов роста, которые стимулируют развитие трофобласта и плаценты [Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2003 Ramhorst R. et al., 2000, Ruiz M.C. et al., 1996]. На сегодняшний день данные мировой литературы весьма противоречивы по иммунным аспектам невынашивания беременности, и по возможным методам терапии иммунных нарушений. В связи с поставленной целью 64 пациентки с аллоиммунными нарушениями были произвольно разделены на 3 группы. С целью подготовки их к беременности проводили ЛИТ лимфоцитами доноров, с использованием различных доз аллогенных лимфоцитов (50 млн, 100 млн и 150 млн клеток). ЛИТ проводили вне беременности с периодичностью один раз в месяц за 2 цикла до предполагаемой беременности. Введение лимфоцитов осуществлялось на 5–9 день цикла однократно в течение 2-х циклов подряд. Взвесь аллогенных лимфоцитов вводили подкожно на переднюю часть предплечья в 8–10 точек. Производилась визуальная оценка местной реакции на введение клеточной взвеси. Пациенткам I группы (26 пациенток) проводили ЛИТ в количестве 50 млн клеток (от одного донора). Во II группе (18 пациенток) проводили ЛИТ в количестве 100 млн клеток (от двух доноров). В III группу входили 20 женщин, которым проводили ЛИТ в количестве 150 млн клеток (от трех доноров). Через 3 недели после каждого введения донорских лимфоцитов проводили оценку функционального состояния иммунной системы с помощью 16 анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, контроля показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. В группах по сравнению с нормой до проведения ЛИТ было отмечено повышение уровня лимфоцитов с фенотипом CD3−56+16+, ответственных за клеточно-опосредованные механизмы отторжения. В I группе среднее значение уровня CD3−56+16+ клеток составило 21,96±1,61%, во II группе среднее значение уровня CD3−56+16+ клеток составило 23,4±1,95%, а в III группе – 25,64±2,41% (рис. 2). 30 25 * * 20 * % 15 10 5 0 50 млн клеток До лечения 100 млн клеток После I ЛИТ 150 млн клеток После II ЛИТ Норма *p<0,05 Рис. 2. Относительное содержание CD3−56+16+ клеток в периферической крови женщин до лечения, после I и II процедуры ЛИТ в количестве 50 млн, 100 млн и 150 млн клеток при подготовке к беременности Повышенное содержание CD3−56+16+ в периферической крови найдено у женщин с привычными потерями беременности многими исследователями [Beer A.E. et al., 1996, Darmochwal-Kolarz D. et al., 1999, Kwak J.Y. et al., 1995]. Во время беременности повышение уровня в периферической крови клеток 17 CD56+ выше 18%, является показателем возможного угрожающего выкидыша. Показано, что в ранние сроки беременности содержание CD3−56+16+ лимфоцитов увеличивалось у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе [Emmer прогностическим P.M. et показателем 2000]. al., для А также, спонтанного неблагоприятным выкидыша является повышенное содержание NK клеток у небеременных женщин. Изучение параметров гуморального звена иммунитета показало, что отличия в группах по сравнению с нормой до проведения ЛИТ коснулись IgМ. В I группе средний титр уровня IgМ составил 2,29±0,31 г/л, во II группе средний титр уровня IgМ составил 2,09±0,28 г/л, а в III группе – 2,11±0,18 г/л. После проведения I процедуры ЛИТ определилось статистически достоверное снижение уровня CD3−56+16+ (p<0,05) и CD16+ (p<0,05) клеток при введении 150 млн клеток до нормальных значений. Также отмечено статистически достоверное повышение уровня IgМ (p<0,05) при введении 100 млн и 150 млн клеток. Таким образом, после I процедуры ЛИТ введение 50 млн клеток было эффективным только у 8 (30,8%) пациенток из 26, после введения 100 млн клеток эффективность отмечена у 12 (66,7%) женщин из 18, после введения 150 млн клеток – у всех женщин наблюдали высокую эффективность (100%). После оценки эффективности I процедуры ЛИТ изменился состав групп. При II процедуре ЛИТ в I группе было 8 женщин и доза вводимых лимфоцитов составила 50 млн клеток, во II группе – 30 женщин и доза вводимых лимфоцитов составила 100 млн клеток, в III группе – 26 женщин и доза вводимых лимфоцитов составила 150 млн клеток. После проведения II процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное снижение уровня CD3−56+16+ клеток (p<0,05) при введении 100 млн и 150 млн клеток. Также отмечено статистически достоверное повышение уровня CD8+ клеток (p<0,05) при введении 100 млн и 150 млн клеток (рис. 3). 18 40 35 30 25 % 20 15 10 5 0 * * 50 млн клеток До лечения 100 млн клеток После I ЛИТ 150 млн клеток После II ЛИТ Норма *p<0,05 Рис. 3. Относительное содержание CD8+ клеток в периферической крови женщин до лечения, после I и II процедуры ЛИТ в количестве 50 млн, 100 млн и 150 млн клеток при подготовке к беременности В литературе есть данные о супрессивной роли CD8+ клеток в локальной иммунной реакции эндометрия в период имплантации [Lachapelle M.H. et al., 1996, With N.D. et al., 1997]. Таким образом, повышение уровня CD8+ клеток после проведения ЛИТ может быть расценено как положительный прогностический признак. Также наблюдалось статистически достоверное повышение уровня IgМ (p<0,05) при введении всех доз лимфоцитов. У 8 пациенток I группы после проведения II процедуры ЛИТ, не получив снижения уровня CD3−56+16+ клеток, дополнительно назначили иммуноглобулин человеческий нормальный для внутривенного введения в дозе 25 мл внутривенно капельно через день 3 раза с 6 дня менструального цикла или октагам 2,5г двухкратно через день. По данным Гниповой В.В. (2003) проведение комплексной терапии, с включением иммуноглобулинов, с целью подготовки к беременности у женщин 19 с привычным невынашиванием ранних сроков приводит к нормализации локальных иммунных и морфологических реакций, снижению в эндометрии CD56+ и CD3−56+ 16+ клеток, увеличению CD8+ клеток. Во II фазу цикла всем пациенткам с целью поддержки II фазы и иммуномодуляции назначался препарат дидрогестерон в дозе 10 мг 2 раза в день с 16 по 25 дни менструального цикла. Таким образом, с помощью анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови женщин исследуемых групп при подготовке к беременности было установлено, что наиболее информативным показателем эффективности проводимой терапии является статистически достоверное снижение уровня CD3−56+16+ клеток, а также статистически достоверное повышение уровня CD8+ клеток и уровня IgМ, при проведении ЛИТ в количестве 100 и 150 млн клеток. При определении показателя функционального состояния иммунной системы, чувствительного к влиянию ЛИТ, проведено исследование функции женских лимфоцитов в культуре in vitro на стандартный митоген (ФГА). У пациенток I группы до проведения ЛИТ, средний титр уровня реакции женских лимфоцитов на ФГА составил 199,6±33,3%, во II группе средний титр уровня реакции женских лимфоцитов на ФГА составил 184,6±45,3%, а в III группе – 246,9±36,3%. После I процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное снижение ответа женских лимфоцитов на ФГА при введении 150 млн клеток (p<0,05) и не было должной реакции на дозы 50 млн и 100 млн клеток. После II процедуры ЛИТ наблюдалось статистически достоверное снижение ответа женских лимфоцитов на ФГА при введении всех доз лимфоцитов (p<0,05; p<0,01). При определении блокирующего фактора (БФ) на основе угнетения реакции женских лимфоцитов на стандартный митоген (ФГА) в культуре в I 20 группе до проведения ЛИТ, средний уровень БФ составил 17,68±6,39%, во II группе средний уровень БФ составил 16,49±5,13%, а в III группе – 16,15±6,1%. После I процедуры ЛИТ статистически достоверное повышение уровня БФ было только при введении 150 млн клеток (p<0,05), а после II процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное повышение уровня БФ при введении всех доз лимфоцитов (p<0,05). Третьим шагом было определение антиотцовских антилейкоцитарных антител (АОАТ). В I группе до проведения ЛИТ, средний уровень АОАТ составил 20,74±10,3%, во II группе средний уровень АОАТ составил 15,23±4,37%, а в III группе – 12±5,98%. После I процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное повышение уровня АОАТ при введении 100 млн (p<0,05) и 150 млн (p<0,01) клеток; после II процедуры ЛИТ статистически достоверное повышение АОАТ отмечено при введении всех доз лимфоцитов (p<0,05; p<0,01). Таким образом, анализ функционального состояния иммунной системы женщин исследуемых подгрупп, при подготовке к беременности установил, что наиболее информативным показателем эффективности проводимой терапии является статистически достоверное снижение ответа женских лимфоцитов на ФГА и повышение уровня БФ и АОАТ, которые отмечены при проведении ЛИТ в количестве 100 млн и 150 млн клеток. На основании проведенных исследований установлено, что после I процедуры ЛИТ в количестве 50 млн клеток в I группе женщин снижение уровня CD3−56+16+ клеток, повышение уровня БФ и выработка АОАТ произошли только у 8 женщин, у которых до проведения ЛИТ наблюдалась совместимость супругов по 3 антигенам системы HLA, уровень CD3−56+16+ клеток не превышал 20%, а также после проведения терапии индукторами интерферона наблюдалось снижение сывороточного интерферона до нормальных значений. Во II группе после I процедуры ЛИТ в количестве 100 млн клеток снижение уровня CD3−56+16+ клеток, повышение уровня БФ и 21 выработка АОАТ произошли только у 12 женщин, у которых до проведения ЛИТ наблюдалась совместимость супругов по 4–5 антигенам системы HLA, уровень CD3−56+16+ клеток не превышал 23%, а также после проведения терапии индукторами интерферона наблюдалось снижение сывороточного интерферона до нормальных значений. В III группе – из 20 женщин, которым проводили ЛИТ в количестве 150 млн клеток, эффективные изменения иммунных реакций наблюдались у всех женщин. У 18 пациенток I группы отсутствие эффекта после I процедуры ЛИТ в количестве 50 млн клеток связано с совместимостью супругов более чем по 3 антигенам системы HLA, уровнем CD3−56+16+ клеток более 20%, а также повышенным уровнем сывороточного интерферона несмотря на проведение терапии индукторами интерферона. Во II группе у 6 пациенток отсутствие эффекта после I процедуры ЛИТ в количестве 100 млн клеток также возможно связано с совместимостью супругов более чем по 5 антигенам системы HLA, уровнем CD3−56+16+ клеток более 23%, а также повышенным уровнем сывороточного интерферона после проведения терапии индукторами интерферона. Таким образом, после оценки эффективности различных доз вводимых лимфоцитов установлено, что при подготовке к беременности супружеских пар с аллоиммунными причинами привычного невынашивания беременности различные дозы лимфоцитов (50 млн, 100 млн и 150 млн клеток) необходимо применять с учетом совпадений и особенностей системы HLA, повышенного уровня NK клеток в периферической крови, при отсутствии показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. На основании проведенных исследований получены данные о том, что оптимальным количеством вводимых лимфоцитов для пациенток с привычным невынашиванием беременности аллоиммунного генеза является доза 100 млн и 150 млн клеток. 22 После проведенной подготовки, из 64 супружеских пар беременность наступила у 49 (76,6%) женщин, из них у 5 женщин в I группе, у 23 женщин во II группе и у 21 женщин в III группе. Несмотря на подготовку к беременности и проводимую коррекцию в первом триместре у 7 (14,3%) женщин, из них у 2 женщин I группы, у 3 женщин II группы и у 2 женщин III группы отмечалась клиника угрожающего выкидыша, которая проявлялась в виде болей внизу живота и в пояснице, кровянистых выделений из половых путей и образованием ретрохориальных гематом. Всем пациенткам, в условиях стационара проводилась спазмолитическая, гемостатическая и седативная терапия, а в стадии организации гематомы к лечению добавляли курс энзимотерапии в течение 2-х недель. С целью снижения повышенного уровень NK клеток в периферической крови всем пациенткам с клиникой угрожающего выкидыша в сроках 5–7 недель беременности проводилась терапия иммуноглобулином человеческим нормальным в дозе 25 мл внутривенно капельно через день 3 раза или октагам 2,5г двухкратно через день. По данным УЗИ, в первом триместре беременности гипоплазия хориона была диагностирована у 2 женщин I группы. С ранних сроков беременности всем пациенткам с целью иммуномодуляции назначался препарат дидрогестерон в дозе 10 мг 2 раза в день до 16 недель беременности. Всем женщинам исследуемых групп каждые 4 недели проводилась ЛИТ донорскими лимфоцитами, с индивидуально подобранной до беременности дозой лимфоцитов в количестве 50 млн, 100 млн и 150 млн клеток с момента установления беременности по данным УЗИ и β-ХГ и далее каждые 4 недели беременности до 12 недель. Интервал 4 недели был выбран на основании проведенных раннее в отделении исследований об улучшении показателей уровней гормонов – повышение уровней ХГ, эстрадиола и прогестерона при проведении ЛИТ, которое наблюдается в течение 4-х недель [Манукова С.Н., 23 1987, Мошин В.И., 1989], а также данных Beer A.E. (2000) получивший аналогичные данные. В I группе аллогенные лимфоциты вводили в количестве 50 млн клеток, во II группе вводили в количестве 100 млн клеток, а в III группе – в количестве 150 млн клеток. После проведения I процедуры ЛИТ в сроке 4–5 недель беременности и II процедуры ЛИТ в сроке 8–9 недель беременности в количестве 50 млн, 100 млн и 150 млн клеток, при оценке субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител статистически достоверных изменений не наблюдалось. Во втором субпопуляций и в третьем лимфоцитов в триместрах беременности периферической иммуноглобулинов в сыворотке крови крови содержание и содержание женщин исследуемых подгрупп находились в пределах нормы. Таким образом, ЛИТ является эффективным и безопасным методом при подготовке и ведении беременных с ранними потерями аллоиммунного генеза. На фоне проводимой терапии нам удалось успешно пролонгировать беременности у всех пациенток исследуемых групп. Во втором триместре 9 (18,4%) пациенткам, из них 2 пациенткам I группы, 4 пациенткам II группы и 3 пациенткам III группы в сроках 18–24 недели была произведена хирургическая коррекция шейки матки по поводу истмико-цервикальной недостаточности. Нарушение плацентарного кровотока по данным допплерометрии наблюдалось у 1-ой пациентки I группы и у 1-ой пациентки II недостаточности группы, которым внутривенным проводилось введением лечение плацентарной инфузионных растворов аминокислот, а также препаратами, улучшающими метаболические процессы в плаценте. При скрининговом УЗИ отклонений от нормы выявлено не было. 24 В сроках беременности 17–18 недель всем женщинам проводилась пренатальная диагностика. У всех пациенток исследуемых групп показатели были в пределах нормы. У женщин исследуемых групп третий триместр беременности протекал без особенностей. Таким образом, в результате подготовки к беременности и ведения беременности роды произошли: у 5 женщин I группы, из них у 4-х самопроизвольные, у 1-ой преждевременные в сроках 35–36 недель; у 22 женщин II группы, из них у 16 своевременные, у 1-ой преждевременные в сроках 36–37 недель, у 5-х оперативные роды; у 20 женщин III группы, из них у 17 женщин своевременные, у 3-х оперативные роды. У 10 женщин исследуемых групп исследовалась пуповинная кровь для определения HLA II класса у новорожденных. По локусу DRB1 отмечено гомозиготность у 1 новорожденного по аллелям 01/01 и у 1 новорожденного по аллелям 11/11. По локусу DQA1 отмечено гомозиготность у 4-х новорожденных по аллелям 0301/0301, у 2-х новорожденных по аллелям 0501/0501 и у 1 новорожденного по аллелям 0101/0101. Особенности системы HLA II класса, а именно наличие аллеля 0201 по локусу DQB1 отмечено у 3-х новорожденных. Всего у пациенток исследуемых групп родилось 47 (95,9%) живых детей, без пороков развития, с нормальными массо-ростовыми показателями. У 1-ой женщины II группы и у 1-ой женщины III группы беременности пролонгируют на момент оформления работы и соответствуют срокам более 32 недель беременности. Таким образом, все выше изложенное указывает на важность и целесообразность проведения комплексной терапии и подбора индивидуальной дозы вводимых лимфоцитов, с учетом совпадений и особенностей системы HLA, оценки функционального состояния иммунной системы при подготовке женщин к беременности с привычным невынашиванием ранних сроков в анамнезе. 25 ВЫВОДЫ 1. В генезе привычного невынашивания беременности первого триместра значимую роль играют аллоиммунные нарушения, которые составляют 24,6%: совместимость супругов по трем и более идентичным антигенам системы HLA; гомозиготный генотип 0301/0301 по локусу DQA1 и генотип 0501/0501 по локусу DQB1 у женщин; наличие аллелей 0201 по локусу DQA1 и/или DQB1 у мужчин, при котором возможно прогнозирование анэмбрионий в 72,7% случаев. 2. При исследовании HLA II класса супружеских пар с привычными ранними выкидышами выявлено, что достоверно чаще, чем в популяции, как у женщин, так и у мужчин встречается аллель 11 по локусу DRB1, у мужчин аллель 0102 по локусу DQA1. По системе HLA I класса достоверно чаще по сравнению с популяционными данными встречаются антиген В16 у женщин, антигены А24 и В12 у мужчин. 3. Наличие совпадений супругов по антигенам системы HLA создает условия для гомозиготности их новорожденных. Типирование HLA II класса у 10 новорожденных выявило наличие гомозиготных генотипов у 9 новорожденных, из них у 2-х по локусу DRB1, у 7 по локусу DQA1. У 3х новорожденных отмечено наличие аллеля 0201 по локусу DQB1. 4. В периферической крови женщин с привычным невынашиванием беременности ранних сроков выявлен высокий уровень CD3−56+16+ клеток, повышенный уровень сывороточного интерферона, отсутствие изменений в показателях аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. 5. Оптимальным количеством вводимых лимфоцитов для пациенток с привычным невынашиванием аллоиммунного генеза является 100 млн и 150 млн клеток, что сопровождается статистически достоверным снижением уровня CD3−56+16+ клеток, повышением уровня CD8+ клеток и IgM, снижением ответа женских лимфоцитов на фитогемагглютинин и 26 повышением уровня блокирующих факторов и антиотцовских антилейкоцитарных антител. При подготовке к беременности наиболее значимую роль играет первая процедура ЛИТ, а вторая процедура закрепляет данный эффект. 6. Применение ЛИТ для индивидуализированной предгестационной подготовки и в первом триместре беременности при выявлении аллоиммунных нарушений у данного контингента больных, позволило успешно пролонгировать беременность у всех женщин, добиться снижения частоты явлений угрозы прерывания беременности и развития плацентарной недостаточности. Роды в исследуемой группе с привычным невынашиванием беременности произошли в 95,9% случаев, из них в 93,6% случаев оценка состояния новорожденных по шкале Апгар составила 8–9 баллов. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. В алгоритм обследования супружеских пар с привычным невынашиванием беременности ранних сроков в анамнезе необходимо включить определение антигенов системы HLA супругов, определение уровня CD3−56+16+ клеток и уровня сывороточного интерферона в периферической крови, определение показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител для выявления аллоиммунных нарушений. 2. У пациенток с ранними потерями беременности аллоиммунного генеза необходимо проведение ЛИТ в течение двух циклов подряд до планируемой беременности. При выявлении совместимости супругов по 3 антигенам системы HLA, незначительном повышении (до 20%) уровня CD3−56+16+ клеток в периферической крови, возможно применение ЛИТ в дозе 50 млн клеток; при выявлении совместимости супругов по 4–5 антигенам системы HLA, повышенного уровня CD3−56+16+ клеток в 27 периферической крови от 20 – 23%, целесообразно проведение ЛИТ в дозе 100 млн клеток; при выявлении совместимости супругов по более чем 5 антигенам системы HLA, повышенного уровня CD3−56+16+ клеток в периферической крови более 23%, необходимо применение ЛИТ в дозе 150 млн клеток. Ведение аллоиммунных лимфоцитов противопоказано при поливалентной форме аллергии и при аутоиммунных причинах невынашивания беременности. 3. При отсутствии изменений в показателях аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител, целесообразно проведение ЛИТ в количестве 100 млн и 150 млн клеток. 4. Для оценки эффективности проводимого метода лечения через 3 недели после иммунизации необходимо определение показателей субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови, определение показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. 5. Несмотря на проводимую терапию аллогенными лимфоцитами, при отсутствии нормализации параметров CD3−56+16+ клеток, в предполагаемом фертильном цикле показано внутривенное введение иммуноглобулина и применение дидрогестерона. 6. У женщин с привычным невынашиванием беременности аллоиммунного генеза, при наступлении беременности целесообразно проводить ЛИТ в 4–5 недель и далее применять каждые 3–4 недели до 12 недели беременности, под контролем клинического течения беременности, показателей субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови, показателей аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител. 28 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лимфоцитоиммунотерапия (ЛИТ) в комплексном лечении ранних потерь беременности / Л.А. Петросян // Материалы VIII Всероссийского Научного форума «Мать и дитя». – М. – 2006. – с.197. 2. Оптимизация лимфоцитоиммунотерапии (ЛИТ) в лечении привычной потери беременности иммунного генеза / Л.А. Петросян, А.А. Дьяконова, Н.К. Матвеева, Л.В. Кречетова // Материалы IX Всероссийского Научного форума «Мать и дитя». – М. – 2007. – с.193. 3. Иммунологические аспекты привычной потери беременности (обзор литературы) / Л.А. Петросян // Проблемы репродукции. – 2008. - №2. – с.62-67. 29